BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

ESCUELA DE BIOLOGA

ACCIN DE LA nociceptina/orfanina FQ SOBRE LAS NEURONAS DEL COMPLEJO PERIESOFGICO DEL CARACOL TERRESTRE Helix aspersa

TESIS PROFESIONAL

Autor: Ricardo Cruz Cruz

Tutor: Enrique Soto Eguibar

Puebla, Pue. Junio del 2001

LISTA DE ABREVIATURAS
Ach , y -MSH 5-HT AC ACTH AmpPA AmpPHP BSA A/D CGRP CHO d+ dDinA, B y 1-8 DPDPE DSLET Dura50 DuraPA DV EPSPs GIRK HA HPLC i.c.v. i.t. IP3 IPSPs Leu-enc Met-enc noc/oFQ oFQ ORC ORL-1 PDYN PENK PKA PKC PLD PNOC POMC PPDYN PPENK pPHP PPNOC PPOMC SIA SP VIP Vmem Acetilcolina Hormona estimulante de los melanocitos , y Serotonina Adenilato ciclasa Hormona adrenocorticotrpica Amplitud del potencial de accin Amplitud de la posthiperpolarizacin Albmina srica bovina Conversor analgico/digital Pptido relacionado con el gene de la calcitonina Clulas ovricas de Hamster Pendiente de despolarizacin Pendiente de repolarizacin Dinorfina A, B y 1-8 [D-pen, D-pen] encefalina [D-Ser, D-Leu] encefalina treonina Duracin del potencial de accin al 50% Duracin del potencial de accin Discriminador de ventana Potenciales Postsinpticos Excitatorios + Canal de K rectificante de entrada Histamina Cromatografa lquida de alta afinidad intracerebroventricular intratecal Fosfatidil inositol trifosfato Potenciales Posinpticos Inhibitorios Leucina encefalina Metionina encefalina nociceptina/orfanina FQ orfanina FQ Osciloscopio de rayos catdicos Receptor similar al opioide 1 Prodinorfina Proencefalina Protena cinasa A Protena cinasa C Fosfolipasa D Pronociceptina Proopiomelanocortina Preprodinorfina Preproencefalina Pendiente de posthiperpolarizacin Prepronociceptina Preproopiomelanocortina Analgesia inducida por estres Sustancia P Pptido intestinal vasoactivo Voltaje de membrana

NDICE
RESUMEN 1

INTRODUCCIN Caractersticas generales de moluscos

Particularidades de Helix aspersa Actividad elctrica de las neuronas del caracol Pptidos opioides Receptores a opioides Mecanismos de accin de pptidos opioides Nociceptina/orfanina FQ y su receptor Efectos centrales y perifricos de noc/oFQ Mecanismos de accin de nociceptina/orfanina FQ Pptidos opioides en invertebrados JUSTIFICACIN HIPTESIS OBJETIVOS MATERIAL Y MTODO Preparacin de las drogas Modelo biolgico Diseccin Registro intracelular Microperfusin con Noc/oFQ

2 2
3 4 7 9 10 11 13 16 18 22 22 22 23 23 23 23 24 25

Anlisis de resultados
Obtencin de la nociceptina/orfanina FQ RESULTADOS

25
26 27

Controles
Efectos de la noc/oFQ DISCUSIN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA APNDICE

27
29 40 45 46 57

RESUMEN

El heptadecapptido nociceptina/orfanina FQ (noc/oFQ) fue identificado como un ligando endgeno de alta afinidad para el receptor opioide ORL-1. La presencia de este pptido en el complejo periesofgico de Helix aspersa y su influencia sobre la conducta trmica aversiva en el caracol Cepaea nemoralis indican que la noc/oFQ desempea un papel fundamental en el sistema nervioso de los moluscos. Por esta razn decidimos estudiar su efecto sobre la actividad elctrica de las neuronas de los ganglios subesofgicos y cerebrales del caracol Helix aspersa con el fin de dilucidar el papel funcional y el mecanismo de accin de la noc/oFQ en estas neuronas. Se realizaron registros intracelulares en neuronas del complejo periesofgico con electrodos de vidrio que fueron llenados con KCl 3 M, con resistencia de entre 30 y 60 M. Se seleccionaron las clulas cuyo potencial de membrana era mayor a -40 mV y cuyos potenciales de accin tenan un sobretiro. Los experimentos se grabaron en videocassettes y se procesaron fuera de lnea. Se estudi la frecuencia de descarga y la forma de los potenciales de accin antes y despus de la aplicacin del pptido. Para la aplicacin de la noc/oFQ se acerc a la clula en registro una micropipeta de aproximadamente 300 m de dimetro en la punta y la droga se aplic por eyeccin de presin. Se aplicaron 100 l en un perodo de 15 a 20 segundos en concentraciones de 1 M (n=6), 10 M (n=8), 50 M (n=4) y 100 M (n=6). La microperfusin de noc/oFQ 1 M no produjo cambios ni en la frecuencia de descarga ni en la morfologa de los potenciales de accin despus de la aplicacin del pptido. Mientras que a concentracin 10, 50 y 100 M se observaron grupos de neuronas en que se produjo un efecto excitatorio, en tanto en otras clulas el efecto fue de tipo inhibitorio. La morfologa del potencial de accin no se modific en la mayora de los casos, aunque en algunas ocasiones la fase de posthiperpolarizacin se hizo ms rpida. Estos resultados coinciden con los hallazgos inmunohistoqumicos, en los que se demostr la presencia de inmunorreactividad a noc/oFQ en neuronas del complejo periesofgico de esta especie.

NTRODUCCIN
1.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE MOLUSCOS Despus de los artrpodos, los moluscos constituyen el phylum ms grande del reino animal, en el cual se incluyen caracoles, pulpos, calamares, ostras y almejas. Los miembros de este phylum poseen simetra bilateral y se caracterizan por presentar una cubierta protectora de la masa visceral llamada manto que envuelve tanto a la cabeza como al pie (un sistema muscular complejo que sirve para la locomocin) y que es el encargado de secretar la concha. Entre el manto y la masa visceral existe un espacio denominado cavidad del manto que contiene los rganos respiratorios, los rganos de los sentidos (osfradio), las branquias (ctenidio) y que a su vez, se abre al sistema reproductivo, al sistema renal y al recto. Por su parte, la masa visceral alberga al hgado, al corazn, a la glndula digestiva y a los rganos reproductivos (Kandel, 1979) (Figura 1). Su sistema nervioso es una serie de aproximadamente seis pares de ganglios bien definidos: bucal, cerebral, pleural, pedal, parietal y visceral. Todos los ganglios se comunican por varios tipos de conexiones y comisuras que componen un anillo nervioso alrededor del esfago (Barnes, 1989; Bullock, 1977).

Aorta posterior

Gnada

Receptculo seminal Oviducto Corazn Glndula hipobranquial Ctenidio Sifn Cavidad del manto Ano Osfradio Tentculo ceflico Ojo Probscide Boca Aparato radular Estatocisto Esfago Pie

Hgado

Estmago Glndula digestiva Msculo columelar

Oprculo

Figura 1. Anatoma general de los gasterpodos, indicando la posicin de sus rganos internos (modificado de Brusca y Brusca, 1990). 5

1.1.1 PARTICULARIDADES DE Helix aspersa Se caracteriza por tener una concha de forma espiral. Posee un grueso pie y pulmones rudimentarios, en lugar de branquias (ctenidio) (Russell-Hunter, 1979). En la cabeza posee 4 tentculos: dos corresponden a los ojos y dos a otros rganos sensoriales incluyendo el olfato y el tacto. El sentido del tacto est distribuido por toda la superficie del cuerpo, pero se localiza principalmente en los dos pares de tentculos que se encuentran en la cabeza.

Figura 2. Diagrama del complejo periesofgico del caracol terrestre Helix aspersa, mostrando los ganglios cerebrales (A,B), pleurales (C,G), pedales (H,I), parietales (D,F) y viscerales (E). Modificado de Kerkut y cols., 1975.

El sistema nervioso est compuesto por un par de ganglios bucales y nueve ganglios ordenados en un complejo ganglionar periesofgico (dos cerebrales, dos pleurales, dos pedales, dos parietales y uno visceral) (Figura 2). Cada ganglio est formado por grupos de neuronas motoras unipolares e interneuronas. En el interior del ganglio se encuentra el neuropilo el cual presenta apndices entrelazados que permiten mltiples conexiones y que contribuyen a la complejidad del circuito (Ratt y Chase,

1997). Las neuronas desarrollan conexiones con neuropilos de varios ganglios y, por lo tanto, reciben y distribuyen impulsos elctricos en numerosas uniones sinpticas. Los ganglios cerebrales se encuentran situados en la parte anterior del pie, por debajo del esfago y de ellos parten dos pares de cordones nerviosos que se prolongan hacia la regin posterior del complejo periesofgico hasta conectarse con los ganglios pedales y pleurales, los cuales, estn unidos entre s por otro par de nervios. Del ganglio pedal emergen dos cordones nerviosos que se comunican con los ganglios parietales y que desembocan en el ganglio visceral. Los ganglios pedal, pleural, parietal y visceral estn localizados en la lnea media del pie, por encima del esfago formando la masa ganglionar subesofgica (Barnes, 1989; Brusca y Brusca, 1990). Los ganglios bucales inervan el aparato radular y el esfago. Los ganglios cerebrales se subdividen en protocerebro, mesocerebro y postcerebro, y estn encargados de inervar los ojos, los estatocistos, la boca, los tentculos, el pie y la superficie de la cabeza. Los ganglios pleurales inervan el manto y el msculo columelar. Los ganglios pedales inervan los msculos del pie, la piel y los pliegues epidodiales (quimiorreceptores). Los ganglios parietales inervan al osfradio. El ganglio visceral inerva el corazn, el hgado, el rin, el sistema digestivo, el ano y la musculatura del cuerpo (Barnes, 1989; Brusca y Brusca, 1990).

1.2. ACTIVIDAD ELCTRICA DE LAS NEURONAS DEL CARACOL Los primeros intentos por identificar neuronas mediante criterios morfolgicos, en los gasterpodos, se enriquecieron notablemente con el uso de tcnicas electrofisiolgicas que permitieron, ms adelante, caracterizar a las neuronas en cuanto a sus patrones de descarga y de respuesta a estmulos antidrmicos sobre las terminaciones nerviosas (Kerkut y cols., 1975). Mediante la tcnica de registro intracelular, las neuronas del sistema nervioso central de los caracoles han sido diferenciadas y, atendiendo su actividad elctrica, stas pueden dividirse en: 1) silentes o 2) con descarga espontnea (marcapaso o sinptica).

Las neuronas silentes mantienen su potencial de membrana en reposo sin presentar variaciones endgenas, por lo que no generan potenciales de accin, excepto cuando se les estimula. Por su parte, las clulas que presentan descarga espontnea pueden dividirse en dos grupos: 1) aquellas que son excitadas a travs de mltiples conexiones sinpticas con otras neuronas activas y que, por lo tanto, desarrollan patrones de descarga irregulares con una gran cantidad de EPSPs e IPSPs (Figura 3a) y 2) las que presentan actividad marcapaso. Estas ltimas se agrupan en dos categoras; la ms comn corresponde a clulas con descarga regular rtmica, las cuales poseen menor nmero de entradas sinpticas (en comparacin con las clulas con descarga irregular) y que por lo tanto, poseen una frecuencia de descarga estable durante largos periodos de tiempo (Figura 3b). El grupo de neuronas menos frecuente comprende clulas con ritmo marcapaso bimodal o bifsico en el cual se observan periodos de descarga en trenes o rfagas seguidos por una fase inhibitoria de larga duracin en donde la clula se hiperpolariza impidiendo el disparo de potenciales de accin (Kerkut y cols., 1969 Salnki y Vehovszky, 1981) (Figura 3c). Este tipo de actividad puede tener varios orgenes: en primera instancia, un nervio contiene fibras nerviosa excitatorias e inhibitorias que pueden hacer sinapsis con una neurona dentro del sistema nervioso, si estas fibras poseen umbrales de activacin distintos, la fibra con el umbral ms bajo estimulara primero y la fibra con el umbral alto lo hara despus, provocando una descarga bifsica en la neurona blanco. Otra alternativa podra ser que ambas respuestas (excitatoria e inhibitoria) puedan ser mediadas por vas polisinpticas en las cuales intervengan interneuronas. Finalmente, es posible que exista la presencia de ms de un tipo de receptor postsinptico para un solo transmisor, en este caso la respuesta en la neurona blanco dependera de los patrones de actividad de la fibra presinptica (Kerkut y cols., 1975). Otra posibilidad es que las propiedades de las corrientes inicas presentes en la membrana de la clula tengan relaciones de amplitudes y cinticas tales que el potencial de membrana oscile de forma rtmica produciendo la descarga en rfagas. Como se mencion anteriormente, la actividad elctrica de las clulas del sistema nervioso se ve influenciada en gran medida por conexiones sinpticas. En el

complejo periesofgico del caracol terrestre Helix aspersa se han identificado un gran nmero de molculas que pueden modular el patrn global de descarga de las neuronas; entre los ms estudiados se encuentran acetilcolina (Ach), aminocidos como el glutamato y aminas biognicas como la serotonina (5-HT), la dopamina y la histamina (HA). En el caso de Ach, 5-HT, glutamato y dopamina la aplicacin independiente de cada uno de ellos produce efectos excitadores, inhibidores y bifsicos (Kerkut y cols., 1975) mientras que la perfusin de HA ejerce slo efecto excitador (Kerkut y cols., 1970). El mismo tipo de efectos fue reportado por Ikumi y su grupo en 1982 para serotonina y dopamina en Achatina fulica (Ikumi y cols., 1982).
8998-9

A
20 mV

10 seg
28699-28

B
20 mV

1 seg
51699-1

C
20 mV

5 seg

Figura 3. Actividad elctrica de las neuronas del complejo periesofgico del caracol Helix aspersa. (A) Descarga irregular, la cual presenta mayor cantidad de EPSP. (B) Descarga tipo marcapaso. (C) Marcapaso bimodal. Registros obtenidos en el Laboratorio de Neurofisiologa Sensorial en el Instituto de Fisiologa de la BUAP por el autor.

Por otra parte, se han identificado diversos pptidos bioactivos como encefalinas, dinorfinas, FMRF-amida, substancia P (SP), pptido relacionado con el gene de la

calcitonina (CGRP), pptido intestinal vasoactivo (VIP), gastrina y colecistoquinina en el sistema nervioso del caracol Helix aspersa, y aunque no se ha descrito su efecto sobre la actividad elctrica de las neuronas del complejo periesofgico, es muy probable que estos pptidos puedan modular dicha actividad.

1.3 PPTIDOS OPIOIDES En el ao de 1803, Derosne obtuvo una sal de opio que, por su poder narcotizante, denomin narcotina. Posteriormente, Sertrner purific de la planta de opio un componente al que llam morphinum (en referencia a Morfeo dios del sueo) el cual tena cualidades analgsicas y narcticas. Diversos intentos para determinar los mecanismos de accin de la morfina guiaron al descubrimiento de los pptidos opioides endgenos: las encefalinas (Hughes y cols., 1975), las endorfinas (Goldstein y cols., 1971; Bradbury y cols., 1976) y las dinorfinas (Kakidani y cols., 1982). Los pptidos opioides endgenos estn ampliamente distribuidos en el cerebro y en el sistema nervioso perifrico (Boom y cols., 1999) y juegan un papel fundamental en la nocicepcin, las funciones endocrinas, cardiovascular, gastrointestinal e

inmunolgica, actuando como neurotransmisores o como neuromoduladores. Tcnicas en biologa molecular han demostrado que existen tres protenas precursoras de pptidos opioides (Uhl, Childens y Pasternak, 1994). Cada una de ellas es una larga prohormona peptdica: la proopiomelanocortina (POMC) (Nakanishi y cols., 1979), la proencefalina A (PENK) (Comb y cols., 1982) y la proencefalina B o prodinorfina (PDYN) (Kakidani y cols., 1982). Todas ellas se caracterizan por poseer un pptido seal necesario para su procesamiento postraduccional en el retculo endoplsmico y en el aparato de Golgi. Cada prohormona es cortado por enzimas proteolticas las cuales son empaquetadas junto con los precursores opioides en las vesculas de secrecin. El procesamiento postraduccional vara dependiendo del tipo celular, inclusive dentro de una misma clula la expresin de estos pptidos puede variar gracias a diversos procesos regulatorios.

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El gene de la POMC es traducido dentro de una prohormona de 267 aminocidos. El procesamiento postraduccional produce varios pptidos opioides pequeos entre los que se encuentran la Met-encefalina, la -endorfina y la -lipotropina (Figura 4a). Esta prohormona contiene pequeos fragmentos biolgicamente activos que no estn relacionados con los pptidos opioides y que son: hormona adrenocorticotrpica (ACTH) y hormona estimulante de los melanocitos (-MSH, -MSH y -MSH), las cuales se sintetizan en la adenohipfisis. El gene que codifica para la PENK es un precursor proteico con 267 aminocidos. En esta protena (Figura 4b) existen cuatro copias de Met-encefalina y una de Leu-encefalina, Met-encefalina-Arg6-Phe7 y Met-encefalina-Arg6-Gly7-Leu8. Alternativamente, el precursor PENK puede ser procesado en un pptido que contiene encefalinas largas, entre las que se incluyen: la BAM-18P, la metorfamida, la amidorfina, el pptido E y el pptido F. PPOMC
-MSH ACTH -MSH -Endorfina

Seal NH2
-MSH Met-enc Met-enc Arg-Gly-Leu -LPH

COOH
Met-enc Arg-Phe

PPENK

Seal NH2
Pptido F Pptido E

COOH

PPDYN

-Neoendorfina

DinA

DinB

Seal NH2
-Neoendorfina Din 1-8 Leu-enc

COOH

PPNOC

Nociceptina!

Seal NH2
Nocistatina

COOH
PPNOC154-181

Figuras 4. Precursores de pptidos opioides y sus posibles productos. En A se observa la preproopiomelanocortina (PPOMC) y sus fragmentos -endorfina, hormona estimulante de los melanocitos , y (, y -MSH), hormona adrenocorticotrpica (ACTH) y hormona lipotrpica (-LPH). En B la preproencefalina (PPENK) y sus fragmentos metionina-encefalina (Met-enc), leucina-encefalina (Leu-enc), pptido E y F. En C la preprodinorfina (PPDYN) y sus fragmentos y neoendorfina, dinorfina A,B y 1-8 (DinA, DinB y Din1-8). Y en D la prepronociceptina (PPNOC) y sus fragmentos nocistatina, nociceptina y prepronociceptina154-181, (PPNOC154-181) (modificado de Feldman y cols., 1997). 11

El gene de la PDYN es una prohormona de 254 aminocidos (Figura 4c) la cual, al ser segmentada, puede producir tres copias de leu-encefalinas, o bien una copia de dinofina A, dinorfina B, neoendorfina y neoendorfina. 1.3.1 RECEPTORES A OPIOIDES Estudios farmacolgicos han definido al menos tres clases de receptores a opioides denominados , y , que difieren en su afinidad por varios ligandos y en su distribucin en el sistema nervioso. Estos receptores se encuentran acoplados a protenas Gi/0 y presentan una misma estructura general con una regin extracelular amino terminal, siete dominios transmembranales y una estructura carboxilo terminal intracelular (Figura 5). El receptor se define operacionalmente como el sitio de alta afinidad en que los opioides producen analgesia, aumento del tono muscular, constipacin, oliguria, fuerte depresin respiratoria e intensa dependencia fsica. La morfina, las endorfinas, y las endomorfinas se unen a este receptor y su efecto es antagonizado por naloxona (Chang y Cuatrecasas, 1979; Zadina y cols., 1997).

Extracelular

Membrana plasmtica

Intracelular

Figura 5. Estructura del receptor . Cada circulo representa un aminocido. Los siete dominios transmembranales son tpicos de receptores acoplados a protenas G. Los crculos obscuros representan sitios de fosforilacin para protenas cinasas A y C (PKA y PKC) (modificado de Feldman y cols., 1997).

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Se han identificado dos tipos de receptores : el 1, de alta afinidad a la morfina y a los opioides, y que se encuentra principalmente en el sistema nervioso central; y el 2, presente en el sistema nervioso perifrico y con baja afinidad a la morfina (Pasternark y Wood, 1986). Por su parte, el receptor , juega un papel importante en la depresin respiratoria y no parece mediar la analgesia (Pasternak, 1982; Lord y cols., 1977). Tiene gran afinidad por todos los pptidos derivados de la proencefalina, pero tambin puede unir endorfinas y dinorfina 1-8 (Akil y cols., 1984). El principal antagonista selectivo de este receptor es el naltrindol. En 1991, Jiang y su grupo sugirieron la existencia de dos subtipos de receptor con base en la potencia de los agonistas: el receptor 1, al que se une con alta afinidad la [D-pen, D-pen]encefalina (DPDPE), y el 2, que tiene como agonista preferencial a la [D-Ser, D-Leu]encefalina-treonina (DSLET) (Portoghese y cols., 1992). El receptor se ha postulado para drogas del tipo de la ketazocina, y su accin analgsica es pobre (Martin y cols., 1976). Participa en funciones como la diuresis, la nocicepcin, la alimentacin y las secreciones endocrinas (Hansen y Morgan, 1984). Las dinorfinas y las neoendorfinas son agonistas de este receptor, que es antagonizado por nor-binaltorfimina y naloxona. Se han descrito tres tipos de receptores : el 1, al que se une el U50488 y los 2 y 3, que ligan preferencialmente el benzomorfn. 1.3.2 MECANISMOS DE ACCIN DE PPTIDOS OPIOIDES Los sistemas efectores a los que estn acopladas los pptidos opioides incluyen la inhibicin de la adenilatociclasa (AC), la activacin del ciclo de los fosfoinostidos y la regulacin de canales de potasio y calcio. La unin de agonistas opioides a sus receptores activa protenas Gi/o, que inhiben a la adenilatociclasa (AC) en un proceso dependiente de GTP, lo que conlleva a una disminucin en la produccin de AMPc, esencial en diversas cascadas de sealizacin intracelular. Este proceso es sensible a naloxona (antagonista de los receptores , y ) y a toxina pertusis (inhibidor de protenas Gi/o).

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El efecto de los agonistas del receptor , tales como la morfina y la morficeptina, es el incremento de la actividad de la proteina cinasa C (PKC) en el citosol. Este proceso es mediado por la fosfolipasa D (PLD), la cual promueve la formacin de fosfatidilinositol y diacilglicerol (Mangoura y Dawson, 1993; Narita y cols., 1994), involucrados es una gran variedad de procesos celulares. Por otra parte, el efecto de pptidos opioides sobre canales inicos es igualmente mediado por protenas G (Brown y Birnbaumer, 1990). La activacin de estas protenas, por medio de los receptores y , incrementa las conductancias de K+ provocando una hiperpolarizacin de las clulas. En algunos tejidos, el aumento en las corrientes de K+ acelera la fase de repolarizacin e incrementa la magnitud de la posthiperpolarizacin del potencial de accin. Aunque se carece de evidencias que involucren a los receptores en la regulacin de las conductancias de K+, se piensa, que en algunos tejidos, estos receptores pueden alterar la funcin de los canales de potasio (Carpenter y cols., 1996). Por su parte, agonistas de receptores , y disminuyen las conductancias de Ca2+ al cerrar canales tipo N en varios tejidos (Ottolia y cols., 1998; Adams y Terquettrini, 1998; Endoh y Suzuki, 1998; King y cols., 1999). A su vez, los receptores modulan canales de calcio tipo L y P/Q en neuronas del ganglio submandibular del hamster, efecto que es bloqueado por naloxona (Endoh y Suzuki, 1998). Asimismo, la dinorfina A (agonista del receptor ) disminuye las corrientes de Ca2+ tipo P en neuronas del ganglio de la raz dorsal (Wiley y cols., 1997). El acoplamiento entre el aumento de las corrientes de K+ y el decremento de las corrientes de Ca2+ reduce potencialmente la liberacin de neurotransmisor y puede ser el responsables del efecto analgsico de los opioides (DiChiara y North, 1992).

1.4 NOCICEPTINA/ORFANINA FQ Y SU RECEPTOR Durante varios aos se pens que existan solamente tres clases de receptores a pptidos opioides en los organismos. Sorprendentemente, Mollereau y su grupo, en 1994, descubrieron la presencia de un cuarto gene que codifica para este tipo de receptores. Este ltimo une agonistas y antagonistas opioides con muy baja afinidad (Mollereau y cols., 1994) y fue llamado receptor hurfano similar al opioide (ORL-1).
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El receptor ORL-1 (tambin conocido como: LC132, XOR, ROR-C, KOR3, Hyp 8-1, C3 y NOR) presenta una homologa de entre 63 y 65 % en su secuencia de aminocidos con respecto de los otros tres receptores, pero su segunda asa extracelular posee una caracterstica cida que lo asemeja ms al receptor (Meunier y cols., 1995; Hawkinson y cols, 2000). Basndose en la distribucin del transcripto del receptor ORL-1 en el cerebro y en la mdula espinal, y antes de identificar su ligando endgeno, se consider que podra desempear un papel en procesos nociceptivos. Siguiendo esta lnea, Meunier y su grupo, en 1995, aislaron de cerebro de rata un heptadecapptido que se une especficamente a ORL-1 y que, al ser inyectado por va intracerebroventricular (i.c.v.), produce hiperalgesia. Este neuropptido fue llamado nociceptina. En 1995 Reinscheid y colaboradores demostraron la presencia de un pptido idntico a nociceptina en el cerebro porcino; ste posee afinidad nanomolar por el receptor ORL-1 y fue nombrado orfanina FQ (oFQ). La nociceptina/orfanina FQ (noc/oFQ) es transcrita a partir del gene denominado PNOC, el cual es un precursor que codifica para pptidos opioides endgenos, su procesamiento postraduccional produce una copia de noc/oFQ, una de nocistatina (prepronociceptina125-132) y una de prepronociceptina154-181 (Figura 4d) (Mollereau y cols.
Noc/oFQ Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuAla-Asn-Gln-OH

Dinorfina Leuencefalina Metencefalina -endorfina

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-AspGln-OH Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-ValThr-Leu-Phe-Lys-Asn-Val-His-Lys-Lys-Gly-Gln-OH Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys

Neoendofina

Tabla I. Secuencia de aminocidos de los principales pptidos opioides. En negritas se muestran los residuos de aminocidos conservados con respecto a nociceptina. Ntese que la secuencia Tyr-Gly-Gly-Phe est presente en todos los pptidos excepto en la noc/oFQ, donde la Tyr es sustituida por Phe. Como puede observarse las dinorfinas presentan una mayor similitud con la noc/oFQ (modificado de Julius, 1995). 15

1996). La similitud entre el gene de la PNOC y los otros tres precursores opioides sugiere que pueden haber derivado de un ancestro comn (Mollereau y cols., 1996; Darlison y cols.,1999). Al igual que los otros tres precurosres opioides la PPNOC, presenta un pptido seal, el cual es escencial para ingresar al retculo endoplasmico. El procesamiento postraduccional de la PNOC se lleva a cabo en los granulos de secrecin despus de haber sido formados en el aparato de Golgi. La noc/oFQ es homloga de las endorfinas, encefalinas y dinorfinas (Tabla I), principalmente de la dinorfina A (Guerrini y cols, 2000), pero a diferencia de esta ltima, carece de una tirosina en el extremo amino terminal esencial para la activacin de los receptores , y , de ah la gran especificidad de noc/oFQ por el receptor ORL-1. Interesantemente, la nocistatina es un pptido que funciona como antagonista de la nociceptina, pero se sabe que ste no es un antagonista competitivo debido a que no acta directamente sobre el receptor ORL-1 (OkudaAshitaka y cols., 1999; Zhao y cols., 1999). Hasta el momento no existen reportes que describan la actividad biolgica de la prepronociceptina154-181. 1.4.1 EFECTOS CENTRALES Y PERIFRICOS DE noc/oFQ Inicialmente se propuso que la noc/oFQ era un pptido que provocaba nocicepcin (Meunier y cols., 1995; Reinscheid y cols., 1995). Estudios subsecuentes, utilizando controles adicionales, mostraron que la inyeccin i.c.v., por s misma, provoca una analgesia inducida por stress (SIA) que puede ser revertida por naloxona y noc/oFQ. El hecho de que la SIA haya sido revertida por naloxona indica que este mecanismo es mediado por opioides y que la noc/oFQ acta como un antiopioide (Mogil y cols., 1996a). La analgesia inducida por agonistas de los receptores (DAMGO), (DPDPE) y (U50488H) es bloqueada por la inyeccin i.c.v. de noc/oFQ (Mogil y cols., 1996b), as como la analgesia inducida por morfina en ratones (Grisel y cols., 1996) y ratas (Tian y cols., 1997). Se demostr tambin que noc/oFQ es completamente inefectiva para revertir la analgesia inducida por morfina administrada por va intratecal (i.t.), indicando que

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funciona como un analgsico supraespinal, pero no como un analgsico espinal (Grisel y cols., 1996; Tian y cols., 1996). De acuerdo con lo que se esperaba, en 1997, King y su grupo reportaron una rpida aparicin de analgesia espinal en ratones al administrar dos fragmentos de noc/oFQ (noc/oFQ(1-11) y noc/oFQ(1-7)) por va i.t., efecto que fue revertido por naloxona (King y cols., 1997). En contraste, se detect analgesia insensible a naloxona en ratas, al aplicar noc/oFQ por esta misma va (Xu y cols., 1996). Se demostr adems que no existe tolerancia cruzada entre el efecto antinociceptivo de la inyeccin i.t. de noc/oFQ y morfina, indicando que estos dos frmacos activan distintos receptores (Hao y cols., 1997). Con algunas excepciones (Rossi y cols., 1996; Hara y cols., 1997), se ha demostrado que la noc/oFQ ejerce un efecto dicotmico en el cual la administracin supraespinal produce hiperalgesia (antagonizando la analgesia opioide) y la espinal analgesia (similar a la de los pptidos opioides). En algunas ocasiones, el efecto de la noc/oFQ es antagonizado por naloxona Rossi y cols., 1996; King y cols., 1997); ello se debe a la influencia indirecta de distintos mecanismos opioides, ya que la naloxona no se une al receptor OLR-1. El efecto de la noc/oFQ en respuestas nociceptivas es ms complicado que un simple descenso en el umbral nociceptivo. Varios estudios han demostrado que este pptido produce hiperalgesia, bloqueo de la hiperalgesia, analgesia, bloqueo de la analgesia, bloqueo de la alodinia o bien, ningn efecto (Grisel y cols, 1996; Meunier y cols, 1995; Reischeid y cols, 1995; Xu y cols, 1996 y Pan y cols, 2000). Los factores que difieren entre estos estudios son la especie, la va de administracin, el ndice de conductas medidas, la dosis administrada y el estado fisiolgico del sujeto. Estas diferencias pueden contribuir a la variabilidad de resultados (Harrison, 2000). No obstante, esto no impide proponer que la noc/oFQ media un amplio espectro de respuestas algsicas y analgsicas en los seres vivos. Se ha demostrado tambin que la noc/oFQ tiene un efecto en la locomocin. Reinscheid y su grupo, en 1995, notaron que la inyeccin i.c.v. (0.1 a 10 nM) de este pptido en ratones caus un decremento en la actividad vertical y horizontal, as como una disminucin del tono muscular (Reinsched y cols., 1995). Tales resultados fueron

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confirmados en ratas a dosis de 10 y 100 nM, observndose fallas en la coordinacin, equilibrio y tono muscular. La tolerancia al pptido se desarroll a los 2 y 3 das despus de la primera inyeccin y desapareci a los 7 das despus de la ltima (Devine y cols., 1996). Sin embargo, otros estudios han demostrado que la aplicacin i.c.v. de noc/oFQ en ratones puede causar un incremento en la locomocin vertical y horizontal. Este efecto es insensible a naloxona y puede ser revertido por agonistas dopaminrgicos (Florin y cols., 1996). La influencia sobre la accin motora es especficamente supraespinal, ya que la administracin i.t. de noc/oFQ (0.5 a 10 nM) no produce signos de deficiencia motora (Xu y cols., 1996; Tian y cols.,1997). La noc/oFQ ejerce varios efectos sobre la conducta alimenticia. La aplicacin i.c.v. de 1, 3 y 10 nM del pptido produce la ingesta de alimento durante las primeras 4 horas luego de la inyeccin a ratas saciadas (Pomonis y cols., 1996; Stratford, 1997). Este efecto fue sensible a naloxona y puede involucrar un sinergismo con receptores opioides. Los altos niveles de RNAm (Mollereau y cols., 1994) y protena (Anton y cols., 1996) de ORL-1 en el hipocampo, sugiere la participacin de la noc/oFQ en procesos cognitivos. Adicionalmente, microinyecciones en esta regin deterioran el aprendizaje espacial en ratas (Sandin y cols., 1997). Registros electrofisiolgicos apoyan esta teora ya que se ha demostrado que agonistas de receptores y facilitan la induccin de la potenciacin a largo plazo (LTP) en neuronas del hipocampo; mientras que las dinorfinas (que actuan sobre el receptor ) y la noc/oFQ ejercen un efecto opuesto reduciendo la pendiente de los EPSPs y la amplitud de los potenciales de accin. Estos resultados sugieren que tanto la noc/oFQ como las dinorfinas modulan la plasticidad sinptica envuelta en la memoria y el aprendizage y que el contrabalance entre los receptor ORL1 y los receptores y pueden jugar un rol importante en la regulacin de la eficacia sinptica y la plasticidad funcional (Yu y cols., 1997). Aunque no ha sido ampliamente estudiado, se sabe que la noc/oFQ regula procesos involucrados con la motivacin (Murphy y cols., 1996), la ansiedad (Jenck y cols., 1997), la diferenciacin neuronal (Saito y cols., 1996), la secrecin neuroendocrina (Bluet-Pajot y cols., 1997), la liberacin de neurotransmisor (Faber y

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cols., 1996) y las percepciones sensoriales como el olfato, el gusto, la audicin (Darland, 1998) y la vista (Neal y cols., 1997). Por otra parte, varios estudios han demostrado la actividad de noc/oFQ en tejidos perifricos, principalmente en el msculo liso, donde inhibe la respuesta a estmulos elctricos en pelvis aislada de cobayo (Giuliani y Maggi, 1996) y la contraccin de los conductos deferentes de ratn (Berzetei-Gurske y cols., 1996). Funciona como un potente vasodilatador de la arteria femoral y de la cartida (Gumusel y cols., 1997), produciendo hipotensin en ratas (Champion y Kadowits, 1997; Giuliani y cols., 1997). En msculo esqueltico disminuye en un 50% la contraccin del leo del cobayo (Zhang y cols., 1997). La noc/oFQ acta tambin sobre las funciones renales, debido a que la inyeccin intravenosa del pptido produce diuresis y suprime la excrecin de sodio en el flujo urinario de la rata. Efectos similares se observan despus de la administracin i.c.v. del pptido (Kapusta y cols., 1997). Por esta razn se piensa que la noc/oFQ desempea funciones homeostticas (Darland, 1998). Aunque su presencia no ha sido demostrada directamente, se piensa que noc/oFQ tiene un papel en la funcin inmunolgica, ya que el RNAm transcrito de ORL1 est presente en linfocitos humanos (Wick y cols., 1995) y de ratn (Halford y cols., 1995).

1.4.2 MECANISMO DE ACCIN DE NOC/OFQ Debido a que las asas intracelulares del receptor ORL-1 y de los receptores opioides poseen un gran nmero de secuencias idnticas, es factible anticipar que ORL-1 est acoplado a los mismos efectores celulares regulados por protenas G(i/o) (Hawes y cols, 2000). Anteriormente se haba reportado que altas dosis de etorfina y dinorfina(1-13 y 1-17) (agonistas del receptor ) inhiban la acumulacin de AMPc estimulada por forscolina en clulas ovricas de hamster (CHO) (Mollereau y cols., 1994). En 1995 se demostr que la noc/oFQ produca el mismo efecto, pero en un proceso insensible a naloxona (Reinscheid y cols., 1995; Meunier y cols., 1995). Dos aos despus, Ma y colaboradores reportaron la presencia del receptor ORL-1 (Ma y cols., 1997) en la lnea

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celular de neuroblastoma-glioma 108-115 y encontraron que la noc/oFQ es capaz de inhibir a la adenilato ciclasa (AC) (esencial para la produccin de AMPc y para la subsecuente activacin de PKA), en un proceso sensible a toxina pertusis, pero no a naltrindole, demostrando que el receptor OLR-1 se acopla a una protena G(i/o). Por otra parte, la unin de noc/oFQ al receptor OLR-1 estimula a las subunidades y de la protena Gi en CHO, promoviendo la produccin de fosfatidil inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol, los cuales subsecuentemente activan a la PKC. Este efecto no fue revertido ni por naloxona (antagonista de los receptores , y ) ni por naltrindole (antagonista del receptor ). Sin embargo, el pretratamiento de estas clulas con toxina pertusis elimin completamente la activacin de PKC (Lou y cols., 1997). Siguiendo esta lnea, Pei y su grupo, en 1997, encontraron que la exposicin crnica de CHO a este pptido produce una desensibilizacin del receptor ORL-1, efecto que es revertido por inhibidores de PKC, pero no de PKA. Esto indica que PKC es la responsable de los procesos involucrados en la tolerancia y la dependencia a noc/oFQ. Registros de fijacin de voltaje con la modalidad parche perforado han demostrado que el receptor ORL-1 est acoplado al canal de potasio rectificante de entrada (GIRK), debido a que dosis nanomolares de noc/oFQ activan este canal e incrementan la conductancia al K+ en oocitos de Xenopus (Matthes y cols., 1996) y en neuronas del raf dorsal de la rata, mediante un proceso insensible a naloxona (Vaughan y Chistie, 1996). La activacin de estos canales por noc/oFQ induce una corriente saliente de K+ en neuronas del locus coeruleus (Connor y cols., 1996). y en clulas de la amigdala (Meis y Pape, 1998). Esto canales tambin son blanco de la noc/oFQ en neuronas de la sustancia gris periacueductal (Vaughan y cols., 1997) y del hipotlamo ventromedial (Lee y cols., 1997), adems en clulas de los ncleos supraquiasmtico, supraptico y arcuato de la rata (Allen y cols., 1999; Slugg y cols., 1999; Wagner y cols., 1998), as como en neuronas piramidales del hipocampo de rata (Amano y cols., 2000) y de ratn (Ikeda y cols., 1997). Las corrientes activadas en la amgdala, en la sustancia gris periacueductal, en el hipotlamo ventromedial y en los ncleos supraquiasmtico, supraptico y arcuato no fueron revertidas por naloxona; sin embargo, las corrientes evocadas en el locus coeruleus fueron levemente

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antagonizadas por este frmaco. Por su parte, las corrientes salientes de K+ en las neuronas del hipocampo de rata fueron insensibles a nocistatina (ver pagina 11). Adems de estos resultados, se ha reportado una influencia de noc/oFQ sobre los canales de calcio dependientes de voltaje. Por ejemplo, en clulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y que expresan naturalmente el receptor ORL-1, el pptido inhibe en un 40 % la conductancia del canal de calcio tipo N, efecto que es abolido por toxina pertusis pero no por antagonistas opioides (Connor y cols., 1996). A su vez, Knoflach y su grupo, en 1996, registrando neuronas de hipocampo de rata, demostraron que los canales de calcio tipo L, N y P/Q son parcialmente inhibidos al aplicar noc/oFQ en la perfusin, en un proceso sensible a toxina pertusis e insensible a naloxona. Estos datos sugieren que la accin de la noc/oFQ reduce la excitabilidad neuronal o la secrecin de neurotransmisor al activar los canales GIRK y al reducir las corrientes de Ca2+ que fluyen a travs los canales tipo N, los cuales estn involucrados en el control de la exocitosis de los neurotransmisores.

1.5 PPTIDOS OPIOIDES EN INVERTEBRADOS Estudios multidisciplinarios, farmacolgicos, fisiolgicos e inmunohistoqumicos han sido de gran utilidad en la investigacin de la biologa comparada de los pptidos opioides y de las posibles funciones en las que participan a lo largo de la escala filogentica. Actualmente podemos afirmar que los pptidos opioides tuvieron su origen en organismos menos evolucionados, como los protozoarios, y que son protenas ancestrales con analoga entre los sistemas neurosecretores de los invertebrados y de los vertebrados superiores. En los moluscos, el sistema opioide est involucrado en la locomocin (Burrowes y cols., 1983), en la termorregulacin (Kavaliers y Hirst, 1984), en la conducta alimenticia (Kavaliers y Hirst, 1987), en la nocicepcin (Kavaliers y Perrot -Sinal, 1997) y en el sistema inmunolgico (Sonetti y cols., 1997). Estudios inmunohistoqumicos han demostrado una amplia distribucin de pptidos opioides en el sistema nervioso de invertebrados. Mediante tcnicas de inmunofluorescencia y e inmunohistoqumica con anticuerpos policlonales contra estos pptidos, se ha identificado la presencia de Leu-encefalina en los ganglios cerebrales y

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parietales de Helix aspersa, as como de Met-encefalina distribuida homogneamente en todo el sistema nervioso de este molusco (Len-Olea M., 1987 y 1993). Estos resultados fueron corroborados por trabajos en que se indujo la liberacin de Met y Leu encefalinas en la masa ganglionar de Helix aspersa mediante pulsos despolarizantes de potasio (Pellicer y cols., 1993). El efecto de los pptidos opioides sobre las neuronas del sistema nervioso de los invertebrados no es claro, debido a que la mayora de los reportes indican que los opioides tienen un efecto dicotmico sobre la descarga de las clulas; por ejemplo: mediante la tcnica de registro intracelular, se ha reportado que la morfina produce respuestas despolarizantes e hiperpolarizantes en las neuronas del caracol Helix locuorum (Bezrukova y Solntseva, 1981). La naloxona inhibe la accin de los opioides endgenos y es capaz de producir despolarizacin e hiperpolarizacin de la membrana plasmtica cuando es aplicada sobre neuronas del ganglio visceral y parietal derecho del caracol Helix aspersa, afectando la frecuencia de descarga de las clulas (Gutirrez, 1992). Asimismo, se ha demostrado que la naloxona produce efectos tanto excitadores como inhibidores sobre neuronas del complejo periesofgicos de Helix locuorum (Romanenko, 1987). En el caracol Helix aspersa la Met-encefalina reduce la amplitud de los potenciales postsinpticos excitatorios (EPSPs), acortando su duracin y alargando su fase de posthiperpolarizacin; sugiriendo que ejerce una modulacin presinptica (Gutirrez, 1994). Por otra parte, se ha planteado que los pptidos opioides juegan un papel fundamental en procesos analgsicos y nociceptivos en invertebrados, ya que la aplicacin de morfina bajo la cavidad del manto del caracol terrestre Cepaea nemoralis produce un aumento en la latencia a estmulos trmicos de manera anloga a las respuestas analgsicas reportadas en vertebrados (Kavaliers y cols., 1983). A su vez, la aplicacin de noc/oFQ por esta misma va reduce el periodo de latencia a la estimulacin trmica, produciendo un efecto hiperalgsico contrario al de los pptidos opioides (Kavaliers y Perrot-Sinal, 1997). Por medio de tcnicas inmunohistoqumicas, se demostr la presencia de noc/oFQ en el sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa (Snchez-lvarez y cols.,

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manuscrito en preparacin), el marcaje para el pptido es fuerte en el ganglio cerebral (Figura 6A) ya que se observa que existen reas densamente marcadas en las tres regiones del ganglio (anterior, media y posterior). Como nos muestra la figura 6, el marcaje contra noc/oFQ se encuentra presente tanto en neuronas (Figura 6C y D) como en fibras nerviosas (Figura 6B) las cuales pueden estar proyectando hacia regiones subcerebrales. Los ganglios pedal, pleural y parietal presentaron tambin

inmunorreactividad al pptido aunque el marcaje en estas regiones fue moderado. Por su parte, el ganglio visceral no presento fibras ni neuronas inmunorreacitvas a noc/oFQ. En el presente trabajo no se pretende obtener una visin global del proceso nociceptivo producido por la noc/oFQ en el caracol, sino dilucidar su efecto a nivel celular, empleando como modelo biolgico al caracol terrestre Helix aspersa.

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81m Figura 6. (A) Vista panormica de la parte anterior del ganglio cerebral muestra abundantes fibras inmunorreactivas a nociceptina en los ganglios cerebrales. Neuronas positivas presentes en la parte lateral e inferior de ambos ganglios. (B) Fibras que proyectan al nervio cerebropedal izquierdo fuertemente positivas a nociceptina. Neuronas pequeas positivas (15-26 m de dimetro), localizadas en la parte posterior del postcerebro. (C) Ampliacin de neuronas pequeas (9-11 m de dimetro) en la parte lateral del postcerebro derecho, adems fibras que forman una densa red a travs del neuropilo. (D) Fibras inmunorreactivas a nociceptina forman una extensa y densa red en la regin medial del postcerebro derecho. (E) Grupo de neuronas pequeas (10-12 m de dimetro) positivas a nociceptina, localizadas en el borde lateral del mesocerebro izquierdo. Este grupo no se muestra en la fotografa panormica. 24

JUSTIFICACIN
Debido a que se ha demostrado un incremento en la sensibilidad al dolor en el caracol terrestre Cepaea nemoralis, al administrar noc/oFQ (Kavaliers y Perrot-Sinal, 1996) bajo la cavidad del manto, y debido a la presencia de este neuropptido en el sistema nervioso del caracol Helix aspersa (Len-Olea, manuscrito en preparacin); se pretende medir su influencia sobre la actividad elctrica de las neuronas del complejo periesofgico, ya que estas clulas sintetizan noc/oFQ y muy probablemente receptor ORL-1.

HIPTESIS
La presencia de noc/oFQ en el caracol terrestre Helix aspersa, es capaz de modular la actividad elctrica (frecuencia de descarga) y la morfologa del potencial de accin de las neuronas del complejo periesofgico del caracol terrestre Helix aspersa, ya que tanto los receptores a opioides como el receptor ORL-1 se encuentran acoplados a protenas G(i/o), las cuales, activan canales de potasio rectificantes de entrada (GIRK) y bloquean canales de calcio tipo L, N y P/Q, entre otros procesos. En conjunto estos cambios en la conductancia de membrana pueden modificar el disparo de potenciales de accin y el patrn de descarga de las neuronas, as como sus interacciones sinpticas.

OBJETIVOS
General Determinar el efecto de la noc/oFQ sobre la actividad elctrica de las neuronas del caracol terrestre Helix aspersa Particulares 1) Analizar el efecto de la noc/oFQ sobre la frecuencia de descarga de las neuronas.

2) Analizar el efecto de noc/oFQ en las distintas fases del potencial de accin.

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MATERIAL Y MTODOS
3.1. PREPARACIN DE LAS DROGAS La noc/oFQ fue disuelta en agua desionizada de donde se obtuvieron alcuotas de 10 l a concentracin 1 mM, las cuales fueron almacenadas a -20C. La noc/oFQ fue diluido en solucin Ringer normal para molusco compuesta de la siguiente manera (mM): 75 NaCl, 4 KCl, 0.005 MgCl2, 5 CaCl2, 7 Hepes, ajustando el pH a 7.4 con NaOH. El volumen final de microperfusin (100 l) fue complementado con 1% de albmina srica bovina libre de proteasas, con la finalidad de estabilizar a la noc/oFQ, en la solucin. Para que a noc/oFQ no fuese degradada se protegi, aadiendo a la solucin Ringer, bacitracina (3 M), un potente inhibidor de endopeptidasas (Aleixandre y cols., 1981). 3.2 MODELO BIOLGICO Se utilizaron caracoles adultos Helix aspersa, los cuales se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio 10 das antes de la diseccin. Se colocaron en cajas de acrlico que contenan una capa de 10 cm de tierra; se alimentaron con avena y lechuga y fueron hidratados todos los das. 3.3 DISECCIN El caracol se coloc en una cmara de diseccin con fondo de sylgard, y se le dej en reposo hasta que su cuerpo quedara adherido a ella. En seguida se removi la concha realizando un corte transversal en la base de sta e inmediatamente despus se fij el cuerpo con alfileres y se agreg solucin Ringer para molusco a temperatura ambiente. A continuacin, bajo un microscopio estereoscpico (Nikon SMZ-10), se realiz un corte en la piel sobre la regin dorsal a lo largo de la cabeza, para exponer la masa visceral, que posteriormente fue removida con el fin de descubrir los ganglios subesofgicos. Posteriormente se retir el esfago, lo que nos permiti apreciar el ganglio cerebral, el cual est situado por debajo de ste. Una vez removida toda la masa visceral, se extrajo el complejo periesofgico y se coloc en la cmara de registro (con capacidad es de 2 ml) con ayuda de alfileres que nos permiten sujetarlo. Consecutivamente
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empleando pinzas y tijeras finas se retir la cpsula de tejido conectivo que cubre los ganglios, exponiendo de esta manera los grupos de neuronas.
ORC

. .
AMPLIFICADOR

-49

GRABADORA
!"#$
0:04:10

DV

CA/D

Figura 7. Montaje de la preparacin del sistema nervioso del caracol para el registro intracelular. La actividad elctrica es regitrada usando un amplificador de DC y se observa en un osciloscopio de rayos catdicos (ORC). El registro se grab usando un sistema de grabacin en videocasetes para ser procesada posteriormente en una computadora PC con la ayuda de un discriminador de ventana (DV) y un conversor analgico/digital (CA/D).

3.3.1 REGISTRO INTRACELULAR Una vez disecada la masa ganglionar se mont en una cmara de registro donde se fij con alfileres para sujetarla. Se perfundi de manera constante (2ml / min) con solucin Ringer extracelular para molusco. Para el registro intracelular, se usaron

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microelectrodos de vidrio con resistencia de entre 30 y 60 M que fueron llenados con solucin 3 M de cloruro de potasio (KCl). Se emple un osciloscopio de rayos catdicos (Tektronix 2214) y un amplificador DC (Axon Instruments) para monitorear el registro y un micromanipulador hidrulico el cual nos ayudo a introducir el microelectrodo en la clula. Los datos se guardaron en videocasetes para su posterior procesamiento (Figura 7).

3.3.1.1 MICROPERFUSIN CON noc/oFQ El trabajo consisti fundamentalmente en realizar registros intracelulares en el complejo del ganglio subesofgico y cerebral para probar la influencia de la noc/oFQ la cual se perfundi cercana al sitio de registro con una microjeringa Hamilton (100 l) unida a una cnula conectada a una micropipeta de vidrio que se encontraba montada en un manipulador, lo que nos permiti aproximar la droga a la zona de registro. Se perfundieron en la cmara de registro 100 l de orfanina 1, 10, 50 y 100 M lentamente, para eliminar cualquier artefacto mecnico en el registro. Cabe destacar la preparacin se prefundi continuamente con solucin salina durante el transcurso del experimento y de la aplicacin del pptido.

3.4 ANLISIS DE RESULTADOS Para el anlisis de los resultados, fue necesario modificar el programa de cmputo Analnew7 (Soto y cols., 1997) el cual, nos permiti estudiar tanto la morfologa del potencial de accin como el intervalo de tiempo entre las espigas de las clulas registradas (Apndice 1). Mediante un conversor analgico digital (DigiData 1200 de Axon Instruments) y el sofware analnew7 (Soto y cols., 1997, Soto y cols., 2000) se digitaliz (0.2, 3 y 10 KHz) la actividad elctrica de las neuronas de la masa ganglionar durante el registro control y despus de la microperfusin con noc/oFQ, con la finalidad de determinar si las fases de los potenciales de accin (amplitud y duracin del potencial de accin, amplitud de la posthiperpolarizacin y pendiente de despolarizacin, repolarizacin y

posthiperpolarizacin) se vean afectadas al aplicar este neuropptido.

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Por su parte, el anlisis de intervalos interespigas se realiz con la ayuda de un discriminador de ventana (Samuel Cid, 2000) y el programa de cmputo analnew7, la captura de los datos tanto para el registro control como para el experimental fue de 1 minutos; durante este periodo, se almacen el nmero de espigas producidas por la clula registrada, lo cual nos permiti cuantificar el nmero de potenciales de accin producidos por unidad de tiempo. A la vez, se calcul el tiempo promedio de los intervalos entre espigas (t), la desviacin estndar de los intervalos interespigas () y el coeficiente de variacin de los mismos (/t). 3.5 OBTENCIN DE LA noc/oFQ La noc/oFQ fue aislada de cerebro de rata de manera manual en fase slida por el procedimiento de qumica de aminocidos Fmoc (Kowalczyk y OShea, 1997), purificada por dos pasos secuenciales de cromatografa de exclusin en gel y por HPLC fase reversa, purificado a homogeneidad. Su masa fue verificada por espectrometra de masas. Todo esto fue realizado en el Instituto Mexicano de Psiquiatra de la ciudad de Mxico, en el laboratorio del Dr. Benito Antn.

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RESULTADOS
4.1 Controles Los criterios empleados para determinar la inclusin de los registros en el estudio fueron: 1) que las neuronas registradas tuvieran un potencial de membrana mayor a -40 mV, 2) que el potencial de accin tuviera sobretiro y 3) que el registro se mantuviera estable a lo largo del tiempo sin grandes cambios o tendencias ostensibles en el potencial de membrana. Para demostrar que nuestro sistema de microperfusin funcionaba

adecuadamente decidimos estudiar el efecto del cido glutmico 1 mM (n=1) sobre las neuronas del complejo periesofgico del caracol. El efecto de este neurotransmisor ha sido ya descrito en la literatura (Kerkut y cols., 1975). Al aplicarlo, la respuesta se caracteriz por presentar un lapso inhibitorio de alrededor de 6 minutos, seguido de un notable aumento en la frecuencia de descarga de la clula (Figura 9). El efecto del cido glutmico fue revertido a los 15 minutos despus de la aplicacin. De esta manera corroboramos que nuestro sistema de microinyeccin funcionaba

correctamente.
Ac. Glutmico 1 mM

0 mV 10 mV

5 min

10 seg

Figura 9. Registro intracelular de una neurona del ganglio parietal derecho del caracol. La actividad elctrica de la clula se digitaliz a 200 Hz (exp. 18). Luego de la microaplicacin del cido glutmico, se observa un efecto inhibidor con una hiperpolarizacin de cerca de 20 mV, seguido luego de varios minutos por un aumento en la actividad elctrica de la clula.

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Asimismo, probamos que nuestro sistema de microperfusin no influyera en el registro produciendo algn artefacto mecnico; para ello, decidimos microperfundir solucin Ringer normal sin agregar ninguna droga (n=1). Los resultados arrojados por este experimento demuestran que no existe ningn cambio entre el registro control y el correspondiente a la microperfusin de Ringer (Figura 10). Por otra parte, al momento de diluir la nociceptina en solucin Ringer para obtener el volumen final de microperfusin, tuvimos que agregar 1% de suero bovino fetal (BSA), el cual permite la estabilidad del pptido en solucin, pero antes de ello decidimos probar s el BSA no influa en la actividad elctrica de las clulas y en la morfologa del potencial de accin. Para demostrarlo, microinyectamos BSA durante el registro (n=1). En este caso, no existe ninguna influencia del BSA sobre la descarga de las clulas ni sobre las propiedades del potencial de accin (datos no mostrados).

31000.dat 0 mV 10 mV

20 seg

Microperfusin con Ringer Figura 10. Actividad elctrica de una neurona del ganglio parietal derecho del caracol, digitalizada a 200 Hz. Se observa que no existe ningn cambio en la frecuencia de descarga de la clula al microperfundir Ringer para molusco Las lneas que delimitan la microperfusin son pequeos pulsos hiperpolarizantes los cuales ilustran el inicio y la finalizacin de la aplicacin de Ringer (o de noc/oFQ en el caso de algunas figuras que se presentan posteriormente).

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Con la idea de proteger a la nociceptina de peptidasas que pudieran degradarla, decidimos adicionar bacitracina (un inhibidor de peptidasas) al Ringer de perfusin. Quisimos comprobar tambin si esta enzima era capaz de producir un efecto sobre la actividad elctrica y la forma del potencial de accin de las neuronas del caracol, ya que se ha descrito que la bacitracina, al ser coaplicada con encefalinas, potencia el efecto de stas en el sistema nervioso (Aleixandre y cols., 1981). La aplicacin de la bacitracina 3 M (n=1) no produjo ningn cambio en la actividad elctrica de las clulas con respecto a su registro control y tampoco afect la morfologa del potencial de accin de las neuronas (datos no mostrados). Se realiz tambin un experimento en el cual se perfundi Ringer con bacitracina 3 M y se microperfundi Ringer con 1% de BSA, de la misma forma como se microinyect la noc/oFQ; sto, con la finalidad de demostrar que no existe ninguna influencia de la bacitracina y del BSA sobre el potencial de accin y sobre la actividad elctrica de las neuronas al ser coaplicados ambos frmacos (datos no mostrados).

4.2 Efectos de la noc/oFQ Se realizaron un total de 40 experimentos en los cuales se registraron neuronas del complejo periesofgico del caracol Helix aspersa. Se aplic noc/oFQ 1 M (n=6), 10 M (n=8), 50 M (n=4) y 100 M (n=6) (Tabla 2). En todos los experimentos, se grab la actividad espontnea como control durante 5 minutos y posteriormente se registr su actividad durante 15 minutos con la droga. En un total de 6 experimentos en neuronas de los ganglios parietales y visceral se aplic noc/oFQ 1 M (Tabla 2). Cabe destacar que para esta serie de experimentos no se protegi al pptido con bacitracina en la perfusin y tampoco se adicion BSA al volumen final de microinyeccin. En estos experimentos, el porcentaje de cambio de la media de los intervalos interespigas entre el registro control y el correspondiente a noc/oFQ no present grandes modificaciones, ya que la media de los porcentajes de cambio para esta concentracin (la cual incluye el porcentaje de cambio de todos los experimentos realizados a dosis 1 M) fue del 5.1% 3.8. Estos resultados, nos indican que existen cambios
32

Excitador Exp19 Exp.21 Exp.22 Exp.26 Exp.27 Exp.63 Excitador X

1 micromolar (n=6) Inhibidor

Sin efecto x x x x x x

10 micromolar (n=8) Inhibidor

Sin efecto x

Exp.30 Exp.52 Exp.53 Exp.54.1 Exp.55.1 Exp.61.1 Exp.62 Exp.64

x x x X x x Excitador 50 micromolar (n=4) Inhibidor x x x Excitador X X 100 micromolar (n=6) Inhibidor Sin efecto Sin efecto x

Exp.54.2 Exp.55.2 Exp.57 Exp.61.2

Exp.46 Exp.48 Exp.49.1 Exp.50 Exp.63.2 Exp.65

x x x x

Tabla 2. Muestra un resumen de los experimentos realizados con noc/oFQ a diferentes concentraciones y el efecto encontrado para cada uno de ellos.

cambios muy ligeros en la frecuencia de descarga de las clulas despus de la microperfusin con la noc/oFQ 1 M (Figura 11A). Por su parte, no se presentaron variaciones ni en el potencial de membrana ni en la morfologa del potencial de accin antes y despus de la microperfusin con el pptido (Figura 11B).

33

3998-4.dat 0mV 15 mV

noc/oFQ 1 M

20 seg

0 mV

___Exp.64 control (21299-7) Vmem= -61.5 mV AmpPA= 66.6 mV AmpSP= 52.7 mV DuraPA= 6.9 ms Dura50= 4 ms d+= 22.56 mV/ms d-= 22.57 mV/ms AmpPHP= 6.1 mV pPHP= 0.01 mV/ms ....Exp.64 noc/oFQ 1 M (21299-8) Vmem= -61 mV AmpPA= 66.6 mV AmpSP= 53 mV DuraPA= 6.9 ms Dura50= 4 ms d+= 22.56 mV/ms d-= 21.39 mV/ms AmpPHP= 6 mV pPHP= 0.02 mV/ms

10 mV 20 ms

Figura 11. (A) Registro intacelular de una neurona del ganglio parietal derecho del caracol digitalizada a 200 Hz, en donde se muestra parte del registro control y la microperfusin de noc/oFQ 1 M. Se observa que el pptido no produjo cambios en la frecuencia de descarga de la neurona. (B) Valores promedio de los potenciales de accin en condiciones control (lnea continua) y despus de la aplicacin de noc/oFQ 1 M (lnea punteada) se observa que no existe ningn cambio en la morfologa de la espiga del control y durante la microperfusin con el neuropptido (exp. 64).

Posteriormente se realiz una serie de 8 experimentos sobre las neuronas del ganglio parietal derecho y visceral, donde se prob el efecto de noc/oFQ 10 M (Tabla 2). Esta vez, el pptido fue protegido con bacitracina y estabilizada con BSA. A esta concentracin 2 neuronas del ganglio parietal presentaron un efecto excitador, el cual produjo una ligera despolarizacin de alrededor de 5 mV que provoc una disminucin de los intervalos interespigas con respecto al registro control. El porcentaje de cambio en los intervalos interespigas al aplicar la noc/oFQ aument el 42.6% 21.9 con

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respecto al registro control, efecto que fue revertido 2 minutos despus de la microperfusin del pptido (Figura 12A). Por su parte, la noc/oFQ no influy drsticamente en la morfologa del potencial de accin, excepto en la fase de posthiperpolarizacin, la cual, se hizo ms rpida, variando de 0.04 mV/ms a 0.1 mV/ms despus de la aplicacin del neuropptido (Figura 12B).

16799-8.dat 0 mV 20 mV

noc/oFQ 10 M

20 seg

0 mV

B
10 mV 20 ms

___Exp.61.1 control (16799-9) Vmem= -55.1 mV AmpPA= 67.2 mV AmpSP= 59 mV DuraPA= 11.2 ms Dura50= 5.3 ms d+= 19.53 mV/ms d-= 19.53 mV/ms AmpPHP= 7.2 mV pPHP= 0.04 mV/ms ....Exp.61.1 noc/oFQ 10 M (16799-10) Vmem= -51 mV AmpPA= 61.4 mV AmpSP= 55.4 ms DuraPA= 11 ms Dura50= 5.5ms d+= 18.55 mV/ms d-= 17.58 mV/ms AmpPHP= 9.2 mV pPHP= 0.1 mV/ms

Figura. 12. (A) Registro intracelular de una neurona del ganglio parietal del caracol digitalizada a 200 Hz, donde se observa un aumento notable en la frecuencia de descarga de la clula despus de la microperfusin de noc/oFQ 10 M. (B) Valor promedio de los potenciales de accin del registro control (lnea continua) y despus de la aplicacin de noc/oFQ 10 M (lnea punteada) en donde se aprecia una despolarizacin de la neurona y un cambio en la pendiente de posthiperpolarizacin (de 0.04 mV/ms a 0.1 mV/ms) despus de la perfusin del neuropptido (exp.61.1).

A esa misma concentracin (10 M), se encontr que 3 neurona del ganglio parietal presentaron un efecto inhibitorio el cual consisti en una ligera hiperpolarizacin
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que provoc una disminucin de la frecuencia de descarga de las neuronas despus de la microperfusin de la noc/oFQ (Figura 13A). El cambio en los intervalos interespigas despus de aplicar el pptido aument el 19.2% 8.8%. Por su parte, las distintas fases del potencial de accin no se modificaron en gran medida al microperfundir la preparacin con este neuropptido, aunque la amplitud del potencial de accin aumento alrededor del 8 % (74.9 a 80.9 mV) (Figura 13B).

19799-2.Dat 0 mV 15 mV

20 seg

Noc/oFQ 10 M
___Exp.62 control (19799-12) Vmem= -62.4 mV AmpPA= 74.9 mV Dura50= 6.8 ms d+= 17.58 mV/ms d-= 17.58 mV/ms AmpPHP= 4.5 mV pPHP= 0.01 mV/ms

0 mV

10 mV 20 ms

....Exp.62 noc/oFQ 10 M (19799-13) Vmem= -64.5 mV AmpPA= 80.9 mV Dura50= 6.5 ms d+= 20.51 mV/ms d-= 21.48 mV/ms AmpPHP= 4.6 mV pPHP= 0.01 mV/ms

Figura 13. (A) Neurona del ganglio parietal derecho digitalizada a 200 Hz. Se observa una ligera hiperpolarizacin al finalizar la perfusin de noc/oFQ 10 M que trae como resultado un aumento entre los intervalos interespigas de la clula (B) Valores promedio de los potenciales de accin del registro control (lnea continua) y durante la microperfusin de noc/oFQ (lnea punteada). Se observa que una ligera hiperpolarizacin despus de la aplicacin del pptido y un aumento en la amplitud de la espiga, (exp. 62).

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En 3 neuronas en las que se aplic noc/oFQ 10 M no se observ efecto sobre la frecuencia de descarga (Figura 14A) ya que el cambio en los intervalos interespigas despus de aplicar el pptido fue slo del 3.2% 2.4%. Por su parte, la morfologa del potencial de accin tampoco se modific al microperfundir el neuropptido a esta concentracin (Figura 14B).
28699-13.dat

0 mV

A
15 mV

noc/oFQ 10 M

20 seg

0 mV

exp.64n exp.64c

___Exp.54.1 control (28699-23) Vmem= -42.9 mV AmpPA= 91.9 mV AmpSP= 59 ms DuraPA= 9.9 ms Dura50= 8 ms d+= 25.39 mV/ms d-= 14.65 mV/ms AmpPHP= 4.8 mV pPHP= 0.01 mV/ms

....Exp.54.1 noc/oFQ 10 M (28699-24) Vmem= -42.5 mV AmpPA= 92.3 mV AmpSP= 59.6 ms DuraPA= 10.9 ms 10 mV Dura50= 8.8 ms d+= 23.44 mV/ms 20 ms d-= 13.63 mV/ms AmpPHP= 4.6 mV pPHP= 0.01 mV/ms

Fig 14. (A) Clula del ganglio parietal derecho del caracol digitalizada a 200 Hz. Se observa que no existen cambios en la frecuencia de descarga en el registro control y despus de la microperfusin de noc/oFQ 10 M. Se alcanza a apreciar un ligero aumento entre los intervalos interespigas al momento de la aplicacin del frmaco (B) Datos promedio de los potenciales de accin del registro control (lnea continua) y durante la aplicacin de noc/oFQ (lnea punteada). Se muestra que no existen cambios en la morfologa de las espigas antes y despus de la perfusin con el neuropptido (exp. 54.1).

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Se realizaron 4 experimentos en los que se prob el efecto de noc/oFQ 50 M sobre las neuronas del ganglio parietal y visceral (Tabla 2). En estos casos, el neuropptido fue protegido con bacitracina y estabilizado con BSA. A esta concentracin, dos neuronas presentaron un efecto inhibitorio que consisti en una hiperpolarizacin de la clula (Figura 15A), la cual mostr una disminucin del 23.3% 13.8% en los intervalos interespigas despus de la microperfusin con la noc/oFQ. Por su parte, las distintas

28699-14.dat

0 mV 10 mV

Noc/oFQ 50 M

20 seg

0 mV

___Exp.54.2 control (28699-26) Vmem= -44.7 mV AmpPA= 89.9 mV AmpSP= 82.8 ms DuraPA= 9 ms Dura50= 7.9 ms d+= 23.44 mV/ms d-= 14.65 mV/ms AmpPHP= 6.3 mV pPHP= 0.01 mV/ms ....Exp.54.2 noc/oFQ 50 M (28699-27) Vmem= -48.6 mV AmpPA= 91.5 mV AmpSP= 83.3 ms DuraPA= 10.3 ms Dura50= 7.8 ms d+= 24.41 mV/ms d-= 15.63 mV/ms AmpPHP= 6.7 mV pPHP= 0.01 mV/ms

10 mV 20 ms

Figura 15. (A) Digitalizacin (200 Hz) de una neurona del ganglio visceral. Control y microperfusin de noc/oFQ 50 M. Se observa una ligera hiperpolarizacin, que trae como resultado una disminucin en la frecuencia de descarga de la clula. (B) Valores promedio para los potenciales de accin del registro control (lnea continua) y despus de la microperfusin con noc/oFQ 50 M (lnea punteada). Como podemos apreciar existe una hiperpolarizacin segundos despus de la aplicacin del neuropptido (exp.54.2). 38

fases del potencial de accin no presentaron variaciones al aplicar el neuropptido, aunque el potencial de membrana disminuy alrededor de 4 mV (Figura 15B).
90799-13.dat

0 mV 20 mV

20 seg

noc/oFQ 50 M
___Exp.61.2 control (9799-16) Vmem= -68.8 mV AmpPA= 70.9 mV AmpSP= 59 mV DuraPA= 9 ms Dura50= 4.7 ms d+= 27.34 mV/ms d-= 22.46 mV/ms AmpPHP= 7.4 mV pPHP= 0.03 mV/ms

0 mV

10 mV 20 ms

....Exp.61.2 noc/oFQ 50 M (9799-18) Vmem= -68.8 mV AmpPA= 69.9 mV AmpSP= 58.6 mV DuraPA= 8.5 ms Dura50= 4.7 ms d+= 26.37 mV/ms d-= 21.48 mV/ms AmpPHP= 7.1 mV pPHP= 0.02 mV/ms

Figura 16. (A) Registro intracelular de una neurona del ganglio visceral digitalizada a 200 Hz. Se observa parte del registro control y la microperfusin con el neuropptido. En este caso se aprecia que la noc/oFQ no produjo cambios en la frecuencia de descarga de la clula. (B) Valor promedio de los potenciales de accin de una neurona del ganglio visceral en donde se aprecia que no existen cambios en su morfologa despus de la aplicacin de noc/oFQ 50 M, con respecto al control (exp.61.2).

Los dems experimentos realizados a concentracin 50 M, no produjeron cambios en la frecuencia de descarga, ya que el porcentaje de cambio de los intervalos interespigas se modific slo 2.9% 1.1% despus de aplicar la noc/oFQ. Asimismo, la

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morfologa del potencial de accin no se vio afectada por la microperfusin de noc/oFQ (Figura 16). Se hicieron tambin 6 experimentos a concentracin 100 M (Tabla 2); 4 de ellos en el ganglio cerebral y 3 en el parietal derecho. En estos casos, la noc/oFQ fue protegida con bacitracina y estabilizada con BSA. Dos de las neuronas registradas en el ganglio cerebral presentaron un efecto excitador, el cual consisti en una leve despolarizacin (5 mV) que provoc una disminucin de los intervalos interespigas del 27.6% 11.5% despus de la microperfusin con noc/oFQ (Figura 17A). En ambos
12399-11.dat

0 mV

20 mV

Noc/oFQ 100 M

20 seg

0 mV

___Exp.48 control (12399-11) Vmem= -53 mV AmpPA= 85.8 mV AmpSP= 73 mV DuraPA= ms Dura50= 6.67 ms d+= 26.37 mV/ms d-= 16.49 mV/ms AmpPHP= 8.9 mV pPHP= 0.04 mV/ms ....Exp.48 noc/oFQ 100 M (12399-18) Vmem= -53.9 mV AmpPA= 86.4 mV AmpSP= 74.1 mV DuraPA= ms Dura50= 7 ms d+= 26.95 mV/ms d-= 15.23 mV/ms AmpPHP= 8.6 mV pPHP= 0.04 mV/ms

10 mV 20 ms

40

Figura 17. (A) Registro intracelular de neurona del ganglio cerebral, digitalizada a 200 Hz, presenta un ligero aumento en la frecuencia de descarga despus de la aplicacin de noc/oFQ 100 M. (B) Datos promedio de los potenciales de accin de la misma clula, en donde se observa que no existen cambios notables en la morfologa de las espigas entre el registro control y despus de la aplicacin de noc/oFQ 100 M, (exp.48).

casos no se produjo ningn cambio en la forma del potencial de accin, aunque el potencial de membrana disminuy alrededor de 5 mV (Figura 17B). El patrn global de descarga se modific ligeramente despus de la aplicacin del pptido. Los dems experimentos realizados a concentracin 100 M, no presentaron cambios drsticos en la frecuencia de descarga de las clulas (Figura 18A) ya que los
11299-4.dat

0 mV

20 mV

noc/oFQ 100 M

20 seg

0 mV

B
10 mV 20 ms

___Exp.63.2 control (11299-19) Vmem= -52.7 mV AmpPA= 76.1 mV AmpSP= 69 mV DuraPA= 11 ms Dura50= 5.33 ms d+= 26.07 mV/ms d-= 18.75 mV/ms AmpPHP= 9.3 mV pPHP= 0.07 mV/ms ....Exp.63.2 noc/oFQ 100 M (11299-20) Vmem= -52.4 mV AmpPA= 75.6 mV AmpSP= 69.1 mV DuraPA= 11 ms Dura50= 5.33 ms d+= 25.78 mV/ms d-= 17.87 mV/ms AmpPHP= 9.2 mV pPHP= 0.06 mV/ms

Figura 18. (A) Actividad elctrica de una neurona del ganglio parietal derecho digitalizada a 200 Hz. Se aprecia que no hay cambios en la frecuencia de descarga de la clula despus de la aplicacin de noc/oFQ (B) Valor promedio de los potenciales de accin de la misma clula. No existen cambios entre la morfologa de las espigas del registro control y despus de la aplicacin del neuropptido (exp.63.2).

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intervalos interespigas se modificaron solo un 3.5% 1.5% despus de la aplicacin de la noc/oFQ (Figura 18B). Del total de experimentos realizados, el 37.5% de las neuronas fueron afectadas por la noc/oFQ. El 20.8 % presentaron efecto inhibitorio y el 16.7 % un excitatorio. A dosis 1 M no se observaron cambios, mientras que a 10 M el 62.5% de las clulas fueron afectadas por el pptido, de las cuales, el 25% desarrollaron un efecto excitatorio y el 37.5% un efecto inhibitorio. Por su parte, a concentracin 50 M el 50 % de las clulas desarrollaron un efecto inhibitorio. Mientras que a dosis 100 M, el 30 % de las neuronas presentaron un efecto excitatorio.

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DISCUSIN

Los resultados inmunohistoqumicos demuestran claramente la presencia de noc/oFQ en el sistema nervioso del caracol Helix aspersa, principalmente en fibras y neuronas localizadas en el cerebro anterior, en el cerebro medio y en el cerebro posterior, probablemente porque el ganglio cerebral, principalmente el mesacerebro, est involucrado en la respuesta a estmulos nociceptivos (Ieruzalimsky y col., 1994; Ratt y Chase, 1997). Curiosamente la inmunorreactividad a noc/oFQ fue decreciendo en tanto se alejaba del ganglio cerebral, por lo tanto, los ganglios pedal y pleural presentaron un abundante marcaje al neuroptido, posiblemente porque del ganglio cerebral emergen un gran nmero de fibras nerviosas que descienden a lo largo del anillo periesofgico y que desembocan en el ganglio pedal y pleural. Por su parte el ganglio parietal present una inmunorreactividad dbil, tanto en las neuronas como en las fibras nerviosas que inervan dicho ganglio. Probablemente este grupo de neuronas, junto con las del ganglio visceral puedan ser un blanco importante en la accin de la noc/oFQ De acuerdo con estos resultados podemos proponer que la noc/oFQ se sintetiza principalmente en clulas de los ganglios cerebral, pedal y pleural, debido a la alta inmunorreactividad presente en estas regiones del sistema nervioso del caracol. A su vez, el abundante marcaje que existe en las fibras nerviosas de estos ganglios, puede ser indicativo de un transporte antergrado a travs de estas fibras hasta las uniones sinpticas donde se realiza la comunicacin neuronal con clulas de otros ganglios, Por lo tanto, el efecto electrofisiolgico de la noc/oFQ es esperable en las neuronas que presentan los receptores ORL1 y no en las neuronas que liberan el pptido y que son las que se marcan en la inmunohistoqumica. Los resultados obtenidos mediante tcnicas inmunohistoqumicas han

demostrado una gran distribucin de noc/oFQ en el ganglio cerebral, pedal y pleural, moderada en el parietal y carente en el visceral. De la misma forma, se ha reportado la presencia de encefalinas en el sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa, en donde leu-encefalina est presente en la porcin anterior del ganglio cerebral y en el ganglio parietal y met-encefalina se encuentra distribuida homogneamente a lo largo

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de todo el complejo periesofgico (Len-Olea y cols., 1993). Pero aunque la noc/oFQ y las encefalinas puedan coincidir en una misma regin del sistema nervioso, no existen reportes en la literatura que demuestren la coliberacin de distintos pptidos opioides en una misma clula. Nuestros resultados indican que la noc/oFQ ejerce un efecto sobre las neuronas del sistema nervioso del caracol terrestre Helix aspersa, ya que en el 37.5% de los caso, la microperfusin de noc/oFQ sobre el complejo periesofgico produjo ligeras variaciones en el potencial de membrana, lo que trajo como consecuencia un cambio en la frecuencia de descarga de las clulas. Las variaciones en el potencial de membrana podran deberse a cambios en la permeabilidad a iones K+ y Ca+, ya que la noc/oFQ promueve la activacin de los canales GIRK e inhibe la de los canales de calcio tipo L, N y P/Q. En el presente estudio se encontr que a dosis bajas (1 M) la noc/oFQ no produjo efecto en el potencial de accin ni en la frecuencia de descarga de las neuronas, sto tal vez se debi a que en los experimentos realizados a esta concentracin el pptido no fue protegido con bacitracina ni estabilizado con BSA y probablemente la vida media y el efecto biolgico del pptido se vieron afectados en esas condiciones. A concentraciones ms elevadas (10 M, 50 M y 100 M) la microperfusin de noc/oFQ produjo cambios en la frecuencia de descarga de las neuronas y en el potencial de membrana. El anlisis de las distintas fases del potencial de accin indica que la noc/oFQ modifica el potencial de membrana y en algunos casos la pendiente de la posthiperpolarizacin. Esto sugiere que el pptido est actuando directamente sobre las propiedades de membrana de estas neuronas. Los datos electrofisiolgicos descritos en este trabajo concuerda con lo reportado por Snchez-lvarez y su grupo, quienes en 1997 encontraron que existe inmunorreactividad a noc/oFQ en los ganglios cerebrales y subesofgicos del caracol Helix aspersa. La IC50 que se ha reportado para noc/oFQ es de 0.9 nM y 1 nM (Meunier y col., 1995; Reinscheid y col., 1995), y aunque el efecto de este pptido ha sido probado en un amplio rango de concentraciones (desde 1 nM hasta 10 M) la mayora de los

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trabajos electrofisiolgicos han encontrado un efecto mximo a dosis 10 M. Nuestros resultados no concuerdan con estos reportes debido a que el efecto producido por la noc/oFQ en nuestra preparacin no vara al microperfundir el pptido a las diferentes dosis (10, 50 y 100 M). A concentracin 10 M la noc/oFQ ejerce un efecto dicotmico en las neuronas de los ganglios cerebral, parietal y visceral del caracol, debido a que en algunas ocasiones se produjo un aumento en la frecuencia de descarga debido a la despolarizacin de la clulas y en otras una disminucin de la misma, provocada por una hiperpolarizacin de las neuronas. Estos resultados concuerdan con lo reportado en la literatura debido a que un gran nmero de neurotransmisores presentes en el sistema nervioso del caracol Helix aspersa como lo son ACh, glutamato, 5-HT y dopamina ejercen un efecto dual sobre las neuronas del complejo periesofgico, ya que Kerkut y su grupo, en 1975 demostraron que la aplicacin por separado de cada uno de estos frmacos produce tanto despolarizaciones como hiperpolarizaciones de las neuronas de los ganglios visceral y parietal derecho. Ms interesante an es el hecho de que los mismos opioides, como es el caso de la morfina, y el antagonista de amplio espectro naloxona, producen igualmente un efecto dicotmico, ya que la aplicacin de cada uno de ellos produce igualmente efectos despolarizantes e hiperpolarizantes sobre las neuronas del sistema nervioso del caracol (Bezrukova y Solntseva, 1981; Romanenko, 1987). Aunque a dosis 50 M slo se observaron efectos inhibitorios no se descarta la posibilidad de que a esta concentracin la noc/oFQ pueda ejercer un efecto excitador indirecto, produciendo un efecto dual sobre las neuronas del complejo periesofgico del caracol. Lo mismo podra suceder a dosis 100 M, en donde la microperfusin del pptido nicamente present efectos excitadores. Los reportes que se tienen hasta el momento indican que la noc/oFQ produce una corriente saliente de K+ al activar canales GIRK. Dicha activacin trae como consecuencia una hiperpolarizacin de las clulas y por lo tanto, una disminucin en la frecuencia de descarga de las mismas, provocada por la prdida de K+ intracelular. Nuestros resultados indican que la microperfusin de noc/oFQ produce no slo efectos inhibidores, sino tambin excitadores sobre distintas neuronas del sistema nervioso del
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caracol (ver tabla 2). La explicacin a este acontecimiento se sustenta en el hecho de que en la preparacin del sistema nervioso para el registro, se mantienen intactas las entradas sinpticas y por lo tanto, no podemos descartar un efecto indirecto de la noc/oFQ sobre algunas clulas del complejo periesofgico (aunque en ningn caso se observaron cambios en los potenciales sinpticos luego de la aplicacin del neuropptido). Dicho de otra manera, el efecto excitador de la noc/oFQ tal vez pueda llevarse a cabo al inhibir alguna neurona que se encuentre modulando la descarga de la clula registrada, la cual, al ser liberada aumenta su frecuencia de descarga de manera considerable. Por otra parte, trabajos recientes han reportado que la noc/oFQ ejerce un efecto bifsico en la actividad elctrica de las neuronas de hipocampo de rata (Amano y col., 2000). Aunado a ello, se ha demostrado que la mayora de los neurotransmisores presentes en el sistema nervioso del caracol producen tambin un efecto bifsico en las clulas del complejo periesofgico (Kerkut y col., 1975). En contraste con estos resultados, la noc/oFQ no ejerce un efecto bifsico en la actividad elctrica de las neuronas de los ganglios cerebral, visceral y parietal del caracol, aunque no se descarta la posibilidad de que diversas entradas sinpticas puedan modular este tipo de descarga en algunas neuronas del sistema nervioso de este molusco. El intenso marcaje de neuronas en el ganglio cerebral nos hizo pensar en un principio, que el porcentaje de clulas sensibles a noc/oFQ en esta regin era mayor que en las neuronas de los ganglios subesofgicos, aunado a ello Ratt y Chase en 1997 reportaron que un gran nmero de vas nociceptivas se encontraban situadas en el cerebro del caracol, estos antecedentes nos inclinaron a realizar una serie de experimentos en esta regin. Desafortunadamente la gran mayora de clulas en el ganglio cerebral no presentan descarga espontnea. An as, nos pudimos percatar de que el efecto de la noc/oFQ es muy similar en las neuronas cerebrales y en las neuronas subesofgicas; lo que significa, que gran parte de la noc/oFQ que se sintetiza en los ganglios cerebrales es transportada a los ganglios pedal y pleural a travs de los nervios cerebro-pedales y cerebro-pleurales, y probablemente una gran cantidad de neuronas del ganglio parietal son blanco de neuronas pedales sensibles a noc/oFQ. Esta teora se sustenta gracias al

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trabajo de Kerkut y su grupo en 1970 en donde demuestran que varias neuronas parietales extienden proyecciones hacia el ganglio pedal y al mismo tiempo, un gran nmero de neuronas del ganglio visceral desarrollan conexiones con neuronas parietales. Por esta razn, es muy probable que en algunas ocasiones la noc/oFQ regule de manera indirecta la actividad elctrica de las neuronas parietales. Por su parte, la carencia de inmunorreactividad en las neuronas del ganglio visceral, nos hace pensar que la noc/oFQ modula la actividad de estas clulas de manera indirecta. Hemos enfatizado que la gran mayora de las neuronas del ganglio cerebral no presentaron descarga espontnea al momento de ser registradas, Este hecho, tal vez podra estar relacionado con cambios estacionales, ya que se ha demostrado que durante el invierno (periodo en el cual nosotros realizamos estos experimentos) la concentracin intracelular de potasio en un gran nmero de neuronas, es mucho ms elevado con relacin a otros meses (Kerkut, G. y Meech, R., 1967). Este aumento en la concentracin de potasio intracelular produce un incremento en el potencial de membrana de las clulas (-55 y -65 mV), el cual en condiciones normales se encuentra entre 45 y 50 mV. Este paquea hiperpolarizacin, podra impedir que se alcance el voltaje de activacin de los canales de sodio, los cuales son esenciales en la generacin de los potenciales de accin. Como se mencion en el primer captulo, el caracol Helix aspersa sintetiza un gran nmero de neurotransmisores y neuropptidos implicados en mltiples funciones dentro del sistema nervioso, por lo tanto, es probable que la noc/oFQ se encuentre regulando la liberacin de estos transmisores en las terminales presinpticas, de la misma forma en que lo hacen los pptidos opioides (Gutirrez, 1994), ya que tanto la noc/oFQ como los opioides inhiben la accin de los canales de calcio tipo L, los cuales, son indispensables en la liberacin del neurotransmisor. Esto nos permite proponer que la noc/oFQ acta como un neuromodulador dentro del sistema nervioso de los moluscos.

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CONCLUSIONES
La noc/oFQ modula la actividad elctrica de las neuronas del complejo periesofgico del caracol terrestre Helix aspersa. En el 37.5 % de los casos la microperfusin de noc/oFQ produjo variaciones en el potencial de membrana de las clulas y en otras afecto la fase de posthiperpolarizacin del potencial de accin. Este efecto podra ser la base de las modificaciones conductuales en la reduccin de la latencia a estmulos trmicos, cuando se inyecta noc/oFQ bajo la cavidad del manto en el caracol Cepaea nemorales y se realiza la prueba del plato caliente (Kavaliers y cols., 1997).

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