XIII Congreso Nacional Farmacutico

Granada, 15-18 de octubre de 2002

Mesa Redonda: Anlisis Clnicos: Futuro de las Especializaciones Farmacuticas Ponencia: Nuevas Salidas Profesionales: Gentica-Citogentica-Gentica Molecular Eduardo Gmez Arqueros Farmacutico Genetista, Valladolid

Mesa Redonda: Anlisis Clnicos: Futuro de las Especializaciones Farmacuticas

Gentica-Citogentica-Gentica Molecular
Eduardo Gmez Arqueros Farmacutico Genetista, Valladolid La forma ms sencilla de definir la gentica es la rama de la medicina que estudia los genes y su herencia. En la gentica humana existen muchos campos de inters, siendo las ms importantes la citogentica (estudio de los cromosomas), Gentica molecular (Aplicacin de las tcnicas de biologa molecular al estudio de la estructura y funcin de genes individuales) y la gentica clnica (aplicacin al diagnstico y cuidado del enfermo). La gentica clnica es aplicada por un mdico genetista (pediatra, gineclogo, hematlogo, etc.). La citogentica y la gentica molecular son reas de laboratorio que pueden ser ejercitadas por un farmacutico, bilogo, mdico o qumico. Citogentica La citogentica es la ciencia que estudia los cromosomas, su estructura y su herencia. Estos cromosomas de aspecto homogneo en el ncleo celular en interfase se condensan en la divisin celular realizndose su estudio en la etapa de metafase de la mitosis. El anlisis cromosmico se ha convertido en un procedimiento diagnstico importante en la prctica diaria de la medicina y como describiremos ms adelante, las anomalas cromosmicas constituyen causas importantes de problemas de fertilidad, prdidas reproductivas y defectos congnitos. El cariotipo sin bandas es la clasificacin por tamao y la posicin del centrmero de los cromosomas en 7 GRUPOS (A, B, C, D, E, y G) segn la ISCN(International Sistem for Human Citogenetic Nomenclature, Pars 1971). Gracias a las tcnicas de bandeado Giemsa se han podido diferenciar los 23 pares de cromosomas. Las clulas ms utilizadas debido a su capacidad de crecer y dividirse rpidamente en cultivo son: Linfocitos sangre perifrica: Extraccin mediante una venopuncin con heparina y cultivo de linfocitos T estimulados con el mitgeno Fitohemaglutinina sacrificando el cultivo a las 72 horas con colchicina. (cordocentsis). Vellosidades corinicas o lquido amnitico: cultivo de tejido trofoblstico(va transcervical o transabdominal, 9 semanas de gestacin, 1% prdidas) o amniocitos (amniocentsis transabdominal, 14 semanas de gestacin, 0,3 % prdidas) para el diagnstico prenatal clulas linfoblastoides de mdula sea: Cultivo para el estudio de alteraciones cromosmicas producidas por enfermedades hematolgicas malignas como el linfoma de Burkitt(t 8,14) oncogn c-MYC o L.M.C.(t9,22). La presencia de alteraciones da un valor diagnstico y pronstico de la enfermedad.

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Anlisis cromosmico En los seres humanos el ncleo celular normal contiene 46 cromosomas (23 pares). 22 pares son iguales en las mujeres y en los varones y se denominan autosomas. El par 23 corresponde a los cromosomas sexuales, gonosomas , y contiene dos X s en la mujer y un X y un Y en el varn. Cada cromosoma normal en metafase puede ser visto como dos cromtidas que se unen estrechamente en un punto llamado constriccin primaria o centrmero (cen). El centrmero divide al cromosoma en dos brazos denominados:

Segn la posicin del centrmero podemos clasificar los cromosomas en tres tipos: Cromosoma Metacntrico: los cromosomas que tienen el centrmero en el centro ( pares 1, 3, 16, 19 y 20). Cromosoma Acrocntrico: Los cromosomas que tienen el centrmero muy cerca del extremo. Los brazos cortos de estos cromosomas tienen al final unas estructuras llamadas satlites (pares 13, 14, 15, 21, 22 e Y). Cromosomas submetacntrico: tienen el centrmero en posicin intermedia a entre las anteriores. En la nomenclatura citogentica el cariotipo se nombra primero el nmero de cromosomas y despus el complemento sexual. Ej. : 46,XX. Para nombrar una determinada banda se nombra primero el cromosoma, despus el brazo, la regin y el nmero de banda que se enumera a partir del 1, comenzando por la banda cercana al centrmero. Ej. 9p12: cromosoma 9, brazo corto, regin 1, banda 2. CARIOTIPO HUMANO NORMAL Cada especie tiene un complemento cromosmico, caracterstico en nmero y morfologa. Esto es lo que conocemos como cariotipo. El estudio de las metafases del cultivo de clulas de un tejido de un individuo es lo que conocemos como cariotipo constitucional. El cariotipo de una mujer normal es 46,XX . El cariotipo de un hombre normal es 46,XY. VARIACIONES CROMOSMICAS EN UN CARIOTIPO NORMAL En la cromatina (asociacin de ADN y protenas del que se componen los cromosomas) podemos diferenciar la Eucromatina regiones codificantes y la heterocromatina regiones no codifi cantes. La heterocromatina presenta una considerable variacin entre individuos en la cantidad y distribucin. Dentro de un cariotipo normal nos podemos encontrar tres regiones heterocromticas con alta variabilidad: Heterocromatina centromrica: muy visible en los cromosomas 1, 9 y 16. Segn el ISCN se describe como qh+ qh-. Ej. : 46,XX, 16qh+. Cromosoma 16 normal con regin heterocromtica mayor que el otro 16.

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Brazos cortos y satlites de los cromosomas acrocntricos: el brazo corto aparece como una extensin de la regin centromrica y los satlites son las pequeas masas de cromatina en forma de bolas oscuras que aparece el extremo del brazo y que codifican el RNA ribosmico. En el ISCN se denominan 46,XX, 13s+. Satlites largos en el cromosoma 13. Y 46,XX, 22pss. Satlites dobles en el cromosoma 22h. Brazo largo del cromosoma Y: la parte distal del brazo largo es una regin muy variable en el cromosoma Y. Normalmente estas variaciones se transmiten sin cambios de padres a hijos. No tiene efectos clnicos conocidos. Segn el ISCN se nombran Yqh+ Yqh-. EL CARIOTIPO HUMANO ANORMAL Los cariotipos anormales se producen por errores en la meiosis durante la fertilizacin o por errores en la divisin meitica. Las anomalas cromosmicas pueden ser numricas o estructurales: ANOMALAS NUMRICAS 1. ANOMALAS NUMRICAS DEL CONJUNTO: Poliploida. Ej. Tetraploida 92,XXXX 92,XXYY.Triploida 69,XXY. Tanto la triploida como la tetraploida se han observado en fetos que no llegan a trmino. La triploida es causa del 20% de los abortos espontneos. 1/20.000 rnv. No hay evidencias de relacin con la edad materna. Es probable que la triploida ocurra por un fallo en una de las divisiones de maduracin en el vulo (digina) o en el espermatozoide (diandra) o por doble fertilizacin de un ovocito (dispermia). Las tetraploidas proceden de una incompleta segmentacin del cigoto. 2.ANOMALAS NUMRICAS PARCIALES AUTOSMICAS: su nomenclatura es muy simple se suma o resta el cromosoma implicado Ej. 47,XY, +13. Trisoma 21 (Sr. De Down) - Frecuencia 1/800 r.n.v. 85% sobreviven al ao de vida. -Fenotipo: Retraso mental (CI 40-70) estatura corta, cuello corto, puente nasal plano, boca abierta con macroglosia, pliegue palmar simiesco, enfermedad cardiaca congnita(1/3), fstula duodenal, mayor riesgo de leucemia, hipotiroidismo, inmunodepresin, Varn infrtil, mujer con baja fertilidad (50% de riesgo de recurrencia), alzheimer etc. - abortan espontneamente. Riesgo asociado con la edad materna. Trisoma 18 (Sr. De Edwards) - frecuencia: vara entre 1/3.000 y 1/7.000 - Fenotipo: retraso mental, fallo en el crecimiento CIR, hipotona muscular, malformaciones cardiacas, implantacin de los pabellones auriculares baja y mal formes, puos cerrados de manera caracterstica( segundo y quinto dedo superponen al tercero y cuarto), etc. - 95% abortan espontneamente y la supervivencia postnatal es escasa. Influencia de la edad materna. Trisoma 13 (Sr. De Patau) - Frecuencia: 1/25.000 - Fenotipo: Grave retraso mental y de crecimiento, m icrocefalia, labio leporino, paladar hendido, coloboma de iris e incluso ausencia de los ojos, polidactilia, alteraciones cardiacas graves, criptorquidia, etc. - La mayora abortan antes del sexto mes de gestacin y la supervivencia postnatal es escasa. 3.ANOMALAS NUMRICAS PARCIALES, SEXUALES: Su nomenclatura es distinta a la de los autosomas. Los cromosomas sexuales se incluyen juntos y simplemente se aaden u omiten. Ej. 47,XXY. 48,XXXY. 45,X. a. Trisomas sexuales. 47,XXY. Sr. Klinefelter

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-Frecuencia: 1/1.500 -1.800 rnv. Mosaicismo en un 15%(mejor pronstico). -Origen: error en la disyuncin meitica materna o paterna. -Fenotipo: Muy variable. Retraso mental poco probable (leve en el habla y desarrollo psicomotriz). En la adolescencia aparece ginecomastia(30%), altura superior a la media, retraso puberal( Tto. con testosterona), testculos de pequeo tamao(infertilidad), vello facial de escaso crecimiento. 87% de las parejas que lo detectan por diagnstico prenatal llevan a termino el embarazo. -Tasa de supervivencia de un 97%. precoz. -Origen: error en la disyuncin meitica materna. 47,XYY. Sr. XYY -Frecuencia:1/1.000 rnv. -Origen: Error meiosis paterna. -Fenotipo: riesgo elevado de problemas de conducta(agresividad, 3% de los presos). Fertilidad normal. b. Monosomas sexuales : 45,X. Sr. De Turner -Frecuencia: 1/2.500 rnv. Mosaicismo en un 40% (45,X/46,XX) -Diagnstico prenatal: pliegue nucal aumentado, Higroma qustico cuello(desarrollo linftico anmalo debido a una hipoalbuminemia temprana). -Fenotipo: inteligencia normal (dificultades en el habla y psicomotoras), Pterigium coli (Desarrollo anormal sistema linftico en el cuello), algunas al nacer presentan edema en el dorso del pie, anomalas cardiacas y renales, en el desarrollo puberal aparece la corta estatura, digenesia gonadal, etc. Tto. Estrgenos y GH mejoran el desarrollo de los caracteres sexuales secundarios y la estatura. -98-99% abortan espontneamente(10% de los abortos). No hay relacin con la edad materna. c. Polisomas sexuales : 48,XXXY(1/20.000) y 49,XXXXY(1/80.000) variante del Sr. De Klinefelter 48,XXXX y 49,XXXXX variante femenina del Klinefelter

47,XXX. Triple X o Trisoma del X -Mujer con fenotipo muy variable: infertilidad, CI normal, desarrollo puberal

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RIESGO DE ALTERACIONES CROMOSMICAS POR EDAD MATERNA Y EDAD GESTACIONAL(1/N en la tabla)

Edad Matern a
20 25 30 35 40 44

Trisoma 21

Trisoma 18

Trisoma 13

Turner

Klinefelt er 40
4.16 7

12
1.06 8 946 626 249 68 21

20
1.29 5 1.14 7 759 302 82 26

40
1.52 7 1.35 2 895 356 97 30

12
2.48 4 2.20 0 1.45 6 580 157 50

20

Edad gestacional(semanas) 40 12 20 40 12
7.82 6 6.93 0 4.58 5 1.82 6 495 156 14.65 6 12.97 8 8.587 3.419 927 292 42.42 1.47 3 1 37.56 7 24.85 6 9.876 2.683 846

20
3.12 5

=
1.667 1.667 1.667 1.250 1.000 833

4.897 18.01 3 4.336 15.95 1 2.869 10.55 4 1.114 4.202 2 310 1.139 98 359

ANOMALAS ESTRUCTURALES A) Reordenamientos desequilibrados: En estos casos es probable que el fenotipo del paciente resulte anormal. 1.Deleciones: Prdida de un segmento cromosmico que genera un desequilibrio. Las consecuencias clnicas dependen del tamao delecionado y el nmero o funcin de los genes que contiene. Su abreviatura segn el ISCN es del . Ej. 46,XX, del(6)(p22) delecin en el brazo corto del cromosoma 6. Sr. Cri du Chat (Sndrome del maullido de gato) -Frecuencia: 1/30.000-50.000 rnv. 46,XY, del(5)(p15) -Fenotipo: retraso mental grave, poca esperanza de vida(40 aos), llanto recin nacido caracterstico, microcefalia(cabeza pequea), hipertelorismo(ojos separados), pabello nes auriculares de implantacin baja, cara de luna, dificultades para comer, frecuentes infecciones respiratorias, etc. -80-85% de los casos son de aparicin espordica y el 10-15% restante, son hijos de portadores de una translocacin. Tambin podemos encontrarnos con microdeleciones o deleciones no visibles mediante las tcnicas de bandeado Giemsa, las cuales pueden ser detectadas por las tcnicas de Biologa Molecular conocida como F.I.S.H. (Fluorescence in situ hibridization). 2.Duplicacin: Duplicacin de un segmento cromosmico. Puede ser directa o inversa. Su abreviatura segn la ISCN es dup. Ej. 46,XY, dup(4)(q11q21) duplicacin de un segmento entre las bandas 11 y 21 del brazo largo del cromosoma 4. 3.Cromosomas en anillo: Se forman cuando se producen dos roturas terminales en un cromosoma y se unen los extremos. Son muy raros pero se han detectado para cada cromosoma humano. Nomenclatura r. Ej. 46,X , r(X) debido al prdida de la banda Xq21 cursan con un fenotipo semejante al del Sr. de Turner (5%) y algunos pacientes manifiestan un leve retraso mental. 4. Isocromosomas: cromosoma al que le falta un brazo y el otro est duplicado. Son frecuentes los mosaicos. Nomenclatura i . Ej. 46,X, i(Xq) isocromosoma del brazo largo del cromosoma X que suele cursar con un fenotipo semejante al Sr. de Turner (10%).

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5. Cromosomas marcadores: Son cromosomas diminutos formados por reordenamientos complejos. Suelen estar formados por heterocromatina centromrica, pero pueden llegar a contener parte de algn gen. Su identificacin es normalmente compleja y su hallazgo en un cariotipo fetal complica la evaluacin clnica y el consejo gentico. Las nuevas tcnicas de pintado cromosmico F.I.S.H. han facilitado su identificacin, pero pueden llegar a incrementar el coste econmico y de tiempo. Nomenclatura +mar. Ej. 46,XX, +mar. Frecuencia: 1,5/ 1.000 De lo que aparecen de novo, se calcula que el 13% se asocian a alteraciones fenotpicas. B) Reordenamientos equilibrados: Estos no tienen efecto fenotpico, ya que toda la informacin gentica se encuentra presente. Sin embargo, estos reordenamientos estructurales constituyen una amenaza para la siguiente generacin ya que estos portadores pueden producir una alta frecuencia de gametos desequilibrados y, por lo tanto tener descendencia anormal con cariotipos desequilibrados. 1. Inversiones: Se produce por dos roturas dentro de un cromosoma, inversin del segmento entre ellas y unin de los fragmentos cromosmicos implicados. Estas, segn sean las roturas, en cada brazo o en un mismo brazo, las clasificamos en pericntricas (incluyen del centrmero) o paracntricas. El fenotipo del paciente es normal y su importancia clnica se relaciona con su descendencia. La inversin del cromosoma 9, presente en ms del 1% de la poblacin citogenticamente estudiada, se considera una variante normal que no tiene repercusin clnica en los portadores y parece no estar asociada con riesgo significativo de aborto o descendencia desequilibrada. Nomenclatura inv . Ej. 46,XX, inv(9)(p11q12). 2.Translocaciones: Existen dos tipos: 2a.Translocaciones recprocas: Intercambio de segmentos cromosmicos entre dos cromosomas. El nmero cromosmico total no cambia. No suelen tener repercusin clnica en el portador, pero se asocian con un riesgo elevado de gametos desequilibrados y descendencia anormal. Nomenclatura t. Ej. 46,XY, t(3;22)(p21;q11) Translocacin entre el brazo pequeo del cromosoma 3 y el brazo largo del cromosoma 22. 2b. Translocaciones robertsonianas: Reordenamiento en el que intervienen dos cromosomas acrocntricos perdiendo generalmente los brazos cortos en los cuales estn codificados los genes del RNA ribosmico. Debido a que existen varias copias de estos en el resto de cromosomas acrocntricos, el portador suele ser fenotpicamente normal con un nmero cromosmico total de 45 cromosomas. Tienen un riesgo elevado de gametos desequilibrados y descendencia anormal. Ej. 45,XX, t(13;22)(q11;q12). 2c. Insercin: Translocacin no recproca en el que un segmento se retira de un cromosoma y se inserta en otro de manera directa o inversa. Nomenclatura ins . NUEVAS TECNOLOGAS FISH (hibridacin in situ molecular) Nueva tecnologa que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para detectar o confirmar anomalas gnicas o cromosmicas que no se pueden detectar con las tcnicas citogenticas de rutina. Para su aplicacin desnaturalizamos la muestra de DNA, hibridamos las sondas marcadas y observamos en un microscopio de fluorescencia la seal emitida. Esta tcnica es til para la deteccin en ncleos o metafases de microdeleciones, cromosomas marcadores, confirmacin de translocaciones, etc. La sensibilidad de esta tcnica es mayor que la citogentica de rutina pero depende de un sndrome o alteracin concreta. Su utilizacin se est incrementando para la deteccin en lquido amnitico de las principales trisomas (13, 18 y 21) y determinacin del sexo (X e Y) en 48-72 horas, siempre esperando a la citogentica de rutina para confirmar el resultado ya que esta tcnica no sustituye el anlisis completo del cariotipo. Recientemente ya se disponen tcnicas que nos permiten pintar cada cromosoma de un color (SKY) o con bandas caractersticas (RX-FISH). Estas tcnicas tienen an un coste elevado pero esperamos que en un futuro prximo se conviertan en una herramienta habitual en el laboratorio de Gentica para facilitar la labor del citogenetista.

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QF-PCR Esta tcnica de nueva generacin est sustituyendo a la tcnica FISH para la deteccin en 24-48 horas de las principales trisomas y cromosomas sexuales en lquido amnitico, siendo esta un complemento a la citogentica de rutina. El principio del mtodo se basa en la proporcionalidad entre la cantidad inicial de una secuencia de ADN y la cantidad del producto de amplificacin generado durante el inicio de la fase exponencial de la PCR. La cuantificacin del producto de amplificacin es posible gracias a la utilizacin de cebadores marcados con fluorocromos. La seal fluorescente es capturada y procesada por un sistema informtico lo que facilita su interpretacin por el citogenetista. BIO-Chips Tambin conocida como microarray DNA -chip, esta tecnologa va a revolucionar el anlisis molecular. Como todas las grandes ideas es conceptualmente sencilla, aunque requiere de una infraestructura notable. El chip est formado por una placa de slice o nylon donde inmovilizamos de forma ordenada miles(hasta 40.000) de secuencias de c-DNA (DNA complementario), construyendo as un panel de sondas semejante a un chip informtico. La naturaleza de estas secuencias de DNA estar en funcin de las aplicaciones que queramos darle a nuestro chip. Sobre este chip se colocar el DNA a estudiar marcado con un fluorocromo y si hbrida algunas de las secuencias de nuestro chip emitir una seal que ser capturada y procesada por un autoanalizador. Este bio-chip va a permitirnos estudiar los ms de 30.000 genes localizados en los cromosomas y sus variaciones interindividuales, incluyendo las distintas propensiones a una u otra enfermedad. Su utilizacin ser crucial en la medicina del futuro ser crucial para la prevencin y diagnstico personalizado. Aplicaciones del Bio-chip: . Cncer: la formacin de un tumor se debe a una compleja acumulacin de mutaciones de los genes de una clula que p rovocan que escape de control y prolifere indebidamente. Algunas de estas mutaciones son causadas por agresiones externas(tabaco, radiacin ultravioleta solar, etc.) y otras las lleva puestas un individuo desde su nacimiento, lo que explica la susceptibilidad de algunas personas a desarrollar uno u otro tipo de cncer. Conocer estas mutaciones nos va a permitir si responder a un tratamiento u otro. . Enfermedades simples: de los 30.000 genes humanos hay unas 1.100 variaciones asociadas a unas 1.500 enfermedades. Predecir el riesgo ser ahora relativamente sencillo. .Enfermedades complejas: la propensin gentica a las enfermedades ms comunes no se debe a la alteracin de un solo gen, sino a decenas o cientos a la vez. Los bio-chips revolucionarn la medicina al analizar de una sola vez todas las variantes de esos genes. .Frmacos a medida: el conocer las mutaciones especificas que provoquen una enfermedad en un individuo, nos va a permitir personalizar el tratamiento. La administracin de EEUU ha calculado que las reacciones adversas a medicamentos causan en dicho pas dos millones de hospitalizaciones al ao.

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