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CARACTERIZACIN DE LA EXPRESIN DEL GEN CAPN-10 EN CELULAS BLANCAS DE SANGRE PERIFRICA Y EN LA LNEA CELULAR 293T
ab

Eduardo Lpez Ordua, Jaime Garca-Mena, Jess Kumate y Miguel Cruz Lpez.. Unidad de investigacin Mdica en Bioqumica, Hospital de Especialidades Centro Mdico. Nacional Siglo XXI, IMSS; Avenida Cuauhtemoc N 330, Col. Doctores, Mxico D.F., C.P.. 06725,Tel. b 56276900, ext. 21477 Tel. directo: 57612358, e-mail: mcruzl@yahoo.com. Laboratorio 6, Departamento de Gentica y Biologa Molecular, CINVESTAV; Avenida Instituto Politcnico Nacional 2508, Colonia Zacatenco, Mxico D.F. Tel. 50613800, ext. 5328, e-mail: C jgmena@cinvestav.mx, Fundacin IMSS

RESUMEN
Se han estudiado ms de 250 genes candidato sin la identificacin de algn gen marcador predominante a diabetes tipo 2 (DT2). De estos genes el que codifica para la calpaina 10 humana (CAPN-10), parece tener mayor relacin con DT2. El polimorfismo SNP-43 se ha considerado un marcador de asociacin y riesgo en poblacin mexiconorteamericana. El SNp43 G/G se ha relacionado con niveles disminuidos de mRNA en msculo de pacientes con DT2 y con alteraciones en diversos parmetros bioqumicos. Hasta la fecha no se ha estudiado la expresin de genes relacionados con el desarrollo de DT2 en clulas blancas de sangre perifrica. Objetivos: estudiar la relacin del SNP-43 y su contribucin a la alteracin de la estabilidad del mRNA de CAPN-10 en linfocitos de sangre perifrica, de pacientes DT2 y sujetos sanos. Determinar el tiempo de vida media de dicho gen en la lnea celular 293T, para tratar de encontrar una relacin entre el SNP-43 y la estabilidad de los mensajeros de CAPN-10 como un posible mecanismo molecular de la contribucin de CAPN-10 en la patognesis de la DT2. Metodologa: En doce individuos, 6 sujetos sanos (3 GG y 3 AA para el SNP-43) y 6 pacientes DT2 (3 GG y 3 AA para el SNP-43) se determin por RT-PCR la presencia de un fragmento de 400 pb que incluye los exones 3 y 4, comunes a 6 de los 8 transcritos reportados para CAPN10. Conclusiones: La expresin del gen CAPN10 en clulas blancas de sangre perifrica es baja, tanto en sujetos sanos como en pacientes DT2, independiente de la presencia del SNP43 y sin afectar el orden de unin de los exones 3 y 4. El tiempo de vida media determinado en la lnea celular 293T para CAPN-10 fue de 4 horas contrastado contra el tiempo de vida media de 5.65 horas para beta actina.
Palabras clave: Calpaina 10, expresin, vida media Agradecimientos: Trabajo financiado por CINVESTAV y FOFOI-IMSS.

INTRODUCCIN
Hasta ahora, ms de 250 genes candidato han sido estudiados para demostrar su asociacin con el desarrollo de DT2; estos genes codifican protenas involucradas en la sealizacin de la insulina, transporte de glucosa, sntesis de glucgeno, sntesis y absorcin de cidos grasos, diferenciacin adipoctica y factores transcripcionales entre otros (Florez JC,2003). Uno de los genes ms promisorios y cuestionados de asociacin es el gen de la CAPN10 localizado dentro de la regin NIDDM1. Este es el primer gen localizado por posicionamiento clonal estudiado en 170 familias, postulndose como candidato para conferir mayor susceptibilidad a diabetes tipo 2 en Mxico-Norteamericanos (Horikawa Y, 2001). El primer locus de susceptibilidad de CAPN10 fue descrito en la comunidad Mxico-Americana de Starr County, Texas, con

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varios polimorfismos asociados como riesgo a padecer diabetes. Los polimorfismos ms relevantes son las variantes en los sitios denominados SNP-43, INS/DEL19 y SNP-63 (Horikawa Y, 2000; Evans JC 2001; Horikawa Y, 2003). De acuerdo con el primer reporte, la variacin en el gen CAPN10 conocida como SNP-43 (UCSNP-43, GA), incrementa un 14% el riesgo atribuible para desarrollar DT2 en poblacin mexico-americana (Horikawa Y, 2000). Sin embargo, otros estudios no apoyan esta observacin original (Turner MD, 2005). La no replicacin de estos estudios entre diferentes poblaciones puede simplemente explicarse a los diferentes niveles de mezcla gnica (addmixture) o bien por sesgos en las aproximaciones estadsticas o nmero de individuos bajo estudio (Turner MD, 2005). Investigaciones realizadas en el grupo tnico de los indios Pima, revel que el genotipo G/G para el SNP-43 se encuentra asociado con una disminucin en el recambio de insulina y prdida gradual en el control de la glucosa (Horikawa Y, 2000; Yang X, 2001). Adems estos individuos homocigotos G/G tuvieron niveles reducidos de RNAm de CAPN10 en msculo esqueltico (Baier LJ, 2000; Yang X, 2001).

OBJETIVOS
Genotipificar en una muestra de poblacin de la ciudad de Mxico el polimorfismo SNP-43. Analizar la relacin del SNP-43 y su posible contribucin a la alteracin de la estabilidad del mRNA de CAPN-10 en linfocitos de sangre perifrica, de pacientes con DT2 y sujetos sanos. Determinar el tiempo de vida media de dicho gen en la lnea celular 293T.

MATERIALES Y MTODOS.
Sujetos de Estudio. Los individuos reclutados para estos estudios estn radicados en la ciudad de Mxico. La muestra consisti de 36 individuos divididos en dos categoras fenotpicas: 18 pacientes diagnosticados con diabetes tipo 2 (SDT2) y 18 sujetos sanos (SS) no relacionados y sin antecedentes de la enfermedad en al menos 2 generaciones previas. Los participantes fueron citados para la evaluacin clnica y toma de muestra sangunea (12 horas de ayuno), para anlisis bioqumicos y extraccin de cidos nuclicos. Se evaluaron los siguientes analitos: glucosa en ayunas, colesterol total, colesterol unido a protenas de alta y baja densidad (HDL y LDL) y triglicridos. Los ensayos bioqumicos de todos los individuos fueron realizados en el equipo automatizado ILab 350 (Instrumentation Laboratory, IL). En la misma cita todos los participantes fueron revisados y sujetos a entrevista por un mdico endocrinlogo y registrados sus datos antropomtricos (estatura, peso, ndice de masa corporal) as como la presin arterial. A partir de ste grupo se seleccionaron 6 individuos de cada categora para realizar los estudios de expresin de CAPN10. Lneas Celulares. Se emple la lnea celular 293T epiteliales, provenientes de rin a su vez derivada de la 293T/17 (ATCC CRL-11268). Las clulas 293T fueron cultivadas en botellas de 75cm2 con 10ml de medio DMEM (Gibco, Laboratories) suplementado con glutamina 4mM, 1.5 g/L NaHCO3, 25mM de glucosa y 10% de suero fetal bovino. Esta lnea celular fue crecida a una temperatura de 37 C y con una atmsfera de 5% de CO2, el cambio de medio se realiz cada 48 horas de acuerdo a las especificaciones de la ATCC, realizando tres subcultivos previos al estudio de decaimiento. Se emple el mtodo de exclusin de azul de Tripano (Sigma) para determinar la viabilidad celular. Extraccin de DNA genmico y Genotipificacin del SNP-43. A partir de 4 ml de sangre tomada con el sistema Vacutainer (Becton-Dickinson) con EDTA como anticoagulante, se extrajo el DNA genmico empleando el sistema comercial QIAamp

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(Qiagen), siguiendo las instrucciones de la empresa fabricante. La integridad del DNA fue verificada por medio de la medicin espectrofotomtrica a 260/280 nm y por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% teidos con bromuro de etidio y documentados digitalmente. La deteccin del SNP-43 fue realizada para todas las muestras de DNA, incluida la lnea celular, empleando la sonda Taqman (Nmero de ensayo: C__27483762_10) que detecta el UCSNP-43 (SNP-43 G/A) localizado en la regin rs3792267 del gen CAPN10. La discriminacin allica se realiz por medio del software del equipo automatizado 7900 HT (Applied Biosystems). La secuencia de la sonda fue la siguiente: 5-GCT CAC GCT TGC TGT GAA GTA AGG C [A/G] TTT GAA GGT GAG GCT AAG CCT TGA C-3. Extraccin de RNA total y cuantificacin de los mensajeros de CAPN10. El RNA total fue purificado a partir de 1.0X107 clulas blancas de sangre perifrica y a partir de 2.2X106 clulas cultivadas (293T), empleando el sistema comercial QIAamp RNA Blood, siguiendo el protocolo proporcionado por la empresa (Qiagen). El RNA extrado fue tratado con DNasa Q (Promega) y la integridad fue verificada por electroforesis en gel de agarosa al 1.0% y espectrofotometra a 260/280 nm. Se realiz la sntesis de cDNA a partir de 1g de RNA total, tanto de los sujetos participantes como de las lneas celulares, empleando la enzima Super Script II (Invitrogen) e iniciadores de hexmeros al azar (random primers). La deteccin de los transcritos de CAPN10 fue realizada por PCR en tiempo real empleando el sistema DNA Fast Start SYBR-green (Roche) y el sistema de deteccin Light Cycler 2.0 (Roche). Los iniciadores para el exn 3 (197 pb) fueron E3F 5-GTC ATT CCT CCG GGA CAG-3 y E3R 5-TTG GCG TAG ACC TTT TCC AG-3, para exon 4 (190 bp) E4F 5- GGG TCC TAC GAG CAC CTG T-3 y E4R 5-AGC AGC TGA TCA GAC ACT GG-3. Con los iniciadores E3F y E4R es posible amplificar un fragmento de 387 pb, el cul flanquea a los exones 3 y 4 del gen CAPN10. El empleo de este par de iniciadores permite diferenciar la amplificacin de CAPN10 a partir de RNAm o cDNA de una amplificacin de DNA genmico por diferencia en el tamao de los fragmentos, ya que el producto de amplificacin a partir de DNA genmico corresponde a un fragmento de 1600 pb al incluir al intrn 3. Tambin se determin la vida media de beta actina. Los iniciadores diseados amplifican un fragmento de 597 pb, siendo la secuencia de los iniciadores la siguiente: BaF 5- CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3 y BaR 5-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3. Los fragmentos de 387 pb de CAPN10 conteniendo los exnes 3 y 4 y de 587 pb del fragmento de beta actina fueron amplificados y clonados en el vector pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen), para generar los plsmidos denominados pTopo-CAPN10-387 y pTopo-Bac-587 respectivamente. Diluciones seriales con un rango de 104 a 108 molculas de cada plsmido fueron empleadas para construir curvas estndar a partir de las cuales se calcul el nmero de copias para cada gen. Ensayo de decaimiento de RNAm de CAPN10. La lnea celular 293T fue cultivada de acuerdo a la descripcin previa y la vida media de los transcritos de CAPN10 fue determinada como una estimacin a partir del decaimiento del nmero de copias del fragmento exn 4 en la lnea celular tratada con 1 M de actinomicina D (Sigma). Veinticuatro horas previas al tratamiento las clulas fueron contadas y transferidas de las botellas de 75cm2 a placas de 10cm2 en alcuotas de 2.2X106 clulas cada una. Bajo estas condiciones se realizaron 3 experimentos independientes con recoleccin de clulas cada 2 horas durante 8 horas y aislamiento de RNA total. Anlisis estadstico. Todos los valores bioqumicos y antropomtricos fueron expresados como promedio una desviacin estndar. Las diferencias estadsticamente significativas entre los grupos fenotpicos (SDT2 y SS) fueron determinados por medio de una prueba de ANOVA.

2 Congreso Nacional de Qumica Mdica RESULTADOS

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La muestra bajo estudio consisti de 36 individuos. La tabla 1 resume los parmetros bioqumicos y antropomtricos. Podemos resaltar el hecho de que la hiperglucema caracterstica de la enfermedad, mientras que el grupo SS se encuentra dentro de lo normal y ausencia de resistencia perifrica a la insulina. Los niveles de colesterol total no presentaron diferencias estadsticamente significativas entre los grupos contrastados. El IMC para los dos grupos bajo estudio mostraron encontrarse por arriba de de 25, lo cual nos esta indicando que muestra se encuentra con sobrepeso y obesidad moderada principalmente en el grupo de sujetos SDT2. Los niveles de insulina y la resistencia a la insulina en tejidos perifricos son concordantes con cada uno de los grupos, observndose los mayores niveles de insulina y resistencia en los sujetos SDT2 y los niveles normales de insulina y ausencia de resistencia a la misma en individuos SS. Estas diferencias observadas en estos parmetros bioqumicos y antropomtricos nos permiten establecer la adecuada clasificacin de los individuos en las dos categoras fenotpicas.
Caracterstica Edad (aos) 2 IMC (kg/m ) PAD (mmHg) PAS (mmHg) Glucosa (mg/dl)* Colesterol (mg/dl) LDL (mg/dl)* HDL (mg/dl) TG (mg/dl) T2D 51.02 27.81 123.93 83.94 172.07 221.48 139.31 45.12 229.62 SD 7.41 3.80 16.05 16.75 72.43 46.10 40.72 11.74 129.51 HT2DNB 50.93 26.96 118.40 75.83 86.70 207.43 80.71 41.19 209.30 SD 5.06 3.31 8.93 7.01 5.38 38.22 27.29 18.55 54.00

Tabla 1. Perfiles antropomtricos y bioqumicos de la muestra.*Diferencia significativa p<0.05

Se genotipificaron los 36 individuos divididos en las dos categoras fenotpicas el SNP-43 de CAPN10 encontrndose una frecuencia de 0.65 para el alelo G y 0.35 para el alelo A en los individuos SDT2, y para los individuos SS de 0.58 para el alelo G y 0.42 para el alelo A. Como se muestra en la figura 1A CAPN10 se expresa en clulas blancas de sangre perifrica, pudindose diferenciar los productos de 190 (exon 3), 197 (exon 4) y 387 (exn 3-4) a partir de cDNA y o bien un fragmento de 1300 pb a partir de DNA genmico. En 12 individuos, 6 SDT2 y 6 SS, se examin si el orden de los exones despus del splicing se encontraba afectado por el SNP-43 en su versin G/G. El fragmento de 387 pb pudo detectarse en los 12 individuos analizados independientemente del alelo portado para el SNP-43 o el fenotipo (figura 1B). Para abordar si el genotipo G/G afectaba la estabilidad de los mensajeros, la lnea celular 293T fue genotipificada para el SNP-43, determinndose su homocigocidad para el alelo G. La vida media observada para CAPN10 en clulas 293T fue de t = 8.00 y la para beta actina t=6.35.

DISCUSIN
En el presente trabajo, hemos demostrado la expresin de CAPN10 en clulas blancas de sangre perifrica. Nuestros datos sugieren que la expresin de CAPN10 no se ve afectada en el corte del intrn 3 y la fusin de los exones 3 y 4, por la presencia del genotipo G/G para el SNP-43. Pudimos demostrar el apropiado splicing del intron 3, tanto en sujetos SDT2 y SS de forma independiente al genotipo G/G para el SNP-43 por deteccin del fragmento de 387 pb, mismo que fue clonado y secuenciado, corroborar el orden adecuado de los exones fusionados. La vida media de los transcritos de CAPN10 en la lnea celular 293T, con genotipo G/G, fue de 8.00 horas,

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el cual es indicativo de que no afecta la estabilidad del pre-mRNA y mRNA, ya que esta vida media fue realizada a partir de cDNA sintetizado con random primers, lo que nos permiti evaluar el la estabilidad de los transcritos de CAPN10 durante todo el procesamiento del mismo.

Figura 1. Expresin de CAPN10 en clulas blancas de sangre perifrica. A) Deteccin de los productos de PCR de 190 pb (lnea 1) para el exon 3, 197 pb (lnea 2) para el exon 4 y 387 pb (lnea 3) para la fusin de los exones 3-4. En la lnea 4 se observa el produto de 1300 pb a partir de DNA genmico que incluye al intron 3. B) Deteccin del producto de PCR de 387 pb a partir de 4 individuos SDT2, 2 individuos SNP-43 A/A (lneas 1 y 2) y 2 individuos SNP-43 G/G (lneas 3 y 4); y de 4 individuos SS, 2 individuos SNP-43 A/A (lneas 7 y 8) y 2 individuos SNP-43 G/G (9 y 10). Como controles se emplearon las clulas 293T y jurkat (lneas 5, 6 y 11,12).

CONCLUSIONES
Queda demostrada la expresin de CAPN10 en clulas blancas de sangre perifrica, al determinar la presencia de los exnes 3 y 4 por RT-PCR en tiempo real. En la lnea celular 293T la vida media de CAPN10 es de 8.00 horas en empleando 1 M de actinomicina D, lo que permite observar una estabilidad en los mensajeros de CAPN10 independiente del genotipo G/G para el SNP-43

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