ESPECTROFOTOMETRA

RESUMEN En las prcticas de espectrofotometra se realiz una curva de calibracin con KMnO4 y se midi la concentracin de una muestra problema, de igual forma se realiz una curva patrn con albumina de suero bovino para la determinacin de la concentracin de protenas en sangre de un estudiante. INTRODUCCIN La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas y bacterias. La Mecnica Cuntica nos dice que la luz est compuesta de fotones cada uno de los cules tiene una energa: E fotn = h= hc/ , Donde c es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y h= 6.6 10-34 Js es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia qumica absorbe luz de longitud de onda , esto significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. En las prcticas realizadas se midieron absorbancias a 526nm y 540nm que corresponde a la regin visible lo cual podemos evidenciar ya que las soluciones presentaban colores observables al ojo humano, sin embargo, se pueden usar estas tcnicas para hacer mediciones en regiones en las que no se observa color alguno en zonas del uv, o infrarrojo. Las molculas que absorben la energa del fotn pasan a un estado excitado de mayor energa y siguiendo la ley de conservacin de la energa la diferencia entre la intensidad incidida y la que se obtiene en el detector ser la cantidad de fotones absorbidos por la muestra que es proporcional a la concentracin del analito en la solucin.

una molcula slo puede absorber fotones cuya energa hsea igual a la energa de un estado molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrnica y que la distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea de identidad de cada sustancia o molcula como se muestra en la figura 1

Figura 1: espectro de absorcin de 2 molculas A y B para 4 diferentes longitudes de onda. El instrumento usado en la prctica se trata de un fotmetro, como el que se muestra en la figura 2

Figura 2 componentes de un fotmetro La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta debido a la absorcin de las molculas de la muestra. El ritmo de absorcin depende de la intensidad inicial de luz y de la concentracin de molculas. De esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en una muestra con una concentracin de molculas [B], se produce una atenuacin de intensidad dI dada por: dI k BI dL La constante k se denomina coeficiente de absortividad molar. La expresin anterior se puede integrar de la siguiente forma:

lo cual da lugar a la ley de Beer-Lambert1 para la absorcin que relaciona la intensidad a la salida e la muestra If, con la intensidad inicial I0, la concentracin de molculas y la distancia recorrida por la luz en la muestra, L:

El fotmetro, en lugar de la intensidad, mide la absorbancia A que se define por:

La utilizacin de la absorbancia al realizar los espectros tiene la ventaja de ser directamente proporcional a la concentracin de molculas en la muestra.

OBJETIVOS Preparar curvas patrn para realizar mediciones en el fotmetro. Realizar anlisis espectrofotomtricos para determinar la concentracin de muestras problema

Procedimiento El procedimiento se lleva a acabo como lo est descrito en la gua de laboratorio. ANLISIS Y RESULTADOS Para la primera prctica se tom una solucin de KMnO4 (100 ppm), se diluy para obtener las siguientes concentraciones y respectivas absorbancias. Concentracin Vol. de la madre (mL) 0,2 solucin Vol. Final (mL) Absorbancia

10

0,135

4 8 10 Muestra problema 1 Muestra problema 2

0,4 0,8 1

10 10 10

0,181 0,325 0,410 0,220 0,390

Tabla 1 valores obtenidos para la primera prctica La frmula utilizada es V1C1 = V2C2, llevando a un baln de 10mL. As para la concentracin de 2ppm tenemos 100ppm x X = 2ppm x 10mL X= 2x10/100 = 0,2mL y se lleva al aforo de 10mL La medicin en el fotmetro se llev a cabo a 526nm que corresponde a un color verde, y el opuesto visto desde un crculo cromtico es el color morado, color de la solucin de KMnO4, ya que esta solucin absorbe en la longitud de onda del verde. Al realizar el grfico obtenemos:

Chart Title
0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 Axis Title 10 15

y = 0.0353x + 0.0472 R = 0.9901

Axis Title

Series1 Linear (Series1)

Grfico 1 grfica de absorbancia vs concentracin. Con la ecuacin de la recta interpolamos los puntos de absorbancia de las muestras problema encontrando las siguientes concentraciones: y = 0,0353x + 0,0472

(0,220 0,0472)/0,0353 =X X= 4,9ppm Y la segunda muestra problema X= 9,7 ppm

La albmina es una protena que se encuentra en gran proporcin en el plasma sanguneo, siendo la principal protena de la sangre, y una de las ms abundantes en el ser humano. Es sintetizada en el hgado y supone un 54,31% de la protena plasmtica. Para la segunda prctica se realiz una curva patrn con albumina de suero bovino debido a que la cantidad de protena es similar a la cantidad que se encuentra en la sangre humana, se adicion a cada muestra tanto para la curva como para las muestra problema una cantidad de 3mL de reactivo de Biuret, que reacciona con las protenas y les confiere una coloracin azul oscuro producida por un complejo de CU2+, la longitud de onda escogida para hacer la medicin es de 540nm que corresponde a un color amarillo-verdoso y el color que se observa al frente en un crculo cromtico es el azul oscuro que es el color de la muestra con el reactivo de Biuret. Las concentraciones para la curva y muestra problema se llevaron a cabo con lo descrito por la tabla 2 REACTIVO ML Albmina 0.2 3mg/mL (mls) H2O (mL) Reactivo de Biuret (mL) concentracin Absorbancia 3.0 3.0 0 0 2.8 3.0 0,1 0,031 2.6 3.0 0,2 0,06 2.3 3.0 0,35 0,128 2.0 3.0 0,5 0,142 1.0 3.0 1 0,269 0 3.0 1,5 0,371 0,33 2.0 3.0 0.4 0.7 1.0 2.0 3. 1 2 3 TUBO NMERO 4 5 6 7 8

Tabla 2: informacin para preparar las soluciones de la curva, muestra problema y absorbancias registradas. De manera similar a la prctica uno se realiza el clculo de las concentraciones V1C1 = V2 C2

As, para el tubo 2 la concentracin es de 0,2 x 3 = 6 x X X= 0,1 mg/mL Con los valores obtenidos se realiza la grfica

Grafica 2: grfica de los valores obtenidos en la prctica Tenemos un valor alejado de los datos, debido a que no se hicieron repeticiones no se puede confiar de manera certera en este dato, para obtener una mejor linealidad vamos a despreciar el dato obtenido en el tubo 4 dndonos la siguiente grfica

Chart Title
0.4 0.35 0.3 Axis Title 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 Axis Title 1.5 2 Series1 Linear (Series1) y = 0.2445x + 0.0132 R = 0.9964

Grfica 3 grfica obtenida despreciando un valor alejado. Con esta grfica trabajaremos la muestra problema, siendo la ecuacin de la grfica y = 0,2445x + 0,0132 la concentracin de la muestra problema es: X= (0,33 0,0132)/0,2445 = 1.29 mg/mL Esta es la concentracin en los 6 mL, pero la muestra que se agreg de sangre fue de 2mL, adems, previamente se haba diluido la muestra de sangre de 1/10 mL por tanto

Las concentraciones de albumina en sangre humana estn en una concentracin que oscila entre 35 y 50mg/mL por lo que podemos decir que est en el rango aceptado.

CONCLUSIONES La espectrometra es una tcnica analtica que nos permite conocer la concentracin de una muestra problema realizando una curva patrn del analito de inters, teniendo en cuenta la longitud de onda a la cual absorbe la radiacin electromagntica (fotones). La ley de Lambert .Beer dice que la concentracin de una muestra es proporcional a la cantidad de luz absorbida, siempre y cuando la absorbancia no sobrepase el valor de 1, por tanto las muestras se deben de diluir antes de realizar la medicin y tener en cuenta esa dilucin al momento de realizar los clculos para la identificacin de la concentracin en la matriz. Existen analitos que es difcil la identificacin debido a las longitudes de onda a las que absorben, por tal caso a estos se agregan reactivos en exceso que reaccionen un 100% con el analito de inters y que le confiera propiedades (como el color) para la identificacin mediante las tcnicas espectrofotomtricas. BIBLIOGRAFA Skoog, Duoglas; Holler, James y Nieman, Timothy INSTRUMENTAL. Quinta Edicin. Editorial Mc GRAW HILL. 2001. http://www.espectrometria.com/espectrometria PRINCIPIOS DE ANALISIS

ROCHA Castro E.; PRINCIPIOS BSICOS DE ESPECTROSCOPA; Editorial UACh, Mxico (2000),