Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Dr.

Alejandro Leal La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingls de "polymerase chain reaction") es un mtodo de amplificacin in vitro de segmentos de ADN que fue ideado por Kary Mullis a mediados de la dcada de los 80. Desde entonces el anlisis de la base molecular de la variacin biolgica a nivel del material gentico se ha facilitado enormemente, pues sin necesidad de pasos previos de clonacin, se pueden obtener cantidades de ADN de una regin especfica del genoma a partir de una disolucin compleja de ADN para su posterior caracterizacin por diversos mtodos. Antes de la PCR, la obtencin de cantidades suficientes de una regin especfica del genoma involucraba una serie de pasos previos: 1. la formacin de bibliotecas genmicas: cortar el ADN del genoma en cuestin, introducir los segmentos resultantes en vectores de clonacin plsmidos o virus modificados- que servan para transformar bacterias en las que estos se multiplican, 2. tamizaje de la biblioteca genmica en bsqueda de la regin de inters con sondas -segmentos de ADN obtenidos previamente mediante diversos mtodos, cuya secuencia sirve para "pescar" a su regin de secuencia homloga o complementaria -hibridar-, de entre el resto de secuencias presentes en la biblioteca, 3. Clonar el segmento: tomar muestras de la colonia que contiene el segmento de inters y multiplicarla en el medio de cultivo adecuado, de esta forma se hacen mltiples copias -clonacin- del segmento, 4. Purificar el segmento: separar el ADN del vector del ADN de la bacteria y luego escindir el fragmento de inters del vector y purificarlo. Cada uno de los pasos anteriores es muy laborioso y requiere de la adquisicin de destrezas de quien los efecta. Es importante recalcar, que estos pasos son an la base del anlisis molecular de cualquier especie, pues es a partir de ellos que se logra el conocimiento bsico sobre las secuencias de las diferentes regiones del genoma, lo que es la base de la PCR. La ventaja de la PCR radica en que una vez que se conoce la secuencia de la regin de inters se prescinde de posteriores pasos de clonacin. La PCR se basa en ciertas caractersticas de la duplicacin in vivo del ADN; la primera es que la sntesis de nuevas cadenas de ADN es un proceso catalizado enzimticamente por la ADN polimerasa y la segunda es la necesidad de la ADN polimerasa de iniciadores (primers) para que se pueda ligar a la hebra de ADN que le servir de base o molde para sintetizar la nueva hebra. Este requerimiento es el

que se explota para lograr la sntesis especfica de un segmento determinado del genoma a partir de una disolucin de ADN extrado directamente de las clulas. Si se conoce la secuencia de la regin de inters, se pueden sintetizar estos iniciadores y luego en repetidos ciclos de amplificacin, aumentar exponencialmente el nmero de copias de la regin, pues cada copia recin sintetizada, sirve de molde para la sntesis de otra en el ciclo siguiente. Para ejemplificar este hecho, supngase que se empieza a amplificar un segmento a partir de una sola molcula de ADN, esto es, de dos hebras. La PCR se desarrolla en tres pasos: 1. Desnaturalizacin de la doble hlice, esto es separacin de las dos hebras mediante el rompimiento de los puentes de hidrgeno que las mantiene unidas, lo que se logra calentando al ADN de doble banda hasta alcanzar temperaturas superiores a los 90C. 2. Alineamiento de los iniciadores diseados para la regin de inters. Para lo cual, la temperatura se baja a una que sea ptima para que los iniciadores hibriden con sus regiones homlogas. Los iniciadores se disean en pares ya que ambas hebras deben servir como moldes para la sntesis. 3. Extensin o sntesis por polimerizacin de las nuevas molculas. La temperatura se aumenta para despegar iniciadores hibridados con regiones de homologa parcial de la secuencia, dejando unidos slo aqullos con homologa absoluta y permitir que la polimerasa catalice la reaccin de sntesis del nuevo segmento. En este punto, se termina con dos copias del segmento, la que sirvi como base de la sntesis y la recin sintetizada y a su vez, nuevos sitios para que se coloque el iniciador son generados con cada cadena de ADN nueva. El ciclo se repite con el doble de molculas base que en el anterior, por lo que al final del mismo se tienen cuatro copias. Si el proceso se repite por tercera vez, al final se obtienen ocho copias y as sucesivamente. Al cabo de n ciclos se tienen 2n copias del segmento de inters a partir de una nica doble hlice de ADN; entonces, luego de 10 ciclos se tienen 1 024 copias, de 15 ciclos 32 768 copias, al cabo de 20 ciclos 1 048 576 copias, etc. Las amplificaciones se llevan a cabo en un tubo de polipropileno, de los llamados tubos Eppendorf, al que se adicionan los componentes esenciales para la reaccin: ADN molde, iniciadores, ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), los cuatro desoxirribonuletidos trifosfato (dNTPs), Mg+2 y la solucin amortiguadora (buffer) apropiada, todo en solucin acuosa. El tubo se coloca en un termociclador, un aparato programable que controla la temperatura, la duracin de los pasos y el nmero de ciclos de amplificacin.

Fig. 1. Esquema de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Como se puede inferir de lo anterior, la tcnica es muy sensible, permite amplificar secuencias especficas a partir de muy poco material inicial. Estas caractersticas hacen que la PCR tenga mltiples aplicaciones en diversos campos, aparte de la biologa molecular, como el forense, la arqueologa, la infectologa, etc.. Se puede usar para diagnosticar la presencia de un virus o bacteria en un tejido, para identificar el origen de una muestra, p.ej. pelo o semen, en casos de delitos, identificar la especie de la que proviene un determinado tejido, para monitorear la terapia en algunos tipos de cncer, efectuar anlisis de ligamiento para encontrar genes en el mapa genmico, estudiar evolucin molecular, determinar la contaminacin de alimentos o agua, etc. Entre las demostraciones ms espectaculares del poder de esta tcnica est el haber servido para identificar molecularmente una planta de magnolia, del Mioceno. Con PCR se amplificaron y luego se analizaron en detalle genes de 18 millones de aos de edad. Tambin se han podido estudiar las relaciones evolutivas de mamuts congelados, momias, restos del hombre de Neandertal etc. En esta prctica se montar una reaccin de PCR, se mostrar cmo funciona un termociclador y se analizarn algunos resultados de la aplicacin de esta tcnica.

En la presenta prctica se determinar el genotipo de cada estudiante para la insercin polimrfica de un elemento Alu Amplificacin de insercin polimrfica de Alu

Una gran porcin de los genomas eucariticos est formada por secuencias de ADN repetitivo que se encuentran dispersas por todo el genoma. Muchas de ellas son secuencias transponibles, secuencias mviles que pueden moverse a otras localizaciones dentro del genoma. Algunas de estas secuencias son las conocidas como SINEs y LINEs. Estas secuencias representan una parte importante del genoma humano (alrededor de un 10%) y se caracterizan por estar formadas por una mezcla del 70 por ciento de secuencias nicas y del 30 por ciento de secuencias repetitivas. El grupo de los elementos dispersos largos o LINEs representa una categora de secuencias de ADN repetitivas transponibles. En humanos, el ejemplo ms destacado es el de la familia L1. Los miembros de esta familia tienen unos 6400pb de longitud y se estima que hay hasta 100 000 en el genoma. El mecanismo de transposicin de estos elementos es muy similar al de los retrovirus (depende de la accin de la transcriptasa reversa), razn por la cual se les llama retrotransposones. Los elementos dispersos cortos, SINE por sus siglas en ingls (short interspersed elements) tienen menos de 500pb de longitud. En un genoma humano se pueden encontrar 500 000 o ms. Los SINEs humanos mejor caracterizados son un conjunto de secuencias muy relacionadas denominadas familia Alu (el nombre se debe a la presencia de sitios de restriccin para la endonucleasa AluI). Los miembros de esta familia, que tambin se encuentran en otros mamferos, tienen entre 200 y 300pb de longitud y se encuentran dispersos bastante uniformemente por todo el genoma, tanto entre genes como dentro de ellos. En humanos, esta familia comprende ms del 5% del genoma completo. Los genes en eucariotas estn compuestos por exones e intrones. Los exones constituyen las regiones codificantes de un gen, que codifican para productos con funciones importantes. Por esta razn, las secuencias exnicas varan poco entre individuos. Por el contrario, los intrones (segmentos del gen que son eliminados por splicing y no llegan a salir del ncleo) varan a menudo entre individuos, tanto en tamao como en secuencia. Son las secuencias no codificantes como las regiones entre genes y los intrones, que permiten estudiar la diversidad gentica entre individuos y son la base de la identificacin de individuos (por ejemplo pruebas de paternidad) y la gentica de poblaciones.

Esta prctica consiste en un tamizaje sencillo basado en la tcnica de PCR para la deteccin de una secuencia Alu dentro del locus PV92, en el cromosoma 16. Esta insercin de Alu est ubicada en un intrn y es dimrfica (presente en algunos individuos y en otros no, Figura 3). Algunas personas tienen la insercin en el locus PV92 en uno de sus dos cromosomas 16, otros la tienen en ambos homlogos, y algunos no la tienen en ninguno. La presencia o ausencia de la insercin se detecta por una reaccin de PCR, seguida de electroforesis en un gel de agarosa. En esta prctica los estudiantes aislarn su propio ADN genmico. Utilizarn iniciadores que flanquean la insercin Alu (de 300pb) y 641pb del locus PV92. Como resultado los alelos con la insercin generarn un producto de 941pb y los alelos sin la insercin un fragmento de 641pb. La electroforesis de los productos en un gel de agarosa permite distinguir los tres genotipos posibles (+/+, +/-. -/-).

Fig. 3. La presencia o ausencia de la insercin Alu en el locus PV92 del cromosoma 16

Procedimiento Leccin 1: Extraccin de ADN

Leccin 2: Amplificacin por PCR