FITOPATOLOGIA

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS FITOPATOLOGA
MANUAL DE PRCTICAS DE FITOPATOLOGA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2011 p. 81
M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas
M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas
Aprobados por la Academia de Biologa, 2011
LaboratoriodeFitopatologa
CONTENIDO Practica 1. Preparacin de medios de cultivo..1 Practica 2. Aislamiento de hongos, siembras y condiciones optimas para su desarrollo.4 Practica 3. Tipos de inoculacin de patgenos en plantas sanas9 Practica 4: Montaje de hongos en muestras permanentes.13 Practica 5: Aislamiento de hongos y bacterias existentes en muestras de suelo 16 Practica 6: Cenicillas..18 Practica 7: Pudricin caf de frutales con hueso..22 Practica 8. Hongos: Mildus...25 Practica 9: Carbones.29 Practica 10: Royas.32 Practica 11: Tizones y manchas foliares bacterianas..35 Practica 12: Marchitez Bacteriana...39 Practica 13. Manchado del follaje y de los frutos .43 Practica 14. Bacterias que producen prodicin blanda 48 Practica 15. Aislamiento de nematodos del suelo52 Practica 16. Aislamiento de nematodos de plantas..56 Practica 17. Enfermedades causadas por virus60 Practica 18. Seleccin de bacterias antagnicas para el control de enfermedades en plantas..64 Practica 19. Daos en granos y semillas mal almacenados ...69 Practica 20. Aflatoxinas en granos y semillas74
Practica 1: Preparacin de medios de cultivo. Objetivo: Que el alumno obtenga un conocimiento prctico sobre los diversos mtodos de preparacin de medios de cultivo en laboratorio. Introduccin: La preparacin de los medios de cultico en las prcticas de laboratorio es importante, ya que se utilizan para sembrar microorganismos como bacterias y hongos, y al reproducirse s pueden identificar de acuerdo con sus caractersticas estructurales. Al asilar patgenos causantes de enfermedades es comn utilizar medios apropiados para su cultivo. Algunos requieren de sustancias especficas para su crecimiento y desarrollo, para extractos naturales que facilitan la multiplicacin de estos patgenos. El agar de dextrosa y papa se utiliza en microorganismos como parsitos facultativos y saprofitos; el agar bacteriolgicos como su nombre lo indica, crecimiento y desarrollo, y a travs de algunos experimentos se puede conocer que producto puede detener su crecimiento y aun mas cual puede eliminarlos por completo. Materiales: Autoclave Balanza analtica Termoplato Agua destilada Algodn Gasas Medio de cultivo PDA Matraz 500 ml Tape Cajas petri estriles Tubos de ensaye esmerilados con tapa
Procedimient o: Se prepara el autoclave, llenndose hasta la parrilla de agua destilada y se prende en medio, mientras que calienta, se pesan en la balanza analtica el medio PDA el que se requiera (39g por 1 L de agua), se coloca agua destilada en un matraz y se vaca el PDA pesado, y se pone a calentar en el termoplato hasta que de una coloracin oro oscuro y se desbaraten los grumos, mientras sucede eso se preparan los tapones para el matraz utilizando algodn, se tapa y se sella con cinta masking tape. Con esta preparacin se coloca el medio PDA ya bien disuelto en cajas petri hasta o y se llenan tubos de ensayo si se requiere hasta la marca de y luego se sellan con cinta. Posteriormente, el contenido del matraz, el de los tubos previamente sellados y envueltos en papel sanilta lo mismo para las cajas petri, se colocan en el autoclave para esterilizar (a 15 lb por 15 min). Al sacar los tubos de la olla se dejan cuajar el medio inclinado para dejar mayor superficie donde se desarrolle el hongo. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy, J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp.
Resultados :
Conclusiones:
Practica 2: Aislamiento de hongos, siembras y condiciones optimas para su desarrollo. Objetivo : El estudiante tendr conocimiento de los diferentes tipos de aislamiento de hongos, mtodos de siembra y purificacin, adems, mediante la observacin de las condiciones optimas de desarrollo, identificar el tipo de patgeno y su estudio para aplicar la tcnica de control ms conveniente. Introduccin : Al conocer los diversos tipos de aislamiento de hongos se podr obtener una metodologa practica para llevar a cabo estudios fitopatologicos dando especial atencin a las plagas mas comunes y que afectan los cultivos de mayor importancia econmica, adems se contara con una buena gua para resolver problemas fitosanitarios despus de conocer las condiciones optimas de desarrollo de los patgenos que atacan a los cultivos y causan diversas enfermedades. Materiale s: Microscopio ptico y de diseccin. 2 mecheros Fisher. 2 cajas petri. Asa de platino. Papel secante Cloro Etiquetas Agua destilada
Caja petri con material vegetativo enfermo (hongo) Cinta scotch. Portaobjetos y cubreobjetos Fibra de vidrio. Cutex
Procedimiento hongo:
para
aislar
el
Mtodo de la cinta scotch. Se levanta al hongo, se coloca en el portaobjetos y se observa en el microscopio ptico para observar algunas de sus estructuras. Mediante el levantamiento de estructuras. Se levanta la cascara de algn material en forma, ejemplo: la papa) con una navaja y se coloca en el porta objetos, despus se le agrega una gota de colorante rojo para luego observarlo en el microscopio de diseccin. (hacer uno sin colorante). 4
Por el mtodo de raspado. Se coloca un portaobjetos una gota de rojo colorante; luego la mancha del material vegetativo se raspa con un bistur o una navaja y una vez que se monto la muestra en el portaobjetos con una gota de rojo colorante se procede a observarla en el microscopio. Procedimiento para siembra en PDA, todo bajo campana de flujo laminar: Se debe tener 3 cajas petri; en la primera colocar agua destilada, en la segunda cloro al 5% y en la tercera agua destilada. Despus de haber aislado el material vegetativo infectado se coloca dos minutos en la caja con cloro al 5%, con la finalidad de limpiar la muestra de hongos contaminados y se pasa por ultimo a la caja con agua destilada para enjuagar y quitar el exceso de cloro. Para esto se tiene los dos mecheros prendidos, se coloca papel secante sobre la mesa en que est trabajando y se humedece la superficie de esta con cloro. Luego se esteriliza el asa de platino, se abre la caja petri y se coloca la muestra en ella, se acerca al mechero y se sella y a los pocos das se ver el desarrollo del hongo. Otro mtodo es utilizando papel filtro, este papel se humedece con agua y se coloca en la caja petri, despus se acomoda el hongo dentro de ella y se tapa. El hongo se desarrolla as en la humedad. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Herrera T. y M. Ulloa. 1990. El reino de los hongos. Fondo de Cultura Econmica y UNAM, Mxico, 552 pp. Romero C.S. 1968. Hongos Fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid, Mxico. 671 pp.
Resultados: Procedimiento 1 (cinta scotch)
Procedimiento 2 (levantamiento de estructuras)
Procedimiento 3 (raspado)
Procedimiento de siembra en PDA
Conclusiones:
Practica 3: Tipos de inoculacin de patgenos en plantas sanas. Objetivo : Aprendizaje sobre los tipos de inoculacin de patgenos a una planta sana. Introduccin : A travs de la inoculacin se introduce a una planta sustancias extraas a la misma, como las bacterias, virus, hongos, entre otros, los cuales traern como consecuencias alteraciones fisiolgicas y morfolgicas al organismo en tratamiento. Experimentalmente se realiza con el propsito de observar sintomatologa general, ciclo biolgico de la enfermedad, as como la resistencia del hospedero tenga hacia el patgeno, o bien la susceptibilidad. Materiale s: Licuadora Papel filtro Algodn Vaso de precipitado de 500 ml Jeringa desechable Planta sana nacida en suelo Placas con PDA inoculadas con hongo
Procedimiento 1: Se tienen 200 ml de agua en un vaso de precipitado, los cuales se colocan en la licuadora. Se macera el PDA con el hongo en desarrollo en la licuadora. Se agita el contenido durante 15 segundos y al extracto resultante se le coloca en el vaso de precipitado. Se toma con una jeringa una muestra de 4cc y se deposita en la base del tallo, abrindose el tejido con la aguja y ah se inocula. O bien, solo deposite el contenido (4cc) en la base del tallo de la planta. 9
Procedimiento 2: Se saca un block de 1cm y se deposita adherido a la planta a un lado del tallo, este block ser del de los hongos en el medio PDA, esto reporta la ventaja de que si hongo llega al suelo y tiene medio para nutrirse, despus se tapa con suelo. Procedimiento 3: Del licuado se empapan 5 ml en un algodn y se coloca cerca de la planta, despus se tapa con papel filtro. Procedimiento 4: Se utiliza un atomizador al cual se le coloca el hongo macerado del vaso de precipitado y se asperja la parte foliar, o bien, se pueden empapar trozos de algodn o de papel filtro y se adhieren a la superficie foliar. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos Fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid, Mexico. 671 pp.
Resultados : Procedimiento 1:
10
Procedimiento 2:
Procedimiento 3:
11
Procedimiento 4:
Conclusiones:
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Practica 4: Montaje de hongos en muestras permanentes. Objetivo: El alumno aprender a realizar montas de hongos para su posterior identificacin de acuerdo con sus caractersticas estructurales. Introduccin: Un fitopatgenos es aquel microorganismo que causa o produce alguna enfermedad o algn cambio en la planta. La mayora de los patgenos de plantas son hongos de las divisiones ascomicetes, basidiomicetes u oomycota, y las principales enfermedades causadas por hongos son mildius, oidios, royas, carbones, agallas, deformaciones, necrosis, chancros, marchiteces foliares, vasculares, podredumbres radiculares etc. Las bacterias colonizan espacios intercelulares en distintos rganos o el xilema, algunas como Agrobacterium, Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas, Corynebacterium Streptomyces, son algunas bacterias patgenas que se pueden encontrar entre las plantas. Materiales: Microscopio de diseccin Microscopio compuesto Muestra de hongo desarrollado en la caja petri Asa de platino Porta y cubre objetos Azul o rojo colorantes Fibra de vidrio Etiquetas adheribles Procedimiento: Se abren las cajas petri cerca del mechero. En un porta objetos se coloca una gota de formal y una de colorante (rojo o azul). Se coloca cierta cantidad del hongo en el portaobjetos y se protege con pequeos trozos de fibra de vidrio. Lentamente se coloca el cubreobjetos. Se sella con cutex. Se pasa al microscopio y se observa, si no es muy visible utiliza aceite de inmersin. Formol Cutex
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Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 5: Aislamiento de hongos y bacterias existentes en muestras de suelo. Objetivo : El alumno conocer un mtodo prctico de los tipos de aislamiento de hongos y bacterias existentes en el suelo. Introduccin : El suelo es un compuesto orgnico natural que proviene de la transformacin de sus agentes formadores a travs de diversos procesos fsicos, qumicos y biolgicos que le confieres propiedades caractersticas. Entre estas esta la capacidad de sustentar la vida vegetal y los microorganismos existentes en l; tales como bacterias y hongos, los cuales son diseminados por diversos agentes. Los organismos del suelo que ms importancia tienen cuantiaba y cualitativamente son las bacterias. Entre estas merecen citarse especialmente las vinculadas con el ciclo del nitrgeno, ya que lo utilizan para su sntesis orgnica, adems de que son capaces de atacar todo compuesto orgnico. Los hongos son hetertrofos estrictos que prosperan en suelos cidos, porque en estas condiciones las bacterias no pueden competir con ellos. Tambin son agentes activos de descomposicin. Materiale s: Muestras de suelo. Material vegetal (manzanas, papas y zanahorias sanas) Recipiente de tamao regular amplio y de poca altura Navaja 500 ml de agua Procedimient o: Se coloca la muestra de suelo en el recipiente. Se riega hasta que est bien hmeda. Se parte en cortes laterales el material vegetal. Se colocan enterrados hasta la mitad cada uno de los cortes vegetales en la superficie del suelo contenido en el recipiente. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp.
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Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Resultados:
Conclusiones:
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Practica 6: Cenicillas Objetivo : Describir y dibujar los signos y los sntomas causados por las cenicillas. Demostrar la importancia de los apndices en los cleistotecios para la identificacin de los gneros. Introduccin : Esta enfermedad es causada por hongos ascomicentos del orden Erysiphales los cuales son parsitos estrictos y se manifiesta por el desarrollo de una cubierta pulverulenta de color blanco grisaseo en las partes areas de las cuales plantas infectadas. Las cenicillas son de distribucin mundial, habindose observado por primera vez en el ao 1894 en algunas plantas de la familia cucurbitceas. En la actualidad han sido reportadas ms de 7100 especies de angiospermas hospedantes encontrndose en frutales, hortalizas, gramneas y ornamentales. Este grupo de hongos produce, en la fase sexual de su ciclo de vida, ascocarpos del tipo cleistotecio, los cuales pueden contener en su interior, una o varas ascas, las que a su vez contienen de dos a ocho ascas. Por otra parte, el estado asexual o imperfecto puede estar representado por el gnero Oidium, Oidiopsis y Ovulariopsis. En los cleistotecios es importante observar la morfologa de los apndices que desarrolla, lo que permite identificar los gneros. Materiale s: Agujas de diseccin Porta y cubreobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Hojas de diversos cultivos daados por la cenicilla
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Procedimient o: Observar y describir los sntomas y signos en las diferentes plantas indicando las siguientes caractersticas: aspecto de las lesiones, coloracin, tamao, forma y distribucin. Examinar y dibujar bajo el microscopio estereoscopio las lesiones y los cuerpos de fructificacin del hongo. Hacer preparaciones de un raspado de la lesin, observar al microscopio y dibujar las estructuras fructferas. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi-prensa. Madrid. 671 pp.
Resultados :
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Conclusiones:
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Microsphaera sp.
Podosphaera sp.
Erysiphe sp.
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Practica 7: Pudricin caf de frutales con hueso Objetivo : Describir y dibujar los sntomas y signos de la pudricin caf. Demostrar la capacidad patognica del hongo. Introduccin : Esta es una enfermedad de tipo necrtico causada por un hongo ascomiceto del gnero Monilinia del cual se conocen tres especies: M. fructigena causante de la pudricin caf europea descubierta en 1796 y M. fructicola y M. laza causantes de la pudricin americana, descubiertas en 1807 en ciruelos silvestres, de los cuales posteriormente paso a durazneros cultivados. Los primeros sntomas de la enfermedad aparecen en las inflorescencias las cuales empiezan a marchitarse, apareciendo en un principio manchas cafs en los ptalos, estambres o pistilos y posteriormente toda la flor es invadida. Materiale s: Agujas de diseccin Bistur Cajas de petri Cubre y portaobjetos Papel estraza Vasos de precipitados Cmara hmeda Estufa de incubacin Medio de cultivo PDA Lactofenol Frutos de hueso sanos y enfermos
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Procedimient o: Describir y dibujar los signos y sntomas producidos por Monilinia. Aislar el hongo causante de la enfermedad en cultivo puro utilizando placas con medio PDA. Hacer una preparacin de las estructuras fngicas y observar al microscopio. Reproducir los sntomas de la pudricin caf inoculando frutos sanos con el cultivo puro.
Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi -prensa. Madrid. 671 pp.
Resultados :
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Conclusiones:
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Practica 8. Hongos: Mildus Objetivo: Conocer signos y sntomas de los mildus Identificar los principales gneros de hongos causantes de mildus. Introduccin: Los mildus son enfermedades que afectan a una gran variedad de plantas, en regiones donde prevalecen condiciones ambientales de humedad y frio. Los hongos causantes comprenden alrededor de 300 especies, que incluyen a patgenos muy destructivos de las plantas cultivadas. Los mildus se caracterizan por la produccin de gran numero de esporangioforos, los cuales se proyectan en forma aislada o en pequienos grupos a travs de los estomas en el envs de las hojas. Sebreo los esporangioforos, se produce un gran numero de esporangios que inducen a la formacin de manchas de color blanco, gris o violeta mostrando un aspecto algodonoso. Los hongos causantes de estas enfermedades, son oomicetos del orden peronosporales y presentan un parasitismo estricto. Algunos ejemplos son: Cebolla pernosopora destrictor, cucurbitceas Pernosopora cubensis, lechuga Bremia lactucae, trigo Sclerospora macreospora. Material: Agujas de diseccin Cubreobjetos y portaobjetos Navaja de diseccin Microscopio Estereoscopio Plantas infectadas con mildus Agua destilada estril Lactofenol
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Procedimiento: Observar y describir los diferentes tipos de signos y sntomas presentes en el follaje de algunos cultivos afectadas con mildus y hacer dibujos. Hacer una preparacin a partir de un raspado de la lesin con una gota de lactofenol o agua, entre porta y cubreobjetos, para observar a microscopio. Dibujar los esporangioforos observados y compararlos con los esquemas de referencia. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicion, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicion. Academic Press. 636 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autonoma de Chapingo. 345 pp. Smith I.M. 1992. Manual de enfermedades de las plantas. Mundi -prensa. Madrid. 671 pp.
Resultados:
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Conclusiones:
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FOTOGRAFIAS Y DIBUJOS PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS PERONOSPORALES
Bremia sp.
Peronospora sp.
Plasmopara sp.
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Practica 9: Carbones Objetivo : Describir y dibujar los sntomas carbones que se presentan en algunos cultivos de Mxico. Identificar la morfologa macroscpica de los telios y microscopia de las teliosporas. Introduccin : Los carbones son enfermedades causadas por basidiomicetos del orden ustilafinales. En estas enfermedades hay desplazamiento del contenido del grano por una masa de esporas pulverulentas de color negro que se parecen al holln denominadas soros y que disminuyen en forma drstica los rendimientos. Los hongos causantes de los carbones atacan las semillas de las gramneas y se desarrollan en ellas destruyndolas por completo. Sin embargo varios carbones atacan a las hojas, tallos o verticilos florales y algunos infectan semillas o plntulas antes de que emerjan del suelo y se desarrollan en el interior hasta la formacin de las inflorescencias; otras solo producen infecciones locales sobre hojas, tallos y otros rganos. Hoy formacin de soros que se mantienen unidos temporalmente por una membrana delgada y rara vez matan a su hospedero, en algunos casos, l as plantas pueden atrofiarse notablemente. Materiale s: Agujas de diseccin Bistur Cajas de petri Cubre y portaobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Plantas enfermas con signos y sntomas de carbn. 29
Procedimiento: Describir y dibujar las muestras de carbones. Hacer preparaciones a partir de un raspado de la lesin para observar las teliosporas en el microscopio. Dibujar los diversos tipos de teliosporas observados. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 10: Royas. Objetivo : Describir y dibujar los sntomas y signos producidos por las royas Identificar los gneros causantes de las royas. Introduccin : Las royas son enfermedades causadas por hongos basidiomicetos del orden uredinales, los cuales son parsitos estrictos. En su gran mayora, tienen una distribucin mundial atacando en forma agresiva cereales y plantas forrajeras, forestales, frutales, hortcolas, industriales y ornamentales. Los gneros de hongos responsables de las royas, generalmente infectan las partes areas de las plantas produciendo lesiones pustilares conocidas con el nombre de soros, agallas y diversos tipos de ramificaciones conocidas como escoba de bruja o una reduccin en su desarrollo. De las royas de los cereales, la del trigo mas importante econmicamente, ya que se presenta en todos los lugares del mundo donde s cultiva esta gramnea, siendo la mas destructiva la causada por Puccinia graminiss, la cual forma uredosoros de color cafrojizo oscuro en ambos lados de las hojas, en los tallos y en las espigas. Materiale s: Agujas de diseccin Bistur Cajas de petri Cubre y portaobjetos Navaja de un solo filo Microscopio Estereoscopio Lactofenol Plantas enfermas con signos y sntomas de roya.
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Procedimiento: Describir y dibujar los signos y sntomas del material infectado. Hacer preparaciones a partir de un raspado de la lesin entre porta y cubreobjetos con lactofenol, agua o KOH al 3%. Dibujar los diversos estructuras fngicas. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
Resultados:
33
Conclusiones:
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Practica 11: Tizones y manchas foliares bacterianas. Objetivo : Observar y describir las enfermedades que afectan al tejido parenquimatico, as como los sntomas que se expresan como tizones y manchas foliares. Aplicar los mtodos de aislamiento para bacterias fitopatogenas a partir de tejidos enfermos y practicar las tcnicas para su identificacin. Demostrar la patogenicidad de las cepas aisladas mediante la prueba de hipersensibilidad en plantas de tabaco. Introduccin: Los tipos ms comunes de enfermedades bacterianas son aquellas que aparecen como manchas de varios tamaos sobre las hojas, tallos, inflorescencias y frutos; otras aparecen como necrosis continuas de rpido alcance en tales rganos y son denominados tizones. Sin embargo, la mayora de los tizones son comnmente la expresin final de las infecciones severas de manchas sobre las hojas, tallos e inflorescencias. Las manchas pueden ser tan numerosas que destruyen la mayor parte de la hoja, pueden ser necrticas; a menudo: circulares o irregulares y en algunos casos estn rodeadas por un halo amarillento o como en el caso de las monocotiledoneas, manifestarse como lneas paralelas a las nervaduras, definiendo estras muy caractersticas. Los tizones y manchas foliares ms comunes son: del algodonero, Xanthomonas campestris, del chile Xanthomonas axonopodis, del frijol Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, del nogal Xanthomonas arvoricola pv. juglandis, del maz Pseudomonas rubrilineans. Materiales: Agua destilada esterilizada Agujas de diseccin Asa bacteriolgica Cajas petri Cubreobjetos y portaobjetos Jeringas desechables Navajas de un solo filo Matraces Erlenmeyer 35
Morteros Pinzas Tubos de vidrio Vasos de precipitado Microscopio Estereoscopio Medio de cultivo B de King Hojas enfermas con sntomas tpicos de tizn bacteriano Plantas de tabaco sanas. Procedimient o: Examinar las hojas de las plantas enfermas. Describir y anotar los tipos de sntomas y signos. Lavar con agua corriente las hojas daadas y posteriormente desinfectar con hipoclorito de sodio o agua jabonosa, para eliminar ambos, enjuagar con agua destilada estril. Hacer cortes de los tejidos enfermos, con navaja o tijeras, tomando tejido sano y enfermo, aprox. De 0.5 cm de dimetro. En un mortero estril, moler los tejidos infectados de las hojas, adicionando de 3 a 5 gotas de agua destilada estril. Hacer aislamientos por estra cruzada en placas con medio de cultivo B de King. Escoger aquellas bacterias que produzcan fluorescencia o una pigmentacin amarilla y crecimiento lento, seleccionar y purificar. Con las colonias que fueron positivas a la fluorescencia y pigmentacin amarilla, preparar una suspensin de 3 x 10 8 clulas por mililitro e infiltrar por separado hojas de tabaco en la nervadura central, dejando una zona intervenal totalmente inoculada. Tanto las colonias fluorescentes como las de pigmentacin amarilla sern asperjadas con una suspensin de 3 x 108 clulas por mililitro en pantas de frijol sanas. Observar la reaccin de hipersensibilidad en tabaco en un tiempo de 24 horas a 48 horas y en frijol. Observar los sntomas tpicos de tizn, segn sea el caso. 36
Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 12: Marchitez Bacteriana Objetivo : Describir los sntomas de marchitez inducidos por bacterias fitopatogenas. Aplicar un mtodo de inoculacin para inducir una infeccin en plantas de tomate. Introduccin : La marchitez bacteriana es una de las enfermedades de tipo sistemtico que se observa en muchas plantas vasculares y la cual tiene una distribucin mundial ya que ha sido reportada en frica, Argentina, Canad, EU, Europa, Japn y Mxico. Las bacterias responsables de esta enfermedad, entran en los tejidos de las plantas, se propagan y mueven a travs de los vasos xilematicos, y debido a la gran cantidad de bacterias producidas as como a la produccin de polisacridos dentro de estos vasos se produce una interferencia en la translocacion de agua y nutrimentos. Material : Agujas de diseccin Cajas petri Porta y cubreobjetos Navaja de un solo filo Matraces erlenmeyer Tubos de ensayo Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Placas con B de King Agua destilada estril Equipos Gram Cepa de Clavibacter michiganense Plantas de tomate 39
Procedimiento: Hacer una descripcin de los sntomas y signos presentes en plantas de tomate y/o de papa con sntomas de marchitez bacteriana. Lavar con agua jabonosa y agua corriente las plntulas de tomates. Cortar la panta en pequeos trozos de aprox. 0.5 cm y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2%. Moler los trozos de tejido ya tratado hasta obtener una masa bacteriana. Aislar el agente etiolgico responsable de la marchitez bacteriana por estria cruzada a partir de la masa bacteriana. Seleccionar las colonias amarillo claro y de crecimiento lento Aplicar la tincin de Gram y de Rye a las colonias seleccionadas. Describir la morfologa macroscpica y microscpica que hayan dado positiva ambas pruebas. Inocular mediante la tcnica del palillo, mesa bacteriana, en la axila de las hojas. Observar las plantas peridicamente durante 20 das. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
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Resultados:
41
Conclusiones:
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Practica 13. Manchado del follaje y de los frutos. Objetivo : Describir los sntomas necrticos y manchados causados por diferentes hongos, tanto en frutos como en follaje. Aislar e identificar los fitopatogenos presentes en las muestras. Introduccin : Las partes areas de las plantas cultivadas: follaje, flores, frutos, peciolos y ramas jvenes, pueden ser daadas por una serie de hongos imperfectos pertenecientes a diversos gneros como: Alternaria, Cercospora, Colletotrichum, Helminthosporium, Micosphaerella, Pestalotia, Phytophthora, Pseudooeziza, Pyricularia y otros. Las enfermedades que ocasionan esos hongos, se manifiestan en la forma de lesiones necrticas de tamao y forma variable, siendo favorecido su desarrollo principalmente por la humedad relativa sobre todo en valores superiores al 80% as como por temperaturas ambientales entre 26 y 32 grados C. A las enfermedades que producen las diferentes especies del hongo Calletotrichum, se les da el nombre de Antracnosis las cuales se presentan en leguminosas como el frijol, en rboles frutales como: el aguacate, el cafeto y el mango, adems, en otros cultivos como la sandia. Material : Agujas de diseccin Cajas de petri Cubre y portaobjetos Estufa de incubacin Matraces erlenmeyer Navaja Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Frutos y hojas con manchado necrtico Medio de cultivo PDA 43
Agua destilada esterilizada. Hipoclorito de sodio al 2% Procedimiento: Determinar y dibujar los sntomas y signos presentes en hojas y frutos enfermos. Cortar trozos de tejido de 0.5 cm de dimetro y desinfectar las muestras con solucin de hipoclorito de sodio al 2% durante cinco minutos. Decantar el hipoclorito y lavar dos veces con agua destilada estril; colocar los trozos de tejido desinfectado en placas con PDA. Incubar las placas inoculadas a 28 grados C hasta la aparicin de colonias fungosas. Describir la morfologa macroscpica y microscpica de las colonias fungosas desarrolladas y dibujar las estructuras que observe al microscopio. Hacer cortes de tejido vegetal en el que se presenten estructuras de fructificacin (acervulos, picnidios, peritecios). Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
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Resultados:
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Conclusiones:
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FOTOGRAFIAS PARA IDENTIFICACION DE HONGOS DEL FOLLAJE
Cylindrosporium sp.
Pestalotia sp.
Colletotrichum 47
Practica 14. Bacterias que producen prodicin blanda. Objetivo : Demostrar, por medio de una prueba rpida y sencilla, la produccin de enzimas pectinoliticas en bacterias causantes de la pudricin de tejidos blandos. Diferenciar el tipo de pudricin inducido por Erwinia carotovora de aquel producido por Bacilluis spp. Introduccin : Las bacterias que inducen desintegracin de tejidos vegetales por efecto de las enzimas, se presentan con mayor frecuencia en hortalizas constituidas por tejidos carnosos tales como: Apio, berenjena, calabaza, cebolla, col, espinaca, papa, rbano, tomate y zanahoria; en estos cultivos se producen prdidas considerables en el campo, durante su transporte, almacenamiento y mercadeo. Los sntomas son semejantes en todos los hospederos, al principio en dichos rganos aparece una pequea lesin aguanosa que se extiende con rapidez tanto en dimetro como en profundidad, la zona afectada se ablanda y suaviza. Su superficie puede quedar manchada o hendida, o bien arrugarse y quedar vejigosa, los bordes al principio estn bien definidos pero despus se hacen irregulares. Los tejidos se vuelven opacos y en corto tiempo adquieren un color cremoso y se vuelven mucilaginosos desintegrndose hasta formar una masa de clulas desorganizadas. En los frutos y tubrculos la superficie externa permanece intacta a diferencia de sus contenidos que cambian hasta constituir un lquido turbio, pero es ms frecuente que se formen grietas y exude un liquido mucilaginoso a travs de ellas, casi no tiene aroma, hasta que se colapsan sus tejidos infectados despus de lo cual, las bacterias secundarias hacen que los tejidos se descompongan y produzcan un olor desagradable. Material : Asa Bistur Cajas de petri Cubreobjetos y portaobjetos Matraces erlenmeyer Pinzas Papel filtro o sanitas 48
Vasos de precipitados Micro y estereoscopio Agua destilada estril Alcohol Tubrculos de papa blanca Cepa de Erwinia carotovora Procedimiento: Examinar las muestras de tubrculos de papa y describir los tipos de sntomas y signos. Hacer cortes de tejidos enfermos y sanos con navaja o tijeras tomando aprox. 0.5 cm de dimetro. Colocar los cortes de tejido en tubos de caldo nutritivo o agua destilada estril y/o forma directa a partir de la lesin/ Hacer aislamientos por estra cruzada, tomando una asada a partir de los tubrculos con agua destilada estril y/o directa e incubar a temperatura ambiente. Describir las caractersticas tanto macroscpicas como microscpicas de las colonias desarrolladas, poniendo nfasis en las siguientes caractersticas. 1. Observar un cultivo de 24 hr. Bajo el microscopio estereoscopio. 2. Hacer incidir la luz reflejada mediante un espejo cncavo, po la parte baja de la caja. 3. Reconocer las colonias de Erwinia carotovora por la presencia de reticulaciones. Para demostrar la produccin de enzimas pectinoliticas, cortar rodajas de papa de un grosor 0.5 cm y colocarlas en cajas de petri conteniendo un papel hmedo. Hacer una incisin que pase por el centro de la rodaja teniendo cuidado de no llegar a los extremos, la profundidad de esta incisin no deber ser mayor de 3 milmetros. Inocular por medio de una asa bacteriolgica masa bacteriana a lo largo de incisin, a partir del cultivo puro de la cepa que se aisl. Incubar a 28 grados C durante 48-72 hr. 49
Tincin de flagelos (Metodo de Pappeler) Hacer un frotis a partir de una suspensin bacteriana con una concentracin de 3 x 10 8 clulas por mililitro de acuerdo a la escala de Mc Farland. Dejar secar el frotis al aire. Adicionar acido tnico con trixido de cromo y dejar actuar por 10 min. Lavar con agua corriente teniendo mucho cuidado. Adicionar el cristal violeta y dejar actuar por 5 min. Lavar con agua corriente y secar la preparacin al aire. Observar a microscopio. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicion. Academic Press. 636 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 15. Aislamiento de nematodos del suelo. Objetivo : Aislar e identificar nematodos de muestras de suelo. Introduccin : Los nematodos, son un filo de gusanos pseudocelomados con ms de 25 mil especies registradas y un nmero estimado mucho mayor, el cuarto del reino animal por lo que se refiere al nmero de especies, a estos organismos se conocen como gusanos redondos, debido a la forma de su cuerpo en un corte transversal, son organismos esencialmente acuticos, aunque proliferan en ambientes terrestres, los cuales los podemos encontrar en el suelo, plantas (fitopatgeno), incluyendo el hombre. Estos gusanos cilndricos y de piel dura habitan en todos los ambientes, efectuando una fecundacin interna y disponen de una cavidad llena de lquido y de un tubo digestivo completo, algunos nematodos viven como parsitos intestinales, causando daos en el hombre. Todas las especies de fitoparsitos de nematodos poseen un estilete, lo que ayuda a diferenciarlas de las especies que pueden resultar benficas, existen, sin embargo, especies que poseen estilete y que no son fitoparsitos, como el caso de Tylenchus, dentro de los gneros fitoparsitos se encuentra Meloidogyne, Xiphinema, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, etc. Estos organismos daan las races de multitud de plantas introducindose en ellas y absorbiendo sus jugos, no hay un suelo que no tenga nematodos, aunque para producir daos, su nmero tiene que ser elevado y las especies de plantas tienen que ser sensibles a ellos, algunos sntomas que presentan las planas son: las hojas toman un color verde plido o amarillo que se marchita cuando el clima es clido (no confundir con falta de nutrientes), plantas raquticas, con poco desarrollo, descoloridas, esto aumenta su susceptibilidad al fro, a hongos y a bacterias oportunistas, los vegetales afectados pueden llegar a morir por la accin directa del nematodo o por los parsitos de debilidad, el debilitamiento progresivo de la planta, marchitamiento sin explicacin y sin poder observar nada, tambin suelen manifestarse por rodales o lneas de cultivo. Algunos puntos de control pueden ser una desinfeccin con fumigantes txicos, desinfeccin mediante solarizacin, prevenir antes de sembrar, desinfeccin de suelo y substratos etc., en cualquier caso es difcil recuperar plantas infectadas y lo ms eficaz es la desinfeccin del suelo antes de plantar. Materiale s: Suelo fresco Embudo 52
Tubo de goma Abrazadera Soporte universal Papel filtro Ligas Cajas petri Tamices (20, 60, 200 mallas) Agua Tela
Procedimient o: Utilizando una muestra fresca del suelo aproximadamente de 100 a 300 cc. Los nematodos pueden aislarse mediante el mtodo del embudo de Baermann o mediante tamizado. Mtodo 1: Baermann Embudo de
Este consiste en un embudo de vidrio bastante largo (de 12 a 15 cm de dimetro) al cual se encuentra unido un tubo de goma, con una abrazadera colocada sobre el tubo. El embudo se coloca sobre el soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad (papel filtro), o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso de precipitados se invierte entonces el embudo con el trozo de tela y todo el suelo que este bajo el agua se deja as durante todo el transcurso de la noche o por varias horas. Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a travs de la tela o el papel poroso en el agua y se sumergen hasta el fondo de tubo de goma inmediatamente por arriba del nivel donde se encuentra la abrazadera. Se colecta el primer volumen en una caja petri para examinarla y se asla individualmente cada nematodo utilizando estereoscopio.
Mtodo tamizado
2:
Por
Se basa en que una muestra pequea de suelo (300cc) se mezcla con un volumen mucho mayor de agua (2Lts), los nematodos flotan en el agua y pueden ser colectados en tamices con poros de ciertos tamaos. 53
Se realizara una mezcla el agua-suelo se agita y se permite que repose durante 30 segundos. El sobrenadante se cuela con un tamiz de 20 mallas (20 orificios por pulgada cuadrada), el cual retiene los residuos de gran tamao pero permite que los nematodos se cuelen hasta el recipiente. El liquido que contiene los nematodos se vierte despus en un tamiz de 60 mallas, el cual retiene a los nematodos de gran tamao y residuos pero deja que los mas pequeos pasen, los residuos de este se pasan por otro tamiz de 200 mallas el cual retiene a los nematodos pequeos y algunos residuos. Y se observa a estereoscopio y microscopio. Finalmente, se lavan los tamices de 2 a 3 veces para dejar libre de residuos y de nematodos. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Resultados :
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Conclusiones:
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Practica 16. Aislamiento de nematodos de plantas. Objetivo : Aislar e identificar nematodos de muestras de plantas. Introduccin: Todas las especies de fitoparsitos de nematodos poseen un estilete, lo que ayuda a diferenciarlas de las especies que pueden resultar benficas, existen, sin embargo, especies que poseen estilete y que no son fitoparsitos, como el caso de Tylenchus, dentro de los gneros fitoparsitos se encuentra Meloidogyne, Xiphinema, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, etc. Estos organismos daan las races de multitud de plantas introducindose en ellas y absorbiendo sus jugos, no hay un suelo que no tenga nematodos, aunque para producir daos, su nmero tiene que ser elevado y las especies de plantas tienen que ser sensibles a ellos, algunos sntomas que presentan las planas son: las hojas toman un color verde plido o amarillo que se marchita cuando el clima es clido (no confundir con falta de nutrientes), plantas raquticas, con poco desarrollo, descoloridas, esto aumenta su susceptibilidad al fro, a hongos y a bacterias oportunistas, los vegetales afectados pueden llegar a morir por la accin directa del nematodo o por los parsitos de debilidad, el debilitamiento progresivo de la planta, marchitamiento sin explicacin y sin poder observar nada, tambin suelen manifestarse por rodales o lneas de cultivo. Algunos puntos de control pueden ser una desinfeccin con fumigantes txicos, desinfeccin mediante solarizacin, prevenir antes de sembrar, desinfeccin de suelo y substratos etc., en cualquier caso es difcil recuperar plantas infectadas y lo ms eficaz es la desinfeccin del suelo antes de plantar. Materiales: Planta contaminada Estuche de diseccin Agua Embudo de vidrio Tubo de goma Soporte universal Papel filtro Tela 56
Ligas Cajas petri Estereoscopio Procedimient o: Sin tomar en cuenta el rgano de la planta que contenga a los nematodos, se cortan en piezas pequeas ya sea con la mano o utilizando una mezcladora durante unos segundos y se vierte entonces en el embudo de Baermann segn el mtodo. Los nematodos salen de los tejidos y nadan en el aguan del tubo a partir del cual se colectan en caja petri. Mtodo de Embudo de Baermann Este consiste en un embudo de vidrio bastante largo (de 12 a 15 cm de dimetro) al cual se encuentra unido un tubo de goma, con una abrazadera colocada sobre el tubo. El embudo se coloca sobre el soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad (papel filtro), o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso de precipitados se invierte entonces el embudo con el trozo de tela y todo el suelo que este bajo el agua se deja as durante todo el transcurso de la noche o por varias horas. Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a travs de la tela o el papel poroso en el agua y se sumergen hasta el fondo de tubo de goma inmedi atamente por arriba del nivel donde se encuentra la abrazadera. Se colecta el primer volumen en una caja petri para examinarla y se asla individualmente cada nematodo utilizando estereoscopio. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. 57
Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 17. Enfermedades causadas por virus. Objetivo : Aprender la tcnica de transmisin mecnica de virus fitopatogenos. Reproducir sntomas de mosaico y/o lesiones locales en plantas de Nocotiana tabacum como indicadora. Identificar las inclusiones de tipo viral Realizar la tcnica de ELISA Introduccin: Los virus a los que Beijerink les dio el nombre, se caracterizan por su tamao ultramicroscpico, por su multiplicacin intracelular obligada, porque no han sido cultivados en medio libre de clulas y por si composicin nucleoproteinica diferenciandose de esta forma de otros fitopatogenos. Los sntomas que inducen los virus son primarios y secundarios, los primeros son manifestaciones iniciales en la planta y resultan frecuetnemente de las inoculaciones mecanicas artificiales y posteriormente de infecciones naturales. Los secundarios se manifiestan posteriormente y se pueden observar en partes no inoculadas como es el caso de las infecciones sistmicas. Materiales: Atomizadores Carborum Cubre y portaobjetos Hisopos Microplacas inmunolgicas Morteros Matraces erlenmeyer Balanza analtica Agua destilada estril Floxina Formalina al 2% 60
Glicerol Solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.0 Hojas de plantas con sntomas virales Plantas de Gomphrenea globosa y Nicotiana tabacum Procedimiento: Aplicar una cantidad pequea de carborundum en el haz de las hojas de las plantas de tabaco. Triturar en un mortero, hojas con sntomas virales y adicionar 5 ml de solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.0 Humedecer un hisopo en el triturado y frotar suavemente la superficie de las hijas previamente preparadas con carborundum. Inocular con solucin amortiguadora una hoja de tabaco, la cual servir como testigo. Mantener en condiciones de invernadero las plantas inoculadas y hacer observaciones peridicamente para registrar el tiempo transcurrido en que se ponen en evidencia los primeros sntomas. Etiquetar todas las hojas que hayan sido inoculadas. Inclusiones virales Desprender la cutcula y epidermis de la nervadura central o secundaria de las plantas infectadas con virus. Colocar las tiras de tejido en las microplacas serolgicas, que contiene formalina al 2% y dejar actuar por 15 min. Colocar las tiras de tejido en microplacas serolgicas conteniendo los colorantes, floxina y rosa de bengala al 2% y los dejara actuar por 5 a 15 min. Lavar dos veces los tejidos con agua destilada. Colocar los tejidos entre porta y cubreobjetos con glicerol. Describir y dibujar las inclusiones observadas en los tejidos. 61
Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 18. Seleccin de bacterias antagnicas para el control de enfermedades en plantas. Objetivo : Aprender la metodologa general para la bsqueda y seleccin de microorganismos antagnicos contra hongos fitopatogenos. Adquirir el conocimiento y habilidad para seleccionar bacterias con capacidad antagnica contar hongos en el suelo. Introduccin : La bsqueda de sistemas de control biolgico, que contribuyan a la solucin de problemas fitopatologicos para eliminar la utilizacin de productos qumicos que tanto daan el ambiente, ha sido motivo de preocupacin de los investigadores en los ltimos aos. Sin embargo realmente son pocos los sistemas biolgicos de control de enfermedades de plantas que han tenido xito y que se han llegado a comercializar. El xito de estos sistemas depende de la eficiencia con la que controla el patgeno, la facilidad de manipulacin del microorganismo antagnico para su produccin a escala industrial y su bajo costo de produccin. La necesidad de mantener un ambiente menos contaminado obliga a los investigadores interesados en cubrir estas reas, a buscar sistemas biolgicas de control, para reducir as loe efectos negativos en el hombre y en el medio ambiente debido al uso indiscriminado de plaguicidas. Material : Agitador de vidrio Frascos de vidrio para dilucin Tubos de ensaye de 10 x 15 Pipetas de 1 ml Agujas de diseccin Cajas petri Estufa de incubacin Balanza granataria 64
Medio de cultivo PDA Medio de cultivo B King 500 gr de suelo de almaciago sin tratar (cualquier vivero) Cepa tipo de Fusarium sp. Agua destilada Cloruro de sodio Procedimiento : Preparar una suspensin del suelo para la obtencin de colonias bacterianas.
Pesar 10 gr de suelo de vivero sin que haya sido tratado con algn plaguicida. Adicionar los 10 gr de suelo a 90 ml de agua destilada estril. Preparar diluciones: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 a partir de la suspensin de suelo. Pipetear 0.1 ml de diluciones 10 -6, 10-7, 10-8, sembrar por duplicado y depositar en placas que contengan medio B King. Distribuir sobre la superficie del medio con una varilla acodada estril e incubar a 28 grados C hasta la aparicin de colonias bacterianas. Seleccin de cepas bacterianas con capacidad antagnica.
Sembrar en el centro de la placa PDA una porcin del hongo aislado obtenido mediante un sacabocados de 0.3 cm de dimetro. Seleccionar las colonias bacterianas que presenten diferencia en tamao, forma, aspecto, color y consistencia. Sembrar por la tcnica de punto a una distancia de 2.5 cm del hongo cada una de las colonias bacterianas seleccionadas. Incubar las placas sembradas con el hongo y las bacterias a 28 grados C, hasta que se manifieste una zona de inhibicin por parte de las bacterias con capacidad antagnica. Seleccionar y purificar las bacterias que hayan producido un halo de inhibicin. Conservar las bacterias en solucin salina o agua destilada estril. Cuantificar cada una de las cepas que mostro capacidad antagnica. 65
La capacidad ser probada de manera independiente de la siguiente forma:
Sembrar el hongo exactamente al centro de una placa de PDA. Sembrar 16 puntos equidistantes por la tcnica de punto una de las cepas seleccionadas en torno al hongo sembrado. Realizar el mismo procedimiento del 2 si se quieren probar otros aislamientos con capacidad antagnica. Dejar como testigo dos placas de PDA sembradas nicamente con el hongo. Medir el dimetro de la colonia del hongo, cada 24 hr hasta que el testigo haya cubierto la totalidad de la superficie del medio. Graficar en papel milimtrico los valores obtenidos. Determinar cual o cuales bacterias presentan la mejor capacidad antagnica. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.
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Resultados:
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Conclusiones:
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Practica 19. Daos en granos y semillas mal almacenados. Objetivo : Conocer los daos que causan los hongos Aspergillus, Penicillium y Fusarium en granos almacenados. Identificar mediante la morfologa colonial y microscpica los gneros involucrados. Determinar el poder germinativo de las semillas daadas y no daadas. Introduccin: El grupo de hongos de almacn esta constituido por gneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium los cuales adems de reducir la calidad de los granos y semillas almacenados, son capaces de producir toxinas potentes que afectan la salud de los animales domsticos y del hombre. Ciertas especies de penicillium se encuentran en granos en estado de deterioro, especialmente en maz, donde invaden los embriones, los cubren o reemplazan con una masa de esporas, dando una coloracin azul al pericarpio en la regin del embrin. Los factores que determinan un grado de infeccin de los hongos son los siguientes: contenido de humedad del grano, temperatura, humedad relativa, tiempo que permanece el grano en el almacn, condicin fsica de la semilla e infestaciones por insectos. Todos estos aspectos se pueden encontrar interactuando, lo cual se traduce en problemas de contaminacin por hongos de almacn los cuales pueden ser incrementados por cosecha de los gramos con un contenido de humedad alto, descuido del grano durante su transporte a largas distancias por un sistema de ventilacin deficiente en el almacn. Material : Agua destilada estril Cajas petri Cubre y portaobjetos Hipoclorito de sodio 2% Lactofenol Matraces erlenmeyer Pinzas de diseccin 69
Toallas de papel secante Papel filtro Embudos de vidrio Soporte universal Pinzas de Mohr Jeringa de 20 ml Navaja de un solo filo Microscopio compuesto Microscopio estereoscopio Cmara hmeda Estufa de incubacin Medio PDA Mac Harina de maz Semilla sana y enferma Procedimiento: Aislamiento de hongos de almacn:
Examinar y dibujar los daos observados en semillas almacenadas bajo condiciones desfavorables y compararlas con semillas sanas. Desinfectar cinco semillas daadas y cinco semillas sanas con solucin de hipoclorito de sodio al 2% durante 5 min. Eliminar el exceso de hipoclorito mediante dos lavados con agua destilada estril. Colocar las semillas en placas de medio PDA o Malta-Sal-Agar e incubar durante 5 das a temperatura ambiente. Anotar las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las colonias fngicas desarrolladas. Dibujar las estructuras observadas al microscopio. 70
Pruebas de germinacin
Tomar al azar semillas sanas y mal almacenadas (50). Las semillas seleccionadas sern lavadas con agua corriente para posteriormente ser sometidas por separado a una solucin de hipoclorito de sodio al 2% seguido de dos lavados de agua destilada estril. Una vez desinfectadas se colocaran en toallas de papel hmedas y ordenar en hileras de cinco para tener un total de 10 hileras. Enrollar la toalla de papel tendido cuidando que las semillas se mantengan en el mismo lugar donde fueron ordenadas. Los rollos formados sern etiquetados y colocados en una cmara hmeda y puestos a incubar a 28 grados C durante 6 das. Referencia s: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. Resultados :
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FOTOGRAFIAS PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS DE ALMACEN
Aspergillus sp.
Fusarium sp.
Penicillium sp.
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Practica 20. Aflatoxinas en granos y semillas Objetivo: Determinar cuantitativamente la presencia de aflatoxinas. Introduccin: Las aflatoxinas son un grupo de compuestos que cobraron importancia a partir de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con man infectado con una especie fngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil. Los micelios de esta y de otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas y a especies oleaginosas de mani, girasol, algodn, soya, entre otros cereales. Las aflatoxinas B1, los mayores niveles de contaminacin por aflatoxinas se han registrado en semillas de algodn y maz, cacahuates, nueces, avellanas y otros frutos secos. En cereales como el trigo, arroz, centeno o cebada la presencia de estos txicos suele ser menor. Materiales: Semillas de maz, algodn, etc. Licuadora Balanza analtica NaCl Metanol Filtro Jeringa de 20 ml Columnas aflatest Fluorometro Solucin de bromo Procedimiento: Para la determinacin de aflatoxinas mediante el sistema Aflatest (carcter demostrativo). Se utilizaran: 74
Pesar de 50-100 gr de la muestra: semillas de maz, algodn, cacahuate, sorgo o nuez y molerlas durante un minuto a alta velocidad en licuadora. Tomar 50 gr de la muestra anterior y se le agregan 5 gr de NaCl, adicionando 100 ml de metanol al 80% y filtrar. Colocar 10 ml del extracto filtrado en un vaso limpio y diluir con 40 ml de agua destilada. Filtrar nuevamente para obtener un liquido de aspecto transparente. Colocar 10 ml del extracto en una jeringa de 20 ml ensamblada a una columna que contiene adheridos anticuerpos monoclonales. Pasar a travs de la columna, regulando la velocidad de flujo a 2 gotas por segundo. Hacer 2 lavados con 10 ml de agua destilada, procurando dejar un menisco en la columna monoclonal. Eluir la columna con metanol QP directamente con el propsito de obtener las alfatoxinas que se encontraban unidas a los anticuerpos monoclonales. Colectar el eluyente en un tubo de lectura especial para fluorometro. Adicionar 1 ml de la solucin de bromo al extracto colectado para revelar la presencia de aflatoxinas y leer en el fluorometro. El fluorometro nos da un valor directo de la aflatoxinas presentes en la muestra analizada. Referencias: Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp. Agrios G.N. 1997. Plant Pathology. 4ta Edicin. Academic Press. 636 pp. Baudin A.B., Hooper D.E., Matre y R.B. Carrol. 1988. Laboratory Exercises in plant pathology. An instructional kit. A.P.S. St. Paul Minnesota. 196 pp. Kiraly Z., Z. Klement, F. Solymosy y J. Voros. 1974. Methods in plant pathology. Akademial Kiado. Budapest. 509 pp. Romero C.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp. 75
Resultados:
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Conclusiones:
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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS FITOPATOLOGA

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

Procedimiento 2 (levantamiento de estructuras)

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