INSTRUMENTACIN QUMICA III ESPECTROMETRA DE MASAS ELECTROFORESIS CAPILAR CON DETECCION DE ESPECTROMETRIA DE MASAS POR ORBITRAP-VELOS

La electroforesis capilar es una tcnica utilizada como separacin de diferentes molculas en una solucin de acuerdo con la relacin masa/carga de las mismas y puede obtenerse una separacin de pptidos de forma rpida y eficiente por lo cual es necesario un detector sensitivo tal como el espectrmetro de masas Orbitrap-velos. El anlisis de electroforesis mantiene 2 caractersticas principales que la inyeccin de muestra en nanolitros y concentracin baja es necesaria para mantener la alta eficiencia en la separacin y a su vez el uso de un detector con un tiempo de respuesta rpido.

En este estudio el uso de electroforesis capilar con el uso de espectrometra de masas se utiliz con la fuente de ionizacin de electrospray debido a la gran facilidad de ionizar molculas grandes tales como lo son algunos pptidos. La interface de electroforesis capilar y electrospray se dividen entre dos diseos uno con flujo cubierto (o con vaina) y uno no cubierto (sin vaina). En este caso se utiliz un diseo de flujo cubierto con espectrmetro de masas LTQ Orbitrap-velos debido a que este instrumento combina una trampa lineal de doble presin y una analizador Orbitrap de alta resolucin.

Los pptidos utilizados al igual que los capilares de borosilicato y la silica que separa los capilares fueron comprados a una casa matriz. Los capilares se trataron con acido clorhdrico e hidrxido de sodio y con el buffer de separacin; todo el proceso de espectrometra de masas se realiz con el equipo de Orbitrap-velos en modo positivo a 300C y con un escaneo de espectro de masas de 4002000 m/z. En el momento de probar la reconstruccin de los picos de electroforesis del equipo Orbitrap se inyectaron cuatro estndares de protenas y se generaron electroferogramas de iones seleccionados a 75 valores de m/z diferentes de cada uno de los pptidos, los cuales fueron comparados con una curva de calibracin realizada con 55 pptidos.

El equipo LTQ Orbitrap-velos es capaz de adquirir escaneos de iones precursores de alta resolucin, lo cual se desea que altas separaciones proteomicas ocurran. Sin embargo, las ventanas de tiempo

de separacin estrechas haces que la adquisicin del espectro de masas sea ms lento. Al evaluar el desempeo del espectrmetro de masas para separaciones capilares electroforticas de alguna muestra compleja, en la cual una fraccin de extraccin de pptidos en fase solida con 10% de acetonitrilo se analizaron usando adquisiciones de datos dependientes. En este proceso se pueden lograr buenas separaciones de pptidos por electroforesis capilar, los cuales pueden ser alcanzados en una alta variedad de condiciones de pH, comnmente pueden ser conseguidos de forma mayoritaria en procesos en ambientes alcalinos, sin embargo este sistema utiliza sistemas cidos lo cual en un rgimen de nanospray altera el pH en el emisor de electrospray, lo que permite el anlisis de espectrometra de masas en modo positivo de pptidos acidico, incluso cuando estn cargados negativamente en la separacin alcalina.

En conclusin el espectrmetro de masas Orbitrap-velos es un detector muy interesante para la separacin de pptidos mediante electroforesis capilar, debido a que ofrece una alta resolucin de anlisis a la vez que las tasas de adquisicin de espectros de masas tndem alrededor de 10Hz y tambin el uso de una interface con electrospray, el cual se basa en un bombeo electrocintico lo que genera que el liquido llegue a un estado de nanospray, lo que genera que el sistema pueda proveer una alta flexibilidad en la separacin de molcula, en esta operacin el trabajo realizado fue en una ventana de tiempo corto, lo cual es ideal para muestras simples, pero no para muestras complejas con lo que con este proceso se logr obtener la generacin de ~100 espectros de masas tndem durante la ventana de separacin, lo cual limita el nmero de pptidos identificados de muestras complejas.