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Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa Facultad de Artes y Ciencias

Take Home

Equipo #3: Juan Bonilla, Noris Coln, Flix De Jess,


Rafael Rosario, Nicole Vzquez, Idalis Velzquez 16 de abril de 2013 Biol 4368- 070 Prof. Carlos Ros

1. Describa y compare en una tabla los tipos de secrecin microbiana, indicando protenas involucradas, mecanismo general, funcin y microorganismo que posee el mismo. Tipos de secrecin Sistema Sec General Secretory Pathway Protenas involucradas SecA: ATPasa citoplasmtica SecB: protena chaperona SecYEG: complejo protenas de unin SecG: estimula el transporte SecD, SecF, yajC: protenas regulatorias Mecanismo general SecB se une a una preprotena en el citosol y es dirigido a SecYEG (unida a Sec A) en la MI. La unin de ATP por SecA promueve la liberacin de SecB del complejo. La hidrlisis del ATP permite el paso de la protena por la translocn Encuentra un motif en una secuencia de aminocidos, transloca la protena utilizando un gradiente de protones como fuente de energa. El sustrato se reconoce a travs de una secuencia Funcin Translocar y exportar protenas no plegadas Microorganismos Bacterias Gram - y Gram +, Saccharomyces cereviciae y E.coli

Tat Twin arginine translocation pathway

TatA: proteina membranica TatB: protena reconocedora TatC: protena reconocedora

Translocar y exportar protenas plegadas.

Bacterias, cloroplastos, mitocondrios, E.coli.

SSTI Sistema de Secrecin Tipo I

ABC: transportador en membrana interna PME: forma canal en la

Secrecin de toxinas y exoenzimas

Casi todas las bacterias. E.coli

membrana externa PF: protena de fusin a la membrana interna

SSTII Sistema de Secrecin Tipo II

GspD: secretina GspBCFGHIJKLMNO: asociadas a la membrana interna GspS: lipoprotena

SSTIII Sistema de Secrecin Tipo III

Los anillos son formados por ms de 20 protenas.

seal en el extremo carboxilo terminal. En este modelo de secrecin, la protena periplsmica de fusin PF interacta con el transportador ABC en la MI y con la protena PME que forma un canal en la ME. Emplea el sistema Sec para transportar las protenas al periplasma y la secuencia lder es removida por proteasas en la cara externa de la MI. La regin amino terminal de la secuencia seal es procesada. Est compuesto por protenas de MI relacionadas a las del cuerpo basal del

Responsable de las enzimas hidrolticas y de las toxinas.

Bacterias Gram Klebsiella oxytoca Vibrio cholerae

Traslocar factores de virulencia a la celula husped.

Chlamydia, E.coli, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Shigella y

SSTIV Sistema de Secrecin Tipo IV

ATPasas forman canales y proveen energa. VirB6 atraviesa la M1, VirB2, VirB1.

SSTV Sistema de Secrecion Tipo V

OMP, Tat T5cSS T5bSS

SSTVI Sistema

Protenas efectoras

flagelo y protenas que formar anilllos en la MI y en la ME. La translocacin de las protenas requiere la energa de la hidrlisis del ATP. VirB1 a VirB11 y VirD4 transfieren el complejo protenaDNA en un solo paso desde el citoplasma hasta la clula eucarionte a travs del pilus-T. Las protenas que usan esta ruta tienen la capacidad de formar un barril beta con su terminal C, que se inserta en la membrana externa permitiendo al resto del pptido alcanzar el exterior de la clula. Un injectosoma

Yersinia.

Exportar la toxina pertusis. Transportar DNA oncognico y protenas.

Legionella pneumophila, Helicobacter pylori, Brucella suis, Bordetella pertussis y Agrobacterium tumefaciens.

Transporte de Protenas, factores de virulencia

E.coli, Bordetella pertusis, Neisseria gonorrhoeae

Por medio de un

Vibrio cholerae,

de Secrecin Tipo VI

Chaperona citoplasmtica

introduce a las protenas en el citoplasma de la clula husped. La protena integral forma un canal de translocacin. En la mycomembrana, se forma otro canal para el paso de las protenas. El dominio pasajero, en el carboxilo terminal, permite la secrecin a travs de ME formando una estructura de barril .

SSTVII Sistema de Secrecin Tipo VII

Rv3877: protena integral de la membrana Protenas que forman canal en la membrana

injectosoma, introducir protenas efectoras al citoplasma. Transporte de protenas

Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas aeruginosa. Mycobacterium,Bacillu s, Clostridium spp., Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. Neisseria gonorrhoeae

Autotransportad ores

IgA1

Exportar proteasas, toxinas, adhesinas e invasinas.

Flores Herrera O, Riveros Rosas H, Sosa Peinado A, Vzquez Contreras E (eds). Mensaje Bioqumico, Vol XXVII. Depto Bioqumica, Fac Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Cd Universitaria, Mxico, DF, MXICO. (2003). Hynds, P. J., Robinson, D. & Robinson, C. (1998). The Sec-independent twin-arginine translocation system can transport both tightly folded and malfolded proteins across the thylakoid membrane. J Biol Chem 273. Thanassi, D. G., and S. J. Hultgren. 2000. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane. Curr. Opin. Cell Biol. 12:420-430.

2. Compare y contraste entre el Citoesqueleto eucariote y procariote.

A. Microfilamentos de Actina y MreB

En el citoesqueleto eucariota tenemos los microfilamentos, estos estn compuestos por actina, la cual es una protena formadora de filamentos en eucariotas. Los filamentos de actina consisten de dos polmeros de protofilamento envueltos en una hlice de mano derecha. Los microfilamentos de actina tienen como funcin, encargarse de la contraccin muscular, la formacin de pseudpodos, y mantener la morfologa celular(1).

El homlogo de esta protena en el citoesqueleto procariota lo seria MreB. Este es muy divergente en secuencia en cuanto a la actina pero tiene una estructura muy parecida basado en el actin-fold que une esa superfamilia de protenas. MreB forma ensamblajes de dos protofilamentos que son parecidos estructuralmente a los de la actina pero no tienen el giro helical. Los filamentos de MreB forman una hlice debajo de la membrana celular para influenciar la posicin de la sntesis de la pared celular(1). El MreB juega un papel esencial en determinar la forma de la clula en algunas bacterias y posiblemente sea responsable en coordinar la sntesis de peptidoglicano(3).

Otro homlogo de la actina lo es ParM el cual tiene un rol en la formacin de filamentos. ParM ensambla polmeros retorcidos que son reminiscentes de la F-actin

pero con un giro de lado izquierdo(1).Ademas a esto se han identificado mecanismos de segregacin de plsmidos dependientes de ParM(4).

B. Filamentos Intermedios y CreS.

Los filamentos intermedios(FIs) son distintos a los microtubulos y microfilamentos en estructura, bioqumica y distribucin filognica. A diferencia de la actina y la tubulina, las cuales son protenas globulares que forman protofilamentos, los FI son protenas de dmeros extendidos que se solapan para formar cables no polarizados. Estas protenas son variadas y se agrupan en 5 categoras: las queratinas acidicas, las queratinas bsicas, las vimentinas y desminas, las internexinas y protenas neurofilamentosas y por ultimo las laminas. Sus funciones principales lo son mantener la fuerza de tensin celular y el soporte mecnico(1). Descubrimientos recientes de defectos genticos han elucidado que alteraciones estructurales a los FI pueden afectar el que estn envueltos en sealar y controlar las redes regulatorias de genes(5).

La protena CreS forma filamentos helicales que son necesarios para la forma vibriode o helical de algunas bacterias. A nivel de secuencia CreS e mas similar a las protenas eukarioticas de FI de lo que son la MreB o la FtsZ a la actina y tubulina respectivamente(6). Aunque la CreS fue inicialmente descrita solo como parecida a los FI, su funcin y estructura secundaria predicha fueron interpretados como evidencia de que son homlogos procarioticos de los FI(1).

C. Microtubulos y FtsZ

Los microtubulos eucarioticos son construidos a partir de protofilamentos que resultan de la polimerizacin de heterodimeros de - y -tubulina(1). Muchos consisten de 13 protofilamentos que interactan lateralmente para formar un tubo hueco. Estos heterodimeros son centrales a la composicin del citoesqueleto.(2)

En los procariotas la protena homologa lo sera la FtsZ la cual tiene una secuencia conservada de siete residuos casi idntica a una tubulina terminal-N(1).

(1)Wickstead, B., Gull, K. The evolution of the cytoskeleton. J Cell Biol 2011 194:513-525. Published August 22, 2011, doi:10.1083/jcb.201102065 (2)Ford, W., Keeling, P. Alpha Tubulin from Early-Diverging Eukaryotic Lineages and the Evolution of the Tubulin Family. Mol Biol Evol (1996) 13 (10): 1297-1305. (3)Figge, R., Divakaruni, A., Gober, J. MreB, the cell shape-determining bacterial actin homologue, co-ordinates cell wall morphogenesis in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology, 51(5), Blackwell Science Ltd: 1365-2958. ,doi 10.1111/j.13652958.2003.03936.x (4)Rut Carballido-Lpez, Jeff Errington, A dynamic bacterial cytoskeleton, Trends in Cell Biology, Volume 13, Issue 11, November 2003, Pages 577-583, doi 10.1016/j.tcb.2003.09.005. (5) Harald Herrmann, Sergei V. Strelkov, Peter Burkhard, Intermediate filaments: primary determinants of cell architecture and plasticity. J Clin Invest. 2009 July 1; 119(7): 17721783. Published online 2009 July 1. doi: 10.1172/JCI38214 (6) Cabeen, Matthew T. Herrmann, Harald., Jacobs-Wagner, Christine., The domain organization of the bacterial intermediate filament-like protein crescentin is important for assembly and function, Cytoskeleton 68(4), 1949-3592, doi 10.1002/cm.20505

3. Presente adems modelos de interaccin que describan y expliquen cmo una bacteria puede presentar una morfologa: (10 pts.) a. Redonda (coco) b. Bacilar (bacilo) c. Cuadrada (rcula)

La morfologa que va a obtener una bacteria, es decir, su forma, se va a ver afectada por la interaccin de ciertos compuestos que dependiendo su funcin, van a conferir a la bacteria una morfologa redonda, bacilar o cuadrada.

a. Redonda (coco) Una bacteria puede obtener una morfologa redonda (coco) gracias a la interaccin de varias protenas. Los cocos no tienen en su genoma protenas mreB codificadas, las cuales trabajan en la elongacin de las clulas procariotas, por lo que FtsZ asume el rol principal en la morfologa de los mismos. La FtsZ se ensambla en un anillo que se forma al momento de la divisin celular. Este es el que se encarga de que la divisin celular de paso a dos clulas hijas exactas. MreB funciona como un regulador negativo de la protena de unin a PBP3. Esta enzima se encarga de la sntesis del peptidoglicano en el septo, que ocurre al momento de divisin celular. Al no estar presente la mreB, la actividad de FtsI (PBP3) va a aumentar, llevando a la bacteria obtener una morfologa redonda, debido a una hyperseptacin por el trabajo de la PBP3. (1), (2)

b. Bacilar En los bacilos, la protena homloga a actina, mreB, s est presente, por lo que la funcin de la PBP3 disminuye, permitiendo que la clula se alargue ya que no va a crear el septo que le concede a la clula la forma elongada. La mreB y la PBP2 trabajan en la sntesis del

exoesqueleto de peptidoglicano de la bacteria. Aunque no es homloga a la actina, la RodZ, tambin se ha visto que confiere a la bacteria una morfologa bacilar, ayudando en la localizacin de las subunidades de la pared celular de la bacteria, como la mreB hace con el peptidoglicano. Una bacilo que est pasando por el proceso de extensin lateral de su pared celular no puede ser septada. La sntesis del septo solo puede ocurrir en el momento de divisin celular, lo que previene que la extensin ocurra. En el caso de los bacilos, no ocurrira sta sntesis. (2), (3)

c. Cuadrada (rcula) La falta de presin de turgor en la bacteria va conferir a la misma la forma cuadrada. Esta falta de turgor libera a la bacteria de estrs en la pared celular, esto simplifica a la misma y permite que la clula pueda adoptar cualquier forma. La forma que vaya a tomar la clula depender entonces de las forma de las subunidades que compongan la pared celular. En el caso de las bacterias cuadradas se ha encontrado que la pared celular est compuesta de rejillas hexagonales, pero

ocasionalmente, con parches de arreglos cuadrados. Otro elemento que contribuye a la composicin cuadrada de la bacteria lo es el arreglo y la forma de las subunidades de la pared celular de estas procariotas. Se ha sugerido adems, que la protena halomucina, que es homloga a la mucina, protege a la clula de desecacin y permite que la bacteria mantenga su forma cuadrada. (4)

Referencias (1) Shiomi, D., Masako, S., & Hironori, N. (n.d.). Determination of bacterial rod shape by a novel cytoskeletal membrane protein. (2008). The EMBO Journal, 27, 30813091. doi: 10.1038 (2) Stewart, J. C. (n.d.). Taking shape: control of bacterial cell wall biosynthesis. (2005). Molecular Microbiology, 57(5), 11771181. doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04760.x

(3) Vicente, M., Tamames, J., Valencia, A., & Mingorance, J. (Eds.). (2004). Molecules in time and space: Bacterial shape, division and phylogeny . (8 ed.). Springer. (4) Seckbach, J. (Ed.). (1999). Cellular origin and life in extreme habitats series. (Vol. 1). Springer.

4. Disee dos experimentos, uno para probar que una protena es translocada usando el sistema Sec y otro a travs de ABC. (10 pts.)

Sistema Sec

Sistema de translocacin y exportacin de protenas no plegadas.

Componentes: 1. Pptido lder 2. Protena chaperona (SecB) 3. Complejo de protenas de unin (SecYEG) 4. ATPasa citoplasmtica (SecA)

Para disear un posible experimento que

pruebe como una protena es

translocada usando el sistema Sec, primero hay que localizar un gen que codifique para la protena translocada. Luego se hace una fusin raduccional con un reportero que este activo en periplasma, por ejemplo fosfatasa alcalina (Pho A).

Un ejemplo sencillo es mutar un componente del sistema Sec en bacterias gram negativo (ilustrado en la foto anterior). Este es el ejemplo de Escherichia coli, la cual se le puede mutar la expresin de algn compuesto del sistema. Se puede mutar SecA, que es un componente periferal de la translocasa que sirve como ATPasa citoplasmtica. recibe la pre-protena y sufre cambio en conformacin que resulta en el enlace de ATP. Esto hace que el complejo de translocasa este incompleto ya que no va a poder continuar al no haber energa y un precursor. Luego se hace un fraccionamiento celular y se verifica la actividad del reportero en los distintos compartimientos. Para el complejo mutado no se observar actividad en el periplasma. Para ver si funciona con sistema Sec, se puede insertar un vector con el gen que codifica para la SecA. Al crecerla, se observara actividad en el periplasma y demostraramos que funciona con sistema Sec y con una mutacin en uno de sus componentes es suficiente pa inhibir la actividad del mismo.

Sistema ABC

ATP-binding cassette (ABC)

Componentes: 1. P class pump - tipo standard de fosforilacin 2. ABC superfamily - bacteria-humano 3. T domains - dos transmembranales 4. A domains - dos ATP-binding citoslicos

Para determinar el transporte de protenas a travs del sistema ABC, sera validando la funcin del sistema. Se crea una mutacin de delecin en el segmento del gen que codifica para el motif C del transportador. El motif C es altamente conservado en el sistema ABC y su funcin es llevar a cabo hidrlisis de ATP. La mutacin en este segmento de la protena, impedira el transporte de protenas especficas para el sistema ABC hacia las membranas externas e internas del organismo. Se utilizara la proteasa alcalina, que es una protena distintiva de la bacteria Pseudomonas aeruginosa, para ser marcada con green fluorescent protein (GFP) y poder observar la acumulacin de la protena no-transportable en la clula. El control, para el experimento sera crecer las bacterias sin la mutacin de delecin en el segmento del gen que codifica el motif C. El transporte no se vera afectado quedando totalmente funcional y permitiendo el paso de la proteasa alcalina hacia el exterior de la clula. Para verificar los resultados, se podra cotejar la presencia y ausencia de la proteasa alcalina en los diferentes compartimientos a travs de fragmentacin celular por la fluorescencia de GFP.

Referencias: 1. White, D. (2007). The Physiology and biochemistry of prokaryotes 3rd edition. In Chapter 17: Protein Transport (pp. 438-4). New York: Oxford University Press.

2. Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter. Hung LW, Wang IX, Nikaido K, Liu PQ, Ames GF, Kim SH; Nature 1998; 396: 703-707 3. Ponte-Sucre, A (editor) (2009). ABC Transporters in Microorganisms. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-49-3. 4. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U2c_SistemasSecrecion_19651.pdf

5. http://jpkc.scu.edu.cn/ywwy/zbsw(E)/edetail5.htm

5. Hemos podido ver en clase como existen sistemas en bacterias capaces de permitir percibir cambios en su ambiente y poder realizar las estrategias fisiolgicas necesarias para crecer y desarrollarse en los mismos. (25 pts) Describa los sistemas de regulacin de dos componentes presentes en los siguientes organismos y su relacin con los siguientes procesos descritos.

Los sistemas de regulacin que hemos estudiado hasta ahora se ponen en marcha cuando un estmulo ambiental qumico, normalmente una pequea molcula relacionada con el metabolismo (el efector), entra en la clula e interacciona con una protena reguladora, que a su vez se une (o deja de unirse) con una secuencia de ADN al comienzo del opern. Adems de estos sistemas se descubri que las bacterias poseen tambin numerosos sistemas en los que la seal ambiental no entra a la clula, sino que es detectada por un sensor a nivel de membrana, el cual reemite (transduce) el estmulo hacia una protena citoplsmica, la cual a su vez interacciona con secuencias determinadas al comienzo del opern, para regularlo, generando as la respuesta adaptativa correspondiente a la seal ambiental. Como en la mayor parte de los casos el sistema funciona con dos protenas (la sensora y la reguladora), a este tipo de sistemas se los conoce con el nombre de sistemas de regulacin de dos componentes. Los distintos sensores, a pesar de que cada uno detecta un estmulo diferente, se parecen entre s en al menos parte de su secuencia, y lo mismo ocurre con los reguladores de respuesta, por lo que se habla de dos familias de protenas (cada una con un probable origen evolutivo comn): 1. Familia de histidn-proten-quinasas (HPK): Este tipo de protenas son las sensoras de algn tipo de estmulo ambiental. Muchas de ellas son autofosforilables, pero su funcin esencial es la de fosforilar al correspondiente segundo miembro de la pareja (el regulador). Los distintos sensores suelen tener en comn su porcin carboxiterminal, denominada dominio transmisor (que incluye la histidina fosforilable). Los sensores suelen ser protenas integrales de membrana citoplsmica. Cada sensor tiene un dominio aminoterminal caracterstico, inmerso en el espacio periplsmico, y de este modo detectan algn estmulo procedente del ambiente. Al hacerlo, parece que cambian de conformacin, de modo que el dominio transmisor intracitoplsmico se autofosforila y luego fosforila al correspondiente regulador de respuesta. Familia de reguladores de respuesta (RR): cada regulador de respuesta, tras ser fosforilado en cierto asprtico por su correspondiente HPK, ejerce algn efecto regulatorio. Normalmente, los RR fosforilados actan como activadores de la

2.

transcripcin de ciertos operones. Los distintos reguladores comparten un mismo tipo de dominio aminoterminal, denominado dominio receptor, que incluye el asprtico que recibe el fosfato del sensor correspondiente. Los reguladores que actan como activadores de transcripcin suelen incluir un dominio carboxiterminal a base del tpico motivo hlice-giro-hlice, capaz de interactuar con ciertas secuencias de ADN. A. Escherichia coli a. colocarla en una solucin de ms de 0.85% de NaCl ***** Segn las investigaciones no se observan cambios genticos ni en la cintica de crecimiento de Escherichia. coli en concentraciones de NaCl menores de 3% . De hecho los estudios sugieren que E. coli es capaz de adaptarse en un medio donde la concentracin de NaCl aumente a 1% cada mes con una adaptacin exitosa a 11% de NaCl (Jin Ann Howw, 2013). b. crecerla a 420C La llamada respuesta al choque trmico es un mecanismo adaptativo compartido por prcticamente todos los seres vivos, consistente en el aumento rpido de la sntesis de una serie de protenas (denominadas protenas Hsp, iniciales del ingls heat shock proteins) ante la elevacin brusca de la temperatura por encima de la ptima, con un descenso lento a sus niveles basales. Las protenas Hsp protegen a las clulas del dao que les causara una posterior elevacin adicional de la temperatura. En Escherichia coli la mayor parte de los 36 genes codificadores de protenas Hsp forman un reguln, y los correspondientes operones son transcritos por la versin de la ARN-polimerasa provista de la subunidad s32. Los operones del reguln del choque por calor se transcriben a partir de promotores especiales (con su propia secuencia consenso) cuando son reconocidos por la holoenzima de la ARN-polimerasa con la subunidad s32. Durante el crecimiento en condiciones normales, hay muy pocas molculas de s32 en la clula, debido a que se degrada rpidamente (en uno o dos minutos), pero cuando sube la temperatura de 30 a 42 C, los niveles suben 15 veces, de modo que aumenta la transcripcin de los genes del choque trmico. Al parecer, esos niveles de s32 vienen regulados postraduccionalmente por alguna de las propias chaperonas. c. colocarla en una cmara anaerobia E.coli es un microorganismo que se encuentra dentro del grupo de los aerobios facultativos, utilizando oxigeno como aceptador final de electrones en la cadena

respiratoria cuando esta disponible y en ausencia de oxigeno la energa la obtiene por fermentacin. En E. coli se han encontrado diversas molculas que intervienen en el control gentico del cambio del metabolismo aerobio a anaerobio, entre ellas resalta la protena Fnr, que se considera la llave maestra que controla la actividad de muchos de los genes que se requieren en condiciones anaerbicas. Primero; se ha propuesto que 32FNR detecta el estado redox por medio de una caja [4Fe-4S] por subunidad en la cual participan cuatro cisteinas, de las cuales tres se encuentran en el extremo N terminal. Segundo; una secuencia de residuos en el dominio central interacciona con la RNA polimerasa. Tercero; tiene un dominio que posiblemente este involucrado en el proceso de dimerizacin de unidades, que es la forma en que es activa. Y cuarto; en el extremo carbono terminal tiene una secuencia de aminocidos que le permite interactuar con su sitio de unin con el DNA en la regin promotora y que tiene una secuencia consenso TTGATN4-ATCAA (la caja FNR). d. moverla a la estacin espacial ***** Las consecuencias generales de los vuelos espaciales sugieren los siguientes efectos generales sobre crecimiento de E. coli en el cultivo de crecimiento: (1) la duracin de la fase log se redujo, (2) la tasa de crecimiento no fue afectado (o ligeramente ms lento), (3) la duracin de la exponencial fase de crecimiento se increment, y (4) un significativamente mayor densidad celular final se logr.La regulacin de la Respuesta SOS es a nivel molecular el dao en el ADN crea un solo ADN de cadena, que forma un complejo ternario con la La protena RecA y ATP; este complejo promueve la escisin de la protena LexA, estas protenias trabajan en conjunto para asegurar la supervivencia de la bacteria (PHILIPPE BOULOC and RICHARD DARI, 1991). * B. Bacillus a. baja en nutrientes del medio y b. aumento en densidad celular Bajo condiciones de limitacin de nutrientes y de aumento en la densidad celular o respuesta a condiciones de estrs, se generan una serie de seales que modulan el inicio de la esporulacin. Bacillus presenta un control temporal al terminar el crecimiento exponencial, lo que le permite llevar a cabo una serie de cambios tanto estructurales como metablicos que culminan con la formacin de esporas. La secuencia de eventos morfolgicos que culminan con la formacin de una espora libre, consta de siete pasos y se muestra en la figura 1. El paso cero se inicia con una respuesta al agotamiento de nutrientes y a la produccin de pptidos que responden a una alta concentracin celular (Schneider et al., 2002). En el paso II se producen enzimas hidrolticas, como las proteasas y amilasas, y termina con la formacin de un septo en un polo de la clula, en el paso

siguiente(III) ocurre el engullimiento de la preespora, del IV al VII formacin de la corteza, formacin de la cubierta, maduracin y lisis. Durante esta serie de eventos se forman dentro de un mismo cuerpo dos clulas; la clula madre y la preespora, las cuales mantienen una comunicacin para poder en conjunto y de una forma metablica ordenada, formar la espora. La transicin de un estado al otro es gobernada por seis protenas reguladoras llamadas factores sigma, que se unen a la ARN polimerasa y determina que promotores se reconocern. Estos factores son: el factor sigma que ocurre durante el crecimiento vegetativo, A, y cinco factores que se activan en cascada durante la esporulacin, llamados H, F, E, G y K . En el paso cero y debido a las seales antes mencionadas se activa, va fosforilacin, el regulador transcripcional codificado en SpoOA. El mecanismo por el cual 19SpoOA es fosforilado involucra una transferencia secuencial de fosfato inorgnico al travs de una serie de reacciones conocidas como sistema FOSFORRELEVADOR. Al travs de A, SpoOA se produce durante el crecimiento vegetativo en bajas concentraciones, sin embargo al tiempo To H (producto de SpoOH) amplifica la seal para incrementar la produccin de SpoOA y otros genes como SpoOF y KinA. El fosforrelevador consiste bsicamente de cuatro reacciones; inicialmente en respuesta a una seal , KinA se autofosforila y el resto del fosforrelevador consiste de tres reacciones subsecuentes en que se transfiere el fosfato, primero de KinA-P a SpoOF para producir SpoOF-P, de este a SpoB para producir SpoB-P y finalmente de este a SpoOA para producir SpoOA-P. El gen KinB es otro gen de por lo menos tres que codifican para una protena con actividad similar a KinA. Adems existen tres fosfatasas que inhiben la actividad del fosforrelevador; la fosfatasa SpoOE es especifica para SpoOA-P, la RapA lo es para SpoOF-P al igual que RapB y sus funciones pudieran ser prolongar el estado de transicin y as acumular suficiente SpoOA y estimular etapas posteriores o bien inhibir la acumulacin de SpoA-P y contribuir a la inactivacin del fosforrelevador en etapas posteriores del proceso de esporulacin . AbrB es un gen que participa en la regulacin de una variedad de procesos que estn asociados con el final de la fase exponencial de crecimiento y principalmente inhibe esta expresin. SpoOA-P es el producto final del fosforrelevador y el ms importante ya que activa y reprime la transcripcin de muchos genes asociados a la esporulacin, incluyndose el mismo (Sonenshein, 2000).

Figura 1.Proceso de esporulacin en Bacillus :

Referencias : 1.http://www.bib.fcien.edu.uy/files/etd/pasan/uy24-13972.pdf 2.http://www.mkm-pi.com/biotech/sistemas-de-expresion-de-proteinas-en-escherichiacoli-para-la-produccion-de-biofarmacos-alternativas-y-criterios-de-seleccion-3/ 3.http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15regulacion.htm 4.Jin Ann Howw. (et all.). Nuestros resultados sugieren que e. coli adaptada para 1% de aumento en nacl cada mes con una adaptacin exitosa a 11% de nacl. (2013). 2013 (Article ID 21909), 7. Retrieved from http://dx.doi.org/10.7167/2013/219095 5.PHILIPPE BOULOC and RICHARD DARI. (n.d.). Escherichia coli metabolism in space. (1991).Journal of General Microbiology, 1(137), 2839-2843. 6.Schneider KB, TM Palmer, AD Grossman 2002. Characterization of comQ and comX, two genes required for production of ComX pheromone in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 184:410-419 7.Sonenshein AL 2000. Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis Curr Opinion Microbiol 3:561-566.

6. Utilizando un diagrama de flujo, y desde el punto de vista quimiotctico, presente lo qu ocurrira fisiolgicamente con una bacteria: (20 pts) (1) si hay un atrayente en el medio a una misma concentracin, que tal y un repelente. Quimiotaxis bacteriano se deriva de la regulacin esparcida del movimiento lineal con reorientaciones que surgen de cambios en rotacin flagelar. En la bien estudiada Escherichia coli, rotacin flagelar en contra de las manecillas del reloj (CCW) causa movimiento lineal, mientras rotacin flagelar a favor de las manecillas del reloj (CW) causa que la bacteria haga twitch o tumble, y se reoriente. La frecuencia del movimiento lineal y reorientaciones es alterada por molculas atrayentes beneficiosas y molculas repelentes perjudiciales (1). Atrayentes y repelentes afectan la frecuencia de tumble en maneras opuestas (2). Especficamente, molculas atrayentes causan que la bacteria se mueva linealmente con pocas reorientaciones, mientras repelentes aumentan las reorientaciones (1). Cambios en la direccin rotacional de flagelos son controlados por el regulador de respuesta quimitctica CheY. Cuando CheY esta fosforilado (CheY-P), se une al motor flagelar y causa reorientaciones. CheY defosforilado no se une al motor, dejndolo rotar en su direccin CCW predeterminada que establece movimiento lineal (Fig. 1a). Los niveles de CheY-P son controlados por una va de transduccin de seal quimitctica que comienza cuando quimiorreceptores detectan caractersticas ambientales

especficas y transmiten esta informacin a la kinasa CheA. CheA a su vez fosforila CheY para crear CheY-P (1). El ensamblaje de repelentes a los receptores activa la kinasa CheA, resultando en un aumento en fosforilacin del regulador de repuesta CheY. Fosforilacin induce una cambio conformacional en el regulador de respuesta que le permite ensamblarse a protenas de intercambio en el motor flagelar, causando una respuesta repelente. Atrayentes tienen el efecto contrario, inhibiendo la kinasa, previniendo la fosforilazacin del regulador responsivo and as bloqueando la interaccin entre el regulador de respuesta y el motor. [] Inmediatamente despus de que la clula ha sido expue sta a

un estmulo repelente, sus receptores envan una fuerte seal para activar la kinasa y efectuar una respuesta motor repelente. Sin embargo, despus de unos pocos segundos, la clula regresa exactamente a su comportamiento pre estmulo, a pesar de la presencia continua del repelente. [] Demetilacin [de los MCPs, methyl-accepting chemotaxis proteins] fuerza al receptor a un estado que tiende a inactivar la kinasa, as que la reaccin de demetilacin acta como un mecanismo de realimentacin negativa para causar adaptacin a repelentes. Al contrario, atrayentes causan un incremento en metilacin de receptores que activa la kinasa y causa adaptacin a atrayentes (Fig. 1b).

(a)

(b)

Fig.1.(a)Phosphorelay signaling.(b)Modelo de estado-doble de receptores de sealizacin (3) (2) en presencia de un atrayente y un repelente a la vez con CheZ no funcional. Como vimos en la pregunta anterior, cuando una bacteria se encuentra en un medio con atrayente esta tiene un movimiento lineal, mientras si se encuentra en un medio con repelente esta se reorienta y hace tumble. Si la bacteria se encuentra en un medio con ambos, atrayente y repelente, esta se adapta y se mueve en lo que se conoce como random walk (Fig. 2), esto es, el movimiento de la bacteria est balanceado entre movimiento lineal y tumble. Sin embargo, si la protena CheZ no es funcional esta no puede defosforilar CheY y la bacteria se reorienta y se queda haciendo tumble por ms tiempo, o lo que se conoce como biased walk (Fig. 2).

Fig. 2. Random and biased walks (3). Referencias (1) Sanders, L., Andermann, T., Otteman, K. (2013). A supplemented soft agar chemotaxis assay demonstrates the Helicobacter pylori chemotactic response to zinc and nickel. Microbiology 159, 46-57. (2) Tso, W., and Adler, J. (1974). Negative Chemotaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol 118(2), 560-576. (3) Parkinson Lab. An Overview of E. coli chemotaxis. Department of Biology-University of Utah. http://chemotaxis.biology.utah.edu/Parkinson_Lab/projects/ ecolichemotaxis/ecolichemotaxis.html (4) Grebe, T., Stock, J. (1998). Bacterial chemotaxis: The five sensors of a bacterium. Current Biology 8(2), R154-R157.

7. Diagramticamente represente el modelo de interaccin entre las protenas afectadas y las involucradas en las siguientes situaciones: (10pts) a. presencia de perxido de hidrgeno en el medio de cultivo. Figura 1: Diagrama de interaccin de H2O2 en E. coli. (2)

El perxido de hidrogeno (H2O2) puede originarse en los metabolismos de muchas bacterias aerbicas y anaerbicas. El H2O2 inhibe o destruye actividades enzimticas y por consecuencia destruye a la bacteria. En casos como este las bacterias poseen una enzima que la ayuda a romper el H2O2 en agua y oxigeno por medio de la enzima catalasa. Hay ocaciones que la bacteria no posee esta enzima y recurre a la oxidacin de sulfhidrilo. (1) En la bacteria E. coli se encuentra una protena llamada OxyR que es la encargada de tanto la seal como regular la oxidacin propia o por la presencia de H2O2. Tambin la ruta metablica de H2O2 esta conjuntamente enlazada con las reacciones redox de thiol. (2) 1. Universidad Nacional de Colombia. 2004. Perxido de hidrogeno. 7 de abril de 2009. http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/agronomia/2001819/lecciones/cap06/ cap06_02.html 2. Michael Toledano, et all. Microbial H2O2 sensors as archetypical redox signaling modules. TRENDS in Biochemical Science. Vol 29 No. 7. Julio 2004.

8. En la replicacin microbiana las protenas Fts y Mreb juegan un papel protagnico. Presente un modelo secuencial de participacin de estas protenas en el proceso de replicacin y las consecuencias de haber mutaciones en las mismas que eviten su expresin y actividad. (5 pts). La funcin de las protenas MreB y FtsZ en el citoplasma de E.coli es la de asegurar que nuevas subunidades de muropptidos son insertadas de manera espacialmente correcta durante la elongacin y divisin. Particularmente para la retencin de un dimetro constante y la forma en general de la clula los materiales nuevos deben ser insertados de manera uniforme en la pared celular alrededor del dimetro de la clula.(1) La protena MreB se encarga del proceso de elongacin de la clula, y se piensa que este localiza los componentes de la maquinaria sinttica del peptidoglicano a lo largo de la pared celular lateral, decidiendo la geometra del crecimiento de la pared. Mientras que la divisin celular es iniciada cuando la FtsZ s condensa en la membrana interna en el centro de la clula y desencadena la invaginacin al atraer un set de protenas a formar un anillo septal.(1) De haber una mutacin que inactivara la FtsZ solamente, la MreB funciona normalmente formando hlices y dirigiendo la insercin de las nuevas subunidades de peptidoglicano de manera uniforme. Si hubiese una mutacin que inactivara la MreB las clulas tomaran forma redonda debido a la desintegracin de las hlices de MreB pero aun as las nuevas subunidades de peptidoglicano se distribuiran de manera uniforme.

De haber una mutacin que inactive ambas protenas se vera incorporacin agrupada e irregular de las nuevas subunidades de peptidoglicano.(1)

En esta figura podemos ver la razn por la cual la inactivacin de una sola de estas protenas no afecta de gran manera una clula. Esto se debe a que pueden actuar de manera individual la una de la otra o de manera concertada para lograr (1) su funcin.

En esta figura podemos ver un modelo de la interaccion entre Mreb(azul) y FtsZ(rojo) durante la divisin celular.

(2)

En esta imagen podemos observar los efectos de la inactivacin de FtsZ, MreB y PBP 2. En (A), (B) y (E) podemos ver la inactivacin de ambos FtsZ y MreB. En (C) y (D) podemos ver la inactivacin de MreB. Y por ultimo en (F) podemos ver la inactivacin de FtsZ y PBP 2.

(3)

(1) Varma A., Young K. In Escherichia coli, MreB and FtsZ Direct the Synthesis of Lateral Cell Wall via Independent Pathways That Require PBP 2. J. Bacteriol. June 2009 vol. 191 no. 11 3526-3533 (2) Vats P., Rothfield L. Duplication and segregation of the actin (MreB) cytoskeleton during the prokaryotic cell cycle. PNAS 2007 104 (45) 17795-17800; published ahead of print October 31, 2007, doi:10.1073/pnas.0708739104 (3) Varma A, de Pedro MA, Young KD. FtsZ directs a second mode of peptidoglycan synthesis in Escherichia coli. J Bacteriol. 2007 Aug;189(15):5692-704.

9. Utilizando el programa Tmpred y el de generacin de curvas de hidrofobicidad (http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html; http://www.vivo.colostate.edu/molkit/ hydropathy/index.html), indique si las siguientes protenas son o no transmembrnicas, demuestre su respuesta (15 pts): a. M S R P R L I V A L F L F F N V F V H G E N K V K Q S T I A L A L L P L L F T P V T K A RTPEMPVLENRAAQGDITAPGGARRLTADQTAALRDSLSDKPAKNIILLIGDGMGDSE ITAARNYAEGAGGFFKGIDALPLTGQYTHYALNKKTGKPDYVTDSAASATAWSTGVK T YNGALGVDIHEKDHPTILEMAKAAGLATGNVSTAELQDATPAALVAHVTSRKCYGPS A TSEKCPGNALEKGGKGSITEQLLNARADVTLGGGAKTFAETATAGEWQGKTLREQA Q P E AVQRALEFAKKDGNTLVIVTADHAHASQIVAPDTKAPGLTQALNTKDGAVMVMSYGN S EEDSQEHTGSQLRIAAYGPHAANVVGLTDQTDLFYTMKAALGLK De acuerdo con el programa esta protena posee tres dobleces que van de adentro hacia afuera de la membrana y dos dobleces que van de afuera hacia adentro de la membrana, esto indica que la protena posee un comportamiento transmembrnico. La figura uno nos deja saber la direccin de cada hlices. La figura dos es un modelo de como se vera esa protena en la membrana. La figura tres es la grfica de hidrofobicidad que nos deja saber cuan hidrofbica o hidroflica es la protena. A N RGYQLVSDAASLNSVTEANQQKPLLGLFADGNMPVRWLGPKATYHGNIDKPAVTCT PQRNDSVPTLAQMTDKAIELLSKNEKGFFLQVEGASIDKQDHAANPCGQIGETVDLD

Figura 1: Hlices transmembranales.

Figura 2: Diagrama de hlices transmembranales.

Figura 3: Grfica de hidrofobicidad.

b. M R L A A L L L A A L L A T P A F A V Q P D E I L P D P A L E A R A R D I S Q G L R C L VCRNENIDDSNAQLARDLRLLVRERLAAGDSDAEVVEFVVDRYGEYVLLNPTTGGA NL ILWIAGPAMLAGGLGLAALYLRRRRTAPDAASAALSDEEQARLPEILKD. De acuerdo con el programa esta protena posee dos dobleces que van de adentro hacia afuera de la membrana y dos dobleces que van de afuera hacia adentro de la membrana, esto indica que la protena posee un comportamiento transmembrnico. La figura uno nos deja saber la direccin de cada hlices. La figura dos es un modelo de como se vera esa protena en la membrana. La figura tres es la grfica de hidrofobicidad que nos deja saber cuan hidrofbica o hidroflica es la protena. Figura 1: Hlices transmembranales.

Figura 2: Diagrama de hlices transmembranales.

Figura 3: Grfica de hidrofobicidad.

c. Y V E P P P A A F I G I D E L G K W S F Y R A L I A E F I A T L L F L Y I T V L T V I G YKSQSATDPCGGVGILGIAWAFGGMIFVLVYCTAGISGGHINPAVT

De acuerdo con el programa esta protena posee dos dobleces que van de adentro hacia afuera de la membrana y dos dobleces que van de afuera hacia adentro de la membrana, esto indica que la protena posee un comportamiento transmembrnico. La figura uno nos deja saber la direccin de cada hlices. La figura dos es un modelo de como se vera esa protena en la membrana. La figura tres es la grfica de hidrofobicidad que nos deja saber cuan hidrofbica o hidroflica es la protena. Figura 1: Hlices transmembranales.

Figura 2: Diagrama de hlices transmembranales.

Figura 3: Grfica de hidrofobicidad.

10. El Dr. Berstein opina que cuando hablamos de los sentidos, esto solo puede aplicarse a organismos multicelulares avanzados como lo son los del reino animal. Demustrele al doctor Berstein que est equivocado, presentando ejemplos fisiolgicos donde los microorganismos utilicen sus sentidos. (20 pts). Los humanos utilizan cinco sentidos para obtener informacin sobre su ambiente y planear sus acciones. Ahora que el genoma de Escherichia coli ha sido secuenciado, est claro que [esta] tiene la misma cantidad de sensores quimitcticos: Trg, para ribosa y galactosa; Tar, para aspartato; Tsr, para serina [ambos comprenden aproximadamente el 90% de las molculas receptoras de la clula (5)]; Tap, para pptidos; y [] Aer, el cual puede ser un detector redox (1). Todos excepto Tap son mediadores de la respuesta a uno o ms receptores especficos de repelentes (4). Estos quimiorreceptores son conocidos como protenas quimiotcticas aceptadoras de metil, o MCP (por sus siglas en ingles). Los dos receptores ms importantes en E. coli, Tar y Tsr, pueden cada una sumar las seales de diferentes, y aparentemente desligados, estmulos para generar un producto integrado. Por ejemplo, respuestas a ambos el atrayente serina y el repelente cido son mediados por Tsr, con serina tendiendo a contrarrestar los efectos del cido, mientras que dos atrayentes aspartato y maltosa dan respuestas aditivas mediadas por Tar (1). Cuando las clulas de E. coli son expuestas a estmulos atrayentes y repelentes, uno mediado por Tar y el otro por Tsr, la respuesta puede ser bifsica, con Tsr mediando una respuesta repelente rpida, seguida por una respuesta atrayente relativamente lenta a travs Tar (2). Por otro lado, a pesar de que las respuestas mediadas por los quimiorreceptores [menores] Trg, Tap y Aer son de duracin e intensidad cuantitativamente similares a las mediadas por Tar y Tsr, estas protenas estn presentes a slo una dcima parte del nivel de Tar o Tsr (1). Tambin se ha comprobado que estos tres quimiorreceptores, en ocasiones, slo pueden trabajar cuando interactan con Tar y Tsr, como es el caso particular de Trg. Una asociacin ntima entre receptores mayores y menores, al menos en trminos del sistema metilacin/adaptacin, es tambin sugerida por la observacin

de que una forma mutante de Trg que no tiene sitios metilables todava puede sostener respuestas quimitcticas adaptables (3). El ltimo quimioreceptor Aer es el mayor transductor oxgeno-sensor en Escherichia coli. Aer tiene un dominio sensorial citoplasmtico N-terminal (PAS) que se piensa monitorea el estado del oxgeno ambiental a travs de cambios redox asociados en un grupo prosttico dinucletido flavina adenina (5). Por ltimo, existe otro sensor de nutrientes llamado Enzima I del sistema de fosfotransferasa (PTS) dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) el cual se agrega a la kinasa CheA para controlar la fosforilacin de CheY en respuesta a cambios en el transporte y metabolizacin de azcar (1).

(a)

(b)

Fig. 1. (a) MCPs de Escherichia coli (6). (b) Sistema de quimiotaxis de una bacteria (7).

Referencias (1) Grebe, T., Stock, J. (1998). Bacterial chemotaxis: The five sensors of a bacterium. Current Biology 8(2), R154-R157. (2) Khan S, Spudich JL, McCray JA, Trentham DR: Chemotactic signal integration in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:9757-9761.

(3) Hazelbauer GL, Park C, Nowlin DM: Adaptational crosstalk and the crucial role of methylation in chemotactic migration by Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:1448-1452. (4) Feng, X., Baumgartner, J., Hazelbauer, G. (1997) High- and low-abundance chemoreceptors in Escherichia coli: Differential activities associated with closely related cytoplasmic domains. J. Bacteriol 179(21), 6714-6720. (5) Gosink, K., Burn-Barral, M., Parkinson, J. (2006) Signaling interactions between the aerotaxis transducer Aer and heterologous chemoreceptors in Escherichia coli. J. Bacteriol 188(10), 3487-3493. (6) Kanehisa Laboratories. Bacterial chemotaxis - Reference pathway (KO). http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?org_name=ko&mapno= 02030&mapscale=1.0&show_description=show (7) Kohidai, L. Chemotaxis: Receptor regulation. http://en.wikipedia.org/wiki/Chemotaxis

11. Desarrolle y presente un diagrama de su protena favorita una vez la misma ha sido denaturalizada por calor y cmo una chaperona entra en accin para renaturalizarla o degradarla. (10pts).

Fig. 1. Modelo de accin de la chaperona sHSP.

Fig. 2. Modelo esquemtico de HSP33 como ejemplo de Chaperonas Intrnsicamente Desordenadas de Stress-especfico

Las protenas pequeas de choque trmico (sHSP) son una clase de chaperonas moleculares prcticamente omnipresentes que actan de manera altamente eficiente para prevenir agregacin irreversible de diferentes sustratos proteicos.

Las protenas desnaturalizadas por el calor puede agregarse para formar complejos insolubles, o para prevenir la agregacin mediante la unin a sHsps. La protena desnaturalizada puede entonces ser degradada por las proteasas en la clula, o redoblada por chaperonas dependientes de ATP como la HSP70.

1. Van Montfort et al. Nat. Struct Biol. 2001; Cheng et al. JBC 2008; Jaya et al. PNAS 2009

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