CATALISIS ENZIMATICA OBJETIVOS. 1. Realizar la obtencin de una enzima por medio de un reactivo frijol de soja. 2.

Conocer la temperatura optima del catalizador para estas reacciones. 3. Obtener los parmetros de la ecuacin de rapidez por los mecanismos de catlisis. INTRODUCCION: La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.1 Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL: MATERIAL EQUIPO REACTIVOS

4 Barras de agitacin magntica 2 Cristalizadores 4 Tubos de ensaye de 20 x 200 mm con tapn. 6 Vasos de precipitados 100 mL 1 Pipeta volumtrica de 10 mL 2 perillas 1 Soporte Universal 1 Pinzas para matraz 1 Cronmetro 1 Matraz aforado de 100 mL 3 Matraz aforado de 25 mL

1 Conductmetro celda 2 Parrilla calentamiento agitador magntico

100 mg de una suspensin con de ureasa en 50 mL de agua. Por equipo: de con 100 mL de solucin de 0.02M. 25 mL de solucin de 0.015M. 25 mL de solucin de 0.004M. 25 mL de solucin de 0.007M.

urea urea urea urea

Procedimiento experimental Parte A: preparacin de la solucin de ureasa. 1. Suspender 100 mg de ureasa en 50 ml de agua, agitar fuertemente. 2. Triture en un mortero 0.5 g de soja y agregar 10 ml de etanol al 30% (v/v). 3. Centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos. Mezcle todos los sobrenadantes en un recipiente y homogenice. Parte B: temperatura de actividad mxima del catalizador. 1. En el tubo de ensaye perfectamente limpio y seco, colocar 20 ml de la solucin de urea 0.02 M. Fijar el tubo al soporte universal. Colocar el bao sobre la parrilla de calentamiento. 2. Equilibrar el bao a 20 C, agregar 4 gotas del extracto de ureasa o 2 ml de la solucin de ureasa al tubo de ensaye y poner en marcha el cronmetro en el momento de mezclar. Inmediatamente introducir la celda al tubo. Este experimento lo puede realizar a la temperatura ambiente. 3. Hacer medidas de conductividad para la reaccin cada 10 segundos (12 lecturas en total). 4. Repetir el experimento a las temperaturas de 30, 40, 50 y 60 C. Parte C: parmetros de la ecuacin cintica. 1. Realizar nuevamente la hidrlisis de 20 ml de urea con ureasa a la temperatura ptima que se obtuvo en la parte B, a las concentraciones 0.015M, 0.004M y 0.007M. RESULTADOS EXPERIMENTALES

TABLA 1. CONDUCTANCIAS EN FUNCION DEL TIEMPO A DIFERENTES TEMPERATURAS. CONDUCTANCIA (S) Tiempo(seg) Tamb 22C 10 53.1 20 48.7 30 45.6 40 42.7 50 40.1 60 39.4 70 36.9 80 35.7 90 34.5 100 33.7 110 33.1 120 32.4

30C 53.5 49.5 46.6 43.7 41.5 39.7 36.6 34.9 34.2 33.7 33.0 32.3

40C 52.0 46.8 42.8 40.7 45.4 53.0 55.9 64.1 67.6 69.8 70.5 73.2

50C 70.5 70.2 72.5 85.2 87.4 96.0 97.4 98.7 100.4 96.3 93.1 94.0

60C 113.5 91.8 79.4 77.2 74.1 70.5 71.0 71.4 71.7 72.9 74.3 75.2

La rapidez inicial, r0, se obtiene graficando la conductancia contra el tiempo, de la tabla 1 se obtienen las siguientes grficas (se distribuyeron en dos graficas para distinguir cada una de las curvas)

GRAFICA 1: CONDUCTANCIAS EN FUNCION DEL TIEMPO A DIFERENTES TEMPERATURAS

100 90 80 conductancia S 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tiempo ( seg) EN FUNCION DEL TIEMPO A GRAFICA 2: CONDUCTANCIAS DIFERENTES TEMPERATURAS 160 140 120 conductancia S 100 80 60 40 y = 0.3263x + 44.914 R = 0.9965 y = 0.7331x + 43.879 R = 0.9868 y = 0.6327x + 36.377 R = 0.999 T 40C T 50C T 60C Linear (T 40C) Linear (T 50C) y = 0.1972x + 48.026 R = 0.9981 Tamb T 30C Linear (Tamb) Linear (T 30C) y = 0.3358x + 53.917 R = 0.9701

Para poder determinar la rapidez inicial se determina la ecuacin de cada recta y la pendiente de cada una de estas representa la rapidez inicial (r0), obteniendo los siguientes datos de rapidez inicial: TEMPERATURA (C) ambiente 30 40 50 60 RAPIDEZ INICIAL, r0, (S/s) 0.1972 0.3358 0.3263 0.6327 0.7331

La rapidez inicial, r0, se obtiene graficando la conductancia contra el tiempo, de la tabla 1 se obtienen las siguientes grficas:

GRAFICA 3:Temperatura de maxima actividad catalitica

0.8 0.7 0.6 r0 (S/seg) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura C Series1

Como se observa de la grfica 3, la temperatura ptima del catalizador se encuentra alrededor de 32 C. Antes de esta temperatura se da un incremento continuo de la actividad cataltica y despus de 32 C comienza la desnaturalizacin de la enzima que resulta en una disminucin de la actividad cataltica. Se observa tambin que a 48 C nuevamente empieza el incremento en la actividad cataltica. Como se ve en la grfica 3 un temperatura de 60C la recta tiene r = 0.999, por lo que se eligi a esta como la temperatura de trabajo para la parte C del experimento. TABLA3. CONDUCTANCIA CONCENTRACIONES EN FUNCION DEL TIEMPO A DIFERENTES

CONDUCTANCIA (S) Tiempo(seg) 0.015 M 10 1001 20 1005 30 997 40 843 50 755 60 660 70 598 80 552 90 520 100 497 110 489 120 485 TABLA 3. Rapidez inicial a varias temperaturas.

0.004 M 539 614 671 735 805 861 911 984 1098 1123 1199 1263

0.007 M 731 642 655 704 759 810 874 928 989 1079 1177 1192

TEMPERATURA (C) RAPIDEZ INICIAL, r0, (S/s) 22 0.0572 30 0.236 40 0.165 50 0.217 60 1.153 El modelo de Michaelis-Menten para cintica enzimtica, tiene como etapa lenta de la reaccin a la siguiente ecuacin de rapidez:

Esta ecuacin define la rapidez del proceso, puede ser expresada como (ver generalidades):

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

En donde KM, es la constante de Michaelis, y K2[E]0 = rmax es la rapidez mxima. La dependencia de la rapidez inicial con la concentracin inicial de sustrato, dada por esta ecuacin se muestra en la figura 1 de generalidades, que indica como la rapidez de la reaccin, a medida que aumenta la concentracin de sustrato, aumenta rpidamente hasta alcanzar un valor mximo que se mantiene aproximadamente constante. Si la hidrlisis de la urea catalizada con la enzima ureasa se ajusta a la cintica de Michaelis-Menten debemos obtener una lnea recta al representar los datos por mtodos como el de Lineweaver-Burk y el de Eadie-Hofte.

La ecuacin de rapidez puede integrarse fcilmente de la siguiente manera:

[ ]

[ ] [ ] [ ]

Entonces separando variables e integrando se obtiene:

[ ] ) [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ]

La concentracin de sustrato es:

[ ]

En donde S es la concentracin inicial de urea, y x es lo que reacciona a tiempo t, ahora necesitamos relacionar los datos de conductancia con S x. Para calcular x, la cantidad de reactivo que reacciona, de los datos de conductancia, se asume que la conductancia de la solucin Gt a tiempo t sigue la ecuacin:

La reaccin que se estudio en la experimentacin es la siguiente:

Tomando en cuenta las especies con carga que participan se obtiene lo siguiente:

[(

( )

En donde:

conductancia inica equivalente de la especie j concentracin de la especie j constante de la celda

Ahora tenemos x en funcin de la conductancia y de la concentracin inicial de urea, por lo que S-x, al sustituyendo la ecuacin es:

( ( (

) ) ) ) ( )

( (

Ahora sustituimos la ecuacin (6) en:

[ ]

[ ]

[ ]

Debido a que [S] es [S - x]:

[ (

)]

[ ( )+

)]

[ ]

* (

[ ]

( )

Al graficar el lado izquierdo de la ecuacin (7) contra el logaritmo que aparece en el lado derecho, dividido entre el tiempo se obtiene una lnea recta de pendiente KM y ordenada al origen rmax = K2 [E]0. En la tabla siguiente se muestran los datos:

TABLA 4. Rapidez inicial a varias concentraciones de urea.

CONCENTRACIN (mol/L) 0.015 0.007 0.004

RAPIDEZ INICIAL, r0, (S/s) 0.239 0.031 0.055

Grfica 4. Determinacin de rapidez inicial a varias concentraciones de urea.

Rapidez inicial a varias concentraciones de urea

140 120 CONDUCTANCIA (S) 100 80 60 40 20 0 0 50 TIEMPO (s) 100 150 y = 0.5143x + 54.229 R = 0.9199 y = 0.6484x + 47.461 y = 0.5404x + 55.167 R = 0.9986 R = 0.9992 0.015M 0.004 M 0.007 M Linear (0.015M) Linear (0.004 M) Linear (0.007 M)

TIEMPO (segundos) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0.015 M 59.2 66.4 71.6 76.8 82.8 88 93.2 98.8 103.9 109 114 119.8

CONDUCTANCIA (S) 0.004 0.007 M M 53.9 73.1 61.4 64.2 67.1 65.5 73.5 70.4 80.5 75.9 86.1 81 91.1 87.4 98.4 92.3 104.8 98.9 112.3 107 119.9 117 126.3 119.2

TABLA 5. Constante De Michaelis y rapidez mxima obtenida a las concentraciones de urea.

Concentracin de urea (M) 0.015 0.007 0.004

Constante de Michaelis, KM (mol/L) 3.7441 x 10-3 1.3964 x 10-3 7.4468 x 10-4

Rapidez mxima, rmax (mol/s) 1.7087 x 10-4 7.7658 x 10-5 4.5676 x 10-5

Coeficiente de correlacin R2 0.9993 0.9986 0.9995

Grfica 5. Determinacin de constante de Michaelis y rapidez mxima a distintas concentraciones de urea.

KM y rmax a varias concentraciones de urea

0 -0.8 - S/t (Gt-Gc/G0-Gc) -0.6 -0.4 -0.2 -0.0002 -0.0004 -0.0006 -0.0008 -0.001 -0.0012 -0.0014 ln [S(Gt-Gc/G0-Gc)] / t -0.0016 0.015 M 0.004 M 0.007 M Linear (0.015 M) 0 y = 0.0037x + 0.0002 R = 0.9995

El modelo de Michaelis-Menten para cintica enzimtica, tiene como etapa lenta de la reaccin a la siguiente ecuacin de rapidez:

Esta ecuacin define la rapidez del proceso, puede ser expresada como (ver generalidades):

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

En donde KM, es la constante de Michaelis, y K2[E]0 = rmax es la rapidez mxima. La dependencia de la rapidez inicial con la concentracin inicial de sustrato, dada por esta ecuacin se muestra en la figura 1 de generalidades, que indica como la rapidez de la reaccin, a medida que aumenta la concentracin de sustrato, aumenta rpidamente hasta alcanzar un valor mximo que se mantiene aproximadamente constante. Si la hidrlisis de la urea catalizada con la enzima ureasa se ajusta a la cintica de Michaelis-Menten debemos obtener una lnea recta al representar los datos por mtodos como el de Lineweaver-Burk y el de Eadie-Hofte.

La ecuacin de rapidez puede integrarse fcilmente de la siguiente manera:

[ ]

[ ] [ ] [ ]

Entonces separando variables e integrando se obtiene:

[ ] ) [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ]

La concentracin de sustrato es:

[ ]

La reaccin que se estudio en la experimentacin es la siguiente: Tomando en cuenta las especies con carga que participan se obtiene lo siguiente:

[( En donde:

( )

conductancia inica equivalente de la especie j concentracin de la especie j constante de la celda

En la ecuacin (4) asumimos que la urea no contribuye a la conductancia. Suponemos tambin que la solucin empleada es diluida y entonces , , , son constantes.

( (

As x est dada por:

( (

) )

( ) ( )

( )

Ahora tenemos x en funcin de la conductancia y de la concentracin inicial de urea, por lo que S-x, al sustituyendo la ecuacin (5) es:

( ( (

) ) ) ) ( )

( (

Ahora sustituimos la ecuacin (6) en:

[ ]

[ ]

[ ]

Debido a que [S] es [S - x]:

[ (

)]

[ ( )+

)]

[ ]

* (

[ ]

( )

Al graficar el lado izquierdo de la ecuacin (7) contra el logaritmo que aparece en el lado derecho, dividido entre el tiempo se obtiene una lnea recta de pendiente KM y ordenada al origen rmax = K2 [E]0. En la tabla siguiente se muestran los datos:

TABLA 4. Rapidez inicial a varias concentraciones de urea.

CONCENTRACIN (mol/L) 0.015 0.007 0.004

RAPIDEZ INICIAL, r0, (S/s) 0.239 0.031 0.055

Grfica 4. Determinacin de rapidez inicial a varias concentraciones de urea.

Rapidez inicial a varias concentraciones de urea

140 120 CONDUCTANCIA (S) 100 80 60 40 20 0 0 50 TIEMPO (s) 100 150 y = 0.5143x + 54.229 R = 0.9199 y = 0.6484x + 47.461 y = 0.5404x + 55.167 R = 0.9986 R = 0.9992 0.015M 0.004 M 0.007 M Linear (0.015M) Linear (0.004 M) Linear (0.007 M)

TIEMPO (segundos) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

0.015 M 59.2 66.4 71.6 76.8 82.8 88 93.2 98.8 103.9 109 114 119.8

CONDUCTANCIA (S) 0.004 0.007 M M 53.9 73.1 61.4 64.2 67.1 65.5 73.5 70.4 80.5 75.9 86.1 81 91.1 87.4 98.4 92.3 104.8 98.9 112.3 107 119.9 117 126.3 119.2

TABLA 5. Constante De Michaelis y rapidez mxima obtenida a las concentraciones de urea.

Concentracin de urea (M) 0.015 0.007 0.004

Constante de Michaelis, KM (mol/L) 3.7441 x 10-3 1.3964 x 10-3 7.4468 x 10-4

Rapidez mxima, rmax (mol/s) 1.7087 x 10-4 7.7658 x 10-5 4.5676 x 10-5

Coeficiente de correlacin R2 0.9993 0.9986 0.9995

Grfica 5. Determinacin de constante de Michaelis y rapidez mxima a distintas concentraciones de urea.

KM y rmax a varias concentraciones de urea

0 -0.8 - S/t (Gt-Gc/G0-Gc) -0.6 -0.4 -0.2 -0.0002 -0.0004 -0.0006 -0.0008 -0.001 -0.0012 -0.0014 ln [S(Gt-Gc/G0-Gc)] / t -0.0016 0.015 M 0.004 M 0.007 M Linear (0.015 M) 0 y = 0.0037x + 0.0002 R = 0.9995

CONCLUSIN

Los efectos de la temperatura en las enzimas son muy complejos, por lo general su actividad se incrementa al aumentar la temperatura, hasta un punto mximo donde comienza a destruirse la actividad enzimtica.

La mayora de las enzimas muestran actividad ptima entre 30 y 40 C. Sin embargo pueden ser inactivadas por el calor. De acuerdo a los datos experimentales se encontr que la temperatura de actividad mxima de la ureasa es 32 C, como se observa en la grfica 3, el posterior incremento en la actividad de la ureasa puede deberse a que las enzimas son capaces de tener diferentes estados conformacionales, uno de ellos inactivo a ciertas temperaturas.

BIBLIOGRAFIA.

OBAYA VALDIVIA ADOLFO. Clculo de parmetros de rapidez en cintica qumica y enzimtica. 1 ed. UNAM, FES Cuautitln, 2005. S. R. LOGAN. Fundamentos de cintica enzimtica. Madrid, Ed. Addison-Wesley, 2000.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE CINETICA Y CATALISIS QUIMICA PRACTICA V CATALISIS ENZIMATICA HERRERA FLORES JUAN GUSTAVO MARES SANCHEZ JOSE ANGEL RAMIREZ DIAZ LUIS FRANCISCO