Partes del Microscopio

Todos los microscopios de luz convencionales y pticos contienen las siguientes partes: Lentes oculares: Estas son las lentes a travs de las cuales miramos, habitualmente tienen el poder de entre 10x y 40x Brazo: conecta la base con el lente ocular y la torre. Base: La base del microscopio. Iluminador: La fuente de luz localizada en la base del microscopio, con fuente de electricidad y o un observador, reflejando luz natural externa. Tabla: La plataforma con clips donde yace el espcimen Torre: La parte rotativa del microscopio con lentes de objetivo. Lentes objetivos: Hay habitualmente entre 3 y 4 de ellos, localizados en la torre. Los lentes objetivos tienen los siguientes magnificadores: 4X, 10X, 40X y 100X. Los lentes ms largos tienen un poder de 100X. Los lentes son normalmente acromticos, parcentered y para focales. Lentes condensadores: Ellos focalizan la luz del rayo sobre el objeto observado. Algunos microscopios estn equipados con lentes condensadores Abbe que se mueven de arriba hacia abajo.

DESCRIPCION DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPIO

Estereomicroscopio o microscopio de diseccin.

Microscopio estreo
El microscopio estreo o "microscopio de diseccin" es un microscopio ptico utilizado para una visin tridimensional. Capturando la luz con dos objetivos, los microscopios estreos permiten mejores estudios de un espcimen grueso. Capaz de permitir la observacin de superficies oscuras, las funciones del microscopio estreo permiten ver dos rayos de luz haciendo un efecto visual estreo. Los microscopios estreos no son muy populares, la habitual magnificacin no es ms grande que 100 y 10 veces del tiempo promedio. Algunos microscopios estreos utilizan objetivos auxiliares para una magnificacin superior.

Microscopio de campo oscuro o ultramicroscopio

Bienvenido Microscopa de Campo Oscuro El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms pequeas que el poder separador del sistema ptico usado por transparencia.

El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios pticos. Desde muchos aos atrs el microscopio ptico posibilito el descubrimiento de las clulas y la elaboracin de la teora de que todos los seres vivos estn constituidos por clulas. El microscopio ptico se compone de dos partes principalmente: 1. Parte Mecnica: Sirve de soporte. 2. Parte ptica: constituida por tres sistemas de lentes. * Condensador * Objetivo * Ocular

El condensador del microscopio ptico convencional tiene como finalidad proyectar un cono de luz sobre los elementos que estn siendo analizados en el microscopio. Despus de atravesar el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una imagen aumentada en el plano focal del ocular ,que nuevamente la amplia y es recibida por la retina como

una imagen situada a 25 cm de la lente ocular.

El microscopio de campo oscuro esta constituido por un microscopio ptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos envindolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo. Existen dos clases de condensador de campo oscuro: * Cardiode

* Paraboloide. Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigacin con Treponemas. Para que el efecto de campo oscuro se logre , la apertura numrica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeo y gran aumento no as con los de inmersin los cuales debern adicionarse de un diagrama de suspensin para la reducir la apertura numrica.

RESOLUCIN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO Se llama poder de resolucin de un sistema ptico a la capacidad de separar detalles y es expresado por el limite de resolucin que es la menor distancia que existe entre dos puntos para que estos aparezcan individualizados. Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema ptico es su limite de resolucin y no su poder de aumentar el tamao de los objetos. El limite de resolucin depende de la apertura numrica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada. En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numrica superior a este valor. El limite de resolucin del objetivo esta dado por la siguiente formula: LR = k x Long. onda / AN * k = Constante ( 0.61) * Log. onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde - amarilla por ser el ojo humano mas sensible a estos colores que a otros. * AN = Apertura numrica no superior a 1.0 MTODOS PARA OBSERVACIN EN FONDO OSCURO Existen diferentes mtodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro , es decir, utilizando nicamente la luz difractada por l.

OBSERVACIN INCIDENTE O POR REFLEXIN La observacin por reflexin con iluminacin oblicua o anular es la mas frecuentemente utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo visual. OBSERVACIN POR TRANSMISIN (Fondo Negro Central) La observacin por transmisin con una pantalla central necesita la utilizacin de un objetivo con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular , la de Wilska: anoptral, versin original y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorcin.

OBSERVACIN POR TRANSMISIN (Fondo negro Anular) La observacin con iluminacin anular de abertura superior a la del objetivo, es la nica que, en la practica corriente , se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difcilmente puede utilizarse objetivos de gran aumento , de apertura numrica superior a 1.0. dado que el condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la inmersin, evitando las burbujas de aire. OBSERVACIN BIRREFRINGENTE ( Polarizacin) La observacin de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo negro de naturaleza muy particular.

OBSERVACIN HAZ PERPENDICULAR (Fondo Negro ultramicrosopico) La observacin con un haz perpendicular a la direccin de la observacin segn Ziedentopf y Szimondy da informaciones sobre la orientacin de las partculas observadas. Accesorios de campo oscuro Usados principalmente para especimenes no coloreados que son semitransparentes o transparentes.

NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO Las imgenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde ,con numerosas franjas de difraccin muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos ,en el centro de una estructura parecen pticamente vacos . es por ello que deben adoptarsen grandes precauciones en el momento de interpretar las imgenes . Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre ms dbil que la luz directa deben formarsen fuentes lumnicas muy intensas, lo que no siempre es fcil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones.

PREPARACIN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA. El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solucin salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina , se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparacin de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparacin solamente en su mitad posterior. Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersin en cantidad adecuada; este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del

condensador. Se centra la preparacin y se observa con objetivo de pequeo aumento colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador, luego se observa el campo microscpico con el objetivo de gran aumento, esto permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales.

VENTAJAS * Permite ver partculas dipersas en un medio homogneo. * Hace posible la observacin del movimiento Browniano de las partculas. * Se puede utilizar para la observacin de preparaciones sin colorear. * Visualiza los bordes destacados delas muestras. * Tcnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con dimetros superior a 0.2 um.

DESVENTAJAS * Inadecuada preparacin de la muestra. * Difcil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. * No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de clulas o partculas.

Microscopio de contraste de fases Bienvenido Microscopio de Contraste de Fase Qu es el microscopio de contraste de fase? Para poder observar una clula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y hacerle una tincin, lo que implica, la muerte de la clula en cuestin. Esto siempre ha sido una preocupacin para los expertos en el campo del estudio celular, debido que al pasar por todos estos procesos, algunas estructuras pueden daarse o cambiar su forma. Para esto se utiliza el microscopio de contraste de fase (entre otros mtodos ms modernos), que permite realizar exmenes inmediatos y observar clulas vivas. La microscopa de contraste de fase, fue desarrollada fundamentalmente por Zernike en 1932. Se basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de distintos ndices de refraccin, aprovechando y amplificando dichos retrasos. El microscopio de contraste de fase permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas. Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. Constitucin del microscopio de contraste de fase Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio ptico de campo claro con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales.

El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos anillos de fase, que son discos transparentes con un diseo en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imgenes se ven diferentes en cada uno, esto se explicar ms adelante.

En la figura superior se muestra la ubicacin del anillo de fase y el condensador anular en el microscopio. Adems en la de la derecha, se muestra un corte de un objetivo, mostrando el disco de fase. Hay que considerar adems que cada una de estas parte no es nica, sino que existen varios juegos de condensadores y de objetivos, dependiendo de la ocasin y el zoom que se necesite.

Fundamentos fsicos: Como ya mencion, este microscopio se basa en que la luz, al atravesar objetos con distintos ndices de refraccin, experimente retrasos (o desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder observarlos, el microscopio de contraste de fase, mediante las dos adaptaciones que aparecen arriba, acenta dichos retrasos, haciendo que zonas con distintos ndices de refraccin se traduzcan en una variacin de contraste lo cual puede ser observado.

La manera de funcionar es la siguiente: Por medio del condensador, se logran separar los rayos luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen, al pasar por la muestra, los rayos que atraviesan objetos ms densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan un cuarto de lambda ms, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte ms delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas luminosas se perciben como diferencias en el contraste, en distintos tonos de gris. Adems el anillo de fase disminuye la intensidad de la luz.

Adems, existen distintas formas de discos de fase, positivos y negativos, los que tienen distintos efectos sobre la luz difractada, haciendo que las imgenes se vean de diferente manera dependiendo cual se use.

En la figura superior se muestra el diseo de los tipos de anillos de fase, el superior corresponde al positivo y el inferior al negativo, se muestra tambin el efecto sobre las ondas luminosas y un ejemplo de de cmo se ve la misma muestra con cada disco de fase. Adems, existen discos de fase con distintas caractersticas de absorcin y retardo de los rayos luminosos, lo que indudablemente influye en el contraste de las imgenes

Aplicaciones El microscopio de contraste de fase, debido a sus propiedades, se utiliza para exmenes inmediatos (o invivo), este tipo de microscopio ha desplazado en uso al de campo claro. Cabe destacar como desventaja, el que los objetos se vean delimitados por un halo o aura brillante alrededor en el caso del contraste de fase positivo, o por una sombra en el caso del contraste negativo, defecto producido por la manera de que se producen las imagenes. Aqu tenemos un ejemplo, varios paramecios conjugandose,

Vistos con contraste positivo (a la derecha) y en contraste negativo (a la derecha)

Microscopio de fluorescencia

Bienvenido Microscopio de Fluorescencia INTRODUCCION Microscopa de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbi da como rayas luminosos. Siendo escasas las molculas autofluorecentes, su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores.

Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas molculas u orgnulos. Pero lo ms habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras molculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo especfico a estructuras concretas de la clula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). Problema: La utilizacin de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia. Fluorescencia: A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado. Epifluorescencia: Hoy da se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio acta como lente iluminadora y de imagen. CONSTITUCION FUNDAMENTAL: Fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta.

Filtros: Retienen la radiacin ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiacin visible, que no es peligrosa. Existen un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos: *El de excitacin: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico. Corta completamente la luz de excitacin no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo. *Espejo Dicroico: Permite la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia. Posicionado en 45 respecto al eje ptico, la longitud de onda ms corta es reflejada y la longitud de onda ms larga lo atraviesa.

COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepcin de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo. Otra diferencia radica en que la luz de iluminacin (excitacin) no est involucrada en la formacin de la imagen. En este sentido la microscopa de fluorescencia difiere de la microscopa normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminacin. FUNDAMENTO FISICO La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin. Ejemplo: 1. Primer filtro de excitacin: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema est seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) 2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar

la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo . 3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos: *El largo de onda de la fluorescencia (emisin) es generalmente ms largo que el largo de onda de la luz excitadora *Mientras ms larga sea la longitud de onda, ms baja es la energa de la luz. Por lo tanto la energa de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida. *La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho ms baja que la de la luz de excitacin *La fluorescencia se desvanece. *Cada substancia posee un espectro de fluorescencia caracterstico.

APLICACIONES 1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma. 2.Fluorescencia inducida: Partes especficas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante mtodos de tincin. Ej:substancias especficas como organelos celulares, protenas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. 3. Sobre objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin, siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molcula de DNA, un virus. TECNICAS DE TINCION FLUORESCENTE 1.DAPI: tie el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.

Desventaja: No discrimina entre clulas vivas y muertas. 2. Tincion de Viabilidad: permite discriminar entre clulas vivas y muertas

Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, tintes se pueden pegar a otras cosas que no son clulas en muestras ambientales o complejas. 3. Green Fluorescent Protein: Deteccin y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.

4. Autofluorescencia Ej: Vitamina A, clorofila de cianobacterias

5. Fluorescencia inducida

6. Objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin de los lentes pticos, siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molcula de DNA, virus FLUORESCENCIA MULTIPLE Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o ms colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.

Microscopio de polarizacin Bienvenido Microscopio de Polarizacin Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador), el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol dejando pasar nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Algunos compuestos orgnicos responden al efecto de la luz, stos tienen un alto grado de orientacin molecular (sustancias anistropas), que hace que la luz que lo atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atmicos. El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano, as el cuarzo gira la posicin de polarizacin, facilitando la identificacin de sustancias que extinguen la luz. Al fenmeno de extincin de luz causado por estos planos atmicos y orientaciones moleculares se

llama birrefringencia. Este tipo de microscopio se usa para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, y otras de origen exgeno.

El microscopio de polarizacin se basa en el empleo de dos filtros polarizadores. El primero de ellos, el polarizador propiamente dicho, sirve para generar un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace incidir en la muestra. El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra y el ocular. Cuando ambos polarizadores se encuentran cruzados, se extingue la luz generada por el primer polarizador. Sin embargo, si la muestra contiene sustancias que presentan anisotropa, se produce birrefringencia y esta puede detectarse.

Qu significa anisotropa y birrefringencia? Cuando las ondas luminosas, que son radiaciones electromagnticas que oscilan en diferentes planos, atraviesan un cuerpo cuyo ndice de refraccin es el mismo en cualquier direccin, la velocidad de la luz es la misma en cualquier direccin, y se dice que ese cuerpo es istropo. el vidrio, los gases y lquidos son istropos. Pero cuando al atravesar un cuerpo, la velocidad de propagacin de la luz no es la misma en todas las direcciones, entonces se dice que dicho cuerpo presenta anisotropa. Cuando un rayo de luz incide en un cuerpo anistropo, el rayo original se divide en dos rayos diferentes y se produce birrefringencia. Cuando se produce birrefringencia aparece un rayo regular rpido que vibra en una direccin y otro paralelo llamado irregular con velocidad de propagacin ms lenta y que vibra ortogonalmente con respecto al primero. El microscopio de polarizacin es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usa

para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de las clulas intersticiales testiculares.

Qu utilidad tiene el microscopio de polarizacin? En el laboratorio de histologa y anatoma patolgica, la microscopa de polarizacin permite determinadas aplicaciones diagnsticas. Numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lpidos, protenas, depsitos seos, depsitos de amiloide etc. poseen birrefringencia.

Microscopio electrnico.

Bienvenido
Microscopio Electrnico Se dispone de varios tipos de microscopios para el estudio de material biolgico (clulas y tejidos).

Para la observacin en alto vaco el material debe cumplir con dos requisitos: estar seco y ser conductivo. Los pasos a seguir para acondicionarlas son los siguientes: *Fijacin: Se realiza a fin de detener los procesos fisiolgicos del material y conservarlos lo mas parecido posible al estado vivo. Se usa una mezcla de solventes como el FAA (formol, alcohol y c. Actico). *Deshidratacin: El agua presente en las muestras y/o en los fijadores al evaporarse, produce contaminacin de la columna del MEB y deformacin de la superficie de la muestra. Por ello los especmenes deben deshidratarse y secarse para su observacin. La deshidratacin se realiza por tratamiento del material en una serie acetnica ascendente. El secado se lleva a cabo por el proceso de punto crtico, que consiste en reemplazar la acetona por anhdrido carbnico (CO2) lquido, el cual pasa a la fase gaseosa sin generar calor de evaporacin. De este modo las muestras se secan sin colapsarse, ya que no estn sujetas a los daos causados por la tensin superficial. *Metalizacin: Los especmenes a observar se recubren con una delgada capa de material conductivo (Au, Au/Pd, C), a fin de evitar los fenmenos de carga y dao por barrido de electrones a la muestra. El procedimiento para lograr este recubrimiento es la evaporacin del metal en atmsfera de plasma de Argn. Introduccin Un microscopio es, bsicamente, un sistema ptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles caractersticos del objeto. Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrn, mientras que con el microscopio electrnico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom. En el microscopio electrnico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interaccin de estos electrones con los tomos de la misma, surgen seales que son captadas por algn detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla. Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se encuentran el microscopio electrnico de transmisin (TEM) y el microscopio electrnico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes caractersticas de una muestra. El SEM provee informacin sobre morfologa y caractersticas de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales. Un gran avance se ha alcanzado con la incorporacin de tcnicas de procesamiento de imgenes

para revelar detalles especficos de inters, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra. Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios pticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quines se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

Un microscopio electrnico funciona con un haz de electrones generados por un can electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificacin se produce por un conjunto de lentes magnticas que forman una imagen sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscpios electrnicos slo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromtico.

Comparacin entre microscopios de luz y electrnico Los microscopios de luz y electrnico son esencialmente, idnticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrnico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolucin. Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuacin. Cabe destacar que la misma, involucra caractersticas generales de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM.

Resolucin El concepto de resolucin est relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mnima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas. La resolucin terica del microscopio electrnico es:

Para valores de l = 0.037 y a = 0.1 radianes, la resolucin nominal es 0.2 . Naturaleza de las ondas de electrones

De Broglie mostr que una partcula movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella. Esta relacin est expresada por:

donde l es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad. Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, l = 0.05 A. que es 100.000 veces ms corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz. La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la mecnica cuntica. Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica, como la que se produce cuando un haz electrnico interacta con la materia, pierde energa y produce una radiacin cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagntico. Limitaciones del microscopio electrnico *El limitado dimetro de la apertura no permite que la informacin detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolucin. *El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al constraste de difraccin, provocado por la prdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes gruesos. *El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes finos. *Existen tambin distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmtica, esfrica y cromtica *El problema de la funcin de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema ptico a una imagen descompuesta en ondas cuadrticas. El material biolgico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vaco y la transferencia de energa. Para resolverlos, se utilizan distintas tcnicas dependiendo del tamao de la muestra: * Para muestras grandes como rganos, tejidos o clulas, se utilizan tres tcnicas: 1. La fijacin qumica o la criofijacin 2. La inclusin en resinas (criosustitucin)

3. La rplica metlica * Para muestras pequeas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes t cnicas 1. La tincin negativa: los agentes de tincin ms usados son el molibdato amnico, el fosfotungstato sdico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactan mnimamente con la muestra y son estables en la interaccin con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusin, tienen un tamao de grano pequeo. 2. La rplica metlica: para construir la rplica metlica se evapora el metal (estao), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vaco, se disuelve. 3. La criomicroscopa Aplicaciones En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el microscopio electrnico debido a una curiosa propiedad: Como el campo elctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un circuito integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio electrnico, se puede apreciar el potencial al que est cada elemento del circuito. Tipos de microscopios electrnicos Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Microscopio electrnico de transmisin (MET) El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Permite la observacin de muestra en cortes ultrafinos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Se coloca una placa fotogrfica o una pantalla fluorescente detrs del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Reemplaza la luz visible por un haz de electrones que produce un muy alto poder de resolucin. En este sistema se reemplazan los lentes (cristales) por campos electromagnticos, estos producen la amplificacin de la imagen. Este haz de electrones viaje en un tubo de alto vaco, la imagen formada es registrada en la pantalla (monitor) o en una placa fotogrfica. La formacin de la imagen depende de la dispersin de los electrones. La imagen se debe a la ausencia de esos electrones. Depende del nmero atmico (de los tomos presentes en el objeto) y del grosor del

objeto. Los cortes son de 1/40 micras (250 Armstrong) de espesor. Se pueden obtener aumentos de hasta 160.000 veces. Instrumento El sistema ptico-electrnico del microscopio electrnico de transmisin est constitudo por las siguientes partes: 1. Can de electrones 2. Sistema de lentes 3. Pantalla fluorescente Estos componentes estn ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vaco. El can de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Est constitudo por un filamento (ctodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente ms negativo que ste. El nodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt. El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoinicamente por el ctodo son acelerados hacia el nodo, pasan por la apertura circular central de ste y un haz de alta energa es emitido hacia la columna del microscopio. El sistema de lentes est formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, ms modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su dimetro y el ngulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra. La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especmen. Es considerada el componente ms importante del microscopio electrnico. Cualquier defecto en sta, ser magnificado y transmitido al resto del sistema ptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolucin final y la correccin de las aberraciones. Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente. La pantalla del microscopio electrnico de transmisin est recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.

Mediante el microscopio electrnico de transmisin podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgnico oinorgnico. Para esto, existen diferentes formas de operacin que posibilitan el estudio de una caracterstica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales nobiolgicos y biolgicos podemos nombrar : 1. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc. 2. Estudio de catalizadores. 3. Determinacin de impurezas, precipitados,etc. 4. Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales. 5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros. 6. Determinacin de tamao de partcula en catalizadores, minerales,etc. 7. Identificacin de planos cristalinos. 8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos. 9. Realizacin de estudios de histoqumica para identificxar compuestos especficos. 10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. 11. Reconocimiento de virus. 12. Estudios de citoqumica. 13. Estudios de estructuras moleculares. Microscopio electrnico de barrido (MEB) En el microscopio electrnico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y

orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque, al contrario que los TEM o los microscopios pticos, produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. A diferencia de los microscopios pticos, el MEB utiliza un haz de electrones que se trasladan en una trayectoria libre de colisiones (columna de alto vaco) e interactan con el espcimen, recorriendo la topografa de la muestra. El bombardeo de la muestra con el haz produce un elevado nmero de seales, las que son captadas por un detector y transformadas en una imagen. El microscopio electrnico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrnico de transmisin. Ambos tienen ciertas caractersticas comunes tales como un can de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vaco. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la informacin que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfologa superficial. En el microscopio electrnico de barrido, el haz electrnico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interaccin entre los electrones incidentes con los tomos que componen la muestra se generan seales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una seal y las convierte en una seal electrnica que es proyectada en un tubo de rayos catdicos (CRT). El barrido del haz est sincronizado con el barrido del CRT y produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT. Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.

SEM se estudian: 1. Morfologa superficial catalizadores, etc. 2. Electrodepsitos 3. Adherencia fibra-matrz en polmeros. 4. Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos. 5. Formas de cristalizacin de minerales. 6. Control de calidad de catalizadores industriales. 7. Morfologa superficial interna de partculas polimricas. 8. Morfologa de tejidos u rgano animales y vegetales. 9. Estudio de molculas 10. Reconocimiento de fsiles. Interaccion haz incidente-Muestra en el SEM Naturaleza de la interaccin: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los tomos que componen la muestra. De all surgen seales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas seales se producen simultneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes. Uno de los detectores ms comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas. Por esta razn, poseen baja energa (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfologa superficial de la muestra. Unidades de medida en microscopia La unidad que se usa en microscopa de luz es el micrn () que es la milsima parte del milmetro. En microscopa electrnica la unidad ms conocida es el angstrom (), definido como la diez millonsima parte del milmetro. Tambin se emplea el nanometro (nm), que es la millonsima parte del micrn. As, por ejemplo, la resolucin de un microscopio de la de un microscopio electrnico de 2.5 .

Mediante el de minerales,

luz

es

0.25

2500

Galeria de imagenes a Microscopio Electronico

Detalle de bacterias (bacilos) a 10000X. Las bacterias miden aproximadamente una micra.

Detalle de fibras de algodn (600X). (1cm= 10 micras)

Detalle de epidermis de semilla de justicia. Fotografia tomada con el microscopio electrnico de barrido. (1cm=10 micras)

Detalle de ala de mariposa (220X). (1cm=30 micras)

Micrografa electrnica de Transmisin de un polmero. (1cm=0.2 micras)

Vista general de un piojo (20X).(1cm=300 micras)

FUENTE: *http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_electr%C3%B3nico *http://criba.edu.ar/cribabb/servicios/secegrin/microscopia/apunte_col.htm *http://www.icarito.cl/medio/articulo/19509_200080638,00.html