Mejora gentica del girasol Helianthus annuus L. para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib.

de Bary

M ngeles del Castillo Alonso Avances en Mejora Gentica Vegetal Doctorado Ecosistemas Agrcolas Sostenibles

ndice
Introduccin Consecuencias de la podredumbre blanca en el cultivo del girasol Procesos de resistencia inducidos en la planta por el ataque del hongo Fundamentos de la mejora gentica de Helianthus annuus L. para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary Mejora gentica clsica Mejora gentica moderna Dcada de los noventa Primera dcada siglo XXI Ao 2012 Hbridos de girasol comercializados actualmente con resistencia parcial a S. sclerotiorum Conclusiones Referencias

Introduccin Consecuencias de la podredumbre blanca en el cultivo mundial del girasol El girasol (Helianthus annuus L.) es uno de los cultivos oleaginosos ms importantes y por tanto ampliamente cultivado en todo el mundo. La extensin dedicada a este cultivo llega a sobrepasar los 23 millones de hectreas mundiales (http://www.fao.org/), siendo su produccin anual 32 millones de toneladas. El girasol es por tanto, la cuarta fuente mundial de aceites vegetales (http://www.fas.usda.gov/). Su domesticacin se origin en el centro-este de Estados Unidos, hace aproximadamente 4000 aos (Crites 1993; Harter et al., 2004; Smith y Yarnell, 2009). En un primer momento tena inters como fuente de semillas comestibles, as como por una variedad de fines no alimentarios (como colorante o fines ceremoniales) (Soleri y Cleveland, 1993). El uso del girasol como cultivo productor de aceite es un desarrollo ms reciente que data del siglo XVIII en Europa del Este. A travs de los aos, la mejora en su cra se dirige al rendimiento en aceite. El germoplasma constituy la base de la reserva gentica de semillas oleaginosas moderna y fue la causa de su retorno a Amrica del Norte, donde la produccin comercial comenz en la segunda mitad del siglo XX. En los ltimos aos, las lneas de hbridos de semillas oleaginosas han representado entre el 80-85% de la produccin de girasol en Estados Unidos, siendo el destino del resto el consumo como fruto seco. El moho blanco provocado por el hongo Sclerotinia sclerotiorum es uno de los patgenos ms devastador y cosmopolita de los cultivos que adems, persiste durante aos en el suelo, lo que hace su tratamiento mucho ms complicado. Afecta a ms de 400 especies distintas de plantas entre ellas, el girasol. La podredumbre blanca causada por Sclerotinia sclerotiorum provoca limitaciones muy importantes en cuanto al rendimiento del cultivo en las regiones templadas de todo el mundo. Este hongo puede atacar a muchas partes distintas de la planta, siendo las ms importantes en cuanto a disminucin de produccin, la pudricin del tallo y fundamentalmente la pudricin del captulo (Gulya et al., 1997). Su infeccin provoca el secado rpido de las hojas y el desarrollo de lesiones en las races primarias y en la parte basal del tallo derivando a la muerte pocos das despus de la aparicin del marchitamiento (Dorrel y Huang, 1978). Las prdidas de rendimiento estn entre un 10 y un 20% aunque pueden llegar incluso al 100% cuando las condiciones climticas son las ptimas para el desarrollo del hongo patgeno (Sackston, 1992). En Irn, por ejemplo, las infecciones provocadas por S. sclerotiorum se consideran una amenaza potencial para el cultivo de girasol. El control qumico es posible pero es muy difcil, debido a la enorme persistencia de este hongo en el suelo, siendo esta medida por lo tanto, no muy viable. El desarrollo de variedades resistentes se convierte as, en un objetivo fundamental. A da de hoy se han conseguido bastantes genotipos de Helianthus annuus L con diferentes grados de resistencia a S. sclerotiorum que se encuentran disponibles en el mercado, pero todava no hay ninguno con una resistencia total (Davar et al., 2010) (Hahn, 2002) siendo ste un objetivo primordial en el campo de la mejora actual en el cultivo del girasol.

Procesos de resistencia inducidos en la planta por el ataque del hongo Una vez que se ha inducido un contacto entre el husped y el patgeno, los inductores producidos y liberados por el mismo, inducen las defensas adicionales del husped. stas comprenden desde el refuerzo de las paredes celulares hasta la produccin de fitoalexinas y la sntesis de protenas relacionadas con dicha defensa (Slusarenko et al., 2000). Los genes relacionados con la defensa se activan para la sntesis de gran variedad de protenas, incluyendo enzimas que controlan el metabolismo secundario, protenas relacionadas con la patognesis (PR) y protenas reguladoras que controlan la expresin de los genes relacionados con la defensa (Dixon et al., 1994). La respuesta inducida por la planta a las enfermedades se correlaciona perfectamente con la acumulacin de protenas PR. stas estn relacionadas con la degradacin de la pared celular causando la lisis de la clula fngica. La quitina y el glucano que son oligmeros liberados durante la degradacin de la pared celular del hongo, actan como elicitores que provocan diversos mecanismos de defensa en las plantas (Frindlender et al., 1993). Las protenas PR se localizan en zonas extracelulares. Cuando los microorganismos patgenos invaden al husped inicialmente se multiplican en los espacios intercelulares de las clulas de la planta. Por lo tanto la acumulacin de estas protenas antimicrobianas en el espacio intercelular es imprescindible para inhibir la accin del patgeno. La induccin y la acumulacin de protenas de defensa solubles hace que la planta sea resistente a la invasin de patgenos (Van Loon, 1997) correlacionndose con la defensa dicha invasin en numerosos cultivos tales como: pepino (Rasmussen, 1991), tabaco (Beaudoin-Eagan y Thorpe, 1985) o tomate (Bashan et al., 1985). Fundamentos de la mejora gentica de Helianthus annuus L para la resistencia a Sclerotinia sclerotiorum Lib. de Bary Mejora gentica clsica:

Helianthus annuus L. es una especie diploide con un tamao de genoma estimado de unos 3,6 billones de bp y 17 pares de cromosomas (2n = 34) (Arumuganathan y Earle, 1991). La resistencia segn Agrios (1988) es la capacidad de un organismo para excluir o superar, completamente o de manera parcial, el efecto perjudicial de un patgeno. Existen as, dos tipos generales de resistencia a la enfermedad (Plank, 1968): (i) una resistencia completa, condicionada por genes mayores y (ii) una resistencia incompleta, condicionada por genes mltiples, cada uno con un efecto parcial. Una limitacin de los genes mltiples de la resistencia, es la falta de durabilidad ya que sta se puede ver modificada por un cambio en la poblacin del patgeno (Talukder et al, 2004). Debera ser posible extender as, la durabilidad de los principales genes a los mltiples genes (Hittalmani et al, 2000) con el fin de conseguir variedades con resistencia duradera. En definitiva, la resistencia de genes menores o parcial reduce el crecimiento y reproduccin del patgeno pero no activan la reaccin hipersensible que es indicativa de la incompatibilidad conferida por los genes mayores de resistencia. La resistencia parcial involucra muchos genes, cada uno de ellos individualmente hace una contribucin relativamente pequea a la resistencia global. Dado que la resistencia se puede medir cuantitativamente, estos genes se conocen como

caracteres de resistencia cuantitativos, y los loci genticos asociados con ellos se llaman loci cuantitativos de resistencia (QTL) (Young, 1996). La herencia cuantitativa a menudo resulta de la segregacin de los mltiples factores genticos, y estos caracteres polignicos estn fuertemente influenciados por las condiciones ambientales (Kearsey y Pooni, 1996). Se han realizado muchos estudios en el girasol para determinar los QTL que determinan otras caractersticas agronmicas y de desarrollo muy importantes tales como: das de floracin y la respuesta de fotoperodo (Len et al., 2001), embriognesis somtica (Flores Berrios et al., 2000), Phoma macdonaldii (Rachid al-Chaarani et al., 2002; Bert et al., 2004), mildiu (Plasmopara halstedii) (Rachid al-Chaarani et al., 2002). Aunque se han propuesto a lo largo de los aos diferentes procedimientos de control para limitar el dao de Sclerotinia sclerotiorum, la ms alentadora es la siembra directa de cultivares genticamente resistentes que disminuyen el riesgo de epidemias. Actualmente existen muchos programas pblicos y privados para la resistencia a la pudricin blanca en todo el mundo. La base de dichos programas est en el uso de infecciones artificiales tanto para evaluar lneas endogmicas e hbridos y seleccionar tanto plantas individuales como familias en generaciones segregantes ya que el ataque de S. sclerotiorum como se acaba de mencionar, est fuertemente relacionado con las condiciones ambientales. Una de las pruebas con S. sclerotiorum que se empleaba en los programas de mejora clsica era la inoculacin del patgeno con ascosporas del hongo sobre captulos secos de girasol para la evaluacin la resistencia a la enfermedad en campo. Aos ms tarde y con el fin de agilizar los procesos de seleccin, se sugiri la posibilidad de aplicar una prueba con micelio adems de con ascosporas ya que la respuesta del captulo a estas pruebas, se hereda de forma independiente (Castao, 1992). Si la seleccin de planta se puede realizar de acuerdo con los resultados a estas dos pruebas, se podan combinar los genes para la resistencia a la pudricin blanca en captulos. Por desgracia este programa de cra no era muy viable debido al requerimiento de demasiado tiempo ya que dichas pruebas tenan que ser aplicadas individualmente en cada estacin experimental, duplicndose el nmero de aos por ciclo de seleccin. Fue necesario entonces, desarrollar una nueva estrategia que incluyera la seleccin simultnea de ambas pruebas de resistencia. El primer paso fue obtener una fuente de variabilidad gentica del rasgo en estudio, la resistencia a la pudricin blanca. Los criadores de girasol utilizaban una amplia gama de recursos de germoplasma en sus programas de mejora. El tipo ms comn de poblacin era el cruzamiento endogmico (Fick y Miller, 1997). La poblacin obtenida deba ser caracterizada genticamente con el fin de determinar los parmetros genticos que permitan a los mejoradores seleccionar la metodologa ms eficiente para mejorar las caractersticas seleccionadas y desarrollar lneas que combinaran los rasgos deseables. Los estudios preliminares (Castao et al., 1989) estudiaron la eficiencia de la seleccin simultnea para la resistencia a varias formas de infecciones por S. sclerotiorum aplicado en la misma estacin en diferentes lneas endogmicas. La respuesta de plantas infectadas por una combinacin de ambas pruebas aplicados durante la floracin y madurez fisiolgica, respectivamente, mostraron que no haba diferencia entre la aplicacin de ambas pruebas de forma simultnea o correlativa.

De todos modos fueron necesarios estudios genticos para la determinacin de la herencia ante esta nueva estrategia de seleccin a travs de combinados de dos pruebas distintas. Para estos estudios se emplearon dos lneas puras, CD y SD, descrita por Castao et al. (1993), se utilizaron como padres en el estudio. La lnea CD fue seleccionada de la lnea endogmica USDA HA 89, y la lnea de SD fue generado a partir de la variedad hbrida de edad INRA 6501. Estas lneas endogmicas se eligieron de acuerdo a sus diferentes orgenes genticos y sus diferentes respuestas a S. sclerotiorum en infecciones del captulo. La lnea CD tiene un nivel de resistencia menor que la lnea SD (Castao et al., 1989). Se lleg a la conclusin de que este tipo de estrategia poda resultar ventajosa ya que reduce significativamente el tiempo necesario para la seleccin de poblaciones con mayor resistencia al ataque de S. sclerotiorum. Se lleg a la conclusin adems en varios estudios realizados de estos tests, que el retrocruzamiento entre SD x (CD x SD) produca ms cantidad de compuestos fenlicos, dando un mayor nivel de resistencia a S. sclerotiorum. Es desde este momento y hasta la nueva generacin de estrategias genticas en la primera dcada del siglo XXI, que se emplearon estos tipos de tests para la determinacin de genotipos que incorporaban genes de resistencia a la podredumbre blanca. Mejora gentica moderna:

Dcada de los noventa La cra hasta este momento se basaba en tests de resistencia con infecciones artificiales simulando condiciones semi-naturales de ataque. Tal y como se vena haciendo tradicionalmente. Como ya dijimos anteriormente, dichas pruebas, aunque son combinadas entre micelio y ascosporas, acortndose el tiempo requerido, siguen siendo muy costosas y dependientes de las condiciones ambientales. Por lo tanto, surge la hiptesis de que sera muy til encontrar marcadores de resistencia que hicieran posible reducir el nmero de pruebas necesarias y aumentar la eficiencia de las llevadas a cabo. En esta dcada se produce el esplendor de tcnicas relacionadas con RFLPS y marcadores isoenzimticos que se utilizaron para investigar loci de caracteres cuantitativos involucrados en la resistencia a la extensin del micelio de S. sclerotiorum, tanto en hojas como en captulos. Se demostr (Mestries E. et al., 1998) que existen cuatro loci de caracteres cuantitativos para la resistencia en hoja y dos para la resistencia en captulo. Adems una de estas zonas pareca participar en la resistencia a ambos tipos de ataque de S. sclerotiorum mientras que las otras parecan especficas de la resistencia slo de una parte de la planta. El carcter cuantitativo de los loci de forma individual explicaba entre un 9% y un 48% de la variabilidad fenotpica aparecida, por lo que se confirmaba que hay una base polignica de dichos rasgos cuantitativos. Los loci de rasgos cuantitativos explicaban el 60% de la variacin gentica para la resistencia de la hoja y 38% para el captulo. Comprobaron adems que caracteres como el peso de la semilla, el contenido en aceite de la misma y la floracin de la planta tenan una relacin ms que directa con la resistencia a S. sclerotiorum puesto que se detect un grupo de enlace que inclua los loci de los cinco caracteres cuantitativos medidos: dos de resistencia y tres sobre caractersticas ajenas a dicha resistencia.

Por lo tanto la hiptesis de una vinculacin pleiotrpica puede dar la explicacin de la relacin existente entre esos caracteres y la resistencia a la podredumbre blanca. Sabiendo que la resistencia a S. sclerotiorum es polignica y de un genotipo dado, el nivel de resistencia de cada parte de la planta puede ser y es muy diferente (Wendel J., Weeden M., 1989). Es por tanto necesario considerar cada forma de ataque como una enfermedad diferente para mejorar simultneamente la resistencia de cada parte de la planta a fin de obtener variedades con un nivel satisfactorio de resistencia general. Adems, el conocimiento acerca de los marcadores de resistencia a S. sclerotiorum (QTL) comienza a proporcionar informacin sobre el nmero de segmentos cromosmicos involucrados en dicha resistencia. Existen dos tipos de resistencia en girasol en funcin del grado de penetracin del patgeno en el husped: (i) la primera a la penetracin del hongo dentro de la planta y la segunda resistencia (ii) a la extensin del micelio por los tejidos de la planta. Basndose en el mapa de ligamiento consensuado desarrollado en 1995 (Gentzbittel L. et al. 1995) se pudieron detectar los QTL asociados con el ltimo tipo de resistencia, en particular en hojas y captulo, usando isoenzimas y RFLPs (Mestries E., Gentzbittel L. et al., 1998). El anlisis con RFLPs se bas en la eleccin de 73 sondas distintas que se utilizaron en la creacin del mapa de ligamiento de 1995, tanto por su polimorfismo entre lneas parentales como por su distribucin a lo largo del genoma. El procedimiento que se sigui fue la extraccin de ADN, su digestin por enzimas de restriccin (EcoRI, HindI, BgIII y EcoRV) y por ltimo la hibridacin de Southern blot. Se analizaron 82 marcadores que formaron 18 grupos de ligamiento. Se observ que hay una muy alta significacin entre los caracteres fecha de floracin y peso de la semilla con la reaccin a S. sclerotiorum tanto de la hoja como del captulo.

Tabla 1. Coeficientes de Pearson de correlacin fenotpica entre los cinco caracteres cuantitativos observados en la progenie del girasol (GH x PAC2).

En la tabla 2 se muestra que todos los marcadores enumerados son codominantes. Para la reaccin al test de resistencia en hoja, el QTL detectado fue ubicado en diferentes grupos de ligamiento dependiendo de la generacin. As en F2 se encuentra en el grupo A, en F3 en los grupos G y P y en la F4 en el grupo I. Dicha variacin podra tener relacin con la variacin ambiental (condiciones climticas) ya que las tres generaciones se hicieron crecer en tres aos diferentes mientras que la prueba del captulo se realiz en cmara de crecimiento en condiciones estndar. Es por esto que en la reaccin en el captulo hay mucha mejor correspondencia entre generaciones, con los mismos QTLS identificados en los grupos de ligamiento A y M. El alelo favorable fue siempre el paterno PAC2 en contraste con la hoja que en la F2 y F4 es el mismo, pero en la F3 vara siendo el del progenitor materno susceptible.

Tabla 2. Localizacin y efecto del QTL que afecta a los cinco caracteres cuantitativos de la progenie del girasol (GH x PAC2).

En la figura nmero 1 se muestra el mapa de los grupos de ligamiento con la posicin relativa de los QTL detectados. Se puede observar cmo forman grupos QTL relacionados con la resistencia a S. sclerotiorum y QTL relacionados con otros caracteres como el peso de la semilla, el contenido en aceite y la fecha de floracin (para el grupo de ligamiento A). Hay que tener en cuenta que el hecho de que el mapa gentico empleado incluya muchos marcadores dominantes puede conducir a un resultado impreciso de localizacin de QTL, tanto en el nmero de los mismos como en su importancia relativa, especialmente para aquellos con efectos aditivos. Fue de inters por tanto incrementar la densidad del mapa con marcadores codominantes con el fin de mejorar la cobertura del genoma de girasol y as poder detectar con mayor precisin los QTL. De todos modos fueron demostrados 4 QTL para las tres generaciones estudiadas en cuanto a la resistencia de la hoja y del captulo a S. sclerotiorum. El grupo de ligamiento A comprende una zona implicada en ambos tipos de resistencia. Mientras que hay otras zonas en los grupos G, I y P que parecen ser especficos para la resistencia de una parte concreta de la planta, la hoja siendo un locus en el grupo M especfico para el captulo. Adems slo el 40% de la variacin fenotpica para la resistencia se explica por los QTL detectados por lo tanto, casi el 50% de dicha variacin es una incgnita a da de hoy. Estos resultados adems han informado de la resistencia al mildiu velloso en mijo (Jones ES., Liu CJ. Et al., 1995) y para el rendimiento del grano de maz (Veldboom LR, Lee M, Woodman WL, 1994). En conclusin diremos que estos estudios de la dcada de los noventa confirmaron la compleja naturaleza de la resistencia a S. sclerotiorum en girasol e indicaba que la identificacin de QTL involucrados en este carcter es posible en genotipos de girasol cultivados hasta ese momento. Se detectaron cinco zonas genmicas implicadas en la resistencia a la extensin del micelio del hongo en los tejidos de las plantas. Algunos se presentan comunes tanto en la hoja como en el captulo, mientras que otros son especficos para la resistencia en partes concretas de la planta. Este estudio mostraba, en definitiva, que las mediciones de otros caracteres cuantitativos (peso de la semilla, fecha de floracin y contenido en aceite) son particularmente importantes con el fin de determinar el QTL para la resistencia a S. sclerotiorum que se podra seleccionar en combinacin con otras caractersticas agronmicas favorables, consiguiendo variedades comerciales que incorporaran mejoras de resistencia a la vez de mejoras en caracteres muy importantes desde el punto de vista de calidad. Primera dcada siglo XXI Conforme las tcnicas de deteccin y procesamiento de datos fueron evolucionando, se publicaron sucesivos artculos con nuevas visiones sobre la resistencia a S. sclerotiorum que muestra el girasol. El reciente desarrollo de nuevos marcadores moleculares ha sido un factor importante en el establecimiento de densos mapas moleculares. Las especies con un gran genoma, como es el caso del girasol (2n =34), necesitan tcnicas con un gran nmero de dichos marcadores. Surge la aplicacin de AFLP como una tcnica poderosa para la identificacin gentica del girasol. De la misma manera se comienzan a utilizar los SSR como otro marcador cuyos polimorfismos son muy eficaces en la cartografa gentica, en estudios evolutivos, huellas dactilares y anlisis de pedigr (Paniego et al., 2002; Tang et al., 2003). stas son por tanto herramientas muy eficaces para el estudio de la resistencia a enfermedades genticamente complejas, como la resistencia parcial que nos ocupa.

Figura 1. Mapa de los grupos de ligamiento para la progenie de girasol (GH x PAC2).

Nos referimos por tanto a un nuevo mapeo de QTL relacionados con dicha resistencia (Davar R, Darvishzadeh R. et al., 2010) en el que se cartografan 7 QTL localizados en 7 grupos de ligamiento que confirman el control polignico del que se sospechaba en 1995. En este estudio se emplean microsatlites (SSR) y AFLPs, tcnicas mucho ms novedosas que las empleadas en la dcada de los noventa. Se utilizan 116 lneas endogmicas recombinantes organizndose completamente al azar con 6 repeticiones. Se establecen dos candidatos adecuados LG8 y LG16, para poder desarrollar marcadores moleculares para la resistencia a S. sclerotiorum que nos sirvan para una posterior seleccin asistida por marcadores moleculares (MAS) base de la mejora del girasol para este carcter. La poblacin de RILs fue desarrollado por descendencia de una sola semilla de un cruce entre las lneas parentales de girasol PAC2 y RHA266. RHA266 se obtuvo a partir de un cruce enre Helianthus annuus y Peredovik por el USDA, mientras que PAC2 proviene de un cruce entre H. petiolaris y HA61 desarrollado por el INRA de Francia (Gentzbittel et al., 1995). Esta poblacin ha sido muy empleada para el anlisis gentico de rasgos complejos en girasol (Rachid al-Chaarani et al., 2004; 2005; Abou Al Fadil et al., 2007; Darvishzadeh et al., 2007; Poormohammad Kiani et al., 2007; 208;2009). Cada grupo de ligamiento se enumera de acuerdo con el mapa de referencia de girasol actualmente considerado como el ms detallado (Tang et al., 2002) tal y como se muestra en la figura nmero 2.

Figura 2. Grupos de ligamiento derivados del cruce entre (cmsHA89) x (H. annuus var. Annuus) mapeo de la poblacin en F3.

Figura 2. Grupos de ligamiento derivados del cruce entre (cmsHA89) x (H. annuus var. Annuus) mapeo de la poblacin en F3. (CONTINUACIN).

Se presume que corresponden a uno de los 17 cromosomas del genoma haploide del girasol (n=17). El mapa mejorado incluye como ampliacin de ste, 157 marcadores nuevos SSR que determinan la resistencia a S. sclerotiorum tal y como se muestra en la figura nmero 3 incorporando los nuevos QTLs. En la tabla 3 se definen dichos QTLs para la resistencia a S. sclerotiorum. El anlisis revel 7 QTLs localizados en 7 grupos de ligamiento 1, 2, 4, 6, 8, 14 y 17. Todos los QTLs detectados se encuentran en grupos diferentes. La varianza fenotpica explicada por cada QTL vara de un 5% a un 8%. Como muestra el signo del efecto aditivo, la

resistencia parcial a S. sclerotiorum proviene en unos casos el alelo correspondiente a la lnea materna (PAC2) y en otros a la lnea paterna (RHA266).

Figura 3. Grupos de ligamiento del genoma del girasol presentando los QTLs para la resistencia parcial a Sclerotinia sclerotiorum.

Tabla 3. QTLs que confieren resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en RILs de girasol.

Los RILS estudiados tenan una gran variacin gentica para la resistencia parcial a S. sclerotiorum lo que indica que hay una gran potencial para aumentar la resistencia a dicha enfermedad. La susceptibilidad a la podredumbre muestra un patrn continuo, lo que reafirma la teora de que esta resistencia est controlada

por un sistema polignico. Algunos RILS sufrieron una enfermedad menos grave que sus padres, pero otros producen mayor gravedad de la enfermedad que stos, lo que sugiere que la segregacin transgresiva de la resistencia se produjo en este cruzamiento. El signo de los efectos de los genes demostr que ambas lneas parentales contribuyen a la resistencia a este patgeno. Como comentamos en la mejora gentica de los noventa Mestries et al., 1998 analiz QTLS asociados a la resistencia en girasol a S. sclerotiorum encontrando una segregacin transgresiva para este carcter. Esto sugiere que cada padre posee alelos de resistencia y susceptibilidad para los loci que controlan este carcter. El padre resistente probablemente posee alelos de susceptibilidad para loci implicados en este rasgo, ya que las transgresiones se produjeron hacia una mayor susceptibilidad. Todo esto nos muestra que la seleccin fenotpica convencional para este carcter es una tarea muy compleja y que por tanto la seleccin asistida por marcadores (MAS), es una herramienta eficaz en los futuros programas de mejora. Sin embargo, los QTLS y marcadores relacionados deben ser validados antes de su aplicacin en MAS. Algunos MAS ya han sido reportados con xito en programas de mejoramiento de arroz (Cho et al., 1994) utilizando marcadores moleculares para seleccionar para el carcter semienano, o (Wang et al., 2005) que descubri 3 QTLS con grandes efectos sobre la fertilidad de la espiguilla. Hasta el momento, varios son los estudios que se han realizado ya para QTL que controlan la resistencia parcial del girasol a S. sclerotiorum algunos (Mestries et al., 1998; Bert et al., 2002; Micic et al, 2004; Rnicke et al, 2005). Sin embargo, la falta de marcadores SSR y la nomenclatura comn en los mapas de ligamiento hace muy difcil comparar estudios como (Davar R et al., 2010) con otros tales como (Mestries et al., 1998). En definitiva, la seleccin asistida por marcadores (MAS) para la resistencia a S. sclerotiorum, an no es posible debido a la falta de marcadores moleculares efectivos. Son necesarios ms estudios para desarrollar tales marcadores estrechamente ligados. Mediante el uso de grandes tamaos de poblacin y un mayor nmero de marcadores, ser posible identificar ms QTLs que estn estrechamente vinculados, este proceso se denomina cartografa de alta resolucin de los QTLS que puede ser utilizado para desarrollar marcadores fiables para MAS y tambin para discriminar entre un solo gen o varios genes ligados. LG8 y LG16 son buenos candidatos para los anlisis adicionales para el desarrollo de marcadores moleculares para la resistencia a la enfermedad S. sclerotiorum, ya que la resistencia QTL que confiere a S. sclerotiorum ya ha sido identificados en estos dos grupos de vinculacin en varios estudios independientes. Ao 2012 Debido a la velocidad con que las tcnicas y procedimientos evolucionan en mejora gentica, es interesante resear ciertos trabajos publicados este ao que incorporan novedades importantes en cuanto a la resistencia a S. sclerotiorum en girasol, se refiere. Primero es importante destacar el trabajo de Bowers JE. et al., 2012 publicado en abril de 2012 que actualmente se considera como el mapa gentico base del girasol. En l se incorporan a dicho mapa 10000 locus nuevos obtenidos mediante el anlisis simultneo de mltiples poblaciones de girasol, empleando como marcadores SNPs. Aunque ya hemos visto que existe una amplia coleccin de mapas de ligamiento para el girasol desarrollados a partir de diversos marcadores moleculares, incluyendo RFLPs ( Berry et al., 1995; Gentizbittel et al., 1995), ADN amplificado al azar, RAPD (Rieseberg et al. 1993), AFLP (Gedil et al., 2001) y SSR (Heesacker et

al., 2008; Tang et al., 2002; Yu et al. 2003), la densidad de estos mapas es relativamente baja hasta el momento, con un promedio de menos de un marcador por 2 Mb de ADN en los mejores casos, que ha limitado su utilidad para ciertas aplicaciones, entre ellas la mejora contra el ataque a S. sclerotiorum. Teniendo en cuenta por ejemplo que el genoma de Arabidopsis se bas en un mapa gentico con una densidad media de un marcador por 151 kb (Kaul et al., 2000), el genoma del arroz con densidades de un marcador por 171 kb (Harushima et al., 1998) o de un marcador por 290 kb en el caso del sorgo (Paterson et al., 2009), un genoma con 3,6 billones de bp (Kane et al., 2011) requerira un mapa gentico que contubiese al menos 10000 loci para acercarse a esas densidades de marcadores. De ah la importancia del trabajo de Bowers et al. En la tabla nmero cuatro se pueden observar el nmero de loci definidos en cada uno de los cromosomas de girasol en cada una de las poblaciones estudiadas en el trabajo. La tasa de error estimada para estos mapas fue mucho menor que el nivel estimado demostrando la alta reproducibilidad de SNP empleados, con los que el total de tasa de error fue aproximadamente de un 1%. As pues diremos que la disponibilidad de plataformas de alto rendimiento que permite el anlisis con SNP hace posible la generacin de grandes cantidades de datos en gran parte libre de errores. En el trabajo de Bowers, se pudo generar ms de 5 millones de datos moleculares en cuatro poblaciones de mapeo. Una hazaa que hubiera sido imposible de realizar con los enfoques tradicionales de genotipado. Se demuestra el valor de analizar simultneamente mltiples poblaciones de mapeo que permite la asignacin de muchos ms marcadores, incluyendo el relleno de lagunas de datos existentes hasta el momento. El resultado es un mapa gentico de alta densidad que tiene el valor potencial de facilitar el nuevo montaje del genoma que actualmente est en desarrollo. La disponibilidad de un gran conjunto de SNPa hace posible la caracterizacin genotpica eficiente y detallada de colecciones de germoplasma, lo que proporciona un medio para evaluar el genoma. Pero los avances no se quedan en el uso de SNPs. Un estudio todava ms reciente del mismo autor (Bowers JE. et al., 2012) de diciembre de 2012, da un paso ms all en la bsqueda de una mayor densidad de marcadores. Si bien el empleo de SNPs es una herramienta que produce datos de muy alta calidad, el requerimiento de la previa identificacin de dichos SNPs a travs de re-secuenciacin de genotipos concretos, limita su utilidad si el objetivo es producir un mapa de alta densidad a partir de una poblacin particular. Es la aparicin de mtodos de genotipado basado en micro matrices y extraccin de informacin genotpica directamente de la secuencia de datos hace posible y econmicamente viable el genotipado de decenas de miles e incluso millones de polimorfismos dentro de un mapeo gentico de una poblacin nica. En este nuevo trabajo se describe la caracterizacin genotpica de un subconjunto de la poblacin de mapeo RHA280RHA801, utilizando un chip de genes Affymetrix. Es una poblacin muy caracterizada en el mapeo del girasol. Es una lnea endogmica recombinante (RIL) derivada de un cruzamiento entre cultivares de girasol RHA280 y RHA801. Debido a que contiene una fraccin sustancial de todos los genes en el genoma de girasol, este mapa tambin servir como una valiosa herramienta para la identificacin de genes candidatos subyacentes (QTL) que se han ido asignando en otros estudios. Uno de los ms recientes relacionados con la identificacin de genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum es el publicado tambin en el ao 2012 (Fusari CM. et al., 2012). En este trabajo se plantea la asociacin de mapas (AM) como una opcin prometedora para la cartografa de QTLs, ya que detecta relaciones entre

Tabla 4. Resumen del nmero de loci mapeados en cada poblacin de girasol estudiada.

la variacin fenotpica y polimorfismos de genes en los actuales bancos de germoplasma sin el desarrollo del mapeo de poblaciones. Este mtodo consiste en proponer una serie de genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum en funcin de los QTLs ya descritos en artculos anteriores. En total se analizaron 94 lneas endogmicas de girasol para la resistencia a este patgeno. Dado que para el ataque de S. sclerotiorum no existen mecanismos biolgicos o bioqumicos identificados claramente, fueron seleccionados 43 genes candidatos en base a estudios previos de girasol y Brassica napus infectados con el hongo. Se eligi Brassica napus puesto que es uno de los estudios ms complejos que se han realizado hasta el momento mediante el anlisis de microarrays en genotipos tanto resistentes como susceptibles a la infeccin con S. sclerotiorum (Zhao J, Udall JA, et al., 2006). Se encontraron 686 genes expresados despus de lainfeccin en genotipos resistentes y 1586 genes en genotipos susceptibles, respectivamente. Aumentando esta diferencia con el tiempo. Las funciones de estos genes incluyen la sntesis de protenas relacionadas con la patognesis, con la explosin oxidativa entre otras. Sin embargo la extrapolacin de esta informacin para el girasol y su uso para evaluar nuevas fuentes de resistencia requiere la identificacin de genes ortlogos entre Brassica napus y Helianthus annuus. La asociacin de mapas (AM) fue sugerida como una prometedora alternativa vinculada ntimamente con la cartografa clsica con el fin de dilucidad la base gentica de los rasgos complejos en el girasol. El principal inconveniente de AM es la posibilidad de obtener falsos positivos debido a que la estructura de la poblacin no est reconocida. An as esta herramienta se est empleando con xito en la cartografa de genes involucrados en varios rasgos en diferentes especies como el tiempo de floracin y la tolerancia al aluminio en el maz o la resistencia al tizn del grano en el trigo o la resistencia la muerte descendente en la lechuga (Breseghello F, Sorrells ME, 2006; Simko I et al., 2009).

Tabla 5. Genes candidatos para la resistencia a S. sclerotiorum: fuentes de seleccin y caractersticas para el mapeo de asociacin del genotipo de la poblacin.

Tabla 6. Valores de P de la asociacin entre el gen candidato y la incidencia de S. sclerotiorum en el girasol.

Este enfoque permiti la deteccin de una asociacin significativa, de entre los 43 genes candidatos, del gen HaRIC_B y la incidencia de S. sclerotiorum (P<0,01) lo que representa la reduccin de dicha incidencia en un 20% aproximadamente. Estos resultados sugieren por tanto, que dicho gen es un posible candidato a tener muy en cuenta en estudios sucesivos relacionados con programas de mejora del girasol que puedan incorporar genes para el carcter de resistencia a S. sclerotiorum. La AM ser de utilidad as, en la diseccin de otros rasgos complejos del girasol, proporcionando en definitiva, una herramienta muy valiosa para ayudar en el mejoramiento de cultivos en el futuro. Hbridos de girasol comercializados actualmente con resistencia parcial a S. sclerotiorum. Las herramientas de manejo actualmente utilizadas en el cultivo de girasol se basan en una buena eleccin del cultivar (basado en mejora gentica), una fecha de siembra que permita escapar a los momentos ms peligrosos y en la aplicacin de desecantes para anticipar la cosecha de cultivos infectados. Otras herramientas en estudio pero que requieren desarrollo son el uso de fungicidas o microorganismos biocontroladores de la enfermedad (Escande et al, 2002). La caracterizacin del comportamiento de los cultivares de girasol frente a la podredumbre en condiciones naturales es dificultosa debido a la alta influencia que

tienen las condiciones meteorolgicas sobre la capacidad de este hongo para instalarse y producir la enfermedad. Por lo que el estudio de variedades mejoradas genticamente parece ser la clave del cultivo de girasol en el futuro. En la tabla 7 aparecen los hbridos de girasol detectados como de alta resistencia a la podredumbre causada por S. sclerotiorum que actualmente se comercializan y que han sido desarrollados en programas de mejora a partir de los estudios genticos sobre la interaccin del girasol y el ataque de este patgeno, realizados en las dos ltimas dcadas. HBRIDO ACA 884 AGROBEL 972 MG 50 P64A51 ALBISOL 2 CAUQUN CF 17 CONSUS 102 DEKASOL 3920 JAGUEL PAIHUEN PAN 7001 PARASO 20 PROTON ER 301 SPS 3103 SPS 4530 VDH 481 EMPRESA COMERCIAL ACA LA TIJERETA DOW MORGAN PIONEER RIESTRA EL CENCERRO ADVANTA CONSUS MONSANTO KWS EL CENCERRO PANNAR NIDERA PRODUSEM SPS SPS ADVANTA

Tabla 7. Hbridos de buen comportamiento ante la podredumbre blanca del captulo por S. sclerotiorum. Caracterizacin realizada a partir de por lo menos tres ensayos de inoculacin asistida con ascosporas.

A da de hoy los hbridos disponibles en el mercado son cada vez ms resistentes a S. sclerotiorum pero an as, debido a la enorme influencia de los factores ambientales, y a la dificultad para determinar con exactitud su base gentica por tener carcter polignico, queda mucho camino por recorrer en el campo de la mejora de este cultivo.

Conclusiones El objetivo de este trabajo fue el estudio de la evolucin de la mejora gentica en el cultivo del girasol para el carcter de resistencia al ataque y proliferacin del hongo S. sclerotiorum, desde sus comienzos all por los aos ochenta hasta nuestros das. La importancia de conocer la base gentica de los mecanismos de resistencia del girasol frente a este patgeno radica en las importantes prdidas en la produccin que ocasiona anualmente en este cultivo (pudiendo llegar incluso al 100% si las condiciones climticas son las ms adecuadas para esclerotinia). La solucin a este problema parece estar en programas de mejora ya que es una infeccin muy difcil de combatir por otras vas como el tratamiento con productos qumicos (debido a su enorme persistencia en el suelo). Aunque tambin es interesante complementar el uso de variedades mejoradas genticamente con, por ejemplo, el momento de siembra para evitar que se solapen el estado ms vulnerable del cultivo con las mejores condiciones de desarrollo del patgeno. Los estudios preliminares (Castao et al., 1989) estudiaron la eficiencia de la seleccin simultnea para la resistencia a varias formas de infecciones por S. sclerotiorum aplicado en la misma estacin en diferentes lneas endogmicas. La respuesta de plantas infectadas por una combinacin de ambas pruebas aplicadas durante la floracin y madurez fisiolgica, respectivamente, mostraron que no haba diferencia entre la aplicacin de ambas pruebas de forma simultnea o correlativa. Esto permiti agilizar las pruebas de resistencia que se venan haciendo hasta el momento para la seleccin fenotpica de variedades de resistencia por retrocruzamiento. En la dcada de los noventa se produce el esplendor de tcnicas relacionadas con RFLPS y marcadores isoenzimticos que se utilizaron para investigar loci de caracteres cuantitativos involucrados en la resistencia a la extensin del micelio de S. sclerotiorum, tanto en hojas como en captulos. Adems, el conocimiento acerca de los marcadores de resistencia a S. sclerotiorum (QTL) comienza a proporcionar informacin sobre el nmero de segmentos cromosmicos involucrados en dicha resistencia. En 1995 se elabora el primer mapa de grupos de ligamiento para la resistencia a esclerotinia consensuado a nivel internacional (Gentzbittel L. et al. 1995). Estos estudios con marcadores moleculares, confirmaron la compleja naturaleza de la resistencia a S. sclerotiorum en girasol. Se detectaron cinco zonas genmicas implicadas en la resistencia a la extensin del micelio del hongo en los tejidos de las plantas. El reciente desarrollo de nuevos marcadores moleculares, relacionado con la primera dcada del s. XXI, ha sido un factor importante en el establecimiento de densos mapas moleculares. Surge la aplicacin de AFLP como una tcnica poderosa para la identificacin gentica del girasol. De la misma manera se comienzan a utilizar los SSR como otro marcador cuyos polimorfismos son muy eficaces en la cartografa gentica, en estudios evolutivos, huellas dactilares y anlisis de pedigr (Paniego et al., 2002; Tang et al., 2003). Se establecen dos genes candidatos adecuados LG8 y LG16, para poder desarrollar marcadores moleculares para la resistencia a S. sclerotiorum que nos sirvan para una posterior seleccin asistida por marcadores moleculares (MAS) base de la mejora del girasol para este carcter. En el afn de identificar con cada vez ms detalle la base gentica de la resistencia a la podredumbre blanca, surgen los ltimos trabajos del 2012 enfocados a elaborar mapas de grupo de ligamientos ms precisos. Esto es posible gracias al surgimiento de nuevas tcnicas genticas como el uso de SNPs y en ltima instancia, el empleo de chips de genes, que permiten la

extraccin de informacin genotpica directamente de la secuencia de datos haciendo posible y econmicamente viable, el genotipado de decenas de miles e incluso millones de polimorfismos dentro de un mapeo gentico de una poblacin nica. Por ltimo surge el plantear la asociacin de mapas (AM) como una opcin prometedora para la cartografa de QTLs, ya que detecta relaciones entre la variacin fenotpica y polimorfismos de genes en los actuales bancos de germoplasma sin el desarrollo del mapeo de poblaciones. Esta herramienta se est empleando con xito en la cartografa de genes involucrados en varios rasgos en diferentes especies. La AM ser de utilidad as, en la diseccin de otros rasgos complejos del girasol, proporcionando en definitiva, una herramienta muy valiosa para ayudar en el mejoramiento de cultivos en el futuro. Es cierto que en estos ltimos aos la evolucin de las tecnologas al alcance de la gentica, est dando frutos interesantes con respecto al conocimiento de los mecanismos genticos involucrados, por lo que es presumible encontrar con cierta prontitud, un mapa gentico completo que permita establecer programas de mejora adecuados para la obtencin de genotipos 100% resistentes a S. sclerotiorum. Muchos son los trabajos publicados relacionados con la mejora gentica del girasol para el ataque de S. sclerotiorum, aunque se han citado una buena cantidad, no estn recogidos todos los que son, pero s se ha intentado mostrar una visin clara de la situacin pasada, presente y futura de este campo en la investigacin que todava tiene demasiadas incgnitas por resolver.

Referencias Davar R. et al (2012). Sclerotinia-Induced Accumulation of Protein in the Basal Stem of Resistant and Susceptible Lines of Sunflower. Not Bot Horti Agrobo, 2012, 40(1):119-124. Godoy M. et al (2005). Sclerotinia resistance in sunflower: I. Genotypic variations of hybrids in three environments of Argentina. Euphytica (2005) 145: 147154. Godoy M. et al (2012). Sclerotinia resistance in sunflower. II. Combining ability and midparent heterosis for reaction to ascospore infections at flowering. Euphytica (2012) 188:299307. Fusari CM., Di Rienzo JA., et al., (2012). Association mapping in sunflower for sclerotinia head rot resistance. BMC Plant Biology 2012, 12:93.
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