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Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioqumica e Biologia Molecular

1 Semestre, 2010/2011

Arsnio Fialho Leonilde Moreira Jorge H. Leito Isabel S-Correia

Instituto Superior Tcnico

Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioqumica e Biologia Molecular

TP1.- Anlise de protenas por electroforese em Gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) TP2.- Caracterizao cintica da enzima invertase TP3.- Extraco do DNA cromossmico de Escherichia coli e clculo da sua concentrao. Extraco rpida e em pequena escala de DNA plasmdico (mtodo da lise alcalina). TP4. Digesto do DNA cromossmico e plasmdico com endonucleases de restrio; separao e visualizao de fragmentos de restrio por electroforese em gel de agarose.

TP.1 - ANLISE DE PROTENAS POR ELECTROFORESE EM GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

Introduo

As protenas constituem uma vasta classe de biomolculas que desempenham na clula funes muito diversas. Para analisar simultaneamente um to grande e variado grupo de compostos, necessrio recorrer a tcnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem pequenas variaes no seu comportamento, de modo a que as vrias molculas sejam diferenciadas. As tcnicas de electroforese caem nesta categoria, e so largamente utilizadas pois baseiam-se no facto de todas as protenas apresentarem uma carga elctrica global quando colocadas num meio de pH diferente do seu ponto isoelctrico. Deste modo possivel provocar a migrao de protenas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migrao variar de acordo com a protena, uma vez que influenciada pelo tamanho, carga, forma e composio qumica de cada molcula. Grosseiramente, pode-se considerar que a migrao electrofortica duma molcula apenas funo da sua densidade de carga, ou seja , da respectiva razo carga/massa. Assim as protenas separar-se-o de acordo com o respectivo valor desta razo: quanto maior ela for, maior ser a velocidade de migrao da molcula. A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) um mtodo rpido e sensvel para analisar a composio de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os monmeros de acrilamida, ao polimerizarem, formam longas cadeias, as quais se ligam entre si por crosslinking (ligaes cruzadas), atravs dos resduos de bis-acrilamida, tambm nelas incorporados. O processo de polimerizao consiste numa reaco em cadeia de radicais livres, iniciada pelo persulfato de amnio (PSA) e pelo N,N,N,N-tetrametilinediamina (TEMED), os quais se encontram presentes na mistura de polimerizao. O PSA activa o TEMED, deixando-o com um electro desemparelhado. Este radical reage ento com uma molcula de acrilamida, transformando-a tambm num radical. Este, por sua vez, reage com um outro monmero de

acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e assim sucessivamente at se formar um polmero com ligaes cruzadas (crosslinked). O numero de ligaes cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros do gel e consequentemente determina o intervalo de massa molecular das protenas que podem ser separadas nesse gel. Isto quer dizer que, consoante o nmero de ligaes cruzadas, assim se separam as protenas com baixa massa molecular ou com elevada massa molecular. O contedo total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30%, correspondendo o valor da percentagem ao total das molculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida, p/v). A separao de uma mistura de protenas no sistema SDS-PAGE pois um reflexo da diferena dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) protena(s) em questo pode ser estimada por comparao da respectiva mobilidade electrofortica (Rf), com a de protenas de massa molecular conhecida (padres). A simplicidade e rapidez desta tcnica, adicionadas ao facto de que apenas necessria uma pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a electroforese em gel de poliacrilamida no mtodo mais utilizado para a anlise de misturas proteicas complexas. Uma vez que as protenas de praticamente todas as origens so facilmente solubilizadas pelo SDS, a tcnica possui aplicao generalizada. As protenas separadas no gel de poliacrilamida podem ser facilmente coradas com uma soluo contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de protena da ordem de 0,1 g. Apesar deste mtodo permitir detectar praticamente todos os constituintes da maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situaes em que necessria uma maior sensibilidade, a qual pode ser alcanada recorrendo-se ao mtodo de colorao com nitrato de prata.

POOS PARA APLICAO DAS AMOSTRAS

ESQUEMA DE UM GEL DE POLIACRILAMIDA

(AS PROTENAS MIGRARO DE CIMA PARA BAIXO)

3
1 PROTENAS PADRO 2 mistura complexa 3 protena pura

220kDa 160kDa 97kDa 54kDa 18 kDa -

GEL CORADO COM AZUL DE COOMASSIE

(as protenas so visveis nas diferentes pistas)

Separao electrofortica de protenas por SDS-PAGE 12Preparar o sistema para fazer o gel. Preparar o gel de resoluo (12,5% de acrilamida), juntando: -1,25 ml de soluo I (Tabela II) -2,08 ml de soluo de acrilamida -1,64 ml de gua destilada -8 l de TEMED -33 l de persulfato de amnio 10% Misturar cuidadosamente e pipetar imediatamente a soluo entre as placas de vidro e silica at uma altura de aproximadamente 6 cm. Colocar uma camada de 1 ml de isopropanol de forma a obter uma superfcie plana. Deixar polimerizar. 34Aps polimerizao remover o isopropanol com papel absorvente. Preparar o gel de concentrao (6% de acrilamida) juntando: -0,4 ml de soluo II (Tabela II) -0,4 ml de soluo de acrilamida -1,2 ml de gua destilada -4 l de TEMED -12 l de persulfato de amnia 10% Misturar cuidadosamente, encher as placas com esta soluo e colocar o pente. Deixar polimerizar. 56789Montar o sistema de electroforese e preencher os tanques com tampo de electroforese 1x (Tabela II) Preparar as amostras para aplicao no gel, juntando 20 l de cada uma das fraces de purificao com 5 l de tampo da amostra. Ferver durante 5 min. Proceder electroforese aplicando uma voltagem constante de 150 volts, durante 1h. Retirar o gel e coloc-lo numa soluo corante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e agitar 10 min. Colocar o gel numa soluo descorante (Tabela II). Levar ao micro-ondas 30 s e agitar 10 min. Findo este tempo devem-se ver as bandas de protenas.

Tabela II- Solues usadas para a electroforese de protenas em gel de poliacrilamida em condies desnaturantes. SOLUO REAGENTES 0,4% SDS Tampo do gel de concentrao 0,5 M Tris base (II) Soluo de acrilamida (bisacrilamida) Tampo de electroforese TrisGlicina 10x 0,4% SDS 30% acrilamida 0,8% bisacrilamida 0,25 M Tris base 1,92 M glicina 1% SDS Tampo de aplicao em SDS- 20% glicerol PAGE 4% SDS 100 mM Tris.Cl pH 6,8 0,2% azul de bromofenol 200 mM DTT Soluo corante 2 g Coomassie blue R-250 100 ml cido actico 475 ml etanol 425 lm gua Soluo descorante 80 ml cido actico 210 ml etanol 510 ml gua pH 6,6-6,8 Diluir 1:10 antes de usar pH 6,6-6,8 OBSERVAES pH 8,8-9,0 Tampo do gel de resoluo (I) 1.5 M Tris base

Preparao e aplicao das amostras no gel. 1. Adicione a cada amostra de protena um volume idntico de tampo de amostra. 2. Ferva 2min e coloque em gelo at a aplicao no gel. 3. Com a ajuda de uma pipeta automtica, aplique as amostras e padres no gel que foi j previamente preparado. (No se esquea de anotar a ordem de aplicao das amostras e padres). 4. Coloque a soluo de electroforese (j diluda) nas tinas superior e inferior do aparelho de electroforese. 5. Coloque a tampa da camara de electroforese, fazendo a conexo dos electrodos. 6. Ligue os electrodos fonte de electroforese, tendo em ateno respectiva polaridade. (Por conveno, o vermelho o positivo e o preto o negativo). As protenas iro migrar para o polo positivo. 7. Coloque o boto que regula a voltagem no mximo, de forma a esta no ser limitante. 8. Regule o boto da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por gel. 9. Deixe que a migrao do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resoluo. 10. Desligue a fonte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da cmara, despeje a soluo de electroforese, e remova a sanduiche retirando as respectivas molas. 11. Com o auxlio de um espaador (ou de qualquer outro objecto de plstico), separe as duas placas (a de vidro e a de alumina).

Colorir as protenas no gel 1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo soluo corante com azul de Coomassie. 2. Deixe a corar durante 15-20min.

3. Retire o gel para outra caixa contendo gua destilada. Escorra a gua e lave novamente com gua destilada. 4. Escorra a gua e adicione soluo descorante. Agite durante 5-10min. 5. Repita o ponto anterior at observar ntidamente as bandas correspondendo s vrias protenas. 6. Coloque o gel sobre um pedao de papel de filtro grosso (3MM), cubra com Larfilm e seque no secador de geis.

MARCADOR DE PESO MOLECULAR LMW (BioRad) 97,0; 66,0; 45,0; 30,0; 20,1; 14,4 kDa

TP2 CARACTERIZAO CINTICA DA ENZIMA INVERTASE

Introduo A enzima invertase (beta-fructofuranosidase; EC 3.2.1.26) catalisa a hidrlise da sacarose nos seus dois monmeros constituintes: glucose e frutose. Existem actualmente vrias aplicaes industriais desta enzima, sobretudo na indstria alimentar, onde a enzima usada tem origem na levedura. No presente trabalho experimental ir proceder-se caracterizao cintica da enzima, para o que se estudar o efeito da concentrao do substrato (sacarose) na actividade da enzima.

Parte experimental Executar o seguinte ensaio para cada uma das solues de sacarose 1.- Medir 25ml de soluo de sacarose para o reactor, e termostatiz-la a 45C com agitao (basta esperar cerca de 5 minutos). Executar os ensaios por ordem crescente de concentrao da sacarose. 2.- Preparar o nmero de tubos de ensaio requeridos para cada ensaio, marcando os tubos e colocando em cada 0,5ml do reagente de DNS. 3.- Retirar uma amostra de 0,5ml do reactor, correspondente ao tempo zero, para um tubo de ensaio j preparado. 4.- Adicionar ao reactor 0,5ml da soluo de invertase, marcando simultaneamente o incio da contagem do tempo.

5.- Retirar amostras de 0,5ml do reactor de minuto a minuto at se completarem 7 minutos de reaco. As amostras devem ser colocadas imediatamente nos tubos de ensaio que j contm reagente de DNS, garantindo que todo e qualquer elemento de volume da amostra se mistura com o reagente (para paragem da reaco enzimtica, devido ao simultneo aumento do valor de pH da soluo). Cobrir os tubos que contm amostra com uma tampa solta. 6.- Preparar um tubo de ensaio com soluo tampo e reagente de DNS, nas mesmas quantidades e propores que as dos tubos que contm as amostras, a que se chamar de branco. Colocar-lhe tambm uma tampa. 7.- Aps a colheita e preparao das 8 amostras e do branco, referentes ao estudo cintico, colocar os respectivos tubos no banho de gua a 100C durante 5 minutos (para que se d a reaco com o DNS). 8.- Ao fim dos 5 minutos os tubos devem ser arrefecidos em gua fria. 9.- Adicionar 5ml de gua destilada a cada tubo arrefecido. Agitar cada tubo no vrtice. 10.- Ler a absorvncia de cada soluo a =540nm, contra o branco de tampo acetato pH 4.5 que sofreu o mesmo tratamento.

Solues fornecidas: - Solues de substrato (sacarose) a 15, 30, 45, 60, 75 e 100 g/L. Estas solues esto preparadas em tampo acetato 20mM pH 4,5, contendo 1% (p/v) de cloreto de clcio. - Soluo enzimtica de invertase (0,10mg/ml) [grau-V, da Sigma-Aldrich Co.], em tampo acetato a pH 4,5.

Recta de calibrao (DNS) 1.- A partir de uma soluo de 1,0 g/L de glucose em tampo acetato 20mM pH 4,5, efectuar diluies para 0,8 g/L; 0,6 g/L; 0,4 g/L e 0,2 g/L de glucose no mesmo tampo (preparar 2ml de cada diluio). 2.- Aplicar o mtodo do DNS [1] a estas 5 solues padro e traar a recta de calibrao obtida. O mtodo consiste na execuo do protocolo acima indicado substituindo as amostras pelas solues de glucose.
Ateno: A recta de calibrao pode tambm ser construda com solues de qualquer outro acar redutor ou com misturas destes, pois o produto que detectado a =540nm resulta da reaco com qualquer acar redutor.

Tratamento dos resultados 1.- Determinar as velocidades iniciais de reaco para cada concentrao inicial de sacarose, [expressas em moles de substrato hidrolisado / (volume reaccional tempo)], para o sistema ensaiado. 2.- Calcular as constantes cinticas, atravs da representao grfica de Lineweaver-Burk. 3.- Comentar os resultados obtidos [2] .

Sugesto de consulta bibliogrfica

[1] Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Analytical Chemistry, 31:426-428.

[2] Bahar, T. e Tuncel, A. (2004). Concanavalin A carrying reactive beads for yeast invertase
purification, Reactive & Functional Polymers, 61: 203-210.

TP3.- Extraco do DNA cromossmico de Escherichia coli e clculo da sua concentrao. Extraco rpida e em pequena escala de DNA plasmdico (mtodo da lise alcalina).
Os cromossomas de procaritas so geralmente molculas circulares covalentemente fechadas, embora em alguns casos se tenham observado cromossomas lineares. O tamanho de um cromossoma bacteriano varia entre algumas centenas de kb (1 kb = 1000 pares de base) (7,8 x 105 para Mycoplasma pneumoniae) e aproximadamente 10000 kb (9,5 x 106 para Myxococcus xanthus), contendo cada clula apenas uma cpia. O cromossoma bacteriano contm genes essenciais para as diversas funes celulares e ainda genes especficos da espcie. Devido inexistncia de membranas celulares internas em bactrias, o DNA cromossmico encontra-se agregado numa regio citoplasmtica qual se denominou nucleoide. Para alm do cromossoma, as clulas bacterianas apresentam ainda outros elementos genticos tais como plasmdeos, transposes, elementos de insero e vrus. Plasmdeos de ocorrncia natural apresentam uma variao de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. Possuem replicao autnoma e a maiora deles so circulares, embora algumas espcies bacterianas apresentem plasmdeos lineares. Os plasmdeos contm genes essenciais para a sua manuteno na clula (iniciao e controlo da replicao) e ainda genes que em determinados ambientes, conferem vantagem selectiva ao hospedeiro. Assim, os plasmdeos podem ter genes que conferem resistncia a antibiticos, responsveis por processos de virulncia, toxinas, produo de antibiticos, sistemas de modificao/restrio, vias metablicas degradativas, induo de tumores em plantas ou a fixao de azoto. Pode-se afirmar que os plasmdeos de ocorrncia natural so os responsveis pela grande variedade fisiolgica em bactrias. A partir destes elementos genticos naturais, possvel por manipulao gentica, construir no laboratrio vectores de clonagem, os quais so depois utilizados como veculos para clonagem de genes. Estes elementos genticos, contm de um modo geral, entre outros, um local de clonagem com diferentes locais nicos para determinadas enzimas de restrio, um ou mais genes que codificam para enzimas que conferem resistncia a antibiticos e regies promotoras.

Neste trabalho laboratorial pretende-se extrar o cromossoma (trabalho 3A) e dois plasmdeos/vectores de clonagem (pWH844 e pUgdG) (trabalho 3B) da estirpe Escherichia coli HB101 e sua posterior restrio (trabalho 4A) e visualizao aps separao dos fragmentos de DNA em gel de agarose (trabalho 4B) onde ser estimado o peso molecular aproximado desses plasmdeos.

3A- Extraco do DNA cromossmico da estirpe Escherichia coli HB101 Procedimento experimental
Diagrama para a preparao de DNA cromossmico
1 ml centrifugar Ressuspender sedimento em 250 l 20% sacarose Vortex Adicionar 250 l soluo lisozima 15 min a 37C Adicionar 100 l pronase

E. coli HB101

Adicionar igual volume clorofrmio Centrifugar Transferir fase superior novo tubo

Transferir fase superior novo tubo

vortex

Adicionar 70 l acetato centrifugar 300 l de sdio 10 min fenol/clorofrmio centrifugar 15 min

Adicionar

30 min 37C

Adicionar 700 l isopropanol a -20C

Lavar sedimento 70% EtOH ressuspender em 100 l TE Secar a 60o C 5 min

Guardar 4o

1- Inocular a estirpe E. coli HB101 em 50 ml de meio LB (composio em anexo) e inocular durante a noite a 37C com agitao. 2- Pipetar 1 ml para um tubo de microcentrfuga e centrifugar 3 minutos a 13000 rpm. Remover completamente o sobrenadante e adicionar 250 l de uma soluo 20% de sacarose em tampo TE. Ressuspender por vortex.

3- Adicionar 250 l de uma soluo de lisozima (5 mg/ml em tampo TE) e misturar cuidadosamente. Incubar 15 minutos a 37C. 4- Adicionar 100 l de pronase E (5 mg/ml em 10% N-lauroilsarcosine) e misturar. Incubar 30 min a 37C. 5- Adicionar 70 l de acetato de sdio 3 M (pH 5.3) e misturar. 6- Adicionar seguidamente 300 l de fenol/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1). Misturar e centrifugar 10 min. Recolher a fase aquosa (superior) novo tubo. Repetir o passo 6. 7- fase aquosa recolhida, adicionar 300 l de clorofrmio/lcool isoamlico. Misturar e centrifugar. 8- Transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo e precipitar o DNA cromossmico por adio de 700 l de isopropanol (mantido a -20C) e misturar at aparecimento do DNA. Centrifugar 15 min e remover o sobrenadante. 9- Lavar o sedimento de DNA cromossmico com 500 l de etanol a 70%. Centrifugar durante 5 min, remover o sobrenadante e secar o DNA a 60C durante 5 minutos.
10-

Ressuspender o sedimento de DNA cromossmico em 100 l de tampo TE (10 mM Tris.Cl pH 8.0; 1 mM EDTA). Conservar a 4C at posterior utilizao.

3B- Extraco do DNA plasmdico da estirpe Escherichia coli HB101 recorrendo tcnica da lise alcalina
Existem vrios mtodos de extraco de DNA plasmdico. O mtodo utilizado neste trabalho consiste numa modificao do mtodo de Birmboin & Doly (1979). O processo inicia-se pelo crescimento das clulas at incio da fase estacionria. Segue-se a recolha do sedimento de clulas por centrifugao e a sua ressuspenso numa soluo contendo glucose e lisozima e adio de uma soluo de hidrxido de sdio e SDS (dodecil sulfato de sdio). Este tratamento provoca a lise celular, dissoluo da membrana plasmtica, desnaturao de macromolculas (protenas e DNA) e hidrlise do RNA. Adiciona-se ento uma soluo de acetato de potssio (KAc) 3M (pH=4,5) que promove a precipitao do complexo SDSprotenas. O pH cido da soluo KAc permite ainda neutralizar o pH do lisado, fortemente alcalino devido presena de NaOH. Este reequilbrio do pH leva renaturao do DNA plasmdico, restabelecendo a sua conformao original. Contudo, o DNA cromossmico, devido s suas dimenses, no consegue voltar sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos. Aps a adio do KAc, pois possvel, por centrifugao, separar um sedimento constitudo por membranas, protenas e DNA cromossmico de um sobrenadante onde o DNA plasmdico se encontra dissolvido. Uma desproteinizao mais profunda desse sobrenadante posteriormente levada a cabo utilizando uma mistura de fenolclorfrmio de modo a obter DNA plasmdico suficientemente puro e assim adequado a servir de substrato para as enzimas de restrio. Por fim, o DNA plasmdico precipitado com etanol, seco, e ressuspenso em tampo TE. Birnboin, H.C., & Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombunant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.

Procedimento experimental
Diagrama para a preparao de DNA plasmdico (mtodo da lise alcalina)
1 ml centrifugar Ressuspender Sedimento em 200 l soluo I Vortex 5 min em gelo Adicionar 200 l soluo II 5 min Temp amb 10 min gelo Adicionar 200 l soluo III Centrifugar

E. coli HB101/pWH844 E. coli HB101/pUgdG Adicionar igual volume clorofrmio Centrifugar Transferir fase superior novo tubo Adicionar 500l EtOH Transferir fase superior novo tubo vortex

Transferir sobrenadante centrifugar igual volume novo tubo fenol/clorofrmio colocar 15 min a -70o C Guardar 4o C centrifugar

Adicionar

Lavar sedimento 70 % EtOH Secar a 60o C 5 min

ressuspender em 50 l TE

1- Inocular as estirpes E.coli HB101 contendo os plasmdeos pWH844 e pUgdG, em 50 ml de meio LB (composio em anexo) e incubar durante a noite a 37oC com agitao. 2- Pipetar 1 ml para um tubo e centrifugar 3 minutos a 15000 rpm, 4 C. Remover completamente o sobrenadante e adicionar 200 l de soluo I (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris.Cl pH 8; 10 mg/ml lisozima) e ressuspender. Incubar 5 min em gelo. 3- Adicinou 200 l de soluo II (0,2 M NaOH; 1% SDS). Misturar suavemente por inverso do tubo e coloc-lo durante 10 min temperatura ambiente. 4- Adicionar 200 l de soluo III (3 M acetato de potssio pH 4,5 ajustado com cido actico glacial). Misturar por inverso do tubo e coloc-lo durante 10 min em gelo.

5- Centrifugar o lisado durante 15 min a 15000 rpm, 4oC. Transferir o sobrenadante para novo tubo e adicionar um volume igual de fenol/ clorofrmio/ alcool isoamlico (25: 24: 1). Vortex e centrifugar durante 5 min. 6- Transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo e adicional um volume igual de clorofrmio: alcool isoamlico (24:1). Vortex e centrifugar durante 5 min. 7- Transferir a fase superior aquosa para um novo tubo. Precipitar o DNA plasmdico por adio de 500 l etanol absoluto colocado a -20oC. Deixar 15 min a -70 C. Centrifugar 15 min a 4 C e remover o sobrenadante. 8- Lavar o sedimento de DNA plasmdico com 500 l de etanol a 70%. 9- Separar o precipitado por centrifugao (15000 rpm, 5 min), remover o sobrenadante e secar o DNA plasmdico a 60C durante 5 min. 10- Ressuspender o sedimento de DNA em 25 l de tampo TE (10mM Tris.Cl, pH8; 1 mM EDTA). Conservar temperatura de 4C at posterior utilizao.

TP4. Digesto do DNA cromossmico e plasmdico com endonucleases de restrio; separao e visualizao de fragmentos de restrio por electroforese em gel de agarose. 4 A- Restrio do DNA cromossmico e dos plasmdeos pWH844 e pUgdG de E. coli HB101 por aco de uma endonuclease de restrio
Endonucleases so enzimas que reconhecem sequncias especficas de bases no DNA e so capazes de hidrolisar as cadeias de DNA. Uma vez que essa hidrlise ocorre em ambas as cadeias, os sistemas de reparao celular no funcionam, permitindo dessa forma a destruio de cidos nucleicos invasores (ex: virus). Para alm da sua funo protectora na clula, as enzimas de restrio tm tambm extrema importncia em investigao cientfica, nomeadamente em processos de clonagem de genes, execuo de mapas de restrio ou a determinao do tamanho de molculas de DNA.

Procedimento experimental
plasmdeos pWH844/pUgdG 17 l 2 l 1 l DNA cromossmico 17 l 2 l 1 l

DNA Tampo do enzima 1x Enzima de restrio HindIII

1- Adicionar em cada tubo de microcentrfuga os volumes indicados na tabela anterior, com a seguinte ordem: DNA (plasmdico ou cromossmico), tampo da enzima 1x, gua e finalmente a enzima de restrio. 2- Misturar cuidadosamente e incubar a 37C durante 1h. 3- Guardar a -20C at posterior utilizao.

4B- Visualizao do DNA cromossmico e plasmdico por electroforese em gel de agarose

Electroforese uma tcnica onde molculas com carga so capazes de migrar por aplicao de um campo elctrico, sendo a sua separao efectuada com base no peso molecular. A separao de cidos nucleicos que se encontram carregados negativamente (grupos fosfato) efectuada geralmente em gis de agarose. A agarose forma uma matriz porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e atravs do qual as molculas de cidos nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da massa (pb) e conformao das molculas. A velocidade de migrao depende ainda da sua composio nucleotdica, da concentrao da matriz de agarose utilizada, do campo elctrico aplicado ao sistema (V/cm) e ainda da composio do tampo utilizado na electroforese. Aps migrao dos cidos-nucleicos em gel de agarose, possvel visualizar estas molculas, imergindo o gel numa soluo de brometo de etdeo, pois este composto intercalase nas suas cadeias e fluorescente quando irradiado com radiao ultravioleta, permitindo desta forma sua deteco.

Procedimento Experimental
Dissolver 0,8 g agarose TAE 1x por fervura Colocar amostras gel deixar arrefecer 1a2h 100 V verter numa forma com pente solidificar colocar gel adicionar tina electrofortica TAE 1x

mergulhar 15 min visualizao gel soluo plasmdeos TAE com brometo com luz UV etdeo

fotografar

DNA plasmdico com ou sem restrio + 2 l corante DNA cromossmico com ou sem restrio + 2 l corante 1 l padro DNA + 2 l corante

1- Preparar um gel de agarose com concentrao de 0,8% em tampo TAE (1x) (composio deste tampo em anexo). Aps suspenso da agarose no tampo, ferver at obter uma mistura homognea. Arrefecer ate 50 C antes deitar a mistura lquida dentro do molde contendo um pente de 8 dentes de modo a formar 8 cmaras com a possibilidade de aplicao de 25 l da soluo de DNA. Deixar solidificar o gel durante ~ 30 min. 2- Remover cuidadosamente o pente e colocar o gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal de electroforese e encher a unidade com tampo TAE (1x) at que o nvel do tampo cubra e ultrapasse em 1 mm a superfcie do gel. 3- Aplicar em cada uma das cmaras presentes no gel, as amostras de DNA cromossmico e plasmdico, onde se adicinou previamente 2 l de uma soluo corante com elevada densidade (40% sacarose; 0,25% azul de bromofenol; 0,25% xilenocianol). Como referncia aplicar tambm uma amostra contendo uma mistura de fragmentos de peso molecular conhecido (1 kb DNA ladder) (ver anexo). 4- Iniciar a electroforese por aplicao de um campo elctrico (100 V) (no esquecer que os cidos nucleicos migram para o nodo). 5- Aps separao electrofortica, colocar o gel numa soluo de brometo de etdeo (1 mg/ml) preparada em tampo TAE 1 x, durante 15 min. 6- Retirar o gel do tampo anterior usando luvas (o brometo de etdeo cancergeno) e remover o lquido em excesso. 7- Visualizar o DNA plasmdico pela fluorescncia emitida pelo brometo de etdeo a estes associado, quando irradiado com radiao UV (cuidado: usar culos para UV). 8- Fotografar o gel sob radiao ultravioleta.

ANEXO Meio LB (g/l)

- 10 g Peptona - 5 g Extracto de levedura - 5 g NaCl

Tampo TAE (50x) (TP4)

-242 g TRIS base -57,1 ml cidi actico glacial -100 ml de soluo de EDTA 0,5 M (pH 8.0) -H2O at 1 litro Ajustar o pH a 8,0.

Padro de pesos moleculares (TP4)