CAROTENIDES

PESQUISA Cores Atraentes e Ao Biolgica

O Laboratrio de Quimio/Biotecnologia de Biomassa (LQBB) da UFPR , na dcada de 1990, acumulou experincia em Biotecnologia aperfeioando o substituto temporrio de pele humana base de celulose bacteriana para terapia de queimaduras, otimizando a produo microbiana de anidrido de difrutose a partir de inulina de razes de dlia como potencial edulcorante diettico e consolidando nova tecnologia de isolamento e purificao de acetogeninas de sementes de anonceas (graviola) como praguicidas e antitumorais. O projeto biotecnolgico ora reportado e pioneiro no Brasil visa, no interregno entre 1996 e 2000, produo microbiana de carotenides oxigenados (astaxantina) a partir de insumos nacionais de baixo custo (caldo de cana e uria) para emprego em piscicultura e avicultura e o encapsulamento destes pigmentos combatentes de radicais livres (e.g., bixina de urucum) em ciclodextrinas para incremento de sua natural baixa solubilidade em gua e para proteo contra o ambiente fsico desfavorvel (ar e luz).

Mestre, Doutor e Professor Titular em Bioqumica no LQBB-UFPR Universidade Federal do Paran; 11 Prmio Paranaense em C&T (1997) jfontana@bio.ufpr.br Nutricionista e Doutoranda em Bioqumica na UFPR Mestre em Bioqumica pela UFPR

Jos D. Fontana

Sabrina V. Mendes

Daniele S. Persike

Eletrotcnico do SCB-UFPR Bolsista AT-NS do CNPq

Luiz F. Peracetta Mauricio Passos

Ocorrncia natural Os carotenides compreendem uma famlia de compostos naturais, dos quais mais de 600 variantes estruturais esto reportadas e caracterizadas, a partir de bactrias, algas, fungos e plantas superiores. A produo natural mundial estimada em 100 milhes de toneladas por ano, e encabeada pela fucoxantina das algas fotossintticas marrons. Os mamferos no esto bioquimicamente capacitados para a biossntese de carotenides, mas podem acumular e / ou converter precursores que obtm da dieta (e.g., converso de -caroteno em vitamina A). No plasma humana predominam o -caroteno e o licopeno. Os carotenides mais comumente encontrados nos alimentos vegetais so o -caroteno (cenoura; Daucus carota), licopeno (tomate; Lycopersicum esculentum), vri40 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

as xantofilas (zeaxantina, lutena e outras estruturas oxigenadas do milho, Zea mays; da manga, Mango indica; do mamo, Carica papaya e da gema de ovo) e a bixina (aditivo culinrio e corante drmico usado por indgenas amaznicos, obtido do urucum, Bixa orellana). Outras ocorrncias naturais de uso culinrio so a capsaxantina e capsorubina ( pprica, Capsicum annuum ) e a crocina (aafro, Crocus sativus), excepcionalmente solvel em gua e um dos raros glicosdeos diterpnicos (C20) encontrados em plantas. Variabilidade estrutural e anlise laboratorial As frmulas qumicas de parte dos carotenides acima mencionados esto representadas na figura 1. As respectivas coloraes vo desde o

amarelo, passando pelo laranja, at o vermelho intenso e resultam da multiplicidade de duplas ligaes conjugadas na estrutura mais freqente do tipo C40 e se prestam caracterizao de cada variante estrutural por meio da espectrofotometria no visvel com comprimentos de onda mximos de absoro (mx ) na faixa de 410 a 510 nm (Figura 2). Os carotenides apresentam muitas possibilidades de ocorrncia de isomrica geomtrica (especialmente induzida por temperatura) e tica. Para fins de quantificao, um extrato organossolvente (clorofrmio; acetona; etanol) apresentando uma absorbncia de 0,25 unidades de absorbncia corresponde, aproximadamente, a uma concentrao de 1 g de carotenide / mL em funo do coeficiente de extino A1%1cm= 2500. Uma atmosfera de nitrognio durante o isolamento, processamento e embalagem , via de regra, requisitada para anular o efeito altamente daninho do oxignio sobre a cadeia polinica dos carotenos mais lbeis como o licopeno e -caroteno. A incluso de antioxidantes como BHT (Butylated Hydroxy Toluene), palmitato de ascorbila ou pirogalol , por vezes, adotada como cautela protetora na fase final de formulao de preparaes medicamentosas ou alimentares. Entre as metodologias alternativas para monitoramento do isolamento, purificao e determinao quantitativa de carotenides esto a cromatografia em camada delgada (TLC; Figura 3) acoplada densito-

metria e a cromatografia lquida de alta presso ou performance (HPLC; Figura 4), cujo limite de sensibilidade se situa na faixa de 5 a 10 g de carotenide por litro. Este tipo de anlises no LQBB-UFPR tem indicado que na levedura rsea-alaranjada Xanthophyllomyces dendrorhous (antes Phaffia rhodozyma) a astaxantina varia de 27% a 63% dos carotenides totais. Apelo mercadolgico e ao biolgica A sensao da cor um quesito de valor na motivao do consumidor de carnes e ovos (lembrado tambm o apelo do mercado cosmetolgico), alm de achar-se popularizado o conceito de que os carotenides so efetivamente saudveis. Um exemplo convincente a capacidade 250 vezes superior da astaxantina em combater radicais livres (espcies ativas do oxignio) quando comparado com o tocoferol. A ocorrncia de radicais livres refere-se ao oxignio singlet (1O2) e s ditas espcies reativas do oxignio ou ERO(s) : Estas ERO(s) so geradas no curso do metabolismo normal, mas so intensificadas aps exposio a xenobiticos (e.g., pesticidas). Como efetores malficos clivam o DNA, peroxidam lipdios insaturados, alteram a atividade enzimtica e depolimerizam polissacardeos. O efeito global o envelhecimento e a morte celular. Compostos naturais ricos em duplas ligaes conjugadas atuam, por seu efeito antioxidante, na destruio (seqestro, varredura; quenching, scavenging) destes radicais livres. Este exatamente o efeito mais benfico que os carotenides da dieta ou de formulaes medicamentosas podem desempenhar no organismo humano ou animal em geral, ou seja, o seqestro e a extino de radicais livres. Medidas via fotoemisso indicam que a capacidade de seqestro de oxignio singlet por parte de carotenos e xantofilas mxima para o licopeno, alta para astaxantina ou cantaxantina, intermediria para -caroteno ou bixina e menor para lutena e crocina.

A base da proteo conferida por carotenides contra reaes de fotossensibilizao repousa num mecanismo de transferncia de energia (physical quenching), que devolve o oxignio singlet a seu estado basal, facilmente mensurvel por espectroscopia de fotoemisso (atravs de near-infrared; 1270 nm)
1

Figura 1: Estrutura qumica de alguns carotenides

O2 + Car 3O2 + 3Car

somada capacidade que tem o carotenide triplet de dissipar a energia incorporada na forma de calor em favor do ambiente, retornando a seu estado original:
3

b) R-COO+carotenoR-COO-caroteno e, paralelamente, sob uma tenso adequada de oxignio, o curso das reaes se completa como abaixo: c) caroteno + O caroteno-O-O
2

Car Car+calor (energia trmica)

Particularmente malfica a gerao de radicais peroxil a partir da reao entre as ERO(s) e os lipdios insaturados da arquitetura da membrana celular: R-COOH + OHR-COO+ H O
2

d)caroteno-O-O+R-COOprodutos inativos Um indicativo do curso destas reaes o fenmeno de descolorao (bleaching) experimentado pela molcula de caroteno, diretamente mensurvel por espectrofotometria no visvel ou acoplando-se outras reaes cromognicas como, p.ex., para o dialdedo malnico (MDA) gerado no curso da peroxidao lipdica, pois o MDA facilmente detectvel com cido tiobarbitrico (TBA) resultando em produto corado em

Um carotenide pode atuar sobre estes radicais, segundo diferentes mecanismos de reao, resultando na extino do radical livre inicial peroxil segundo as reaes a ou b : a) R-COO+carotenoR-COOH+caroteno Figura 2: Espectro de absoro de carotenides quimiossintticos e microbianos

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Figura 3: Cromatografia em camada delgada de carotenides (TLC em cromatoplaca de slica gel 60 Merck) corrida com tolueno : acetato de etila : acetona (85 : 8 : 7), inicialmente fotografada para as cores naturais (A) e depois nebulizada com o reagente de p-anisaldedo : metanol : cido sulfrico (1 : 94 : 5) a quente (B) para revelao de todos componentes lipdicos. Amostras: OO=triolena; -C=beta-caroteno; C=Cantaxantina; A1 e A2=astaxantina; Pr e Pr=extratos organosolventes cru e purificado da levedura Xanthophyllomyces; m=mistura dos padres de astaxantina, cantaxantina e betacaroteno; Hp = extrato da alga Haematococcus (no encistada) CY = ster etlico do cido apocarotenico; B = extrato de urucum; P = extrato de pprica; S = extrato de aafro. (Notar, em B, a contaminao de gorduras neutras e fosfolipdios nas amostras Pr e P) rosa. A influncia do nmero de duplas ligaes conjugadas (incluindo-se as terminais das cabeas cclicas tipo ionona presentes no -caroteno, cantaxantina e astaxantina) na ao antioxidante e destruidora de radicais livres pode ser comparativamente medida utilizando-se um complexo do tipo heme-proteina-Fe2+ como gerador de radicais livres e TBA como sensor final. A astaxantina revela-se como o mais eficiente scavenger de radicais peroxil (dose efetiva mdia
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Figura 4: Cromatografia Lquida de Alta Resoluo (HPLC) em coluna Supelcosil LC-18 com solvente isocrtico acetonitrila : clorofrmio : metanol : gua (60 : 25 : 10 : 5, v/v/v) a 0,5 mL/min e presso de 650 psi. (Notar a dominncia de astaxantina e de -caroteno respectivamente nos extratos organosolventes da levedura X. dendrohous e do fungo P. blaskeleeanus) ou ED50= 0,2 M), seguida, em ordem decrescente de eficincia, por zeaxantina, cantaxantina, lutena, tunaxantina e -caroteno (ED50= 0,4 a 1,0 M) atuando o -tocoferol, como composto referencial, ainda menos eficientemente (ED50 = 3,0 M). Vrias outras reaes atestam a polivalncia reacional protetora dos carotenides, tais como a gerao de radicais ction (Car+) e sua dismutao (Car + Car2+), adio (Car-OOR ) e simples doao de hidrognio para inativar radical hidroxila. O on ferroso (Fe2+), ainda que essencial para a estruturao de cromoprotenas fundamentais no transporte de gases e eltrons (hemoglobina e mioglobina; citocromos), exerce eficiente catlise na decomposio da gua oxigenada, gerando ERO ainda mais danosa do que o prprio perxido: o radical hidroxila: Fe2+ + H2O2 + H+Fe
3+

cal livre relativamente estvel de forte colorao azulada e suficientemente solvel nos lcoois miscveis com gua (e.g., isopropanol 25%): (DPPH)+carotenide (DPPH):H+carotenideox sendo que mesmo uma soluo clorofrmica 0,5 mM de DPPH, num intervalo de 10 min, progressivamente descorada pela adio de igual volume de soluo isomilimolar de bixina. Alternativamente, construimos um ozonizador, no qual o O3 gerado numa cuba envoltria para aquela que contem a soluo de carotenide, propiciando o contato da atmosfera de gs oxidante e evitando a imerso dos eletrodos na cuba reacional central. Abaixo est esquematizada uma das possveis reaes iniciais entre carotenide e o oznio:

+ H2O + OH

Esta a clssica reao de Fenton, particularmente eficiente na degradao oxidativa de carboidratos.No curso das reaes de interao entre caroteno e radicais livres, vrios produtos do tipo epxido podem ser gerados (e.g.,5,6-epoxi-,-caroteno e o 5,6,5,6-diepoxi-,-caroteno). A ttulo de ensaios para acompanhar a eficincia comparativa de carotenides selecionamos, por um lado, a difenipicrilhidrazina (DPPH; um radi-

Por ao do arco gerador de oznio (3 kVolts), no interregno total de tempo de 25 minutos, a efincia de ozonlise foi maior com astaxantina (t1/2 = 6 min) do que com bixina (t1/2 = 14 min, amplificado para > 28 min quando a bixina pr-encapsulada em -ciclodextrina como capa protetora molecular). Nos animais, a concentrao de carotenides coloridos em determinados tecidos (pele, plumas, carapaa), alm da proteo anti-oxidante, inte-

diceto--caroteno), presente na levedura basidiomiceta rseo-alaranjada Xanthophyllomyces dendrorhous (antes Phaffia rhodozyma) e a cantaxantina (4,4-diceto--caroteno), pigmento das plumas do flamingo, do guar maranhense e do champignon Cantharellus cinnabarinus. Somente para o par astaxantina e cantaxantina, o mercado internacional alcanar, no ano 2000, a notvel cifra de US$ 150 milhes, dada sua crescente absoro pelas atividades industriais de aquicultura (fish farming) e avicultura. A via microbiolgica de produFigura 5: Avaliao de mercado em intervalos quinqeniais para a o de carotenides de interesse coproduo mundial por ano de astaxantina mais cantaxantina {grfico mercial, quando comparada contraa partir dos dados de K. L. Dean, Industrial Bioprocessing 14(5): 4-5 : parte oriunda de sntese qumica, o incremento da via biotecnolgica projetado para o ano 2000 em vem alcanando progressiva aceitarelao a 1996 de 100% comparativamente a 45% alcanado pela o expressa por uma duplicao do via quimiossinttica) porte de mercado a cada quinqunio (Figura 5). Conforme demonstrado gra a complexa rede de sinais de se. Diferentemente do -caroteno, uma pelo LQBB da UFPR (tese de doutocomunicao envolvidos na atrao, xantofila como a astaxantina (di-hi- rado da Profa. Tania M.B. Bonfim, coadvertncia e camuflagem. Como droxi-di-ceto--caroteno) interage forexemplo, no peixe Gastrosteus acule- temente com carreadoatus, a progressiva pigmentao ala- res naturais (carotenoproranjada do abdmen no macho indi- tenas) atravs de stios de ca para a fmea a aptido para o acomodao em certos doacasalamento, enquanto que, para mnios da molcula prooutros machos, sinal de advertncia tica para as cabeas pode defesa de uma base territorial. A larizadas (oxigenadas) do vitamina A ou retinol (derivado dire- pigmento. o caso da to do -caroteno mediante cisso e firme fixao da astaxantioxidao) est envolvida no proces- na na carne do salmo e so de viso, reproduo e desenvol- na carapaa de crustceos vimento normal da pele. Nos vege- como o camaro e a latais, concentrados nos cloroplastos, gosta. O binding e dissociao do os carotenides esto envolvidos na pigmento so acompanhados de efeiFigura 7: Crescimento (biomassa) captao e transferncia da energia to batocrmico: as carapaas frescas e pigmentao celular (astaxantiluminosa no processo de fotossnte- de crustceos nos parecem mais cinnognese da levedura basidiomiza-azuladas enquanto que, aps o ceta X. dendrorhous (antes P. rhocozimento, se tingem mais fortemente dozyma) cultivada em meio lquiem vermelho-rosado. do base de caldo de cana bruto Via alternativa de obteno: biotecnologia microbiana O -caroteno ou pr-vitamina A, como alternativa sntese qumica, pode ser obtido de cepas geneticamente melhoradas dos fungos filamentosos Blakeslea trispora e Phycomyces blaskeleeanus, um avano biotecnolgico obtido pelo grupo de E. Cerd-Olmedo, em Sevilha, na Espanha. Dentre os carotenides mais intensamente oxigenados destacamse a astaxantina (3,3-dihidroxi-4,4diludo a 1:10 e suplementado com concentraes crescentes de uria, durante 5 dias a 26oC e 100 rpm de agitao. { Dada a forte associao do carotenide com as clulas, estas, aps liofilizao, foram embebidas com dimetilsulfxido (DMSO) por h e, em seguida, extradas com acetona, seguida de uma mistura de clorofrmio : metanol 2:1 para fins de quantificao espectrofotomtrica dos pigmentos carotenides }
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Figura 6: Trs modelos de microorganismos carotenognicos. (Esq.) cultivo em placa (caldo de cana + uria) da levedura P. rhodozyma, hoje X. dendrorhous (acima) e de uma bactria carotenognica do solo (abaixo). (Dir.) microfotografia tica de um cisto pigmentado da alga H. pluvialis

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Figura 8: Esquema da complexao entre -ciclodextrina e do ster etlico do cido apocarotenico, um aditivo para raes destinadas alimentao de frangos e ao reforo da pigmentao da carne e ovos orientada pela Profa. Miriam B. Chociai; 1999), a levedura Xanthophyllomyces (Figura 6) pode ser cmoda e economicamente cultivada para a produo de astaxantina em caldo de cana bruto e uria (Figura 7) ou em bagao de cana hidrolisado. Mesmo a vinhaa, um subproduto poluidor da indstria sucroalcooleira, tem um efeito benfico no incremento da biossntese de astaxantina. Nos cultivos adicionados de 0,1 a 0,5 mL% de vinhaa, o teor de astaxantina, em g / g clulas, aumenta de 120 (caldo de cana no suplementado) para 420. A possvel explicao a presena de mevalonato no vinhoto, um precursor natural de carotenides. Estes procedimentos biotecnolgicos tiram vantagem de duas enzimas-chaves abundantes na levedura, a invertase e a urease, e tambm da excepcional habilidade bioqumica desta levedura, qual seja, a capacidade de fermentao de vrios dissacardeos presentes ou derivados de biomassa, tais como lactose, celobiose, xilobiose e maltose. Outro resultado relevante encontrado no LQBB-UFPR foi o incremento ainda maior da astaxantinognese quando o caldo de cana suplementado com pequeno teor (< 0,1g%) de gruposchaves de aminocidos glicognicos ou cetognicos. Em relao suplementao com 0,1% de uria + fosfato de sdio, as misturas de aminocidos vali44 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

na / treonina / metionina / leucina ou de tirosina / triptofano / cistena propiciam pigmentao carotenide 10% ou 50% superiores, respectivamente. Noutra simplificao experimental, 0,1g% de glutamato (e.g., molhos do tipo Shoyu) resultou em pigmentao equivalente obtida com a mistura 0,1% de extrato de levedura + extrato de malte, dois insumos de custo elevado para fermentaes industriais. Tambm como alternativa vlida para substituir a proteose / peptona como fonte de N (suplemento caro) consolidamos a farinha de soja ou aparas de couro (subproduto de curtume, de baixssimo custo). Interessante ressaltar que tais aparas, a exemplo de outros resduos colagenosos, so ricas em glicina (ca. 30%), um aminocido exclusivamente glicognico. Como derradeira alternativa para suprir nitrognio levedura foi tambm empregada a milhocina (CSL = Corn Steep Liquor), um subproduto do processamento do milho contendo 40% de slidos totais e correspondendo gua de lavagem e embebio dos gros quando do fracionamento em amido e germe (leo). Em relao ao caldo de cana no suplementado, a milhocina pode duplicar ou triplicar o teor da carotenodes totais se adicionada na base de 0,1 ou 0,2mL%. Para contemplar, num pas que colhe > 200 milhes de toneladas de cana de acar por ano-colheita, uma viso biotecnolgica integral do emprego desta agrocommodity, bagao de cana (125 kg de peso seco por ton de cana fresca; alto excedente nas usinas de aucar) foi separado em cerne e casca previamente hidrolisados com enzimas celulolticas comerciais (CelluclastR). Os

acares simples derivados da celulose e hemicelulose (glucose, celobiose; xilose, xilobiose), foram utilizados como fonte de C alternativa sacarose do caldo de cana. A casca resultou em padro de pigmentao levemente superior ao miolo do bagao e ambos os resultados foram similares aos obtidos com o caldo. Final e curiosamente, o acar mascavo (cristais de castanho a marrom, obtidos na coco e concentrao do caldo de cana nativo), na mesma concentrao, resulta em produo de astaxantina cerca de 20% superior em relao ao caldo de cana nativo que lhe d origem. O melao de cana (gua-me da cristalizao da sacarose) igualmente se presta ao cultivo e pigmentao de Xanthophyllomyces. Outros microrganismos passveis de explorao para astaxantina so a alga clorofcea unicelular Haematococcus pluvialis (figura 6dir.) e a bactria marinha Agrobacterium aurantiacum. Na alga, tratamos de induzir o encistamento, pois, nesta fase, onde dispara a biossntese de astaxantina. Valorizao biotecnolgica Como regra geral, os carotenides so lipossolveis. No plasma de mamferos so transportados em associao s lipoprotenas. Excepcionalmente adquirem alguma hidrossolubilidade como resultado de processos oxidativos ou derivatizaes naturais como no caso da norbixina do urucum (ambas funes carboxilas terminais demetiladas) e dos carotenides sulfatados de organismos marinhos. Do ponto de vista biotecnolgico, a obteno de derivados hidrossolveis de carotenides uma interessantssima perspectiva comercial e no LQBBUFPR tais complexos tm sido obtidos por meio do encapsulamento em , ou -ciclodextrinas (Figura 8) ou seja hexa, hepta ou octa-maltossacardios cclicos derivados do amido que ainda podem ser modificadas quimicamente (metilao, hidroxipropilao) para incremento de propriedades como a hidrossolubilidade e capacidade de captao de substncias lipoflicas de interesse farmacolgico, cosmtico ou culinrio. Em nossa experincia, a RAMEB (Random Methylated -CycloDextrin) e a HP-CD (HydroxyPropyl--CycloDextrin) tm se revelado as estruturas mais aptas

Figura 9: Hidrossolubilidade do ster etlico do cido apocarotenico induzida pela complexao com -ciclodextrina. (A) o carotenide insolvel em gua; (B) soluo de -ciclodextrina; (C) complexo hidrossolvel carotenide / ciclodextrina

na captao oclusiva de pigmentos carotenides de interesse mdico-farmacutico. Nas figuras 8 e 9 representa-se o fenmeno do encapsulamento e a conseqncia desejvel: formulaes caracterizadas pela hidrossolubilidade e que, absorvidas a partir da dieta, podem, lenta e progressivamente, liberar o pigmento dentro do organismo consumidor. A estratgia de encapsulamento, alm da liberao modulada do princpio carotenide retido na cavidade funcional da ciclodextrina, propicia mecanismo protetor de alta eficincia justamente contra os fatores ambientais que so altamente destrutveis estrutura nativa e livre dos carotenos: vapores cidos ou oxidantes, luz, calor e oxignio. A combinao destes fatores leva, indubitavelmente, gerao de alteraes estruturais, as quais, no obstante a manuteno da cor (ainda que alterada) podem no mais responder pela propriedade biolgica otimizada desejada. Na figura 10 esto nossos dados quanto estabilidade da bixina de urucum frente a diferentes ambientes fsicos: a combinao oxignio (ar) e luz a mais deletria. O urucum uma fonte fitofarmacutica cujo plantio e explorao experimenta crescimento no pas e, para alguns preparados comerciais (anatto), atribui-se tambm uma ao hiperglicemiante. No Brasil, uma iniciativa de produo de ciclodextrinas acha-se em avano no grupo de Engenharia Qumica da FUEM (Maring, PR), o que pode viabilizar uma indstria nacional de novos biofrmacos, j que a matria-prima (amido de mandioca) intensamente cultivada nesta zona geogrfica. Como o projeto de pesquisa aplicada que est sendo desenvolvido no LQBBUFPR pretende o domnio de uma vertente biotecnolgica que contemple, alm do pleno uso de cana-de-acar, tambm uma aplicao completa da biomassa celular de Xanthophyllomyces, foi avaliada a qualidade nutricional da protena unicelular (SCP = Single Cell Protein) da levedura. Os valores encontrados para 17 aminocidos foram similares aos obtidos com o levedo de panificao ou cervejaria (Saccharomyces), exceto pelo teor um pouco inferior de metionina (1.5 versus 2.2%), mas nossa anlise no incluiu o

lular da levedura, facilitando ou incrementando o acesso ao pigmento intracelular para os animais alimentados com a mesma. Agradecimentos O primeiro autor agradece a colaborao da Hoffmann - La Roche (Antnio R. Chagas Lima) pela doao das amostras de carotenides quimiossintticos da srie Carophyll, da CYCLOLAB (Drs. J. Szejtli e L. Szente; Budapest, Hungria) e da CERESTAR (Dr. R. Beck, Vilvoorde, Blgica) pela proviso das ciclodextrinas. A colaborao pregressa da Profa. Dra. M. Baron (vice-coordenadora do projeto PADCT-SBIO/CNPq) e das Profas. Dras. T.M.B.Bonfim e M.B.Chociai (Departamento de Farmcia) foi importante no produtivo encaminhamento do projeto. Referncias Bibliogrficas (ordem de abordagem neste texto) T. LATSCHA Carotenoids their nature and significance in animal feeds, Department of Animal Nutrition and Health, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland, 1990. G. BRITTON, S.LIAAEN-JENSEN & H. PFANDER Carotenoids: isolation and analysis, vol. 1-A, Birkhauser Verlag, Berlin, Germany, 1995. J.D. FONTANA, M.F. GUIMARES, N.T. MARTINS, C.A. FONTANA & M. BARON Culture of the astaxanthinogenic yeast Phaffia rhodozyma in lowcost media. Appl. Biochem. Biotechnol., 57/58, 413-422, 1996 J.D. FONTANA & M. BARON Lowcost media save in astaxanthin production Industrial Bioprocessing, vol. 18(9), p. 1, 8 & 9, 1996. L. Parker (ed) Carotenoids, Part A: Chemistry, Separation, Quantitation, and Antioxidation Methods in Enzymology, vol. 213, 538p, 1992. B. HALLIWELL & J.M.C. Gutteridge Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press, 3rd ed., London, 1996. J. SZEJTLI Cyclodextrin Technology, Kluwer Acd. Publ., Dordrecht, The Netherlands, 437p., 1988.
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Figura 10: Influncia do ambiente fsico na degradao da bixina. Amostras de soluo clorofrmica de bixina foram separadamente submetidas s condies fsicas explicitadas na figura e as respectivas anlises espectrais no campo do visvel executadas ao 6 dia de experimentao. {Na exposio cumulativa e mais adversa (luz + O2) cerca de 40% da bixina sofreu degradao}

teor especifico de cisteina, o outro aminocido sulfurado. Todos os 8 aminocidos essenciais (no sintetizados pelo homem) mais os 2 semiessenciais (biossintetizados aqum da necessidade diria) esto presentes nos hidrolisados da proteina de Xanthophyllomyces. Cromatografias preliminares (revelao com vapores de iodo, confirmando os perfis das amostras Pr versus OO da Fig. 3-B) indicam que a matria lipdica principal da levedura (TAG = triacilgliceris e PL = fosfolipdios) predominantemente insaturada, outro ponto favorvel para o emprego da levedura integral na formulao de raes animais para aquacultura e avicultura ou de neo-alimentos para consumo humano. Prosseguem no LQBB, como etapas sendo desenvolvidas e a vencer, dois desafios: a) obteno de mutante de Xanthophyllomyces estvel e hiperprodutora de astaxantina (e.g., via mutagenizao com nitroso-compostos) e b) co-emprego de enzima ou complexo hidroltico que rompa ou permeabilize a parede ce-