PONTIFICA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO

FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA

ICB-690 Laboratorio de Bioprocesos INFORME DE LABORATORIO: FERMENTACIN PILOTO

Alumnos: Blanca Araya A. Ernesto Gonzlez R. Francisco Mesa L. Felipe Scott C. Fabrizio Venturini E. Profesores Gua: Ral Conejeros Oscar Romero

Mayo - 2009

RESUMEN
El siguiente informe resume los resultados de las actividades realizadas durante el desarrollo del primer laboratorio del curso ICB-690. Se cultiv la levadura K. marxianus en un fermentador con 100 L de caldo con medio complejo con lactosa como sustrato limitante para determinar el efecto de suspender la aireacin en un cultivo en crecimiento. Para la fase de cultivo aireada se determinaron valores de velocidad especfica de crecimiento de 0,42 h-1 para las mediciones de la concentracin celular realizadas mediante peso seco y de 0,48 h-1 para las mediciones realizadas mediante turbidimetra. Para esta misma fase se obtuvieron rendimientos de lactosa en clulas de 0,40 g/g (peso seco) y 0,42 g/g (turbidimetra) para ambas metodologas de medicin de la concentracin celular. Para la fase no aireada la velocidad de crecimiento y el rendimiento de sustrato en clulas cayeron drsticamente obtenindose valores de 0,013 y 0,011 para la velocidad especfica de crecimiento determinada por peso seco y turbidimetra respectivamente. Los valores de rendimiento de sustrato en clulas fueron iguales a 0,02 g/g para ambos mtodos de determinacin de la concentracin celular. En conclusin la suspensin del suministro de aire lleva a la transformacin de la fuente de carbono en otros metabolitos, presumiblemente etanol, en la cepa utilizada la cual es caracterizada debido a su capacidad de fermentar el disacrido lactosa como Kluyver negativo.

NDICE
1 2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 4.1 4.2 4.3

pg.

Introduccin.............................................................................................................. 1 Revisin Bibliogrfica ............................................................................................... 2 Materiales y mtodos ............................................................................................... 4 Preparacin de la muestra ....................................................................................... 4 Determinacin de biomasa ...................................................................................... 4 Medicin de sustrato por el mtodo de DNS ............................................................ 5 Cultivo del inculo para el reactor piloto................................................................... 6 Fermentacin Piloto ................................................................................................. 6 Resultados ............................................................................................................... 8 Cultivo de propagacin en reactor Biolafitte ............................................................. 8 Evolucin de la concentracin de clulas y sustrato durante el cultivo piloto ........... 8 Determinacin de la velocidad especfica de crecimiento y el rendimiento de

sustrato en clulas........................................................................................................... 10 5 6 7 Discusiones ............................................................................................................ 15 Conclusin ............................................................................................................. 17 Referencias bibliogrficas ...................................................................................... 18 Mediciones de Biomasa y Sustrato ............................................................. 20 Curva de Calibrado de Biomasa .................................................................. 23 Curva de Calibrado de Sustrato .................................................................. 24 Diseo del Buffer del Reactor de Propagacin ............................................ 26

Apndice .I Apndice .II Apndice .III Apndice .IV

ii

NDICE DE TABLAS

pg.

Tabla 1: Datos cinticos obtenidos desde bibliografa ............................................................ 2 Tabla 2: Composicin del medio de cultivo para la fermentacin en el reactor Biolafitte. ....... 6 Tabla 3: Composicin del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto. ............................... 7 Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad especfica de crecimiento para las fases con y sin aireacin del cultivo piloto........................................................................ 12 Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en clulas durante las fases con y sin aireacin del cultivo piloto .............................................................................. 13 Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentacin en el reactor piloto. ...................................................................................................... 20 Tabla 7: Medicin de la concentracin celular realizadas mediante turbidimetra (M1, M2..M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra. ......................... 21 Tabla 8: Medicin de la concentracin celular determinada mediante peso seco................. 22 Tabla 9: Datos obtenidos para la realizacin de la curva de calibrado de lactosa ................ 24 Tabla 10: Especies qumicas consideradas para el diseo del buffer................................... 26 Tabla 11: Datos del proceso de fermentacin ...................................................................... 27 Tabla 12: Resultados del diseo del buffer .......................................................................... 27

iii

NDICE DE FIGURAS
Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en funcin del tiempo. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante

pg.

turbidimetra (). ....................................................................................................... 8 Figura 2: Concentracin de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] .................................... 9 Figura 3: Logaritmo natural de la concentracin celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5,5 h) para la zona exponencial aireada. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag. Biomasa determinada mediante turbidimetra (), biomasa determinada mediante peso seco (). ......................................................................................... 10 Figura 4: Logaritmo natural de la concentracin celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5,5-7,5 h) para la zona exponencial no aireada. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante turbidimetra (). ..................................................................................... 11 Figura 5: Representacin de la concentracin de lactosa [g/L] versus la concentracin celular [g/L] para la zona exponencial aireada. Biomasa determinada mediante peso seco (). Biomasa determinada mediante turbidimetra ()............. 12 Figura 6: Representacin de la concentracin celular [g/L] versus la concentracin de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante turbidimetra (). ............ 13 Figura 7: Curva de calibrado biomasa.................................................................................. 25

1 INTRODUCCIN
El objetivo de la experiencia es estudiar las consecuencias de la interrupcin abrupta del suministro de aire en un cultivo de Kluyveromyces marxianus, este objetivo fue definido considerando el uso de K. marxianus en cultivos industriales, intentando simular una falla fortuita en el suministro de aire, con lo que esperamos poder evaluar las posibles prdidas que esto provocara al proceso de produccin de biomasa. Las posibles consecuencias de una falla en el sistema de suministro de aire se presentan en el Captulo 2: Revisin Bibliogrfica, donde adems se presenta la informacin nutricional referente a la levadura que fue utilizada en el desarrollo del medio de cultivo. En el Captulo 3: Materiales y mtodos, se muestran los procedimientos realizados durante el laboratorio y las metodologas experimentales, junto con las condiciones en las que se realiz el cultivo de propagacin y el cultivo piloto. En el Captulo 4: Resultados, se presentan los resultados obtenidos durante la experiencia. En el Captulo 5: Discusiones, se realiza un anlisis crtico de los resultados obtenidos en vista de la revisin bibliogrfica. En el Captulo 6: Conclusin, se presenta la conclusin obtenida en funcin del objetivo planteado.

2 REVISIN BIBLIOGRFICA
Resulta difcil la caracterizacin de la cepa, puesto que las nuevas clasificaciones taxonmicas muestran que Kluyveromyces fragilis, K. bulgaricus, K. cicerisporus y K. wikenii no se diferencian mucho desde el punto de vista gentico de K. marxianus lo que ha motivado a la inclusin de estas especies bajo el nombre comn de Kluyveromyces marxianus (Fonseca et al., 2008). En general Kluyveromyces spp es utilizado en la industria lctea para la reduccin de la DQO de los efluentes, con la concomitante generacin de biomasa microbiana de inters comercial (Lukondeh et al., 2005). Tambin se ha reportado el uso de Kluyveromyces fragilis para la sntesis de lactasa a partir de suero de leche (Acevedo et al., 1996). K. marxianus es catalogada como una especie insensible a la glucosa, no presentando efecto Crabtree (Walker, 1998). Con respecto a la incapacidad de fermentar otro glcido distinto de glucosa en condiciones anaerobias (conocido como efecto Kluyver) existen diferencias dependiendo de la cepa, por ejemplo K. marxianus ATCC10022 es Kluyver(-), es decir, es capaz de fermentar disacridos en condiciones anaerobias, en cambio la cepa K. marxianus CBS 7894 Kluyver (+) es incapaz de hacerlo (Pinheiro et al., 2000). En la Tabla 1 se presenta una recopilacin de parmetros obtenidos desde bibliografa Tabla 1: Datos cinticos obtenidos desde bibliografa Cepa K. marxianus ATCC10022 K. marxianus CBS 7894 K. marxianus FII 510700 K. fragilis K. fragilis K. marxianus MTCC 1288 Rendimiento biomasa [g/g] 0,10 0,15 0,49 0,37 0,37 0,47 0,28 0,24 0,43 0,22 Velocidad especfica de crecimiento [h-1] 0,04 0,06 0,35 0,37 0,38 0,59 0,35 0,52 0,40 Referencia Pinheiro et al. (2000) Pinheiro et al. (2000) Lukondeh et al. (2005) Krzystek y Ledakowicz (2000) Acevedo et al. (1996) Zafar et al. (2005)

3 Se ha reportado que el efecto de la aireacin junto con otros parmetros ambientales afecta de manera importante tanto la velocidad especfica de crecimiento como el rendimiento de sustrato en biomasa, esto debido a la capacidad de la cepa de generar etanol y a cambios morfolgicos de algunas cepas bajo condiciones de estrs (OShea y Walsh, 2000). El modelamiento del crecimiento con lactosa como fuente de carbono debe considerar la concentracin de etanol y lactosa, puesto que ambos compuestos generan inhibicin, en el caso de lactosa, sobre los 16 g/L y con respecto al etanol, sobre los 1,25 g/L (Zafar et al., 2005).

3 MATERIALES Y MTODOS
3.1 Preparacin de la muestra
Para realizar los anlisis de biomasa, sustrato y etanol, a todas las muestras se les realiza el siguiente proceso: Eliminar 100 ml como premuestra. Tomar la muestra desde el fermentador (30 ml). Tomar 10 ml de la muestra inicial que se depositan en un tubo de centrifuga de 15 ml con tapa. Centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. Verter el sobrenadante en un vial con tapa, mientras que el pellet se mantiene en el tubo de centrfuga. Del vial tomar 4 ml que son filtrados, y depositados en tubos eppendorf para la determinacin de etanol. Para la determinacin de biomasa por turbidimetra se toma una alcuota directamente de la muestra inicial. Luego para determinar el sustrato se toma una alcuota del vial. Para la determinacin de biomasa por peso seco se emplea el pellet. Mientras que para cuantificar etanol por cromatografa gaseosa se usa el contenido del eppendorf.

3.2 Determinacin de biomasa

La determinacin de biomasa se realiza por dos mtodos, mediante turbidimetra y por peso seco. Esto debido a que la medicin por turbidimetra es rpida, lo que permite tomar decisiones casi instantneamente; pero en ltima instancia si los resultados de ambas mediciones fueran significativamente distintos es el peso seco el que determina el crecimiento real del microorganismo. La determinacin por turbidimetra necesita de una curva de calibrado que ha sido construida anteriormente comparando los resultados del anlisis turbidimtrico con el de peso seco (segn se muestra en el Apndice .II). Para llevar a cabo el anlisis turbidimtrico se realiza el siguiente protocolo: Se toma la muestra inicial y se mide su absorbancia a 600 nm teniendo como blanco medio de cultivo sin inocular.

5 Con esta medida de absorbancia y la curva de calibrado construida, se calcula la concentracin celular. Si la absorbancia est fuera del rango de la curva de calibrado, se realiza una dilucin que permita que la muestra presente una absorbancia en el rango de dicha curva. Para la determinacin de biomasa por peso seco, se realiza el siguiente protocolo: Tomar el pellet obtenido en la preparacin de la muestra, y aadir aproximadamente 5ml de agua. Resuspender el pellet y centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante es descartado y se agregan nuevamente aproximadamente 5ml de agua. Volver a centrifugar por 20 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se descarta nuevamente y el pellet es resuspendido en una mnima cantidad de agua. Esta mezcla es depositada en un capacho de papel aluminio previamente secado en la estufa a 105C y pesado. Agregar una mnima cantidad de agua al tubo de centrfuga y enjuagar, vertiendo el contenido en el capacho. Este enjuague se realiza 2 veces. El capacho se introduce en la estufa a 105C hasta que registre peso constante. Luego la concentracin se calcula como el cuociente entre la diferencia en masa de los capachos y el volumen de muestra inicial centrifugado (10 ml).

3.3 Medicin de sustrato por el mtodo de DNS

Para determinar la cantidad de lactosa en el medio se utiliza el mtodo de DNS. Para su aplicacin se necesita una curva de calibrado donde se aplica este mtodo a soluciones de lactosa de concentracin conocida (vase Apndice .III). Este mtodo procede segn lo descrito a continuacin: Diluir el sobrenadante de la centrifugacin de la muestra tomada desde el fermentador (contenido en el vial), de modo que la muestra a tomar luego tenga entre 0,15 y 1,5 g/L de lactosa, para que est en el rango de la curva de calibrado. Tomar 1 ml de muestra y depositarla en un tubo de ensayo con tapa para posteriormente agregar 1 ml de DNS y agitar.

6 Luego poner durante 15 min el tubo en agua a ebullicin. Una vez transcurrido dicho tiempo traspasar el tubo a agua con hielo y dejar all por 2 min. Finalmente agregar 10 ml de agua destilada al tubo, agitar y medir absorbancia a 540nm.

3.4 Cultivo del inculo para el reactor piloto

Para el reactor Biolaffitte se utiliz un inculo de 1,87 g/L, y para lograr 6,6 g/L de biomasa una vez transcurridas 15 h de cultivo deban agregarse 160 ml si se consideraba una velocidad especfica de crecimiento mxima de 0,36 h-1. Sin embargo por seguridad se agregaron 200 ml. El medio de propagacin del inculo para el fermentador piloto se resume en la Tabla 2. Tabla 2: Composicin del medio de cultivo para la fermentacin en el reactor Biolafitte. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO47H2O CaCl22H2O K2HPO4 FeSO47H2O Extracto de levadura Concentracin [g/L] 31,36 3,93 0,50 0,11 2,19 0,46 4,13

3.5 Fermentacin Piloto

El cultivo comienza con el bombeo del inculo desde el reactor Biolafitte (10 L) al reactor piloto con 90 L de medio de cultivo esterilizado con la composicin mostrada en la Tabla 3. Para la fase de cultivo aireado la agitacin fue ajustada en 250 rpm y el flujo de aire por volumen de medio fue de 1,42 vvm. Luego, en el momento que se cort la aireacin, la agitacin se disminuy a 50 rpm.

7 Tabla 3: Composicin del medio de cultivo utilizado en el reactor piloto. Compuesto Lactosa (NH4)2SO4 MgSO47H2O CaCl22H2O K2HPO4 FeSO47H2O Extracto de levadura Concentracin [g/L] 32,21 4,86 0,62 0,14 1,58 0,56 5,09

4 RESULTADOS
4.1 Cultivo de propagacin en reactor Biolafitte
Se alcanzaron luego de 15 h de cultivo una concentracin celular de 7,08 g/L y una concentracin final de lactosa de 0,45 g/L. El rendimiento global de la propagacin fue de 0,24 g/g.

4.2 Evolucin de la concentracin de clulas y sustrato durante el cultivo piloto

El resultado de las mediciones llevadas a cabo durante la experiencia piloto se resume en la Figura 1 para la biomasa y en la Figura 2 para la concentracin de lactosa.

12

10
Biomasa [g/L]

8
6

4 2
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tiempo [h]
Figura 1: Curva de crecimiento de la biomasa en funcin del tiempo. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante turbidimetra (). La Figura 1 muestra una fase lag de una hora para continuar con un crecimiento exponencial hasta las 6,5 h de cultivo tanto para la biomasa medida mediante peso seco y turbidimetra. Luego de 6,5 h se suspendi el suministro de aire, lo que se tradujo en una drstica reduccin en la velocidad especfica de crecimiento hasta el final del cultivo transcurridas 8,5

9 h. Las muestras de biomasa obtenidas mediante peso seco entre el inicio del cultivo y las 2,5 h fueron descartadas por estar muy por encima de la masa de clulas esperable, esto debido a errores en el procedimiento de centrifugacin y lavado de las muestras. Las lneas discontinuas representan la proyeccin del crecimiento celular en ambas fases del cultivo (con y sin aireacin) a partir de los valores calculados, mediante la Ecuacin 1, de velocidad especfica de crecimiento y concentracin celular inicial (vase Seccin 4.3: Determinacin de la velocidad especfica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en clulas). Los datos recolectados durante la experiencia piloto, y cuyos promedios se presentan en la Figura 1 y Figura 2, pueden ser consultados en el Apndice .I: Mediciones de Biomasa y Sustrato.

35,0

30,0
25,0
Sustrato [g/L]

20,0

15,0
10,0 5,0

0,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Tiempo [hr]
Figura 2: Concentracin de lactosa [g/L] versus tiempo de cultivo [h] La Figura 2 representa el consumo de lactosa por la poblacin de K. marxianus durante el cultivo. La concentracin inicial de lactosa medida fue muy similar a los 32,2 g/L esperados en base a la dosificacin del medio de cultivo. Adems durante las primeras 3 h de cultivo no hubo un consumo apreciable, o que al menos se correlacionara con el crecimiento observado durante ese periodo. Este hecho ser tratado en el Captulo 5: Discusiones. Luego del corte en el suministro de aire se aprecia una disminucin en la velocidad de consumo de sustrato.

10

4.3 Determinacin de la velocidad especfica de crecimiento y el rendimiento de sustrato en clulas

A partir de los datos obtenidos en la experiencia piloto, presentados en la Figura 1 y en la Figura 2, se procedi a calcular el valor de la velocidad especfica de crecimiento y el rendimiento de lactosa en clulas Ecuacin 1 y en la Ecuacin 2. Ecuacin 1 Ecuacin 2 ( )

mediante las linealizaciones mostradas en la

Para realizar la linealizacin los datos de concentracin celular fueron llevados a un grfico de logaritmo natural de la biomasa [g/L] versus tiempo de crecimiento ( siguiente transformacin lineal: Ecuacin 3 Donde TC es el tiempo de cultivo y TL la duracin de la fase lag (1 hora). Las linealizaciones para ambos mtodos de medicin de la concentracin celular en la fase aerobia se muestran en la Figura 3.
2,50 2,00

) utilizando la

Ln(Biomasa[g/L])

1,50 1,00

0,50 0,00
-0,50 0 1 2 3 Tiempo [h] 4 5 6

Figura 3: Logaritmo natural de la concentracin celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (1-5,5 h) para la zona exponencial aireada. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag. Biomasa determinada mediante turbidimetra (), biomasa determinada mediante peso seco ().

11 La linealizacin para la fase aireada con la concentracin celular obtenida por peso seco se extiende desde las 2,5 h a las 6,5 h de cultivo (final del cultivo aireado), se excluyeron los datos iniciales ya que no se cuenta con datos confiables antes de las 2,5 h de tiempo de cultivo. Para la concentracin celular obtenida por turbidimetra, la linealizacin abarca desde el inicio del crecimiento (1 hora de cultivo) hasta las 6,5 h de tiempo de cultivo. La Figura 4 representa las linealizaciones realizadas para la fase de crecimiento sin suministro de aire, en esta se elimin la medicin de peso seco correspondiente a 8 h de tiempo de cultivo y la medicin por turbidimetra realizada a las 7 h de tiempo de cultivo, esto porque presentaban una alta desviacin con la tendencia observada. Los valores de velocidad especfica de crecimiento y coeficientes de correlacin (r2) calculados mediante la regresin lineal (Ecuacin 1) de los datos obtenidos se presentan en la Tabla 4. .

2,23 2,22
Ln(Biomasa[g/L])
2,21

2,20
2,19 2,18

2,17
2,16

2,15
2,14 5,5 6 6,5 7 7,5 8

Tiempo [h]
Figura 4: Logaritmo natural de la concentracin celular [g/L] versus el tiempo de crecimiento (5,5-7,5 h) para la zona exponencial no aireada. El tiempo representado corresponde al tiempo total de cultivo menos 1 h de fase lag. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante turbidimetra ().

12

Tabla 4: Valores obtenidos de la velocidad especfica de crecimiento para las fases con y sin aireacin del cultivo piloto. Datos Peso seco, F. aireada Turbidimetra, F. aireada Peso seco, F. no aireada Turbidimetra, F. no aireada 0,42 0,48 0,013 0,011 0,995 0,994 0,908 0,991

Para calcular el rendimiento de lactosa en clulas (

) se linealizaron los datos de

concentracin celular obtenidos por turbidimetra y peso seco con la concentracin de lactosa segn la Ecuacin 2. Para la fase aireada se consideraron, para ambos mtodos de medicin de la concentracin celular, las muestras medidas entre las 2,5 y 6,5 h de cultivo. La linealizacin as obtenida puede apreciarse en la Figura 5.

9 8 7
Biomasa [g/L]

6
5 4 3

2
1 0 15,0

20,0

25,0
Sustrato [g/L]

30,0

35,0

Figura 5: Representacin de la concentracin de lactosa [g/L] versus la concentracin celular [g/L] para la zona exponencial aireada. Biomasa determinada mediante peso seco (). Biomasa determinada mediante turbidimetra ().

13 El rendimiento de lactosa en clulas para la fase sin aireacin se calcul con los datos comprendidos entre las 6,5 h (corte del suministro de aire) y el final del tiempo de cultivo para ambos mtodos de determinacin de la concentracin celular. Esto puede apreciarse en la Figura 6.
9,3

9,2
9,1

Biomasa [g/L]

8,9
8,8 8,7 8,6

8,5

0,0

5,0

10,0

15,0

Sustrato [g/L]
Figura 6: Representacin de la concentracin celular [g/L] versus la concentracin de lactosa [g/L] para la zona exponencial no aireada. Biomasa determinada mediante peso seco (), biomasa determinada mediante turbidimetra (). Los valores del rendimiento de lactosa en clulas calculados para ambas fases del cultivo, as como los coeficientes de correlacin (r2) se presentan en la Tabla 5. Tabla 5: Valores obtenidos de rendimiento de lactosa en clulas durante las fases con y sin aireacin del cultivo piloto Datos Peso seco, F. aireada Turbidimetra, F. aireada Peso seco, F. no aireada Turbidimetra, F. no aireada

0,40 0,44 0,02 0,02

0,973 0,974 0,947 0,989

14 Durante el transcurso de la experiencia se prepararon 10 muestras de caldo centrifugado y filtrado para la determinacin de etanol mediante cromatografa. Al momento de entregar este informe aun no se dispona de los resultados de dichas mediciones, sin embargo se espera contar con ellas durante la primera semana de mayo y agregar esta informacin a una posible futura presentacin.

15

5 DISCUSIONES
Luego del la interrupcin en el suministro de aire a las 6,5 h de cultivo se observ una notable disminucin en la velocidad especfica de crecimiento, mientras que la concentracin de lactosa en el medio disminua ininterrumpidamente (vase Figura 1 y Figura 2). Estos hechos indicaran que la variedad de K. marxianus utilizada en la experiencia es Kluyver negativa, dado que es capaz de fermentar la lactosa en condiciones anaerobias (supuestas en base a la ausencia de aireacin, la hermeticidad del fermentador y la presin positiva de CO2 generada por la fermentacin). Sin embargo dado que no fue posible monitorear la concentracin de oxgeno disuelto en el caldo no es correcto asegurar con certeza que la cepa es Kluyver negativo. Esto repercute en que cuando se suspende el suministro de aire, la cepa degrada la lactosa sin crecer significativamente, lo que se traduce en un desperdicio de sustrato si este estaba destinado a la generacin de biomasa. Esto es claro al comparar la concentracin celular cercana a 9 g/L alcanzada versus una concentracin celular mxima de entre 12,4 y 13,2 g/L estimados en base al rendimiento de sustrato en clulas de la fase aerobia (0,40-0,44) y la concentracin celular alcanzada al momento de cortar el suministro de aire. Si la cepa hubiese sido Kluyver positivo la concentracin de lactosa no habra disminuido y, una vez reanudado el suministro de aire, se piensa que el sustrato podra haber sido aprovechado siempre que la maquinaria celular no hubiese resultado daada por la falta de aire. La velocidad de crecimiento en la fase aerobia, 0,42 h-1 de acuerdo a la medicin de biomasa mediante peso seco y 0,48 h-1 segn la medicin realizada por turbidimetra, se encuentra dentro de lo esperado segn la recopilacin bibliogrfica realizada (vase Tabla 1). Para la etapa sin suministro de aire la velocidad de crecimiento especfica calculada a partir de las mediciones de biomasa mediante peso seco y turbidimetra son 0,013 h-1 y 0,011h-1 respectivamente. Valores menores a los reportados en bibliografa los que varan entre 0,16 h-1 (Acevedo et al, 1996) y 0,02 h-1 a 0,04 h-1 para 40 y 10 g/L de lactosa respectivamente (Pinheiro et al. 2000). Cabe cuestionar la validez de la velocidad especfica de crecimiento para la zona anaerobia ya que se combinan los hechos de disponer de pocas mediciones, un corto tiempo de anlisis y la dificultad de realizar adecuadamente las altas diluciones

16 necesarias para la determinacin de la biomasa mediante turbidimetra para un cultivo con una concentracin celular de alrededor de 9 g/L. Los valores de rendimiento de lactosa en clulas para la fase aerobia (0,40 y 0,44 para la biomasa determinada mediante peso seco y turbidimetra) y anaerobia (0,02 por ambos mtodos de medicin) se encuentran cerca de los valores reportados en bibliografa: entre 0,4 y 0,5 para cultivo aerobio (Pinheiro et al. 2000) y 0,06 para un cultivo sin aireacin (Acevedo et al.1996). Los valores calculados se encuentran por debajo del rendimiento de lactosa en clulas estimado en base al rendimiento terico mximo y el uso del factor para cultivo aerobio y 0,1 para cultivo anaerobio): (0,6

El porcentaje de carbono en clulas se obtuvo desde bibliografa (Krzystek y Ledakowicz, 2000). Durante las primeras 3 h de cultivo, se observa que la biomasa aumenta pero que el sustrato no disminuye proporcionalmente. Esto puede deberse a los errores cometidos durante la dilucin de la muestra para la determinacin de la cantidad de sustrato, ya que durante las primeras horas de cultivo la alta concentracin de lactosa obliga a utilizar elevadas diluciones (1:30), lo que aumenta el error en la medicin.

17

6 CONCLUSIN
Un cultivo industrial cuyo fin sea la produccin de biomasa de K. marxianus resultara severamente perjudicado si se interrumpe el suministro de aire durante el transcurso del mismo, esto si se trata de una cepa Kluyver negativa, la que es capaz de degradar sustrato en estas condiciones sin presentar una velocidad de crecimiento significativa. Para establecer fehacientemente si la cepa estudiada corresponde al tipo Kluyver negativa o positiva se recomienda instalar un medidor de oxigeno disuelto o desplazar el oxgeno en el fermentador, una vez suspendido el suministro de aire, con nitrgeno. De esta forma se aseguran las condiciones anaerobias en el caldo.

18

7 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Acevedo F. , J. C. Gentina, N. Bojorge, I. Reyes, y A. Torres. 1996. Development of a pilotplant fermentation process for the production of yeast lactase. Annals of the New York Academy of Sciences, 799:559-562. Fonseca G. , E. Heinzle, C. Wittmann, y A. Gombert. 2008. The yeast kluyveromyces marxianus and its biotechnological potetial. Applied Microbiology Biotechnology, 79:339-354. Krzystek L. y S. Ledakowicz. 2000. Stoichiometric analysis of kluyveromyces fragilis growth on lactose. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 75:1110-1118. Lukondeh T. , N. J. Ashbolt, y P. L. Rogers. 2005. Fed-batch fermentation for production of kluyveromyces marxianusii 510700 cultivated on lactosed-based medium. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 32:284-288. O'Shea D. y P. Walsh. 2000. The effect of culture conditions on the morphology of the dimorphic yeast kluveromyces marxianus var. marxianus nrrly2415: a study incorporating image analysis. Applied Microbiology Biotechnology, 53:316-322. Pinheiro R. , I. Belo, y M. Mota. 2000. Air pressure effects on biomass yield of two different kluyveromyces strains. Enzyme and Microbial Technology, 26:756-762. Walker G. M. 1998. Yeast: physiology and Biotechnology. First edition. pages 216 - 217. Chichester: John Wiley and Sons. Zafar S. , M. Owais, M. Saleemuddin, y S. Husain. 2005. Batch kinetics and modelling of ethanolic fermentation on whey. International Journal of Food Science and Technology, 40: 579-604.

19

INDICE DE APNDICES
Apndice .I Apndice .II Apndice .III Apndice .IV

pg.

Mediciones de Biomasa y Sustrato... 20 Curva de Calibrado de Biomasa 23 Curva de Calibrado de Sustrato. 24 Diseo del Buffer del Reactor de Propagacin 26

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APNDICE .I MEDICIONES DE BIOMASA Y SUSTRATO

A continuacin se presentan los resultados de las mediciones realizadas durante el transcurso de la fermentacin en el reactor piloto para la concentracin de clulas y lactosa. En ambos casos se entrega el valor de absorbancia transformado en concentracin celular o concentracin de lactosa mediante la Ecuacin 4 y la Ecuacin 5 respectivamente. Tabla 6: Mediciones de sustrato realizadas durante la experiencia de fermentacin en el reactor piloto. Tiempo 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 Medicin 1 [g/L] Medicin 2 [g/L] E E E 31,7 31,9 31,4 29,6 27,4 26,4 24,3 21,7 18,4 12,7 9,86 8,20 5,61 3,36 31,6 31,2 30,9 30,9 29,9 29,9 28,6 26,9 26,0 23,9 22,7 18,3 13,2 9,97 8,02 5,58 E

Las mediciones marcadas con E fueron eliminadas ya que no se encontraban en el rango de la curva de calibrado La concentracin celular determinada mediante turbidimetra durante el transcurso del cultivo en el reactor piloto se presenta en Tabla 7. A medida que aument la concentracin celular

21 tambin aument la variacin entre duplicados de la misma muestra haciendo necesario repetir hasta 6 veces la medicin. Tabla 7: Medicin de la concentracin celular realizadas mediante turbidimetra (M1, M2M6) denotan mediciones realizadas sobre la misma muestra. Tiempo [h] 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 M1[g/L] 0,75 0,81 0,88 1,10 1,45 1,90 2,38 3,28 4,35 5,39 6,90 8,11 9,29 9,12 9,78 9,71 9,78 0,87 1,11 1,48 1,90 2,37 3,35 4,31 5,37 7,03 8,01 9,58 9,85 9,71 3,49 5,36 7,10 9,81 9,75 9,39 9,78 6,38 6,16 6,53 M2[g/L] M3[g/L] M4[g/L] M5[g/L] M6[g/L]

22 La Tabla 8 muestra el resultado de las mediciones de concentracin celular determinadas mediante peso seco. Se eliminaron las muestras comprendidas entre el inicio del cultivo y las 1,5 h debido a errores cometidos en la ejecucin del protocolo. Tabla 8: Medicin de la concentracin celular determinada mediante peso seco Tiempo cultivo Masa de clulas 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 1,66 1,62 2,12 2,62 3,34 4,16 5,1 6,12 7,39 8,58 8,71 8,72 8,94 8,83

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APNDICE .II CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA

Se necesita un caldo de cultivo crecido, del que se debe conocer su concentracin celular por peso seco. Para esto se toman alcuotas que se centrifugan por 15 minutos a 10000 RPM, el sobrenadante es descartado y el pellet se somete al protocolo de determinacin de biomasa por peso seco. Del caldo se preparan distintas diluciones y se mide su absorbancia comparando con un blanco de medio de cultivo estril. Se construye la curva de calibrado donde se correlaciona la absorbancia registrada con la concentracin celular de peso seco. Siguiendo lo anterior, se tiene que el caldo empleado posee una concentracin celular de 2,17 g/L (promedio de 2,11; 2,15 y 2,25 g/L). Luego se realizan diluciones 1:10; 1:15; 1:20 y 1:30 a las que se le mide la absorbancia, registrando valores de 0,706; 0,510; 0,422 y 0,293 respectivamente. Esto permite construir las siguientes expresiones que relacionan la concentracin y la absorbancia.

Ecuacin 4

donde: : absorbancia : concentracin de biomasa

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APNDICE .III

CURVA DE CALIBRADO DE SUSTRATO

Para la determinacin de la curva de calibrado para la deteccin de lactosa mediante el mtodo DNS se prepar una solucin estndar de concentracin conocida de 1,5 g/L. A partir de esta solucin se dispuso de una batera de diluciones desde 0 g/L a 1,5 g/L por duplicado, a las cuales se les aplic el mtodo de DNS y se midi su absorbancia respectiva a 540nm. Los datos formulados se exponen en la Tabla 9. Tabla 9: Datos obtenidos para la realizacin de la curva de calibrado de lactosa Muestra 1 2 3 4 5 6 Volumen Solucin Estndar [ml] 1 2 4 6 8 10 Volumen Agua Concentracin Absorbancia Destilada[ml] [g/L] 1 9 8 6 4 2 0 0,150 0,300 0,600 0,900 1,20 1,50 0,040 0,122 0,276 0,409 0,562 0,742 Absorbancia 2 0,040 0,113 0,263 0,415 0,538 0,725

El grafico obtenido entre absorbancia y concentracin de lactosa del total de los datos expuestos se presenta en la Figura 7.

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0,8 0,7 0,6

Absorbancia

0,5 0,4 0,3

0,2 0,1
0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Concentracin de lactosa (g/L)

Figura 7: Curva de calibrado biomasa La correlacin obtenida con presentados en la Tabla 9 es: Ecuacin 5 Donde: : absorbancia : concentracin de lactosa entre absorbancia y concentracin para los datos

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APNDICE .IV PROPAGACIN

DISEO DEL BUFFER DEL REACTOR DE

Para disear el tampn se utilizar cido ctrico monohidrato y se ajustar el pH con hidrxido de sodio. Para realizar el diseo se consideraron las especies qumicas de la Tabla 10, considerando los subndices i para la concentracin al inicio de la fermentacin y f para el final de la fermentacin. El pH al que se realizar la fermentacin ser entre 4,5 al comienzo y 4 al final de la fermentacin. Se trabajar con pH cido debido a que esto genera una presin de seleccin para levaduras, se escogi este rango debido a que ha sido utilizado con xito en otros trabajos con Kluyveromyces (Acevedo et al., 1996). Tabla 10: Especies qumicas consideradas para el diseo del buffer Especie qumica [g/L] Citrato total agregado Citrato estado de oxidacin 0 Citrato estado de oxidacin -1 Citrato estado de oxidacin -2 Citrato estado de oxidacin -3 Ion hidrxido Protones Ion Sodio Ion Sulfato Smbolo

Balance de masa de las especies del citrato al comienzo de la fermentacin: Ecuacin 6 Balance de cargas al inicio del cultivo: Ecuacin 7 Balance de masa de las especies del citrato al final de la fermentacin: Ecuacin 8 Balance de cargas al final del cultivo: Ecuacin 9

27 Cada una de las especies del citrato puede ser expresada en funcin de la concentracin de protones y la concentracin de citrato con estado de oxidacin cero , de acuerdo a las

ecuaciones de equilibrio qumico. Ecuacin 10 Despejando las variables: Ecuacin 11

Resolviendo el sistema de ecuaciones al remplazar la Ecuacin 11 en la Ecuacin 6, Ecuacin 7, Ecuacin 8 y Ecuacin 9, y considerando el equilibrio del agua tenemos los resultados de la Tabla 12, utilizando los datos del proceso expuestos en la Tabla 11. Tabla 11: Datos del proceso de fermentacin Especie qumica Concentracin [M]

Tabla 12: Resultados del diseo del buffer Especie qumica Concentracin [M] Concentracin [g/l]

: Expresados como cido Ctrico monohidrato. : Expresado como Hidrxido de Sodio

Finalmente, para la preparacin de 10 L de medio de cultivo se deber agregar 242 g de cido ctrico monohidrato, y posteriormente se deber ajustar el pH con 64,3 g de hidrxido de sodio. Experimentalmente esto se debe realizar agregando una solucin de hidrxido de sodio mientras se mide el pH.