ASPECTOS MECANSTICOS DE LA BIOSNTESIS DE NANOPARTCULAS DE PLATA POR VARIAS CEPAS DE FUSARIUM OXYSPORUM Resumen Produccin extracelular de las nanopartculas

de metal por varias cepas del hongo Fusarium oxysporum se llev a cabo. Se encontr que los iones de plata acuosas cuando se exponen a varias cepas de Fusarium oxysporum se reducen en la solucin, lo que conduce a la formacin de hidrosol de plata. Las nanopartculas de plata se encontraban en el intervalo de 20-50 nm de dimensiones. La reduccin de los iones de metal se produce por un nitrato reductasa dependiente de quinona y un proceso de transporte extracelular. Las potencialidades de este diseo nanotecnolgico basada en la biosntesis de fuga de nanopartculas para varias aplicaciones tcnicas son importantes, incluido su potencial como material antibacterial. Antecedentes La desasimilatoria frrico reductasa, que se encuentra en las bacterias son una parte esencial de los ciclos de hierro [1] y son esencialmente intracelular, pero una a una extracelular se aisl a partir de Mycobacterium paratuberculosis [2]. Otro mecanismo posible podra ser activo en este proceso, ya que se descubri que algunas bacterias reducen Fe3 + por xidos de producir y secretar compuestos pequeos, difusibles redox que pueden servir como lanzadera de electrones entre el microbio y el sustrato de hierro insoluble [3]. El papel de los compuestos excretados en la transferencia de electrones extracelular fue revisado recientemente [4]. La presencia de hidrogenasa en hongos como Fusarium oxysporum se demostr con suspensiones de clulas lavadas que haban sido cultivadas aerbicas y anaerbicas en un medio con glucosa y sales modificado con nitrato de [5]. La nitrato reductasa fue aparentemente esencial para la reduccin de hierro frrico [6]. Muchos hongos que exhiben estas propiedades caractersticas, en general, son capaces de reducir Au (III) o Ag (I) [7]. Adems de estas enzimas extracelulares, naftoquinonas varios [810] y antraquinonas [11] con excelentes propiedades redox, se inform en F. oxysporum que podra ser actuar como lanzadera de electrones en las reducciones de metal [3]. Aunque se sabe que los microorganismos tales como bacterias, levaduras y hongos juegan actualmente un papel importante en la remediacin de metales txicos a travs de la reduccin de los iones de metal, se consider que era interesante como nanofbricas muy recientemente [12]. El uso de estas propiedades desasimilatoria de hongos, la biosntesis de los nanomateriales inorgnicos utilizando organismos eucariotas como los hongos pueden ser utilizadas para el cultivo de nanopartculas de oro [13] y la plata [14] intracelular en clulas de hongos Verticillium [15]. Recientemente, se ha encontrado que los iones acuosos cloroaurato puede reducirse extracelularmente usando el hongo F. oxysporum, para generar oro extremadamente estable [16] o de nanopartculas de plata en agua [17]. Otro proceso, que se describe en la literatura, se relacion para producir nanopartculas de plata a travs de catlisis oligopptidos, precipitando las partculas con varias formas (hexagonal, triangular y esfrica) [18]. Sin embargo, en la reduccin de hongos de iones Ag llev suspensin coloidal, de manera diferente que en el caso de oligopptidos. A continuacin, los aspectos mecansticos siguen

siendo una cuestin abierta, sin embargo, este proceso ocurre en el caso de hongos probablemente, ya sea por accin reductasa o por quinonas lanzadera de electrones o ambos. Nuestros objetivos en este estudio son comparar los diferentes cepas de F. oxysporum a fin de comprender si la eficacia de la reduccin de iones de plata est relacionada con una accin reductasa o quinona.

Figura 1 UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa de 10-3 M AgNO3 con la biomasa fngica (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la regin de longitud de onda baja. Resultados y Discusin Los matraces Erlenmeyer con la biomasa de F. oxysporum eran de un color amarillo plido antes de la adicin de los iones Ag + y esto cambi a un color pardusco en la terminacin de la reaccin con los iones Ag + de 28 h. La aparicin de un color amarillo es el color marrn en solucin que contiene la biomasa sugiri la formacin de nanopartculas de plata [21]. Los espectros UV-Vis registrada de los vasos de reaccin 07SD F. oxysporum cepa (Mtodo A) a diferentes tiempos de reaccin se presenta en la figura 1. La fuerte resonancia de plasmn superficial centrado en aproximadamente. 415-420 nm aumenta claramente en intensidad con el tiempo. La solucin fue extremadamente estable, sin evidencia de floculacin de las partculas incluso varias semanas despus de la reaccin. La insercin de la figura 1 muestra espectros UV-Vis en la regin de longitud de onda mnima registrada del medio de reaccin mostr una banda de absorcin a aproximadamente. 265 nm y fue atribuido a los aminocidos aromticos de las protenas. Es bien sabido que la banda de absorcin a ca. 265 nm surge debido a excitaciones electrnicas en residuos de triptfano y tirosina en las protenas. Esta

observacin indica la liberacin de protenas en solucin de F. oxysporum y sugiere un posible mecanismo para la reduccin de los iones metlicos presentes en la solucin [17]. La Figura 2 muestra los espectros de emisin de fluorescencia de hongos filtrado de una de la cepa (07SD). Una banda de emisin centrada a 340 nm se observ. La naturaleza de la banda de emisin indica que las protenas unidas a la superficie de las nanopartculas y los presentes en la solucin de existir en la forma nativa [22]. Los resultados similares fueron observados para todas las cepas estudiadas, como se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 1, la cepa 07SD apareca como el ms eficiente en la produccin de nanopartculas de plata. Aparentemente, las diferentes eficiencias estn relacionados con la reductasa y / o para la generacin de quinona y se discutir ms adelante. Una desestabilizacin de las nanopartculas es evidente en el caso de F. oxysporum 534, 9114 y 91248 cepas en 28 horas, como se indica por una disminucin en la absorcin de 420 nm.

Figura 2 Espectro de emisin de fluorescencia registrada de la mezcla de reaccin nanopartculas de plata-hongo. La longitud de onda de excitacin fue 260 nm. De manera similar, cuando la biomasa se sumergi en agua y slo el fngica filtrado (Mtodo B) se aadi a una solucin de AgNO3 10-3 M, la solucin acuosa inicialmente incolora cambi a un color marrn amarillento plido dentro de 28 h de reaccin (datos no mostrados ), indicando claramente que la reduccin de los iones se produce extracelularmente a travs de agentes reductores liberados en la solucin de F. oxysporum como lo muestra el espectro de UV-Vis para la cepa 07SD (Fig. 3).

Figura 3 UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa de 10-3 M AgNO3 con el fngica filtrado (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la regin de longitud de onda baja. Las figuras 4 y 5 se muestra la micrografa SEM registrados a partir de la nanopartcula de plata (Mtodo A). Esta imagen muestra los agregados de nanopartculas de plata. En esta micrografa, nanopartculas esfricas en el intervalo de tamao de 20-50 nm se observaron. Las nanopartculas no estaban en contacto directo, incluso dentro de los agregados, lo que indica la estabilizacin de las nanopartculas por un agente de proteccin terminal. Esto corrobora con la observacin anterior de Ahmad et al. [17] en su estudio sobre F. oxysporum. La micrografa misma en el Mtodo B se observ (no mostrada). En el anlisis por espectroscopia de dispersin de energa (EDS) de las nanopartculas de plata se confirm la presencia de la seal de plata elemental (Figura 6). La TLC (Cromatografa de Capa Fina) anlisis en gel de slice de 60 placas utilizando cloroformometanol-cido actico (195:5:1) mostr una mancha con valor de Rf de 0,65, y utilizando benceno-nitrometano-cido actico (75:25: 2) mostr una mancha con valor de Rf de 0,85, que corresponde a 2-acetil-3, 8 - dihidroxi-6-metoxi antraquinona o sus ismeros en 2 - acetil-2,8dihidroxi-6-metoxi antraquinona (Esquema 1). Esto fue corroborado por el espectro de fluorescencia del filtrado (Mtodo A), lo que indica un resto antraquinona fluorescencia [11]. Los espectros de excitacin en el mximo de emisin (550 nm) encajan muy bien con el espectro de absorcin de la antraquinona en la Figura 7.

Figura 4 Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 11000 magnificacin.

Figura 5 Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 40000 magnificacin. La Figura 8 muestra la nitrato reductasa a travs de la reaccin de nitrito con 2,3diaminophthalene. El espectro de emisin presenta dos picos principales de intensidad de fluorescencia a 405 y 490 nm correspondiente a la emisin mxima de la diaminonapthotriazole y 2,3-, DAN (exceso), respectivamente. La intensidad de estas dos bandas aument con la adicin de un 0,1% KNO3 solucin, lo que confirma la presencia de la nitrato reductasa.

Figura 6 EDS espectros de nanopartculas de plata

Figura 7 Espectro de emisin de fluorescencia de la solucin acuosa de 10-3 M AgNO3 con la biomasa fngica (07SD). La longitud de onda de excitacin fue 465 nm. El recuadro muestra el espectro de excitacin de fluorescencia (emisin a 550 nm ). Parece que la reductasa es responsable de la reduccin de los iones Ag + y la subsiguiente formacin de nanopartculas de plata. La misma observacin se inform con otra cepa de F. oxysporum y se seal que esta reductasa fue especfico para F. oxysporum. Sin embargo, Fusarium moniliforme, no dio lugar a la formacin de nanopartculas de plata, ni intracelularmente ni extracelularmente pero contena reductasas intra y extra celulares en una manera similar como F. oxysporum [17,23]. Esto es una indicacin de que probablemente las reductasas en este tipo de Fusarium son importantes para el Fe (III) a Fe (II), pero no a Ag (I) a Ag (0). Adems, en F. moniliforme derivados de antraquinonas no se detectaron a diferencia del caso de F. oxysporum. Tanto fusarium eran iguales en la produccin de naftaquinonas [8], pero difieren en la produccin de antraquinonas. Probablemente, en nuestro caso, Ag (0) reduccin se debi principalmente a una conjugacin entre la lanzadera de electrones con la participacin reductasa como se muestra en la Figura 9. Conclusin Aunque el oro / plata nanopartculas han sido sintetizados utilizando procariotas tales como bacterias [24,25] y eucariotas tales como hongos [13,14], las nanopartculas crecer intracelularmente, excepto en el caso de un reciente informe en el que F. oxysporum fue utilizado. En ese caso, las nanopartculas creci extracelularmente [17]. En nuestro caso, todas las cepas de F. oxysporum estudiadas mostraron la capacidad de produccin de nanopartculas de plata, sin embargo, dependiendo de las relaciones de conexin reductasa / electrn en estas condiciones. Biolgicamente sintetizadas nanopartculas de plata podran tener muchas

aplicaciones en reas como la ptica no lineal, revestimientos espectralmente selectivos de absorcin de energa solar y materiales de intercalacin para las bateras elctricas, como los receptores pticos, catlisis en reacciones qumicas, bio-etiquetado [26], y como capacidad antibacterianos [27]. Mtodos Las cepas de F. oxysporum utilizados fueron los siguientes: O6 SD, SD 07, 534, 9114 y 91248 de la Esalq-USP Gentica y Biologa Molecular Laboratorio-Piracicaba, SP, Brasil. El inculos fngicos se prepararon en un 2% de extracto de malta y extracto de levadura 0,5% a 28 C en placas de Petri. El crecimiento de los hongos lquido se llev a cabo en presencia de extracto de levadura al 0,5% a 28 C durante 6 das. La biomasa se filtr y se resuspendi en agua estril.

Figura 9 Mecanismos hipotticos de la biosntesis de las nanopartculas de plata

Plata reduccin y su caracterizacin Mtodo A: En la reduccin de la plata, la metodologa descrita anteriormente fue seguido [17]. En pocas palabras, aproximadamente 10 g de F. oxysporum biomasa fue tomada en un matraz cnico que contena 100 ml de agua destilada. Solucin de AgNO3 (10-3 M) se aadi al matraz erlenmeyer y la reaccin se llev a cabo en la oscuridad. Peridicamente, las alcuotas de la solucin de reaccin y se eliminaron las absorciones se midieron usando un espectrofotmetro de UV-Vis (Agilent 8453 - matriz de diodos). Mtodo B: Otra prueba se llev a cabo de la siguiente manera: aproximadamente 10 g de F. oxysporum biomasa fue tomada en un matraz cnico que contena 100 ml de agua destilada, se mantuvo durante 72 horas a 28 C y despus los componentes de la solucin acuosa se separaron por filtracin. A esta solucin, AgNO3 (10-3 M) se aadi y se mantuvo durante varias horas a 28 C. Las nanopartculas de plata se caracterizaron por microscopa electrnica de barrido (SEM) y espectroscopia de dispersin de energa (EDS) con una tensin de 20 kV (Jeol - JSM-6360LV) y previamente recubierta con oro a vaco. Determinacin de los compuestos de electrones-trasladados Liberacin de electrones-trasladados compuestos se sigui la metodologa descrita anteriormente [11]: A fin de determinar las quinonas solubles en agua que podran funcionar como una lanzadera de electrones, los cultivos se filtraron 4-6 semanas, y el filtrado se ajust a pH 3 con HCl 1 M. La solucin acidificada se pas entonces a travs de una columna con resina de intercambio inico (Amberlite ) para la absorcin de los pigmentos. Los compuestos se eliminan de la columna por elucin con acetona, se elimin la acetona utilizando una evaporacin rotatorio Buchi y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Todas las extracciones de acetato de etilo se combinaron y se redujeron usando el evaporador rotatorio. Despus de eso, 2 uL muestras fueron vistos repetidamente sobre una placa de gel de slice 60 hasta un punto era visible bajo luz UV a 254 nm. Las muestras fueron resueltas utilizando un cido cloroformo-metanol-actico (195:5:1) y benceno-nitrometano-cido actico (75:25:2) sistema diseado para movilizar pigmentos polares. Las placas fueron secadas al aire y las manchas se visualizaron bajo luz ultravioleta [19]. El nitrato reductasa ensayo La reduccin de nitrato se demostr en el mismo medio (Mtodo A y B) de la misma caldo de crecimiento de F. oxysporum con la adicin de 0,1% de KNO3 [6]. La prueba para la nitrato reductasa se hizo despus de 2 das por el mtodo fluoromtrico [20]. Brevemente, 100 l hongos filtrado y los 200 l de agua desionizada. Para esto, 10 l de recin preparada 2,3 diaminonaphtalene (DAN) (0,05 mg / ml en HCl 1 M) y se mezcla inmediatamente. Despus de 10 minutos de incubacin a 20 C, la reaccin se detuvo con 5 l de 0,1 M NaOH. La intensidad de la seal fluorescente producida por el producto se maximiza mediante la adicin de base. la formacin de 2,3-diaminonapthotriazole se midi utilizando un PerkinElmer (LS-55) con espectrofotmetro de luminiscencia y longitud de onda de excitacin a 375 nm y la banda de emisin medida a 550 nm [20].

Determinacin de los residuos de triptfano / tirosina

Presencia de residuos de triptfano / tirosina en las protenas de liberacin que en el filtrado fngica se analiz por fluorescencia [17]. la mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo en un espectrofotmetro de luminiscencia Perkin-Elmer (LS-55). La longitud de onda de excitacin era 260 nm, cerca de mximos transiciones pticas del triptfano y tirosina. Autores de las contribuciones ND concibe el estudio, junto con la Oficina de Asuntos Jurdicos y EE y particip en su diseo y la coordinacin y recogieron todos los datos y escribi el documento. PDM obtenido todos los puntos de vista de SEM, realizado los ensayos enzimticos, los aspectos de electrones trasladados y discutieron las tres partes relacionadas en el manuscrito. GIHS realizado todas las pruebas de hongos y medida de todas las variaciones espectroscpicas de la resonancia de plasmn de las nanopartculas de plata bajo la supervisin de EE. Oficina de Asuntos Jurdicos tambin supervis todos los aspectos de las nanopartculas en este trabajo. Todos los autores ledo y aprobado el manuscrito final.