TEMA 6.

3 LUMINISCENCIA MOLECULAR
La luminiscencia molecular son aquellos que desprenden luz sin desprender calor, o que lo hacen sin una causa aparente, como un incendio, un ejemplo de ellos son las lucirnagas y los gusanos luminiscentes. atipo de material que se emplea; mas bien es la emisin de luz por medios diferentes a la combustin, como por ejemplo la luz, o brillo, que emite el reloj luminoso. Dentro de este trabajo se incluyen los 8 tipos de luminiscencia las cuales son; Quimioluminiscencia, causada por reacciones qumicas; la Bioluminiscenciaque es la emisin de luz por organismos vivientes; Roentgenluminiscencia, producida por rayos X de altas energas; Catodoluminiscencia; Anodoluminiscencia e ionoluminiscencia; etc. La luminiscencia y la fosforecencia tienen infinitas aplicaciones como por ejemplo en la pantalla de los televisores, etc. La espectroscopia de fluorescencia es una tcnica muy sensible para determinar algunas molculas. Igualmente, los mtodos de quimioluminiscencia y fosforescencia tienen diversas aplicaciones en los laboratorios analticos modernos. SUBTEMA 6.3.1 FUNDAMENTOS DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los tomos o las molculas son excitados por absorcin de la radiacin electromagntica. Las especies que han sido excitadas se relajan luego hacia el estado fundamental, liberando el exceso de energa en forma de fotones. La principal ventaja de la fluorescencia molecular es su elevada sensibilidad, que suele ser de uno a tres ordenes de magnitud superior a la de la espectroscopia de absorcin, con este mtodo se han detectado molculas nicas de especies seleccionadas y en condiciones controladas. Otra de sus ventajas es el amplio intervalo de concentracin lineal, el cual es significativamente mayor que el que se encuentra en la espectroscopia de absorcin. Esto se debe principalmente a que es relativamente limitada la cantidad de sistemas qumicos que exhiben una fluorescencia apreciable, adems, esta propiedad es mas susceptibles a los efectos de las interferencias que la absorcin. FUNDAMENTOS DE LA FLUORESCENCIA MOLECULAR Para medir esta propiedad, la muestra se excita a la longitud de absorcin, o longitud de onda de excitacin, y se mide la emisin a una longitud de onda mayor, llamada longitud de fluorescencia o emisin . Por ejemplo, la forma reducida de la coenzima dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) puede absorber radiacin a 340nm. La molcula fluoresce con una emisin mxima a 465nm. Esta fluorescencia se mide normalmente en ngulo recto al rayo incidente, as se evita medir la radiacin incidente. La emisin que tiene una vida mas corta se conoce como fluorescencia, mientras la luminiscencia que permanece por ms tiempo se llama fosforescencia.

PROCESOS DE RELAJACIN 1

Se muestra un diagrama parcial de niveles de energa para una molcula hipottica. Se representan tres estados electrnicos de energa: Eo, E1 y E2; Eo es el estado basal o fundamental, y E1 y E2 son estados excitados. Cada uno de estos estados electrnicos se muestra con cuatro estados de excitacin por vibracin. Cuando esta molcula se irradia con una banda de radiacin con longitudes de onda E hasta E2 se tiene una poblacin momentnea de los cinco estados de vibracin del primer estado electrnico excitado, E1. Igualmente, cuando las molculas se irradian con una banda mas energtica con longitudes de onda mas cortas, E1hasta E 2 los cinco estados de vibracin del estado electrnico de mayor energa, E2, se pueblan momentneamente. Cuando una molcula es excitada hasta los niveles E1 o E2, pueden desencadenarse varios procesos que llevan a que la molcula pierda el exceso de energa. En la figura anterior se muestran dos de los mecanismos ms importantes: la relajacin no radiante y la emisin de fluorescencia. Los dos procesos mas importantes de relajacin no radiante que compiten con la fluorescencia se muestran en la figura. La relajacin por vibracin, que se representa mediante las flechas onduladas cortas entre los niveles de energa de vibracin, tiene lugar durante los choques de las molculas excitadas con las molculas del disolvente. La fluorescencia, este proceso casi siempre implica una transicin del estado electrnico excitado mas bajo, E1, en el que ya se encuentra la molcula, al estado fundamental, Eo. La fluorescencia tambin puede darse nicamente del nivel de vibracin mas bajo del estado E1 a cualquier nivel de vibracin Eo, ya que la conversin interna y el relajamiento por vibracin son ms rpidos que la fluorescencia. De esta forma, un espectro de fluorescencia casi siempre esta compuesto de una sola banda con muchas lneas estrechas, que reflejan las transiciones desde el nivel de vibracin mas bajo del estado E1 hasta los diferentes niveles de vibracin del estado Eo. Conviene hacer notar que la emisin de fluorescencia suele tener menor energa que la que acompaa a la excitacin. A este cambio de la longitud de onda se le conoce tambin como desplazamiento de stokes. RELACION ENTRE LOS ESPECTROS DE EXCITACIN Y DE FLUORESCENCIA 2

En virtud de que las diferencias de energa que hay entre los estados de vibracin son casi iguales a las que se encuentran entre el estado fundamental y los estados excitados, el espectro de excitacin, o absorcin, de un compuesto, se vera casi como una imagen especular de su espectro de fluorescencia, y ambos espectros se empalman cerca del origen de transicin. Este efecto se ve en la figura anterior, sin embargo, esta regla de la imagen especular tiene muchas excepciones, sobre todo los estados fundamental y excitados tienen distintas geometras moleculares, o cuando aparecen diferentes bandas de fluorescencia de diversas partes de la molcula. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION SOBRE LA INTENSIDAD DE LA FLUORESCENCIA La energa radiante de la fluorescencia F es proporcional a la energa radiante del haz de excitacin absorbido por medio: F = K (Po P) Donde Po es la energa de la radiacin que incide en la muestra y P es la energa de la radiacin que sale despus de atravesar una longitud b del medio. La constante K depende de la geometra y de la capacidad de la fluorescencia para competir con los procesos no radiantes. A esta capacidad se le conoce como eficacia o rendimiento cuantico, y es la relacin entre el nmero de fotones que emiten fluorescencia y el nmero de fotones que absorben. Cuando la concentracin del analito es baja y donde se tiene mayor efecto la fluorescencia, la ecuacin se transforma en: F = K` Poc Donde C es la concentracin de la especie fluorescente y K` es una nueva constante de proporcionalidad. Cuando la energa radiante del haz incidente se mantiene constante, la ecuacin indica que F es directamente proporcional a la concentracin del analito. De esta forma, el grafico de la energa radiante fluorescente en funcin de la concentracin de la especie fluorescente deber ser lineal en el intervalo de concentraciones bajas. Cuando C aumenta lo suficiente para que la absorbancia sea mayor que 0.05, se pierde esta relacin lineal y F tiende a alcanzar una meseta con la concentracin. Este efecto se conoce como efecto de filtro interno por absorcin primaria ; con concentraciones ms altas, la energa radiante de la fluorescencia comienza a disminuir conforme aumenta la concentracin.

INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA 3

Todos los equipos para anlisis por fluorescencia funcionan con el sistema de configuracin general. Si los dos selectores de longitud de onda son filtros, el equipo se llama fluormetro, y si estos son monocromadores, se dice que el instrumento es un espectrofluormetro. En algunos instrumentos se combinan estas dos caractersticas, utilizan un filtro de excitacin junto con un monocromador de emisin. Los equipos de fluorescencia tambin pueden llevar un sistema de doble haz para compensar los cambios en la energa de la fuente de radiacin debidos al uso y al cambio de longitud de onda. Los equipos que pueden corregir la distribucin espectral de la fuente de radiacin se conocen como espectrofluormetros rectificadores. Las fuentes de fluorescencia normalmente son ms potentes que las que se utilizan en la absorcin. En la fluorescencia, la energa radiante emitida es directamente proporcional a la intensidad de la fuente de radiacin, en cambio, la absorbancia es proporcional al cociente de las energas de radiacin, y prcticamente no depende de la intensidad de la fuente de radiacin. Por esta razn, las fuentes de fluorescencia suelen ser lmparas de arco de mercurio o de xenn, lmparas de arco de mercurio con xenn y lser. Por su parte, los monocromadores y los transductores son parecidos a los que utilizan los espectrofotmetros muy sensibles invariablemente utilizan fotomultiplicadores. Los sistemas detectores en serie, en particular los que utilizan dispositivos de carga acoplada (CCD, por sus siglas en ingles) son cada vez ms comunes para hacer mediciones de fluorescencia. Los fluorometros y espectrofluorometros se fabrican con caractersticas tan variadas como las de los espectrofotmetros de absorcin: aunque los equipos de fluorescencia son ms costosos que los equipos para absorcin de calidad comparable.

APLICACIONES DE LA ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR 4

La espectroscopia de fluorescencia no se clasifica como una herramienta fundamental para el anlisis cualitativo o estructural. Esto se debe, en parte, a que las molculas que presentan diferencias estructurales mnimas suelen tener espectros de fluorescencia muy parecidos. Adems, las bandas de fluorescencia en solucin son relativamente anchas a temperatura ambiente. No obstante, la fluorescencia es una herramienta muy valiosa para analizar e identificar derrames de hidrocarburos. La fuente de los hidrocarburos vertidos se puede conocer comparando el espectro de emisin de fluorescencia de la muestra derramada con el de la posible fuente. El anlisis por fluorescencia tambin tiene aplicacin en los estudios de equilibrios qumicos y cinticos. El procedimiento que se sigue es similar al que se utiliza en la espectrofotometra de absorcin. Adems, como el anlisis por fluorescencia es ms sensible que el de absorcin, es ms factible estudiar reacciones qumicas con concentraciones mas bajas. En muchos casos en los que no es posible seguir l emisin de fluorescencia de una molcula. Tambin se han desarrollado mtodos cuantitativos de anlisis por fluorescencia para especies inorgnicas, orgnicas y bioqumicas. Los mtodos de fluorescencia para compuestos inorgnicos se pueden dividir en dos clases: mtodos directos.- que se basan en la reaccin del analito con un agente complejante para formar un complejo fluorescente, y mtodos indirectos.- que dependen de la disminucin en la fluorescencia. Este efecto, conocido tambin como apagamiento, es consecuencia de las interacciones entre las molculas del analito y un reactivo fluorescente. Los mtodos de apagamiento se emplean principalmente en el anlisis de aniones y oxigeno disuelto. Las aplicaciones de los mtodos de fluorescencia para resolver problemas orgnicos y bioqumicas son impresionantes. Entre los numerosos compuestos que pueden determinarse por fluorescencia se encuentran los aminocidos, las protenas, las coenzimas, las vitaminas, los cidos nucleicos, los alcaloides, las porfirinas, los esteroides, los flavonoides y muchos metabolitos. ESPECTROSCOPIA DE FOSFORESCENCIA MOLECULAR La fosforescencia es un fenmeno de fotoluminiscencia muy parecido al de la fluorescencia. Las molculas que normalmente no son radicales libres tienen sus espines electrnicos apareados cuando se encuentran en el estado fundamental. El estado electrnico molecular en el que todos los espines electrnicos estn apareados se conoce como estado de singulete. Por su parte, el estado fundamental de un radical libre es un estado de doblete debido a que el electrn no apareado puede adoptar dos direcciones en un campo magntico. Cuando uno de los electrones de un par electrnico de una molcula se excita hasta un nivel superior de energa, se puede dar un estado de singulete o de triplete. En el estado excitado de singulete, el espin del electrn promovido todava se encuentra en direccin contraria al del electrn no excitado. La fluorescencia de las molculas implica una transicin desde un estado excitado de singulete hasta un estado fundamental de singulete. La probabilidad de que se lleve acabo esta transicin es muy alta; por tanto, la vida media de un estado excitado de singulete es muy breve. La fosforescencia molecular implica una transicin desde un estado excitado de triplete hasta un estado fundamental de singulete. Como esta transicin lleva a cambiar el espin del electrn, la probabilidad de que suceda es muy baja. La vida media mas larga de la fosforescencia es tambin una de sus desventajas. Como resultado de la vida media larga, los procesos no radiantes pueden competir con la fosforescencia y desactivar el estado excitado. Por esta misma razn, los procesos de fosforescencia son poco eficaces y su intensidad correspondiente es relativamente baja. Para aumentar su eficacia, la fosforescencia normalmente se mide a bajas temperaturas en medios rgidos como los vidrios. La fosforescencia tiene menos aplicaciones que la fluorescencia como consecuencia de su menor intensidad. La fosforimetria es til para determinar diversas especies orgnicas y bioqumicas, tales como cidos nucleicos, aminocidos, purinas y pirimidinas, enzimas, hidrocarburos, policiclicos y pesticidas. Muchos compuestos farmacuticos tambin exhiben fosforescencia con intensidad suficiente para analizarlos con esta tcnica, mientras que los equipos empleados para medir fosforescencia son algo mas complicados que los que miden fluorescencia. Los equipos diseados para medir fosforescencia permiten discriminar entre esta y la fluorescencia. Para ello, se retrasa la medicin de fosforescencia hasta que la fluorescencia decaiga casi hasta el nivel cero.

METODOS DE ANALISIS POR QUIMIOLUMINISCENCIA: REACCIONES QUE PRODUCEN LUZ La instrumentacin tan simple que se requiere para medir la quimioluminiscencia es una de sus caractersticas mas atractivas para el anlisis. Dado que el mtodo no precisa de una fuente externa de radiacin, todo el equipo puede reducirse a un vaso de reaccin y un tuvo fotomultiplicador. Los mtodos de quimioluminiscencia tambin se caracterizan por su alta sensibilidad. Pueden detectar desde partes por milln hasta poco menos de partes por mil millones. El anlisis por quimioluminiscencia tiene su principal aplicacin en la medicin de gases, como xidos de nitrgeno, el ozono y los compuestos de azufre; tambin especies inorgnicas, tales como el peroxido de hidrogeno y algunos iones metlicos. FACTORES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA. La intensidad de fluorescencia es afectada por los siguientes factores: 1. Estructura: La fluorescencia se presenta ms comnmente y en forma ms intensa con compuestos que tienen grupos funcionales aromticos con bajas energas de transicin . Compuestos que tienen estructuras de carbonilos alifticos y alicclicos o de dobles enlaces cojugados con un alto grado de estabilidad de resonancia tambin pueden presentar fluorescencia, pero el nmero de estos es relativamente pequeo comparado con el nmero de sistemas aromticos fluorescentes. La sustitucin de grupo funcional en el anillo de benceno cambia la longitud de onda de mxima absorcin con un cambio correspondiente en la posicin e intensidad de la lnea de emisin de fluorescencia. 2. Temperatura y naturaleza del solvente: El efecto de un aumento en la temperatura incrementa el nmero de choques moleculares, por lo que la desactivacin tiende a efectuarse a travs de procesos no radiativos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia. La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor viscosidad menor nmero de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia. La polaridad del solvente tambin tiene influencia en la fluorescencia, debido al efecto hipsocrmico y batocrmico que el solvente ejerce sobre el compuesto. 3. Efecto del pH: Debido a las diferentes formas qumicas que son posibles de existir a diferentes condiciones de pH, la intensidad de fluorescencia tambin es afectado por este factor. Ejemplo: el fenol y el in fenolato tienen diferentes propiedades fluorescentes, por lo que si las condiciones son de pH bsico la especie estar en el equilibrio qumico en la forma del fenol y/o ion fenolato, afectando as la intensidad de fluorescencia. 4. Efecto del oxgeno disuelto: Debido al paramagnetismo de la molcula de oxgeno, esta tiende a desactivar cualesquier estado activado por oxidacin fotoqumica de la especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las molculas excitadas al estado triplete .por lo que es deseable que el oxgeno no se encuentra presente en solucin o su concentracin sea mnima 6

INSTRUMENTACIN PARA FLUORESCENCIA Los componentes de un fluormetro o espectrofluormetro son muy similares a los de un espectrmetro Visible- UV. Un diagrama simplificado de los componentes de un fluormetro son los que aparecen en la Figura 2. El diagrama de doble haz es sumamente til para compensar por las fluctuaciones en la intensidad de la fuente de excitacin. El haz de referencia pasa a travs de un atenuador de radiacin y se ajusta ste hasta hacer que la intensidad de este haz sea igual a la intensidad del haz de fluorescencia que pasa por el recipiente de muestra cuando se encuentra en ste un blanco. El haz de radiacin dirigido al recipiente de muestra pasa por un filtro (fluormetro) o por un monocromador (espectrofluormetro), donde se selecciona la longitud de onda de la radiacin que va ha incidir en la muestra. La radiacin fluorescente emitida por la muestra es en todas direcciones pero es ms convenientemente medida a un ngulo de 90 con respecto al haz incidente ya que la radiacin dispersada por la solucin y por la celda misma puede interferir con la radiacin emitida por la especie fluorescente. Tanto el haz de referencia como el haz de muestra son dirigidos a un sistema de foto tubos y posteriormente a un amplificador diferencial que se encuentra conectado a un sistema de lectura, tal como una escala digital o de aguja (Figura 2).

La seleccin en la compra de un espectrofluormetro o un fluormetro radica esencialmente en el costo y en la finalidad del trabajo que se desea hacer con un instrumento de este tipo. Un espetrofluormetro es mucho ms costoso que un simple fluormetro de filtros. Con el primero es posible hacer estudios sofisticados sobre una estructura electrnica y de niveles energticos en molculas o iones adems de anlisis cuantitativo. Un fluormetro de filtros es de mucho menos precio y funciona en forma completamente satisfactoria en aspectos de trabajo rutinario y con tcnicas ya establecidas (Ejemplo: laboratorios de anlisis clnicos, laboratorios de control de calidad), por lo que en laboratorios de anlisis, es mucho ms frecuente encontrar fluormetros simples que espectrofluormetros. 7

Se

debe El

tener un amortigua
COMPONENTES DE FLUORMETROS cuidado dor para DE EXCITACIN.- La lmpara de tungsteno ordinaria no da suficiente intensidad para ser utilizada en ajustarFUENTES especial al la fluorescencia. Son comunes las lmparas de Xenn y de Mercurio. La lmpara de xenn es ms verstil que la lmpara de mercurio. La lmpara de xenn produce una intensa radiacin por el paso de corriente en una atmsfera de xenn; el espectro de este tipo de lmpara es continuo de 250 a 600 nm. Con un pico de mxima intensidad a 470 nm.

FILTROS Y MONOCROMADORES.- Para fluormetros de filtros de utilizan frecuentemente filtros de absorcin y filtros de interferencia. Los espectrofluormetros generalmente utilizan rejillas de difraccin como monocromadores. DETECTORES.- Debido a que la seal de fluorescencia es de baja intensidad se requiere de un potente sistema de amplificacin. Por esto son preferidos los tubos fotomultiplicadores, aunque tambin se usan comnmente los fototubos en aparatos de menor precio. CELDAS.- En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio comn cuando la radiacin que se maneja es de rango visible. Para Ultravioleta es necesario utilizar slice o cuarzo. APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA Durante un tiempo y no hace muchos aos, la espectroscopia de fluorescencia molecular estuvo restringida en sus aplicaciones cuantitativas a unos cuantos qumicos raros. Hoy da la fluorescencia es de primordial importancia en la qumica analtica. Una de sus ms espectaculares aplicaciones ha sido en la deteccin y cuantificacin de substancias que son separadas a travs del uso de la cromatografa de lquidos. Muchos sistemas bioqumicos son de estructura tal que frecuentemente presentan fluorescencia o pueden ser trasformados a especies de este tipo si originalmente no lo son. Por otra lado, especies inorgnicas que son difciles de detectar y cuantificar por espectroscopia UV-Visible o por Absorcin Atmica se utilizan por fluorescencia. Adicionalmente a esto los niveles de deteccin son del orden de partes por billn, cantidades que por otras tcnicas son difciles de detectar. Estas entre otras son las razones de la importancia creciente de la fluorescencia molecular. Algunas de las especies que pueden ser analizadas por fluorescencia son las siguientes: Compuestos Orgnicos y Bioqumicos: adenina, cido antranlico, cistena, hidrocarburos aromticos policclicos, indol, naftol, protenas, cido saliclico, escatol, triptfano, cido rico, adrenalina, alquilmorfina, LSD, penicilina, fenobarbital, procana, reserpina, clorofila, alcaloides, flavonoides, esteroides, cido ascrbico, cido flico, nicotinamida, piridoxal, corticoesteroides, estrgenos, progesterona, andrgenos, cidos biliares, colesterol, triglicridos, creatinina, deshidrogenasas, transaminasas, fosfatasas, perioxidasas, ATP, luciferina, luciferasa, vitaminas: A, B1, B2, B6, C y la E, etc. Compuestos Inorgnicos: cianuro, fluoruro, sulfatos, fosfatos, aluminio, arsnico, berilio, boro, calcio, magnesio, tierras raras, selenio, uranio, etc. Sin duda alguna las aplicaciones ms importantes en la fluoromtria son en anlisis de alimentos, de productos farmacuticos, de productos naturales y en anlisis clnicos.