Bioassay- guided fractionation of methanolic extract of Costus sp.

Carla Stephanie Coln Cintrn Universidad de Puerto Rico en Cayey

Diabetes en Puerto Rico

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La diabetes es una enfermedad crnica degenerativa que abarca un grupo de desrdenes metablicos caracterizados por altos niveles de glucosa en la sangre. En Puerto Rico el porcentaje estimado de adultos que alguna vez en su vida han sido diagnosticados con diabetes ha aument de 8.5% en el ao 2000 a 10.6% en el ao 2004. Esto coloca a Puerto Rico en la primera posicin, en trminos de la prevalencia de diabetes, entre los estados y territorios de los Estados Unidos.1
1: Orville M. Disdier Flores, BS, MS; Epidemilogo, Departamento de Salud de Puerto Rico.

Diabetes en Puerto Rico continuacin

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En trminos del manejo de la diabetes, aproximadamente el 32.7% de las personas viviendo con diabetes utilizan insulina, el 73.4% toman medicamentos orales y el 29% ha tomado alguna clase o curso sobre como manejar su condicin. En Puerto Rico, solamente el 14.5% de los adultos consumen 5 o ms servicios de frutas o vegetales al da, ms del 61% estn obesos o en sobrepeso, el 27% tienen hipertensin y a penas el 17% mantienen algn rgimen de ejercicio. Estos son indicadores de que las medidas de prevencin, control y tratamiento que se necesitan para lidiar con la diabetes en Puerto Rico requieren de estrategias complejas y multidimensionales.1

1: Orville M. Disdier Flores, BS, MS; Epidemilogo, Departamento de Salud de Puerto Rico.

Propuesta Investigativa
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Es esta la necesidad que impulsa nuestra investigacin, obtener datos favorables para una nueva opcin de tratamiento. En esta se estudian extractos metanlicos de plantas pocos estudiadas, en mi caso, Costus spiralis (insulina) con el propsito de crear posibles soluciones teraputicas, en mi caso el aumento de la capacidad antioxidante. Segn estudios realizados Costus spiralis (insulina) ha mostrado alta actividad biolgica como diurtico, por su alto contenido de flavonoides. Los flavonoides son antioxidantes y ayudan a prevenir algunos de los desrdenes fsicos que causa la diabetes.

Importancia de los Flavonoides

teraputicos de los flavonoides2: Mejoramiento de la accin de la vitamina C, Ayuda contra desrdenes cardiovasculares, Prevencin del cncer, Ayuda contra alergias y enfermedades autoinmunes, Protege el hgado, Es antiflamatrio, Alivia los sntomas de la arteriosclerosis, Entre otros.
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Usos

2: Alejandro Martnez M., Qumico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia.

Flavonoides utilizados
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Durante el estudio de los extractos de Costus spiralis (insulina) se utilizaron tres estndares, todos flavonoides. Estos fueron: Quercetina Rutina Catequina

Estndares (flavonoides2)
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Rutina- Se encuentra en la cscara de los ctricos; fue considerada como la vitamina P, pero ya no se le conoce como tal. Es utilizada para tratamientos de hipertensin y en geriatra. Tiene efectos anticancergenos potenciales. Catequina- Se encuentra en frutas como las uvas, ayuda a prevenir enfermedades coronarias e isquemias cardacas. Presenta un papel importante contra la accin de la morfina.
2: Alejandro Martnez M., Qumico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia.

Estndares (flavonoides) continuacin

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Quercetina 2- A mostrado efectos antiinflamatorios, ya que estabiliza las membranas de las clulas que liberan histaminas, reduciendo su liberacin. Esta tambin inhibe la enzima que convierte la glucosa en sorbitol, un compuesto que est relacionado con las complicaciones diabticas, incluyendo las cataratas. La quercetina mejora la secrecin de insulina y protege las clulas pancreticas del dao por radicales libres. Al igual que Rutina, tiene
efectos anticancergenos potenciales; y al igual que Catequina, presenta un papel importante contra la accin de la morfina. Por ltimo, ayuda contra condiciones cardiovasculares.

2: Alejandro Martnez M., Qumico M. Sc., Doctor en Ciencias, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia.

Cromatografa de capa fina

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Tcnica que permite separar (fraccionar) los componentes de una mezcla sustancias biolgicas, basndose en el principio de adsorcin selectiva. El trmino se deriva de chrma, color, ya que los primeros ensayos del mtodo tuvieron por objeto separar compuestos que eran naturalmente coloreados. En un principio se utiliz se utiliz la cromatografa para fraccionar e identificar molculas pequeas, como aminocidos o azcares, utilizando cromatografa de particin.

Datos histricos
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El botnico ruso Mikhail Tswett estableci las ventajas de la cromatografa y fue el primero en utilizar este trmino, es recordado como el padre de la cromatografa. Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de cromatografa de capa fina. Egon Stahl (1956) di el nombre de cromatografa de capa fina. Estandariz los procedimentos, equipos y adsorbentes dando un auge a la tcnica simple, a bajo costo y eficiente.

Diseo Experimental
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Se proceden a analizar dos extractos metanlicos de Costus sp., previamente preparados en el laboratorio mediante extraccin slido-lquido (soxhlet) y sometidos a cromatografa de columna cada uno por individual. Las fracciones obtenidas por cromatografa de columna se someten a anlisis mediante cromatografa de capa fina. Condiciones para realizar cromatografa de capa fina: - Estandares metanlicos: - Rutina - Quercetina - Catequina

Diseo Experimental
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Fase mvil: acetato de etilo, metanol y cido actico en una proporcin de 80:20:1 Solvente para extractos: Metanol (99.8 + %) Preparacin de cmara de desarrollo: . Limpiarla y secarla .Colocar papel absorbente y saturarla con la fase mvil (asegurndose de que quede fase mvil en el fondo). Preparacin de la placa: . Placa de silica gel 60 F254 TLC, plastic sheet (20 x 20 cm).

Diseo Experimental
. Hacer las marcas correspondientes, como se muestra en el siguiente dibujo:
Zona hasta donde llega el solvente.

Identificar cada carril con el nmero de fraccin, e identificar la placa con la fecha y extracto correspondiente.

1 cm

Zona donde se colocan las gotas de muestra.

1 cm

* Se utiliza a lo largo, obteniendo 19 carriles para muestras (fraccciones).

Diseo Experimental
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Desarrollo de la cromatografa de capa fina: - Utilizar un tubo capilar para colocar la gotas de muestra en la placa de TLC. - Mientras ms pequeas las gotas mejor. - Esperar a que se sequen las gotas de muestra en la placa. - Colocar la placa dentro de la cmara de desarrollo de manera uniforme. - Tapar la cmara y esperar a que la fase mvil alcance la lnea superior de la placa.

Diseo Experimental
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Revelado de la placa de cromatografa de capa fina: -Remover la placa de la cmara de desarrollo. - Colocarla sobre papel absorbente y esperar a que se seque (precaucin: trabajar dentro de un extractor). - Utilizar una lmpara UV para identificar las manchas en la placa (de haber alguna) y marcarlas con un lpiz. - Colocar la placa sobre un papel y rociarla con una solucin de DPPH3 al 0.2% en metanol. - Pueden aparecer algunas manchas amarillas, de ser as, identificarlas con un lpiz.
3: DPPH es: 2,2- Di(4-tert- octylphenyl)-1-picryl-hydrazyl, free radical; sigma- Aldrich, lote 29802 KI (1-3).

Resultados
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Masa del Primer extracto de Costus sp.

Masa de Muestra de hojas Liofilizadas = 3.15 0.01 g Masa de extracto recolectado = 2.4536 0.0001 g Porciento de extracto por muestra= 77.9% Nmero de fracciones 1y2 3y4 5y6 7y8 9 y 10 11 -13 14 - 19 20 - 22 Masa de fracciones ( 0.0001 g) 0.0042 0.0533 0.1187 0.8788 0.4887 0.6505 0.4626 0.1549

Masa total recolectada de las fracciones de Costus sp. = 2.8117 g (Ntese que a algunas fracciones tienen rastros de solvente)

Resultados
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Masa del Segundo extracto de Costus sp. Masa del extracto recolectado = 0.8939 0.0001 g A este segundo extracto se le realiz una cromatografa de columna y e obtuvieron 32 fracciones. La masa de cada fraccin no se tom, porque an tienen solvente. Nos enfocamos en anlisis de TLC de las fracciones recolectadas.

Anlisis de Fracciones del Primer Extracto de Costus sp.

Anlisis de fracciones de la primera cromatografa de columna

R del TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna)

Nmero de fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 a la 19 (cada una individual) Cantidad de manchas 0 0 1 1 1 1 6 5 3 3 1 1 1 0 R de cada mancha N/A N/A 0.78 0.78 0.74 0.78
0.22, 0.41, 0.53, 0.64, 0.70, 0.76

0.22, 0.41, 0.55, 0.70, 0.77 0.21, 0.40, 0.74 0.20, 0.41, 0.76 0.20 0.21 0.19 N/A

Segundo TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

R del TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

Nmero de fracciones Rutina Quercetina Catequina Extracto de Costus sp.
(del: 20-06-08)

Cantidad de manchas 1 0 0 3 3 0 1 1 6 5 1 0

R de cada mancha 0.16 N/A N/A 0.09, 0.27, 0.85 0.1, 0.25, 0.86 N/A 0.86 0.85 0.27, 0.52, 0.68, 0.81, 0.88 0.28 N/A
0.28, 0.51, 0.68, 0.74, 0.81, 0.86

Extracto de Costus sp.

(del: 26-09-08)

Fraccin 1 y 2 Fraccin 3 y 4 Fraccin 5 y 6 Fraccin 7 y 8 Fraccin 9 y 10 Fraccin 11 y 13 14 19(cada una individual)

Tercer TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

R del TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

Nmero de fracciones Rutina Quercetina Catequina Extracto de Costus sp.
(del: 20-06-08)

Cantidad de manchas 1 1 0 3 3 1 1 0

R de cada mancha 0.16 0.78 N/A 0.09, 0.27, 0.85 0.1, 0.25, 0.86 0.86 0.18 N/A

Extracto de Costus sp.

(del: 26-09-08)

Fraccin 1 y 2 Fraccin 11 y 13 Fraccin 14 19

Cuarto TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

R del TLC (Fracciones1era Cromatografa de columna y estndares)

Nmero de fracciones Rutina Quercetina Catequina Fraccin 14 19 Fraccin 20 Fraccin 21 Fraccin 22 Cantidad de manchas 1 1 1 1 1 1 1 R de cada mancha 0.16 0.78 0.52 0.40 0.93 0.93 0.87

Anlisis de fracciones de la Segunda cromatografa de columna (Realizada de la fraccin 7-10 del primer extracto)

Anlisis de fracciones de la Segunda cromatografa de columna (Realizada de la fraccin 7-10 del primer extracto) continuacin

R del TLC (Fracciones 2da Cromatografa de columna)

Nmero de fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Cantidad de manchas 1 1 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 R de cada mancha 0.80 0.79 0.24, 0.53, 0.72 0.26, 0.54, 0.68 0.58, 0.68, 0.70 0.56, 0.69, 0.76 0.56, 0.71, 0.77 0.56, 0.71, 0.77 0.71, 0.76 0.71, 0.76 0.71, 0.77 0.71, 0.77 0.71, 0.77 0.71, 0.76 0.71, 0.77

R del TLC (Fracciones 2da Cromatografa de columna)

Nmero de fraccin 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Cantidad de manchas 2 2 2 3 2 2 2 2 1 1 2 2 2 1 1 R de cada mancha 0.71, 0.76 0.71, 0.77 0.71, 0.76 0.57, 0.71, 0.79 0.40, 0.66 0.18, 0.45 0.18, 0.45 0.18, 0.45 0.17 0.18 0.09, 0.17 0.09, 0.21 0.07, 0.21 0.21 0.20

R del TLC (Fracciones 2da Cromatografa de columna)

Nmero de fraccin 31 32 33 34-38 (cada una por individual) Cantidad de manchas 2 2 1 0 R de cada mancha 0.07, 0.16 0.07, 0.23 0.29 N/A

Anlisis de Fracciones del Segundo Extracto de Costus sp.

Anlisis de fracciones de la Tercera cromatografa de columna (Realizada del segundo extracto)

Anlisis de fracciones de la Tercera cromatografa de columna (Realizada del segundo extracto) continuacin

R del TLC (Fracciones 3ra Cromatografa de columna)

Nmero de fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Cantidad de manchas 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2 2 2 R de cada mancha 0.92 0.93 0.92 0.93 0.91 0.92 0.92 0.90 0.69, 0.90 0.67, 0.86 0.89 0.70, 0.89 0.70, 0.89 0.71, 0.90 0.70, 0.86

Nmero de fraccin 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Cantidad de manchas 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 1 0

R de cada mancha 0.79 0.65, 0.86 0.65 0.66 0.29 0.28 0.32 0.42 0.45 0.47 0.47 0.28, 0.46 0.23, 0.46 0.19, 0.47 0.19 0.20 N/A

Anlisis de Fracciones de ambos extractos de Costus sp.

Anlisis de fracciones de las tres cromatografas de columna (Realizada del ambos extractos de Costus sp.)

R del TLC (Fracciones las tres Cromatografas de columna)

Nmero de fraccin Cromatografa de columna a la cual pertenece 1era 2da 2da 2da 2da 2da 3ra 3ra 3ra 3ra 3ra 3ra 3ra Cantidad de manchas 2 4 1 1 0 1 1 3 3 2 3 2 3 R de cada mancha

Fraccin 20-22 Fraccin 19-20 Fraccin 33 Fraccin 34-38 Fraccin 39 Fraccin 1-7 Fraccin 8 Fraccin 9-10 Fraccin 11 Fraccin 12-15 Fraccin 16 Fraccin 17 Fraccin 18-20

0.62, 0.72 0.61, 0.67, 0.74, 0.83 0.31 0.32 N/A 0.82 0.81 0.61, 0.73, 0.81 0.62, 0.76, 0.81 0.61, 0.80 0.61, 0.74, 0.82 0.51, 0.75 0.38, 0.52, 0.70

R del TLC (Fracciones las tres Cromatografas de columna)

Nmero de fraccin

Cromatografa de columna a la cual pertenece 3ra 3ra 3ra 3ra 3ra

Cantidad de manchas

R de cada mancha

Fraccin 21-22 Fraccin 23-26 Fraccin 27-29 Fraccin 30-31 Fraccin 32

3 2 2 4 1

0.34, 0.49, 0.73 0.50, 0.75 0.35, 0.46 0.26, 0.45, 0.82 0.67

Conclusiones
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En los primeros TLC no se mostraba presencia de los estndares, se asumi que estaban muy diluidos, y se rotoevaporaron y efectivamente se obtuvieron las manchas. Otro factor que ayud fue aumentar el nmero de gotas de muestra en la placa al doble.

Trabajo por realizar

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Las fracciones que mostraron ser antioxidantes por revelado de DPPH, y a la misma vez tienen R parecidos o iguales a los estndares utilizados, deben ser analizadas por NMR y/o infrarrojo para comprobar la presencia de los estndares en los extractos. Basado en los resultados se le adjudica o no la actividad biolgica antioxidantes a los flavonoides utilizados. En un futuro, se les podra realizar NMR y/o infrarrojo a las fracciones que mostraron ser antioxidantes, pero tenan R distinto a los estndares establecidos en la investigacin.