UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL

ANA CARINA FERNANDES FERREIRA

CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

2008 LISBOA

UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL

ANA CARINA FERNANDES FERREIRA

DISSERTAO DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA

CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

2008 LISBOA

Dedicatria

todos aqueles que sempre acreditaram em mim...

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Agradecimentos
Gostaria de agradecer minha orientadora, Professora Marlia Ferreira, todo o empenho, apoio, carinho e ateno que me deu ao longo deste projecto. Existem professores que marcam geraes, mas tambm existem aqueles que nos marcam para a vida! Ao Professor Antnio Barreto pelo seu contributo para a realizao deste estgio. Professora Maria Joo Fraqueza pelos seus ensinamentos. Lena, Zzinha e D. Maria pela forma carinhosa e familiar como me acolheram no laboratrio, por todo o que aprendi com elas, o meu muito obrigado! Na indstria, gostaria de agradecer o carinho com que fui acolhida bem como os ensinamentos transmitidos, ao Dr. Armindo Loureno, Dra. Rosrio Barata, Eng. Ftima Fernandes, ao Sr. Rui Oliveira, e ao Eng. Paulo Almeida, e de uma forma especial Eng. Paula Ferreira, pelo seu carinho e amizade. Gostaria igualmente de agradecer a todas as pessoas que trabalham na sala de fatiados, em especial D. Ermelinda, pela sua disponibilidade e ajuda na realizao deste projecto. Ao Azores Team, sinnimo do incio, meio e fim desta longa caminhada que foi o nosso curso, a vossa amizade permanecer para sempre, Ana Catarina Bastos, Joanna Franco, Mariana Messias e Patrcia Simes. Ao quase Aoriano Gonalo Antunes, obrigado pela enorme pacincia demonstrada, no fcil lidar com tanta Aoriana junta! A todos os meus colegas, de turma e de ano, que comigo se cruzaram ao longo destes seis anos, o meu muito obrigado. Com receio de me esquecer de algum no citarei nomes! A todos os meus amigos... sabe bem saber que esto sempre l! Aos meus pais, Lcia e Antnio, um muito obrigado ser muito pouco para lhes agradecer tudo o que fizeram por mim! Sem eles as etapas difceis no tinham sido ultrapassadas e esta longa caminhada no tinha chegado ao fim! Muito Obrigado! Ao meu irmo, Paulo, companheiro de todas as horas, um importante pilar da minha vida, e minha cunhada Ana, o meu agradecimento por estarem sempre presentes. Aos meus avs maternos, Felcia e Henrique, e a toda a minha famlia, peas muito importantes na minha vida, um obrigado muito especial. Ao meu namorado, Steven, obrigado pela pacincia, apoio, carinho, suporte e acima de tudo amizade. Apesar de longe nunca deixaste de estar presente... Muito Obrigado!

Meno de apoio
Este projecto foi totalmente financiado pela indstria de produtos alimentares onde decorreu.

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Avaliao de uma metodologia de ATPmetria na monitorizao da higiene fabril

Resumo

Nas ltimas dcadas tem-se assistido a uma grande evoluo, quer nos mtodos de produo dos alimentos, quer nos controlos necessrios para garantir a produo de alimentos seguros. Tornou-se necessrio aplicar mtodos mais rpidos do que os da microbiologia clssica de forma a verificar a eficcia dos planos de higienizao das indstrias alimentares, no momento exactamente anterior ao incio de fabrico, de forma a que as superfcies que contactam directamente com os alimentos possam ser novamente higienizadas, caso seja detectada uma situao no conforme. De forma a implementar um mtodo expedito que permitisse avaliar a higienizao efectuada em equipamentos de uma indstria alimentar, neste estudo compararam-se mtodos clssicos de deteco de microrganismos (aerbios totais a 30 C e Enterobacteriaceae), com mtodos ditos rpidos, designadamente deteco de ATP por bioluminescncia e deteco de protena. O estudo decorreu na sala de fatiados, na lmina e no tapete de duas das trs mquinas presentes. As colheitas para os 3 testes foram realizadas em simultneo, aps higienizao, sob as mesmas condies. Registou-se, igualmente, a observao visual das superfcies onde se realizaram as colheitas. Os resultados dos testes estatsticos McNemar e coeficiente Kappa revelaram respectivamente os valores p= 0,022 e kappa= 0,410 para a comparao entre aerbios totais e ATP por bioluminescncia; p= 0,146 e kappa= 0,428 para a comparao entre aerbios totais e deteco de protena; p= 0,581 e kappa= 0,398 para a comparao entre ATP por bioluminescncia e deteco de protena. Tendo em ateno os resultados estatsticos obtidos, as caractersticas desta indstria e os objectivos pretendidos, verificou-se que o teste de protena no trazia nenhuma mais-valia, pelo que a escolha recaiu sobre o teste de leitura de ATP por bioluminescncia, como o mais adequado na monitorizao da higiene.

Palavras-chave: planos de higienizao, microbiologia clssica, deteco ATP por bioluminescncia e deteco de protena

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Evaluation of a methodology based on ATP bioluminescence for food industry hygiene monitoring

Abstract

In the last decades there were relevant improvements on the methods used in food production, as well as on the necessary controls to make it more safe. It has became necessary to apply more rapid tests then the ones in use in classical microbiology, to allow the verification of the efficacy of the hygiene plans on food industries just before the beginning of the production, and guarantee the hygiene conditions of surfaces in contact with food, and consequently providing an answer almost at real time. In the present work, in order to implement a more expedite method that could enable the evaluation of hygiene conditions in food equipments, different classical methods of detection of microorganisms (total viable counts and Enterobacteriaceae) and rapid

methods, such as ATP bioluminescence and protein detection assay, were compared. The study was developed in the slided room, on the conveyor belt and on the blades of two slicer machines, using three different testes. The samples were collected simultaneously, after hygiene procedures, under the same conditions. Data on visual observations of the contact surfaces where samples were taken, were also registered. The results of statistic tests, McNemar and Kappa coefficient showed respectively the value p= 0,022 and kappa= 0,410 for comparation between total viable counts and ATP bioluminescence; p= 0,146 and kappa= 0,428 for comparation total viable counts and protein detection; p= 0,581 and kappa= 0,398 for comparation ATP bioluminescence and protein detection. Considering the results of the statistic tests, characteristics of the industry, and the proposed aims, we concluded that the protein test assay doesnt show advantages, becoming evident that the ATP bioluminescence is more suitable, for the purpose of hygiene monitoring.

Key-words: hygiene procedures, classical microbiology, ATP bioluminescence and protein detection.

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ndice

Dedicatria ______________________________________________________________ iii Agradecimentos__________________________________________________________ v Meno de apoio _________________________________________________________ v Resumo________________________________________________________________ vii Abstract ________________________________________________________________ ix ndice __________________________________________________________________ xi ndice de figuras ________________________________________________________ xiii ndice de tabelas ________________________________________________________ xiv Lista de abreviaturas_____________________________________________________ xiv Introduo ______________________________________________________________ 1 1. Reviso Bibliogrfica ___________________________________________________ 3
1.1 Higienizao/Plano de higienizao ____________________________________________ 3
1.1.1 Programa de higienizao ___________________________________________________________5
1.1.1.1 1.1.1.2 1.1.1.3 1.1.1.4 1.1.1.5 Tipos de sujidade _______________________________________________________________________ 5 As superfcies __________________________________________________________________________ 6 A gua ________________________________________________________________________________ 7 Mtodos de higienizao __________________________________________________________________ 7 Detergentes e desinfectantes ______________________________________________________________ 8

1.1.2 Higiene Pessoal __________________________________________________________________11 1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza ________________________________________________12

1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos___________________________________________ 12

1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae _____________13

1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia ________________________________ 16 1.4 Mtodos de deteco de protena e de acares, fosfatos e hidratos de carbono _____ 21

2. Materiais e Mtodos ___________________________________________________ 25

2.1 Meios de Cultura ___________________________________________________________ 28 2.2 Preparao da soluo de diluio____________________________________________ 28 2.3 Esterilizao ______________________________________________________________ 28 2.4 Anlises microbiolgicas____________________________________________________ 28
2.4.1 Colheita e preparao de amostras ___________________________________________________28 2.4.2 Contagem de microrganismos a 30 C ________________________________________________29 2.4.3 Contagem de Enterobacteriaceae ____________________________________________________29

2.5 Mtodos rpidos ___________________________________________________________ 29

2.5.1 Colheita de amostras ______________________________________________________________29 2.5.2 Material utilizado no teste de ATP ____________________________________________________29 2.5.3 Leitura do ATP por bioluminescncia__________________________________________________30 2.5.4 Material utilizado no teste de deteco de protena_______________________________________30 2.5.5 Leitura das zaragatoas de PRO-Clean ________________________________________________31

2.6 Anlise estatstica _________________________________________________________ 31

xi

3. Resultados____________________________________________________________ 33
3.1 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C ____________________________ 33 3.2 Contagem de Enterobacteriaceae _____________________________________________ 35 3.3 Deteco de ATP por bioluminescncia________________________________________ 38 3.4 Visualizao da deteco de protena _________________________________________ 40 3.5 Registo da observao visual ________________________________________________ 42

4. Discusso ____________________________________________________________ 47 5. Concluses ___________________________________________________________ 57 Bibliografia _____________________________________________________________ 59 Anexos _________________________________________________________________ 63

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ndice de figuras
Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia.____________________________ 18 Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena. ________________________________ 22 Figura 3 Lmina de ao inoxidvel de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ____ 27 Figura 4 Tapete de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ___________________27 Figura 5 Lmina da fatiadora e placas de delimitao das superfcies de colheita de amostras.__ 27 Figura 6 Tapete transportador com placas, para delimitao das superfcies de colheita de amostras. ______________________________________________________________________ 27 Figura 7 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia e respectiva zaragatoa descartvel Ultrasnap. ____________________________________________________ 30 Figura 8 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia, preparado para efectuar medio. ________________________________________________________________ 30 Figura 9 Zaragatoa PRO-Clean. ___________________________________________________ 31 Figura 10 Zaragatoas PRO-Clean, aps colheita das amostras de superfcies com diferentes quantidades de protena. __________________________________________________________ 31 Figura 11 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 12 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 13 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ______________________________________________________________________ 35 Figura 14 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas._______________________________________________________________________ 35 Figura 15 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. _______ 36 Figura 16 Contagem de Enterobacteriaceae na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 17 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 18 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas.____ 38 Figura 19 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ____ 39 Figura 20 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ___ 39 Figura 21 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. ____ 40 Figura 22 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios na lmina da mquina 1. _____________________________________________________________ 40 Figura 23 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios no tapete da mquina 1. _____________________________________________________________ 41 Figura 24 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, na lmina da mquina 3. _____________________________________________________________ 41 Figura 25 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, no tapete da mquina 3. _____________________________________________________________ 42 Figura 26 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 42 Figura 27 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 28 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 29 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 44 Figura 30 Anlise de concordncia entre os vrios testes, assim como da observao visual. ___ 45

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ndice de tabelas

Tabela 1 Contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo.................................................................................................................................... 33 Tabela 2 Contagens de Enterobacteriaceae, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo. ..... 36 Tabela 3 Valores de ATP medidos por bioluminescncia, nas amostras recolhidas, nas duas mquinas de fatiar e nos dois locais em estudo.. ................................................................................. 38 Tabela 4 Resumo dos resultados dos testes estatsticos de McNemar e do Coeficiente Kappa ..... 46 Tabela 5 Colheitas no concordantes entre si nos 3 testes .............................................................. 52

Lista de abreviaturas

AOAC International Association of Official Analytical Chemistry International ATP Adenosina trifosfato BCA cido bicinchoninico BPH Boas Prticas de Higiene CDM Contagem directa ao microscpio DNA cido desoxirribonucleico HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotdeo ISO International Organization for Standardization NASA National Aeronautics and Space Administration NP Norma Portuguesa PCC Ponto Crtico de Controlo PPM Partes por milho RLU Relative Light Units / Unidades Relativas de Luz UFC Unidade Formadora de Colnia

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Introduo

O meu estgio curricular do Mestrado Integrado em Medicina Veterinria foi realizado na rea cientfica de Segurana Alimentar e teve a durao aproximada de 5 meses, com uma mdia de 8 horas dirias. Decorreu no Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Tcnica de Lisboa e numa indstria de transformao de produtos crneos. No Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais, acompanhei as diversas actividades do laboratrio de microbiologia alimentar. De salientar a participao em anlises microbiolgicas a zaragatoas, para controlo e monitorizao de higiene, a produtos alimentares de origem animal (peixe, carne de bovino e suno, doces variados e molhos) e a guas. As anlises eram efectuadas a solicitao do exterior, no regime de prestao de servios. Estas anlises, efectuadas segundo as tcnicas descritas nas Normas especficas portuguesas ou europeias em vigor, incluram a pesquisa e/ou contagem de alguns microrganismos, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C,

Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, esporos de Clostrdeos sulfito redutores, Salmonella spp, Listeria monocytogenes, fungos (bolores e leveduras) e Vibrio spp. As anlises de gua, de acordo com o estipulado no Decreto-lei n. 306/2007, constaram da pesquisa de Enterococos e Escherichia coli em 100 ml. Concomitantemente a essas tarefas, estive integrada num estudo solicitado por uma empresa de carnes, no qual se pretendia avaliar as alteraes microbiolgicas e qumicas sofridas pela carne de bovino desde o corte e embalagem at ao consumo final, quando armazenada em atmosfera protectora e colocada nas prateleiras de um supermercado, nas condies usuais de venda aos consumidores. Acompanhei a colheita desses produtos quer no local de corte e embalagem, quer nos supermercados, de acordo com o desenho experimental do estudo. No laboratrio, realizaram-se anlises microbiolgicas, nomeadamente a pesquisa de bactrias cido lcticas (ISO 15214:1998), Brochothrix (ISO 13722:1996), microrganismos aerbios totais a 30 C (NP 4405:2002) e Pseudomonas spp (ISO 13720:2000). Na indstria de transformao de produtos crneos, com trs linhas de produo (fatiados, pastas e cozidos), fui integrada no Departamento da Qualidade, acompanhando e participando como estagiria nas tarefas a desenvolvidas. Entre outras tarefas, acompanhei processos de fabrico nas diferentes linhas, verifiquei menes de rotulagem em embalagens e latas e procedi a colheitas de produtos para anlise microbiolgica. A amostragem era

aleatria e realizada sobre os produtos produzidos ao longo da semana (em mdia 6 produtos por semana). As determinaes microbiolgicas, incluram contagens de microrganismos aerbios a 30 C (NP 4405:2002), Enterobacteriaceae (NP 4137:1991), bactrias cido lcticas (ISO 15214:1998), Staphylococcus aureus (NP 2260:1986), Escherichia coli e coliformes (utilizando o meio RAPID`E.coli 2 Agar da Bio-Rad Laboratrios, aprovado pela AOAC international Association of Official Analytical Chemistry International), alm de pesquisa de esporos de clostrdeos sulfito redutores (NP 2262:1986). Efectuava-se, ainda, a todas as matrias-primas recebidas na fbrica, a pesquisa de Staphylococcus aureus. Participei na apreciao das provas de estabilidade (provas de estufa) das conservas alimentares realizadas na indstria (salsichas, pasta de fgado e de carne). De cada ciclo de esterilizao eram retiradas, no mnimo, 3 latas, das quais uma era mantida temperatura ambiente, uma a 35 C e outra a 55 C, durante 7 dias. Aps a incubao, eram escolhidas 20 latas aleatoriamente, das mantidas temperatura ambiente, para realizao das determinaes ponderais (pesagem do produto e do excipiente quando presente). O resultado das determinaes ponderais, de acordo com padres pr-definidos, determina a aprovao ou reprovao de todo o lote. As restantes latas eram abertas para se verificar a integridade do produto, suas caractersticas macroscpicas (cor, textura, superfcie e contagem das unidades) e do excipiente, quando presente. Observei os grficos de cada esterilizao (com meno temperatura e presso), tendo especial ateno para os diferentes tipos de grficos, correspondentes a um tipo de conserva, uma vez que existem programas pr-definidos que tm que ser respeitados para que a esterilizao possa ser considerada vlida. Para alm disso, procedi a um estudo que tinha em vista a escolha de um mtodo dito rpido para monitorizar e verificar a aplicao dos planos de higiene numa sala de fatiagem de produtos prontos a serem consumidos, uma vez que esta etapa considerada um PCC (Ponto Crtico de Controlo) no plano HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point). Para o efeito, compararam-se dois mtodos expeditos ditos rpidos, a saber, a pesquisa de ATP (Adenosina trifosfato) por bioluminescncia e a deteco de protena, com mtodos de microbiologia clssica, onde se fez a avaliao da presena de alguns dos principais indicadores de higiene, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C e Enterobacteriaceae. O objectivo deste trabalho foi, ento, nas condies em presena, escolher o mtodo expedito que mais se adequa monitorizao do PCC considerado.

1. Reviso Bibliogrfica

1.1 Higienizao/Plano de higienizao

A palavra higiene teve a sua origem na Grcia Antiga. Na mitologia grega, aparece Asclepius, filho de Apollo, referido como o Deus da medicina e da cura, e sua irm Hygeia ficou conhecida como a Deusa da cura, estando esse poder directamente relacionado com a limpeza (Lelieveld, Mostert & Holah, 2005). Hipcrates, um dos mais famosos mdicos da Grcia Antiga, conseguiu restabelecer a sade de alguns dos seus pacientes atravs de dieta apropriada e higiene conveniente (Lelieveld et al., 2005). Alguns antropologistas defendem que o homem tem uma tendncia natural para viver com higiene e num ambiente ordenado, evitando o consumo de alimentos sujos. E em meados do sculo XIX, na Europa, o mdico hngaro Ignc Flp Semmelweis (estabeleceu relao entre o decrscimo da febre puerperal e a higienizao conveniente das mos aquando dos cuidados mdicos) e o cirurgio Joseph Lister (introduziu a asspsia na cirurgia), introduziram na sociedade moderna, os cuidados higinicos (Lelieveld et al., 2005). Desde ento, inmeros investigadores concentraram-se no estudo da higiene, de uma maneira geral e de uma forma especfica na higiene alimentar, uma vez que muitos alimentos podem funcionar como veculos transportadores e causadores de doenas. Assim, introduziram-se as Boas Prticas de Higiene (BPH) na manipulao de alimentos ao longo de toda a cadeia alimentar, de forma a garantir a segurana alimentar. As BPH esto previstas na legislao nacional e internacional, e so muito frequentemente consideradas pr-requisitos num sistema de segurana alimentar baseado nos princpios do HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point), conceito que foi introduzido por Bauman, no ano de 1970, e alterou os conceitos de segurana alimentar at ento em vigor (Hawronskyj & Holah, 1997; Metaxopoulos, Kritikos & Drosinos, 2003). Prevenir a contaminao dos alimentos, a chave de um sistema de segurana alimentar. A contaminao ocorre, muitas vezes, devido proliferao indesejvel de microrganismos, deficiente separao dos produtos crus e processados, ao inadequado controlo de temperatura durante o processo de fabrico ou armazenamento, inadequada higienizao ou a contaminao cruzada, especialmente por microrganismos patognicos ou suas toxinas, em refeies prontas a consumir (Easter, 2003; WHO/FAO, 2003; Legnani, Leoni, Berveglieri, Mirolo & lvaro, 2004). O controlo higinico eficaz fundamental para evitar as consequncias nefastas para a sade humana e para a economia das doenas e leses causadas por alimentos e

deteriorao de alimentos (WHO/FAO, 2003). Blankenfeld-Enkvist & Brnnback (2002), defendem mesmo que os contaminantes microbiolgicos nos alimentos so um dos mais importantes problemas no que se refere a custos econmicos. A infeco instala-se quando h ingesto de alimentos contaminados com bactrias patognicas viveis, cuja quantidade tem de ser suficiente para ultrapassar a barreira cida do estmago; passada esta barreira, os microrganismos sobreviventes chegam ao intestino delgado, onde se multiplicam e provocam o aparecimento de sintomas (Soares, 2007). Todos os intervenientes, incluindo agricultores e criadores, fabricantes e

processadores, manipuladores de alimentos e consumidores, tm a responsabilidade de garantir que os alimentos so seguros e adequados ao consumo (WHO/FAO, 2003). Os consumidores esperam dispor de alimentos de alta qualidade, isentos de microrganismos patognicos e toxinas, pelo que a adequada higienizao indispensvel, no podendo ser substituda por nenhuma outra aco (Wildbrett, 2000). Para garantir a correcta aplicao dos planos de higienizao, todas as tarefas devem estar registadas em documentos devidamente arquivados, permitindo posterior consulta, especialmente os desvios e aces correctivas implementadas (Baptista, 2003). Efectuar de forma adequada o plano de higienizao tem uma importncia econmica elevada. Os custos tm que ver com o tempo despendido e a mo-de-obra, equipamento e consumveis utilizados e se a higienizao no for realizada da forma mais correcta e eficaz, o custo inerente a estas aces poder ser muito superior ao benefcio que delas advm (Easter, 2003). A matria orgnica remanescente, derivada de resduos de alimentos ou incrustaes, pode funcionar como suplemento nutricional que favorece a sobrevivncia e a proliferao dos microrganismos, diminuindo a eficcia dos detergentes e desinfectantes (Patel, 1994). Muitas vezes, na indstria, existem as condies ideais para o desenvolvimento de biofilmes em qualquer superfcie. Estes, podem demorar dias ou semanas para iniciar o seu desenvolvimento, que ocorre quando os microrganismos se agregam nas superfcies e segregam uma matriz extracelular protectora, constituda por polissacridos e

glicoprotenas. Remover um biofilme, recorrendo a limpeza e desinfeco, pode revelar-se tarefa impossvel, pelo que extremamente importante, impedir a adeso e reduzir a incidncia de agregao de microrganismos, principalmente os patognicos, a estas superfcies (Jessen & Lammmert, 2003; Lelieveld et al., 2005). O design higinico dos equipamentos e o Layout da planta, tambm so aspectos importantes na preveno e controlo dos biofilmes (Forsythe, 2002). Um plano de higienizao deve especificar as reas, equipamentos e utenslios a serem limpos, a responsabilidade por tarefas especficas, o mtodo e a frequncia da limpeza e as medidas de monitorizao. De forma clara e directa deve responder a

perguntas como: o que limpo, como limpo, quando limpo e quem limpa (WHO/FAO, 2003). A limpeza deve ser feita das reas menos contaminadas para as mais contaminadas, e a eliminao da sujidade deve ser efectiva, assim como a destruio ou a reduo de microrganismos, at nveis considerados aceitveis e que no coloquem em risco a sade dos consumidores e a qualidade do produto, nomeadamente os potencialmente patognicos e os que provocam deteriorao dos alimentos (Noronha, n.d.). Idealmente, o plano de higiene dever ser pensado logo quando se inicia o desenho e a construo do edifcio e a escolha dos equipamentos, uma vez que a sua configurao deve permitir a correcta manuteno, limpeza e desinfeco. A contaminao pelo ar deve ser prevenida ou minimizada e deve verificar-se a existncia de proteco efectiva contra a entrada e permanncia de pragas. O projecto das instalaes deve privilegiar o fluxo de produtos das zonas mais contaminadas para as menos contaminadas, prevenindo desta forma as recontaminaes. Todos os documentos inerentes construo devem ser criteriosamente catalogados, validados e armazenados (Noronha & Baptista 2003; Lelieveld et al., 2005). Os estabelecimentos fabris devem estar afastados de reas ambientalmente poludas e de actividades industriais que constituam risco grave de contaminao, de reas sujeitas a inundaes, salvo se forem tomadas precaues suficientes, de reas com especial predisposio infestao por pragas e de reas em que os resduos, lquidos ou slidos, no possam ser eficazmente removidos (WHO/FAO, 2003).

1.1.1 Programa de higienizao

Para se realizar um programa de higienizao com sucesso, essencial conhecer a natureza da sujidade que vai ser removida, o tipo de superfcies que vo ser higienizadas, a qualidade da gua, os mtodos de higienizao mais adequados e utilizar agentes de limpeza e desinfeco compatveis com a indstria alimentar. igualmente importante escolher o mtodo mais indicado para avaliar e monitorizar a eficcia do processo implementado, o que permitir no s detectar precocemente um problema mas, acima de tudo, evitar a sua perpetuao.

1.1.1.1 Tipos de sujidade

Definir o tipo de sujidade um dos elementos mais importantes quando se pretende implementar um plano de higiene, pois est intimamente relacionado com o mtodo e

detergente mais indicado para a sua remoo (Noronha, n.d.). Assim, quanto origem, a sujidade pode classificar-se em animal, vegetal e mineral; quanto sua composio qumica, em inorgnica, proveniente de resduos metlicos, alcalinos ou de gua dura, e orgnica, resultante sobretudo de resduos de alimentos (Baptista, 2003). Numa indstria de carnes, a sujidade orgnica , sem dvida, a que maiores problemas causa; os resduos de gordura, protenas e hidratos de carbono, resultantes da laborao, necessitam ser correctamente higienizadas para que sejam cumpridos os prrequisitos estabelecidos no Cdigo de Boas Prticas (Noronha, n.d.). A gordura, insolvel em gua e em solues alcalinas e cidas, facilmente removida na presena de agentes tensioactivos e com ajuda de temperatura (40 C a 60C); as protenas so pouco solveis em gua, ligeiramente solveis em soluo alcalina, mas a sua remoo relativamente fcil; os hidratos de carbono, solveis em gua, permitem igualmente uma remoo relativamente fcil (Noronha, n.d.).

1.1.1.2 As superfcies

A escolha dos materiais utilizados na indstria deve ser cuidada, devendo optar-se pelos materiais durveis, no porosos, que no apresentem facilmente corroso, estveis temperatura e aos produtos qumicos neles utilizados, passveis de manter e limpar (Noronha & Baptista, 2003; WHO/FAO, 2003). O melhor material utilizado , sem dvida, o ao inoxidvel, devido s suas propriedades qumicas. o mais resistente corroso, tem superfcie suave e impermevel, fcil de limpar e resistente a altas temperaturas. Contudo, no totalmente incuo, porque na sua superfcie facilmente se forma uma camada de xido de crmio, que rapidamente destruda pelo contacto com o ar. Inadequadamente utilizam-se materiais abrasivos para a remover, danificando irremediavelmente a superfcie (Jullien, Bnzech, Carpentier, Lebret & Faille, 2003). As superfcies de metal enferrujam devido a detergentes cidos ou com cloro; os galvanizados previnem esse enferrujamento. Nas superfcies de borracha, deve optar-se pelas no porosas ou esponjosas, e por utilizar detergentes alcalinos que no afectam a sua estrutura, ao contrrio do que acontece quando se utilizam solventes orgnicos e cidos fortes (Noronha, n.d.). Superfcies de beto podem ser danificadas e fragmentar devido ao contacto com alimentos cidos e agentes de limpeza. O vidro, quando utilizado, deve ser suave e impermevel e para proceder sua limpeza deve recorrer-se a detergentes alcalinos suaves ou neutros, que no alteram a sua estrutura (Noronha, n.d.). A madeira est contra-indicada na indstria alimentar, uma vez que no possvel realizar uma higienizao conveniente, porque a sua superfcie rugosa facilita a fixao dos

microrganismos, para alm do que absorve facilmente humidade, gorduras e leos (Noronha, n.d.).

1.1.1.3 A gua

Quando se pretende por em prtica um plano de higienizao, um dos factores determinantes a ter em conta a qualidade na gua, que deve ser prpria para consumo humano (ausncia de odor, sabor, cor e sedimentos estranhos, salubre, limpa, desejavelmente equilibrada na sua composio, livre de microrganismos e no corrosiva), (Noronha, n.d.; Decreto Lei n 306/2007). De acordo com o Decreto-Lei n 306/2007, a gua destinada ao consumo humano fornecida por redes de distribuio, por fontanrios no ligados rede de distribuio, por pontos de entrega, por camies ou navios-cisterna, por reservatrios no ligados rede de distribuio ou utilizada numa indstria alimentar, deve ser analisada quanto a parmetros microbiolgicos, parmetros qumicos e parmetros indicadores. igualmente neste Decreto-Lei que se encontram estabelecidas as frequncias mnimas de amostragem e de anlise para a realizao do controlo de qualidade da gua. O abastecimento, armazenamento e distribuio de gua potvel, assim como o controlo de temperatura, deve estar disponvel, de forma a garantir a segurana e a adequao aos alimentos. A utilizao de gua no potvel est prevista na indstria, desde que se destine exclusivamente a controlo de incndios, produo de vapor, refrigerao ou aco semelhante que no contacte com os alimentos. Os sistemas de gua no potvel, devem estar identificados para que no haja refluxo para os sistemas de gua potvel (WHO/FAO, 2003). Em alguns locais da indstria, dada a natureza das operaes a realizadas, igualmente importante controlar a temperatura ambiente, de forma a garantir a segurana dos alimentos. O inadequado controlo desta varivel uma das causas mais comuns das doenas com origem nos alimentos.

1.1.1.4 Mtodos de higienizao

As prticas de higiene, devero ser realizadas de forma adequada, para garantir que os microrganismos so removidos e inactivados durante a limpeza e desinfeco (Tompkin, 2004). A limpeza pode recorrer utilizao combinada de mtodos fsicos, como o calor, a frico, o fluxo turbulento, a limpeza a vcuo ou outros mtodos que evitem o uso de gua, e mtodos qumicos utilizando detergentes e/ou desinfectantes (WHO/FAO, 2003).

Os mtodos e materiais de limpeza utilizados dependem da natureza da indstria (processo de fabrico, tipo de produto, tipo de superfcies) e nvel de higiene requerido, podendo ser efectuada apenas uma limpeza ou uma limpeza seguida de desinfeco. Por vezes, por razes relacionadas com a economia de tempo e energia, h interesse em limpar e desinfectar em simultneo (sanificao), todavia, em muitos casos, esta operao conjunta levanta reservas, porque a sujidade que envolve os microrganismos reduz a eficcia da desinfeco; para compensar a perda de eficcia provocada pela sujidade, utilizam-se sempre quantidades mais elevadas de sanificador do que seria necessrio para uma superfcie previamente limpa (Wildbrett, 2000). O processo de higienizao inicia-se com o enxaguamento, para remoo de partculas de sujidade e de alguns microrganismos pouco aderidos, seguindo-se lavagem com a aplicao do detergente, que actua sobre as partculas de sujidade que se encontram aderidas, diminuindo a sua ligao s superfcies; segue-se a fase de enxaguamento, para remoo completa das partculas entretanto libertadas, do detergente aplicado e de alguns microrganismos (Noronha, n.d.; Wildbrett, 2000; Cruz, Cenci & Maia, 2006). Nos casos em que se realiza desinfeco, aplica-se ento o desinfectante que se deixa actuar durante algum tempo; ocorre nesta fase uma reduo considervel do nmero de microrganismos. Segue-se novo enxaguamento para remoo completa do

desinfectante, etapa dispensvel para alguns desinfectantes (Noronha, n.d.). A desinfeco, no ser efectiva, sempre que algum dos passos anteriores do processo de higienizao, no for eficazmente realizado (Lelieveld et al., 2005). Por fim realiza-se a secagem, cuja principal finalidade a remoo de gua em excesso, eliminando a humidade residual que poderia favorecer o crescimento de microrganismos (Noronha, n.d.). Realiza-se recorrendo a ar seco ou qualquer outro material disponvel como, por exemplo, papel descartvel, de forma a que a recontaminao seja mnima (Lelieveld et al., 2005).

1.1.1.5 Detergentes e desinfectantes

Os detergentes utilizados nos processos de limpeza, devem obedecer a alguns requisitos, como a dissoluo rpida e completa na gua, penetrao rpida na sujidade, capacidade de condicionar ou neutralizar a dureza da gua, e de manter a sujidade em suspenso, facilidade de enxaguar, biodegradvel e no txico. Agrupam-se em trs classes, detergentes alcalinos, cidos e enzimticos (Noronha & Baptista, 2003). Os detergentes alcalinos possuem pH entre 7 e 14; os altamente alcalinos, so utilizados para a remoo de impurezas incrustadas ou queimadas, os moderadamente alcalinos so eficientes na remoo de gorduras e os alcalinos suaves so vulgarmente utilizados na limpeza manual de reas ligeiramente sujas.

Os detergentes cidos, removem os materiais que esto secos ou incrustados nas superfcies e dissolvem os minerais. So especialmente eficazes na remoo de depsitos formados pelos detergentes alcalinos. Existem detergentes cidos orgnicos e inorgnicos. Os primeiros no corroem as superfcies, so adequados para limpezas manuais e reduzem a dureza da gua. Os inorgnicos so excelentes para remover e controlar depsitos minerais, mas bastante corrosivos para as superfcies (Noronha, n.d.). Os detergentes enzimticos constituem uma alternativa aceitvel, quando os equipamentos no podem ser expostos a condies excessivamente cidas ou alcalinas, uma vez que as enzimas actuam de forma especfica sobre a sujidade (Baptista, 2003). Escolhido o detergente mais adequado, de acordo com as caractersticas da indstria, fundamental seguir as recomendaes do fabricante sobre concentrao, tempo e temperatura de utilizao; , tambm, importante a remoo prvia das sujidades, por aco mecnica. A alterao de apenas um destes factores pode comprometer irremediavelmente a eficcia do detergente (Langsrud, Sidhu, Heir & Holck, 2003). A principal funo da desinfeco, reduzir o nmero de microrganismos viveis, principalmente os patognicos, e prevenir o crescimento microbiano durante a produo; especialmente importante em superfcies hmidas, onde as condies so mais favorveis proliferao microbiana (Noronha, n.d.). Actualmente o mercado disponibiliza trs tipos de desinfeco: por calor, por radiao ou qumica. A desinfeco por calor, um bom mtodo, actua sobre todos os microrganismos, no corrosivo, contudo apresenta como principais limitaes a no aplicabilidade em superfcies sensveis ao calor, bem como o seu elevado custo. A desinfeco por radiao mais usada em hospitais e laboratrios; na indstria alimentar os restos de alimentos e outras sujidades, absorvem a radiao e tm um efeito protector dos microrganismos, o que, por si s, j uma grande desvantagem. A desinfeco qumica , sem dvida a mais vulgarmente utilizada, contudo, necessrio escolher o desinfectante mais apropriado de acordo com os microrganismos que se pretendem eliminar; os mais utilizados so o cloro e compostos de cloro, compostos de iodo e compostos de amnio quaternrio (Noronha, n.d.). O cloro e compostos de cloro, so bons antibacterianos, contudo ineficientes na presena de alguns produtos orgnicos; as solues muito concentradas podem ser corrosivas para as ligas de alumnio. Dentro dos compostos de cloro, os mais utilizados so os hipocloritos de clcio e sdio, cujo uso, nas concentraes adequadas, no alteram as qualidades organolpticas dos produtos (Noronha, n.d.; Jessen & Lammmert, 2003). Os compostos de iodo, podem combinar-se com agentes de limpeza cidos; as solues preparadas devem ter concentraes entre 25-50 mg/l de iodo activo e pH inferior

a 4. O seu tempo de actuao bastante baixo, contudo este composto pode ser corrosivo, o que implica a necessidade de enxaguamento abundante com gua limpa. Elimina um largo espectro de bactrias, mas a presena de resduos alimentares e de sujidade inactivao; apresenta cor amarela quando o iodo se mantm activo, e a alterao da cor significa a inactividade do composto. Os compostos de amnio quaternrio tm boa capacidade de higienizao, no so txicos nem corrosivos, contudo tendem a permanecer nas superfcies, da a importncia de enxaguar cuidadosamente com gua limpa. Devem ser usados em concentraes entre 200-1200 mg/l; se a gua de lavagem for dura, deve aumentar-se a concentrao, mas nunca se pode misturar quaisquer detergentes ou agentes higienizantes aninicos (Noronha, n.d.). A escolha do desinfectante deve considerar o tempo de contacto, temperatura, concentrao, pH, limpeza prvia e dureza da gua, os quais so factores importantes que condicionam a sua eficcia (Cruz et al., 2006). Ainda muito comum, na indstria, a realizao da limpeza manual, efectuada pelos prprios manipuladores de alimentos. Devido grande heterogeneidade de resultados que se podem obter, requerida uma cuidada monitorizao. Para auxiliar limpeza manual pode recorrer-se a mangueiras com pistolas de gua, com tamanho adequado ao local a higienizar, de forma a evitar quedas de presso ou disperso da sujidade, e a escovas, preferencialmente de nylon, pois tm fibras resistentes, uniformes e no absorvem gua (Noronha, n.d.). O uso de raspadores est condicionado limpeza de zonas de dimenso reduzida e os mecanismos abrasivos, vulgarmente conhecidos por palha-de-ao, esto restritos a zonas que no contactem directamente com os alimentos. Contudo, podem ainda utilizar-se outros mtodos, tais como imerso, alta presso (recorrendo a bombas de gua de alta presso ou pistolas de vapor), espuma e gel (evita aco mecnica e reduz custos de mo de obra), limpeza de equipamentos em circuitos fechados (implica instalao de equipamentos especficos) e pulverizao, recorrendo a nebulizantes e fumigantes ou a sistemas de asperso (Noronha, n.d.). O equipamento utilizado na limpeza da rea de fabrico deve estar criteriosamente identificado, para no ocorrer troca com o equipamento utilizado em reas de no produo; deve ser manuseado com cuidado e de acordo com as instrues do fabricante, se for o caso. Aps higienizao, devem-se lavar, desinfectar e secar os utenslios e equipamentos e armazen-los em lugar prprio. Os detergentes e desinfectantes devem ser colocados em local fechado, longe dos gneros alimentcios, evitando o risco de contaminao (Noronha, n.d.).

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1.1.2 Higiene Pessoal

A roupa usada no exterior da fbrica, deve ser diferente da usada no interior da mesma, principalmente nas zonas de processamento de alimentos. Idealmente cada funcionrio deve possuir equipamento de proteco individual de cor clara, constitudo por touca ou barrete, camisa, camisola ou bata, calas e calado apropriado. Eventualmente avental, com bolsos abaixo do nvel da cintura, de forma que os objectos pessoais a guardados que possam cair, vo directamente para o pavimento (Baptista & Saraiva, 2003). As pessoas que entram em contacto directo ou indirecto com os alimentos, devem manter um nvel adequado de limpeza pessoal, e comportamentos e modos de operao adequados de forma a no contaminarem os alimentos por contaminao cruzada, quer devido a infeces bacterianas, quer virais. Os operadores envolvidos no processo de limpeza, devem receber formao em higiene pessoal e alimentar, para que sejam prevenidas as contaminaes cruzadas dos alimentos, resultantes da disseminao da sua flora corporal, principalmente as que resultam dos microrganismos com uma dose infectante baixa, como seja a Escherichia coli O157 (WHO/FAO, 2003; Lelieveld et al., 2005). As contaminaes cruzadas podem ocorrer de forma directa, quando o alimento directamente contaminado a partir de outro alimento ou superfcie com que contacte e ainda atravs do ar (Legnani et al., 2004). A contaminao indirecta envolve um processo bem mais complexo, em que a contaminao ocorreu em um ou mais locais ao longo da cadeia alimentar, tendo permanecido resduos nos tecidos (Lelieveld et al., 2005). As reas de processamento devem ter acesso restrito ou controlado, podendo ser necessrio lavar as mos ou desinfect-las antes da entrada nestas reas. O equipamento de uso pessoal dever ser o mais apropriado e a sua utilizao exclusiva do local de trabalho; dever apresentar-se limpo e ser trocado com frequncia, de forma a reduzir a potencial de contaminao durante o processo laboral. Os lavatrios para lavagem das mos devem estar equipados com gua quente e fria. As mos devem ser higienizadas com sabo especfico, e a desinfeco realizada com produtos adequados; devem ser secas com toalhas descartveis. O Staphilococus aureus, constituinte comum da flora cutnea habitual pode continuar presente, mesmo tendo os cuidados citados, pelo que pode ser aconselhvel o uso de luvas descartveis quando se manipulam alimentos (WHO/FAO, 2003). A lavagem das mos e da zona dos antebraos exposta, dever ocorrer obrigatoriamente no incio da laborao, aps ida casa de banho, aps as refeies, sempre que se manusear alimentos crus ou material contaminado, antes de se colocar ou

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mudar de luvas e depois de se contactar com detergentes ou desinfectantes (Baptista & Saraiva, 2003).

1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza

Optimizar e monitorizar, o programa de limpeza, reduz custos em material e tempo, minimiza a contaminao ambiental, diminui as perdas por avarias e aumenta o tempo de vida til dos produtos alimentares. Normalmente, a monitorizao avalia a presena de resduos, recorrendo a inspeco visual e faz a avaliao microbiolgica, atravs do recurso a tcnicas de microbiologia clssica ou a mtodos mais expeditos, como as placas de contacto. Por outro lado, pode recorrer-se utilizao de mtodos rpidos para monitorizao do plano de limpeza, nomeadamente ATPmetria, que mede a quantidade de ATP presente numa determinada superfcie, ou zaragatoas especficas que permitem detectar protena (importante na indstria de carnes) ou lactose (indstrias de lacticnios). De acordo com Baptista (2003), uma elevada percentagem de intoxicaes e infeces alimentares, resulta da contaminao dos equipamentos, o que refora a noo da importncia fundamental da higienizao, na indstria alimentar.

1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos

De acordo com Prescott, Harley, & Klein (2005), a microbiologia pode ser definida como o estudo de organismos e agentes demasiado pequenos para serem claramente vistos a olho nu. Mesmo antes de os microrganismos poderem ser visualizados, alguns autores suspeitavam da sua existncia e responsabilizavam-nos por doenas. Entre estes encontrase o filsofo romano Lucretius (98-55 A.C.) e o fsico Girolamo Fracastoro (1478-1553), que sugeriram, cada um a seu tempo, que as doenas eram causadas por criaturas vivas invisveis (Prescott et al., 2005). Antony van Leeuwenhoek, um microscopista amador, foi o primeiro a observar e descrever microrganismos, publicando os resultados das suas primeiras observaes de bactrias e protozorios em 1677 (Ferreira & Sousa, 2000; Prescott et al., 2005). Contudo, s no sculo XIX (1857), Louis Pasteur, demonstrou que a fermentao cido lctica era produzida por microrganismos, iniciando desta forma a era moderna da microbiologia alimentar (Prescott et al., 2005).

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A anlise microbiolgica, designada clssica, tradicional ou convencional, remonta aos anos de 1920-1930, contudo nessa poca no existia metodologia especfica. Anteriormente a esta data, a nica forma de verificar se um local estava ou no correctamente higienizado, seria recorrer inspeco visual, alis um mtodo ainda bastante utilizado na indstria alimentar. Isoladamente no um bom mtodo, porque apenas detecta os detritos maiores (Baptista, 2003), todavia associado com outros pode-se revelar bastante til, por exemplo, quando combinado com luz ultravioleta, pode detectar detritos de p ou de leo em stios pouco acessveis. Actualmente, as tcnicas de anlise microbiolgica baseiam-se na colheita de amostras e respectivo processamento em laboratrio, de acordo com mtodos descritos em Normas Portuguesas (NP) ou Internacionais (EN, ISO, entre outros). As amostras podem ser slidas, lquidas, de ar ou amostras de superfcies, e os mtodos, solutos, meios de cultura e diluies utilizados dependem do tipo de material colhido, da estrutura da superfcie e da expectativa do tipo e nvel de contaminao. At aos anos 80, o controlo da eficcia dos planos de higienizao numa indstria alimentar era feito com recurso microbiologia dita clssica (Easter, 2003), recolhendo amostras com zaragatoas estreis, determinando para o efeito contagens de

microrganismos a 30 C e de Enterobacteriaceae, cujas diluies eram semeadas em meios de cultura especficos ou no, conforme os microrganismos avaliados. Geralmente, procuravam-se microrganismos aerbios mesfilos e microrganismos indicadores de higiene, nomeadamente os de origem fecal. A metodologia microbiolgica clssica , ainda hoje, considerada o Gold Standard, quando as monitorizaes so requeridas em regulamentos nacionais e internacionais, constituindo os mtodos oficiais de controlo (Blankenfeld-Enkvist & Brnnback, 2002).

1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae

Atravs da contagem os microrganismos a 30 C, percebe-se da contaminao presente, na amostra, uma vez que engloba a grande maioria dos microrganismos com importncia na indstria, inclusive os potencialmente patognicos de maior interesse. Por outro lado, as Enterobacteriaceae, incluem um vasto leque de microrganismos, constitudo por bacilos Gram negativos, aerbios-anaerbios facultativos, fermentadores da glucose, catalase positivos e citrocromo-oxidase negativos. Os principais gneros desta famlia so: Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Eschericia, Salmonella, Proteus, Shigella, Yersinia e Klebsiella (Prescott et al., 2005).

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A presena de Enterobacteriaceae em alimentos processados fornece uma boa indicao de um tratamento inadequado ou de recontaminao aps o processamento. A presena de Enterobacteriaceae nas superfcies, equipamentos e mos dos manipuladores pode aumentar o nmero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) nos alimentos, se durante o armazenamento, transporte ou distribuio ocorrer um aumento de temperatura (Crowley et al., 2005). Crowley et al. (2005) referem que as Enterobacteriaceae e outros microrganismos indicadores de higiene avaliam a qualidade dos alimentos e as condies de higiene durante o processamento. No entanto, os autores ressalvam que no seguro associar estes microrganismos indicadores a microrganismos patognicos contaminantes dos alimentos. De acordo com Tebbutt (2007), a contagem de Enterobacteriaceae e de microrganismos aerbios totais a 30 C, providenciam adequada informao para verificar o sistema HACCP. As tcnicas clssicas de colheita e processamento de amostras so amplamente usadas na indstria. Tm a grande vantagem de permitir detectar e quantificar microrganismos especficos, mas apresentam desvantagens, como sejam no detectarem resduos de produtos resultantes de uma m higienizao, ou por outro lado o tempo que medeia entre a realizao da anlise e a obteno de resultados, alm da necessidade de mo-de-obra especializada para as realizar (Lelieveld et al., 2005). O custo inerente a este mtodo tambm constitui um factor limitante, tendo em conta que o mesmo se encontra associado ao nmero de amostras processadas, isto , ao custo da realizao da colheita, transporte para o laboratrio, bem como do processamento de anlise propriamente dita em laboratrio (Tompkin, 2004). Constituem, no obstante, uma ferramenta importante, quando em presena de uma toxinfeco, ou quando se pretende implementar um programa de pesquisa e controlo de um microrganismo potencialmente patognico especfico, por exemplo, Listeria em superfcies. A maioria dos protocolos de colheita de amostras em superfcies baseiam-se na tcnica de Manheiner & Yheunez descrita em 1917. Esta tcnica utiliza zaragatoas esterilizadas, com uma haste mais ou menos flexvel e uma substncia fibrosa na extremidade, mergulhada num soluto diluidor isotnico. A colheita da amostra faz-se por esfregao na superfcie a testar. Os microrganismos transferidos para a zaragatoa podem ser semeados, num meio de cultura adequado, directamente ou aps diluies em soluto apropriado (Lelieveld et al., 2005). O registo da data de colheita, do processamento, bem como do operador que a realizou, assim como a temperatura a que a amostra entregue no laboratrio, so dados extremamente importantes, principalmente na presena de resultados incomuns ou significativamente diferentes, pois podem auxiliar na interpretao dos mesmos.

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Aps incubao, a contagem das colnias desenvolvidas nos meios, fornece uma indicao sobre a abundncia ou no de contaminao na superfcie testada. A recolha feita de forma assptica, recorrendo a um maarico ou lamparina de lcool. As superfcies testadas podem ter diferentes reas, e so geralmente delimitadas por placas metlicas ou de outro material esterilizvel, com janelas quadrangulares. Regra geral, a zaragatoa consegue remover os microrganismos da rea em estudo, todavia, a sua remoo pode ser dificultada quando se est em presena de detritos incrustados e, particularmente de biofilmes. Nestas situaes, as contagens podem ficar diminudas e os resultados eventualmente falseados. Geralmente, as zaragatoas para colheita das amostras encontram-se mergulhadas em solues, neutralizantes, isotnicas e redutoras do stress fisiolgico, cujo principal objectivo manter a viabilidade dos microrganismos recolhidos das superfcies. O soluto neutralizante tem a funo de neutralizar a presena de resduos de detergentes ou desinfectantes que permaneam remanescentes na superfcie, mesmo aps o

enxaguamento. Sem o soluto neutralizante, os resduos de detergente e de desinfectante poderiam inactivar os microrganismos, fazendo com que artificialmente o seu nmero fosse reduzido. Algumas empresas adicionam substncias surfactantes s solues contidas nos tubos das zaragatoas, com o objectivo de reduzir a tenso superficial e melhorar a captao de microrganismos, aquando da realizao da recolha da amostra. Em alguns casos, a presena de surfactante provoca um aumento do nmero de colnias, por desagregao de grupos de organismos, aumentando deste modo, falsamente, o nmero de UFC (Lelieveld et al., 2005). Idealmente, as zaragatoas devero ser processadas logo aps a recolha da amostra, contudo essa situao nem sempre possvel, especialmente se a colheita realizada longe do laboratrio. Ento, as zaragatoas tm que ser transportadas a temperaturas inferiores a 5 C, mas sem permitir a sua congelao. Esta condio faz com que as diferenas microbiolgicas sejam mnimas, quando comparadas com zaragatoas que so processadas logo aps a colheita (Lelieveld et al., 2005). Em qualquer indstria alimentar, fundamental a resposta rpida das anlises efectuadas a determinado produto, equipamento ou superfcie, uma vez que a presena de contaminao microbiolgica pode implicar a perda de produto ou mesmo um problema de sade pblica, com todos os custos que isso implica. J quando se trata de indstria onde existem planos de HACCP implementados, a questo agudiza-se, porque na monitorizao de Pontos Crticos de Controlo, de um fluxograma, so muitas vezes necessrios resultados quase imediatos, para que possam ser reproduzidas aces correctivas em tempo til.

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As desvantagens apontadas anteriormente anlise microbiolgica clssica, particularmente no que se refere ao tempo de resposta so factores muito importantes nestes casos, o que ter a na base, entre outros factores, da procura de um mtodo microbiolgico de resultados mais expeditos. Os principais objectivos dos mtodos rpidos so contribuir para aumentar a eficincia dos laboratrios, simplificar o trabalho, aumentar a capacidade analtica e reduzir os custos (Hygiena, n.d.; Easter, 2003), o que permitiu o crescimento acelerado do mercado dos mtodos rpidos. Entre os vrios testes propostos, referem-se o teste de deteco de ATP por bioluminescncia e o teste de deteco de protena.

1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia

O ATP, importante fonte de energia intracelular, est presente em todos os seres vivos; sendo usado em diversas funes celulares, desempenha um papel importante na troca de energia nos sistemas biolgicos, servindo como dador de energia. Resduos de produtos alimentares, contm elevada quantidade de ATP; as clulas microbianas tambm contm ATP; aps higienizao de equipamentos e superfcies de contacto com produtos alimentares, a quantidade de ATP dever ser reduzida. A descrio bioqumica da reaco de bioluminescncia foi feita em 1940, e a determinao de ATP usando o sistema luciferina/luciferase foi descrito em 1949 (Hawronskyj & Holah, 1997; Patel, 1994). Contudo, o desenvolvimento e aplicao de mtodos baseados na deteco de ATP, teve incio nos anos 80, com a empresa Lumac (Easter, 2003); nessa altura, a medio de ATP por bioluminescncia, destinava-se deteco de microrganismos nos alimentos e monitorizao da higiene, um indicador rpido do nvel de material biolgico presente em superfcies e em lquidos, principalmente nos sistemas aeroespaciais da NASA (National Aeronautics and Space Administration). Estes testes dispensam a sementeira e cultura em meios apropriados e os resultados surgem em segundos ou minutos, contrariamente a horas ou dias como acontece com as metodologias clssicas. Pode considerar-se que representam a verdadeira inspeco ao processo de higienizao, porque para alm dos microrganismos detectam tambm resduos de alimentos, resultantes de uma higienizao deficiente. Estes resduos, podem potenciar o desenvolvimento de microrganismos presentes se as condies ambientais forem propcias, em termos de tempo e temperatura, alm de

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poderem ser origem de contaminao cruzada de outros alimentos e nalguns casos, alergias alimentares (Patel, 1994; Lelieveld et al., 2005). A ATPmetria um mtodo que detecta baixos nveis de contaminao (Redsven et al., 2007), e por isso pode ser utilizada, em todos os locais onde se processam alimentos, sejam hospitais, restaurantes, supermercados ou indstrias diversas, locais onde a rpida avaliao de contaminao e do nvel higinico das superfcies e gua tem elevado interesse, uma vez que contribui para a produo de alimentos seguros, de qualidade e reduz os custos inerentes deteriorao de alimentos. uma tcnica amplamente utilizada, todavia a interpretao do que se avalia nem sempre simples. Simm, Andrade, Mendona, Passos & Chaves (2006) realizaram um estudo de ATPmetria, com substncias orgnicas vulgarmente detectadas em indstrias alimentares, em superfcies de ao inoxidvel, nomeadamente -casena (3,5; 7,0 e 11,0 mg/ml) representando protenas, sacarose (0,6; 1,2 e 11,0 mg/ml) representando os acares e banha de porco (7,0; 14,0 e 21,0 mg/ml) representando as gorduras. Estas concentraes foram determinadas em ensaios prticos, e representam os valores destes compostos, determinados nas referidas superfcies aps finalizada a higienizao. O mesmo estudo, incluiu tambm concentraes de Staphilococus carnosus (5,4 x 109 e 5,4 x 104 CDM/ml) e Bacillus subtilis (2,9 x 107 e 2,9 x 103 CDM/ml), bactrias obtidas por contagem directa ao microscpio (CDM). O estudo mostrou que as solues contendo substncias orgnicas isoladas ou associadas entre si ou com esporos de Bacillus subtilis forneciam resultados considerados satisfatrios, ainda que ressalvando a importncia dos resultados falso negativos, porque a concentrao de ATP do esporo bacteriano 10000 vezes menor que a prpria bactria. Suspenses de Staphilococus carnosus associados s substncias orgnicas ou isoladamente, forneceram resultados insatisfatrios. Os seus autores concluem que esta tcnica pode ser usada para monitorizao da higiene, desde que associada com outros mtodos como a contagem microbiana. A bioluminescncia um fenmeno amplamente observado na natureza, ocorrendo nas profundezas dos oceanos, em alguns insectos, bactria, fungos e numa variedade de outros organismos (Patel, 1994; Liu, Vico & Lindh, 2008). A bioluminescncia, (do grego bios vivo e do latim lumen luz) a luz produzida num sistema biolgico, com uma taxa de eficincia de 96% (Rocha, 2007). O fenmeno de luminescncia ocorre (Fig. 1) quando uma molcula excitada pela absoro de energia, proveniente de uma reaco qumica, retoma ao seu estado inicial com emisso luminosa. Nestas reaces os substratos so de origem biolgica, as enzimas luciferases (oxigenases), utilizam o oxignio molecular para oxidar o substrato (luciferina), traduzindo-se esta reaco pela emisso de um foto por cada molcula de ATP (Liu et al., 2008).

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Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia (Adaptado de: Liu, Vico & Lindh, 2008).

A medio do ATP por bioluminescncia requer usualmente a amostragem de uma rea com, aproximadamente, 100 cm2 (Moore & Griffith, 2002b Hygiena, n.d.). A luz emitida tem caractersticas muito precisas em termos de cor, intensidade e polarizao e a sua quantidade proporcional ao valor total de ATP na superfcie e, por conseguinte, sua limpeza (Rocha, 2007). A quantidade de ATP no interior das clulas varia com o tipo de clula, e com a fase da curva de crescimento em que se encontra (clulas em stress ou na fase estacionria de crescimento contm menor quantidade de ATP). O complexo luciferina-luciferase (a luciferase pode ser obtida do pirilampo Americano, Photinus pyralis), converte a energia qumica associada ao ATP em luz, numa reaco em que h proporo molar, ou seja, um foto de luz produzido pela hidrlise de uma molcula de ATP. Os reagentes esto formulados de forma que haja emisso de uma luz verde amarelada. A luz emitida medida em relative light units (RLU) (Hawronskyj & Holah, 1997; Aycicek, Oguz & Karci, 2006). As leituras obtidas devero ser comparadas com as leituras padro, determinando se uma superfcie se encontra limpa ou no. Em poucos minutos, esta tcnica permite afirmar se a superfcie em estudo se encontra ou no apta para entrar em contacto com alimentos. A formulao qumica dos reagentes varia com a marca do aparelho, contudo, todos contm o complexo luciferina-luciferase, ies de magnsio, soluo tampo e extractores (para remover o ATP das clulas vivas). Variam quanto ao prazo de validade, uma vez que o mesmo est relacionado com a sua composio assim como com a temperatura de armazenamento (Lelieveld et al., 2005). A reaco catalisada pela enzima luciferase, a qual utiliza a energia contida numa molcula de ATP (rica em energia), conduzindo descarboxilao oxidativa da luciferina, cujo resultado a produo de luz, com um pico de ocorrncia aos 0,3 segundos (Patel, 1994). A actuao ptima das enzimas luciferases est condicionada a certas condies: pH 7,75 e temperatura entre 20-22 C (Hawronskyj & Holah, 1997; Niza Ribeiro, Cerqueira, Santos & Louz, 2002). Alteraes de pH, temperatura, presena de ies metlicos (Zn2+, Cd2+ e Hg2+), podem reduzir a luz emitida ou detectada (Patel, 1994).

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Algumas indstrias reclamam um teste que se mantenha estvel temperatura ambiente, contudo essa varia consideravelmente em funo do clima, o que obrigaria as indstrias produtoras destes aparelhos e das zaragatoas a produzirem diferentes produtos de acordo com a amplitude trmica do pas (Lelieveld et al., 2005). O valor de ATP varia consideravelmente de acordo com o gnero alimentcio em presena. Alguns alimentos frescos, como tomate, apresentam valores elevados, enquanto outros alimentos, especialmente os muito processados, ricos em gordura, leo ou acar, mostram valores de ATP muito baixos (Lelieveld et al., 2005). Na produo de leite em p, ou na mistura de farinhas e de acares, os procedimentos de limpeza no removem todos os detritos, pelo que, nestes casos, no possvel utilizar a tcnica de deteco de ATP por bioluminescncia. Os detergentes usados na limpeza, podem provocar uma diminuio ou aumento dos indcios de ATP. Por este motivo, desejvel, para haver consistncia nos resultados, garantir que os agentes de limpeza, so removidos por enxaguamento, antes de o teste ser executado. Contudo, para reduzir ao mximo essa interferncia, muitos kits comerciais contm na sua constituio substncias neutralizantes como a lecitina, tween 80 ou a ciclodextrina (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005). De acordo com Costa, Andrade, Brando, Passos & Soares (2006), o hidrxido de sdio, utilizado na higienizao da indstria de lacticnios no interfere com a deteco de ATP por bioluminescncia. Esta opinio contrria de outros autores que comprovaram a aco inibitria dos sais de sdio sobre a luciferina (Rodionova & Petushkov, 2006). A repetibilidade e confiana dos instrumentos e dos seus testes podem variar consideravelmente de acordo com os fabricantes, mas regra geral so superiores aos testes realizados recorrendo microbiologia clssica com recurso ao uso de zaragatoas (Lelieveld et al., 2005). A sensibilidade dos instrumentos disponveis, bem como dos seus testes varivel, e tem sido discutido qual o limite de sensibilidade adequado aos testes. A resposta a essa questo prende-se com o facto de cada teste, numa indstria, ter a capacidade de distinguir entre uma superfcie eficientemente limpa de uma ineficientemente limpa. Os testes altamente sensveis so mais adequados quando, por exemplo, se pesquisam microrganismos potencialmente patognicos, ou em situaes em que difcil distinguir se uma superfcie est efectivamente limpa ou no. Contudo, alguns estudos referem que a tcnica de deteco de ATP por bioluminescncia apenas detecta microrganismos quando a sua contagem for superior a 103 ou 104 UFC/cm2, enquanto que outros se referem a 100 cm2 ou zaragatoa, o que mostra que no h unanimidade de opinies de autores, e parece ser uma limitao do mtodo, quando comparado com os mtodos tradicionais que conseguem detectar <10 UFC/cm2 (Patel, 1994; Ber & Beuner, 1999; Moore & Griffith, 2002a; Larson et al., 2003).

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A ATPmetria pode ainda ser adaptada num teste para determinao de resduos de substncias alergnicas, sendo para tal necessrio que detecte entre 0,1 e 5 ppm (partes por milho) de alergnios em resduos de alimentos (Lelieveld et al., 2005). A dimenso dos primeiros luminmetros condicionava-os ao uso exclusivo em laboratrio; os seus reagentes eram fornecidos sob a forma de p liofilizado, em frascos contendo 25 ou 50 testes e aps re-hidratao duravam apenas 1 a 2 dias, o que os tornava muito dispendiosos. O seu manuseamento apenas podia ser realizado por um analista especializado (Easter, 2003). Actualmente, os luminmetros possuem um tamanho reduzido, o que possibilita o seu transporte, facilitando desta forma a sua utilizao quer em laboratrio quer fora deste, por exemplo na prpria rea de produo. Adquiriram desta forma uma dupla vantagem por um lado as amostras podem ser imediatamente lidas, minimizando a possibilidade de alterao dos resultados, por outro lado, os responsveis pela higienizao da fbrica verificam se esta foi realizada de forma eficaz ou no (Easter, 2003). Alguns luminmetros, mais recentes, podem ser ligados a um computador ou directamente a uma impressora. Os valores das leituras so transferidos para um programa de software apropriado, permitindo a percepo dos locais onde a higienizao est a ser bem ou mal realizada (Lelieveld et al., 2005). Os programas informticos associados a este tipo de instrumentos, facilitam a identificao das amostras e armazenam informao para posterior anlise. Futuramente, pretendem-se luminmetros verdadeiramente portteis (do tamanha da palma da mo), sem que isso implique uma diminuio da capacidade de realizao (performance) dos testes, ou aumento do custo do aparelho (Lelieveld et al., 2005). Os dispositivos de amostragem e respectivos reagentes, bem como as embalagens tm igualmente evoludo; os reagentes encontram-se em compartimentos separados nas zaragatoas de colheita, facilitando a realizao da tcnica e diminuindo os custos. Para activar os reagentes segura-se com firmeza o tubo contendo a zaragatoa e usa-se o polegar e o indicador para quebrar a vlvula. Agita-se levemente durante 5 a 10 segundos e o dispositivo est pronto para ser colocado no luminmetro e realizada a leitura, at 1 minuto aps a sua activao. A extremidade da zaragatoa de colheita encontra-se acima do nvel de leitura, para eliminar interferncias, aquando da leitura no luminmetro. A empresa fornecedora dos luminmetros e respectivas zaragatoas faculta valores recomendados em RLU para cada superfcie, determinados com base em mtodos clssicos de microbiologia, relacionando-os com as leituras de ATP. Contudo, quem realiza os testes tambm pode estabelecer os seus limites com base na mdia e desvio padro dos resultados da sua amostragem. Assim, um resultado est inserido na categoria conforme, quando o seu valor menor ou igual mdia dos resultados; na categoria cautela, quando

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superior mdia mas inferior ou igual mdia adicionada ao desvio padro; na categoria no conforme quando o valor superior mdia adicionada ao desvio padro (Hygiena, n.d.). Quando se estabelecerem limites utilizando estas ferramentas, fundamental analisar os resultados e, se necessrio, recalcular os limites, pelo menos uma vez por ano, ou sempre que o programa de higiene ou alguns dos seus procedimentos seja alterado, de forma a optimizar os resultados e obter uma melhoria contnua dos padres. Os dispositivos de amostragem, quando armazenados refrigerados entre 2 C e 8 C tm uma validade de cerca de 12 meses, mas se estiverem armazenados entre 8 C e 25 C duram apenas 6 semanas. Os dispositivos de amostragem devem manter-se temperatura ambiente durante 2-5 minutos antes da utilizao (Easter, 2003; Hygiena, n.d.). As principais vantagens de ATPmetria so a rapidez, o baixo nvel de deteco, incluso de todos os tipos de microrganismos activos, fcil interpretao dos resultados, automatizao e anlise local; a principal desvantagem a no indicao da presena de microrganismos potencialmente patognicos nas superfcies (Hawronskyj & Holah, 1997; Rocha, 2007). O teste ideal deveria detectar microrganismos e resduos alimentares com sensibilidade suficiente, a sua eficcia deveria ser semelhante quando realizado sobre superfcies secas ou hmidas, deveria ter boa repetibilidade e reprodutibilidade, deveria ser fcil de manusear, pouco dispendioso, rpido, resistente e deveria possibilitar o armazenamento dos dados (Lelieveld et al., 2005). Larson et al. (2003) estabeleceram uma correlao significativa entre contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C e os valores provenientes das leituras de ATP, em superfcies de diversos locais existentes em casas particulares. Os testes alternativos ditos rpidos, devero ser encarados como um complemento microbiologia clssica, num sistema integrado de controlo da qualidade, especialmente quando se pretende estabelecer a relao entre a contaminao microbiana e risco de doena infectante (Larson et al., 2003; Aycicek et al., 2006).

1.4 Mtodos de deteco de protena, fosfatos e hidratos de carbono

Alm do desenvolvimento e aplicao do teste de deteco de ATP por bioluminescncia, como meio de monitorizar a limpeza, foram desenvolvidos outros testes para detectar componentes de resduos alimentares e avaliar a eficcia da higiene. Com o teste de deteco de protena pretendia-se desenvolver um teste independente de instrumentos, cromognio, barato, simples e funcional, extensvel a

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resduos qumicos, incluindo protenas, aucares redutores, NAD+ (nicotinamida adenina dinucletdo) e fosfatos, individualmente ou combinados. De acordo com os seus fabricantes, so apropriados para grandes e pequenas indstrias de gneros alimentcios, assim como restaurantes e mercados, entre outros (Easter, 2003). Os testes conduzem, usualmente, produo de uma cor nica ou de uma sequncia de cores. Aps um tempo determinado, entre 1 a 10 minutos, a alterao visual da cor pode ser avaliada qualitativamente. A subjectividade do teste aumenta consideravelmente quando utilizado em superfcies moderadamente sujas; a

subjectividade diminui em superfcies muito limpas ou muito sujas (Lelieveld et al., 2005). Alguns testes tm o formato de zaragatoas, outros apresentam-se sob a forma de tiras de plstico ou almofadas de material absorvente impregnado com os reagentes apropriados. De acordo com Griffith, Cooper, Gilmore, Davies & Lewis (2000), testes independentes do uso de instrumentos e economicamente acessveis podem ser utilizados em estabelecimentos de produo de alimentos, muitas vezes criticados pela baixa sensibilidade para a monitorizao de higiene. Em ensaios alternativos ao uso do ATP, os mtodos que detectam protena possuem grande potencial, quando se trata de resduos de alimentos resultantes, por exemplo, de carne de aves, bovinos ou sunos ou de produtos lcteos, devido ao seu elevado contedo em protena. De notar, no entanto que, em testes realizados a alguns alimentos no proteicos, se verificou a reduo dos componentes da reaco do biureto, e consequente mudana de cor, o que representa afinal, tambm, ausncia de limpeza (Lelieveld et al., 2005). A maior parte dos testes que se baseiam na deteco de protena, utilizam a reaco do Biureto (Fig. 2).

Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena (Adaptado de: Forsythe, 2002 ).

Assim, sob condies alcalinas, as ligaes peptdicas das protenas formam um complexo com o Cobre II (Cu2+) do reagente biureto. Esta reaco, adicionada de cido bicinchoninico (bicinchoninic acid BCA), produz uma intensa cor roxa. Neste teste, a palavra de ordem usada dever ser if its green its

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clean se est verde, est limpo. A cor verde significa limpo, os resultados mais pretendidos; cor cinzenta indica resultado medocre, deve voltar-se a enxaguar ou a higienizar ou a repetir o teste; cor roxa sinnimo de resultado negativo, tem que se voltar a higienizar (Lelieveld et al., 2005). Desinfectantes em concentraes normais no causam interferncia ou falsos positivos; em alguns casos elevadas concentraes de produtos alcalinos podem originar resultados falso-negativos, enquanto que desinfectantes base de perxidos podem causar uma reaco de mudana de cor com resultado falso positivo (Hygiena, n.d.). boa prtica aguardar um perodo de tempo adequado aps a limpeza, antes de se realizar a anlise superfcie. importante, em qualquer programa de colheita de amostras, estabelecer um procedimento de amostragem consistente e fcil de reproduzir. Para assegurar melhores resultados, a colheita dever ser feita aps a limpeza com o detergente ou aps enxaguamento, mas antes da desinfeco final. A presena de resduos na superfcie aps a limpeza com detergente reduz a eficcia do desinfectante, por este motivo a realizao do teste nesta fase previne desperdcios de tempo e de produtos qumicos. O teste no foi concebido como ferramenta de deteco microbiolgica, mas se existirem mais de 107 UFC a colorao do teste altera-se como quando na presena de protena (Hygiena, n.d.). O armazenamento a temperatura entre 2 e 25 C permite uma validade de 12 meses. Entre 26 e 35 C, a sua validade significativamente reduzida para 2 semanas. Em situao alguma se deve congelar os testes (Hygiena, n.d.). As zaragatoas devem ser mantidas temperatura ambiente uns minutos antes da sua utilizao, o que aumenta a rapidez da reaco e aumenta a sensibilidade. A ttulo de exemplo, quando as zaragatoas esto temperatura ambiente (15 25 C) tm capacidade de detectar 500 g/100 l, enquanto as mantidas a temperaturas superiores (37 C), nas mesmas condies, apenas conseguem detectar 100 g/100 l (Hygiena, n.d.). Sendo um teste semi-quantitativo, d uma ideia aproximada da concentrao de protena presente. Quando a cor obtida verde, a concentrao varia entre 0-30 g/100 l de protena; cinzento corresponde a uma concentrao de protena entre 50-80 g/100 l e roxo corresponde a uma concentrao superior a 100 g/100 l protena (Hygiena, n.d.). Trata-se de uma tcnica mais rpida do que as de microbiologia tradicional, mais barata que a bioluminescncia por ATP, mas, dependendo do tipo de alimento analisado, ao mesmo tempo, menos sensvel do que esta (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005). A intensidade da cor e a rapidez da sua produo funcionam como indicadores do nvel de sujidade, se bem que os resultados so usualmente fornecidos em termos de limpo ou no limpo.

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Curiosamente, a tcnica de deteco de protenas serviu de base, segundo Lipscomb, Pinchin, Collin, Harris & Keevil (2006), para o desenvolvimento de uma nova tcnica de epifluorescncia utilizando um corante fluorescente, designada comercialmente por SYPRO Ruby. Detecta protenas e pries, especialmente em instrumentos cirrgicos, os quais, segundo os mesmos autores, so muitas vezes responsveis por infeces nosocomiais, muitas das quais com desfecho fatal. O NAD+ e compostos semelhantes so resduos qumicos, extensamente distribudos no material biolgico, incluindo nos alimentos e nos microrganismos. Desta forma, o nvel de NAD+ em superfcies, fornece informao relativa sujidade orgnica. detectado numa reaco qumica que conduz uma reaco visvel, com cores que alteram gradualmente de amarelo a roxo numa escala de 0 6, em 5 minutos (Lelieveld et al., 2005). Nos kits de deteco de resduos qumicos, a ausncia de reaco positiva no implica, necessariamente, ausncia de microrganismos. Estes testes podem ser mais ou menos sensveis, e importante test-los e ter em conta o tipo de alimento produzido. Outros testes baseados em zaragatoas, podem ser usados para detectar glucose ou glucose e lactose, este ltimo com efeito prtico na indstria dos lacticnios. Os resultados so obtidos em 60 segundos. Devido colorao resultante da reaco, os resultados devem ser lidos, if it turns green it isnt clean se se torna verde no est limpo, o que pode causar alguma confuso com os resultados dos testes da protena. Na maior parte dos casos, um teste menos sensvel do que o teste do ATP, mas considerado para alguns resduos de alimentos como razovel, e rpido para um teste no baseado em instrumentos (Lelieveld et al., 2005). Outra opo um teste de fitas, contendo enzimas que detectam fosfatos e hidratos de carbono. Por aco da capilaridade as fitas absorvem resduos de alimentos de superfcies molhadas com os reagentes do teste. Quando as tiras do teste j esto suficientemente molhadas adquirem tom cinzento-escuro; em presena de resduos de alimentos, a sua cor altera-se para roxo em 120 segundos. As vantagens deste teste, quando comparado com testes recorrendo a zaragatoas, prende-se com a sua simplicidade, baixo custo de produo e transporte. Pode tambm ser utilizado para monitorizao da higiene das mos (Lelieveld et al., 2005). Estes testes so menos sensveis do que o de leitura ATP por bioluminescncia, mas facultam um teste simples e semi-quantitativo, para avaliao de higiene fabril. Estes mtodos no tm necessariamente que substituir os tradicionais, utilizando meios de cultura. Tm, antes, que ser vistos como uma informao adicional ao programa de segurana alimentar, adquirida num curto espao de tempo, facilitando desta forma uma aco correctiva imediata, optimizando o processo e reduzindo os custos associados a alimentos alterados.

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2. Materiais e Mtodos

O objectivo deste estudo foi tentar obter algum tipo de relao entre os resultados obtidos pelas contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae e os resultados obtidos atravs de deteco de ATP por bioluminescncia e de deteco de protena, tendo em vista, adoptar um dos mtodos ditos rpidos, na verificao da eficcia do plano de higienizao implementado. O estudo foi realizado numa sala de acesso restrito, mantida a 12 C, onde se fatiam produtos transformados base de carne, prontos a consumir, acondicionados em atmosfera protectora, nomeadamente presunto, fiambre, toucinho fumado, paio, mortadela e fiambre de frango. Utilizaram-se no estudo duas das trs fatiadoras existentes na sala. Na fatiadora nmero 1, fatiam-se, maioritariamente, produtos de marca prpria, pelo que durante o dia se verifica pouca alternncia de produtos. Na fatiadora nmero 3, fatiam-se produtos de diferentes marcas, logo, ao longo do dia, fatiam-se uma grande heterogeneidade de produtos. Foram efectuadas 48 recolhas para cada tipo de anlise, divididas entre as 2 mquinas de fatiar; em cada mquina colhiam-se amostras na lmina (local 1) e no tapete tela transportadora (local 2). Desta forma, na mquina 1 colheram-se 11 amostras de cada local e na mquina 3, 13 amostras, igualmente de cada local. Em cada mquina trabalha um grupo de 4 a 5 pessoas, constante, salvo raras excepes, responsvel pelas operaes de fabrico e limpeza. Cada funcionrio usa equipamento de proteco individual, constitudo por calas e tnica brancas, botas de borracha branca, touca, luvas, mscaras, aventais e manguitos descartveis, colocados apenas no momento de entrada na sala de fatiados. O acesso a esta sala est condicionado por uma desinfeco das mos, por meio de um sensor automtico, que ao mesmo tempo abre automaticamente a porta. Os ensaios realizados nas mquinas 1 e 3, ocorreram durante a higienizao intermdia, ou seja, entre o fim de fatiagem de um produto e o incio da de outro, excepto um caso, em ambas as mquinas que ocorreu no incio da laborao, ou seja, a higienizao foi realizada no dia anterior. Na mquina 1, 5 ensaios aps terminar a fatiagem do presunto e antes de iniciada a do fiambre; 2 quando terminou a fatiagem do fiambre e se iniciou a da mortadela; outros 2 na passagem de toucinho fumado a fiambre; 1 de paio para fiambre e 1 no incio da laborao, ou seja, a higienizao tinha sido realizada no dia anterior. Na mquina 3, 3 amostras foram recolhidas na mudana da fatiagem do presunto para fiambre; 2 de fiambre de frango para fiambre; 2 de chourio para fiambre; 1 de paio

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para fiambre; 1 de fiambre para paio; 1 de paio para presunto; 1 de fiambre para presunto; 1 de presunto para paio; 1 no incio da laborao, ou seja, a higienizao tinha sido realizada no dia anterior. Ao estabelecer um programa de colheitas de amostras, deve determinar-se quem, como e quando as amostras so colhidas, de acordo com o tipo de fabrico. Neste estudo, as amostras foram colhidas de forma assptica, aps higienizao da respectiva mquina de acordo com o plano implementado (Anexos I, II e III). Todas as colheitas foram realizadas pela mesma pessoa, de forma a diminuir interferncias resultantes da colheita, opinio apoiada por Niza Ribeiro, Cerqueira, Santos & Louz (2002), que referem que os operadores so uma importante fonte de variao, que pode ser controlada atravs de programas especficos. Neste contexto, colheram-se amostras destinadas a anlises microbiolgicas clssicas, deteco de ATP por bioluminescncia e deteco de protena (teste PROClean); em simultneo, realizou-se inspeco visual dos locais de colheitas. As amostras foram recolhidas na lmina da fatiadora, montada na respectiva mquina, (Fig. 3 e 5) pronta a iniciar a laborao e no tapete transportador (Fig. 4 e 6) que conduz os produtos j fatiados at s cuvettes de plstico que serviram de embalagem. A escolha dos locais baseou-se na anlise dos resultados de controlos realizados anteriormente e apensos aos planos de higienizao implementados na indstria. Nesses controlos, nos quais se tinham utilizado placas de contacto, os resultados mostravam que as lminas, maioritariamente, fornecem valores conformes, contrariamente ao tapete, cujos resultados eram, quase sempre, no conformes. Escolheram-se, ento, duas mquinas com volume e variedade de trabalho diferentes e dois locais, um pouco problemtico e outro muito problemtico, de acordo com os resultados previamente obtidos das placas de contacto. Esta escolha vai de encontro opinio de Tompkin (2004), que considera que a escolha dos stios de amostragem dever basear-se em experincia prvia; contudo, em alimentos prontos a consumir, dever ser realizada no local imediatamente anterior embalagem e a montante deste. Os valores de ATP, apresentados em RLU, foram medidos num luminmetro com elevada sensibilidade (at 1 femtomole ATP) e boa reprodutibilidade 8 18 % (tendo em conta este tipo de teste), leve e de dimenses reduzidas (260 gramas e 17 x 7 x 3 cm) o que facilita o seu transporte e manuseamento. Os resultados so obtidos aps 45 segundos; antes de cada leitura foi realizada sempre a auto-calibrao para evitar qualquer interferncia decorrente da sua no realizao, no que se dispensam 15 segundos dos 45 segundos anteriormente contabilizados. As leituras foram realizadas na prpria sala de fatiados.

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O teste PRO-Clean detecta resduos de protenas, contudo tambm permite a deteco de outras substncias redutoras tais como acares, taninos e cido ascrbico. Em meio alcalino, d-se a reduo do io Cu2+ a Cu+, alterando desta forma a tonalidade inicial da amostra (verde), alternando entre cinzento e roxo em funo da quantidade de protena ou outras substncias redutoras, presentes. A leitura dos resultados deve ocorrer at 10 minutos do incio da reaco (reaco do biureto), excepto nos casos em que a cor altere para roxo de forma imediata.

Figura 3 Lmina de ao inoxidvel de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas (local 1).

Figura 4 Tapete (tela transportadora de plstico) de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas (local 2).

Figura 5 Lmina da fatiadora e placas de delimitao das superfcies de

Figura 6 Tapete transportador com placas, para delimitao das superfcies de colheita de amostras.

colheita de amostras.

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2.1 Meios de Cultura

Os meios de cultura utilizados neste estudo foram das marcas Merck Merck KgaA, Darmstadt, Germany (TGE-Agar Tryptone Glucose Extract Agar) e da marca Oxoid Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, England, (VRBGA Violet Red Bile Glucose Agar), respectivamente para contagem de microrganismos a 30 C e de Enterobacteriaceae. A descrio e composio por litro de cada um dos, meios encontra-se referida em anexo (Anexos IV e V).

2.2 Preparao da soluo de diluio

Na anlise microbiolgica, usou-se como soluo de diluio a Triptona Sal (Merck Merck KgaA, Darmstadt, Germany), preparada a partir de 1 g de triptona e 8,5 g de NaCl, perfazendo com 1 litro de gua destilada.

2.3 Esterilizao
Os meios de cultura e a soluo de diluio foram esterilizados em autoclave a uma temperatura de 121 C durante 15 minutos. Os tubos de ensaio, as pipetas de vidro e as placas delimitadoras de superfcie foram esterilizados em estufa elctrica temperatura de 180 C durante 2 horas.

2.4 Anlises microbiolgicas

2.4.1 Colheita e preparao de amostras A colheita e preparao de amostras foram realizadas segundo a tcnica descrita nas NP 1828 (1981) e NP 1829 (1982). Da suspenso inicial obtida pela colheita assptica, com auxlio de uma zaragatoa de transporte com soluto diluidor, duma superfcie com rea de 100 cm2, realizaram-se as diluies consideradas suficientes conforme a tcnica descrita na Norma Portuguesa 3005 (1985), e utilizando como soluo de diluio a Triptona Sal. Utilizou-se uma placa delimitadora facilmente esterilizvel, com uma rea de colheita de 100 cm2.

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2.4.2 Contagem de microrganismos a 30 C Anlises efectuadas segundo a tcnica descrita na Norma Portuguesa 4405 (2002), pela qual se realiza a sementeira em placa e por incorporao de 1 ml de amostra, e cerca de 15 ml de meio TGE. Incubao das placas semeadas durante 72 h a 30 C, em aerobiose. Os resultados obtidos referem-se ao nmero de colnias contadas em cada placa de Petri de duas diluies sucessivas, que contenham entre 15 e 150 colnias, e expressam-se em unidades formadoras de colnias por centmetro quadrado (UFC/cm2), tendo em conta o factor de diluio.

2.4.3 Contagem de Enterobacteriaceae As determinaes foram efectuadas segundo a tcnica descrita na Norma Portuguesa NP 4137 (1991). Realizou-se a sementeira em profundidade e em duplicado, aplicando a tcnica da dupla camada (primeiro colocou-se cerca de 15 cm2 do meio apropriado sobre o inculo e aps solidificao, no ultrapassando 15 minutos, colocou-se uma nova camada fina do mesmo meio). Aps solidificao incubaram-se as placas a 37 C durante 24 horas. A contagem realiza-se, sempre que possvel, em duas placas que contenham entre 15 e 150 colnias, e expressa-se em unidades formadoras de colnias por centmetro quadrado (UFC/cm2), tendo em conta o factor de diluio.

2.5 Mtodos rpidos

2.5.1 Colheita de amostras Efectuadas de forma assptica, tendo especial cuidado para no tocar com a zaragatoa em qualquer outro local que no o a analisar. Assim, a colheita da amostra foi realizada numa superfcie de aproximadamente 100 cm2, de acordo com as indicaes do fabricante.

2.5.2 Material utilizado no teste de ATP Luminmetro SystemSURE II e zaragatoas descartveis Ultrasnap para

SystemSURE II (Fig. 7), da marca Hygiena (Hertfordshire, United Kingdom).

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Figura 7 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia e respectiva

Figura 8 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por para

zaragatoa descartvel Ultrasnap.

bioluminescncia, efectuar medio.

preparado

2.5.3 Leitura do ATP por bioluminescncia As zaragatoas da amostragem devem ser mantidas temperatura ambiente 2 a 5 minutos antes do seu uso. Aps colheita da amostra, a zaragatoa pode esperar at 4 h, antes da activao do dispositivo. Aps a activao, agita-se levemente, durante 5-10 segundos e a leitura deve ser feita, dentro de 60 segundos (Fig. 8).

2.5.4 Material utilizado no teste de deteco de protena Zaragatoas descartveis PRO-Clean (Fig. 9) da marca Hygiena (Hertfordshire, United Kingdom), baseadas no mtodo BCA, para deteco de protenas.

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Figura 9 Zaragatoa PRO-Clean.

Figura 10 Zaragatoas PRO-Clean, aps colheita das amostras de superfcies com diferentes quantidades de protena.

2.5.5 Leitura das zaragatoas de PRO-Clean Este teste, baseado no mtodo BCA, varia em funo da temperatura e do tempo de reaco, por isso importante deix-lo atingir a temperatura ambiente (15-25 C) antes da sua utilizao. Quanto maior a quantidade de protena existente, mais rpida ser a mudana de cor e a cor roxa mais intensa (Fig. 10). No necessrio continuar a cronometrar se a superfcie est muito suja e a cor muda quase automaticamente para roxo. A mudana de cor deve ser registada dentro de 10 minutos, aps os quais qualquer alterao no deve ser considerada.

2.6 Anlise estatstica

O tratamento estatstico descritivo dos resultados foi efectuado com o auxlio do programa SPSS 11.5 para Windows, para o efeito determinou-se os valores de um teste no paramtrico o teste de McNemar e do valor do coeficiente Kappa.

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3. Resultados

Os resultados obtidos nas anlises microbiolgicas, nos testes de deteco de ATP por bioluminescncia, de deteco de protena e na observao visual de superfcies, realizadas nas 48 amostras, esto plasmadas nos anexos VI, VII, VIII e IX.

3.1 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C

Das anlises realizadas em 48 amostras, obtiveram-se como valores mdios de contagens de microrganismos a 30 C aps 72 horas de incubao, expressos em Unidades Formadoras de Colnias por centmetro quadrado (UFC/cm2), os valores apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 Contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo. Resultados referentes anlise de 48 amostras, expressos em UFC/cm2. Microrganismos aerbios totais 30 C Mdia Mquina 1* Local 1 Mquina 1* Local 2 Mquina 3** Local 1 Mquina 3** Local 2 *n = 11, **n = 13 4,64 55,73 17,92 41,08 Desvio Padro 6,27 108,35 24,37 46,57

Os valores da lmina da mquina 1 (local 1) foram os que tiveram uma amplitude de variao mais baixa, entre 0 UFC/cm2 e 2,0 x 10 UFC/cm2 (Fig. 11). O valor que mais se repetiu neste local foi 0 UFC/cm2.

33

Mquina 1 Local 1 Contagem de Microrganismos a 30 C

25

(UFC/cm )

20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Colheita

Figura 11 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina (local 1) da mquina 1, nas 11 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

Os valores do tapete (local 2) da mquina 1 foram os que tiveram maior amplitude de variao, entre 0 UFC/cm2 e 3,6 x 102 UFC/cm2 (Fig. 12). O valor que mais se repetiu neste local foi 0 UFC/cm2.

Mquina 1 Local 2 Contagem de Microrganismos a 30 C

400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

(UFC/cm )

Colheita

Figura 12 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete (local 2) da mquina 1, nas 11 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

Os valores da lmina (local 1) da mquina 3, variaram no intervalo entre 0 UFC/cm2 e 7,6 x 10 UFC/cm2 (Fig. 13). O valor que mais se repetiu neste local foi 0 UFC/cm2.

34

Mquina 3 Local 1 Contagem de microrganismos a 30 C 80 (UFC/cm )

2

60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Colheita (dias)

Figura 13 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina (local 1) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

Os valores do tapete (local 2) da mquina 3, variaram entre um mnimo de 0 UFC/cm2 e um mximo de 1,5 x 102 UFC/cm2 (Fig. 14). O valor que mais se repetiu neste local foi 4,0 UFC/cm2.

Mquina 3 Local 2 Contagem de Microrganismos a 30 C

200

(UFC/cm )

150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Colheita

Figura 14 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete (local 2) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

3.2 Contagem de Enterobacteriaceae

Das anlises realizadas em 48 amostras, obtiveram-se como valores mdios de contagens de Enterobacteriaceae, aps 24 horas de incubao, expressos em Unidades Formadoras de Colnias por centmetro quadrado (UFC/cm2), os valores apresentados na Tabela 2.

35

Tabela 2 Contagens de Enterobacteriaceae, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo. Resultados referentes anlise de 48 amostras, expressos em UFC/cm2. Enterobacteriaceae Mdia Mquina 1* Local 1 Mquina 1* Local 2 Mquina 3** Local 1 Mquina 3** Local 2 *n = 11, **n = 13 0,00 4,00 6,69 16,00 Desvio Padro 0,00 12,65 22,90 52,30

Na

lmina

(local

1)

da

mquina

no

se

verificaram

contagens

de

Enterobacteriaceae, nos 11 ensaios realizados. No tapete (local 2) da mquina 1, os valores variaram entre 0 UFC/cm2 e 4,4 x 10 UFC/cm2 (Fig. 15). Contudo, em 10 dos 11 ensaios realizados a contagem obtida foi de 0 UFC/cm2.

Mquina 1 Local 2
50

Contagem de Enterobacteriaceae

(UFC/cm )

40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Colheita

Figura 15 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete (local 2) da mquina 1, nas 11 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

Na lmina (local 1) da mquina 3, os valores variaram entre 0 UFC/cm2 e 8,6 x 10 UFC/cm2 (Fig.16). Contudo, em 11 dos 13 ensaios realizados a contagem obtida foi de 0 UFC/cm2.

36

Mquina 3 Local 1 Contagem de Enterobacteriaceae 100 (UFC/cm ) 80 60 40 20 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2

Colheita

Figura 16 Contagem de Enterobacteriaceae na lmina (local 1) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

No tapete (local 2) da mquina 3, ocorreu a maior heterogeneidade de valores, de Enterobacteriaceae. Os resultados obtidos variaram dentro do intervalo de 0 UFC/cm2 a 2,0 x 102 UFC/cm2 (Fig. 17). Em 9 dos 13 ensaios realizados no se obtiveram contagens (0 UFC/cm2).

Mquina 3 Local 2 Contagem de Enterobacteriaceae

250

(UFC/cm )

200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Colheita

Figura 17 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete (local 2) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em UFC/cm2.

37

3.3 Deteco de ATP por bioluminescncia

Nas amostras colhidas do local 1 (lmina) e do local 2 (tapete) das duas mquinas de fatiar, para medio do ATP presente, utilizando a bioluminescncia, obtiveram-se as seguintes leituras, em mdia (Tabela 3).

Tabela 3 Valores de ATP medidos por bioluminescncia, nas amostras recolhidas, nas duas mquinas de fatiar e nos dois locais em estudo. Valores expressos em RLU. Medio de ATP Mdia Mquina 1* Local 1 Mquina 1* Local 2 Mquina 3** Local 1 Mquina 3** Local 2 *n = 11, **n = 13 15,09 18,45 16,85 14,54 Desvio Padro 16,95 21,05 18,65 20,78

Dos 4 locais em estudo, a lmina (local 1) da mquina 1, apresenta o menor intervalo de variao dos valores de ATP, entre 1 RLU e 51 RLU (Fig. 18). O valor que se repete mais vezes o 3 RLU.

Mquina 1 Local 1 Medio de ATP (RLU)

60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Colheita

Figura 18 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina (local 1) da mquina 1, nas 11 colheitas. Resultados expressos em RLU.

38

Pelo contrrio, no tapete (local 2) da mquina 1, dos 4 locais em estudo, verificou-se a maior amplitude de variao de resultados (Fig. 19). Varia entre 1 RLU e 80 RLU. O valor que se repete mais vezes 5 RLU.

Mquina 1 Local 2
Medio de ATP (RLU)
100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Colheita

Figura 19 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete (local 2) da mquina 1, nas 11 colheitas. Resultados expressos em RLU.

Na lmina da mquina 3 (local 1) obteve-se um valor mximo de 77 RLU e mnimo de 3 RLU (Fig. 20), contudo, o valor que se repete mais vezes 16 RLU.

Mquina 3 Local 1 Medio de ATP (RLU)

100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Colheita

Figura 20 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina (local 1) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em RLU.

No tapete (local 2) da mquina 3 os valores oscilaram entre 2 RLU e 79 RLU (Fig. 21); o valor que se repete com maior frequncia 3 RLU.

39

Mquina 3 Local 2 Medio de ATP (RLU)

100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Colheita

Figura 21 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete (local 2) da mquina 3, nas 13 colheitas. Resultados expressos em RLU.

3.4 Visualizao da deteco de protena

Na mquina 1, foram realizados 11 ensaios, na maioria dos quais se obteve a cor verde, como resultado. Na lmina, obteve-se a cor verde em 6 ensaios, a cor cinzenta em 3 e a cor roxa em 2 (Fig. 22).

Mquina 1 Local 1
Visualizao de deteco de protena

1
Bom

3
Razovel

4
Mau

6 Colheitas

10

11

Figura 22 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios na lmina (local 1) da mquina 1.

Por outro lado, no tapete, obteve-se a cor verde em 8 ensaios, cor cinzenta em 3 e 0 com cor roxa (Fig. 23).

40

Mquina 1 Local 2
Visualizao de deteco de protena
1 Bom

3 Razovel

10

11

Colheita

Figura 23 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios no tapete (local 2) da mquina 1.

Na lmina (local 1) da mquina 3, foram realizados 13 ensaios, dos quais 5 revelaram cor verde, 5 cor cinzenta e 3 cor roxa, ao fim de 10 minutos (Fig. 24).

Mquina 3 Local 1
Visualizao de deteco de protena
1
Bom

3
Razovel

4
Mau

10

11

12

13

Colheita

Figura 24 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, na lmina (local 1) da mquina 3.

No tapete (local 2) da mesma mquina (a nmero 3), os valores obtidos foram maioritariamente de cor verde, com 8 locais, 3 com cor cinzenta e 2 com cor roxa (Fig. 25).

41

Mquina 3 Local 2
Visualizao de deteco de protena
1

10

11

12

13

Bom

Razovel

Mau

Colheita

Figura 25 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, no tapete (local 2) da mquina 3.

3.5 Registo da observao visual

No momento da colheita das amostras para os ensaios descritos, fez-se uma observao visual e respectivo registo do estado de limpeza. Tentando dar alguma objectividade a uma anlise subjectiva, a observao foi feita sempre pela mesma pessoa, em condies, quando possveis, uniformes. Na lmina (local 1) da mquina 1, registaram-se 6 observaes em locais que se consideraram limpos, 3 considerados com limpeza intermdia e 2 considerados sujos (Fig. 26).

Mquina 1 Local 1
Observao visual
1

10

11

Limpo

Intermdio

Sujo

Colheitas

Figura 26 Resultados, dos registos da observao visual lmina (local 1) da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.

42

No tapete (local 2) da mesma mquina o resultado foi semelhante, com a maioria das observaes considerando superfcies visualmente limpas. Assim sendo, verificaram-se 7 locais limpos, 3 locais intermdios e 1 sujo (Fig. 27).

Figura 27 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete (local 2) da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.

Na mquina 3, semelhana da anterior, a maioria dos locais foram considerados visualmente limpos no acto da observao. Assim, na lmina (local 1) consideram-se 5 locais como limpos e dos 8 restantes, 4 foram considerados com limpeza intermdia e os outros 4 locais como sujos (Fig. 28).

Mquina 3 Local 1 Observao visual

1 Limpo

3 Intermdio

4 Sujo

10

11

12

13

Colheita

Figura 28 Resultados, dos registos da observao visual lmina (local 1) da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.

Mquina 1 Local 2

Observao visual
1 Limpo

3 Intermdio

4 Sujo

10

11

Colheita

No tapete (local 2) da mesma mquina, obteve-se o maior registo de locais considerados limpos, 8 locais, 4 considerados com limpeza intermdia e apenas 1 sujo (Fig. 29).

43

Mquina 3 Local 2

Observao visual
1 Limpo

3 Intermdio

4 Sujo

10

11

12

13

Colheita

Figura 29 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete (local 2) da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.

Com os valores obtidos nos 48 ensaios, construiu-se uma tabela de resultados conformes e no conformes (Fig. 30), que permitisse efectuar uma anlise de concordncia entre os diferentes testes (microbiologia clssica, deteco de ATPmetria e visualizao de deteco de protena), e tambm com o registo da observao visual. Na Figura 30, verde significa valores conformes e vermelho valores no conformes, com os valores indicativos disponveis (Deciso da Comisso 471/2001; e Manual tcnico da Hygiena para os testes de ATPmetria e deteco de protena), disponveis nos anexos X e XI. As colheitas 12 e 13 da mquina 1 no se realizaram, pelo que no esto presentes na Figura 30.

44

Colheita

Local M1L1

A. T.

Ent.

ATP

Prot.

Obsv. Vis.

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

10

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

11

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1 ---------------------------------------------------

12

M1L2 M3L1 M3L2 M1L1

-----------

-----------

-----------

-----------

-----------

13

M1L2 M3L1 M3L2

Figura 30 Anlise de concordncia entre os vrios testes, assim como da observao visual.

45

Os resultados detalhados da anlise estatstica comparativa entre microrganismos aerbios totais a 30 C (AT) e ATPmetria, entre microrganismos aerbios totais a 30 C e teste de protena (PROT) e entre ATPmetria e teste de protena (PROT), assim como os valores dos resultados dos testes de McNemar e do Coeficiente Kappa encontram-se detalhadamente apresentados na Tabela 4. .

Tabela 4 Resumo dos resultados dos testes estatsticos de McNemar e do Coeficiente Kappa, Cconforme e NC- no conforme.

Testes comparados

Dados

ATP AT/ATP C 18 2 NC 11 12 0,022 0,410

AT

C NC

PROT AT/PROT C 20 3 NC 9 11 0,146 0,428

AT

C NC

PROT ATP/PROT C 15 8 NC 5 15 0,581 0,398

A TP

C NC

46

4. Discusso

De acordo com o Livro Branco Sobre a Segurana dos Alimentos (Comisso das Comunidades Europeias, 2000), ao longo das ltimas dcadas assistiu-se a uma evoluo notvel, tanto nos mtodos de produo e processamento de alimentos como nos controlos necessrios para assegurar a observncia de normas de segurana alimentar. A higiene de todas as superfcies, equipamentos e utenslios, tem elevado impacto na qualidade e segurana dos alimentos produzidos numa indstria, principalmente nos produtos altamente sensveis ao crescimento microbiano, como sejam produtos frescos, peixe, carne, leite e vegetais (Donk & Gaalman, 2004). A higiene dos gneros alimentcios traduz as medidas e condies necessrias para controlar os perigos potenciais veiculados pelos alimentos, garantindo que sejam prprios para o consumo humano, tendo em conta a sua utilizao esperada. Tradicionalmente, os procedimentos de limpeza eram avaliados recorrendo a inspeco visual ou a mtodos de anlise microbiolgica. Com o desenvolvimento de novas tcnicas analticas surgiram novos e diferentes tipos de testes, normalmente de resultados mais rpidos. De acordo com Moore & Griffith (2002b), sempre que um novo mtodo de monitorizao de higiene for usado, dever ser comparado com a metodologia clssica. Segundo a WHO/FAO (2003) para a implementao de planos HACCP necessrio que os processos de monitorizao (medio ou observao programada de um Ponto Crtico de Controlo (PCC) em funo dos limites crticos) e verificao dos PCC sejam executados com rapidez, porque em processos contnuos, no h possibilidade de efectuar testes analticos com resultados demorados. Tendo em conta esta situao, as medies de parmetros fsicos e qumicos so preferveis aos testes microbiolgicos. Idealmente, as indstrias devem poder dispor de um mtodo rpido e simples de controlo da higiene, contudo no existem testes ideais para determinar esta eficcia. A escolha de um mtodo de monitorizao pressupe identificar a composio dos detritos orgnicos resultantes da produo e identificar a prevalncia bem como as condies fisiolgicas de sobrevivncia dos microrganismos. De acordo com Blankenfeld-Enkvist & Brnnback (2002), o mtodo de colheita de amostras com zaragatoa, apenas remove 1 10 % dos contaminantes das superfcies, contudo como os 3 ensaios efectuados (anlise microbiolgica clssica, deteco de ATP e deteco de protena) se basearam no mesmo mtodo de colheita, esta desvantagem no dever interferir na comparao.

47

A anlise dos dados obtidos permite verificar que, em mdia, os microrganismos aerbios totais a 30 C se encontravam em maior nmero no tapete (local 2) da mquina 1, seguindo-se o tapete (local 2) da mquina 3. J as contagens de Enterobacteriaceae mostram que, em mdia, o tapete (local 2) da mquina 3 foi o local pior higienizado, seguindo-se a lmina (local 1) da mesma mquina. As medies de ATP obtidos, em mdia, indicam que o local com maiores contagens de RLU, em mdia, foi o tapete (local 2) da mquina 3, seguindo-se a lmina (local 1) da mesma mquina. O teste de visualizao de deteco de protena, revelou maiores quantidades na lmina (local 1) da mquina 3, seguida da lmina (local 1) da mquina 1. A observao visual, obteve registos sobreponveis aos da deteco de protena. Os valores indicativos dos teores microbianos totais e de Enterobacteriaceae presentes em superfcies esto estabelecidos na Deciso da Comisso 471/2001. Segundo essa legislao, numa superfcie, para o nmero de microrganismos aerbios totais a 30 C ser considerado aceitvel dever variar entre 0 10 UFC/cm2; todos os valores acima de 10 UFC/cm2 so considerados inaceitveis. No que se refere a Enterobacteriaceae, o limite aceitvel situa-se entre 0 1 UFC/cm2, sendo inaceitvel acima deste intervalo. Os resultados obtidos nas determinaes dos microrganismos aerbios totais a 30C, mostram que, dos 11 ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 1, apenas 2 esto acima do intervalo pr-definido, a colheita 1, com 2 x 10 UFC/cm2 e a 11 com 1,3 x 10 UFC/cm2. No tapete (local 2) da mesma mquina, no mesmo nmero de ensaios, obtiveramse o dobro de resultados no conforme, ou seja, a colheita 1, com 3,6 x 102 UFC/cm2, a 7, com 1,2 x 10 UFC/cm2, a 9 com 1,7 x 102 UFC/cm2 e a 10 com 5,7 x 10 UFC/cm2. Na lmina (local 1) da mquina 3, tendo em conta o mesmo parmetro microbiolgico, dos 13 ensaios realizados, 5 estavam fora do limite pr-estabelecido, o ensaio 1 com 4,3 x 10 UFC/cm2, o 4 com 1,7 x 10 UFC/cm2, o 5 com 3,5 x 10 UFC/cm2, o 7 com 7,6 x 10 UFC/cm2 e o 12 com 5,2 x 10 UFC/cm2. No tapete (local 2) da mesma mquina, verificou-se no conformidade em 7 dos 13 ensaios realizados: o ensaio nmero 1 com 1,2 x 102 UFC/cm2, o 2 com 1,5 x 102 UFC/cm2, o 4 com 8,0 x 10 UFC/cm2, o 6 com 6,1 x 10 UFC/cm2, o 7 com 5,2 x 10 UFC/cm2, o 8 com 3,4 x 10 UFC/cm2 e por fim o ensaio 10 com 1,1 x 10 UFC/cm2. Verifica-se ento que, de acordo com o critrio microbiolgico, os microrganismos aerbios totais a 30 C, no tapete (local 2) de ambas as mquinas mostram mais resultados no conformes do que as lminas respectivas. No que se refere a Enterobacteriaceae, a comparao entre os nmeros obtidos e os nmeros apontados pela referida Deciso, mostra que na lmina (local 1) da mquina 1, os resultados de todos os ensaios estavam dentro dos limites, enquanto que no que se refere

48

ao tapete (local 2), nos mesmos 11 ensaios, apenas em 1 se encontrava fora do intervalo estipulado, o ensaio 1, que apresentou a contagem de 4,4 x 10 UFC/cm2. Na lmina (local 1) da mquina nmero 3, verificou-se uma situao semelhante anterior, apenas os resultados de um ensaio ultrapassam os limites, o ensaio 5 com 8,6 x 10 UFC/cm2. No tapete, constatou-se a existncia de 2 ensaios no conformes, o 2 com 9,0 UFC/cm2 e o 5 com 2,0 x 102 UFC/cm2. Uma vez mais, e no que se refere a Enterobacteriaceae, os tapetes encontravam-se mais contaminados do que as lminas. Segundo a empresa fornecedora das zaragatoas descartveis Ultrasnap e do luminmetro SystemSURE II, por se estar na presena de alimentos prontos a consumir, os limites de aceitao para os valores de ATP em qualquer um dos dois locais (lmina e tapete), sero: conforme, se inferior a 10 RLU; cautela, entre 10 RLU e 20 RLU; e no conforme, mais do que 20 RLU. Tendo em conta estes valores, dos 11 ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 1, 6 foram considerados conformes (ensaios 1, 2, 3, 4, 5 e 6), 2 classificados como cautela (ensaios 7 e 10), e 3 classificados como no conformes (ensaios 8, 9 e 11). No tapete (local 2) da mesma mquina, obtiveram-se 5 resultados conformes (ensaios 1, 2, 3, 6 e 11), 4 cautela (ensaios 4, 5, 7 e 8) e 2 no conformes (ensaios 9 e 10). Comparando os dois locais, de acordo com este teste, verifica-se que o tapete (local 2) possuiu menos valores conformes, sendo nesta mquina, o local menos higienizado. Na mquina 3 no decorrer dos 13 ensaios, a respectiva lmina (local 1) apresentou 6 valores conformes (ensaios 1, 3, 6, 8, 9 e 13), 5 classificados como cautela, (ensaios 2, 5, 10, 11 e 12), e apenas 2 colheitas apresentaram resultados classificados como no conformes (4 e 7). No tapete (local 2), verificou-se a presena de 8 ensaios denominados conformes (1, 3, 4, 5, 8, 9 12 e 13), 2 cautela (7 e 11), e, semelhana do anterior, 3 denominados por no conformes (2, 6 e 10). Nesta mquina, contrariamente anterior, verificou-se que, de acordo com este teste, o local mais higienizado o tapete. O teste de deteco de protena revela uma cor que facilmente associada a superfcie higienizada ou no. Desta forma, verde simboliza superfcie limpa, cinzento superfcie no higienizada, necessita repetir o teste, fazer novo enxaguamento ou nova higienizao, e roxo, superfcie suja, necessita nova higienizao. Na lmina (local 1) da mquina 1, obtiveram-se 6 ensaios com cor verde (1, 3, 4, 5, 7 e 8), 3 com cor cinzenta, (2, 9 e 10) e 2 de cor roxa (6 e 11). No tapete (local 2) da mesma mquina, obtiveram-se 8 ensaios de cor verde (colheitas 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 e 11) e 3 cinzentos (6, 9 e 10). Comparando os dois locais verifica-se que o tapete, de acordo com este tipo de teste, foi o local melhor higienizado. Na lmina (local 1) da mquina 3, apenas em 5 locais se verificou manifestao da cor verde no teste (1, 3, 6, 8 e 9); o mesmo nmero de locais obtiveram cor cinzenta (2, 4, 7,

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11 e 13), 3 observaes obtiveram cor roxa (5, 10 e 12). No tapete (local 2) da mesma mquina, obtiveram-se 8 locais com cor verde (2, 3, 5, 8, 9, 11,12 e 13), 3 com cor cinzenta (1, 6 e 7), e apenas 2 com cor roxa (4 e 10). Comparando a lmina (local 1) e o tapete (local 2) desta mquina, neste teste, verifica-se que o tapete o local melhor higienizado. A observao visual, no traduz limpeza microbiolgica ou qumica, uma vez que superfcies visualmente limpas, podem estar contaminadas. Contudo este parmetro tambm foi registado, semelhana dos resultados dos testes anteriores, para cada mquina e para cada local de colheita. Assim sendo, na lmina (local 1) da mquina 1 registou-se a existncia de 6 observaes consideradas superfcies limpas (1, 3, 4, 5, 7 e 10), 3 designadas como limpeza intermdia (2, 8 e 9) e 2 classificadas como sujas (colheitas 6 e 11). No tapete (local 2) desta mquina, em 7 observaes verificou-se que a superfcie se encontrava limpa (1, 2, 3, 4, 7, 8 e 10), em 3 considerou-se intermdio (5, 9 e 11), e em apenas 1 considerou-se suja (observao 6). Neste tipo de observao, o tapete encontrava-se visualmente mais limpo que a lmina. Na lmina (local 1) da mquina 3, nas 13 observaes efectuadas, verificou-se que a superfcie se encontrava limpa em 5 observaes (1, 6, 9, 11 e 13), com limpeza intermdia em 4 (2, 3, 7 e 8), e com superfcie suja em 4 observaes, (4, 5, 10 e 12). No tapete (local 2) da mesma mquina, em 8 observaes considerou-se a superfcie limpa (1, 3, 4, 8, 9, 11, 12, 13), em 4 que a sua limpeza era intermdia (2, 5, 6 e 7), e em apenas 1 observao se considerou suja, a observao 10. Ber & Beuner (1999), defendem que a validao de um teste alternativo, dever ser feita comparando-o com um teste padro, pelo que, para adopo de um mtodo rpido para a monitorizao de higiene, tem que se fazer a sua avaliao prvia em relao anlise microbiolgica clssica. A anlise mais pormenorizada dos resultados, permite verificar que a colheita nmero 1, nos 4 locais de amostragem, demonstra valores dspares quando comparados com as restantes colheitas. Tendo em conta, que as colheitas em ambas as mquinas foram realizadas no mesmo dia e sob as mesmas condies laboratoriais, ter provavelmente ou ocorrido algum tipo de contaminao no processamento das amostras, ou os meios utilizados estavam de alguma forma contaminados, uma vez que estando j preparados antes do incio dos ensaios, e h tempo indeterminado, no foi possvel garantir a sua esterilidade. Na colheita 5 do tapete (local 2) da mquina 3, foram detectadas unidades formadoras de colnias de Enterobacteriaceae, e ausncia de contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C. Uma vez que a contagem de Enterobacteriaceae dever estar integrada na contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C, os resultados obtidos

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no podem ser considerados normais, alm de terem sido pontuais, pelo que tambm este ensaio no foi considerado na anlise dos resultados. Para a anlise comparativa detalhada dos dados sero excludos os valores resultantes das contagens de Enterobacteriaceae, uma vez que as mesmas, como citado anteriormente, se encontram integradas nos resultados das contagens dos microrganismos aerbios a 30 C. A observao visual, alm de intrinsecamente subjectiva, no traduz limpeza microbiolgica ou qumica, alm de que no pode constituir um meio de monitorizao das operaes de higiene, pelo que, apesar de se terem registado as observaes, os resultados no foram includos na comparao estatstica dos vrios testes. Da anlise da Figura 30, infere-se que dos 43 ensaios considerados vlidos, 24 so concordantes, entre si e em simultneo, nos 3 testes realizados, nomeadamente contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C, deteco de ATP por bioluminescncia e visualizao da deteco de protena. Analisando detalhadamente cada colheita, tendo em conta apenas os 3 testes citados anteriormente, verifica-se que na colheita 2 apenas as determinaes realizados no tapete (local 2) da mquina 1, apresentaram todos os testes concordantes entre si; na colheita 3, todos os ensaios revelaram testes concordantes entre si; na colheita 4 e 5, apenas as amostras das 2 lminas mostraram valores concordantes entre si; na colheita 6 e 7, apenas os testes realizadas na mquina 3 concordaram entre si; na colheita 8, apenas a lmina da mquina 3 apresenta todos os resultados conforme; na e colheita 9 a lmina da mquina 1 e os 2 locais (lmina e tapete) da mquina 3 apresentam valores concordantes; na 10, apenas os tapetes de ambas as mquinas concordavam entre si; na 11 apenas a mquina 1 apresenta testes concordantes. As colheitas 12 e 13, apenas ocorreram na mquina 3. Na primeira todos os valores concordaram entre si, enquanto que na segunda essa concordncia apenas ocorre no tapete (local 2). Nas restantes 19 colheitas (no concordantes entre si), podem existir 6 tipos de combinaes diferentes. Para facilidade de interpretao dos dados, apresentou-se os resultados em forma de Tabela.

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Tabela 5 Colheitas no concordantes entre si nos 3 testes

aerbios totais conforme ATP conforme protena no conforme aerbios totais conforme ATP no conforme protena no conforme

aerbios totais conforme ATP no conforme protena conforme aerbios totais no conforme ATP conforme protena conforme aerbios totais no conforme ATP no conforme protena conforme aerbios totais no conforme ATP conforme protena no conforme

Colheita 2, lmina (local 1) mquina 1; colheita 6, a lmina (local 1) e o tapete (local 2) da mquina 1; colheita 13, na lmina (local 1) Colheita 2, lmina (local 1) da mquina 3; colheita 9, a lmina (local 1) da mquina 1; colheita 10, as lminas (locais 1) de ambas as mquinas; colheita 11, a lmina (local 1) da mquina 3 Colheita 4, tapete (local 2) da mquina 1; colheita 5, o tapete (local 2) da mquina 1; colheita 7, a lmina (local 1) da mquina 1; colheita 8, os 2 locais da mquina 1; colheita 11, a tapete (local 2) da mquina 3. Colheita 8, o tapete (local 2) da mquina 3; Colheita 2, tapete (local 2) da mquina 3; colheita 7, o tapete (local 2) da mquina 1; Colheita 4, tapete (local 2) da mquina 3;

Aos 43 ensaios aplicou-se anlise estatstica. Antes de realizar um tratamento estatstico de dados, necessrio analisar previamente um conjunto de premissas que determinam o tipo de teste a utilizar, nomeadamente a quantidade de variveis em estudo, se os valores podem ser distribudos segundo uma escala, e ainda se apresentam distribuio normal. Nas amostras, em estudo pretendeu-se analisar diferentes testes, com variveis diferentes, mas com um objectivo comum, avaliar se o programa de higienizao foi realizado de forma eficaz, atribuindo a essa premissa a denominao de valor conforme e no conforme, de acordo com o valor resultante do teste, da a designao de amostras emparelhadas. Quantificar os resultados tendo em conta uma escala torna-se por este facto impossvel, assim como a distribuio normal dos mesmos. De acordo com todos estes factores, mais adaptado ao ensaio o recurso a um teste no paramtrico, nomeadamente o teste de McNemar. O recurso a este teste permite comparar 2 propores onde existem pares de resultados numa varivel binria (Petrie & Watson, 2001). Procedeu-se, igualmente, determinao do coeficiente Kappa, o qual determina o grau de concordncia ou associao entre 2 testes; o valor 1 significa concordncia perfeita, o valor 0 que o grau de concordncia igual ao grau de no concordncia, valores

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negativos raramente ocorrem, mas significam que o valor de concordncia menor que o valor de concordncia esperado (Petrie & Watson, 2001). A Tabela 4, mostra os resultados da anlise comparativa dos testes efectuados. A comparao entre microrganismos aerbios totais a 30 C e ATP obteve um valor p= 0,022; de acordo com este teste estatstico, se o valor de p < 0,05 os resultados apresentam diferenas estatisticamente significativas. Das 13 amostras no concordantes, 11 mostraram valores conformes de microrganismos aerbios totais a 30 C e resultados de ATP no conformes, situao perfeitamente entendvel uma vez que o teste de ATP identifica matria orgnica, mesmo no contaminada por microrganismos, pelo que, provavelmente, ter havido uma m higienizao das superfcies aps a laborao. Apesar de microbiologicamente parecer aceitvel, na indstria alimentar esta situao pode ser complicada, uma vez que o material remanescente poder servir de substrato ao crescimento de bactrias, favorecendo eventualmente o crescimento exponencial da populao bacteriana. Ento, apenas 2 dos 43 ensaios realizados (cerca de 5% do total dos ensaios), constituem problema, porque existe contagem bacteriana mas os valores de ATPmetria so conformes. Esta situao, aparentemente pouco clara, tem que ter em ateno que as contagens obtidas se encontram dentro do mesmo logaritmo dos valores indicativos, pelo que, pode ser pelo menos parcialmente explicada pela incerteza da tcnica analtica, ou pela prpria colheita, uma vez que os microrganismos no esto nunca uniformemente distribudos pela superfcie, pelo que no ser possvel, mesmo em colheitas sucessivas, fazer uma amostragem completamente sobreponvel. Niza Ribeiro et al. (2002), corroboram, defendendo que as irregularidades na distribuio das amostras sobre as superfcies e eventualmente a existncia de agregados de bactrias, podem ser importantes. Por outro lado, estas 2 situaes ocorrem no mesmo local, o tapete (local 2) da mquina 3, o qual estava visivelmente danificado apresentando mesmo fendas. As caractersticas destas fendas, de difcil acesso para higienizao, podero constituir fonte de contaminao. A comparao entre microrganismos aerbios totais a 30 C e teste de visualizao de deteco de protena, obtiveram um valor p = 0,146; uma vez que p > 0,05 os resultados no apresentam diferenas estatsticas significativas. A anlise dos dados mostra que 31 dos ensaios, concordam entre si, existindo apenas 12 que discordam entre si. Em 9 dos 12 ensaios, a pesquisa de microrganismos aerbios totais a 30 C deu valores conformes e os resultados do teste de deteco de protena no conformes, o que provavelmente se deveu a um processo de higienizao mal conduzido. Mais uma vez o tipo de analito explica o resultado, pois pode estar presente protena sem contaminao microbiana.

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Os 3 ensaios restantes, revelam, presena de microrganismos e ausncia de visualizao da protena, o que pode parecer pouco explicvel, contudo a cor verde do teste no significa ausncia de protena, mas apenas que est dentro de valores considerados aceitveis para a monitorizao da higiene na indstria alimentar. Em algumas situaes este teste no de fcil interpretao. A distino entre verde acinzentado ou cinza arroxeado nem sempre fcil, dependendo da sensibilidade do operador que a realiza. No entanto, quando a protena est presente em nveis aceitveis (verde), ou quando h uma quantidade elevada (roxo), a interpretao do teste fcil. A comparao entre a ATPmetria e o teste de visualizao de deteco de protena, obtive um valor p = 0,581, pelo que sendo p > 0,05, as amostras no so significativamente diferentes. Da anlise dos dados verifica-se que 30 ensaios concordam entre si, enquanto 13 discordam entre si. Em 5 dos 13 ensaios, a pesquisa de ATP resultou conforme e a de protena no conforme, provavelmente, por questes relacionadas com o local de colheita. Os 8 ensaios que revelaram resultados com valores conformes de deteco de protena e valores no conformes de ATP, so provavelmente explicados pela presena sobretudo de ATP microbiano e menos de ATP proveniente de produtos fatiados. O coeficiente kappa, nas trs determinaes realizadas, resultou em valores equiparados, a saber, 0,410 (41%) entre aerbios totais e ATP; 0,428 (42,8%) entre aerbios totais e observao do teste de deteco de protena; 0,398 (39,8%) entre ATP e observao do teste de deteco de protena. De acordo com Petrie & Watson (2001), a comparao entre os resultados de aerbios totais e ATP e entre aerbios totais e observao do teste de deteco de protena classificada como moderada, enquanto a comparao entre ATP e os resultados da observao do teste de deteco de protena classificada razovel. Por outro lado Thrusfield (2005), sugere que valores superiores ou iguais a 0,75 indicam excelente concordncia, enquanto que valores inferiores a 0,40 sugerem pobre concordncia. De acordo com este autor, nenhuma das comparaes realizada entre os testes apresenta excelente concordncia, existindo mesmo uma comparao (ATP e observao do teste de deteco de protena), que considerada pobre. Segundo Moore & Griffith (2002b), a maior parte dos estudos estabelece uma boa correlao entre a deteco de ATP por bioluminescncia e a anlise microbiolgica clssica, contudo no seu prprio estudo isto no acontece. De acordo com os autores isto deve-se essencialmente ao facto de que a maior parte dos detritos nas superfcies de trabalho serem essencialmente orgnicos e no microbiolgicos, o que provavelmente tambm explica os resultados deste estudo. Vrios autores recomendam o uso de deteco de ATP por bioluminescncia para monitorizao de planos de higienizao. Malik, Cooper & Grifith (2003) recomendam que a

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monitorizao em hospitais seja realizada recorrendo a deteco de ATP por bioluminescncia, enquanto que Bell, Stallard, Brown & Standley (1994), referem que tcnica de deteco de ATP por bioluminescncia demonstrou ser um bom meio para garantir os altos parmetros de higiene dos tanques de leite pela optimizao da rapidez e eficcia com que estas podem ser monitorizadas. A subjectividade inerente interpretao do teste de deteco de protena quando os resultados no so explicitamente aceitveis ou no aceitveis, aliado ao tempo que medeia entre a colheita da amostra e a leitura dos resultados, so um inconveniente claro para este teste quando aplicado na monitorizao da higiene numa indstria como a estudada. Os 10 minutos, para as indstrias em que a presso de produo muito elevada, um tempo ainda considervel, e se ao fim deste tempo no se consegue dizer claramente se necessrio voltar a higienizar, a monitorizao do PCC estar comprometida. Na comparao entre o teste de deteco de protena e o de ATPmetria, aplicados nesta indstria em particular, este ltimo parece sair claramente em vantagem, quer pelo tipo e rapidez de resultados, quer pela facilidade de interpretao. Existem evidncias que sugerem que a relao custo/beneficio na utilizao dos mtodos rpidos, nomeadamente deteco de ATP por bioluminescncia, provavelmente maior que a relao custo/benefcio resultante da monitorizao recorrendo a microbiologia tradicional (Moore & Griffith, 2002b). A grande dificuldade para as pequenas indstrias poder ser o custo do aparelho de leitura de ATP, eventualmente pouco comportvel em alguns casos.

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5. Concluses

O conhecimento das populaes microbianas nas superfcies de trabalho fundamental quando se pretende a segurana de um dado produto alimentar. Para alm de microrganismos indicadores de higiene, tambm importante assegurar a ausncia de microrganismos potencialmente patognicos, pelo que o recurso a outros testes mais especficos e mesmo realizadas. O teste de visualizao de deteco de protena revelou algum interesse, particularmente pela facilidade de transporte das zaragatoas e pelo seu custo comparativamente menor em relao ao teste de ATPmetria. No entanto, devido sobretudo dificuldade de leitura da cor e ao tempo de espera at que essa leitura possa ser feita (10 minutos), no pareceu o mais adequado s caractersticas da indstria em presena. A utilizao de ATPmetria permitiu resultados bastante rpidos, quase imediatos, e uma vez que fornece um valor absoluto, no susceptvel de interpretaes duvidosas. Apresenta a desvantagem do custo do aparelho, que representa um investimento inicial avultado; ainda assim facilmente transportvel. Tendo em conta os resultados obtidos neste trabalho, as caractersticas da indstria onde decorreu o estudo, em particular da sala de fatiados, e os objectivos que se pretendiam alcanar, concluiu-se que - o processo de higienizao dever, provavelmente, ser revisto; - a observao visual prvia utilizao de qualquer teste de monitorizao fundamental; - o recurso deteco de ATP por bioluminescncia, dos testados, o mtodo mais adequado para monitorizar o plano de higienizao utilizado e, desta forma, controlar os PCC do plano de autocontrolo implementado. a anlises de microbiologia clssica devem ser, periodicamente,

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Simm, E.M., Andrade, N.J., Mendona, R.C.S., Passos, F.J.V. & Chaves, J.B.P. (2006). Interferncia de substncias orgnicas, Staphylococcus carnosus e Esporos de Bacillus subtilis na medida de ATP-bioluminescncia. Brazilian Journal of Food Technology, 9, 305-310. Soares, E. (2007). Doenas de origem alimentar - infeces e intoxicaes. Segurana e qualidade alimentar, 2, 6-8. Tebbutt, G.M. (2007). Does microbiological testing if foods and the food environment have a role in the control of foodborne disease in England and Wales?. Journal of Applied Microbiology, 102, 883-891. Tompkin, R.B. (2004). Environmental sampling A tool to verify the effectiveness of preventive hygiene measures. Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 95, 45-51. Thrusfield, M. (2005) Veterinary epidemiology. (pp. 327-329) United Kingdom: Blackwell publishing. Wildbrett, G. (2000). Limpieza y desinfeccin en la industria alimentaria (pp.1-8 & 179-191). Zaragoza (Espaa): Acribia, S.A. WHO/FAO, Comisso do Codex Alimentarius (2003). Cdigo de prticas internacionais recomendadas Princpios gerais de higiene alimentar CAC/RCP 1-1969, Rev. 42003. Roma (Itlia).

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Anexos

Anexo I - Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para a desinfeco ambiental.

Anexo II Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para paredes e pavimentos.

Anexo III - Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para a fatiadora.

Anexo IV Constituio do meio TGE-Agar Tryptone Glucose Extract Agar.

Anexo V Constituio do meio VRBGA Violet Red Bile Glucose Agar.

Anexo VI Resultados dos ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 1.

Anexo VII Resultados dos ensaios realizados no tapete (local 2) da mquina 1.

Anexo VIII Resultados dos ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 3.

Anexo IX Resultados dos ensaios realizados no tapete (local 2) da mquina 3.

Anexo X Limites de aceitao estabelecidos pela Deciso da Comisso 471/2001, relativos ao nmero de Unidades Formadoras de Colnias em superfcies.

Anexo XI Limites de aceitao estabelecidos pela empresa fornecedora das zaragatoas descartveis Ultrasnap e do luminmetro SystemSURE II, medidos em RLU.

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64

Anexo I - Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para a desinfeco ambiental.

INSTRUES DE TRABALHO

LINHA DE FATIADOS
Cdigo: Edio:

DESINFECO AMBIENTAL

1. Material e meios de desinfeco 1.1 Desinfectantes

Agente de desinfeco Glutaraldedo Tempo actuao 2 horas (*) 1 hora (*) 3 horas Choque 1 h 40 min (*) Tempo recuperao 24 horas

Designao (1) TOTAL SHOCK SF

Periodicidade Quinzenal

Apresentao Lquido

Tratamento Manuteno Manuteno (**)

(2) F 66

Cloreto de benzalcnio

Bimestral

Lquido

(*) Ver anexo A. (**) Manuteno - Tratamento a cumprir a menos que haja indicaes em contrrio.

1.2 Meios mecnicos auxiliares AEROBRUMER TIPO H;

2. Modo de funcionamento 1. 2. Desligar os ventiladores da Sala de Fatiados; Colocar o AEROBRUMER TIPO H sensivelmente no meio da sala, afastado dos equipamentos, por forma a garantir a correcta libertao do desinfectante (atomizao) para o ambiente;

65

3.

Utilizando luvas e mscara, desenganchar as fixaes dos puxadores de molas da cubeta (depsito inferior) conforme indica a figura 2;

4.

Colocar na cubeta o desinfectante a utilizar (1) ou (2) de acordo com a periodicidade definida. Por cada hora de funcionamento dever juntar-se cerca de 5 litros de desinfectante, no devendo NUNCA ultrapassar o nvel indicado pelo vinco circular situado no interior da cubeta (ver figuras 3 e 4)

5.

Colocar de novo o aparelho sobre a cubeta, e fix-lo com os puxadores de molas (ver figura 5)

66

6.

Ligar o aparelho tomada apropriada, e marcar o tempo de funcionamento adequado ao desinfectante a utilizar (ex: 2.00h para o TOTAL SHOCK SF) pressionando para o efeito os botes (- e

+) existentes no painel (ver figura 6)

7.

Colocar o aparelho em funcionamento pressionando para o efeito o boto painel (ver figura 6A)

RUN existente no

8.

Fechar a Sala de Fatiados durante o perodo de funcionamento do aparelho, NO SENDO PERMITIDA A ENTRADA NA SALA DURANTE ESTE PERODO. O aparelho desliga automaticamente quando termina o tempo definido.

9.

Aps o tempo de recuperao indicado, ligar os ventiladores da Sala de Fatiados permitindo assim a sua ventilao;

10. Caso seja utilizado o desinfectante (2), proceder obrigatoriamente ao enxaguamento dos equipamentos, superfcies e utenslios antes da sua utilizao. 11. Antes de arrumar o aparelho, proceder sua limpeza da seguinte forma, utilizando para o efeito luvas e mscara: a. Desenroscar o tampo da cubeta (ver figura 7);

b.

Retirar o desinfectante que se encontra na cubeta, atravs do orifcio de sada e coloc-lo num recipiente para prxima utilizao. No deve haver mistura com o

67

detergente original; logo, o lquido que sobrou, deve ser colocado num recipiente parte e ser gasto na prxima utilizao. Enxaguar a cubeta com gua corrente.

NOTA: Ainda que o desinfectante retirado da cubeta apresente uma colorao diferente do desinfectante original, o seu poder de desinfeco no est comprometido, o que significa que deve ser utilizado na aplicao seguinte, completando o volume em falta. c. Terminadas as operaes de limpeza e arrumao do aparelho, retirar todo o material descartvel utilizado (luvas, mscara, avental etc.) e coloc-lo no lixo. Lavar cuidadosamente as mos e colocar novo material descartvel.

3. Responsabilidades 3.1. Responsabilidade directa Os trabalhadores encarregues da aplicao deste procedimento, sob a superviso do Chefe de Equipa, so responsveis em conjunto e duma forma directa pelas aces aqui descritas. 3.2. Responsabilidade pela vigilncia O Chefe de Sector responsvel pela vigilncia do cumprimento das aces previstas no presente procedimento. 3.3. Responsabilidade pela superviso A Direco de Operaes responsvel pela superviso e pela garantia dos meios necessrios s aces previstas neste procedimento, em coordenao com o chefe do servio de produo.

ANEXO A

Designao (1) TOTAL SHOCK SF (2) F 66

Tratamento Manuteno Manuteno Choque

Tempo de actuao 12 min / 100 m3 6 min / 100 m3 10 min / 100 m3

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Anexo II Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para paredes e pavimentos.

INSTRUES DE TRABALHO

LINHA DE FATIADOS
Cdigo: Edio:

Paredes e Pavimentos 1. Material e meios de lavagem e desinfeco 1.1 gua Caractersticas microbiolgicas (caractersticas de gua potvel); Caractersticas fsico-qumicas (pH neutro e dureza baixa).

1.2 Detergentes
Designao Tipo detergente Apresentao Tempo actuao 15 Temperatura actuao Ambiente Dose aplicao 3,5%

(1) SAFEFOAM

Alcalino

Lquido

1.3 Desinfectantes
Designao Agente de desinfeco Quaternrio Clorado Apresentao Tempo actuao 10 10 Temperatura actuao 20 C 20 C Dose aplicao 0,6% 0,7%

(2) DIVOSAN QC AQ (3) DEOGEN VS7

Lquido Lquido

1.4 Meios mecnicos auxiliares Mangueira flexvel com bico de presso e ligador rpido torneira; Mangueira ligada ao kit de formao de espuma; Objectos de escovagem manual; Dispositivo para pulverizao do desinfectante.

2.1 Diria [*] Proceder limpeza dos detritos grosseiros, removendo-os para o lixo;

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Proceder pr-lavagem com gua fria sob presso, removendo os detritos ainda visveis; Aplicar sobre as superfcies uma camada uniforme de espuma do detergente (1) e deixar actuar durante 15;

Efectuar o enxaguamento com gua temperatura ambiente a alta presso.

2.2 Trimestral [+] Proceder pr-lavagem com gua fria sob presso, removendo os detritos grosseiros; Aplicar sobre as superfcies uma camada uniforme de espuma do detergente (1) e deixar actuar durante 15; Efectuar o enxaguamento com gua fria a alta presso.

3. Desinfeco Diria [*] Aps a lavagem diria, aplicar a soluo desinfectante (3)[a] nas superfcies, com o auxlio do dispositivo de pulverizao do desinfectante, deixando actuar pelo menos durante 10; Fazer o enxaguamento com gua temperatura ambiente.

__________
[*]

- Paredes at cerca de 2 metros de altura e pavimentos. e paredes acima de 2 metros de altura.

[+] - Tectos [a]

- Em substituio do desinfectante (3) usar o desinfectante (2), apenas na ltima lavagem da

semana.

4. Responsabilidades 4.1. Responsabilidade directa Os trabalhadores encarregues da aplicao deste procedimento, sob a superviso do Chefe de Equipa, so responsveis em conjunto e duma forma directa pelas aces aqui descritas. 4.2. Responsabilidade pela vigilncia O Chefe de Sector responsvel pela vigilncia do cumprimento das aces previstas no presente procedimento. 4.3. Responsabilidade pela superviso A Direco de Operaes responsvel pela superviso e pela garantia dos meios necessrios s aces previstas neste procedimento, em coordenao com o chefe do servio de produo.

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Anexo III - Instruo de trabalho da indstria alimentar Plano de higienizao para a fatiadora.

INSTRUES DE TRABALHO

LINHA DE FATIADOS
Cdigo: Edio:

Fatiadora

1. Material e meios de lavagem e desinfeco 1.1 gua Caractersticas microbiolgicas (caractersticas de gua potvel); Caractersticas fsico-qumicas (pH neutro e dureza baixa);

1.2 Detergentes

Designao

Tipo detergente

Apresentao

Tempo actuao 10

Temperatura actuao Ambiente

Dose aplicao 0,5%

(1) SHURECLEAN PLUS

Neutro

Lquido

1.3 Desinfectantes

Designao

Tipo desinfectante

Apresentao

Tempo actuao 10 -

Temperatura actuao 20 C -

Dose aplicao 1,0 % Puro

(2) SUREDIS (3) ALCOSAN

lcool

Lquido Lquido

1.4 Meios mecnicos auxiliares Objectos de escovagem manual (escovas, esponjas, etc.); Baldes de plstico; Pulverizadores manuais.

71

2. Remoo de detritos Sempre que se mude o produto a fatiar, remover os detritos com o auxlio de escova e/ou papel absorvente; Diariamente, remover os detritos aps a desmontagem do tapete e lmina.

3. Lavagem A efectuar diariamente sempre que se mude o produto a fatiar; A efectuar diariamente aps a desmontagem do tapete e lmina; Proceder pr-lavagem com gua temperatura ambiente; Seguidamente, lavar todas as superfcies exteriores bem como as peas desmontadas com soluo detergente (1), em gua morna (45 C); No caso particular dos tapete(s) a lavagem dever ser feita com o(s) mesmo(s) a rodar garantindo desta forma que toda a superfcie lavada. Procede-se ao enxaguamento com gua temperatura ambiente.

4. Desinfeco Efectuar diariamente antes do incio do processo de tranchagem, com o desinfectante (3) em toda a mquina, e particularmente nas zonas de contacto com o produto: rampa de colocao do produto, garras, lmina, tiras amovveis e tapete. A efectuar diariamente com o desinfectante (3) sempre que se mude o produto a fatiar; No final do dia de trabalho, com o auxlio dos pulverizadores manuais, aspergir a soluo desinfectante (2)[a], sobre as peas da mquina e restantes superfcies deixando actuar pelo menos 10'; No caso particular dos tapetes a desinfeco dever ser feita com o mesmo a rodar garantindo desta forma que toda a superfcie desinfectada. ___________________
[a]

- o desinfectante no necessita de enxaguamento

5. Responsabilidades 5.1 Responsabilidade directa Os trabalhadores encarregues da aplicao deste procedimento, so responsveis em conjunto e duma forma directa pelas aces aqui descritas. 5.2 Responsabilidade pela vigilncia O Encarregado de Sector responsvel pela vigilncia do cumprimento das aces previstas no presente procedimento. 5.3 Responsabilidade pela superviso

A Direco de Operaes responsvel pela superviso e pela garantia dos meios necessrios s
aces previstas neste procedimento, em coordenao com o chefe do servio de produo.

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Anexo IV Constituio do meio TGE-Agar Tryptone Glucose Extract Agar.

Peptona de casena ----------------Extracto de carne -------------------Glucose ---------------------------------

5,0 g 3,0 g 1,0 g

gar-gar ------------------------------- 15,0 g

Anexo V Constituio do meio VRBGA Violet Red Bile Glucose Agar.

Extracto de levedura ---------------Peptona --------------------------------Cloreto de sdio ---------------------Sais de blis n. 3 --------------------Glucose --------------------------------Vermelho neutro ---------------------Cristal violeta --------------------------

3,0 g 7,0 g 5,0 g 1,5 g 10,0 g 0,03 g 0,002 g

gar-gar ------------------------------- 12,0 g

Anexo VI Resultados dos ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 1.

Colheita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Anlise microbiolgica Clssica Aerbios Totais Enterobacteriaceae
(UFC/cm )
2

(UFC/cm )

Deteco de ATP (RLU) 1 6 3 4 3 2 11 31 42 12 51

2 x 10 1,0 0 1,0 8,0 0 0 0 5,0 3,0 1,3 x 10

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Teste de deteco de protena Verde Cinzento Verde Verde Verde Roxo Verde Verde Cinzento Cinzento Roxo

Registo da observao visual Limpo Intermdio Limpo Limpo Limpo Sujo Limpo Intermdio Intermdio Limpo Sujo

73

74

Anexo VII Resultados dos ensaios realizados no tapete (local 2) da mquina 1.

Colheita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Anlise microbiolgica Clssica Aerbios Totais Enterobacteriaceae
(UFC/cm )
2

(UFC/cm )

Deteco de ATP (RLU) 8 1 5 20 17 5 16 19 80 28 4

3,6 x 10 5,0 1,0 0 3,0 0 1,2 x 10 1,0 2 1,7 x 10 5,7 x 10 0

4,4 x 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Teste de deteco de protena Verde Verde Verde Verde Verde Cinzento Verde Verde Cinzento Cinzento Verde

Registo da observao visual Limpo Limpo Limpo Limpo Intermdio Sujo Limpo Limpo Intermdio Limpo Intermdio

Anexo VIII Resultados dos ensaios realizados na lmina (local 1) da mquina 3.

Colheita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Anlise microbiolgica Clssica Aerbios Enterobacteriaceae Totais 2 (UFC/cm )
(UFC/cm )
2

Deteco de ATP (RLU) 7 11 9 29 16 5 77 10 3 13 19 16 4

Teste de deteco de protena Verde Cinzento Verde Cinzento Roxo Verde Cinzento Verde Verde Roxo Cinzento Roxo Cinzento

Registo da observao visual Limpo Intermdio Intermdio Sujo Sujo Limpo Intermdio Intermdio Limpo Sujo Limpo Sujo Limpo

4,3 x 10 0 0 1,7 x 10 3,5 x 10 1,0 7,6 x 10 0 0 7,0 1,0 5,2 x 10 1,0

1 0 0 0 8,6 x 10 0 0 0 0 0 0 0 0

Anexo IX Resultados dos ensaios realizados no tapete (local 2) da mquina 3.

Anlise microbiolgica Clssica Aerbios Enterobacteriaceae Totais 2 (UFC/cm )
(UFC/cm )
2

Colheita 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Deteco de ATP (RLU) 6 34 2 4 3 79 11 3 2 24 12 6 3

Teste de deteco de protena Cinzento Verde Verde Roxo Verde Cinzento Cinzento Verde Verde Roxo Verde Verde Verde

Registo da observao visual Limpo Intermdio Limpo Limpo Intermdio Intermdio Intermdio Limpo Limpo Sujo Limpo Limpo Limpo

1,2 x 10 2 1,5 x 10 4,0 8,0 x 10 5,0 6,1 x 10 5,2 x 10 3,4 x 10 8,0 1,1 x 10 9,0 4,0 0

0 9,0 0 1,0 2 2,0 x 10 0 0 0 0 0 0 1,0 0

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Anexo X Limites de aceitao estabelecidos pela Deciso da Comisso 471/2001, relativos ao nmero de Unidades Formadoras de Colnias em superfcies.
Limite aceitvel Microrganismos aerbios totais a 30 C Enterobacteriaceae 0 10 / cm
2

Limite no aceitvel > 10 / cm2 > 1 / cm2

0 1 / cm2

Anexo XI Limites de aceitao estabelecidos pela empresa fornecedora das zaragatoas descartveis Ultrasnap e do luminmetro SystemSURE II, medidos em RLU.
Conforme < 10 Cautela 11 20 No conforme > 20

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