F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

Degradación de parafinas por Pseudomonas aeruginosa

MGP-1
Gloria Giraldie Cuéllar,1 Gabriel Pineda,1 Ana María Mesta1 y 2 y Rosa Salgado1
1
Universidad Simón Bolívar, 2ENCB-Instituto Politécnico Nacional

Resumen

Pseudomonas aeruginosa MGP-1 es capaz de utilizar parafinas sólidas, con entre 18 y 28

átomos de carbono. El porcentaje de degradación más grande y la mayor velocidad de
crecimiento fueron encontrados con la mezcla PI. Cuando la cadena de carbono aumenta o
diminuye entre 18 y 28 carbonos, la degradación también diminuye, lo cual sugiere que el
sistema enzimático de la oxidación de alcanos tiene poca especificidad de sustrato.

Abstrac t

Pseudomonas aeruginosa MGP-1 is able to use n-alkanes solid paraffin, with between 18 and
28 atoms of carbon. The largest degradation and growth speed was found with paraffin PI,
when the carbon chain of the alkane increases or decreases, the degradation and growth
rates also decrease progressively, wich suggests that the enzymatic oxidation system of alkanes
has little substrate specificity.

Introducción reportados cuatro géneros bacterianos con capaci-

A partir del ambiente –y sobre todo de sitios conta-
minados con petróleo–, es posible aislar microor-
ganismos capaces de degradar hidrocarburos aromá-
ticos mono y polinucleados, o hidrocarburos alifáticos
como los n-alcanos (Bossert y Bartha, 1984; Foght,
Fedorak y Westlake, 1989; Leahy y Colwell, 1990;
Westlake, Jobson, Phillippe y Cook, 1974; Whyte, Greer
e Inniss,1996; Whyte, Bourbonniére, Inniss y Greer
1997).
Un gran número de bacterias es capaz de crecer
sobre alcanos gaseosos y líquidos (Ratajczak, 1998;
Hamamura, Ryan, Lewis y Daniel, 1999); pero existen
muy pocos reportes acerca de la capacidad para de-
gradar n-alcanos sólidos (parafinas) con cadena
mayor a C18 (Sakai, Maeng, Tani y Kato, 1994; Whyte
et al., 1998). Haines y Alexander (1974) fueron los
primeros en reportar que n-alcanos de siete a 44
átomos de carbono fueron metabolizados por algu-
nos microorganismos; recientemente sólo han sido
dad para usar n-alcanos con más de 20 átomos de
carbono: en 1994, Sakai et al. investigadores demos-
traron el uso de n-alcanos de cadena larga (C13-C44)
por Acinetobacter sp. M-1; Lai y Khanna (1996) inves-
tigaron la mineralización de octacosano por un A.
calcoaceticus S30; Arthrobacter nicotianae KCCB35,
que creció sobre n-alcanos de C10 a C40 como única
fuente de carbono y energía, fue reportado por
Radwan et al. en 1996, y Rhodococcus sp. cepa Q15
es capaz de degradar n-alcanos puros y diesel a bajas
temperaturas –esta cepa mineralizó dodecano y
hexadecano así como alcanos con 28 y 32 carbonos
(Whyte et al., 1998).
Es bien conocida la capacidad del género Pseudomo-
nas para degradar hidrocarburos aromáticos y ali-
fáticos (Fish, Allenby y Lilly, 1982; Parekh, Traxler y
Sobek, 1977; Rosenberg, 1992; Whyte et al., 1997).
Los n-alcanos susceptibles al ataque microbiano
comprenden desde el metano hasta el heptadecano,
por las especies de P. methanica, (CH4) P. oleovorans

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(C5-C12) y P. aeruginosa (C12-C17); sin embargo, no
se ha reportado ninguna cepa de este género con
capacidad para degradar n-alcanos sólidos (Singer
y Finnerty, 1984).
Pseudomonas aeruginosa MGP-1 fue aislada a partir
de suelos contaminados con hidrocarburos en el
Laboratorio de Microbiología General de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, como parte
de un proyecto denominado “Liberación de micro-
organismos al medio ambiente”.
Objetivo
Determinar la capacidad de Pseudomonas aeruginosa
para utilizar alcanos sólidos (parafinas) como única
fuente de carbono y energía, así como los porcentajes
de degradación de las parafinas.
Metodología
Utilización de mezclas de parafina como fuente
de carbono y energía. Se determinó la utilización
de mezclas de parafinas con diferentes temperaturas
de fusión denominadas como PI (pf 56 - 61 ºC), PII
(pf 65 ºC), PIII (pf 73-80 ºC) y PIV (pf 59-63 ºC), marca
Aldrich. El medio mineral M9 se utilizó en todos los
experimentos y se preparó con 6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l
de KH2PO4, 0.5 g/l de NaCl, 2.0 g/l de NH4Cl, y se esterilizó
a 121 ºC durante 15 min y posteriormente se le
adicionaron 2.0 ml/l de una solución de MgSO4.7H2O, a
una concentración 1M y 100 µl/l de CaCl2 1M. Las
cinéticas de crecimiento individuales para cada mezcla
de parafina se hicieron en matraces con 50 ml del
medio mineral M9; 1% de las mezclas de parafinas y
500 µl de un inóculo de la cepa. Los cultivos se incuba-
ron a 27 ºC y en agitación de 100 rpm. El crecimiento
se midió determinando el número de UFC/ml por
cuenta viable en agar cuenta estándar.
Cinética de crecimiento. Las cinéticas de cre-
cimiento se hicieron individualmente, P. aeruginosa
MGP-1 fue cultivada en mezcla de parafinas en las
condiciones mencionadas. Se hicieron dos cinéticas
de crecimiento por triplicado. Los cultivos fueron
incubados a 27 ºC ± 2 ºC con agitación de 100 rpm.
Los testigos negativos para crecimiento y degradación
no fueron inoculados, e igualmente se montó un
testigo sin fuente de carbono.
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La degradación de las mezclas se hizo en lote y por
duplicado. Antes de que los cultivos llegaran a la
fases estacionaria, se les extrajo la fase orgánica tres
veces con benceno.
Las fases orgánicas fueron recolectadas en matraces
y deshidratadas pasándolas a través de un papel
filtro Wathman del n. 1 con Na2SO4. Se concentraron
las muestras por destilación con un rotovapor, para
efectuar el análisis cromatográfico.
Análisis cromatográfico. Para analizar las fases or-
gánicas residuales, se utilizó un cromatógrafo de ga-
ses Perkin Elmer AutoSystem XL con detector de
ionización de flama; se utilizó una columna Perkin
Elmer-5 de sílica fundida, 5% fenil, metilpolisiloxano,
con 30 m de longitud, 0.53 mm de diámetro interno
y 0.5 µ de película. Se utilizó nitrógeno como gas
acarreador a 10 psi. La temperatura del inyector se
mantuvo a 310 °C ; se inyectó 1 µl. La temperatura
inicial del horno fue de 55 °C durante 5 min, pos-
teriormente, se elevó a 280 °C y así se mantuvo du-
rante 5 min y, finalmente, la temperatura se aumentó
gradualmente 3 °C/ min hasta alcanzar los 310 °C. La
temperatura del detector se mantuvo a 310 °C. El
tiempo de corrida fue de 75 min. Las parafinas resi-
duales se cuantificaron a los 16 días; los porcentajes
de degradación se determinaron considerando el área
obtenida de la parafina residual del cultivo sin ino-
cular como el 100% y el área de la parafina residual
del cultivo.
Resultados
Utilización y degradación de mezclas de pa-
rafinas por P. aeruginosa MGP-1. La Figura 1
muestra la cinética de crecimiento de P. aeuginosa
MGP-1 sobre cada una de las mezclas de parafinas,
en log de las UFC/ml. La cepa creció más rápido sobre
la PI; en la PII el crecimiento fue más lento, el cre-
cimiento que se obtuvo en la cepa cultivada en la
PIV fue semejante a la de PI.
La Figura 2 presenta la gráfica de los porcentajes de
degradación para cada mezcla de parafinas, respecto
al tipo de mezcla de parafina que se utilizó. El por-
centaje de degradación fue mayor en la PI, seguida
de PIV, y el menor, en PII. En los tres casos, la degra-
dación de las parafinas fue proporcional al creci-
miento de la cepa.
 F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

Figura 1. Cinética de crecimiento de P. aeruginosa MGP-1 en las mezclas de parafinas, midiendo el crecimiento por UFC/ml

16

14 PI PIV
PIII
12
PII
10
LOG UFC/ml

0 5 10 15 20

días

Se presentan los cromatogramas obtenidos únicamente de las mezclas PI y PII; en los cromatogramas se observa
notablemente la disminución del área de la parafina PI del cultivo de 16 días respecto al testigo sin inocular; la
parafina más degradada es la de PI, donde se observa una mayor disminución del área de la parafina respecto
a la disminución obtenida con la PII que es menor que para cualquier otra mezcla de parafinas, como se
aprecia en la Figura 3.

Figura 2. Porcentajes de degradación de las mezclas de parafinas obtenidos con P. aeruginosa MGP-1

60

50

40
% de degradación

30

20

10

0
PI PII PIII PIV

mezclas de parafinas

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Figura 3. Cromatogramas obtenidos del crecimiento de P. aeruginosa MGP-1 cultivada en las parafinas I y IV

PIV tiempo cero

Parafina I

PIV tiempo dieciséis

PIV tiempo cero

Parafina IV

PIV tiempo dieciséis

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 F a c u l t a d
Discusión
Las cinéticas de crecimiento y la determinación de las
parafinas residuales demostraron que Pseudomonas
aeruginosa MGP-1 utiliza y degrada alcanos lineales
como fuente de carbono y energía, existen pocos
estudios acerca de la utilización de alcanos sólidos
de cadena larga. El uso de mezclas de parafinas
con alcanos de C22 a C28 por Candida intermedia,
C. Lipolitica, y de otra mezcla con C25 a C37 por
Corynebacterium hydrocarboclastus y C. tropicales
fue reportado por Miller y Johhnson (citado en
Sakai et al.,1994); sin embargo, en estos estudios
no se realizaron cinéticas de crecimiento con las
que se puedan comparar resultados –al parecer sólo
se hicieron crecer las cepas en cultivo mineral con
estas parafina– ni tampoco se determinó el porcen-
taje de degradación.
Al cultivar P. aeruginosa MGP-1 en las diferentes
mezclas de parafinas, encontramos que creció más
rápido sobre la mezcla de parafina PI, y con menor
velocidad en la PII, mientras que en la PII y PIV el
crecimiento fue muy parecido. Los cromatogramas
obtenidos muestran que la PI tiene mayor propor-
ción de n-alcanos de entre 18 y 28 átomos de C;
mientras que la PII tiene más n-alcanos de entre 30
y 40 átomos de carbono; por lo que probablemen-
te ésta sea la razón por la cual la cepa crece más
rápido; a medida que la cadena hidrocarbonada
disminuye o aumenta, el crecimiento es más lento.
Sin embargo, es muy notable que después de 30
átomos de carbono, el crecimiento es extremada-
mente lento, y esto puede deberse básicamente a
que las cadenas de más de 18 átomos de carbono
requerirán un mayor tiempo para oxidarse hasta
CO2. Por otra parte, se comprobó que la cepa no es
capaz de crecer en alcanos menores a 10 átomos
de carbono, lo que podría deberse a que el sistema
enzimático que oxida los alcanos no reconoce
aquellos menores a 10 carbonos.
Sakai et al. (1994) demostraron el uso de n-alcanos
de C25 a C37 por un Acinetobacter sp. M-1; la cepa
creció sobre los n-alcanos en 36 horas, y el creci-
miento fue diferente sobre cada alcano; sus resul-
tados son similares a los obtenidos en este trabajo,
ya que la cepa MGP-1 también presentó el mayor
crecimiento sobre las parafinas que tienen en mayor
proporción; C24, seguido de C28 y, por último, C20.
Por otro lado, Acinetobacter creció muy lentamente
en los alcanos con menos de C20 y con más de C28;
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d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a
resultados similares a los obtenidos con de P.
aeruginosa MGP-1.
Por otra parte, el uso de hidrocarburos puros de más
de 30 átomos son escasos; Haines y Alexander (1974)
reportaron que n-alcanos con siete y hasta 44 car-
bonos fueron metabolizados por algunos micro-
organismos, pero no mostraron evidencia directa del
crecimiento microbiano sobre estos hidrocarburos
ni tampoco cuantificaron la degradación (citado en
Sakai et al., 1994; Maeg, Sakai, Tani y Kato, 1996).
Asimismo, Radwan, Sorkhoh, Felzmann y El (1996)
aislaron un Arthrobacter nicotianae KCCB35 que cre-
ció sobre n-alcanos de C10 a C40 como única fuente
de carbono y energía, y reportaron que el mejor
crecimiento fue encontrado al utilizar alcanos de en-
tre 10 y 18 carbonos; sin embargo, ellos tampoco
demostraron convincentemente el crecimiento de
su cepa sobre estos hidrocarburos alifáticos.
Finalmente, en este trabajo demostramos que la
razón por la cual existen pocos reportes acerca de
la cuantificación de la degradación de hidrocarbu-
ros y más específicamente de n-alcanos, se debe
fundamentalmente a que los puntos de ebullición
de los alcanos se incrementa conforme aumenta la
cadena carbonada, por lo que –en este caso– se tuvo
que implementar una metodología en donde se uti-
lizó una columna con un intervalo de temperatura
muy amplio para que los alcanos residuales pudie-
ran ser analizados. Asimismo, previamente al aná-
lisis cromatográfico, se hicieron pruebas de solubi-
lidad de los n-alcanos y resultó que el benceno era
el solvente con el cual se obtenía mayor recupera-
ción; pero debido a su toxicidad, se prefirió usar el
diclorometano, con el que se obtuvo también muy
buena recuperación de los alcanos con menos de
30 carbonos.
Conclusiones
De acuerdo con los resultados obtenidos, la cepa de
Pseudomonas aeruginosa MGP-1 es capaz de utilizar
parafinas sólidas como únicas fuentes de carbono y
energía. Los resultados sugieren que la cepa MGP-1
degrada con mayor rapidez alcanos de entre 20 y 28
átomos de carbono, por esta razón, la parafina I fue
en la que P. aeruginosa creció más rápido y donde se
obtuvo el porcentaje más alto de degradación. Es
importante destacar que la degradación de alcanos
45
 F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

con una cadena hidrocarbonada mayor de 30 átomos
de carbono es más lenta, y sería necesario determinar
si la adición de algunos agentes tenso-activos podría
aumentar el porcentaje de degradación.
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