Quim. Nova, Vol. 27, No.

1, 22-26, 2004 DETERMINAO DE CORANTES ARTIFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (CLAE) EM P PARA GELATINA

Artigo

Marcelo Alexandre Prado e Helena Teixeira Godoy* Departamento de Cincia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, CP 6121, 13083-970 Campinas - SP Recebido em 31/10/02; aceito em 13/6/03

DETERMINATION OF SYNTHETIC DYES BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) IN JELLY POWDER. Synthetic dyes were determined by high performance liquid chromatography in 76 samples of regular jelly and diet jelly powders, of several flavors produced by seven different manufacturers. Three sample of each product, from different batches, were analyzed. The same qualitative composition was observed for products of the same flavor from different manufacturers, but the quantitative composition varied markedly from one manufacturer to the other. There were no or few significant differences between batches from a given manufacturer, demonstrating good quality control in the use of these additives by the food industry. None of the samples exceeded the limit stipulated by Brazilian legislation. Keywords: jelly; dyes; HPLC.

INTRODUO O emprego de aditivos qumicos em alimentos motivo de muita polmic, gerando controvrsias que envolvem consumidores, indstria, pesquisadores e governo. Os corantes artificiais so aditivos alimentares e tm sido objeto de muitas crticas, j que o emprego destes em alguns alimentos se justifica apenas por questes de hbitos alimentares1,2. A cor associada a muitos aspectos de nossa vida, influenciando nossas decises, incluindo as que envolvem os alimentos. A aparncia, segurana, aceitabilidade e caractersticas sensoriais dos alimentos so todas afetadas pela cor. Embora esses efeitos sejam associaes inerentes s caractersticas psicolgicas, eles interferem na escolha dos produtos3. Muitos alimentos industrializados no apresentam cor originalmente e, em outros, a cor natural alterada ou destruda durante o processamento e/ou estocagem, com isso o uso de corantes para suplementar ou realar a colorao perdida e, principalmente, para aumentar a aceitabilidade do produto frente ao consumidor um recurso muito utilizado. A idia de consumo desses produtos d-se primeiramente pela viso; alimentos coloridos, vistosos, so muito mais atraentes para o consumidor, e essa cor deve-se ao uso de corantes, aditivos que no so totalmente inofensivos. Os corantes orgnicos sintticos artificiais foram, progressivamente, substituindo os corantes naturais, devido sua maior estabilidade, poder de colorao, maior faixa de colorao e menor preo, alm de garantir a uniformidade dos alimentos produzidos em larga escala4. Com a globalizao e o conseqente aumento das importaes/ exportaes, fazem-se cada vez mais necessrias a utilizao de mtodos mais confiveis, eficientes e rpidos para a deteco, identificao e quantificao dos corantes. Com as restries das legislaes em relao s quantidades permitidas e as tendncias futuras de se aumentar essas restries, o problema passou a ser alm da iden-

tificao, a quantificao desses corantes em alimentos. O Brasil permite os seguintes corantes artificiais: Tartrazina, Amarelo Crepsculo, Amaranto, Ponceau 4R, Vermelho 40, Eritrosina, Azul Indigotina e Azul Brilhante, Verde Rpido, Azul Patente V e Azorrubina5-7. A determinao de corantes sintticos em alimentos tem sido feita por vrios mtodos espectrofotomtricos8 e cromatogrficos, e mais recentemente utilizando a cromatografia lquida de alta eficincia9-19. Prado e Godoy1 desenvolveram e validaram uma metodologia, por CLAE que, alm das vantagens de eficincia na separao, rapidez e simplicidade, permite a separao e quantificao dos oito corantes permitidos em uma nica anlise, utilizando sistema de eluio isocrtica sem a adio de par-inico fase mvel. Este trabalho teve como objetivo a determinao dos corantes em ps para gelatina utilizando a CLAE. A escolha desse alimento para as anlises deve-se ao fato de ser um produto ampla e habitualmente consumido, principalmente pela populao infantil, e por ser um produto onde os corantes artificiais so tradicionalmente empregados em sua composio. PARTE EXPERIMENTAL Material Foram analisados vrios sabores de cinco marcas de gelatina comum e quatro marcas de gelatinas diet. Para cada marca/sabor de gelatina comum, foram analisados trs lotes diferentes, identificados pela data de fabricao apresentada na embalagem. As amostras de gelatina comum e diet foram preparadas homogeneizandose todo o contedo de duas embalagens em moinho de facas, com peneira de 60 mash. As anlises foram sempre realizadas em duplicata. Todos os produtos foram comprados em supermercados da regio de Campinas, So Paulo e Limeira, totalizando 76 amostras. Reagentes Os padres de corantes artificiais foram adquiridos atravs da Brastquio Imp. Ltda. O metanol utilizado com grau cromatogrfico (ominsolv), a soluo amoniacal e o acetato de amnio foram adqui-

*e-mail: helena@fea.unicamp.br

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ridos da Merck Brasil e cartuchos de sep-pak C18. A gua utilizada no preparo das fases mveis e das amostras foi purificada no sistema Milli-Q (Millipore). As fases mveis foram sempre filtradas em filtros Floupore (Millipore Hawp 0013) de 0,5 m de dimetro de poro e degaseificadas em banho ultra-snico. Equipamentos Aps a extrao as amostras foram centrifugadas em centrfuga marca Hitachi modelo Himac CR21. Para anlise em CLAE foi utilizado cromatgrafo a lquido HP srie 1050, com sistema de bombeamento isocrtico e vlvula injetora tipo Rheodyne e uma ala de amostragem de 20 L de capacidade. Um detector de arranjo de diodos (DAD) HP srie 1050, acoplado a um software HP Chemstation, que apresenta o recurso de visualizao, em at cinco diferentes comprimentos de onda em uma mesma corrida cromatogrfica, possibilitou a anlise de todos os corantes de forma simultnea. Para esse trabalho, utilizaram-se os mesmos comprimentos de onda propostos por Prado e Godoy1, 595 nm para os corantes azuis, 525 nm para os vermelhos e 450 nm para os amarelos. Foi utilizada como coluna analtica a Spherisorb ODS-2 de 150 x 4,6 mm d.i., 5 m (Sigma-aldrich, USA), protegida por uma coluna de guarda Micropore 30 x 4,6 mm d.i., C18, 10 m (Varian, USA). Mtodos Para a extrao dos corantes, pesou-se entre 4 a 5 g de amostra, previamente homogeneizada. Devido simplicidade da matriz as amostras foram simplesmente dissolvidas em gua quente (40 a 50 oC) e o volume ajustado com gua em balo volumtrico de 50 mL. Aps o ajuste de volume, cerca de 10 mL foram coletados e centrifugados por 10 min a uma rotao de 15.000 rpm. O sobrenadante foi filtrado em membrana fluoropore, HAWP 001300 (Millipore), com poros de 0,5 m e depois injetado no cromatgrafo. Etapa cromatogrfica Antes da injeo da amostra , a coluna era condicionada, por um perodo inicial de 12,5 min, a uma vazo de 0,5 mL/min, pela passagem de uma soluo de gua/metanol (70:30) adicionada de 0,08 mol/L de acetato de amnio. Imediatamente, a fase mvel era trocada por uma nova fase mvel constituda apenas de gua/metanol, nas mesmas propores, mas sem a presena do tampo. Com esta fase mvel os corantes so separados atravs de um sistema de eluio isocrtica, com uma vazo de 0,5 mL/min. O tempo necessrio para a separao dos oito corantes foi de 20 min. A coluna foi condicionada, novamente, pela passagem da fase mvel tamponada por um perodo de 12,5 min antes de ser acionada uma nova corrida. Deteco e identificao Os compostos foram detectados atravs do detector de arranjo de diodos (DAD) na regio do visvel. O recurso oferecido pelo software permitiu o registro grfico de cada cromatograma nos trs diferentes comprimentos de onda estabelecidos: 595 nm para os corantes azuis, para os vermelhos a 525 nm e os amarelos a 450 nm. Os corantes foram identificados atravs da comparao dos tempos de reteno obtidos com solues padro analisadas nas mesmas condies e pelos espectros de absoro obtidos pelo DAD. A adio de padres s amostras tambm foi usado como parmetro de identificao (co-cromatografia). A quantificao foi realizada por

padronizao externa, construindo curvas com 5 nveis de concentrao, sendo cada ponto representado pela mdia de trs determinaes20. RESULTADOS E DISCUSSO A simplicidade das matrizes permitiu que as amostras fossem apenas dissolvidas em gua quente, centrifugadas, filtradas e injetadas no cromatgrafo. A etapa de centrifugao suficiente para facilitar no processo de filtrao subseqente. A utilizao de sistema isocrtico com fase mvel tamponada, apresentou grande vantagem, principalmente pela no utilizao do par-inico e pelo pequeno tempo de condicionamento necessrio para o sistema cromatogrfico, apenas 12,5 min. O uso de uma fase mvel tamponada no condicionamento da coluna foi significativo, pois a presena do tampo melhorou a resoluo entre os corantes tartrazina, amaranto, azul de indigotina, ponceau 4R e amarelo crepsculo. Tais dados coincidem com os encontrados em sistemas isocrticos, mudando-se o comprimento de onda ou a fase mvel dos sistemas para a obteno de misturas de padres de corantes artificiais19. A fase mvel tamponada pode afetar de duas maneiras a afinidade do composto para com a fase estacionria: o tampo pode ser utilizado para suprir a ionizao; e/ou para reduzir a solubilidade do corante pela fase mvel18. Esses dados confirmaram a eficincia de eluentes tamponados na separao dos corantes artificiais16,18. Em testes preliminares, a utilizao de brometo de cetiltrimetilamnio (cetrimida) necessitou de um perodo equivalente a dois dias para condicionar todo o sistema1. Embora a tcnica de par-inico seja a mais recomendada para a anlise de corantes artificiais9,16,21, o uso desses compostos apresenta sempre o inconveniente de longos perodos de condicionamento. As composies qualitativa e quantitativa dos corantes artificiais presentes nas amostras so apresentadas nas Tabelas 1 e 2. Dos oitos corantes permitidos pela legislao brasileira, foram encontrados nas amostra analisadas apenas a tartrazina, o amarelo crepsculo, o amaranto, o azul de indigotina e o ponceau 4R. O amaranto foi o corante artificial quantitativamente mais utilizado pelos fabricantes de gelatina (Figura 1), e ainda esteve presente em um maior nmero de amostras analisadas. O ponceau 4R foi encontrado em apenas duas marcas de gelatina diet que, coincidentemente, s fabricam alimentos diet. Nas outras marcas de gelatina diet, que tambm fabricam p para gelatina comum, a composio nos dois tipos de produtos foi a mesma para os diferente sabores. As anlises estatsticas foram realizadas nas amostras de gelatina com a inteno de se verificar diferenas significativas na composio quantitativa de corantes para um mesmo sabor entre as diferentes marcas, Tabelas 3 e 4. Na maioria das amostras analisadas, ocorreu diferena significativa, nvel de 5% de significncia, nas quantidades de corantes artificiais utilizadas nos mesmos sabores de diferentes marcas, chegando em algumas situaes a se utilizar uma quantidade seis vezes maior de um determinado corante. J no caso das gelatinas diet, praticamente, no houve diferena significativa dos corantes utilizados entre os diferentes fabricantes. Trs lotes diferentes, de trs fabricantes diferentes, de p para gelatina comum foram analisados. Nas Tabelas 3 e 4, esto apresentadas as concentraes para cada lote das diferentes marcas, divididos por sabores. Pelo resultado da anlise de varincia verifica-se que a maioria dos fabricantes manteve um bom controle na utilizao desses aditivos. A Figura 2 mostra os cromatogramas de duas amostras de gelatina, uma normal e outra diet, nos trs comprimentos de onda.

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Tabela 1. Teores de corantes artificiais (mg/100 mL) em p para gelatina comum* Sabor Corante A Morango tartrazina amaranto amarelo crep. tartrazina amarelo crep. amaranto tartrazina indigotina amaranto indigotina tartrazina amaranto amarelo crep. tartrazina amarelo crep. tartrazina amarelo crep. amaranto tartrazina amarelo crep. 4,20,2a 3,40,2a 1,570,01a 0,530,02a 10,60,3a 1,610,04a 0,350,00a 3,20,4a 0,640,08a 3,00,2a 1,030,01a 0,500,02a 1,10,2a 0,430,07a 0,550,02a 1,310,07a 1,080,02a 2,130,05a B 3,70,3b 2,70,0b 2,30,3b 0,460,04a 6,60,5b 1,560,05a 0,600,02b 3,100,01a 0,490,05b Marca C 1,620,02c 3,50,5a 3,30,1c 3,30,5b 2,050,00b 0,670,03b 3,460,07a 0,460,09b D 1,400,06c 2,250,04b 2,90,2c 0,200,04c 4,790,01c 1,970,02b 0,200,01c 2,490,07b 0,220,03c 2,480,03b 1,50,1b 0,170,00b 0,50,3b E 0,80,1 4,140,07a 1,60,2c 0,80,2d 0,120,06c 3,00,2d

Abacaxi Cereja Limo Uva Framboesa

0,90,2 4,10,2b

Tangerina Pssego TuttiFrutti

1,050,09b 0,80,4a 4,20,3b 2,930,01b 0,850,07b

* mdias e estimativa do desvio padro (n=4); letras iguais na mesma linha indicam que no h diferena significativa ao nvel de 5% de significncia

Tabela 2. Teores de corantes artificiais (mg/100 mL) em p para gelatina diet* Sabor Corante A Morango Abacaxi Cereja Limo Framboesa amaranto amarelo crep. tartrazina amaranto ponceau 4R tartrazina indigotina amaranto amarelo crep. 5,660,08a 4,160,09a 10,70,4a 1,820,02a 0,540,06a 4,20,4a 5,80,1a D 2,00,9b 0,770,05b 2,130,04a 4,131,3b Marca F G 3,720,0c 1,920,08a 2,360,01c 6,81,1a 3,80,1b 1,10,3b 3,21,2a 6,51,9a 2,00,2a 4,60,7b 5,60,7a

4,340,02a

*mdias e estimativa de desvio padro (n=4); letras iguais na mesma linha indicam que no h diferena significativa ao nvel de 5% de significncia

Figura 1. Grficos das propores dos corantes artificiais utilizados no preparo de ps para gelatinas

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Tabela 3. Comparao dos teores de corantes artificiais (mg/100 mL) entre lotes de p para gelatina* Sabor Morango Corante tartrazina amarelo crepsculo Marca Lote 1 Lote 2 Lote 3

E 0,80,1a 0,750,02a 0,890,00a A 3,40,2a 3,390,07a 3,710,01a B 2,70,0a 3,10,2b 3,00,2b C 3,50,5a 3,250,08a 3,20,2a D 2,250,04a 3,30,3b 3,250,00b E 1,60,2a 2,180,03b 1,800,04a amaranto A 4,20,2a 4,20,3a 3,830,04a B 3,70,3a 4,30,1b 4,140,04b C 1,620,02a 1,40,2b 1,40,1b D 1,400,06a 1,690,02b 1,700,1b E 4,140,07a 4,30,4a 4,30,2a Abacaxi tartrazina A 1,57+0,02a 1,50,1a 1,40,1a B 2,3+0,3a 2,20,4a 2,230,09a C 3,3+0,5a 3,50,5a 3,20,1a D 2,9+0,3a 2,60,1a 2,70,3a E 0,8+0,2a 0,890,01a 0,70,2a amarelo crepsculo A 0,530,03a 0,590,02a 0,450,01a B 0,460,05a 0,400,05a 0,410,07a C 0,30,1a 0,100,05b 0,210,03c D 0,200,05a 0,190,05a 0,230,00a E 0,120,08a 0,110,07a 0,070,00a Limo tartrazina A 1,610,04a 1,630,01a 1,580,07a B 1,560,05a 1,610,02a 1,650,00a C 2,050,00a 1,60,1b 2,130,07a D 1,970,02a 1,70,1a 1,530,03b Cereja azul de indigotina A 0,350,00a 0,410,02a 0,720,03b B 0,600,02a 0,550,03a 1,050,02b C 0,670,03a 0,50,2a 0,210,03b D 0,200,01a 0,230,02a 0,600,00b amaranto A 10,60,3a 10,40,7a 9,90,3a B 6,60,5a 6,80,2a 6,840,07a D 4,790,01a 5,10,2a 6,20,4b E 3,00,2a 1,70,3b 2,80,2a *mdias e estimativa de desvio padro (n=4); letras iguais na mesma linha indicam que no h diferena significativa, nvel de 5% de significncia Tabela 4. Comparao dos teores de corantes artificiais (mg/100 mL) entre lotes de p para gelatina* Sabor Pssego Corante tartrazina Marca Lote 1 Lote 2 Lote 3

A 0,430,09a 0,390,04a 0,380,06a E 1,050,09a 1,10,2a 2,280,01b amarelo crepsculo A 0,550,02a 0,390,04b 0,380,06b E 0,80,4a 0,070,00a 0,120,00a Uva amaranto A 3,20,4a 2,40,4b 2,140,05b B 3,100,02a 2,190,07b 3,790,01c C 3,460,07a 3,50,7a 3,00,1b D 2,490,07a 3,40,2b 2,40,2a azul de indigotina A 0,640,08a 0,460,04b 0,710,07a B 0,490,05a 0,540,07a 0,720,02b C 0,460,09a 0,170,03b 0,220,00b D 0,220,04a 0,270,02a 0,210,02a Tutti-Frutti tartrazina A 1,080,02a 1,070,06a 0,80,3b E 2,930,01a 3,170,09a 3,20,3a amarelo crepsculo A 2,130,05a 2,20*0,04a 1,90,7a E 0,850,07a 0,90,1a 0,790,02a amaranto A 1,310,07a 1,40,2a 0,90,2b E 4,20,3a 4,90,3a 4,70,7a Framboesa tartrazina E 0,90,2a 0,840,04a 0,410,02b amarelo crepsculo A 1,030,01a 1,40,4b 1,460,02b D 1,50,2a 1,60,2a 1,40,3a amaranto A 3,00,2a 3,150,08a 2,850,01a D 2,480,04a 3,400,03b 2,730,03c E 3,190,03a 3,190,03a 3,30,2a Tangerina tartrazina A 0,500,02a 0,470,06a 0,420,07a D 0,140,00a 0,170,04a 0,18+0,03a amarelo crepsculo A 1,10,2a 1,270,07b 1,31+0,01b D 0,50,3a 0,430,01a 0,40,1a *mdias e estimativa de desvio padro (n=4); letras iguais na mesma linha indicam que no h diferena significativa, nvel de 5% de significncia

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Comparando-se os teores de corantes entre as gelatinas comum e diet, observou-se uma tendncia do uso de quantidades maiores em produtos diet. A composio qualitativa e quantitativa encontrada nos diferentes lotes para cada fabricante mostrou o bom controle na utilizao dos corantes sintticos. Em vista dos resultados obtidos, a metodologia aqui aplicada mostrou-se bastante satisfatria, demonstrando um bom potencial para a sua aplicao em outros tipos de produtos alimentcios. REFERNCIAS
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Figura 2. Perfis cromatogrficos nos trs comprimentos de onda de leitura para: (a) gelatina comum sabor framboesa; (b) gelatina diet sabor abacaxi. Condies cromatogrficas descritas no texto

CONCLUSES Na maioria das amostras de gelatina analisadas o limite estabelecido pela legislao brasileira no foi ultrapassado. Somente em duas amostras de gelatina sabor cereja, fabricante A, foram encontrados nveis um pouco superiores. Tambm no foram encontrados misturas de mais de trs corantes e corantes no permitidos. O amaranto foi o corante quantitativamente mais encontrado, estando presente em maior nmero de amostras. O ponceau 4R foi encontrado apenas nas amostras diet.