Objetivo: Este procedimento visa estudar os procedimentos de separao e recuperao da invertase.

Identificaremos experimentalmente esta enzima entre outras enzima desconhecidas e verificaremos sua massa molecular.

Introduo: Enzimas so protenas utilizadas em reaes biolgicas em condies ideais (pH, temperatura, concentrao de substrato, etc.). So biomolculas com alta capacidade especifica e poder cataltico que regem praticamente todo o funcionamento celular interno, favorecendo o metabolismo anablico (construo) e catablico (degradao). Quanto maior o seu teor, maior ser a velocidade da reao, consumindo assim, a quantidade proporcional de substratos para reagir com as enzimas. Conforme a demanda no consumo de reagentes vai ocorrendo, a velocidade da reao decai gradativamente. A grande especificidade de uma enzima determinada pelo tamanho e forma tridimensional, formando regies de afinidade com os reagentes (substratos). A essa complementaridade, denominamos combinao chave-fechadura.

Pode-se representar a reao como segue: E + S -> ES -> EP -> E + P , onde:E = enzima; S = substrato; P = produto Alguns microrganismos so capazes de produzir diversas enzimas de interesse industrial. Dentre esses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae, popularmente conhecida como fermento de panificao, produz a enzima invertase que capaz de hidrolisar a sacarose para produzir o acar invertido que muito utilizado pela indstria de alimentos, pois a frutose mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e no cristaliza to facilmente melhorando a textura de doces e sorvetes. . Em geral, a invertase produzida por leveduras intracelular e a produzida por fungos extracelular e, na maioria das vezes, so glicoprotenas contendo cerca de 10 a 50% de carboidratos.

Transformao da Sacarose em Glicose + Frutose

As dosagens das enzimas so medidas atravs de suas atividades enzimticas, que avaliada pela velocidade de reao que a enzima catalisa ( substrato ou produto). Uma amostra contendo a a enzima encubada com alta concentrao de substrato (para que toda a enzima seja utilizada, e a velocidade da reao ser mxima). A velocidade da

reao medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).

Conhecendo a faixa de concentrao de enzima que permite obter uma variao linear da concentrao de substrato, podemos conferir a atividade desta enzima. A equao de Michaelis e Menten uma equao que relaciona velocidade da reao catalisada com a concentrao de substrato. Assim,

Quando Vo exatamente a metade de Vmax, temos que

onde Km, equivale concentraaod e substrato na qual, Vo a metade de Vmax, quanto menor for o valor de Km, maior ser a afinidade da enzima pelo substrato.

Grfico1: Variao de Vmax com a concentrao de substrato.

PRODUO INDUSTRIAL DE ENZIMAS. A produo de enzimas em escala industrial se faz por fermentao. Poucos so os processos prvios fermentao, no caso da produo de enzimas, um dos mais importantes o preparo do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculo com a cultura estoque liofilizada. H de se tomar cuidado com alguns parmetros durante a fermentao, como presena de contaminao, infeco por bacterifagos,

proliferao de mutantes entre outros. Aps a fermentao, h de se recuperar e purificar as enzimas, com a finalidade de remover substncias txicas e deixa-la pura para o processo em que ser utilizada. A purificao das enzimas depende principalmente do destino a qual sero utilizadas. Para aplicaes farmacuticas, fundamental a alta pureza, enquanto em aplicaes industriais considerada secundria, assim, interferindo no preo e na quantidade obtida. O processo de separao e recuperao depende inicialmente do tipo de enzima de interesse, intracelular ou extracelular. Para as enzimas extracelulares, o processo de recuperao tem incio no lquido fermentado ou no lquido de extrao do substrato; j para as enzimas intracelulares necessrio aplicar algum mtodo prvio de ruptura celular a fim de liberar as enzimas. Em todas as etapas de separao e recuperao das enzimas necessrio manter condies s quais as enzimas no perdero atividade. Para que seja possvel a purificao das enzimas, as clulas so separadas do meio lquido e refrigeradas (para preservar a atividade enzimtica). Os procedimentos empregados na purificao das enzimas podem se agrupados com base na caracterstica da protena que serve como base para a separao: Caracterstica da Protena Solubilidade Procedimento de separao Precipitao por salificao Precipitao isoeltrica Precipitao por solventes Cromatografia de troca inica Eletroforese Focalizao isoeltrica / Precipitao isoeltrica Cromatografia de adsoro Cromatografia em papel Cromatografia em fase reversa Dilise e ultrafiltrao Cromatografia de permeao em gel Eletroforese em gel Ultracentrifugao Precipitao por salificao ("salting out"): Os sais neutros tm efeitos profundos na solubilidade das enzimas. Em concentraes menores os sais aumentam a solubilidade de muitas delas, um fenmeno denominado solubilizao por salificao (salting - in). Por outro lado, medida que a fora inica aumentada, a solubilidade se reduz. Em foras inicas, suficientemente elevadas, uma protena pode ser quase completamente precipitada. Precipitao isoeltrica: O pH em que a molcula proteica tem sua solubilidade mnima seu pH isoeltrico definido como o pH em que a molcula no apresenta carga eltrica efetiva e incapaz de se deslocar em um campo eltrico. Nessas condies, no existe repulso eletrosttica entre as molculas vizinhas, e a elas tendem a coalescer e precipitar. Precipitao por solvente: A uma dada fora inica e pH, a solubilidade das enzimas proporcional a constante dieltrica da soluo. Esse fato permite precipitar protenas contidas em soluo aquosa pela adio de solventes de constante dieltricas menores que a da gua. Em geral, etanol e acetona so usados para essa finalidade.

Carga

Polaridade

Tamanho

Cromatografia de troca inica: No procedimento cromatogrfico, uma mistura de protenas aplicada na coluna que em seguida eluda com uma soluo de pH prdefinido (acima do pI, quando se usa uma coluna trocadora de nions; abaixo do, quando se usa uma coluna trocadora de ctions). A enzima apresentar forte interao eletrosttica com a fase estacionria da coluna e ento permitir que a enzima seja eluda da coluna. Eletroforese e Eletrofocalizao: Essas duas tcnicas se baseiam na mobilidade de uma protena quando submetida a um campo eltrico. As tcnicas eletroforticas so muito empregadas na caracterizao analtica de protenas, mas raramente so usadas na purificao preparativa. Cromatografia de adsoro:Neste processo, o de mais ampla utilizao, duas substncias so ligadas por uma interface onde no ocorre solubilizao. A fase estacionria slida e a fase mvel pode ser lquida ou gasosa. Baseia-se nas atraes eletrostticas ou dipolares da superfcie da fase estacionria pelas molculas da substncia a separar. Cromatografia em papel: uma tcnica de partio, utiliza uma misturas de lquidos, um atuando como fase mvel (eluente) e outro atuando como fase estacionria. Ocorre a reteno das substncias devido s diferentes afinidades para com as fases estacionria e mvel.A mistura aplicada no papel e mergulhada na mistura das fases lquida e estacionria. A tira de papel de suporte colocada em um cuba contendo o eluente. Esta fase mvel (solvente) sobe por capilaridade e arrasta a substncia pela qual tem mais afinidade, separando-a das substncias com maior afinidade pela fase estacionria. As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, solues de cloreto frrico e tiocianoferrato de potssio, fluorescncias, radioatividade, etc. Cromatografia de fase reversa: Consiste em uma fase imvel apolar e uma fase mvel de polaridade moderada. O tempo de reteno maior para as molculas de natureza apolar, enquanto as molculas de carter polar eluen mais rapidamente. A cromatografia de fase reversa baseia-se no princpio das interaes hidrofbicas que resultam das foras de repulso entre o solvente, o composto relativamente apolar, e a fase estacionria apolar. Dilise e ultrafiltrao: Dilise uma das tcnicas mais simples de purificao baseada no tamanho. Basicamente se utiliza uma membrana semipermevel para reter molculas proticas permitindo a passagem das molculas menores do soluto e da gua. Usada frequentemente aps uma etapa de precipitao com sulfato de amnio. Normalmente o precipitado carrega quantidade significativa de sal requerendo a dessalinizao por dilise. Ultrafiltrao est baseada num princpio semelhante ao da dilise, ou seja, molculas menores so separadas da soluo contendo a enzima de interesse, atravs da passagem por uma membrana semipermevel. Muitas vezes a ultrafiltrao empregada e classificada como uma etapa de concentrao, uma vez que permite a retirada de grande quantidade de gua alm de solutos de baixa massa molar. Cromatografia de permeao em gel: O processo de separao realizado utilizando-se uma matriz com porosidade controlada, empacotada numa coluna e envolta pela fase mvel. Uma mistura de molculas de diferentes tamanhos aplicado na coluna, as molculas menores iro penetrar nos poros, assim, tero um movimento mais lento. Vide figura 1. As molculas maiores passam pela coluna com a fase mvel e so eludas primeiro, j as de tamanho intermedirio podem entrar no gel e so eludas na ordem direta em relao ao tamanho, com as de menor PM saindo num volume de eluio menor. Uma coluna cromatogrfica empacotada com um gel de excluso pode ainda ser calibrada com

protenas de massas molares conhecidas e ento usada como para a determinao de massas molares desconhecidas.

Figura 1: esquema de funcionamento de uma cromatografia de permeao em gel Conforme os volumes so eluidos, as absorbncias so lidas e assim consegue-se diferenciar os picos de eluio. Utilizando enzimas com massas moleculares conhecidas, consegue-se construir uma curva padro com log das massas moleculares x volumes de eluio e assim podemos descobrir a massa molar de alguma enzima desconhecida conforme seu volume de eluio nesta mesma coluna. Eletroforese em gel: uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa iro migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato das molculas tambm influi, pois algumas tero maior facilidade para migrar pelo gel. Ultracentrifugao: Centrifugao por gradiente de tamanho ou por densidade da molcula (isopicnica). A partcula ir estacionar na posio onde o tamanho/ a densidade da soluo for prximo ao da partcula. 4.1 Materiais Erlenmeyer de 500 mL e boca larga Bquer de 250-500 mL Funil de vidro Papel de filtro cortado em crculo

 Suporte universal com garra circular Tubos com tampa de borracha Pipeta volumtrica de 1, 2, 5 e 10 mL Balo volumtrico de 10, 25 e 50 mL Pipeta volumtrica de 1 mL, tubos de ensaio e grade para tubos de ensaio Cmara de fluxo laminar Agitador/incubador a 30C Faca e pina esterilizada banho em ebulio. Cromatgrafo G&E modelo ??????? Colunas de excluso molecular Superose 10/300 com tamanho mximo de poro de mais ou menos 70 kDa. Coletor de fraes e tubos de ensaio para coleta das fraes. Espectrofotmetro de dois feixes marca ?????? Reagentes: Meio preparado e esterilizado contendo 1g/L de glicose e 0,5 g/L de extrato de levedura. Soluo reagente de DNS (cido dinitro-saliclico), tampo citrato de sdio 50 mM pH 5,5, soluo de sacarose 5%. Mtodos: Produo da invertase: Dentro de uma cmara de fluxo laminar, adicionar de tablete de 15g de Saccharomyces cereviseae ( fermento comum) a um Erlenmeyer de 500 mL contendo 50,0 mL de meio previamente esterilizado. Colocar o frasco em agitao de 120 rpm a 30 C por cerca de 18 horas. Cromatografia em coluna de excluso por tamanho Filtrar cerca de 5 mL do filtrado do cultivo de levedura, agora com um filtro com poro de 0,45 micrometrose reservar a amostra filtrada. No cromatgrafo previamente ajustado para este estudo injetar 1mL do extrato, e coletar, 40 fraes de 1 mL em tubos de ensaios, para cada frao obter a absorbncia em 280nm que fornecido pelo software do cromatgrafo e proceder a determinao de atividade relativa de invertases nas fraes coletadas conforme descrito a seguir.

Medidas de atividade da invertase: Adicionar nos tubos de ensaios contendo as fraes coletadas 0,5 mL de soluo de sacarose 5%, 0,5 mL de tampo citrato de sdio 50 mM pH 5,5.Agitar bem o tubo e imediatamente dispare um cronmetro, mantendo a reao por 15 minutos temperatura ambiente. Ao trmino do tempo de reao, adicionar 3mL do reagente DNS ao interior do tubo para parar a reao e levar os tubos para o banho maria em ebulio por 5minutos. Preparar solues para "zerar" o espectrofotmetro sem a presena de acares redutores. Para isso, adicionar 0,5 mL de tampo citrato 50 mM pH 5,5, 1 mL de gua e 3 mL de reagente de DNS levar o tubo de ensaio, em banho em ebulio por 5 minutos e reservar esta soluo para zerar o espectrofotmetro. Resfriar os tubos e no espectrofotmetro zerar o aparelho, realizar as leituras no comprimento de onde de 540 nm e anotar os resultados obtidos. Resultados e discusses:

Eluindo-se protenas com massas moleculares j conhecidas na coluna preparada, e lendose as absorbncias a 280nm, calculou-se a curva padro utilizando o log da massa molar e o volume de eluio. As protenas usadas, suas massas moleculares, seus volumes de eluio e o log das massas esto na tabela abaixo.

Tipo de protena Albunina Anidrase Carbonica Citocromo C Aprotimina

Massa Molecular (KD) 66 29 12,4 6,5

Volume da eluio (mL) 14,8 20 24,8 29

Log da Massa Molecular 1,8195 1,4624 1,0934 0,8129

Acurva de calibrao obtida encontra-se abaixo.

Curva de calibrao
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 Volumes de eluio (mL) Log da massa molecular

Log da Massa Molecular Linear (Log da Massa Molecular)

Log da massa molecular= -0,0715(volume de eluio) + 2,8811 R = 0,9993 Depois de calibrada a coluna, a mesma foi utilizada na purificao da enzima produzida anteriormente. Fez-se a leitura de varredura das absorbncias a 280nm, indicando algumas enzimas que estavam presentes na amostra. Utilizou-se a absorbncia citada, pois a invertase absorve luz nessa faixa. Com os dados obtidos, conseguimos traar uma curva com as eluies das enzimas, conforme seus volumes. Vide grfico

Absorbancia de varredura
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 0

10

20

30

40

50

Foi necessrio fazer o teste da medida da atividade da invertase para saber em qual volume de eluio, esteve presente a invertase. A absorbncia a 540nm mostrou que a enzima invertase foi eluida nos volumes de 17mL, 18mL e 19mL. Isso significa que diferentes tipos de invertases, de atividades especficas diferentes foram detectadas.

Atividade da invertase
0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 -0.02 10 20 30 40 50

Com a sobreposio dos grficos, das absorbncias de 280nm e 540nm, podemos perceber claramente qual o pico referente a invertase na varredura a 280nm, alm de perceber outros picos relativos a outras enzimas nos volumes 8mL, 16mL, 22mL e 31mL.

Absorbncias a 280nm e 540nm

0.5 0.45 0.4 Absorbncia 280nm 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 0 10 20 Volume (mL) 30 40 0.02 0 50 -0.02 0.06 0.04 abs240 abs540 0.12 0.1 Absorbncia 540 nm 0.08

Com a curva padro possvel calcular as massas moleculares de todos os picos obtidos nas absorbncias de 280nm e 540nm. Os dados de massas moleculares so representados na tabela abaixo: Volume de eluio (mL) 8 16 17 18 19 22 31 Log Massa Molecular 2,3093 1,7373 1,6658 1,5943 1,5228 1,3083 0,6648 Massa Molecular (kDa) 203,84 54,61 46,32 39,29 33,27 20,33 4,62

A absorbncia 540nm, mostra o pico de atividade em 18 mL (referente a invertase de39,29kDa), enquanto 280nm, mostra que a enzima tem seu pico em 17mL (referente a invertase de 46,32kDa). Isso nos mostra que por mais que esteja em maior quantidade, a enzima eluida a 17mL, tem uma atividade menor que a atividade da enzima eluida a 18mL, mesmo que esta esteja em uma quantidade menor. Enzimas que foram liofilizadas e armazenadas tambm foram estudadas como as produzidas para o experimento e os resultados tanto da varredura a 280nm assim como a leitura a 540nm (aps o teste de DNS) foram colocados em um grfico:

4.00 Absorbncia 280 nm 3.00 2.00 1.00 0.00

Absorbncia de amostras de Invertase liofilizada em 280 e 540 nm 0.80

0.60 0.40 0.20 0.00 0.0 10.0 20.0 30.0 Volume de Eluio (mL) 40.0 50.0 Absorbncia 540 nm

Abs 280 nm Abs 540 nm

A diferena entre as alturas dos picos se deve ao fato de a amostra liofilizada estar mais concentrada. Descartou-se o pico entre 8mL e 11 mL na absorbncia de 540nm, pois pode se tratar de algum tipo de contaminante na coluna de permeao. Sobrepondo os resultados dos dois experimentos verificamos que os resultados se assemelham, a diferena que por mais que as amostras liofilizadas estejam mais concentradas, tem uma atividade enzimtica menor do que as enzimas que no foram armazenadas pelo mesmo processo.