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Monogrfico: Osteoartritis. Volumen 3, Nmero Extra.3, Octubre 2007

Tratamiento de lesiones del cartlago articular con terapia celular

Isaac Manuel Fuentes-Boquetea; Mara del Carmen Arufe Gondaa; Silvia Mara Daz Pradoa; Tamara Hermida Gmezb; Francisco Javier de Toro Santosc; Francisco Javier Blanco Garcad a Departamento de Medicina. Universidade da Corua. A Corua. Espaa. Laboratorio de Investigacin osteoarticular y del envejecimiento. Centro de Investigacin Biomdica. CHU Juan Canalejo. A Corua. Espaa. b Laboratorio de Investigacin osteoarticular y del envejecimiento. Centro de Investigacin Biomdica. CHU Juan Canalejo. A Corua. Espaa. c Departamento de Medicina. Universidade da Corua. A Corua. Espaa. Laboratorio de Investigacin osteoarticular y del envejecimiento. Centro de Investigacin Biomdica. CHU Juan Canalejo. A Corua. Espaa. d Laboratorio de Investigacin osteoarticular y del envejecimiento. Centro de Investigacin Biomdica. CHU Juan Canalejo. A Corua. Espaa. Ctedra Bioibrica de Terapia Celular. Universidade da Corua. A Corua. Espaa.

Las lesiones del cartlago articular que no afectan a la integridad del hueso subcondral no se reparan espontneamente. El carcter asintomtico de estas lesiones propicia la progresiva degeneracin articular y el desarrollo de un proceso artrsico. Para evitar la necesidad de reemplazo protsico, se han desarrollado distintos tratamientos celulares con el objetivo de fomar un tejido de reparacin con estructura, composicin bioqumica y comportamiento funcional iguales que los del cartlago articular natural. Las tcnicas basadas en facilitar el acceso al sistema vascular generan un tejido de reparacin fibrocartilaginoso que no rene las condiciones del cartlago articular. El implante de condrocitos autlogos y la mosaicoplastia autloga aportan un tejido de reparacin de mayor calidad, pero ambas tcnicas implican la escisin de cartlago sano, bien para obtener una elevada cantidad de condrocitos, bien para extraer cilindros osteocondrales que se implantan en el defecto. Las clulas madre mesenquimales constituyen una prometedora herramienta de reparacin del cartlago articular en fase de experimentacin. Aunque las estrategias actuales de terapia celular producen mejoras clnicas y funcionales, todava no es posible generar un tejido de reparacin resistente a la degeneracin y con caractersticas de cartlago articular normal. Palabras clave: Cartlago articular. Terapia celular. Lesiones focales de cartlago. Artrosis. Condrocito. Clula madre.

Treatment of Joint Cartilage Lesions With Cell Therapy

Articular cartilage lesions which do not affect the integrity of subchondral bone, they are not able to repair it expontaneously. The asymptomatic nature of these lesions induces articular cartilage degeneration and development of an arthrosic process. To avoid the necessity to receive joint replacement surgery, it has been developed different treatments of cellular therapy which are focused to create new tissues whose structure, biochemistry composition and function will be the same than native articular cartilage. Approaches used to access the stream produce a fibrocartilaginose tissue which is not an articular cartilage. Implantation of autologous chondrocytes and autologous mosaicplasties induces a quality better articular cartilage. Furthermore both techniques involve

damage in the sane cartilage; because of trying to get a big amount of chondrocytes or because of extraction osteochondral cylinder which will be implanted in the injured joint. The stem cells are a promising toll to repair articular cartilage, however they are in a previous experimentation step yet. Although the present studies using cellular therapy improves clinically and functionally, it is not able to regenerate an articular cartilage which offer resistance the degeneration process. Keywords: Articrapy cartilage. Cell therapy. Focal cartilage lesions. Osteoarthritis. Chondrocyte. Stem cell.

Introduccin El implante de clulas con capacidad condrognica o el acceso a la mdula sea son modalidades de terapia celular para reparar lesiones del cartlago articular. El objetivo final no es slo "cicatrizar" el defecto condral (reparacin), sino generar un tejido de nueva formacin con una estructura, una composicin bioqumica y un comportamiento funcional iguales a los del cartlago articular nativo (regeneracin). Esta revisin aborda diferentes opciones de terapia celular del cartlago articular desde una perspectiva clnica y experimental. Penetracin del hueso subcondral Cuando la lesin afecta al cartlago y el hueso subcondral (lesin osteocondral), se produce la migracin de clulas mesenquimales de la estroma de la mdula sea, que protagonizan la reparacin del defecto1. Esta reparacin est limitada por el tamao del defecto, de modo que la capacidad de reparacin espontnea en lesiones osteocondrales de gran tamao es prcticamente nula. La abertura del rea vascular subcondral se lleva a cabo mediante distintas tcnicas quirrgicas, como la abrasin artroscpica2, las perforaciones del hueso subcondral3, la espongializacin4 y la microfractura5, que es la que ofrece mejores resultados. Estudios experimentales en conejo6,7 y perro8 han observado que el tejido de reparacin as formado es de tipo fibrocartilaginoso (diferente del cartlago hialino articular en composicin, organizacin estructural y propiedades mecnicas) y muestra con el tiempo signos de degeneracin 1,7. No obstante, los resultados clnicos parecen contradecir esta calidad del tejido de reparacin. El tratamiento por microfractura de defectos os teocondrales de rodilla ha aportado a los 2 aos unos buenos resultados clnicos9, que parecen depender de la edad y muestran ms efectividad en pacientes menores de 40 aos10. Aunque se ha indicado que un proceso de degeneracin del tejido de reparacin se inicia a los 18 meses de la microfractura11, se ha descrito a largo plazo (7-17 aos) el mantenimiento de la mejora funcional y la disminucin del dolor12. Injertos de periostio y pericondrio Estas membranas contienen clulas madre mesenquimales que pueden experimentar condrognesis13,14. El implante de periostio o de pericondrio forma un tejido de reparacin fibrocartilaginoso que parece no madurar con el tiempo 15,16. No obstante, los efectos clnicos del implante de pericondrio parecen ser similares a los de la perforacin subcondral, pues a los 10 aos de aplicar ambos procedimientos no se observaron diferencias significativas entre sus resultados 17. Injertos osteoperisticos El injerto de cilindros de hueso recubiertos de periostio produce en modelos animales un tejido neoformado fibroso18 que, con inductores condrognicos, llega a adquirir un aspecto fibrocartilaginoso19. Probablemente, el sangrado de mdula sea en la lesin interfiere con la accin reparadora de la capa germinal del periostio. De hecho, en el conejo, cerca del 67% de las clulas del tejido de reparacin tras el injerto osteoperistico procedan de la mdula sea 20. En contradiccin con esta discreta calidad histolgica del tejido de reparacin, se ha descrito que este procedimiento aporta mejora de la funcin articular y alivio del dolor21.

Mosaicoplastia Se considera que este procedimiento es una prometedora alternativa para el tratamiento de defectos condrales y osteocondrales de pequeo y mediano tamao 22. Bsicamente, consiste en la translocacin al defecto articular de cilindros osteocondrales obtenidos de zonas poco comprometidas con la absorcin de carga (fig. 1). La zona donante se autorrepara con clulas mesenquimales del estroma de la mdula sea que promueven un tejido fibrocartilaginoso. Con el seguimiento artroscpico hasta los 523 y los 10 aos24 del implante, se ha observado supervivencia del cartlago hialino trasplantado, congruencia de las superficies articulares y reparacin fiborcartilaginosa de las zonas donantes. No obstante, si los cilindros osteocondrales sobresalen de la superficie, producen problemas articulares. As, pacientes con este problema manifestaron a los 4 meses de la mosaicoplastia sensacin de pinzamiento e incluso dolor. Su valoracin artroscpica revel fisuras en los cilindros osteocondrales y fibrillas en la superficie articular anexa 25.

Figura 1. Mosaicoplastia. Los cilindros osteocondrales obtenidos de zonas poco comprometidas con la absorcin de cargas se implantan en la zona de la lesin. La mosaicoplastia autloga est limitada por el tamao del defecto, que determina el nmero de cilindros osteocondrales necesarios. Por otra parte, el tejido implantado procede de una zona de poca carga, con menor grosor y diferente estructura histolgica. El alotrasplante puede dar solucin a estas cuestiones: se evita la lesin en la zona de poca carga de cartlago, es posible obtener un nmero elevado de cilindros osteocondrales y stos pueden proceder de la misma zona de carga. Adems, los problemas inmunitarios son escasos debido al carcter avascular del cartlago y el encapsulamiento de los condrocitos en la matriz extracelular. De hecho, el alotrasplante osteocondral en rodilla est bien integrado y ofrece una consistente mejora funcional y del dolor a los 2 aos 26; despus de 10 aos la durabilidad es del 85% de los implantes27. Autotrasplante de condrocitos Actualmente, la alternativa teraputica ms eficaz para reparar lesiones focales del cartlago articular es el implante de condrocitos autlogos28-31. Este procedimiento tambin es aplicable a pacientes con osteocondritis disecante32, pero no a articulaciones artrsicas. El autotrasplante de condrocitos encuentra una limitacin importante en la edad, y es recomendable utilizar esta tcnica en pacientes menores de 55 aos. Este procedimiento consiste en obtener por artroscopia explantes de cartlago aticular de zonas poco comprometidas con la carga (fig. 2). Ya en el laboratorio, de los explantes se aslan condrocitos, que proliferan in vitro hasta obtener un nmero apropiado para el implante (10-12 millones de clulas). En una segunda intervencin quirrgica, se cierra la cavidad del defecto con periostio del propio paciente y se inyectan los condrocitos.

Figura 2. Autotrasplante de condrocitos. A y B: toma de biopsia. C y D: los condrocitos se obtienen triturando el cartlago y procediendo a su digestin enzimtica (tripsina y colagenasa tipo IV). E: las clulas proliferan en un frasco de cultivo a 37 C. F: cndilo femoral con lesin condral. G: en la cavidad del de-fecto, cerrada con una membrana (periostio, colgeno tipo I/III), se inyecta la suspensin con condrocitos. Este tratamiento presenta algunas limitaciones: a) la obtencin de explantes supone una intervencin quirrgica adicional y un dao aadido al cartlago articular que puede originar un proceso artrsico; b) la proliferacin in vitro de los condrocitos debe ser limitada, pues con las divisiones celulares disminuye su capacidad de producir cartlago estable in vivo 33; c) con el envejecimiento disminuye la densidad celular del cartlago, la capacidad de proliferacin in vitro de los condrocitos 34 y el potencial condrognico del periostio35, y d) el proceso de cultivo celular resulta demasiado largo (3-6 semanas) y no est exento del riesgo de contaminacin. El primer artculo sobre el autotrasplante de condrocitos en pacientes data de 1994 28. La valoracin clnica y artroscpica a los 2 aos del implante femoral aportaba buenos resultados. Trabajos posteriores han demostrado la durabilidad del implante, con buenos resultados clnicos despus de 511 aos del tratamiento32. El anlisis histolgico de biopsias del tejido neoformado ha mostrado una cierta heterogeneidad en la calidad del tejido de reparacin. De 41 biopsias tomadas tras 1 ao del implante, un 10% consista en cartlago hialino; un 24%, una mezcla de cartlago hialino y fibrocartlago; un 61%, fibrocartlago, y un 5%, tejido fibroso36. Otros estudios han mostrado al ao del implante la coexistencia en la misma biopsia de regiones con morfologa fibrocartilaginosa y regiones con morfologa hialina, ambas con proteoglucanos y colgeno tipo II29,31. Adems, se observaba actividad de agrecanasa y metaloproteasas, con una mayor actividad de la agrecanasa en las regiones fibrocartilaginosas 31, y la expresin en el ARNm de los procolgenos tipo IIA y tipo IIB 37, caractersticos respectivamente del estado precondroctico y de condrocitos diferenciados38. Estos datos indican que el autoimplante de condrocitos es capaz de inducir la regeneracin del cartlago articular, probablemente por el reemplazo y la remodelacin de una matriz inicial fibrocartilaginosa, mediante degradacin enzimtica y sntesis de colgeno tipo II. Se considera que este proceso contina ms all de los 24 meses despus del implante30,39 y se desarrolla en tres etapas clave: proliferacin celular (abarca las primeras 6 semanas), transicin (entre las semanas 7 y 26) y remodelamiento (ms all de 27 semanas) 40. Se ha cuestionado el uso de la membrana de periostio para retener la suspensin de condrocitos, utilizando como argumentos la necesidad de realizar una extensa incisin quirrgica, la hipertrofia perifrica del implante de periostio y su potencial de calcificacin ectpica. Como alternativa, se propone la utilizacin de una membrana de colgeno tipo I/III 41-43. Un reciente estudio comparativo entre ambas tcnicas no aport diferencias significativas en cuanto a la valoracin clnica, aunque el anlisis artroscpico demostr un significativo nmero de pacientes que necesitaron "rasurado" de la hipertrofia perifrica en el implante de periostio 44. Otras alternativas teraputicas son el alotrasplante 45-47 y el xenotrasplante de condrocitos48,49. El alotrasplante est condicionado por la necesidad de donantes y las limitaciones del almacenamiento

de cartlago o de condrocitos, pues la criopreservacin modifica la supervivencia y la proliferacin de los condrocitos50. Respecto al xenotrasplante, apenas se ha investigado. Ambos procedimientos encuentran en la barrera inmunitaria una de sus principales objeciones. No obstante, si bien los condrocitos aislados resultan inmungenos, el aloimplante de condrocitos atrapados en su matriz extracelular47 o embebidos en geles de colgeno o agarosa45,46 produce nulas o escasas reacciones de rechazo. Por otra parte, tras el xenotrasplante in vivo de condrocitos de cerdo en defectos condrales de conejo cerrados con membrana de periostio, no se observaron signos de infiltracin de clulas inmunitarias49. Trasplante de clulas madre mesenquimales Las clulas madre mesenquimales (MSC) pueden diferenciarse in vitro en una gran variedad de tipos celulares, como adipocitos, condrocitos y osteoblastos51. Estas clulas se aslan desde una pequea muestra de tejido, proliferan en cultivo hasta obtener cantidades apropiadas para aplicaciones clnicas y pueden ser implantadas en el mismo paciente. As, las MSC constituyen una herramienta potencial para reparar tejidos eludiendo problemas relacionados con el rechazo inmunitario del alotrasplante y el conflicto tico por usar clulas madre embrionarias. Las MSC estn ampliamente distribuidas in vivo, de modo que se puede aislarlas de mdula sea 52, periostio53, pericondrio54, membrana sinovial55, tejido conectivo de la dermis y del msculo esqueltico56, grasa57, sangre del cordn umbilical58 y perifrica59,60, membrana amnitica61 e incluso del propio cartlago articular62. Aunque la mdula sea es la fuente tisular de MSC ms utilizada, la sangre de cordn umbilical se est revelando como fuente de gran cantidad de clulas madre, susceptibles de diferenciacin a cualquier tipo celular y con ventajas derivadas de su estado inmunitario y sus telmeros sin acortar63. Actualmente, no hay marcadores especficos para la determinacin precisa de MSC. Los principales criterios para su identificacin son su adherencia al plstico del frasco de cultivo y su morfologa fibroblstica64, su capacidad de proliferacin prolongada en cultivo manteniendo sus caractersticas de clulas madre, su capacidad para diferenciarse in vitro en clulas de origen mesodrmico (condrocitos, adipocitos, osteoblastos) y su carencia de expresin de antgenos hematopoyticos tpicos como CD34 y CD4565. Adems, se ha relacionado diferentes marcadores de superficie con las MSC. Entre los ms ampliamente utilizados estn Stro-1, CD44, CD73, CD90, CD105 y CD166. La escasa cantidad de MSC aisladas de una muestra de tejido hace necesaria su proliferacin in vitro. Pero el nmero de divisiones mitticas debe ser limitado, pues durante el cultivo in vitro las MSC envejecen y experimentan una marcada disminucin de su capacidad proliferativa 66,67 y una prdida gradual del potencial de diferenciacin mltiple66,68. El mantenimiento de fenotipo y capacidad de diferenciacin es proporcional a la telomerizacin de los cromosomas 69. Los telmeros se acortan en cada divisin celular, pero en las clulas madre embrionarias se restituyen por la accin de la enzima telomerasa. En las MSC, esta enzima muestra nula70 o baja actividad68,71,72. La edad del paciente tambin influye en las caractersticas de las MSC, ya que con el envejecimiento se reduce su capacidad proliferativa73. Diversos estudios sealan que la poblacin de MSC comprende subpoblaciones de clulas en diferentes estados de diferenciacin y que la capacidad de diferenciacin puede variar en funcin del tejido del que se las asla. As, las MSC procedentes de mdula sea muestran una mayor tendencia a la diferenciacin osteognica74, en tanto que las MSC de origen sinovial tienen mayor tendencia a la diferenciacin condrognica75. En las mismas condiciones de cultivo y diferenciacin, las MSC aisladas de membrana sinovial muestran ms potencial condrognico que las derivadas de mdula sea, periostio, msculo esqueltico o tejido adiposo76. La reparacin en modelos animales de lesiones condrales con MSC embebidas en gel de colgeno 45 o inyectadas en los defectos cerrados con periostio77 indica que las MSC son capaces de diferenciarse de acuerdo con el medio biolgico en el que se encuentran. Trabajos realizados por

diferentes grupos intentando determinar si las MSC inyectadas intraarticularmente se movilizan hacia el cartlago daado y reparan el defecto obtuvieron resultados opuestos. En rodilla de cabra, con artrosis inducida por rotura meniscal y reseccin del ligamento cruzado anterior, se observ tras 6 semanas de la inyeccin intraarticular de MSC reparacin del menisco, pero no del cartlago ni del ligamento78, lo que evidencia la movilizacin de las clulas hacia el menisco, pero no hacia el cartlago. En cambio, la inyeccin intraarticular de MSC en rodilla de rata mostr que estas clulas se movilizaban hacia todos los tejidos afectados, incluido el cartlago, y contribuan a la regeneracin tisular79,80. Son escasos los trabajos sobre MSC utilizados para tratar lesiones condrales humanas. En rodillas con osteoartritis, se implantaron MSC embebidas en gel de colgeno en defectos condrales cerrados con membrana de periostio; tras 42 semanas, se observaron mejores resultados artroscpicos e histolgicos que en los pacientes osteoartrticos sin implante, aunque esta mejora no result significativa en el aspecto clnico81. Todava hay dudas sobre la utilizacin de MSC para tratar lesiones condrales, en gran medida porque no se conoce con suficiente detalle las etapas de diferenciacin condrognica de estas clulas y no se dispone de protocolos que garanticen la diferenciacin hacia el fenotipo deseado. As, la plasticidad de las clulas derivadas de MSC puede conducir a alteraciones no deseadas en el fenotipo 82,83. Terapia gnica La introduccin de productos gnicos en el mbito del dao tisular puede favorecer el proceso de restauracin del cartlago articular. Este proceso implica determinar los genes y las clulas adecuadas para la transferencia gnica (condrocitos, clulas condrognicas y clulas de la membrana sinovial) usando diferentes vectores para incorporar los ADNc84. Distintos factores anablicos (miembros de la superfamilia de TGF-b, IGF-1, FGF y HGF) pueden inducir condrognesis y sntesis de los componentes de la membrana extracelular, en tanto que las molculas antiinflamatorias (interleucina [IL] 4, IL-10, IL-1Ra, TNFsR) pueden actuar como inhibidores de la degradacin del cartlago 85. La membrana sinovial resulta apropiada para terapias condroprotectoras 86. La transfeccin viral in vivo del gen IL-1Ra en articulaciones reumatoideas reduce la enfermedad en modelos animales 87 y en pacientes se ha mostrado que esta tcnica permite la expresin intraarticular del gen IL-1Ra de una manera segura88,89. Los condrocitos y las MSC resultan dianas preferentes para inductores de condrognesis. As, en modelos animales, el trasplante in vivo en lesiones condrales de MSC transfectadas con BMP-2 de ADNc aporta una mejor reparacin, con una elevada produccin de proteoglucanos y colgeno tipo II90.

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