1.

1 PROPIEDADES NUCLEICOS:

FISICOQUIMICAS

DE

ACIDOS

CUANTIFICACIN POR ESPECTROFOTOMETRIA EFECTO DE LA DESNATURACION POR ALCALI

I. INTRODUCCION Los cidos nucleicos absorben luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA o RNA. Esta caracterstica es usada eficientemente para determinar su concentracin. El espectro de absorcin es nico de cada una de las bases y por lo tanto contribuyen de manera diferente en la absorcin total de UV de una molcula de acido nucleico. La exposicin de las bases nitrogenadas tambin provoca una variacin de la absorcin de UV y este efecto se aprecia en la denaturacin de doble cadena de nucleotidos a simple cadena de nucleotidos Para muchas aplicaciones, se puede ignorar el porcentaje de contribucin de cada una de las bases al espectro de absorcin de UV de una molcula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA). Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando se tratan de oligonucletidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentracin.

Diferentes consideraciones para cuantificar los tipos de acido nucleico Concentracin de Oligonucletido en pmol/l Los cidos nucleicos tiene un mximo de absorcin a una longitud de onda de 260nm. A esta longitud por lo tanto, la absorcin es proporcional a la concentracin.

C (pmol/l)= (A260 * 100 * Factor de dilucin) / (1.54*nA + 0.75*nC + 1.17*nG + 0.92*nT) En la frmula: C, es la concentracin calculada en picomoles por microlitro (pmol/l). A260 es la absorbancia a 260nm. El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por el nmero de veces que aparece en el oligonucleotido. El factor de dilucin es igual a el volumen final de la dilucin dividido entre la cantidad alicuotada para la dilucin. Oscar Nolasco Crdenas : oscarnol@gmail.com Pgina 1

Concentracin de Oligonucletido en g/ml El valor de A260se convierte a g/ml usando el coeficiente de extincin para ssDNA la cual es 1ml/33g para una celda de 1cm de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la muestra contine 33g de ssDNA por ml o en la ecuacin: 1unidad de O.D.de ssDNA=33g Concentracin en g/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular. La concentracin de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/l, tomando en cuenta el promedio del peso molecular de un nucleotido en la molecula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons. (el termino "dalton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atomica del 12C. El cual es utilizado como peso molecular expresado cuantitativamente como g/mol). Ejemplo: el Bacteriofago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250nucleotidos. Para expresar esto como g/pmol: (7250nts) 330g/mol x 106g x _1mol___ nt g 1012pmol =2.39g/mol

Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10l/1000l y da una lectura de A260 = 0.163, la concentracin es: (xg/l) / (0.163) = (33g/l) / (1.0 OD) x= 5.38 g/l multiplicando por (1000 l/10 l) = 538 g ssDNA/ml Para convertir a pmol / l: (538g / ml ) (1pmol / 2.39g )( 1ml / 1000l ) = 0.225 pmol/l

Concentracin

en

g/ml

de

dsDNA

de

Alto

Peso

Molecular.

Para determinar la concentracin de ssDNA de Alto Peso Molecular, plasmidos o productos de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5g/ml pueden ser detectadas. A pH neutro, una solucin de DNA a 1 mg/ml tiene una absorcin mxima a 260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm. (este valor es para molculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para muchas aplicaciones en Biologia Molecular el contenido de G+C no es necesario considerarlo a menos que sea muy extremo). En principio una solucin de dsDNA con una concentracin de 50 g /ml debe tener una A260 i gual a1.0. 1 (A260) unidad de dsDNA=50 g /ml

Las protenas tienen un mximo de absorcin a A280 (principalmente por residuos de triptofano) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algn contaminante proteico. El clculo de la relacin A260 /A280 es una manera comn para expresar la Oscar Nolasco Crdenas : oscarnol@gmail.com Pgina 2

pureza del DNA. Dependiendo de la composicin nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una muestra pura. Debido a otros contaminantes una muestra con una relacin alta de A260 /A280 puede no necesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces tambin, una muestra con una baja relacin A260 /A280 puede secuenciarse bien. El mtodo mas comn de purificacin de DNA es extrayendo la preparacin con fenol para remover la protena contaminante. El fenol tiene una absorcin mxima a 270nm. Las preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A260 y la concentracin de DNA ser sobrestimada. Midiendo la Concentracin de RNA en g/ml. La concentracin de RNA de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medicin de DNA. Sin embargo se aplica la siguiente relacin: 1 unidad A260 de ssRNA = 40g / ml Las preparaciones puras de RNA tienen una relacin A260 /A280 de 2.0

II. OBJETIVOS 1 Estimar la cantidad de cidos nucleicos empleando las tcnicas de espectrofotometra 2 Evidenciar el efecto de la desnaturacin en medio alcalino. III. PROCEDIMIENTO: 1. Encender el espectrofotmetro por 15 min la lmpara de UV 2. Hacer 2 preparaciones para cada muestra de acido nucleico a medir: Para la primera dilucin emplear 1950 L de agua bidestilada, y 50l de la solucin de cidos nucleicos a medir. Usar como blanco de referencia 2mL de agua bidestilada en una celda de cuarzo (una celda de plstico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento). Para la segunda dilucin emplear 1850 L de agua destilada, 100 L de NaOH 0.1N (preparacin fresca) y 50L de la solucin de cidos nucleicos a medir. Usar como blanco de referencia 1900L de agua bidestilada con 100 L de NaOH 0.1N en una celda de cuarzo. Mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utiliz para el blanco. 3. Leer la absorbancia a 260 y 280nm para cada preparacin de cada muestra y calcule la concentracin de cidos nucleicos 4. Determine la pureza de cada muestra y comente sobre los resultados de la lectura. Oscar Nolasco Crdenas : oscarnol@gmail.com Pgina 3

1.2 ELECTROFORESIS DE DNA Electroforesis en geles de Agarosa

Buffer de Electroforesis: Buffer Tris Acetato (TAE) Concentracin Stock (1 litro) 50X Tris Base 242g Acido Acetico Glacial 57.1mL 0.5M EDTA (pH 8.0) 100mL Buffer de Carga 6X Azul de bromofenol Xileno de Cianol FF Sucrosa en agua Preparacin de Geles de Agarosa 1. Pesar 1.2g de agarosa y agregarla en 100ml de buffer TAE 0.5X en un frasco con tapa rosca. 2. Calentar la mezcla en horno microondas por 2min hasta que toda la agarosa este disuelta, recuerde abrir la tapa del frasco durante el calentamiento. 3. Enfri el frasco en agua fra con movimiento constante, evite la gelificacin. 4. Selle los bordes del molde para evitar que la agarosa se derrame por los extremos e impedir la mala gelificacin. 5. Agregue la agarosa disuelta en el molde y coloque los peines, evite la cobertura total de los peines, el gel debe de ser de aproximadamente 3 a 5 mm de grosor. 6. Remueva todas las burbujas presentes alrededor de los dientes del peine y a lo largo del gel. 7. Dejar gelificar de 30 a 45 min a temperatura ambiente 8. Cuidadosamente remueva los peines y los selladores de los extremos del soporte, evitando romper el gel. 9. Prepare suficiente cantidad de buffer de electroforesis TAE 0.5X como para llenar la cmara de electroforesis a manera que el gel quede cubierto aproximadamente en 1mm con el buffer. 10. Mezcle las muestras de DNA con el buffer de carga y cargue con una micropipeta en los pozos del gel. 11. Cierre la cmara electroforetica y coloque los electrodos la fuente de poder a manera que el DNA migre hacia el polo positivo. 12. Programe el voltaje y controle el tiempo necesario para la corrida electroforetica. 13. Si la tapa de la cmara ha sido colocada correctamente usted podr observar burbujas saliendo de los electrodos, debido a la electrolisis. 14. Pasado el tiempo necesario podr observar las bandas correspondientes al azul de bromofenol y del xileno de cianol. 15. Apague la fuente de poder y remueva la tapa

0.25% 0.25% 40% (w/v)

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Visualizacion de la corrida electroforetica La visualizacin se da dedido a la tincin con el tinte fluorescente: bromuro de etidio. Esta sustancia contiene un grupo plano que se intercala entre las bases del DNA. El bromuro de etidio por lo general se prepara en una solucin stock de 1mg/ml en agua, este es guardado a temperatura ambiente en botellas oscuras o envueltas con papel aluminio. Se realiza una dilucin 1/100 del stock (1ug/ml) para teir el gel durante 5 min Lavar el gel teido por 5 min con agua. Visualizar el gel en el transiluminador UV.

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