TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

I. CONCEITOS BSICOS 1. INTRODUO At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente analisada atravs de meios indiretos como a sequncia de protenas e anlise gentica. A partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia. A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao Como comercial ou biotecnolgica do parece ter desta um potencial inesgotvel. conseqncia desenvolvimento tecnologia atualmente possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas atravs da anlise de DNA.

2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia de bactrias como um clone porque todos os
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indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial. A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIO Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia da replicao de um bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presena de nucleases altamente especficas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especficas ( modificao). Como conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias. As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so proteinas monomricas ou
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dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1).
a ) C liv a g e m n o e ix o d e s im e t r ia b ) C liv a g e m s im t r ic a m e n te s it u a d a a o r e d o r d o e ix o d e s im e tr ia

...TC GA... ...AG CT...

...GAA TTC... ...CTT AAG...

+
5 3 3

+
5

M o l c u l a s c o m e x tr e m id a d e s a b r u p t a s

M o l c u l a s c o m e x tr e m id a d e s c o e s i v a s

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind III isolada da
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Haemophilus influenzae, linhagem d III. A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam terminaes coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou no coesivos.

M ic r o r g a n is m o
E s c h e r ic h ia c o li B a c illu s a m y lo liq u e fa c ie n s H B a c illu s g lo b ig ii H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s P ro v id e n c ia s tu a r tii S tre p to c o c c u s a lb u s G T h e r m u s a q u a tic u s B re v ib a c te r iu m a lb id iu m H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s

E n z im a
E coR I Bam H I B g lI I H a eII H in d III P stI S a lI TaqI B a lI H a e III

S e q u n c ia A lv o
G C A T A T T A T A C G

G C

G C

A T

T A

C G

C G

A T

G C

A T

T A

C G

T A

Pu P iy

P i Pu

A T

A T

G C

C G

T A

T A

C G

T A

G C

C G

A T

G C

G C T A

T A C G

C G G C

G C A T

A T

C G

T A

G C

G C

C G

C G

A T

A T

G C

G C

C G

C G

T A

S e r r a tia m a rc e s c e n s

Sm aI

C G

C G

C G

G C

G C

G C

Tabela 1. Algumas endonucleases de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o
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DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas bacterianas. Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas que reconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em mdia a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e 65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer variaes significativas, dependendo principalmente da composio de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio de restrio contendo 8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamferos. A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2).

Sentido da migrao

P a re s d e base

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente.

A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmdeo.

ACGT
P la s m d e o de E .c o li

TGCA

D N A hum ano

TGCA ACGT

TGCA ACGT

E n z im a

E n z im a

GCA T

T ACG
D N A lig a s e

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria atravs de transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo. Geralmente, antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

5. DNA LIGASE

AC

TG

CA T G

AC

TG

P la s m d e o h b r id o

CA T G
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Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligao dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4
O DNA 3 OH + O
-

DNA

O DNA-Ligase
ATP ou N AD

O DNA 3 O
-

P O

DNA

requer ATP como cofator.

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.

5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase a) Fragmentos com extremidades coesivas As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de restrio permitem que dois fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples das extremidades coesivas das duas diferentes molculas, atravs da formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases. Finalmente, a ligao covalente (fosfodister) dos fragmentos realizada pela DNA ligase (ver figura 4). b) Fragmentos com extremidade no coesivas

DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito menos eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentrao muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos necessria para que as molculas com extremidades no coesivas sofram reao de ligao. No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela transformao prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este procedimento pode ser feito atravs de dois processos: a) Adio de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravs da enzima desoxinucleotidil-transferase-terminal ou simplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita simples proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molcula tratada previamente com uma exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais. Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA ligase (Figura 5) b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas. Os adaptadores so oligonucleotdeos sintticos que contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade no coesiva, pode-se optar pela utilizao de T4 ligase em grande concentrao, o que permitir a ligao entre molculas de DNA sem proeminncias.

6. TRANSFORMAO BACTERIANA 6.1.Conceito de transformao induzida O processo de transformao constitui um evento de alta
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importncia na tcnica de manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos autores tambm verificaram que as bactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do crescimento.
5 3 3 5 5 3 5 - E x o n u c le a s e e s p e c f ic a 3 3 3
D e o x in u c le o t d io tr a n s f e r a s e te r m in a l

3 5

+dATP AAAA AAAA TTTT

+dTTP TTTT

E s p a o s p r e e n c h id o s c o m D N A P o l I. D N A lig a s e p a r a c o m p le t a r a lig a o

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).

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DNA a ser inserido Vetor GAATTC CTTAAG + GAATTC CTTAAG Adaptador Sinttico

T4 DNA ligase EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG

EcoRI G AATTC CTTAA G AATTC G G CTTAA

Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformados em coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrio que reconhece o adaptador.

O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afetam o processo de transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula bacteriana competente; DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico.

6.2. Mecanismos de captao do DNA O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria competente ainda desconhecido. Uma hiptese que as molculas do DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas de adeso, que so locais onde a membrana interna e externa da clula bacteriana
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unem-se formando poros. Estes poros s esto presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido a repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipdeos da membrana bacteriana e dos grupo fosfato da molcula do DNA. O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0 oC a fluidez da membrana celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos fosfatos carregados. Os ons Ca+2 formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choque trmico, complementa este processo de captao, provavelmente criando um desbalano trmico entre o interior e o exterior da clula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da zona de adeso. A figura 7 ilustra este processo.

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D N A g e n m ic o

C lu la B a c te r ia n a

Zona de adeso

- -

Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E. coli com uma molcula de DNA exgeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular. Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes. A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na biologia molecular.

--

- - - - - - P la s m d e o -

B ic a m a d a lip d ic a (in te rn a )

C a m a d a p e p tid o g lu c a n B ic a m a d a lip d ic a (e x te rn a ) F o s f o l ip d e o s o n d e c lc io

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1. PLASMDEO

Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico. Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado. Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira; b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem; c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam morrendo. A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo.
O

Am pR

M SC

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Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagem molecular. Esto representados o gene de resistncia (Amp R), a regio de mltiplos stios de clonagem (MSC) e a origem de replicao (O).

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico.

2. FAGOS Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veculo de clonagem molecular, vamos mostrar resumidamente as suas propriedades biolgicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias: a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e a concomitante inativao de outros,
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dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das protenas da capa e da cauda e formam-se novas partculas virais. Em aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos. b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado estado lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado profago. No estado lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira carregando o profago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo para as bactrias descendentes. Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou lisognico depende das condies do meio. Assim, via de regra, em meio rico em nutrientes o estado ltico preferencial, por exemplo o fago na bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da bactria hospedeira e do bacterifago.

2.2 Genoma do fago O bacterifago uma partcula viral constituda de aproximadamente 50% de protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12 nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stios cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas,
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cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que determina a instalao do estado ltico ou lisognico. As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma

clula hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais genes, respectivamente.

2.3 Controle de expresso dos genes do fago Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou lisognica, a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados esquerda (pL) e direita (pR) do gene cI. Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est diretamente relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs da induo da expresso dos genes OP. Por outro lado, o produto do gene N est diretamente relacionado com a expresso dos genes da regio de empacotamento, ou seja genes A e J, responsveis pela sntese das protenas da cabea e da cauda do fago , como tambm da expresso dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula hospedeira.

5 2 4 3

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Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Aps adsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via ltica indicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculas virais. Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada levando integrao do material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira .
E m p a c o ta m e n to R e c o m b in a o R e g u la o R e p l ic a o L is e

cos

in t

.c III N pL

cI C ro pr

c II

Figura 10. Representao esquemtica do genoma do fago .

Durante a via lisognica, a transcrio tambm inicia-se pelos promotores pL e pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes coordena a expresso do gene cI que produz uma protena repressora inibindo a expresso dos genes responsveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante o int, cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no genoma bacteriano estabelecendo o estado lisognico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so dispensveis e consequentemente a regio de integrao do genoma do fago pode ser totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica. Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da E.coli hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por g de DNA o que
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significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos so incorporados na E.coli hospedeira. Atualmente, existem vrios derivados do fago nos quais um ou mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um outro DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores o EMBL3, no qual a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo. Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago. Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados especialmente na clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11. Vamos a seguir fazer algumas consideraes sobre estes dois tipos de vetores. No fago gt10, o inserto geralmente cDNA, inserido no stio da EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o gene cI obstrudo e consequentemente durante a cultura provocar a lise das colnias de bactrias transformadas. Essas colnias lisadas so visualizadas como crculos com o centro claro (placas de lise), bastante distintos das colnias no recombinantes, que por possurem o gene cI ntegro no so lisadas e permanecem como colnias turvas.

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D N A b a c te r i f a g o

b a b b c

EcoR I b a

lig a s e

in fo r m a e s d e s n e c e s s r ia s r e p lic a o EcoR I

e m p a c o ta m e n to in v itr o

b a c te r i f a g o c o n te n d o genes do cam undongo

D N A cam undongo Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento de DNA genmico no fago . As regies indicadas por a contm todas as informaes necessrias para replicao em E. coli e empacotamento in vitro. Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de interesse com enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possui tamanho adequado para o empacotamento.

Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotdeos do cdon de trmino da enzima codificada por esse gene ( -galactosidase). Essa enzima, cuja expresso pode ser induzida por IPTG (isopropil--Dgalactosdeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colnias de bactrias carregando o DNA do fago com o
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gene LacZ intacto (sem inserto), na presena do indutor IPTG e do substrato X-gal, ficaro azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o fago que incorporou o inserto no stio de EcoRI, no expressam a galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificao dos clones recombinantes.

3. COSMDEO A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao, pois o fragmento a ser clonado no pode ser maior do que cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a chamada clonagem em cosmdeos. Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que inclui o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira. As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem os dois stios cos situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados. O DNA genmico de interesse clivado com uma enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao cosmdeo, tambm clivado com a mesma enzima. A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e empacotam estas molculas.
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O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia adquirida a um determinado antibitico. A figura 12 ilustra um tpico processo de clonagem em cosmdeo.

Am p

S t io a lv o d e r e s t r i o

fr a g m e n to s d e r e s tr i o de cos 35 a 40 kb

s e le o d e c l o n e s r e s is t e n t e s a a m p i c i li n a

D N A c i r c u la r i z a a p s in fe c o

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdeo.

4. VRUS A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos
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primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies so chamadas de regio precoce e regio tardia. A regio precoce expressa atravs do ciclo ltico, enquanto que a expresso dos genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas duas regies situa-se a origem de replicao do DNA do vrus. Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T, o qual responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis (clulas nas quais o vrus no completa a sua replicao), como tambm pelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s protenas que formam o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do
o E x p re s s o p re c o c e E x p re s s o ta r d ia

SV40

virus SV40.

G enom a do S V40

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vrus SV40 A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia.
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No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T, ao passo que na segunda opo no haver produo das protenas do capsdeo. Entretanto, estas funes deletadas podem ser suprimidas como veremos a seguir.

4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, perde-se a expresso das protenas do capsdeo (funes tardias). Para que o sistema de clonagem funcione adequadamente pode-se realizar a infeco simultnea com um outro vrus SV40 que tem uma deleo nos genes da regio precoce, mas a regio tardia intacta. Nas clulas coinfectadas as protenas da regio precoce sero produzidas pelo vrus recombinante e as protenas do capsdeo pelo vrus deletado. Como resultado, teremos a produo de uma populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra este procedimento.

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O R e g i o fu n c io n a l p re c o c e

SV40

R e g i o fu n c io n a l ta r d ia

gene da g lo b in a

SV40

S V 4 0 - g lo b in a

c o tra n s fe c o

e m p a c o t a m e n t o e lis e

p a r t c u la s V ir a is

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce

Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das protenas codificadas pela regio precoce (antgeno T). Para evitar uma infeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem
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celular, as clulas COS as quais, apresentam uma poro do genoma do SV40 integrado ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular produz a protena viral denominada antgeno T, a qual liga-se na origem de replicao do vrus e induz a sua replicao. A figura 15 ilustra este tipo de clonagem. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene a ser clonado no pode ser grande, a outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas de macacos e finalmente, o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjados ou delees. Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o vrus da vacina e o Baculovrus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante. Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovrus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas de mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA o qual incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

5. BACTERIFAGO M13 O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a
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clula hospedeira infectada pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico (Figura 16).

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R e g i o fu n c io n a l p re c o c e

SV40

R e g i o fu n c io n a l ta r d ia

gene da h e m a g lu tin in a ( H a )

SV40 m u ta n te

S V 4 0 -H a

c o -tra n s fe c o

S V 4 0 m u ta n te in te g r a d o a o g e n o m a d a c lu la C O S a n t g e n o T r e p lic a o

e m p a c o ta m e n to e lis e

P a r t c u la V ir a l

Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce.

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E .c o li

+
M 13

+
Figura 16. Replicao do bacteriofago M13.

5.1. Clonagem no bacterifago M13 A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da E.coli infectada com este vetor. Como veremos futuramente, este DNA fita simples bastante til no processo de sequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por Sanger e colaboradores (1977). Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de seqenciamento, foram desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais contm o MSC inserido no gene que expressa a -galactosidase. Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa quando o vetor est na clula hospedeira, convenientemente preparada. Este processo denomina-se de alfacomplementao. A incluso do mltiplo stio de clonagem no gene da galactosidade visa a

identificao dos possveis recombinantes quando na presena de um substrato cromognico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil--Dgalactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no recombinante), a enzima funcional e frente ao substrato cromognico este clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando um
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fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio de clonagem, a expresso da enzima suprimida, portanto as clulas so incapazes de metabolizar o substrato cromognico formando placas incolores. 5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio de clonagem, tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um fragmento de DNA em ambas as orientaes. Como veremos adiante, esta estratgia apresenta grande aplicao no programa de sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger. A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambos clivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a insero do fragmento de DNA na orientao 5'3' no vetor M13mp8 e na orientao 3'5' no vetor M13mp9.

P
5

E
3

M 13 m p9

M 13 m p8

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 e M13mp9 clivados com as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGOMDEOS Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade

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especialmente nos processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras geraes de fagos, os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais: fagomdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste stio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o processo de sequenciamento. utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio, possvel criar terminaes 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqenciamento de um grande inserto de DNA, sem a necessidade de mltiplas subclonagens como usual no sistema M13 ou a sntese de vrios oligonucleotdeos internos, usados como iniciadores no processo de seqenciamento.

6.1. Clonagem no fagomdeo Vamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP que particularmente til para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um cDNA clonado neste vetor pode ser automaticamente excisado do fago para um fagomdeo denominado pBluescript. Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma protena de fuso quando na orientao correta, podendo assim tambm ser rastreada com anticorpos.
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Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as protenas do sistema M13. Essas protenas reconhecem os sinais de iniciao e trmino da sntese de DNA do fago auxilar (f1) que esto flanqueando o pBluescript, que por sua vez est incorporado no fago ZAP e carrega o inserto. Com a clivagem destas duas seqncias, o DNA automaticamente circularizado na bactria para originar a forma recombinante do plasmdeo Bluescript SK(M13). O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para as RNA polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser convenientemente linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podem ser obtidas em ambas as direes atravs do uso das RNA polimerases T3 e T7.

7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato de que tratam-se de organismos eucariotos inferiores e como tais possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm disso, muitas protenas de leveduras so similares estrutural e funcionalmente s suas homlogas em mamferos. A utilizao de leveduras como um modelo de estudo traz as seguintes vantagens: tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo. genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas. possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem como a realizao de experimentos de complementao gentica. As clulas de mamferos so
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diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes recessivas. Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em leveduras. A maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras so genes envolvidos na biossntese de aminocidos e nucleotdeos. Um dos marcadores frequentemente utilizados o gene de levedura LEU2 que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima -isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2, no cresce em meio de cultura que no contm leucina. Assim quando o gene LEU2 utilizado na transformao da linhagem leu 2, as clulas desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 sero capazes de crescer em meio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta estratgia semelhante a resistncia ampicilina adquirida por bactrias que foram transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove a resistncia ampicilina. A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados em levedura. GENE ENZIMA
Imidazol glicerolfosfato desidratase -Isopropilmalato desidrogenase -Aminoadipato redutase N-(5'-fosforibosil)- antranilato isomerase Orotidina-5'fosfato decarboxilase

SELEO
Histidina Leucina Lisina Triptofano Uracil

HIS3 LEU2 LYS2 TRP1 URA3

Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura . Os meios de cultura utilizados em geral contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um. Assim, por exemplo, clulas transformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de cultura deficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes de se propagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulao destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizada em bactria como para qualquer plasmdeo convencional e ento o
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mesmo transferido para levedura, organismo onde os ensaios de interesse so realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de replicao de bactria e levedura bem como genes marcadores que funcionam para a seleo nos dois organismos. Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de leveduras: Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Neste caso o plasmdeo no capaz de replicar de modo autnomo na levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos cromossomos de levedura. Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm origem de replicao de bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Dois tipos de origens de replicao de levedura so empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo consiste na origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em levedura. O segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao autnoma). Plasmdeos contendo a origem de replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS replicam em mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma variante deste tipo de vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo centromrica, denominada CEN, que garante que a replicao destes plasmdeos seja estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura (Figura 18). YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) so uma variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que so sequncias das
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extremidades dos cromossomos. A presena de sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se mostrado uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19).
LEU 2 ARS P u c11 8
M u l t ic p i a s

LEU2 ARS P u c11 8 D N A L e v e d u ra D N A L e v e d u ra C p ia n ic a

CEN

Figura 18. Vetores de levedura . Contm sequncias de plasmdeo (aqui de pUC118) que permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli, o gene de seleo em levedura (neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio. Vetores multicpias: Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura. Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2 m, outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio em mltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origens de replicao tipo ARS podem ser mantidos estavelmente atravs da adio de sequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias tipo CEN assegura que o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado de modo preciso durante a diviso celular.

GLOSSRIO - ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao autnoma). Sequncia que funciona como uma origem de replicao em cromossomos de levedura. BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de bactria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no fator F de plasmdeo que assegura que o plasmdeo seja mantido em pequeno nmero de cpias na bactria. Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico e qual liga-se o fuso mittico durante a meiose ou mitose. necessria para a manutno da estabilidade e segregao correta
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dos cromossomos durante a diviso celular. Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em um dado fragmento de DNA. Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes na manuteno da integridade cromossomal. YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura). Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que tem capacidade de replicao autnoma e que contm um centromro de levedura e duas sequncias telomricas em suas extremidades.

EcoR I CEN 4 ARS1 TRP1 Am p

R

YAC

URA3

+EL

Bam HI

+EL

Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s) marcadores para seleo em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenos cromossomos lineares na levedura.

III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente quando o objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo,
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 claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) necessrio obteno de colees de clones recombinantes, portadores de molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar. O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em 106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 10 5 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a soluo deste problema envolva estratgias especficas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA

genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e introduzidos em E. coli atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta (Figura 20).

1. BIBLIOTECA DE cDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de
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tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contriburam para grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias que no codificam para protenas (Figura 21). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de polipeptdios importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subseqente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente.

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Tecido mRNA DNA Digerir o DNA, Parcial ou completamente cDNA Fracionar por tamanho

Escolha do Vetor

DNA clonvel

Ligar DNA a um vetor Introduzir o produto da ligao em E.coli

Titulao e caracterizao da Biblioteca

Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genmicas.

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre

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um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido. 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes.

1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do RNA total do tecido e subseqente seleo da frao de RNA poli(A)+, que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade essencial, uma vez que qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das seqncias na biblioteca. Uma vez obtida a frao de RNA poli(A)+, procede-se sntese dos cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nos ltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA, cada um apresentando vantagens e desvantagens particulares. Como exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado para esse fim: a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalisar in vitro a polimerizao de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das vezes, a
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molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda poli (A)+ do RNA. b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido, pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hbrida RNA-DNA. c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por DNA, resultando em uma molcula de cDNA de fita dupla. d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. Atravs da atividade 3'-5' exonuclesica dessa enzima remove-se possveis nucleotdeos extras nas extremidades 3'. e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de fita dupla, cpia exata da mensagem.

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a insero em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm existem vrios mtodos disponveis, que diferem entre si dependendo do tipo de vetor escolhido: plasmdio ou fago. O fago tem sido o vetor de escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica desta preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdios, o fago requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vetor para produzir nmero equivalente de clones recombinantes. Alm disso, bibliotecas em fago so mais fceis de serem manipuladas do que bibliotecas em plasmdios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores que no so favorveis para procedimentos de seqenciamento do DNA e de mutagnese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe de vetores compreende os fagemdios que, como o prprio nome sugere, so plasmdios contendo pores do genoma de fago e que renem
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vantagens desses dois vetores.

Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.

Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA em fago . metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de S-adenosil metionina. Esse passo essencial para proteger os stios EcoRI que possam existir no cDNA contra a ao da EcoRI em digesto a ser realizada subseqentemente no processo de clonagem. adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Essa reao resulta em molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23). um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela
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digesto com EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na molcula. A metilao prvia do cDNA garante que no haja digesto interna do cDNA. antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de molculas de adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas de Sephadex. as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4 ligase. o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do capsdeo do fago. os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que favorece o crescimento dos recombinantes. aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como produto uma biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as seqncias de RNAm da populao original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca do clone de interesse.

2. BIBLIOTECA GENMICA Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o aspecto principal considerado na construo de uma biblioteca genmica est na obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos
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aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de vetores baseados no fago . Basicamente, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos: a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem. b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos

recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.

44

1
Me

Me
Metilao do cDNA para proteger os stios internos de Eco RI Ligao dos adaptadores EcoRI com o cDNA

Digesto com Eco RI para gerar stios coesivos EcoRI

Separao do cDNA do excesso de adaptadores

cDNA purificado

Ligao do cDNA dos braos do fago lambda

Empacotamento dos recombinantes com as protenas formadoras da partcula viral

Infeco da bactria hospedeira o fago recombinante

Plaqueamento dos recombinantes

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago .

Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua importncia na representatividade da biblioteca. 2.1. Preparo do DNA do inserto A representatividade de uma biblioteca genmica depende

grandemente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados so gerados, para que no haja excluso sistemtica de nenhuma seqncia. O fracionamento mecnico do DNA o meio de se obter completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse
45

mtodo no comumente adotado devido trabalhosa manipulao necessria para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir fragmentao suficientemente aleatria atravs de digestes parciais do DNA com enzimas de restrio. Uma vantagem em se utilizar a digesto parcial do DNA a produo de fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados ao vetor. Para garantir que a digesto atinja todo o genoma so utilizadas enzimas de restrio que cortam freqentemente o DNA e que no apresentam desvios de distribuio de stios. A enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que gera fragmentos compatveis com stios de clonagem de vrios fagos e cosmdios, tem provado ser bastante til na produo de bibliotecas de DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto parcial, os fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao vetor. Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos podero ligar-se entre si produzindo falsos recombinantes. Fragmentos muito grandes que no permitem o crescimento do fago podero ligar-se aos braos do fago, alterando a relao entre as quantidades de DNA de inserto e vetor. Um mtodo de fracionamento freqentemente adotado o de centrifugao em gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a soluo de DNA aquecida para que possveis fragmentos agregados se dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente. Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As fraes contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado so utilizadas para a ligao com o vetor. A figura abaixo ilustra esse procedimento.

46

Tubo de plstico Tubo capilar

Bomba Gradiente de sacarose Tubos de coleta 4 2 3

Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao em gradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, aspirada primeiro.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados, bastante razovel se pensar que a probabilidade de uma dada seqncia de interesse estar presente em uma biblioteca genmica possa ser estimada estatisticamente, com base na distribuio de Poisson. Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser triados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica dada por: N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)] onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e G o tamanho do genoma, em pares de base. Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa como vetor um fago , para termos 99% de chance de isolar qualquer dada seqncia presente em uma nica cpia em um genoma tpico de mamfero. N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x10 4/3x109)]= 690.000

2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica

47

Fagos e cosmdeos so comumente usados na construo de bibliotecas genmicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados com o DNA do vetor para formar concatmeros que podem ento ser empacotados em partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmdios, entretanto, essas partculas virais servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdio se comporta como um plasmdio grande. Os cosmdios podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb, quase duas vezes o tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste modo, usando-se o cosmdio como vetor, necessrio gerar somente 350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca genmica de mamfero. Entretanto, bibliotecas em cosmdios so mais difceis de se construir e manter do que as bibliotecas de fagos. Cosmdios so ento usados quando o gene de interesse muito grande ou quando uma regio extensa do DNA cromossomal desejada. No caso de isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias onde a biblioteca ser usada muitas vezes, o uso de vetores mais recomendado. Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.

5'

cos

3'

BE

B S E

Fragmento central

B E S

BD

3' cos

5'

BE=brao esquerdo

BD= brao direito

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=brao esquerdo; BD=brao direito; stuffer= fragmento central; S= SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme

indicado

no

diagrama

este

vetor

apresenta

um
48

fragmento central flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e esquerdo). O fragmento esquerda, chamado de brao esquerdo, codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita, chamado de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos encontram-se os stios de restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientao inversa. Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um segmento de fita simples (cos). Esses segmentos so complementares entre si e permitem a recircularizao da molcula, e a conseqente replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira. Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no processo de clonagem a parte central do DNA do fago substituda pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando a molcula recombinante. Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes insertos foram desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de levedura (YACs) so molculas lineares de DNA cuja arquitetura mimetiza a estrutura de um cromossomo autntico (Figura 26). Os YACs recombinantes so criados pela ligao de fragmentos grandes de DNA genmico exgeno (at 2000 kb) com os dois "braos" do vetor YAC e o produto da ligao introduzido na levedura por transformao. Nos YACs recombinantes, o segmento de DNA genmico exgeno flanqueado de um lado por um centrmero, uma origem de replicao e uma marca de seleo e pelo outro lado, por uma segunda marca de seleo. As leveduras transformantes com cromossomo artificial so selecionadas como colnias em meio com as drogas de seleo. Os cromossomos artificiais de bactrias (BAC) so molculas de DNA circulares que carregam uma marca de seleo a antibitico. Os segmentos de DNA genmico exgeno so clonados no vetor BAC in vitro e o produto da reao de ligao introduzido por eletroporao em cepas de E. coli, onde mantido como um plasmdio de cpia nica. Os vetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminao dos
49

clones vazios e cheios. A mdia de tamanho dos clones de BACs 120 kb, mas alguns clones podem chegar 300kb. Os vetores de bacterifago P1 acomodam fragmentos genmicos de 70 a 100Kb. Neste sistema, as molculas lineares recombinantes geradas a partir de seqncias do vetor e do genoma so empacotadas in vitro em bacterifago P1. Aps a injeo em E. coli, as molculas se tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a recombinao de seqncias especficas presentes no vetor. Estes vetores carregam marca de seleo para antibitico, marca de seleo positiva para seleo dos clones com inserto de DNA genmico exgeno e uma origem de replicao plasmdial P1, que mantm uma ou duas cpias dos plasmdios recombinantes na clula. Uma segunda origem de replicao pode ser ativada para amplificao dos plasmdios antes do isolamento do DNA.

Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor

50

YAC carrega uma origem de replicao (ORI), um centrmero (CEN), dois telmeros e marcas de seleo (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-16, p. 1139.

Os cromossomos artificiais P1 combinam as caractersticas dos bacterifagos P1 e dos BACs, incluindo a marca de seleo positiva e as origens de replicao do bacterifago P1. Os clones circulares recombinantes de PACs gerados durante a reao de ligao in vitro so introduzidos em E.coli por eletroporao e mantidos como um plasmdio de cpia nica na clula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma humano em PACs variam de 60kb a 150kb.

IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o clone correto na mistura de clones que foi criada durante os procedimentos da confeco da biblioteca genmica ou de cDNA. Embora seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistncia a antibiticos que esto presentes nos vetores (Figura 27A), muito mais difcil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmdio devero ser examinadas milhares de colnias de bactrias crescidas em placas de petri contendo agar, para a deteco daquela(s) colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da protena expressa pelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene de interesse sem qualquer expresso protica que o caracterize (Figura 27B). Ser discutida inicialmente a situao na qual a protena expressa no hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a protena no expressa e a anlise ser feita atravs da prpria presena do DNA de interesse no fago ou na bactria.

1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO

51

Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula hospedeira pode-se identificar o clone que carrega este gene pela presena desta protena entre as colnias recombinantes. Para isto, o hospedeiro no deve produzir esta protena, a menos que ele carregue o clone que a produza. Se esta protena for produzida normalmente pela clula hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira defectiva ou mutante para o gene de interesse. Quando este gene for incorporado ele pode ser detectado por complementao daquela funo. Se a protena a ser detectada for especfica de mamfero, por exemplo, a clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a protena for uma enzima que catalisa uma reao mensurvel pode ser possvel triar as colnias por sua atividade enzimtica.

52

Se a protena de interesse no for uma enzima com funo detectvel, uma outra estratgia ser necessria para a identificao do clone correto, como por exemplo, o uso de um anticorpo especfico para a protena de interesse. Anticorpo uma protena do soro produzida pelos

mamferos que se combina com alta especificidade com outra protena, o antgeno. Neste caso, a protena de interesse o antgeno. Como o anticorpo se combina especificamente com o antgeno, se o antgeno estiver presente em uma ou mais colnias de uma placa de petri, a identificao destas antgeno-anticorpo. colnias poder ser feita observando-se a reao

Figura 27. Em A, estrutura do plasmdio pBR322, um tpico vetor de clonagem. Em B, mtodo da inativao insercional para isolar plasmdios contendo DNA exgeno. A insero do DNA exgeno no plasmdio pBR322
53

causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento de transformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126.

Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a biblioteca de cDNA ter de ser construda num vetor de expresso. Neste caso os cDNAs so inseridos nestes vetores em regies que promovam sua expresso em E.coli, normalmente em promotores que possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma protena de fuso, ou seja, ser sintetizada subseqente a alguns aminocidos pertencentes protena do vetor bacteriano. Estas protenas de fuso so geralmente mais estveis que a correspondente protena de eucarioto produzida em bactria e, portanto podem ser obtidas em grande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo) para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas e ento submetidos a uma soluo contendo um anticorpo especfico para a protena desejada. Depois que os anticorpos livres so removidos, um segundo anticorpo adicionado para localizar a posio do primeiro. O segundo anticorpo normalmente radioativo e pode ser identificado por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colnia radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X ser observada depois que o filme for revelado (Figura 28). A localizao desta mancha no filme corresponde localizao da colnia que produziu aquela protena, na placa de petri original. Esta colnia ser ento recuperada da placa original e cultivada. Uma limitao deste procedimento que o anticorpo utilizado nesta triagem precisa ser especfico para a protena de interesse. A produo de anticorpos pode ser obtida pela injeo da protena (antgeno) em um animal. No entanto, esta protena injetada deve ser pura, caso contrrio mais que um anticorpo ser formado.

54

2 O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias da biblioteca genmica ou de cDNA, se este gene no expresso? Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as duplas hlices juntas so dissociadas em duas fitas simples. Este processo chamado de desnaturao. Estas mesmas fitas simples podero se reassociar se forem conservadas 65 C, por longos perodos, num processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a associao ocorre entre cidos nuclicos de diferentes origens). Reaes de hibridao ocorrem entre quaisquer duas cadeias de cidos nuclicos de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham seqncias de nucleotdeos complementares.

55

Promotor EcoRI lac

gfll

-Galactosidase

Eco RI

EcoRI "linker "

cDNA

EcoRI

EcoRI

Proteina de Fuso

Empacotamento dos fagos in vitro e plaqueamento em camada bacteriana

Membrana de nitrocelulose

Nitrocelulose sobre as placas de lise Placas de lise Remoo da membrana Protenas se ligam a nitrocelulose

Filme de raio-X

anticorpo secundrio

Incuba membrana com anticorpo primrio Lava membrana Incuba membrana com anticorpo secundrio

anticorpo primrio

Figura 28. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver na orientao correta e na apropriada seqncia aberta de leitura traduzido em protena de fuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos.

Este

princpio

da

hibridao

molecular

fundamental

para

caracterizar DNAs recombinantes quando o gene de interesse no

56

expresso. Sondas de cidos nuclicos (fragmentos de cido nuclico marcados radioativamente, geralmente com
32

P) so utilizadas para

localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem uma seqncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca genmica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so espalhados juntamente com uma suspenso de bactrias numa placa de petri contendo meio de cultura slido. Uma vez visualizada as placas de lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdio) preparada uma rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Este processo permite a transferncia de uma poro de fagos de cada placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para a membrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expor e desnaturar o DNA das colnias ali presentes e incubados com uma soluo de DNA ou RNA fita simples, marcada radioativamente e complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois polinucleotdios simples fitas somente iro se hibridar se forem complementares. A localizao da placa de lise que se hibridou sonda determinada aps a exposio da membrana a um filme de Raios-X (autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio das colnias na placa de petri original (Figura 29). Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene vizinho ao gene de interesse, pode ser o RNA de genes que so expressos em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo celular, ou mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a mesma protena. Neste ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada em baixa temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao de sal (baixa estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs que tenham algumas bases no complementares.

57

Membrana de nitrocelulose

Placas de lise

Fagos absorvem a nitrocelulose

Placa mestra

Membrana rplica Sonda de cido nucleico marcada com 32p

Sonda Hibridiza DNA ligado ao filtro

Lavagem das sondas no incorporadas

Sonda hibridiza ao DNA do fago que contem a sequncia complementar

Filme de raio-X

DNA lambda isolado da placa de lise DNA clonado Placa mestra

Clone lambda purificado

Figura 29. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas no fago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Esta triagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa cultura de bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-se visveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posio do clone recombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia. O DNA
58

isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa de petri original e submetida a anlises posteriores.

Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao podem ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridao diferencial. Isto , genes expressos em tecidos especficos, em estgios especficos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados por fatores de crescimento so adequados para serem analisados por este tipo de abordagem. Para esta identificao necessrio produzir duas populaes celulares (ou extrair mRNA de dois diferentes tecidos) uma na qual eles no se expressam e outra na qual eles se expressam. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cDNA seja preparada usando o mRNA isolado de clulas tratadas com fatores de crescimento. Esta biblioteca plaqueada e transferida para dois conjuntos de membranas de nitrocelulose. Um conjunto ensaiado com DNA marcado radioativamente preparado por transcrio reversa do RNA das clulas tratadas com os fatores de crescimento. O outro conjunto de filtros hibridado com cDNA preparado de clulas no tratadas. Clones positivos identificados por hibridizar mais fortemente com a primeira sonda codificam mRNAs induzveis pelos fatores de crescimento (Figura 30). Quando o DNA a ser clonado expressa uma protena cuja seqncia conhecida pode-se inferir a seqncia de um trecho de DNA que lhe deu origem e sintetizar oligonucleotdeos que lhe sejam complementares para serem utilizados como sondas moleculares. Estes nucleotdeos problema devem ter pelo menos 17 estes a 20 nucleotdeos de a comprimento para ser especfico para a seqncia procurada. Um enfrentado para sintetizar oligonucleotdeos degenerecncia do cdigo gentico. Alguns aminocidos so codificados por quatro ou mesmo seis diferentes cdons e, portanto mesmo um pequeno polipeptdio pode ter sido codificado por vrias seqncias de DNA. Para contornar este problema as sondas oligonucleotdicas so algumas vezes sintetizadas como uma mistura de todas as possveis combinaes dos cdons que so traduzidas naquela seqncia protica
59

(Figura 31). Uma destas seqncias correta e ir hibridar com o clone de interesse, mas a possvel hibridao dos outros oligonucleotdeos com seqncias sem interesse pode levar a obteno de clones falsos positivos. Uma variao deste mtodo utilizar o menor nmero possvel de oligonucleotdeos como sonda, escolhendo a regio da protena que contm o menor nmero possvel de cdons degenerados (por exemplo, metionina somente codificada pelo cdon AUG). Deve-se levar em conta tambm qual o cdon de uso mais freqente para cada aminocido, na espcie que est sendo analisada.
Clulas com fatores de crescimento Clulas Quiescentes

Cresce em 3 hs Isola o mRNA poli(A)

Isola o mRNA poli(A)

AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA

Oligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridao

mRNA induzido pelos fatores de crescimento

AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA

Oligo(dt) Transcritase Reversa 32p-dNTPA hibridao

Prepara bibliotca de cDNA com fago lambda e infecta Ecoli

Placa mestra

Rplica em membrana de nitrocelulose Hibridao negligenciavel Clone de cDNA indusvel por fatores de crescimento

Autoradiogrfia cDNA comum

Autoradiogrfia

Isola o clone do fago

Filme de raio-X

Filme de raio-X

Placa mestra

60

Figura 30. Clonagem de genes regulados por fatores de crescimento atravs de hibridao diferencial. Esta estratgia utilizada para clonar uma famlia de genes que so induzidas quando clulas quiescentes so estimuladas a crescer pela adio dos fatores de crescimento.

Cys-Met-Asp-Glu-Met-Lys-Arg-Asn-Ile

Sequncia Parcial de Aminocidos

A A -ATG-AA A -AG A -AA C -ATT Sequncias Possveis TGT-ATG-GAC -GA C T G G G T do DNA C Parte da sequncia com A pouca ambigidade CGC G T Sondas contendo todas as possveis combinaes de condons de parte da sequncia TGTATGGATGAAATGAA TGCATGGATGAAATGAA TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGATGAGATGAA Sonda tentativa

5'TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3'

Hibridao com cDna

G ATGAAGCGCAA C ATC TGCATGGACGA 3' ---ACGTACCTGCT TAG--T TACTTCGCGTT A

5' 5'

TGCATGGACGAAATGAA3'

Figura 31. Desenho de sondas oligonucleotdicas baseadas na seqncia protica. Como a maioria dos aminocidos especificada por dois ou mais cdons estes oligonucleotdeos so sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotdeos das posies ambguas. A seqncia correta estar representada entre os oligos. Uma outra possibilidade usar uma sonda tentativa cuja
61

---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG---

escolha baseada na freqncia de uso do cdon na espcie em estudo. Neste caso pareamentos incompletos podem ocorrer.

3 ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING Vrias tcnicas foram desenvolvidas baseadas nas propriedades de hibridao dos cidos nuclicos visando a triagem e isolamento de seqncias especficas destas molculas. A maioria destas tcnicas, conforme j mencionado, trabalha com uma rplica do DNA de interesse imobilizado num suporte slido tal como uma membrana de nilon ou de nitrocelulose. Um destes mtodos, desenvolvido na dcada de 70 por E. M. Southern, tornou-se conhecido por "Southern blotting". Nesta tcnica o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e os fragmentos resultantes separados por eletroforese num gel de agarose. Os fragmentos de DNA dupla fita so visualizados por colorao com brometo de etdio, desnaturados 'in situ' com hidrxido de sdio e transferidos para uma membrana por capilaridade, com o auxlio de uma soluo de alta concentrao salina. Tais condies permitem que o DNA seja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando uma rplica do gel. O DNA covalentemente ligado membrana usando-se calor ou luz ultravioleta. Sondas de cidos nuclicos (DNA ou RNA marcados radioativamente) podem ser utilizadas para hibridar com o DNA fixado na membrana e a posio na qual a ligao especfica ocorrer pode ser detectada por autoradiografia da membrana (Figura 32). O padro de hibridao pode ser comparado diretamente com a regio no gel original que contm a seqncia de DNA de interesse. Southern blotting uma tcnica to poderosa que permite que as informaes obtidas sejam utilizadas para a construo de um mapa de restrio de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para identificar a regio que contm o gene de interesse. Esta tcnica possibilita tambm que as sondas de cidos nuclicos sejam utilizadas para diagnsticos de distrbios genticos, ensaiando-se o DNA genmico dos indivduos afetados e de seus familiares. De modo anlogo,
62

molculas de RNA tambm podem ser identificadas aps serem separadas por eletroforese, transferidas para nitrocelulose, sofrerem hibridao com sondas de DNA ou RNA. Esta tcnica de analisar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Esta tcnica til como auxiliar na anlise de clones de cDNA porque, o tamanho do mRNA especfico pode ser comparado com o tamanho dos cDNAs clonados, revelando a integridade dos clones. Alm disto, esta tcnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene expresso ou quais so os fatores que regulam a sua expresso.

Sonda de DNA marcada com P

3 2

eletroforese

transferncia do DNA por "blotting".

autoradiografia

gel de agarose

papel de nitrocelulose

autoradiograma

Figura 32. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser identificado separando-se a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo-se para nitrocelulose e hibridizando-se com uma sonda molecular complementar seqncia e marcada com 32P.

4 COMO OS GENES CLONADOS SO UTILIZADOS? O clone de interesse pode ser explorado sob vrios aspectos. Ele pode ser seqenciado e comparado com outras seqncias j descritas, ser utilizado no estudo da expresso gnica do(s) gene(s) contido(s) no clone, ser alterado especificamente por mutagnese stio dirigida ou ser usado para gerar um produto de interesse comercial. Para isto quase sempre ser necessrio transferir o clone, ou parte deste para um vetor mais apropriado para atingir os objetivos desejados. A transferncia de parte do DNA clonado para um novo vetor conhecida como sub clonagem. Algumas destas aplicaes sero
63

abordadas nos captulos seguintes.

5. MAPA DE RESTRIO O mapa de restrio do DNA clonado ou de pequenas molculas de DNAs de fagos, plasmdios ou mitocndrias pode ser bastante til na caracterizao da molcula. Esta tcnica envolve a separao por eletroforese dos fragmentos de DNA obtidos aps digesto do DNA total com determinada enzima de restrio. A ordem dos fragmentos na molcula pode ser descoberta com o uso de outras enzimas de restrio, em duplas digestes e/ou por digestes seqenciais usando 2 enzimas. Assim cada fragmento obtido aps digesto com a enzima x removido do gel e submetido digesto com a enzima y e vice-versa (Figura 33). Informaes sobre o mapa de restrio de um fragmento de DNA so utilizadas, por exemplo, para subclonar partes deste fragmento para o seqenciamento. O mapa de restrio do DNA mitocondrial vem sendo til na caracterizao de linhagens e/ou espcies de vrios organismos, auxiliando em estudos taxonmicos e evolutivos.

Figura 33. Mapa de restrio do DNA do fago para vrias endonucleases. As barras verticais indicam os locais de clivagem de cada enzima e os nmeros no alto indicam o tamanho da molcula em unidades de 5000 pares de bases. Esta molcula possui no total 48502 pares de bases.

V. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reao em cadeia da polimerase possibilita a amplificao de uma seqncia rara de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a
64

necessidade de clonagem molecular. Esta tcnica amplamente utilizada em pesquisa bsica, em medicina forense e no diagnstico de doenas genticas e infecciosas. Inicialmente, necessria a construo por sntese qumica de dois oligonucleotdeos de DNA (iniciadores) complementares as extremidades de cada fita de DNA, flanqueando a regio de interesse. Estes oligonucleotdeos servem como iniciadores da sntese de DNA in vitro, que catalisada pela DNA polimerase. Um ciclo de PCR comea com a desnaturao por calor (95 C), que promove a separao da fita dupla de DNA. A reao resfriada na presena de um excesso dos dois oligonucleotdeos, possibilitando a hibridizao dos dois iniciadores com a seqncia complementar presente no DNA alvo. Em seguida, a reao incubada para atividade da DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando o quatro desoxirribonucleotdios (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Figura 34).

65

Figura 34. As 3 etapas (http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/index.html).

do

ciclo

de

PCR

A cada novo ciclo da reao inicia-se com o aquecimento para desnaturao da dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridao dos iniciadores e sntese de uma nova fita pela DNA polimerase a partir dos iniciadores, sendo que as fitas de DNA recm sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 35). Usualmente, so realizados de 20 a 30 ciclos para amplificao de um segmento de DNA especfico dentro de um genoma. Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichi coli, que possui atividade mxima a 37C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo pois o passo de desnaturao inativa a enzima. Um importante avano ocorreu com a descoberta da enzima Taq DNA polimerase (Saiki et al, 1988) oriunda da bactria Thermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade tima a 72C e permanece razoavelmente estvel mesmo a 95C e com isto, a enzima adicionada somente no inicio do processo .

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Figura 35. Os primeiros 4 ciclos de um PCR em detalhes.No terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto so copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o tamanho so copiadas (http:// allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html).

Alm de ser utilizada para a amplificao de um segmento especfico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode ser utilizada para amplificar um segmento ou toda a seqncia de um produto gnico. Isso pode ser feito a partir da populao de RNA de uma determinada clula ou tecido. Entretanto, como a Polimerase utilizada na metodologia de PCR uma DNA Polimerase depedente de DNA, ela no pode usar RNA diretamente como molde para a amplificao. Assim, inicialmente realizada uma reao de transcrio reversa, onde pela ao da transcriptase reversa o RNA utilizado como molde para gerao de cDNA, que ento utilizado como molde em uma PCR subsequente. Essa abordagem denominada de RT-PCR (Reverse Transcription and Polimerase Chain Reaction) muito til para se analisar de maneira rpida a expresso de genes de interesse, pois uma vez que a PCR realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse s ser amplificado naquelas clulas ou tecidos onde o gene expresso. Esta tcnica pode ser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse, desde que j se tenha alguma informao de sua seqncia, sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isol-lo.

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VI. SEQENCIAMENTO DE DNA A partir do final da dcada de 70 tornou-se possvel a determinar a seqncia nucleotdica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger e cols associado a avanos tecnolgicos, permite que hoje genomas inteiros sejam seqenciados. O presena princpio do mtodo de terminao Um DNA da cadeia pode para ser seqenciamento de DNA baseia-se na sntese de DNA in vitro realizada na didesoxirribonucleotdeos. purificado sintetizado in vitro em uma mistura que contm molculas de fita nica de DNA, enzima DNA polimerase, um DNA iniciador que possibilita a polimerase iniciar a sntese de DNA utilizando os desoxirribonucleotdios. Alternativamente, na presena de didesoxirribonucleotdeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) na reao, o elongamento da cadeia de DNA bloqueado pela incorporao do nucleotdeo sem um grupo OH na posio 3'. No mtodo originalmente desenvolvido por Sanger para seqenciamento de DNA, uma fita complementar sintetizada utilizando um mistura de desoxirribonucleotdeos, um deles marcado com P32 ou S35. So realizadas 4 reaes independentes, contendo uma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotdio em cada uma das reaes. Cada reao produz um conjunto de cpias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqncia. Os produtos destas quatro reaes so separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos so detectados atravs da marcao radioativa. Em cada um das raias, as bandas representam fragmentos que foram terminados em dado nucleotdeo em diferentes posies do fragmento inicial de DNA. Pela anlise da ordem das bandas, comeando pelo final do gel atravs das quatro raias, podese determinar a seqncia do DNA recm sintetizado (Figura 36). Este mtodo ainda amplamente utilizado, sendo que vrios avanos tornaram o seqenciamento de DNA uma tcnica simples e rpida. Os principais avanos foram a adaptao da PCR ao mtodo de
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terminao da cadeia e a utilizao de didesoxirribonucleotdeos marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos). A utilizao de fluorocromos permite que todas as quatro reaes sejam realizadas em um nico tubo e o produto da reao de seqenciamento seja separado em uma nica raia do gel.

Figura 36. Seqenciamento de nucleotdeos pelo mtodo do trmino do crescimento da cadeia. Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352.

Atualmente, todo o processo de seqenciamento de DNA pode ser realizado em seqenciadores automticos. Nestes equipamentos o produto da reao de seqenciamento separado por eletroforese em gel ou em capilar, os fluorocromos so excitados por um feixe laser, os sinais fluorescentes so amplificadas e detectados por tubos fotomultiplicadores ou nos modelos mais modernos por cmaras CCD. Anlises computacionais identificam cada nucleotdeo pelo comprimento de onda de emisso especfico de cada fluorocromo. As bases so identificadas de acordo com a forma do pico fluorescente e a distncia entre picos sucessivos (Figura 37).

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Figura 37. O produto da reao de seqenciamento submetido eletroforese em uma raia de gel. medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a luz emitida detectada por um fotomultiplicador. Esta informao traduzida na forma de seqncia atravs de um computador.

VII. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS 1. INTRODUO A descoberta de promotores e repressores especficos do genoma de E. coli, de uma variedade de vrus de E. coli e de clulas eucariticas permitiu a manipulao da expresso de protenas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expresso pode ser indutvel ou contnua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli baseado no operon lac (Figura 38). Neste sistema, o DNA de interesse clonado em fago (no caso de biblioteca de cDNA de expresso) ou plasmdeo contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da -galactosidase). A induo da transcrio obtida pela adio de um anlogo de lactose sinttico e no degradvel (isopropiltio--D-

galactosdeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o

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promotor livre para a interao com a RNA polimerase e consequente transcrio do gene.
G e n e e s tr u tu r a l

tr a n s c r i o

G e n e e s tr u tu r a l

Figura 38. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac. (a) Na ausncia de indutor. (b) Na presena de indutor.

O sistema mais comumente utilizado para expresso de protenas heterlogas o que utiliza E. coli como clula hospedeira. Este sistema amplamente difundido devido facilidade e baixo custo de se cultivar E. coli, e pela reprodutibilidade e abundncia de protena que produz. Alm disso, modificaes nos vetores e linhagens de E. coli so frequentemente feitas no sentido de aumentar a eficincia e versatilidade do sistema original. Com isto, e com o advento de novos sistemas de expresso em clulas de eucariotos (levedura, insetos, mamfero), a expresso de protenas clonadas tornou-se uma abordagem poderosssima que vem revolucionando os estudos de estrutura, funo, purificao e identificao de novas protenas. Nestes outros sistemas, o recombinante a ser introduzido no hospedeiro alvo pode ser facilmente
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construdo e amplificado em E. coli. Por isso os plasmdeos de levedura, mamfero, etc. so construdos por fuso de uma poro de um plasmdeo de E. coli (origem de replicao e resistncia a um antibitico) com seqncias especficas para se obter expresso em clula eucaritica, conforme veremos adiante.

2. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E.COLI O uso de E. coli para a obteno de protena em quantidade suficiente para o estudo da estrutura e funo da mesma ou para aplicaes clnicas ou industriais hoje disseminado e constitui-se em um marco na histria do nosso conhecimento de estrutura de protenas. Este tpico pretende sobretudo descrever os passos bsicos envolvidos na construo de recombinantes e expresso, em bactria, de uma protena clonada.

2.1 Subclonagem em plasmdeos de expresso O procedimento de clonagem de um fragmento de DNA para expresso exatamente igual a qualquer clonagem, no entanto, deve se ter em mente que o propsito ser obter a protena correta. Para tanto, necessrio respeitar o sinal de traduo de genes procariticos (sinal de Shine-Dalgarno), em outras palavras, o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador (Figura 39). Alm disso, um vetor para expresso em E. coli deve apresentar as seguintes caractersticas: origem de replicao marcador para seleo: gene que confere resistncia a antibiticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina. Ex. o gene da -lactamase que confere resistncia a ampicilina. um promotor para transcrio: como os vetores de expresso so normalmente projetados no sentido de produzir protena em abundncia, o DNA codificante para uma dada protena deve ser
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colocado sob o comando de um promotor forte (exemplos: lacZ, tac (trp+lacZ), -pR, -pL, p10 do bacterifago T7) e regulvel, isto , contendo um repressor para manter os nves basais de expresso do gene insignificantes at a induo, o que se faz geralmente por adio de IPTG, no caso por ex. do repressor lacI, ou choque trmico, no caso do repressor cIts857. sinal de terminao da transcrio sequncias para controle da traduo, como por ex., um stio de ligao ao ribossomo para a iniciao da traduo (Shine-Dalgarno) e um ATG iniciador. Um sinal de terminao da traduo (cdon de terminao) tambm deve estar presente no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado. um MSC para facilitar a insero do gene de interesse na orientao correta.

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Figura 39. Procedimentos para clonagem de um fragmento de DNA em fase de leitura correta em um plasmdeo de expresso.

Uma vez construdo, o vetor de expresso contendo a sequncia codificadora da protena de interesse introduzido em E.coli por transformao. Ao planejar uma subclonagem para a expresso de protena, alm de se respeitar a fase de leitura correta, deve-se tambm tentar na medida do possvel fazer a clonagem unidirecional do inserto. Na clonagem unidirecional utilizam-se duas enzimas de restrio para digerir
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o vetor e o DNA inserto. Na bidirecional utiliza-se uma nica enzima, de modo que as pontas so iguais, permitindo a insero do fragmento em ambas as orientaes. Assim, em uma clonagem bidirecional h 50% de probabilidade de se obter os recombinantes na orientao correta (senso) e 50% na orientao invertida (anti-senso). 2.2 Anlise dos plasmdeos e seleo dos subclones corretos A anlise de DNA plasmidial para a seleo dos subclones corretos feita por digesto com enzimas de restrio e confirmada por sequenciamento se julgar necessrio. A anlise de restrio um procedimento bastante simples; entretanto deve ser feito com cautela e ateno. Seu objetivo selecionar o clone recombinante correto quanto ao tamanho do inserto e sua orientao. Como regra a primeira digesto deve ser feita com a(s) enzima(s) utilizada(s) para a clonagem; isto produzir dois fragmentos: plasmdeo linear + inserto, e permitir avaliar se os stios de clonagem foram recuperados intactos. Se a ligao for realizada entre extremidades cegas, preenchidas pela ao da Klenow polimerase, verifica-se em um catlogo de enzimas de restrio se haver a formao de um novo stio, o qual poder ser clivado para anlise. Outra alternativa consiste em clivar em stios prximos ao da clonagem em ambas as extremidades. A segunda digesto, no caso da clonagem bidirecional, deve ser planejada para determinar a orientao do inserto. Deve-se escolher um stio nico e no centralizado no inserto e um stio no MSC que seja ausente no inserto, produzindo de preferncia dois fragmentos de tamanhos facilmente distingveis no gel. Calcular previamente o tamanho dos fragmentos esperados para ambas as orientaes. A digesto completa fundamental para a correta interpretao dos resultados. A Figura 40 esquematiza um projeto de subclonagem de um gene e a anlise de restrio dos subclones obtidos com o objetivo de: a) selecionar os recombinantes, b) selecionar o recombinante correto.

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3. PRODUO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E. COLI 3.1. Produo de protenas hbridas De maneira ideal, quando se pensa em expresso heterloga, espera-se que a protena de interesse seja estvel, no txica para a bactria, solvel, produzida em grande quantidade e possa ser facilmente purificada. Um procedimento muito utilizado o de expressar a protena de interesse em fuso com um tag especfico que permita a fcil purificao da mesma atravs de cromatografia por afinidade em resinas s quais se encontram acopladas ligantes, aos quais o tag possa se ligar especificamente. Uma outra vantagem bvia de se produzir uma
Bam H I

1kb
H in d II I In s e r to s e n s o

Bam H I

H in d II I

P
R e c o m b in a n te E s p e ra d o (s e n s o )

Bam HI H in d I I I

R e c o m b in a n te In v e r tid o ( a n ti- s e n s o )

Bam HI

H in d III

3kb M SC

protena hbrida, ou de fuso, no caso da expresso de polipeptdeos pequenos ou mesmo peptdeos, os quais, sem fuso, seriam instveis e rapidamente degradados na clula.
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Figura 40. Subclonagem de um fragmento de DNA em plasmdeo de expresso e anlise de restrio de dois recombinantes obtidos.

Nota : Os clones 1 e 2 foram digeridos com BamHI e Hind III, separadamente. Responda: Qual dos dois clones tem o inserto na orientao correta (senso) para a expresso da protena? Em geral projeta-se ainda um stio sensvel a uma determinada protease (ex: fator Xa, trombina), inserido imediatamente acima do stio de clonagem, de maneira que a protena hbrida possa ser clivada liberando a protena clonada que pode ento ser facilmente purificada utilizando-se a mesma coluna de afinidade. A coluna reter a protena de fuso e eliminar no "void" a protena de interesse. Um exemplo de protena hbrida obtida por clonagem no vetor pMAL dado na Figura 41. O procedimento de protelise relativamente trabalhoso e nem sempre eficiente, por isso quando a protena de fuso no interfere se utiliza a prpria protena hbrida, por exemplo, para experimentos funcionais, produo de anticorpos, etc. Note que neste caso pode ser estratgico ter o mesmo DNA clonado em dois sistemas de fuso diferentes. Isto permitir que anticorpos produzidos contra uma protena hbrida sejam purificados por afinidade contra a outra, purificando-se assim apenas anticorpos cujos epitopos localizam-se na protena clonada. Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produo de protenas hbridas podemos citar: pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como protena de fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna de agarose-glutationa pMAL: apresenta a protena ligante de maltose (PLM) de bactria (42 kDa) como fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna com amilose acoplada pQE: apresenta um tag de 6 resduos de histidina como fuso e
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permite a purificao das protenas de fuso em colunas quelantes de Ni2+ pUR: cuja fuso um fragmento da -galactosidase A produo de protenas hbridas geralmente muito simples, eficiente e de baixo custo financeiro, podendo suprir de imediato necessidades da pesquisa bsica, tais como, produo de anticorpos e purificao destes por afinidade, sondas em experimentos variados e para estudos funcionais/estruturais da protena expressa. Permite, tambm, a expresso em grande escala, para fins industriais ou clnicos de enzimas, hormnios, anticorpos, etc., quando a atividade da protena preservada. Alm disto, possvel se obter, por mutagnese, protena com a atividade de interesse potenciada e livre de efeitos adversos ou atividades indesejadas.
(b)
(a )
CLO N AG EM pM ALc

EXPRESSO (IN D U O )

PLM P r o t e in a d e in te r e s s e

P U R IF IC A O PO R A F IN ID A D E

Figura

41.

a)

Esquema e de de da PLMA so de

ilustrando os passos para a expresso,

Lavagem E lu o

purificao b) Gel purificao fuso Em

clivagem de uma protena de fuso. poliacrilamida-SDS fraes protena mostrados da de os

F a to r X a C L IV A G E M ( p r o t e l is e )

paramiosina.
R e t id a S e p a ra o

extratos

clulas no induzidas (1) e de clulas induzidas (2). Em B, protena de fuso PLM78

E li m in a d a

paramiosina aps eluio da coluna de amilose por adio de maltose (1), aps no na clivagem por fator Xa (2) e frao "void"aps PLM (3). coletada passagem

coluna para a reteno da

importante estar alerta de que a situao ideal exposta acima nem sempre atingida. Na realidade, na grande maioria das vezes, protenas de eucarioto produzidas em bactria no so solveis; s vezes podem ser txicas para a clula; algumas so expressas em baixos nveis; algumas interferem com a sua fuso inibindo-a de se ligar resina de afinidade e tornando a purificao menos eficiente; outras formam agregados extremamente insolveis mesmo na presena de SDS/mercaptoetanol; algumas tm a sua atividade biolgica plenamente recuperada, porm outras so inativas. Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produo de protenas heterlogas em E. coli, podemos citar: Protenas txicas: algumas protenas so txicas para a clula hospedeira. Neste caso, pode-se proceder a secreo. Uma alternativa produo de protena citoplasmtica, a produo de protenas que so secretadas. Para tanto basta clonar o DNA codificante em fuso com uma seqncia codificante para um peptdeo sinal de procarioto. Este peptdeo clivado pela peptidase sinal quando a protena secretada para o periplasma. Embora este mtodo freqentemente traga problemas com o rendimento ou a clivagem do peptdeo sinal, h vantagens em alguns casos: no caso de protenas txicas para a bactria; algumas protenas degradadas por protease no citoplasma so estveis no periplasma; algumas que so inativas quando produzidas intracelularmente so ativas quando secretadas; a protena produzida j tem a sua metionina N-terminal processada. Um exemplo
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de sucesso a expresso do hormnio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqncia sinal desta. A induo obtida sob privao de fosfato do meio. Protenas instveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactria deficiente em uma ou mais proteases. raia 1). Baixos nveis de expresso: pode ocorrer pelas razes acima dentre outras, como, por exemplo, instabilidade do mRNA, trmino prematuro da mensagem, traduo ineficiente. Protenas insolveis: protenas de eucariotos produzidas em bactria so geralmente precipitadas na forma de corpos de incluso e requerem procedimentos adicionais de desnaturao para solubilizlas e de renaturao para mant-las solveis e funcionais. Isto nem sempre um problema, pois a formao de corpos de incluso pode proteger a protena contra a degradao por proteases bacterianas e tambm facilitar a purificao, uma vez que so corpos densos, precipitados baixa velocidade de centrifugao, enquanto a maior parte das protenas bacterianas permanecem no sobrenadante. Mas algumas vezes no se consegue renaturao adequada da protena purificada. Neste caso deve-se tentar atenuar a formao de corpos de incluso alterando as condies de expresso, por exemplo, crescendo-se a cultura a temperatura mais baixa aps a induo ou utilizando um promotor mais fraco. Mesmo assim comum se obter algum nvel de fragmentao da protena expressa (ver Fig. 39 b,

3.2. Produo de protenas intactas A vantagem de se produzir protena intacta sem fuso que ela poder ser utilizada sem a preocupao de que o segmento de fuso esteja interferindo em sua estrutura e atividade. A principal desvantagem
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 que nem sempre se encontra um mtodo eficaz para a purificao da mesma. intacta. Vrios vetores encontram-se disponveis no mercado para a expresso de protenas sem fuso em E.coli. Os mais referidos so da srie pET (plasmid for expression by T7 RNA polimerase), cuja expresso est sob o controle do promotor de transcrio 10 e dos sinais de iniciao de traduo s10 da protena do gene 10 (a principal protena do capsdeo) do bacterifago T7. A grande vantagem deste vetor que ele transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rpido que a RNA polimerase de E. coli. Alguns vetores da srie pET apresentam o promotor T7-lac, colocando a expresso da protena sob o controle lac e reduzindo portanto o background de expresso da protena alvo na ausncia de IPTG. Contudo h exemplos demonstrando que para estudos funcionais e de estrutura prefervel investir na produo de protena

4. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM ORGANISMOS EUCARIOTOS Ao se escolher um sistema de expresso, deve-se sempre considerar a aplicao final da protena a ser expressa. Embora o sistema de expresso de protenas heterlogas em E. coli seja bastante difundido, no caso de protenas eucariticas complexas torna-se, as vezes, necessrio lanar-se mo de sistemas de expresso em clulas eucariticas para se produzir protenas na sua forma nativa, pois estes sistemas permitem modificaes ps-traducionais essenciais para a funo de determinadas protenas, como, por exemplo, glicosilao. Consideraremos alguns destes sistemas a seguir.

4.1. Expresso em clulas de mamferos Os vetores para expresso em mamferos contm sequncias para
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facilitar a propagao em bactria (origem de replicao e um marcador para seleo), bem como seqncias especficas para se obter expresso em clulas eucariticas. Assim, um vetor para expresso em clulas de mamferos deve apresentar as seguintes caractersticas: origem de replicao para clulas eucariticas: por exemplo a do vrus SV40 promotor: como, por exemplo, do SV40 ou do citomegalovrus (CMV). Existem tambm vetores com promotores induzveis como, por exemplo, o da tetraciclina e o responsivo ecdisona. sinais para o trmino da transcrio e para a poliadenilao do transcrito marcador para seleo: como por exemplo o gene que codifica a aminoglicosdeo fosfotransferase, conferindo resistncia geneticina (um anlogo de neomicina). sequncia para ligao ao ribossomo (sequncia de Kozak) Os sistemas de expresso em clulas de mamferos podem ser divididos em dois tipos: a) aqueles envolvendo expresso transitria da protena em questo (1-4 dias aps a introduo do DNA); b) aqueles envolvendo a expresso estvel e que requerem, portanto, a integrao do gene no DNA cromossmico.

4.2 Expresso em fungos Fungos so eucariotos unicelulares potencialmente capazes de realizar todas as modificaes ps-traducionais observadas em clulas de mamferos. A facilidade de cultivo em larga escala e o fato de S. cerevisiae ser um microrganismo seguro, legalmente usado na indstria de alimentos e farmacutica, so caractersticas adicionais que tornam a expresso heterloga de protenas neste sistema particularmente atrativa e com perpectivas para uso, por exemplo, no desenvolvimento de vacinas orais atravs da imobilizao de antgenos na superfcie deste microrganismo. Exemplos da expresso de protenas heterlogas em
82

fungos encontram-se descritos nos tens 7.1.2 e 7.2.

5. SISTEMA DE EXPRESSO EM CLULAS DE INSETO UTILIZANDO BACULOVRUS COMO VETOR um dos sistemas de expresso em clulas eucariticas mais poderosos e versteis. O genoma do Baculovrus muito grande para permitir a insero direta de genes heterlogos; por isso, estes so clonados em vetores de transferncia, os quais contm sequncias flanqueadoras que so homlogas (5 e 3 ao inserto desejado) ao genoma do Baculovrus. Procede-se, ento, co-transfeco do vetor de transferncia contendo o gene de interesse clonado e do DNA linearizado do vrus Autographa californica (AcNPV) em clulas do inseto Spodoptera frugiperda (Sf). Nestas clulas ocorre recombinao homloga, com transferncia do gene heterlogo do vetor para o DNA do AcNPV. A infeco das clulas Sf com o DNA do vrus resulta na parada total da expresso das protenas do hospedeiro, permitindo alta produo do mRNA e da protena recombinantes. Uma variedade de vetores de transferncia foram construdos para utilizao neste sistema. Cada vetor contem : uma origem de replicao de E.coli um marcador de resistncia ampicilina o promotor da polihedrina ou da p10 (protenas do baculovrus): promotores fortes. um MSC para permitir insero do gene de interesse sequncias flanqueadoras pertencentes ao genoma do vrus para facilitar a recombinao homloga Vantagens deste sistema de expresso: Modificaes ps-traducionais Obteno de protenas solveis e funcionalmente ativas Altssimos nveis de expresso Capacidade para grandes insertos Expresso simultnea de vrios genes: vrios plasmdeos com
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promotores infectada. -

mltiplos

encontram-se

disponveis

comercialmente,

permitindo a expresso de duas ou mais protenas numa nica clula Facilidade de purificao: vetores apresentando tags de 6xHis e GST permitem a purificao por afinidade das protenas recombinantes. Facilidade de monitoramento da expresso: vetores Biocolors permitem a obteno da protena de interesse em fuso com GFP (green), BFP (blue) ou YFP (yellow), permitindo o monitoramento da expresso sem a necessidade da utilizao de anticorpos.

6. EXPRESSO EM CLULAS DE Drosophila Combina algumas das melhores caractersticas dos sistemas de expresso em clulas de mamfero com aqueles em clulas de insetos utilizando baculovrus. um sistema mais barato e eficiente que expresso em clulas de mamferos e mais rpido que expresso utilizando baculovrus. Este sistema utiliza vetores plasmidiais para expresso transitria ou estvel da protena de interesse. Encontram-se disponveis comercialmente vetores para expresso: a) constitutiva (promotor da actina), b)induzvel (promotor da metalotionena, expresso induzida pela adio de cobre ou cdmio) e c) indzivel e com secreo da protena para o meio. Todos os vetores apresentam tags de 6xHis no C-terminal, facilitando a purificao por afinidade da protena de interesse.

7. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS: APLICAES E PERSPECTIVAS 7.1- Bibliotecas de expresso e identificao de novas protenas atravs de anticorpos ou outros ligantes especficos
7.1.1- Sistema convencional - expresso de biblioteca de cDNA em E. coli

Vocs j viram em captulos anteriores que uma biblioteca de cDNA pode ser construda em vetor de expresso (fago ou plasmdeo). Para
84

essa finalidade, um dos vetores mais utilizados atualmente, pela sua versatilidade, o ZAP e o hospedeiro mais usado E. coli. Quando se clona um dado fragmento de DNA pode-se planejar previamente se deseja-se uma clonagem uni ou bidirecional. Quando se sintetiza uma biblioteca de expresso usual que se opte pela clonagem unidirecional. Para isso basta digerir o vetor com duas enzimas que geram pontas incompatveis e preparar o inserto com adaptadores que geram pontas compatveis com as do vetor, de tal maneira que a orientao seja a correta (fita sense, sentido 5'3', a partir do promotor) para a expresso de protena. A biblioteca amplificada como qualquer outra e a expresso de protena induzida pela adio de IPTG; uma rplica da placa de gar contendo as placas de lise obtida em um filtro de nitrocelulose colocado sobre a mesma por um certo tempo para que as protenas sejam aderidas. Este filtro em seguida tratado como em um Western blot para a deteco de protena, com anticorpo ou um outro ligante especfico para a protena de interesse. O sistema ZAP interessante porque aps o isolamento do clone o fagomdeo pode ser facilmente obtido por exciso in vivo por co-infeco com fago filamentoso auxiliar (Figura 42).

85

Figura 42. Esquema do fago ZAP, isolamento do clone e exciso do fagemdeo pBluescript por coinfeco com fago filamentoso auxiliar.

A protena clonada pode ento ser expressa e suas propriedades estudadas, inclusive pode ser prontamente purificada para a injeo em coelhos a fim de gerar anticorpos. Estes podem ser usados como contraprova da clonagem e como sondas importantssimas para diagnstico, imunocitoqumica, etc. H tambm a possibilidade de se construir a biblioteca em um ZAP modificado que contm o promotor de

citomegalovrus (CMV) e outros elementos necessrios para a expresso do gene clonado em clulas eucariticas.

7.1.2. Novos sistemas para a deteco de receptores ou protenas ligantes

A identificao de molculas que interagem com uma dada protena, isto peptdeos ligantes, protenas ligantes ou receptores,
86

fundamental para o mapeamento da via de ao de uma dada protena na clula. O sistema convencional de "screening" (seleo) descrito acima pode ser utilizado. Mas, novos sistemas comeam a aparecer com o objetivo de selecionar ligantes ou anticorpos. Um destes a clonagem do DNA (biblioteca de cDNA comum ou bibliotecas combinatoriais de peptdeos sintticos) em fuso com uma protena que forma a capa do fago lambda (Felici et al., 1991). Isto tem permitido isolar ligantes de uma biblioteca complexa por passagem das partculas de fago sobre determinado ligante especfico imobilizado em uma matriz. Uma evoluo deste sistema que parece ser promissora a clonagem da biblioteca de cDNA de interesse em fuso com uma protena da parede bacteriana, de tal maneira que as protenas expressas ficaro expostas recobrindo a superfcie da bactria, a qual poder ento ser incubada com um ligante marcado por fluorescncia que marcar aquela clula que expressar o receptor ou ligante especfico. A clula marcada poder, ento, ser selecionada (isolada) por um aparelho de seleo de clulas, "Fluorescent Assisted Cell Sorters", comumente referido como FACS. Para a anlise de milhes de bactrias, entretanto, ser necessrio o desenvonvimento de FACS mais sofisticados. A Figura 43 exemplifica esquematicamente uma protena (anticorpo, neste caso) expressa na superfcie de uma bactria (Little et al., 1993). Este sistema tem sido considerado promissor para a produo de vacinas orais e kits para diagnstico.

c a d e ia pesada c a d e ia le v e c o n e c to r

P o r o v a r i v e l do a n t ic o r p o m e m b ra n a e x te rn a

PA L PA R E D E CELULAR m e m b ra n a e x te r n a c it o p la s m a

gene que c o d if ic a p a r a o a n tic o r p o

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Figura 43. Esquema ilustrando a apresentao na superfcie bacteriana de uma protena heterloga expressa em fuso com uma protena da parede bacteriana. Este caso demonstra a expresso dos domnios variveis de um anticorpo unidos por um peptdeo "conector" em fuso com a lipoprotena associada a peptdeoglicano (PAL). Foi projetado para preservar a conformao nativa da regio varivel do anticorpo de maneira a manter suas propriedades ligantes intactas.

Alm dos exemplos citados acima, o "sistema de dois hbridos" (Fields & Song, 1989), para expresso em levedura, tem sido bastante utilizado para a deteco e identificao de protenas capazes de interagir com uma determinada protena (Figura 44). Neste sistema dois plasmdeos so construdos para posterior co-transfeco e expresso dos hbridos. O primeiro hbrido (isca) a protena conhecida (x) em fuso com o domnio ligante de DNA do fator de transcrio GAL4; o segundo so genes desconhecidos de uma biblioteca de um determinado tecido ou espcie (protena y) em fuso com o domnio da GAL4 ativador da transcrio. um processo engenhoso, cuja lgica baseia-se no fato de que a GAL4, como a maioria dos fatores de transcrio, uma protena com dois domnios bem definidos (um ligante de DNA e o outro ativador da maquinaria de transcrio), ambos indispensveis para o efeito final de ativao da transcrio de genes situados sob seu controle (controle do promotor GAL). Quando se expressa estes domnios separadamente, a protena ser inativa, exceto se os dois polipeptdeos se associarem de tal maneira que encontrar-se-o juntos na regio promotora para exercerem seu papel de ativao da transcrio. Quando se expressam estes hbridos em uma linhagem de levedura, cujo determinado gene marcador de seleco est sob o comando de GAL4 e, cultivam-se as clulas na ausncia de um nutriente essencial sintetizado pelo gene marcador, a ativao deste gene torna-se essencial para a sobrevivncia das clulas. Um gene comumente utilizado como marcador de seleo neste sistema o HIS3, cujo produto uma enzima da via de biossntese de histidina; neste caso, as clulas so capazes de crescer em meio com histidina, mas so incapazes na sua ausncia, a menos que a
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transcrio do gene HIS3 seja ativada pelo fator GAL4 reconstitudo (ativo). Isto significa que no interior das clulas que sobreviveram encontram-se dois hbridos que formam um complexo; isto , a protena conhecida x interage com uma protena desconhecida y, a qual pode ser ento identificada por sequenciamento de seu cDNA e caracterizada. Merece destaque o fato de que a interao entre as protenas x e y, por este processo, ocorre no interior de uma clula eucaritica viva, sendo, por isso, provavelmente mais confivel que outros mtodos utilizados para o estudo de interaes entre protenas.

(a ) G A L 4 n a t iv a T r a n s c r i o

(b ) H b r i d o c o m d o m n io lig a n t e d e D N A d a G A L 4 X

G e n e H IS 3

(c ) H b r id o c o m d o m n io d a G A L 4 a t iv a d o r d a t r a n s c r i o

G e n e H IS 3

( d ) I n t e r a o e n t r e h b r id o s r e c o n s t it u in d o a a t iv id a d e d a G A L 4

G e n e H IS 3

t r a n s c r i o

G e n e H IS 3

Figura 44. Estratgia para detectar protenas ligantes utilizando o sistema de dois hbridos.

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7.2.

A utilizao da tecnologia do DNA recombinante conhecimento de receptores de membrana

no

Para informaes especficas em clonagem de receptores de superfcie celular, incluindo abordagens que visam descobrir ou projetar novas drogas efetivas direcionadas a esses receptores, consulte a reviso de Luyten & Leysen (1993). Estes autores enfatizam que a expresso heterloga de receptores clonados proporciona uma fonte rica, reprodutvel, inexaurvel e barata de subtipos de receptores humanos. Esses receptores expressos podem ser utilizados no screening de drogas e tambm para o design de novas drogas atravs de um melhor entendimento da relao estrutura-funo, visto que a clonagem molecular desses receptores revelou uma abundncia de subtipos, bem como modelos estruturais dos mesmos (Figura 45). Agora, uma nova era pode ter lugar, em que as drogas comeam a ser projetadas e construdas com base na estrutura de seu alvo no organismo (Bugg et al., 1994). Exemplos da utilizao da tecnologia do DNA recombinante neste caso incluem a expresso heterloga de receptores acoplados a protena G nos fungos Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris, visando estudos estruturais e funcionais. Clulas de S. cerevisiae expressando o receptor de somatostatina de rato foram usadas com sucesso no screening de anlogos de somatostatina e bibliotecas combinatoriais para identificar agonistas e antagonistas seletivos para subtipos com potentes efeitos in vivo (M. H. Pausch, 1997).

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Figura 45. Modelos estruturais de famlias de receptores de superfcie celular. Os domnios trans-membrana e alguns domnios funcionais so representados. O enrolamento da cadeia proteica hipottico, pois o nico que teve sua estrutura determinada por cristalografia at o momento foi o domnio extracelular do receptor de hormnio de crescimento.

7.3. Expresso de protenas para interveno teraputica Podemos dizer que h duas maneiras gerais de se fazer teraputica por expresso de protenas: a) a expresso heterloga de uma protena humana em bactria ou clula eucaritica para a produo em grande escala, purificao e utilizao desta para injeo em pacientes: o exemplo mais conhecido provavelmente o da insulina (Bristow, 1993), a qual foi o primeiro produto
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comercial obtido pela tecnologia do DNA recombinante e aprovado para uso em humanos em 1982 pela U.S.FDA (Food and Drug Administration). A Figura 46 mostra as estratgias empregadas para a produo de insulina para fins teraputicos; a bovina e a suna sem modificaes qumicas so menos eficientes. A insulina produzida pela tecnologia do DNA recombinante apresenta a vantagem de eliminar a possibilidade de contaminantes ou agentes infecciosos que podem estar presentes nas protenas purificadas de animais. Uma das maiores expectativas neste campo a possibilidade de se obter mutantes com atividade muito superior ao da protena nativa e sem certos efeitos adversos. Outros exemplos de produtos obtidos pela tecnologia do DNA recombinante e utilizados com finalidade teraputica so o anticoagulante TPA (ativador de plasminognio tipo tecidual), o fator VIII de coagulao e a eritropoietina (hormnio que estimula a produo de eritrcitos). A determinao e caracterizao refinada da estrutura de protenas comea a ganhar maior impacto pela possibilidade de expresso/purificao de protena em larga escala e mutagenisadas. Alm de nos proporcionar a satisfao de se conhecer uma nova estrutura, esse conhecimento nos permite projetar drogas e pensar em outras estratgias teraputicas, tais como, expressar apenas um domnio ativo da protena. Por exemplo, os domnios variveis de anticorpos podem ser expressos como uma nica cadeia polipeptdica ativa. Pode-se pensar tambm na expresso de receptores solveis (ou domnios ativos destes) para um dado vrus, no sentido de inibir a sua interao com o receptor da clula; um exemplo seria a expresso do receptor CD4 para o vrus da AIDS. Uma idia espetacular que comea a emergir a partir do nosso conhecimento da estrutura atmica e funo de fatores de transcrio, a possibilidade da sntese de drogas que inibiriam ou ativariam especificamente um dado fator de transcrio (Figura 47).

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E .c o li E .c o l i

E .c o li

le v e d u ra

c a d e ia A

c a d e ia B

P r -in s u lin a Hum ana

P re c u rs s o r d e in s u l in a

In s u lin a s u n a
s s s s s s s s s s s s s s s s s s

p n creas b o v in o

p n c re a s s u n o

A B

A Ala B

A B

A B

s s s s s

s s s s s

s s s s s

s s s s s

s s s s s

s s s s s

A B

A B

A B

A Thr B

A B

A B

In s u lin a b o v in a

In s u lin a s u in a

In s u lin a h u m a n a (e m p )

In s u lin a h u m a n a (c rb )

In s u lin a h u m a n a (p rb )

In s u lin a h u m a n a (p ry )

Figura 46. Representao esquemtica de estratgias usadas para produzir insulina para fins teraputicos .

Um outro exemplo da potencial aplicao da expresso de protenas heterlogas em interveno teraputica seria a produo de grandes quantidades de anticorpos em plantas, visando seu uso em imunoterapia. As plantas so capazes de sintetizar e montar virtualmente qualquer tipo de molcula de anticorpo, desde fragmentos at cadeias completas e mesmo anticorpos multimricos. Ma & Ben (1995) descreveram a expresso e montagem em plantas da molcula de IgA, que a forma predominante de imunoglobulina em secrees de superfcies mucosas como o trato grastrointestinal. At ento a produo de IgA em sistemas heterlogos tinha sido frustante devido a complexidade desta molcula. Anticorpos produzidos em plantas podem vir a ser particularmente teis para imunoterapia tpica. No caso, por exemplo, de cries, Ma et al. (1990) mostraram que a aplicao tpica de anticorpos monoclonais contra uma protena da superfcie (de adeso) do Streptococcus mutans em dentes humanos conferiu proteo a longo prazo contra esse
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microrganismo em adultos.

D o m n io d e a t iv a o

D r o g a in ib e d o m n io d e a t iv a o

D o m n io d e lig a o a o D N A

D o m n io de d im e r iz a o

D N A

D r o g a in ib e d o m n io d e lig a o a o D N A

D r o g a in ib e d o m n io d e d im e r iz a o

Figura 47. Modelos hipotticos da ao de drogas que poderiam ser efetivas em teraputica atuando sobre um fator de transcrio.

b) a terapia gnica por transfeco de clulas retiradas do prprio paciente com retrovrus, ou outros tipos de vrus, com o intuito de repor um gene mutante ou para o tratamento de doenas multi-fatoriais como cncer e doenas cardacas. A primeira terapia gnica realizada para substituir um gene mutante nico, iniciada em 1990, foi a terapia para a deficincia da adenosina desaminase (ADA), a qual consiste em implantar linfcitos T transfectados com retrovrus expressando a protena ausente
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nos portadores desta doena. Esta tem sido considerada o prottipo das terapias gnicas e tem sido bem sucedida (ver o artigo de F. Watson, 1993).

VIII. ANLISE DE EXPRESSO ATRAVS DE MICROARRANJOS DE DNA Como vimos at agora, a tecnologia do DNA recombinante vem permitindo grandes avanos na identificao e caracterizao de genes especficos. Com relao aos estudos de expresso gnica, abordagens amplamente utilizadas, como Northern blot e RT-PCR, so bastante sensveis e precisas, porm permitem o estudo de um ou poucos genes de cada vez. Os Projetos Genoma, alm de terem gerado informao sobre as sequncias dos genomas de diversos organismos, impulsionaram um grande desenvolvimento tecnolgico que resultou no aparecimento de novas metodologias de anlises genticas. Uma dessas novas metodologias, os microarranjos de cDNA, permite no s a anlise de expresso de genes especficos mas de padres de expresso caractersticos de certos tipos celulares, estgios de desenvolvimento, condies patolgicas e muito mais. Com a utilizao dessa nova metodologia portanto possvel analisar a expresso de milhares de genes simultaneamente, determinando-se quais deles so expressos em tipos celulares especficos, em momentos e condies particulares, sempre atravs da comparao de duas situaes diferentes. Como no caso do Northern blot, a metodologia de microarranjos baseia-se na propriedade de hibridao dos cidos nuclicos. Mas ao contrrio do Northern, onde o RNA total de determinadas clulas ou tecidos est imobilizado em uma membrana de nylon e o fragmento correspondente ao gene de interesse marcado para a hibridao; no microarranjo, os milhares de fragmentos de DNA que representam genes especficos esto imobilizados num suporte slido, que pode ser uma membrana de nylon, ou uma lmina de vidro e o RNA total que marcado antes de hibridar com os fragmentos gnicos imobilizados.

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A metodologia que usa a lmina de vidro como suporte a que permite a anlise de maior nmero de genes. Na figura 48 podemos ver um esquema representando os principais passos de um experimento com microarranjos de DNA.

Figura 48. Esquema da preparao e anlise de microarranjos de DNA.

Primeiramente, os fragmentos representando genes especficos (derivados, por exemplo, de uma biblioteca de clones de cDNA) so amplificados por PCR e aplicados sobre a lmina por um rob que automaticamente fixa lamina os fragmentos de DNA em minsculos crculos com dimetro da ordem de 0,1 mm ou menos, formando os spots. Cada spot na lmina contm milhares de cpias do fragmento de DNA que representa um determinado gene e sua posio exata fica registrada. Ento, o RNA total de clulas em duas diferentes condies isolado e marcado com dois fluorocromos (corante fluorescente) distintos. A marcao do RNA geralmente ocorre atravs da sntese de cDNA utilizando a transcriptase reversa, onde um dos nucleotdeos fornecidos est conjugado com o corante fluorescente. Para o RNA extrado de clulas na condio 1, a sntese de cDNA feita fornecendo-se um dos nucleotdeos marcado com um fluorocromo vermelho e para o RNA extrado de clulas na condio 2, a transcrio reversa feita na presena de um
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nucleotdeo marcado com um fluorocromo verde. Os dois cDNAs marcados so misturados e incubados sobre a lmina contendo o microarranjo, para que possa ocorrer a hibridao entre o cDNA marcado e os fragmentos de genes na lmina. Os spots correspondentes aqueles genes que forem expressos na condio 1, ficaro marcados de vermelho, pois havia RNA corresponde a ele na amostra da condio 1 que foi convertido em cDNA marcado com o fluorocromo vermelho. Aqueles que forem expressos na condio 2 ficaro marcados de verde. Os genes que forem expressos em quantidades equivalentes nas duas condies ficaro amarelos, dada a sobreposio de marcao com os cDNAs de ambas as situaes. Estes resultados so obtidos atravs da utilizao de programas de computador que analisam a imagem do microarranjo hibridizado e quantificam a intensidade do sinal de cada spot. Este tipo de abordagem est sendo amplamente utilizado para o monitoramento de padres de expresso gnica caractersticos de diferentes situaes, como por exemplo, leveduras crescendo na presena de glicose versus leveduras crescendo na presena de lcool ou clulas de diferentes tipos de cncer em relao a clulas normais. Isto possvel devido a disponibilizao da seqncia genmica dos organismos, no caso da levedura por exemplo, foram analisados microarranjos de DNA contendo cerca de 6000 clones o que representa praticamente todos os genes desse organismo. Nesses experimentos observou-se que quando as leveduras passam de uma condio de fermentao de glico se para crescimento em meio com etanol, seu padro de atividade gnica se altera visivelmente, sendo que cerca de 900 genes so transcritos mais ativamente e outros 1200 tm sua atividade diminuda. Os resultados de experimentos com microarranjos de DNA normalmente revelam um grande nmero de genes que tem sua expresso alterada quando se muda de uma condio para outra. Muitos deles so normalmente genes de funo desconhecida e a anlise do microarranjo pode revelar um grupo de genes com os quais eles se relacionam atravs do padro de expresso, o que pode ajudar bastante na predio da possvel funo desses genes. Esta anlise feita usando-se uma tcnica chamada de clustering, atravs da qual grupos de genes que tm expresso regulada de maneira coordenada podem ser identificados. Os resultados dessa anlise so organizados e mostrados em imagens criadas por programas de anlise que permitem a fcil visualizao desses grupos e fornecem tambm a informao sobre o nvel de expresso dos mesmos em cada uma das situaes.
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Genes que so ativados ou reprimidos simultaneamente numa dada circunstncia podem compartilhar funes, fazendo parte de uma mesma maquinaria multi-protica ou atuando em processos celulares comuns. Esta , portanto, uma abordagem de grande utilidade para o atual momento da cincia, a fase ps-genmica ou do genoma funcional.

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IX. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Bristow, A.F. Recombinant-DNA-derived insulin analogues as potentially

useful therapeutic agents. Trends in Biotechnology 11: 301-305, 1993. Bugg, C.E., Carson, W.M., and Montgomery, J.A. Scientific American 269: 60-66, 1994. Felici, F., Castagnoli, L., Musacchio, A., Jappelli, R. and Cesareni, G . J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991. Fields, S., and Song, O. Novel genetic system to detect protein-protein Drugs by Design.

interactions. Nature 340: 245-246, 1989. Little, M., Fuchs, P., Breitling, F., and Dbel, S. Trends in Biotechnology 11: 3-5, 1993. Luyten, W.H.M.L., and Leysen, J.E. 11:247-254, 1993. Ma, J. K-C., and Hein, M. B. Immunotherapeutic potential of antibodies Receptor cloning and heterologous Bacterial surface

presentation of proteins and peptides: an alternative to phage technology?

expression--towards a new tool for drug discovery. Trends in Biotechnology ,

produced in plants. Trends in Biotechnology 13: 522-527, 1995. Ma, J. K-C., Hunjan, M., Smith, R., Kelly, C., and Lehner, T . with monoclonal antibodies against Streptococcus mutans . Immunity 58: 3407-3414, 1990. Monaco, A.P. AND Larin, Z. YACS, BACs, PACs and MACs: artificial An

investigation into the mechanism of protection by local passive immunization Infection and

chromosomes as research tools. Trends in Biotechnology 12: 280-86, 1994 Pausch, M. H. G-protein-coupled receptors in S. cerevisae: high-throughput screening assays for drug discovery. 1997. Sambrook, J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Watson, F. Human gene therapy-progress on all fronts. Trends in Trends in Biotechnology 15: 487-494,

Biotechnology 11: 114-117, 1993.

99

100

NDICE
I. CONCEITOS BSICOS................................................................................................................................................1 1. INTRODUO........................................................................................................................................................ 1 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR.................................................................................................................. 1 3. ENZIMAS DE RESTRIO....................................................................................................................................... 2 4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE............................................................................................................... 6 5. DNA LIGASE........................................................................................................................................................ 7 5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA ligase.........................................................................8 a) Fragmentos com extremidades coesivas.............................................................................................................8 b) Fragmentos com extremidade no coesivas.........................................................................................................8 6. TRANSFORMAO BACTERIANA............................................................................................................................. 9 6.1.Conceito de transformao induzida....................................................................................................................9 6.2. Mecanismos de captao do DNA ....................................................................................................................11 II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR........................................................................................................13 1. PLASMDEO.................................................................................................................................................... 14 2. FAGOS.............................................................................................................................................................. 15 2.1 Biologia do fago ...............................................................................................................................................15 2.2 Genoma do fago ...............................................................................................................................................16 2.3 Controle de expresso dos genes do fago ........................................................................................................17 2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecular.........................................................................................18 3. COSMDEO...................................................................................................................................................... 21 4. VRUS............................................................................................................................................................... 22 4.1. Clonagem no vrus SV40....................................................................................................................................23 4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia................................................................................24 4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce.............................................................................25 5. BACTERIFAGO M13..................................................................................................................................... 26 5.1. Clonagem no bacterifago M13.........................................................................................................................29 5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp........................................................................................30 6. FAGOMDEOS.................................................................................................................................................. 30 6.1. Clonagem no fagomdeo.....................................................................................................................................31 7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS..............................................................................32 III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE.....................................................36 1. BIBLIOTECA DE CDNA........................................................................................................................................ 37 1.1. Sntese de cDNAs de fita dupla..........................................................................................................................40 1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor...............................................................................................41 2. BIBLIOTECA GENMICA....................................................................................................................................... 43 2.1. Preparo do DNA do inserto................................................................................................................................45 2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica.....................................................................................47 IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE...............................................................................51 1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO...............................................................................51 2 O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE.......................55 3 ANLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING ..................................................................62 4 COMO OS GENES CLONADOS SO UTILIZADOS?...................................................................................................... 63 5. MAPA DE RESTRIO.......................................................................................................................................... 64 V. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)...............................................................................................64 VI. SEQENCIAMENTO DE DNA..............................................................................................................................68 VII. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS.............................................................................................70 1. INTRODUO...................................................................................................................................................... 70 2. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E.COLI...........................................................................................72 2.1 Subclonagem em plasmdeos de expresso.........................................................................................................72 2.2 Anlise dos plasmdeos e seleo dos subclones corretos.................................................................................75 3. PRODUO DE PROTENAS HETERLOGAS EM E. COLI..........................................................................................76 3.1. Produo de protenas hbridas.........................................................................................................................76 3.2. Produo de protenas intactas..........................................................................................................................80 4. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS EM ORGANISMOS EUCARIOTOS.............................................................81 4.1. Expresso em clulas de mamferos...................................................................................................................81 101

4.2 Expresso em fungos...........................................................................................................................................82 5. SISTEMA DE EXPRESSO EM CLULAS DE INSETO UTILIZANDO BACULOVRUS COMO VETOR ..................................83 6. EXPRESSO EM CLULAS DE DROSOPHILA........................................................................................................... 84 7. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS: APLICAES E PERSPECTIVAS ..................................84 7.1- Bibliotecas de expresso e identificao de novas protenas atravs de anticorpos ou outros ligantes especficos..................................................................................................................................................................84 7.1.1- Sistema convencional - expresso de biblioteca de cDNA em E. coli........................................................84 7.1.2. Novos sistemas para a deteco de receptores ou protenas ligantes..........................................................86 7.2. A utilizao da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento de receptores de membrana.................90 7.3. Expresso de protenas para interveno teraputica......................................................................................91 VIII. ANLISE DE EXPRESSO ATRAVS DE MICROARRANJOS DE DNA.................................................95 IX. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................................................................99

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