Gonzlez Peraez Santiago Mtodo de Lowry

Bioqumica

El mtodo de Lowry (1951) utiliza tres sistemas para producir coloracin por la presencia de protenas. En primer lugar, el Cu+, forma complejos de coordinacin con dos enlaces peptdicos consecutivos de las protenas, dando lugar a un compuesto coloreado azul de manera similar al mtodo del Biuret-. En segundo lugar, este compuesto es capaz de reducir al reactivo de Folin-Ciocalteu (cido fosfotngstico y fosfomolbdico), dando un color ms azulado. Por ltimo, el reactivo de Folin-Ciocalteu tambin reacciona con los restos tirosinil (residuos de tirosina) de la cadena polipeptdica, produciendo asimismo un color azul por la reduccin del fosfomolibdato en medio bsico.

El espectro de absorcin no corresponde a una nica sustancia, por lo que puede emplearse un amplio margen de longitudes de onda, entre 500 y 700 nm, para la lectura de la absorbancia. Su principal ventaja reside en la sensibilidad (es capaz de detectar cantidades en torno a los 10 g de protena). Al ser una reaccin en dos fases no se ha utilizado en analizadores automticos. Por otra parte, ciertos frmacos interfieren en el proceso y por ello el mtodo no suele utilizarse en los laboratorios clnicos. Mtodo de Bradford Muchas protenas son capaces de fijar colorantes en su superficie. La fijacin del colorante va acompaada muchas veces por un cambio en las propiedades espectroscpicas del mismo (una variacin en el mximo de absorcin, por ejemplo) con el consiguiente cambio de color que da la formacin del complejo frente al del colorante no unido a la protena.

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Este mtodo se fundamenta en que la unin de las protenas al colorante azul brillante de Coomassie G-250 provoca un desplazamiento del mximo de absorcin de este compuesto, desde 465 nm a 595 nm. Por lo tanto las medidas de absorbancia del complejo protena-colorante se realizarn a 595 nm. El mtodo es extremadamente sensible, detectando cantidades de 1 g o incluso inferiores.

Su principal inconveniente radica en que el colorante no se fija por igual a todas las protenas, con lo cual sus resultados no son homogneos. No obstante, su sencillez y su sensibilidad han hecho de este mtodo uno de los ms utilizados en el laboratorio de Bioqumica. Cuantificacin espectrofotomtrica Los polipptidos absorben fuertemente en la regin ultravioleta (UV) del espectro (=200 a 400 nm) sobre todo debido a que sus cadenas laterales aromticas (las de Phe, Trp y Try) tienen coeficientes de extincin molar altos en esta regin del espectro. Sin embargo, los polipptidos no absorben luz visible (=400-800 nm) por lo que son incoloros. A pesar de ello, si una protena tiene un cromforo que absorbe en la regin visible del espectro, esta absorbancia puede utilizarse para detectar su presencia en una mezcla de protenas.

Espectro de absorbancia UV de los tres aminocidos aromticos fenilalanina, triptfano y tirosina.

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Para seguir la purificacin de una protena, es importante medir su cantidad total en cada etapa del proceso. La espectroscopa de absorbancia a 280 nm es una manera conveniente de hacerlo. Los mtodos espectroscpicos son slo moderadamente sensibles para las protenas; pueden detectar un mnimo de 50 a 100 g de protena por mL. Espectrometra de masas MALDI-TOF Las tcnicas de espectrometra de masas analizan la masa de molculas de muestras ionizadas. La espectrometra de masas MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time of light) se basa en que las macromolculas biolgicas se colocan en una matriz cristalina de molculas orgnicas cono el cido dihidroxibenzoico. A continuacin se aplica un pulso corto de lser sobre la muestra. La matriz cristalina absorbe una gran parte de energa de radiacin y de esta manera protege a la protena del disparo. El estmulo del lser produce una fuerte perturbacin y expansin de la red de la matriz. Las molculas cargadas de la matriz y las protenas colocadas all pasan del estado slido a un estado gaseoso e ionizado que denominamos fuente de iones. En frente de la placa de muestra se encuentra un electrodo que acelera los iones libres (en funcin de la polaridad se pueden acelerar de forma selectiva aniones o cationes). En el corto camino hacia el electrodo, los iones se aceleran a distinta velocidad dependiendo de su relacin masa-carga. Tras esta aceleracin, los iones atraviesan un campo nulo en el cual se separan segn su distinta velocidad. Al final de este analizador de tiempo de vuelo (en ingls time of flight, TOF) se mide electrnicamente el tiempo que las molculas necesitan desde la fuente de iones hasta el detector. ste est compuesto por un multiplicador de electrones secundarios en el que las partculas cargadas desprenden una cascada de electrones. Mediante la comparacin con molculas de referencia de masa conocida, se puede determinar con mucha exactitud la masa de una partcula a partir del tiempo de vuelo. Con esta tcnica se consigue la huella dactilar de la protena (peptidemass fingerprint), es decir, se obtiene una lista de las masas de los pptidos, producto de su digestin: esta huella se compara seguidamente de los patrones de digestin tericos de las protenas almacenadas en las bases de datos, a fin de identificar la protena.

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Matriz, fragmentos de protena colocados

Pulso de lser

protenas pequeas protenas grandes

BIBLIOGRAFIA Battaner Arias, Enrique (2000). Biomolculas. Ediciones Universidad de Salamanca. Espaa. Pg. 265 Mijn de la Torre, Alberto (2002). Tcnicas y mtodos de investigacin en nutricin humana. Editorial Glosa. Espaa. Pg. 45. Mller-Sterl, Werner (2008). Bioqumica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la vida. Editorial Revert. Espaa. Pp. 118-119. Roca, Pilar; Oliver, Jordi; Rodrguez, Ana Mara (2003). Bioqumica. Tcnicas y mtodos. Editorial Hlice. Espaa. Pp. 157-158. Voet, Donald; Voet, Judith G.; Pratt, Charlotte (2009). Fundamentos de Bioqumica: la vida a nivel molecular. Editorial Mdica Panamericana. Argentina. Pg. 100