Legenda:

Azul Janaina / Vermelho Gustavo

1. Introduo A Empresa MICRAL Laboratrio de Anlises de Alimentos LTDA atua no mercado h mias de 30 anos e tem suas instalaes atualmente situadas na Rua Gomensoro, nmero 131, no bairro de Olaria, Zona Norte do Rio de Janeiro. Atua na rea de anlises microbiolgicas em alimentos e realiza consultorias para produo segura de alimentos e bebidas. Contar um pouco mais da histria da empresa A Empresa fornece ainda servio de coleta de amostras e recebe as amostras em suas instalaes para que sejam realizadas as analises. Realiza tambm o controle da higienizao das mos de manipuladores bem como utenslios e equipamentos por eles usados. Todos servios prestados pelo laboratrio seguiam as estabelecidas pela Resoluo RDC n12 de 2 de Janeiro de 2001, que dispe sobre a segurana alimentar do ponto de vista microbiolgico estabelecendo padres microbiolgicos sanitrios aceitveis e critrios para interpretao dos resultados das analises realizadas.

2. Preparo de meios de Cultura

Colocar tbm o preparo das placas!!! no esquecer de colocar a o suplemento pra Be. Cereus no MYP.

3. Preparo do ambiente antes das analises

4. Atividades Realizadas 4.1. Analises Microbiolgicas 4.1.1. Contagem padro de bactrias mesfilas aerbias estritas e facultativas Objetivo: Realizar contagem padro de microrganismos mesfilos aerbios estritos e/ou facultativos viveis. Anlises realizadas em swabs de utenslios ou manipuladores??? UTENSLIOS. e em alguns alimentos como carne crua, leite pasteurizado, presunto, entre outros. Esse tipo de anlise tambm pode ser feita em alimentos em que normalmente no seria feita a pedido do cliente a fim de verificar o estado de deteriorao de uma amostra.

Fundamento terico: Dilui-se a amostra em placa de gar padro, e esta incubada a temperatura de 36 1C por 48horas. Mudar o fundamento terico Materiais e reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais matrias obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; agar padro para contagem (PCA); soluo salina peptonada 0,1% (gua peptonada); soluo salina 5% (m/v). Anlise: Preparo da amostra utilizando uma balana de preciso com escala que vai at o centsimo algarismo, pesar 100,2g ou pipetar 100,2mL de amostra e adicionar 90mL de soluo salina peptonada. Deixar a mistura de amostra e gua peptonada no stomacher (instrumento utilizado para melhor homogeinizao da amostra na gua peptonada) por cerca de um minuto. A partir da mistura obtida no stomacher, realizar mais diluies com 1mL de mistura e gua peptonada se necessrio. Colocar 1 mL de cada diluio em placas de petri vazias e, em seguida adicionar cerca de 15mL de agar PCA fundido com soluo de TTC 4% , homogeneizar o gar com o inculo e deixar solidificar em superfcie plana essa tcnica denominada spread plate. Para anlise com swabs, colocar 5 mL de soluo salina 5% (m/v) na prpria embalagem da haste, aguardar de 5 10 minutos (o tempo ta certo??) sim e, em seguida retirar uma alquota de 1 mL da soluo e repetir a tcnica de spread plate no, CPP pour plate... anteriormente utilizada. Depois incubar a 361C por 48horas.

4.1.2. Contagem de bolores e leveduras ( colocar ambientes tbm!!!) Objetivo: Estabelecer procedimento para contagem de bolores e leveduras em alimentos a ambientes ( como se faz essa contagem em ambiente?? No rel. da bonita no diz, e eu nunca fiz...). Deixa-se a placa da ABD aberta no ambiente desejado, por 15 minutos. Depois s incubar na BOD e contar! Fundamento terico: Esse experimento baseia-se na capacidade de crescimento desse tipo de microrganismo em meios com pH cido, prximo a 3,5, onde a maioria das bactrias que geralmente esto presentes em alimentos no se desenvolve. Sendo assim, a utilizao de meios acidificados, com pH 3,5 0,1, promove sua seletividade para fungos e leveduras. Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais matrias obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos; Agar Batata Glicose (PDA Potato Dextrose Agar ); soluo salina peptonada 0,1% (gua peptonada). Anlise: Pesar 10 0,2g ou pipetar 10 0,2mL da amostra. Misturar a essa quantidade de amostra a 90mL de gua peptonada e deixar no stomacher por aproximadamente um minuto. Para amostras de leite condensado ou doce de leite utilizar gua peptonada com concentrao de 20%. A partir da mistura obtida, realizar mais diluies com 1mL de mistura e gua peptonada se necessrio. Inocular 0,1mL das diluies realizadas na placa j seca com PDA 2% a pH ajustado para 3,5 0,1. Com o auxilio da ala de Drigalski, espalhar, com cuidado para no danificar o agar, o inoculo no meio de cultura at que este seja absorvido. Devem ser utilizadas, no mnimo, duas diluies decimais ou deve ser feita uma duplicata da mesma diluio. Quando a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata, 1mL da 1 diluio em trs placas: a primeira com 0,4mL e as outras duas com 0,3mL da diluio cada. Caso o material a ser analisado seja liquido poder ser inoculado 0,1mL da amostra diretamente, sem necessidade de mos diluies. A incubao deve ser feita na estufa intitulada B.O.D. Biologycal Oxygen Demand - a 25 1C num perodo de cinco a sete dias.

4.1.3 Identificao de Clostridium sulfito redutores Clostridium perfringens (Colocar tudo aqui mesmo !) Objetivo: Determinar procedimento para contagem de Clostridium sulfito redutores e Clostridium perfringens. Anlise realizada em alimentos. Fundamento Terico: Em condies anabioticas, no agar seletivo agar SPS , o Clostridium forma colnias negras caractersticas dessa bactria. Isso se deve a sua capacidade de reduzir o sulfito sulfeto de ferro, reao decorrente da presena de citrato de amnio e ferro no meio. Mateirais e reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materias obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gua peptonada 0,1%; agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS). Anlise: Pesar 10 0,2g ou pipetar 10 0,2mL de amostra, diluir em 90mL de gua peptonada 0,1% e deixar essa mistura no stomacher por 60 segundos. Aps sair do stomacher, 1mL da diluio da amostra deve ser inoculada em meio seletivo SPS dentro de tubos de rosca com aproximadamente 15mL de agar fundido e mantido em banho-maria a temperatura de 48C, para

que sejam alcanadas condies anaerbias. Deixar o agar com o inoculo endurecer em banho de gelo e, em seguida incubar a temperatura de 45 0,1 C por 48 horas.

4.1.4. Contagem de Staphylococcus aureus Objetivo: Fornecer mtodo para contagem e identificao de Staphylococcus aureus. Aplica-se em amostras de matrias-primas e alimentos prontos. Em produtos destinados ao Mercosul, a contagem se refere apenas aos soro tipos de Staphylococcus coagulase positivos. Fundamento Terico: Aps sua inculao no meio Baird Parker enriquecido com gema de ovo e telurito de potssio 0,05%, so formadas colnias negras com halos transparentes e precipitao em volta. A gema de ovo evidencia as caractersticas proteolticas e lipolticas da clula da bactria. H testes complementares utilizados para que seja confirmada a presena de S. aureus no alimento: as provas de coagulase, catalase, termonucleuase e colorao de gram. A prova de coagulase se baseia na capacidade do microrganismo de produzir essa enzima, responsvel por coagular o plasma sanguneo. A colorao de Gram demonstra os aspectos morfolgicos e tintoriais do microrganismo. A prova de termonuclease tem seu fundamento na capacidade da clula de produzir DNAse enzima que degrada o DNA de oligonucleotdeos. O teste de catase verifica a capacidade da bateria em sintetizar essa enzima que decompe o perxido de hidrognio, liberando dixido de carbono. Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materias obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; agar Baird-Parker; agar DNAse; verde de metila; agar nutriente; caldo BHI (Brain Heart Infusion); gua peptonada0,1%; soluo salina 0,85%; emulo de gema de ovo pasteurizada 50% (p/v); telurito de potssio 0,05%; plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; perxido de hidrognio 3%(p/v); reagente para colorao de Gram. Anlise: Pesar 10 Pesar 10 0,2g ou pipetar 10 0,2mL de amostra, diluir em 90mL de gua peptonada 0,1% e deixar essa mistura no stomacher por 60 segundos. Aps a homogeinizao retirar uma alquota de 0,1mL da amostra e colocar na placa de Baird-Parker, espalhando suavemente com auxilio da ala de Drigalski. Incubar a temperatura de 36 0,1C por 48horas. Havendo colnias tpicas, realiza-se o teste da catalase para confirmar a presena de S. aureus

Para realizar a prova de catalase deve-se pegar uma alquota de clulas, do agar nutriente ou do caldo de enriquecimento e colocar em placa de vidro ou lmina estril contendo uma gota de perxido de hidrognio 3%, com auxilio de basto de vidro. Misturar o inculo ao perxido e observar a reao. Taetcher,

Como deve ter percebido eu separei os results, pois acho que assim fica mais organizado, se achar ruim me fala que monto tudo junto!!!

4.1.5. Contagem de Coliformes Totais e Termotolerantes Objetivo: Estabelecer procedimento para contagem e identificao de coliformes totais e termotolerantes em alimentos. Anlise realizada em alimentos, matrias-primas, raes, gua e gelo. Fundamento Terico: Para realizar as anlises referentes a coliformes primeiro inoculamos a diluio da amostra em caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), ou simplesmente lauril para o teste presuntivo. Os microrganismos fermentam a lactose do meio e os produtos formados so cido e gs. O que pode ser observado utilizando-se um tubo de Durham. O lauril apresenta em sua composio, uma mistura de fosfatos que lha d poder temponante impedindo a acidificao do meio. A seletividade do caldo se deve a presena de lauril sulfato de sdio, um agente sulfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismo Gram positivos, inibindo seu crescimento. Em caso de resultado positivo para presena de coliformes no teste presuntivo, inocular as amostras provenientes dos tubos de lauril em tubos de caldo EC (Caldo Escherichia coli) para termotolerantes - e caldo Verde Brilhante Bile Lactose (VBBL) para coliformes totais. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo sua acidificao. Sua seletividade se deve a presena de sais biliares responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos. No caso das dietas enterais, as amostras que apresentam resultado positivo no caldo EC so repicadas para placa de agar EMB, afim de identificar a presena de Escherichia coli. O VBBL apresenta em sua formulao bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos.

Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materiais obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; caldo verde brilhante Bile lactose (VBBL); caldo EC; gua peptonada 0,1%; agar EMB. Anlise: Para as amostras de alimentos pesar 10 0,2g ou pipetar 10 0,2mL de amostra, diluir em 90mL de gua peptonada 0,1% e deixar essa mistura no stomacher por 60 segundos. Aps a homogeinizao colocar a mistura em 9 tubos de lauril - em 3 tubos de lauril com concentrao dupla 30mL de amostra, 10 mL em cada tubo; em outros 3 tubos, de lauril com concentrao simples, 3mL de amostra 1 mL em cada tubo; nos ltimos 3 tubos, tambm com lauril em concentrao simples, 0,3mL de amostra diluda, 0,1mL em cada tubo. Incubar a 35 0,1C por 48horas. Em caso resultado positivo, repicar as culturas dos tubos que apresentaram tal resultado nos caldos EC e VBBL. A maior parte dos alimentos no precisa de teste para coliformes totais, logo sero repicados para o caldo VBBL s aqueles que a legislao recomenda como sucos, refrescos e alimentos de uso em lactrios. Estes, por sua vez, devem ser incubados a 35 0,1C por 48horas. Os inculos do lauril repicados para o caldo EC devem ser incubados 45 0,1C por 24 horas, para identificao de coliformes termtolerantes. Quando a amostra for uma dieta enteral, aps a incubao no caldo EC, caso o resultado do teste seja positivo, o inoculo deve ir para o agar EMB, por meio da tcnica de estriamento, e ser inoculado a temperatura de 35 0,1C por 48 horas. Para anlise em gua e gelo, esperar o gelo derreter at um volume em que se possa avolum-lo, retirar dez alquotas de 10mL de cada amostra e coloc-las em caldo RHC direto, sem diluies. O perodo de incubao ser de 24 horas a temperatura de 35 0,1C.

4.1.6. Contagem de Bacillus cereus Objetivo: Demonstra mtodo de contagem e identificao de B. cereus em alimentos. Fundamento terico: Baseia-se na inoculao das diluies da amostra em agar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em agar Polimixina Piruvato Gema de Ovo Manitol Azul (PEMBA). adicionada uma emulso de gema de ovo pasteurizada que tem como objetivo verificar a produo de lecitinase pela

clula do microrganismo. A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios que atua sobre a flora acompanhante. O MYP tem o carbohidrato manitol, que o B. cereus no consegue fermentar, seu indicador de pH o vermelho de fenol. Para confirmar a presena de B. ceureus na amostra utilizado o teste bioqumico de hemlise. Esse teste verifica a produo de hemolisina, responsvel pela hemlise. Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materiais obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gua peptonada 0,1%; agar Base Mossel (MYP); agar nutriente; suplemento para B. cereus; agar sangue. Anlise: Pesar 10 0,2g ou pipetar 10 0,2mL de amostra, diluir em 90mL de gua peptonada 0,1% e deixar essa mistura no stomacher por 60 segundos. Retirar uma alquota de 0,1mL da amostra diluda e colocar na placa de MYP, espalhando suavemente com o auxilio de ala de Drigalski e incubar a 30 0,1C por 48horas. Havendo aparecimento de colnias tpicas da bactria, contar quantas so e repicar a raiz quadrada desse nmero para agar nutriente exemplo se foram encontradas 16 colnias tpicas, quatro sero repicadas para agar nutriente -, e incubar a temperatura de 30 0,1C por 24horas. Aps o enriquecimento inocular a cultura no meio Agar Sangue, para verificar a produo de -hemolisina teste da hemlise.

4.1.7. Contagem total de Enterobactrias Objetivo: Demonstrar procedimento para contagem de Enterobactrias. Essa anlise se aplica a amostras de superfcie de utenslios. Fundamento terico: Na anlise de Enterobactria inocular as diluies da amostra em agar EMB. O agar EMB um meio seletivo diferencial empregado no isolamento de bactrias Gram negativas. Sua seletividade a assegurada pela presena de eosina e do azul de metileno, que inibe o crescimento de bactrias Gram positivas. O carter diferencial obtido atravs da leitura da fermentao da lactose. Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materiais obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; soluo salina 5%(m/v); agar EMB. Anlise: Colocar 5 mL de soluo salina 5%(m/v) na prpria embalagem da haste, aguardar de 5 10 minutos (o tempo ta certo??) sim e, em seguida retirar uma alquota de 0,1 mL da

soluo salina, colocar na placa de EMB, espalhar a soluo sobre o meio, com auxilio da ala de Drigalski, cuidadosamente para no danificar o meio. Incubar a temperatura de 35 0,1C por 48 horas.

4.1.8. Pesquisa de Salmonella sp em alimentos Objetivo: Demonstrar mtodo que auxilie na deteco de Salmonella SP em alimentos prontos. Fundamento terico: Para essa bactria em especial a amostra deve ser tratada antes que as anlises em si sejam realizadas. Primeiro h um pr-henriquecimento da diluio da amostra que ocorre na gua Peptonada Tamponada (gua tamponada). Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos alimentos, capaz de promover estresse nas clulas de Samonella sp, sem inativ-las biologicamente. Quando utilizada soluo de gua tamponada, esta favorece a manuteno do pH, evitando que as bactrias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a recuperao das clulas de Samonella sp. Para leite em p, segundo a FDS, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas. Aps o pr-henriquecimento, h um enriquecimento seletivo que se baseia na utilizao de meios que contm substncias de ao inibitria do crescimento para maioria dos microrganismos interferentes e na incubao em temperatura seletiva. O enriquecimento seletivo de Salmonella sp se faz obrigatoriamente nos meios lquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenitocistina. Adicionalmente, utiliza-se caldo tetrationato.O caldo tetrationato composto por sais de bile que impedem o crescimento de bactrias Gram positivas e o iodo adicionado ao caldo evita o crescimento de outras bactrias do trato intestinal. Materiais e Reagentes: vidrarias, placas descartveis e demais materiais obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; gua tamponada; agar verde brilhante (AVB); Agar Salmonella Shiguela (ASS). Streptococcus sp. Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Listeria monocytogene Analises em gua mineral

Essas outras bactrias eu quero saber se precisa colocar no relatrio??? Me diz o que se faz pra eu poder colocar s o que se faz. Te mandei tudo isso ontem, apagou doidona??

5. Leitura de resultados 6. Referencias Bibliogrficas http://www.ial.sp.gov.br/ gua

BRASIL. ANVISA. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n 12 de 2 de Janeiro de 2001. Publicada no Dirio Oficial da Unio de 2 de janeiro de 2001. BRASIL. MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO. Instruo Normativa n 62 de 26 de agosto de 2003. Publicada no Dirio Oficial da Unio em 18 de setembro de 2003. BRASIL. MINISTRIO DA SADE. Secretaria de Vigilncia em Sade. Coordenao geral de Vigilncia em Sade Ambiental. Portaria MS n 518 de 25 de maro de 2004. Publicada no Dirio Oficial da Unio em 18 de setembro de 2003. AMERICAN PUBLIC HEALTH OF WATER AND WASTE WATER. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16 ed. Washington: American Public Health Association, 1985) FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). Bacteriological Analytical Manual. Arlington. Association of Official Analytical Chemists, 7 ed., 1992.

http://qualittas.com.br/uploads/documentos/Avaliacao %20Microbiologica%20da%20Carne%20Moida%20-%20Magda %20Adriana%20Pesarini%20Pigarro.PDF clstridium perf em agua) http://www.sanasa.com.br/document/noticias/591.pdf perf em agua) (clstridium

http://www.slideshare.net/Samiravet/aula-coliformes (coliformes) http://www.abef.com.br/Legislacoes/INST_NORMATIVA_62_iframe.asp (normativa 62) http://www.proanalise.com.br/produtos/16853/emb_teague_agar_meio_cultura_em_p laca_laborclinagares

Perguntas: Responde aqui pra ficar mais fcil!

1. No se realiza CPP em gua nem matria-prima na Micral correto? R: 2. Swabs: utenslios CPP e EMB / manipulador EMB apenas, correto? R: 3. Batrias lticas e gua mineral ganharo um tpico s para si, porm as bactrias que j foram citadas no sero novamente citadas nesse tpico exclusivo, no caso da gua. Swabs e ambientes: por terem suas analises em comum com alimentos teve suas analises incorporadas em outros tpicos tbm .. S falta mesmo ento Vibrio e Listria.

Amanh at fim do dia te envio toda essa parte pronta s pra vc corrigir! Quero terminar tudo( tudo mesmo! A apresentao, as edies a serem feitas, todas correes e releituras) at sexta... Acho que no passa de 15 pgina meu rel. T ruim ? Era tud que a gente fazia ...