A. TECNICAS DE INOCULACIN Y SANGRIA DE ANIMALES: 1. DESCRIBA LAS INSTRUCCIONES GENERALES PARA INOCULAR ANIMALES. 2.

CUALES SON LOS ANIMALES COMUNMENTE UTILIZADOS PARA ESTAS PRUEBAS. 3. DESCRIBA LA TECNICA DE INYECCION INTRAMUSCULAR. 4. DESCRIBA LA TECNICA DE INYECCION 5. DESCRIBA LA TECNICA DE INYECCION 6. DESCRIBA LA TECNICA DE INYECCION 7. CUALES SON LOS METODOS PARA EXTRAER SANGRE DE LOS ANIMALES. DESCRIBALOS.

B. OBTECCION DE ANTIGENOS BACTERIANOS Y PREPARACION DE ANTISUEROS: 1. CUAL ES EL PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UN ANTIGENO BACTERIANO. 2. COMO ES EL PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE

ANTISUEROS.

A. TCNICAS DE INOCULACIN Y SANGRA DE ANIMALES: 1. Describa Las Instrucciones Generales Para Inocular Animales: Equipamiento: Hay que utilizar una aguja o lanceta esterilizada para pinchar la piel y el vaso sanguneo subyacente. No es recomendable utilizar una hoja de escalpelo (bistur) ya que su uso es impreciso y puede ocasionar una mutilacin accidental del animal o de la persona, si el animal no est adecuadamente sujeto. Lugar: Para familiarizarse con la ubicacin de una vena, se recomienda encarecidamente estudiar primero la anatoma correspondiente en los animales muertos, para evitar tener que realizar repetidas entradas fallidas a la hora de encontrar un vaso sanguneo. Un lugar habitual para practicar la puncin venosa en un animal pequeo es la vena coccgea o de la cola. En pequeos roedores, la extremidad de la cola puede ser amputada y en el caso de los ratones- a diferencia de las ratas- no parece implicar la eliminacin de ninguna vrtebra coccgea. El corte de la cola tiene que realizarse una sola vez o dos como mximo. (En ratas topo desnudas se puede hacer pequeas extirpaciones al final de la cola, que vuelve a crecer en 4-6 semanas y entonces puede realizarse de nuevo.) En pequeos animales sin cola, como los cobayas y hmsteres, se puede utilizar la vena yugular o la de la oreja, pero requiere gran habilidad; en estos mamferos, la puncin cardiaca con anestesia general puede ser el mtodo ms adecuado.

En animales grandes es ms probable que una pequea muestra se tome directamente de una vena superficial. En las aves, puede practicarse la puncin en las barbas, crestas y moco, en el caso del pavo. La utilizacin de las almohadillas plantares para la obtencin de sangre no es aceptable debido a la sensibilidad de la zona y el riesgo de infeccin, ya que los Animales de Laboratorio habitualmente se guardan cerca, o en lechos contaminados por orina y heces. La infeccin puede causar cojera y sufrimiento innecesario. Preparacin Del Lugar Es importante mantener una antisepsia completa a lo largo del muestreo, de forma que todo pelo o resto de piel superficial de encima de la vena, sea retirado. El mtodo para eliminar el pelo depender de la localizacin de la vena y de la especie animal. El pelo se puede eliminar a tirones, con tijeras curvas o con esquiladora. Retirar el pelo a tirones puede realizarse fcilmente en los gatos y conejos sin causar sufrimiento al animal. Las cremas depilatorias qumicas pueden aplicarse en zonas difciles pero generalmente no se recomiendan ya que pueden provocar reacciones en la piel y contaminar las muestras. Algunos animales tales como los gatos, pueden incomodarse con el ruido producido por las esquiladoras elctricas. Hay que tener en cuenta tambin, que las pieles de algunos animales, por ejemplo la de los conejos, son finas y sensibles. No es recomendable afeitar con cuchilla, jabn y agua ya que causa ms dao a la piel que el esquilar.

Las excepciones dependern de la experiencia del operador, de la soltura a la hora de esquilar y el efecto que pueda causar en los animales y de la calidad de la muestra requerida. La zona rasurada o de la que se ha retirado el pelo a tirones deber ser limpiada con agua templada, a la que se le puede aadir un detergente o desinfectante como la cetrimida. Estos agentes debern ser posteriormente retirados con agua para evitar la contaminacin de la muestra. El alcohol (etanol 70% en agua) desengrasar efectivamente la piel de aquellas especies en las cuales la secrecin de glndulas sebceas sea pronunciada (por ejemplo en las ovejas), pero puede contaminar una muestra de sangre si no se le deja evaporar. Es casi imposible producir una superficie estril y una Limpieza excesiva trastornara el ecosistema bacteriano natural de defensa de la piel. La preparacin puede tener entonces el efecto posterior de causar irritacin, deshidratacin de la piel e incomodidad del animal. Para disminuir toda molestia asociada a la puncin venosa, algunos cientficos han investigado recientemente el uso de cremas de anestesia local aplicadas sobre la piel unos 30-60 minutos antes de tomar la muestra. Parecen ser beneficiosas en la reduccin de las molestias en especies como conejos, perros y gatos pero no son tan efectivas en ratas.

 La Toma De Muestra: El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado que, siempre que sea posible, deber ser conocido por los animales. No hay tampoco que sobre valorar el papel clave desempeado por la persona que sujeta al animal y evidencia la vena. La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda) y la puncin llevada a cabo decididamente mejor que con vacilaciones. Puede que el animal muestre signos de incomodidad (como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le debe tranquilizar, tratndole con suavidad y hablndole. Puede que se necesite alguna presin prxima al lugar de oclusin del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de sangre. La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una micropipeta con punta de plstico. Despus de haber sacado la sangre, se debe mantener una presin suave pero firme sobre el lugar durante unos 30 segundos, lo que detendr rpidamente cualquier sangrado. Tambin hay varios preparados hemostticos de alginato de calcio, fibrillas de colgeno y esponja gelatinosa que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado. 2. Cuales Son Los Animales Comnmente Utilizados Para Estas Pruebas. A. Ratn B. Rata C. hmster D. Gerbo E. Cobayo F. Conejo

3. Describa

La Tcnica De Inyeccin

intravenosa,

intraperitoneal

Subcutnea, Intramuscular. A. RATN : Intravenosa. Equipamiento: agujas de 27 - 30 g, jeringas 1 ml de TB, sujetador para ratn, lmpara de calentamiento La vena lateral de la cola del ratn es el sitio ms comn para esta tcnica. Mejores resultados se logran si la cola se introduce en agua caliente o el ratn es calentado en la jaula con una lmpara. Las venas se observan cuando la cola es levantada y girada lentamente en cualquier direccin. La punta de la aguja puede verse como penetra en la vena. No obstante ser una tcnica de fcil aplicacin prctica y entrenamiento es fundamental. Intraperitoneal. Equipamiento: jeringas y agujas 23 - 27 g, a 1 pulgada, preferiblemente con el bisel pequeo. La inyeccin se aplica en el cuadrante izquierdo bajo como se observa, en la figura 7.

Figura 7.- Sujecin para la aplicacin de la inyeccin intraperitoneal en ratn.

El uso del bisel pequeo en la aguja y su insercin a travs de la piel, levantando la aguja en contra de la pared abdominal, evita la posibilidad de puncin en el intestino. Una rpida administracin del fluido puede causar daos en el tejido y hemorragia debido a la presin. Si no se inmoviliza la pata derecha del ratn pudiera existir el riesgo de puncin en los intestinos. El mximo posible de administrar por esta va a un ratn de 20 g es de 2 ml. Subcutnea. Equipamiento: agujas de 25 a 27 g, a pulgada con jeringas de TB. Esta va es utilizada como alternativa a la intramuscular en los ratones. El rea escogida es el hombro. Como alternativa el abdomen ventral es usado utilizando la tcnica de restriccin de la figura 1.

Figura 1.- Mtodos de sujecin y manipulacin en el ratn para inyecciones intraperitoneales o intramusculares.

b. RATA: Intravenosa. Equipamiento: Dependiendo del tamao de la rata agujas de 20 g pueden ser utilizadas, de a 1 pulgada. Un dispositivo de restriccin y una lmpara de calentamiento es til. Las tcnicas descritas para el ratn son aplicables para la rata. En esta la vena safena del lado de la pata trasera El dispositivo de restriccin es til tanto para el animal como para el investigador. Colocando a la rata en un cilindro es el mtodo ms usual. Anestesia ligera con Ketamina-xylazina o CO son medios tiles para el correcto trabajo con la rata. Una administracin intravenosa o toma de sangre prolongada debe ser acompaada de una catter va vena yugular. Esta tcnica requiere de elementos de ciruga. En este caso solicitar el apoyo de los mdicos veterinarios de la UPEAL. Intraperitoneal. Equipamiento: jeringas y agujas 23 - 25 g, ? a 1 pulgada. El lugar de aplicacin es el mismo que para el ratn. La restriccin del animal puede realizarse con el apoyo de otra persona o el uso de anestesia ligera. Intramuscular. Equipamiento: agujas de 25 a 26 g, a pulgada con jeringas de TB. La espalda y los msculos de las patas traseras son idneos para esta tcnica. Al igual que en el ratn debe tenerse cuidado con daar estructuras vitales. La restriccin del animal puede realizarse con el apoyo de otra persona o el uso de anestesia ligera.

 Subcutnea. Equipamiento: agujas de 23 g, 1 pulgada. Esta va es usada como una alternativa a la va i.m. para administrar alguna droga. El lugar ideal es en el rea escapular. Si se realiza con frecuencia debe de alternarse el rea de aplicacin. La restriccin correcta debe ser considerada. La piel de la rata es delgada y difcil de penetrar, debe de tenerse cuidado para evitar accidentes en la aplicacin y las manos del operario. C. CONEJO: Intravenosa. Equipamiento: agujas de 20 a 25 g de un adecuado largo y jeringas. Un pequeo bisel de menos de 1 pulgada no debe ser usado y se recomienda una jeringa de 5 ml o menos. Un dispositivo de restriccin es til. No se recomienda una restriccin manual para esta tcnica. La vena marginal de la oreja es ideal para la aplicacin. Coloque al conejo en la jaula de restriccin. El pelo de la oreja debe ser eliminado y la piel desinfectada con alcohol yodo antes de realizar la puncin. La limpieza de la piel reduce la posibilidad de infeccin. La vena puede golpearse delicadamente varias veces con el dedo para su dilatacin. Inyectar la vena cerca de la base de la oreja. Si se usa la xilacina como dilatador, despus del procedimiento, debe lavarse la oreja con agua y jabn pues es irritante en contacto con la piel.

 Intraperitoneal. Equipamiento: jeringas y agujas 19 - 20 g, 1 a 1 pulgada con la adecuada jeringa. Pequeas agujas pueden ser utilizadas si la sustancia a inocular es de poca y de baja viscosidad. Puede usarse una tabla plana con cuerdas en las cuatro esquinas que permitan la sujecin de cada pata. La superficie de la tabla debe estar lisa, limpia y desinfectada. El conejo tiende a encogerse cuando se le ata por las cuatro patas. La ayuda de un asistente y el uso de ketamina puede tranquilizar al animal y hacer que el procedimiento tenga xito. El abdomen del conejo se rasura. Para evitar la dispersin de pelo, utilice alcohol al 95%. La tabla de restriccin puede inclinarse hacia abajo en direccin a la cabeza del conejo. Debe cuidarse de no daar estructuras y rganos en el momento de hacer la puncin Intramuscular. Equipamiento: agujas de 22 a 23 g, 1 pulgada. El lugar ms comn es la parte trasera del msculo lateral. Si se requiere realizar ms de una puncin el rea debe de rotarse. El pelo debe ser rasurado y la piel desinfectada. Debe tenerse en cuenta el apoyo de un asistente o de un equipo de restriccin adecuado. Subcutnea. Equipamiento: agujas de 20 a 23 g, 1 pulgada.

El rea mejor es el rea escapular. Limpiar la piel con alcohol, eliminar el pelo, mantener la piel levantada al aplicar la inyeccin. D. COBAYO: Intravenosa. Varias venas son utilizadas pero entre individuos existe variacin en el tamao. Entre las ms usadas est la del metatarso lateral, ceflica, safena (27g) y la vena marginal de la oreja para usar una aguja pequea (30g. Catteres deben ser colocados en la vena yugular. Intraperitoneal. Equipamiento: jeringas y agujas 19 - 22 g, con la adecuada jeringa. El equipo de restriccin y la aplicacin de una anestesia ligera es importante si se trabaja solo. Intramuscular. Equipamiento: agujas de 20 a 22 g, 1 pulgada y jeringas de 1 a 5 ml. No se usa con frecuencia pero si fuera necesario deben tomarse precauciones para no daas las estructuras adyacentes. Las inyecciones deben aplicarse en los msculos laterales del muslo y por lo general se requiere la ayuda de un asistente. Subcutnea. Equipamiento: 20 a 22 g, a 1 pulgada con la adecuada jeringa. La piel del cobayo es delgada, especialmente sobre los hombros. Cuando se llevan a cabo inyecciones en esta rea, deben usarse agujas cortas, pesadas, por ejemplo: 20 g, 1 pulgada. El adecuado equipo de restriccin debe usarse.

4. DESCRIBA LA TECNICA DE INYECCION INTRADERMICA Tornamos el animal si es para reaccin cutnea, seria de mejor eleccin animales blancos. Emplearnos una jeringa de 1 cm. Con aguja # 26. Esquilamos el pelo de la zona de inyeccin y DESINFECTAMOS el rea con alcohol y xilol. Con los dedo tomamos un pliegue cutneo y se introduce la aguja con el bisel hacia arriba, lo ms superficialmente posible. Le aplicamos el liquido lentamente y al retirar la aguja girarnos la jeringa hacia arriba ara cambiar el trayecto del canal y evitar que el lquido inyectado se salga. En esta practica la cantidad de liquido no debe excederse de 0.1 CC. Si aparece una mancha anmica blanca y prominente que ponga de manifiesto los orificios de los folculos pilosos demostrar que la inyeccin ha sido bien realizada. a. los lugares ms utilizados para realizar esta prctica son el tercio medio del antebrazo. b. esta tcnica la utilizamos para observar si la persona tolera el medicamento, en otras palabras si no presenta reaccin alrgica al medicamento.

5. CUALES SON LOS METODOS PARA EXTRAER SANGRE DE LOS ANIMALES. DESCRIBALOS A. RATN: Los ratones usualmente son sostenidos por la base de la cola, especficamente en el rea de la parte media hacia la base. Con este sencillo mtodo de sujecin pueden ser transferidos de una jaula a otra, examinados y sexados. Ver Figura 1.

Figura 1.- Mtodos de sujecin y manipulacin en el ratn para inyecciones intraperitoneales o intramusculares

Para la aplicacin de un tratamiento o un examen mas profundo, este mtodo no es suficiente. Para un mejor control sobre el ratn, este debe sujetado por la cola, colocado sobre la rejilla de la jaula, la mesa u otra superficie, preferiblemente de donde el pueda sujetarse y entonces con el dedo pulgar e ndice, tomar la piel que se encuentra en la parte superior de su cuello y hombros. Durante este proceso el ratn puede voltearse y morder pero una vez sujetado correctamente, est perfectamente controlado. Con la otra mano pueden sujetarse la cola y las patas traseras y realizar un adecuado examen de animal. Existen dispositivos de restriccin aplicables a ratones que ayudan a la sujecin y al manejo correcto del animal.

a. RATA : Las ratas normalmente se sujetan por todo su cuerpo. Ver figura 2.

Figura 2.- Mtodos de restriccin y sujecin para inyecciones

Se cubre con la palma de la mano toda su espalda con los dedos rodeando su cuerpo cerca del cuello, debajo de las axilas de sus patas delanteras. Las ratas pueden ser tambin sujetadas por la cola de forma temporal. La sujecin de la rata con una mano es lo ms comn y efectivo para ejercer el control adecuado y debe estar acompaado de la sujecin de las patas y la cola con la otra mano para un control total. En esta posicin otra persona puede realizar el examen o el tratamiento en el animal. Ratas jvenes y ms pequeas pueden ser manejadas de la misma forma que un ratn, cuando su tamao no permita la sujecin con la mano. Un hueso plano que se encuentra en la espalda de la rata llamado Chassaignac, hace difcil la sujecin de la piel de la rata. Las ratas pueden morder y determinadas cepas y lneas son ms agresivas, por ejemplo, la F-344 es ms agresiva que la Sprague Dawley, por lo que el cuidado y la experiencia son determinantes para un manejo correcto y sin heridas. Existen

dispositivos de restriccin aplicables a ratas que ayudan a la sujecin y al manejo correcto del animal. C. HAMSTER: Los hmsteres muerden rpido y profundo cuando el manejo no es el correcto o se encuentran en una situacin de estrs que consideran de peligro. Cuando el manejo es el correcto asimilan muy bien la situacin y llegan a interactuar con la persona. Son varios los mtodos de sujecin de un hmster. Las palmas de ambas manos pueden sujetar al animal. Puede ser elevado sujetndolo con una mano de manera similar a la rata. La piel alrededor del cuello y sobre los hombros es una herramienta til que ejerce un buen control para sujetarlo con una mano, no obstante se requiere de prctica para ejercer dicho control. Ver figura 3.

Figura 3.- Mtodos de restriccin y sujecin del hmster.

En ocasiones es ms fcil utilizar un recipiente para trasladar un hmster de un punto a otro si el control efectivo no es necesario para realizar una evaluacin o inspeccin del animal. D. GERBO: El gerbo responde a los mismos mtodos de manejo de los pequeos roedores que se describen con anterioridad. Para el manejo rpido o de grandes cantidades, la sujecin por la base de la cola es lo ideal. Se debe evitar sujetar al gerbo por la punta de la cola pues eso puede traer por consecuencia el desprendimiento de la piel y el dao al animal. E. COBAYO: Los cobayos rara vez muerden. Son tmidos y la sujecin debe hacerse firme pues tratan de escapar cuando se les manipula. Se sujetan muy bien colocando el dedo pulgar e ndice alrededor del cuello, con la palma de la mano sobre la espalda y el resto de los dedos alrededor del cuerpo. Cuando se mantiene colgado, la otra mano debe sujetar la parte inferior de su cuerpo. Ver figura 4.

Figura 4.- Mtodo de sujecin para inyecciones y movimiento del cobayo

Cuidado especial requiere la manipulacin de hembras gestantes pues son pesadas F. CONEJO: Los conejos no muerden con frecuencia pero pueden causar heridas con las uas de sus patas. Sujtelo de forma tal que las patas traseras estn lejos del cuerpo del operario. Sujetndolo por la piel sobre los hombros con la cabeza en direccin al operario es el mejor mtodo de sujecin para un conejo. Cuando est colgado, se debe sujetar la parte bajo del cuerpo con la otra mano. Ver figura 5.

Figura 5.- Mtodos para la sujecin y transportacin de conejos y su colocacin y ajuste en la jaula de restriccin para tomas de sangre e inyecciones

Los conejos nunca deben ser levantados por las orejas. Si el conejo comienza a moverse violentamente y en rotacin, debe colocarse rpidamente sobre una superficie plana y esperar a que se tranquilice. Este movimiento violento y en forma circular puede traer como consecuencia la fractura de una o ms vrtebras lumbares y dao fatal en la espina dorsal. Los conejos pueden ser llevados a un estado de hipnosis cuando se les acaricia sobre su espalda y el abdomen. Durante la sujecin los conejos pueden intentar escapar de forma violenta y pueden daarse con la aguja o cualquier otro instrumento pudiendo causar daos en el animal o el operario. Por lo tanto la sujecin firme debe realizarse antes de iniciar el procedimiento experimental.

Las jaulas de restriccin son muy eficientes para garantizar lo anterior, como la que se muestra en la Figura 6

Figura 6.- Dosificacin de fluidos en el estomago de la rata. La jeringa es especial, 15 g con punta bola y doblada entre 15 y 20 grados en la punta

Y se recomienda para la mayora de los procedimientos. La prctica de manipulacin con esta tcnica puede obtenerse en la UPEAL- Cinvestav. Existen otros similares, menos rgidos como la bolsa de restriccin que cubre el cuerpo del conejo y permite con igual eficiencia su manipulacin y el uso de diversas tcnicas experimentales. TCNICA. La parte ms difcil es la introduccin de la aguja en vena. Determinados pasos deben ser tomados en cuenta aunque solo la prctica determina la eficiencia del procedimiento. La aguja debe insertarse paralela a la vena y la punta de la aguja dirigida al lumen de forma longitudinal. Cuando se detecta que se introdujo en vena, la aspiracin deben de hacerse lenta para evitar se colapse. La puncin en corazn es el mtodo mas practico para la toma de sangre en

pequeos roedores cuando solo se requieren unas gotas de sangre. Tambin se utilizada en especies mayores. En esta tcnica los animales deben ser anestesiados y sujetados. La aguja debe ser insertada en el punto donde se siente el latido del corazn, como lo seala la figura 8.

Figura 8.- Mtodo para la extraccin de sangre del corazn en rata. El latido del corazn es palpado con el dedo y la aguja es introducida pegada al dedo a travs del pecho en la cmara cardiaca como se muestra en la figura izquierda. Luego la sangre se extrae como se muestra en la figura 9.

La extraccin debe ser lenta y la cantidad limitada a menos que se decida la eutanasia del animal. La vena marginal de la oreja del conejo es ideal para la extraccin de pequeos volmenes de sangre y tambin puede ser usada para inyecciones intravenosas. En este lugar es simple la tcnica. El rea es afeitada y desinfectada con xilacina

seguido de alcohol. La vena es dilatada seguida de la introduccin cuidadosa de la aguja y la extraccin de la sangre. Se coloca la gasa en la puncin para evitar hematomas. El mejor mtodo para extraer mayores cantidades de sangre del conejo es el uso de la arteria de la oreja y un vacutainer de 50 cc. Con esta tcnica entre 30 a 40 cc de sangre pueden ser colectadas. El conejo debe estar bien sujeto y evitarse los hematomas. Puede consultar a los mdicos veterinarios de la UPEAL- Cinvestav para cualquier duda. En el ratn la toma de muestra de sangre de la cola es til para hematocrito, conteos celulares y hemoglobina. La cola debe ser calentada en agua a 40 - 50C. El animal debe ser anestesiado antes. Despus de la desinfeccin de la cola, 1 o 2 mm de la punta de la cola pueden cortarse y la sangre recogida. Si la sangre no sale, se puede ordear la cola. Aunque es un mtodo til, tanto este como el corte de dedos en ratn deben ser evitado lo ms posible. La toma de muestra en vena de la cola del ratn y la rata es posible. La vena se ve lateralmente cerca de la base de la cola, se requiere buena iluminacin y dilatacin para observarse mejor. El sangrado de la vena yugular en especie mayores es lo ms adecuado. El sangrado del plexus orbital de la rata y del sinus orbital del ratn y el hmster es lo ms usual. ml puede ser extrado con una frecuencia semanal usando estas tcnicas. Cuando se extraiga sangre del ratn, la rata y el hmster de la perirbital del ojo, el tubo capilar se coloca en la mayor de las estructuras venosas orbtales. La extraccin de sangre en el seno orbital del ratn requiere que el tubo capilar entre directamente en el sinus orbital.

Cuando se usa en hmster, el tubo capilar es colocado en el caudal del sinus orbital. En la rata se facilita cuando el tubo capilar se coloca encima del globo ocular y se alcanza la vena mayor entre la ms profunda y la vena superficial de la rbita El conocer la ubicacin de las estructuras venosas del ratn, la rata y el hmster ayuda al xito de la tcnica. Es obligatoria la anestesia en toda tcnica de extraccin de sangre periorbital.

B. OBTECION DE ANTIGENOS BACTERIANOS Y PRECIPITACION DE ANTISUEROS. 1. Cual Es El Procedimiento Para La Preparacin De Un Antigeno Bacteriano? Para la realizacin de un antisuero utilizamos dos tipos de antigenos bacterianos. Un tipo consiste en Ag. Purificados aislados de la bacteria, tales como flagelos o cpsulas y el otro de la bacteria total, usualmente muerta por el calor, acetona, formol, alcohol o calor. Para efectuar estos procedimientos de inmunizacin el estudiante deber tener previo conocimiento en el manejo de estos organismos patgenos. El antigeno se obtiene a partir de cultivos en medios enriquecidos, lquidos o slidos. Se seleccionan las colonias S y se transfieren a sendos tubos con BHI, se incuban por 6-8 horas a 37 C y se calientan a 100 C por 2 horas Y . Este procedimiento inactiva los antigenos de superficie (l o B) as como tambin el antigeno H. Solo debe usarse suspensiones homogneas y que no autoaglutinen. Despus del calentamiento la suspensin de antigeno puede preservarse por la adicin de 0.5 % de formol al 10%. En esta forma el antigeno queda lisio para las inoculaciones. Una variacin de este mtodo consiste en: Una vez terminado el periodo de calentamiento (100 C por 2 horas Y 1/2 ) Las bacterias se Centrifugan a 3000 r.p.m. por 30 a Una temperatura de 5 C.

Descartar el sobrendante y resuspender las bacterias en 100 ml. De solucin salina formalizada Al 0.3 %. Para inyectar a los animales la [ ] de bacterias, debe ser de 109 bacterias por ml. Tubo # 3, del Nefelmetro de Mac-Farland. Densidad Aproximado De Bacterias Milln/ml. 900.

TUBO. 3.

CLORURO DE BARIO 1%. 0,3.

H2S4 Al 1%. 9,7.

2. COMO ES EL PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE ANTISUEROS? PREPARACION DE ANTISUERO Los antisueros contra antigenos bacterianos pueden ser producidos por inyeccin parenteral, en animales, de una suspensin de bacterias intactas o una solucin de material antignico purificado obtenido de la bacteria. PREPARACIN DEL ANTGENO O INMUNGENO: Antgenos celulares: Obtener la suspensin de clulas, a las cuales se le determina la concentracin para hacer el ajuste correspondiente, segn el esquema de inmunizacin a emplear, p.e. Si se trata de una suspensin microbiana se prepara de la siguiente forma: Sembrar el microorganismo (bacteria) en agar nutriente e incubarlo a 37C 24 Horas. Hacer la suspensin microbiana aadiendo de 2-5 mls de agua destilada estril. Homogeneizar la suspensin.

 determinar la concentracin por densidad ptica a 660nm y realizar su ajuste segn los requerimientos del esquema de inmunizacin para el inculo. colocar la suspensin microbiana a 100C durante 2 horas para obtener antgenos somticos. Antgenos Solubles: Este tipo de antgeno debe estar preferiblemente liofilizado procediendo de la siguiente forma: pesar la cantidad de antgeno segn la concentracin requerida en el esquema de inmunizacin escogido (mg, g, g). Preparacin del antgeno con el adyuvante Antgenos Celulares: tomar el mismo volumen de la suspensin celular que el que se utilizar como inculo de inmunizacin, p.e. 0.2mL de la suspensin microbiana si se requieren 0.2 mL de inculo por cada animal de experimentacin. centrifugar la suspensin a 300 r.p.m. 10 minutos. decantar el sobrenadante y homogeneizar el pellet obtenido,

desprendindolo del fondo del tubo. aadir la solucin adyuvante previamente magnetizada segn la descripcin de la solucin propuesta, en el tubo que contiene el pellet de bacterias, en el mismo volumen del cual se parti para la suspensin microbiana (0.2 mL).

 homogeneizar con cuidado colocando el tubo entre las manos sin hacer Movimientos rotacionales. inocular el preparado antgeno-adyuvante (inculo de inmunizacin) en el animal de experimentacin, por la va de inoculacin escogida (puede incluirse tambin la intravenosa). Antgenos solubles: Aadirle al antgeno pesado previamente el volumen de la solucin adyuvante que exige el inculo para el esquema de inmunizacin escogido. homogeneizar con cuidado colocando el tubo entre las manos sin hacer Movimientos rotacionales. inocular el preparado antgeno-adyuvante como se explica

anteriormente. Ventajas del procedimiento propuesto: Es de preparacin simple y rpida. Puede ser utilizada para inmunizar por cualquier va. No forma granulomas en el tejido vivo al que se inocula, en el punto de aplicacin de la solucin. El procedimiento de tratamiento magntico de la solucin adyuvante puede usarse en cualquier laboratorio para la elaboracin de estos productos biolgicos. Puede ser aplicada en humanos como inmunoestimulante.

2. QUE ES UN ADYUVANTE? Un adyuvante inmunolgico se caracteriza por ser una sustancia o preparado qumico que, incorporado al antgeno o inyectado simultneamente con l, hace ms efectiva la respuesta inmune y se obtiene un nivel de anticuerpos superior, especficamente en la obtencin de antisueros. Existen diversos tipos de adyuvantes entre los que podemos mencionar sustancias biolgicas (diferentes microorganismos), productos qumicamente definidos en hongos y bacterias, productos biolgicos del sistema inmune, productos sintticos anlogos a los biolgicos, preparaciones qumicas (compuestos del Aluminio tales como Al(OH)3 y Al(SO4), Levamisol, Liposomas, Dextrasulfato, emulsiones oleosas (AFI), productos naturales (polisacridos)

INTRODUCCION

El en rea de la Inmunlogia encontramos una gran variedad de procedimientos para lograr diversos objetivos. Uno de esos casos es la obtencin de los antisueros que gracias a ellos es que podernos contar hoy en da con las vacunas, gran avance que en tiempos pasados no se tenia, lo cual era causante de muchas muertes por enfermedades que podan ser tratadas o evitadas con solo una inyeccin de este antisuero, claro y especifico para determinada enfermedad. Incluso hoy en da estamos en continua lucha por seguir encontrando mas opciones de cura para otras enfermedades que nos afligen. Esta obtencin de antisuero es gracias a un procedimiento que se les realiza a las bacterias o agente infeccioso causante de la enfermedad. En este proceso tornarnos el antigeno bacteriano ya sea cpsulas, flagelos, protenas entre otros, y les realizamos una serie de pruebas en las cuales el producto final es el antisuero. Para verificar la eficacia de estos, necesitarnos un animal de prueba al cual se le llevara un seguimiento de la accin del antisuero, pero para eso necesitamos saber las tcnicas adecuadas de inoculacin para estos animales y la diferencia entre cada tcnica para tener una accin mas confiable del producto final que es el antisuero.

OBJETIVOS.

Adquirir conocimientos sobre las tcnicas a utilizar en e laboratorio de Inmunlogia y saber con que tipos de animales podemos realizar estas tcnicas. Aprender las bases sobre como se obtiene un antisuero y saber el procedimiento de la obtencin de antigenos bacterianos. Obtener un conocimiento previo terico sobre las reas donde se deben realizar las punciones en los animales y saber que es lo que se les aplica; para tener un buen seguimiento.

TCNICAS DE INOCULACIN, SANGRA DE ANIMALES, OBTENCIN DE ANTIGENOS BACTERIANOS Y PREPARACIN DE ANTISUEROS.

LABORATORIO DE INMUNLOGIA.

PRESENTADO A: Dra. MARIA LOURDES LVAREZ G.

UNIVESITARIA DE SANTANDER. BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO. CCUTA.

2005 - A. TCNICAS DE INOCULACIN, SANGRA DE ANIMALES, OBTENCIN DE ANTIGENOS BACTERIANOS Y PREPARACIN DE ANTISUEROS. LABORATORIO DE INMUNLOGIA.

PRESENTADO A: Dra. MARIA LOURDES LVAREZ G.

PRESENTADO POR: LEIDY YUDITH ANGARITA BAUTISTA CODIGO: 02171043.

UNIVESITARIA DE SANTANDER. BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO. CCUTA. 2005 A.

BIBLIOGRAFA.

Inmunlogia Humana Y Bsica, Capitulo 8, Inmunogenicidad y Especificidad Antignica, Pg. 159.

http://www.secal.es/word-pdf/sangre.pdf.

http://cinvestav.mx/upeal/nom82.html

http://cinvestav.mx/upeal/PI-11-02.htmlhttp://cinvestav.mx/upeal/PI1102.html