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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas

ISSN 0717 7917

Fragaria vesca

Volumen 8, Nmero 6, Noviembre de 2009


Editorial Edgar Pastene (Chile) Estado actual de la bsqueda de plantas con actividad antioxidante. Revisiones Ramirez et al. (Brasil) Efectos beneficiosos del extracto de frutas rojas y de sus antocianos. Fredes (Chile) Antioxidantes en berries nativos chilenos. Artculos Avello et al. (Chile) Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosmticos. Letelier et al. (Chile) Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. Rojo et al. (Chile) Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. Gorriti Gutirrez et al. (Per) Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maz morado (Zea mays L.): Mtodo de extraccin. Gaviria Montoya et al. (Colombia) Actividad antioxidante e inhibicin de la peroxidacin lipdica de extractos de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW).. Dad et al. (Argentina) Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina).

Publicada por | Published by: Cooperacin Latinoamericana y Caribea en Plantas Medicinales y Aromticas Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List, SCOPUS, Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

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Comit Editorial | Editorial Board


Fundadores Jos L. Martnez (Chile) - Jorge Rodrguez (Cuba) Editores Jos L. Martnez Escuela de Kinesiologa, Universidad Santo Tomas, Talca, Chile. Jos M. Prieto School of Pharmacy, London University, Reino Unido. Gabino Garrido Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile. Editores Ejecutivos Damaris Silveira Facultade de Cincias da Sade, Universidade de Braslia, Brasil. Peter Taylor Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Carla Delporte Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Chile. Editores de Eventos Mara Ins Isla Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad Nacional de Tucumn, Argentina. Marcelo Wagner Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Co - Editores Brbara Arias Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. Rosa Degen Universidad Nacional de Asuncion, Instituto de Investigaciones Interdisciplinarias, Paraguay. Jeannette Gavillan Universidad de Puerto Rico. Harold Gmez Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Cartagena, Colombia. Vicente Martnez Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos, Guatemala. Edgar Pastene Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Chile. Janet Piloto Ferrer Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos La Habana, Cuba, Edison Osorio Universidad de Antioquia, Colombia Edgar Puente Centro de Toxicologa y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba, Gabriela Ricciardi Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina, Gloria Saavedra Centro de Tecnologa Agroindustrial, Universidad Mayor de San Simn, Cochabamba, Bolivia. Luiz Simeoni Universidad de Brasilia, Brasil Editores Asesores Arnaldo Bandoni Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Armando Cceres Universidad de San Carlos, Guatemala, Norman Farnsworth College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Estados Unidos. Michael Heinrich The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Peter Houghton Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College, London, Reino Unido. Leonora Mendoza Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Francisco Morn Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Mdicas de La Habana, Cuba. Patrick Moyna Facultad de Qumica, Universidad La Repblica, Montevideo, Uruguay. Pulok K. Mukherjee School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata, India. Lionel Robineau Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de las Antillas y Guyana (UAG), Pointe Pitre, Guadalupe. Elisabeth Williamson School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido. Consejo Editorial Talal Aburjai, Faculty of Pharmacy, University of Jordan, Amman, Jordan Christian Agyare, College of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcn, Departamento de Ciencias Bsicas, Universidad del Bio Bio, Chilln, Chile. Roco Alarcn, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociacin de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia. Elizabeth Barrera, Seccin Botnica, Museo Nacional de Historia Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, India

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Salvador Caigueral, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Espaa. Sergio Castro, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos. Rene Delgado, Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clnicos, La Habana, Cuba. Saikat Dewanjee, Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Qumico Farmacuticas y Bioqumicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia. Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnologa Farmacutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorologa, Holgun, Cuba. Mildred Garca, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. rea de Biologa Vegetal, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronoma, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana Gonzlez, Universidad Catlica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers University, New Jersey, Estados Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecologa, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Suzana Leitao, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Catlica del Per. Victor Lpez, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, Espaa. Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia.

Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas e Biolgicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabian Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Miguel Morales, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. John A.O. Ojewole, Faculty of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Sudfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazona Peruana, Iquitos, Per. Jos Lus Ros, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Espaa. Alicia Rodrguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia. Aurelio San Martn, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. Guillermo Schinella, Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia. Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Troms, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panam. Ren Torres, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Anglica Urbina, Facultad de Agronoma, Universidad de Concepcin, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-NotreDame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia Saudita.

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas


This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 449 - 455 BLACPMA ISSN 0717 7917 Editorial

Estado actual de la bsqueda de plantas con actividad antioxidante


[Current state of the search for plants with antioxidant activity]
Edgar R. PASTENE*1
1Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Casilla 237, Barrio Universitario s/n, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.

Abstract
Research on the antioxidant properties of edible and medicinal plants is marking sustained growth o decades. A significant number of products obtained from the plant Kingdom like essential oils, alkaloids and polyphenols have antioxidant effects which are evidenced by different in vitro and in vivo assays. However, it is difficult to harmonise and extrapolate the reported results, given the variety of available assays and constraints associated with each of them. The potential of polyphenols as antioxidant agents has been the most popular subject due to its high consumption in the diet and their ubiquitous presence in many plant species. The current state of knowledge shows us that their potential benefits as prophylactic and therapeutic agents are still not fulfil but their applications in the fields of nutraceutics and functional ingredients have been more immediate. In such products, besides their antioxidant capacity, other properties such as the anti-microbial and gastro and cardio-protective activities should be considered. Their use in isolated form is controversial with some authors questioning the real contribution of polyphenols as responsible for the benefits of plants and foods because many polyphenols do not achieve the systemic concentrations required to exert their effects. Therefore, there is an urgent necessity to shed some light about other plant components, a concern which should be shared by the scientific community involved in this area of expertise. Latest evidence points towards a primary action of these compounds in the digestive tract rather than a systemic one, where not only they could display antioxidants properties but that also act as pro-oxidants and/or free radical generators. Thereby, researchers are encouraged to expand the vision currently ascribed to the polyphenolic antioxidants, by proposing new models and experimental protocols, according to the final destination of these compounds. Keywords: Antioxidants; Free radicals; Medicinal plants; polyphenols; essential oils; functional food

Resumen
La investigacin de las propiedades antioxidantes de las plantas medicinales y alimenticias lleva dcadas marcando un crecimiento sostenido. Un nmero importante de productos obtenidos del reino vegetal, como los aceites esenciales, alcaloides y los polifenoles, posee efectos antioxidantes los cuales son evidenciados mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo. Sin embargo, resulta difcil armonizar y extrapolar los resultados reportados, dada la gran variedad de ensayos disponibles y las limitaciones asociadas a cada uno de ellos. Por su elevado consumo a travs de la dieta y la presencia ubicua en muchas especies vegetales, el potencial de los polifenoles como agentes antioxidantes ha sido el ms estudiado. El estado actual del conocimiento nos muestra que adems de sus beneficios como agentes profilcticos/teraputicos, para dichos compuestos debemos visualizar aplicaciones en el campo de las formulaciones nutracuticas e ingredientes funcionales. En tales productos, a la capacidad antioxidante se sumaran otras propiedades como las antimicrobianas, gastro y cardio-protectoras. Aunque en forma aislada, algunos autores han puesto en duda el aporte de los polifenoles como entidades nicas que expliquen los beneficios de las plantas y alimentos. Particularmente, se sabe que muchos no logran las concentraciones sistmicas necesarias para ejercer sus efectos, lo que plantea la necesidad de buscar explicaciones en otros componentes vegetales. Dicha preocupacin debiera ser compartida por toda la comunidad cientfica involucrada en el rea. En virtud de lo anterior, se han planteado que el sitio de accin primordial de estos compuestos estara en el tubo digestivo donde no slo podran actuar como antioxidantes sino que tambin como pro-oxidantes e incluso generadores de radicales libres. Por todo lo dicho, se llama a los investigadores a ampliar la mirada que hasta ahora se tiene de los antioxidantes, proponiendo nuevos modelos y protocolos experimentales, ms acordes con el destino final de estos compuestos. Palabras Clave: Antioxidantes; radicales libres; plantas medicinales; polifenoles; aceites esenciales; alimentos funcionales.
Recibido | Received: October 22, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: November 12, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009. Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plata (Programa de Incentivos X 446) This article must be cited as: Edgar R. Pastene. 2009. Estado actual de la bsqueda de plantas con actividad antioxidante. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):449 455. {EPub November 30, 2009}. *Contactos | Contacts: Edgar R. PASTENE. E-mail: edgar.pastene@gmail.com .

Introduccin:

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional ( http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Pastene

Estado actual de la bsqueda de plantas con actividad antioxidante

INTRODUCCIN En la presente edicin de BLACPMA se presenta una serie de artculos cientficos que cubren varios aspectos de la investigacin en plantas medicinales con propiedades antioxidantes. En dichos trabajos, el lector puede encontrar esfuerzos destinados a generar datos sobre la capacidad antioxidante de plantas medicinales de uso regional, y cmo sta se asociara con algunas de las propiedades teraputicas reportadas por la etnomedicina (Rojo et al., 2009; Dad et al., 2009, ste nmero). Desde hace varias dcadas se ha venido reconociendo que el consumo regular de antioxidantes contribuye a disminuir el riesgo relativo de desarrollar enfermedades crnicas degenerativas no-transmisibles. Al respecto, gran parte de esta literatura hace referencia a fuentes alimentaras ricas en antioxidantes, principalmente del tipo polifenlico. En este nmero, la necesidad de profundizar en la qumica y actividad biolgica de los pigmentos antocinicos de berries nativos y granos, es abordada en tres trabajos (Ramrez et. al., 2009; Fredes, 2009, Gorrini et al., 2009, ste nmero). Las propiedades antioxidantes no slo deben ser enfocadas desde el punto vista de las interacciones qumico-biolgicas sealadas anteriormente, adems, pudieran verse como una oportunidad para frenar el deterioro oxidativo que ciertamente afecta a los alimentos y los productos de uso cosmtico. Dichos aspectos, en conjunto con la determinacin de sus propiedades antimicrobianas sobre patgenos relevantes a la piel, son reportados para extractos de las hojas de Ugni molinae y Aristotelia chilensis (Avello et al., 2009, ste nmero). Dadas sus caractersticas fisicoqumicas, los aceites esenciales pueden ejercer interesantes efectos antioxidantes tanto en matrices alimentarias como en sistemas biolgicos. Hasta hace poco, era infrecuente encontrar trabajos que describieran otros efectos de los antioxidantes, particularmente aquellos que potencialmente pueden modular la biotransformacin de xenobiticos. Por tal motivo, resulta altamente relevante el enfoque planteado por Letelier et al., (2009, ste nmero) y sus observaciones relativas al efecto de un extracto de Romero sobre las reacciones de biotransformacin. Los ensayos utilizados en ste y otros estudios realizados con clulas, se podran clasificar en un nivel ms avanzado, debido a su mayor cercana con sistemas biolgicos complejos. Al existir un mayor nmero de sustratos biolgicos oxidables y sistemas antioxidantes endgenos (enzimticos o no), stos ensayos permiten
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determinar con mayor claridad aspectos mecansticos y concentraciones necesarias para logar los efectos pesquisados. Sin embargo, cabe sealar que an se esta muy lejos de entender cmo las plantas contribuyen a prevenir o mejorar enfermedades ligadas a la produccin de radicales libres. Lo anterior representa una tarea pendiente que necesariamente requiere de una mirada diferente. Al respecto, en el mundo cientfico existe una tendencia sostenida a considerar los aspectos siguientes: RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES, CAMBIO DE PARADIGMAS. Aspectos metodolgicos: Usamos uno o ms ensayos antioxidantes? La importancia de los polifenoles en salud humana ha sido ampliamente revisada (Ross, 2002; Kim et al., 2003; Kris-Etherton et al., 2004; Raumussen et al., 2005; Ramassamy, 2006; Lira Mora et al., 2009). No obstante, uno de los aspectos crticos de la investigacin sobre la capacidad antioxidante de productos naturales se relaciona con la eleccin de las herramientas de medicin. El estado del arte nos indica que cada vez es necesario contar con una batera de ensayos que nos permitan obtener informacin complementaria. Al respecto, en esta edicin se incluye un trabajo donde el potencial antioxidante de los pigmentos antocinicos de frutos de Mortio fue evaluado mediante varios ensayos (Montoya el al., 2009, este nmero), destinados a revelar el potencial de este fruto como agente antioxidante de matrices oleosas. Al respecto, el uso de radicales estables coloreados como el DPPH, ABTS, DMPD, o reactivos como el FRAP; se recomiendan como criterio preliminar para jerarquizar las distintas plantas, extractos o fracciones de stos, de acuerdo a su poder antioxidante. Dado que en los ensayos mencionados ocurren reacciones de transferencia de electrones y/o hidrgeno, el adecuado conocimiento de la qumica de tales sistemas es condicin sine qua non para interpretar correctamente los resultados, particularmente cuando estos ensayos se aplican a muestras de fluidos biolgicos. Como se puede apreciar en muchos estudios, los datos a menudo son cruzados con el contenido de polifenoles totales de las muestras, determinados como equivalentes de cido glico (GAE). Sin embargo, cada vez es ms frecuente recurrir a tcnicas de separacin acopladas a sistemas de

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deteccin como el arreglo de diodos (DAD) o la espectrometra de masas (LC-MS). Dichas tcnicas permiten diseccionar de mejor manera la actividad antioxidante y asignarla a un grupo especfico de compuestos. Si bien es cierto, no existe una metodologa que pueda ser considerada como un Gold Standard, numerosos estudios consideran que ciertos ensayos como el ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), poseen ventajas comparativas en relacin al resto (Ou et al., 2001). El ndice ORAC permite combinar en un solo parmetro, informacin sobre la cintica de oxidacin utilizando el rea bajo la curva de decaimiento de la fluorescencia o absorbancia de una sonda como la fluorescena (ORAC-FL) o el rojo de pirogalol (ORAC-PGR), la cual es desafiada por radicales peroxilo (AAPH). En el ensayo ORAC-FL los tiempos de induccin estn fuertemente influenciados por el nmero de grupos fenlicos presentes en la muestra mientras que, en el ensayo ORAC-PGR, dichos tiempos prcticamente no se observan y el decaimiento de la absorbancia se ve influenciado principalmente por la reactividad de los fenoles de la muestra. Recientemente, se ha planteado que ambos ndices ORAC (FL y PGR) son complementarios y su relacin es un mejor indicador de la calidad promedio de los antioxidantes de una muestra (Poblete et al., 2009). El mismo grupo de investigadores, ha propuesto el ORAC-PRG como una forma rpida de determinar el contenido especfico de vitamina C en extractos y fluidos biolgicos, dado que esta sustancia es una de las pocas que genera tiempos de induccin en forma concentracin-dependiente (Atala et al., 2009; Torres et la., 2008). En busca del Santo Grial metodolgico, y con el objetivo de ampliar su espectro de aplicacin, varios refinamientos han sido introducidos a este ensayo. Por ejemplo, el uso de ciclodextrina metilada permite obtener el ndice ORAC lipoflico en distintas muestras vegetales o fluidos biolgicos (Huang et al., 2002). Adicionalmente, el ensayo ha demostrado ser altamente verstil, debido a que en l se han introducido modificaciones que permiten medir el efecto de antioxidantes sobre otras especies reactivas del oxgeno y nitrgeno dando origen a variantes para el radical hidroxilo (HORAC), peroxinitrito (NORAC), anin superxido (SORAC), (Ou et al., 2002; http://www.brunswicklabs.com/). Paralelamente, otros investigadores han desarrollado un ensayo denominado CUPRAC (Cupric ion reducing antioxidant capacity), el cual se ha
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empleado para la determinacin de la capacidad antioxidante de polifenoles, cido ascrbico y tioles (Apak et al., 2004; Cekic et al., 2009). El ensayo tambin se ha adaptado para al anlisis de antioxidantes hidroflicos como lipoflicos (Celik et al., 2007) y en la determinacin de la capacidad captadora de radical hidroxilo (Bektasoglu et al., 2008). Hace poco, el uso del ndice ORAC como criterio de poder antioxidante ha sido empleado por la USDA (United States Department of Agriculture), la cual ha publicado una serie de tablas con la composicin antioxidante de alimentos y plantas medicinales de uso en Norteamrica. (http://www.ars.usda.gov/nutrientdata/ORAC). Recientemente, dicha experiencia ha sido tomada como ejemplo por el Laboratorio de Antioxidantes del Instituto de Nutricin y Tecnologa de los Alimentos de la Universidad de Chile (INTA, CORFO-Innova, http://www.inta.cl). Ellos se han embarcado en un ambicioso proyecto para analizar el contenido de antioxidantes de gran parte de los frutos consumidos en Chile, convirtindose en el segundo pas del mundo en contar con una base de datos de similares caractersticas a la de la USDA. Cambiando paradigmas: Uso de las plantas medicinales y alimenticias como fuente de sistemas generadores de especies reactivas del oxgeno y nitrgeno. Cada vez es ms evidente que los polifenoles son molculas promiscuas que pueden afectar distintas funciones biolgicas para bien o para mal. Al respecto, existe creciente evidencia que stos compuestos en determinadas condiciones pueden actuar como pro-oxidantes. La forma en que los polifenoles podran actuar como generadores de especies reactivas del oxgeno (ERO) ha sido abordada por varios investigadores (Aragawa et al., 2003; Arakawa et al. 2002, 2004; Aoshima et al. 2005). Utilizando como modelo de polifenol, catequinas de t verde (cuya propiedad bactericida es conocida), los autores demostraron que a pH 7-8 (o superiores), tal tipo de estructura es capaz de generar cantidades significativas de perxido de hidrgeno. De acuerdo a los autores, la generacin de perxido de hidrgeno podra explicar el efecto bactericida de los flavan-3-oles. La habilidad de las catequinas para generar perxido de hidrgeno sera favorecida por el arreglo de grupos hidroxilo en este tipo de molculas, lo que permitira la disociacin del H+ en solucin y un electrn en el fenol que reduce al oxgeno,

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generndose en consecuencia anin superxido. El anin superxido posteriormente sufre reduccin por la catequina (ej. EGCG), lo que lleva a la formacin de O2 2- ; adicionalmente, el protn se combina con el superxido generando H2O2. Este mecanismo no slo explicara la generacin de H2O2 producida por catequinas puras sino tambin por parte de infusiones de t negro, t verde y t Oolong conteniendo del orden de 1-2.4 x 10-4 mol/L de catequinas. Estas concentraciones de H2O2 seran suficientes para ejercer una accin bactericida en cepas Gram positivas y negativas (Arakawa et al., 2004). La generacin de H2O2 por parte de las catequinas del t verde no slo es un fenmeno concentracindependiente sino tambin dependiente del contexto celular (Yamamoto et al., 2004). Llama la atencin que en estos modelos se observe una capacidad de inducir muerte y/o arresto de la proliferacin en lneas celulares inmortalizadas derivadas de tumores (Wang, 2000; Lu et al., 2002). Esta polifuncionalidad por parte de algunos compuestos fenlicos (EGCG, por ejemplo), es evidente si se considera que adems, stos podran generar ambientes oxidativos diferenciales que permitan proteger a las clulas del husped de las ERO y por otro lado promover la apoptosis de las clulas tumorales (Yamamoto, et al., 2003). En otro mbito, la investigacin de las propiedades antioxidantes in vivo, habitualmente est expuesta a las vicisitudes propias de los sistemas biolgicos. Resulta emblemtico el caso de la elevacin de la capacidad antioxidante plasmtica post-consumo de manzanas, la cual finalmente fue asociada a un aumento del cido rico derivado del metabolismo de la fructosa (Lotito y Frei, 2004). An ms sorprendente resultan los hallazgos recientemente publicados en la revista Hypertension (Webb et al., 2008), en la cual se reporta que los efectos anti-hipertensivos, vasoprotectores y antiagregantes plaquetarios de muchos frutos estaran ms bien asociados a su concentracin de nitratos. En efecto, en voluntarios sanos, la administracin de 500mL de jugo de betarraga (remolacha) produjo una disminucin significativa de la presin sangunea, la cual coincidi con un pico plasmtico de nitrito. La disfuncin endotelial tambin fue contrarestada por el consumo de jugo de betarraga. Los autores proponen que la reconversin entero-salival de nitrato a nitrito (facilitada por bacterias anaerobias situadas en la superficie de la lengua), facilita la posterior produccin de xido ntrico (NO) en las condiciones
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cidas del estmago. El NO, puede ser oxidado a nitrito nuevamente a nivel portal y finalmente ser convertido en NO en aquellos vasos sanguneos que presentan resistencia. El aumento de la produccin de NO a nivel gstrico tambin puede ser beneficioso, protegiendo la mucosa en aquellos pacientes sometidos a tratamientos con anti-inflamatorios no esteroidales (AINE) o infectados por Helicobacter pylori. Ms an, se ha observado que ciertos polifenoles promueven la formacin no enzimtica de NO en el estmago, lo que consecuentemente produce una relajacin del msculo liso vascular in vivo (Silva Rocha, 2009). As, para las manzanas (cuya pulpa es rica en cido clorognico), ya se haba reportado un aumento de la produccin gstrica de NO a partir del nitrito previamente generado por las bacterias de la lengua (Peri et al., 2005). De esta manera, se han ido sumando reportes de efectos de los polifenoles que no requieren concentraciones plasmticas elevadas de stos y que nos llevan a pensar que el sitio ms importante de accin de ellos es el tracto digestivo (vide infra). EL TRACTO GASTROINTESTINAL COMO PRINCIPAL SITIO DE ACCIN DE LOS ANTIOXIDANTES? Sabemos que la actividad antioxidante parece estar asociada a determinadas especies vegetales de uso mdico y/o alimenticio, y por consiguiente pudiera estar limitada a slo algunas familias de metabolitos secundarios. Ejemplos de esto lo constituyen diferentes bayas (berries ricos en polifenoles), algunas crucferas (brcoli rico en glucosinolatos), propleos y especies con aceites esenciales. Al respecto, dentro de los grupos de metabolitos secundarios ms estudiados destacan los polifenoles. Sin embargo, como ya adelantamos, lo disperso de la informacin relativa con su absorcin, metabolismo, distribucin y excrecin ha llevado a muchos investigadores a poner en duda los efectos de los polifenoles a nivel sistmico. De esta forma, se ha sugerido que el primer y tal vez principal sitio donde stos compuestos podran ejercer su accin antioxidante, sera el tracto gastrointestinal (Revisado por Clifford, 2004). Muchos estudios en humanos destacan que slo algunos polifenoles son absorbidos en el intestino delgado. Cabe destacar que la mayor parte de los que logran llegar a nivel sistmico lo hacen conjugados por glucuronidacin, sulfoconjugacin y metilacin, y siempre en concentraciones plasmticas extremadamente bajas.

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Slo entre un 5 y un 10% de los polifenoles absorbidos circulan en forma no-conjugada. Por lo tanto, es muy difcil realizar estudios reales de farmacocintica, y las muestras de plasma u orina habitualmente deben ser sometidas a hidrlisis con glucoronidasa y/o sulfatasa para liberar las agliconas. Tales estudios pseudos-farmacocinticos han llevado a concluir que las concentraciones de polifenoles en plasma son bajos, muy variables y con mximos transitorios (Tmx 1 - 2.5 horas). Es improbable que los conjugados sobrepasen concentraciones de 10 M en total, o de 1 M en el caso de las agliconas. Puesto que es un hecho que gran parte de los polifenoles no se absorben, entonces es vlido formular la pregunta qu funciones pueden cumplir esta gran masa de antioxidantes en las diferentes porciones del tubo digestivo? Recientemente, Selma et al., (2009), han publicado una impecable revisin que da cuenta del universo de potenciales interacciones y reacciones entre los polifenoles y la biota intestinal. En este trabajo se sugiere que el efecto sistmico de los polifenoles seria atribuible a la modulacin del equilibrio bacteriano intestinal y a los metabolitos intestinales generados a partir de stos. El estrs oxidativo asociado a la respuesta inmune que sucede a la presencia de algunos patgenos como Helicobacter y Salmonella, representa uno de los principales mecanismos de defensa pero que, a su vez ocasiona dao colateral a la mucosa gstrica e intestinal. Por lo tanto, parece muy relevante disponer de eficientes sistemas antioxidantes (tanto endgenos como dietarios) en la zona de infeccin. Sin embargo, algunos patgenos como H. pylori poseen estrategias de supervivencia contra el estrs oxidativo que hacen surgir la interrogante de cun beneficiosa puede ser la administracin o ingesta de antioxidantes. Los antecedentes sugieren que estos compuestos podran tener un efecto protector, no slo para el husped (citoprotegiendo el epitelio), sino tambin sobre el H. pylori (contribuyendo a sus defensas antioxidantes). Tericamente, al aumentar la capacidad de las bacterias para lidiar con las ERO generadas por el sistema inmune del husped, se aumentara tambin la posibilidad de que la infeccin se consolide. No obstante, estudios en los cuales se han testeado extractos de plantas ricos en compuestos antioxidantes dan cuenta de efectos anti-H. pylori tanto in vitro como in vivo (Nostro et al., 2005; Mahady et al., 2005; Ustun at al., 2006). De acuerdo a antecedentes preliminares, los compuestos polifenlicos poseen reconocida actividad
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bactericida, asociada probablemente a mecanismos inespecficos que no necesariamente guardan relacin con su actividad antioxidante (citoprotectora) sobre las clulas del epitelio gstrico (Puupponen-Pimia et al., 2001, 2008). Una de las hiptesis que se ha aceptado como paradigma, es que los polifenoles ejercen parte de su actividad antimicrobiana mediante una interaccin no especfica con componentes de la membrana plasmtica (Mori et al., 1987; Haraguchi et al., 1998; Funatogawa et. al., 2004). Otro enfoque que resulta altamente atractivo, es cmo los polifenoles pueden modular la adhesin tanto de bacterias patgenas como de aquellas con funcin probitica (Lactobacilos). Mientras la mayora de los polifenoles muestra capacidad antimicrobiana en distintos rangos, slo algunos como la floridzina (chalcona) y la rutina (flavonol), aumentan la adherencia de Lactobacillus rhamosus a clulas Caco-2 (Parkar et al., 2008). Interesantemente, la propiedad adhesiva de las bacterias prebiticas es uno de los tantos obstculos que se deben sortear para lograr un efecto beneficioso en el intestino (Revisado por Prakash et al., 2008) En virtud de lo anterior, En qu medida se vinculan mecansticamente la actividad antibacteriana con la actividad antioxidante de los polifenoles? Al respecto, dependiendo del grupo de metabolitos secundarios presentes en la especie estudiada, existira una asociacin no-obligada entre la actividad antioxidante de algunos polifenoles y su actividad anti-microbiana (Correia et al., 2004; Shin et al. 2005). Por ejemplo, se sabe que las antocianidinas contribuyen en forma importante a la capacidad antioxidante del arandano, no obstante, recientemente se ha demostrado que la inhibicin de la adhesin de H. pylori, a la mucosa gstrica humana se debera, ms bien, a sus constituyentes de alto peso molecular (procianidinas) (Burger et al., 2000). PALABRAS FINALES. Durante aos, diversas sub-disciplinas de la qumica y la biologa nos han enseado y revelado aspectos sesgados, que slo permiten una visin parcial de la complejidad de los procesos oxidativos. Claramente se requiere complementar las herramientas de medicin existentes e incorporar paulatinamente tecnologas de punta as como consensuar metodologas entre academia e industria. Lejos an de entender como se mueven los delicados engranajes que sub-yacen al equilibrio redox celular, en algn punto se hace absolutamente necesario que

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la investigacin de antioxidantes tienda hacia modelos celulares. En ellos se podra refinar y comprender el comportamiento de estas sustancias en un escenario real, lo que finalmente nos permitir disear por ejemplo, mejores estrategias de prevencin y tratamiento de las enfermedades o crear nuevos alimentos funcionales. Para que la tarea sea exitosa, se requiere de un esfuerzo mancomunado de colaboracin entre todos aquellos investigadores que deseen ampliar la frontera del conocimiento. En otras palabras, a ratos los cientficos debiramos abandonar paulatinamente los demiurgos propios del Hegelianismo, que ponen al pensamiento por sobre la realidad. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 456 - 468 BLACPMA ISSN 0717 7917 Revisin | Review

Efectos beneficiosos de extractos de frutas rojas y de sus antocianos


[Beneficial properties of red berries extracts and their anthocyanins]
Maria Rosana RAMIREZ1*, Laura GERACITANO 2, Daniela MARTI BARROS 2, Amelia Teresinha HENRIQUES1*
1 2

Universidade Federal de Rio Grande do sul (UFRGS). Av. Ipiranga 2752, PoA, RS, Brasil;

Fundao Universidade Federal de Rio Grande (FURG), Av. Itlia Km 8, CEP 96.201-900, RS, Brasil.

Abstract
Epidemiological reports have indicated that individuals who consume diets containing large amounts of fruits and vegetables may reduce their risk for developing age-related diseases. These reductions might be expressed as improvements in motor and cognitive behavior. This review summarized data related to in vitro and in vivo antioxidant activity of polyphenols, emphasizing the main role of anthocyanins. In particular, their physiological effects, their metabolism, bioavailability as well as their direct interaction with lipids and DNA. Keywords: Red berry; Antioxidant activity; Anthocyanins; DNA.

Resumen
Los polifenoles constituyen un grupo de sustancias qumicas considerados metabolitos secundarios de las plantas. Actualmente existe un renovado inters por estos compuestos en virtud de su actividad antioxidante y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana, tales como prevencin de enfermedades crnico-degenerativas. En esta revisin, resumimos los datos relacionados con la actividad antioxidante de in vitro e in vivo de los polifenoles, particularmente los antocianos. Concretamente, sus efectos fisiolgicos, su metabolismo, biodisponibilidad as como su interaccin directa con moleculas de relevancia biolgica como la molcula de ADN y los lpidos. Palabras Clave: Frutas rojas; Antocianos; Actividad antioxidante; ADN.

Recibido | Received: December 9, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: May 12, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was not financed. This article must be cited as: Maria Rosana Ramirez, Laura Geracitano, Daniela Marti Barros , Amelia Teresinha Henriques. 2009. Efectos beneficiosos de extractos de frutas rojas y de sus antocianos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):456 468. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email mariarosanar@yahoo.com.br; amelia@farmacia.ufrgs.br Tel: 0055-51-3308-5258 Fax: 0055-51-3308-5437.

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional ( http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Ramrez et al.

Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

INTRODUCCIN Durante el ao 1989 la Organizacin Mundial de la Salud realiz un trabajo de investigacin denominado proyecto Mnica, el mismo suscit inters debido a los resultados obtenidos que demostraron que las tasas de mortalidad por enfermedades cardiovasculares en Francia eran menores que en otros pases industrializados como por ejemplo el Reino Unido y los Estados Unidos y que esa reduccin significativa en las mismas estaba relacionada con el consumo de vino en esos pases. Este trabajo de investigacin fue realizado en la ciudad de Burdeos (Francia) en el cual se seleccionaban individuos que tenan el hbito de consumir una dieta rica en grasas y consecuentemente presentaban un riesgo elevado de padecer enfermedades cardiovasculares entre otras. Tambin fueron considerados otros factores como el hbito de fumar y la presin arterial, comprobndose que a pesar de practicar hbitos alimentares perjudiciales la poblacin exhiba un bajo ndice de enfermedades cardiovasculares, de colesterol sanguneo as como una baja frecuencia de ataques cardiacos, esta particular situacin fue denominada como paradoja francesa. La explicacin a los resultados obtenidos fue fundamentada en el tipo de dieta basada en frutas, verdura e vino, alimentos particularmente ricos en compuestos fenlicos (Criqui y Riegel, 1994; Renaud y Ruf, 1994). En el mismo sentido, otros autores demostraron que los consumidores moderados de vino tinto, cuando comparados con los abstemios presentan menor riesgo de padecer tanto la enfermedad de Alzheimer, como demencia senil. De acuerdo con otros autores la reduccin del riesgo en los consumidores de vino de contraer Alzheimer es de aproximadamente 25% y menor del 20% de padecer demencia senil (Orgogozo et al., 1997). En Brasil se considera que las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte (32%), se calculan aproximadamente 820 casos por da y aproximadamente 300 mil muertes por ao, es decir por cada cien mil habitantes ocurren en torno de 160 muertes, ste ndice cuando comparado con otros pases como el Japn donde se registran 42 muertes por cada cien mil habitantes, el ndice brasilero es extremadamente elevado. De acuerdo con los datos divulgados por la Sociedad Brasilera de Cardiologa (FUNCOR) aproximadamente 42% de los individuos adultos brasileros presentan un ndice elevado de
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colesterol y el 15% son hipertensos. No obstante, existe una ciudad denominada Veranpolis, la misma est situada en el estado de Rio Grande do Sul, la cual se destaca por presentar el mayor ndice de expectativa de vida del pas y el tercero en el mundo. Los trabajos de investigacin realizados en sta ciudad tambin relacionaron el elevado ndice de vida con el consumo moderado de vino tinto as como de alimentos producidos en la regin. Del mismo modo, los estudios epidemiolgicos realizados en poblaciones orientales, demostraron que existe una relacin entre la disminucin en la incidencia de cncer de mama, el consumo elevado de soja, as como de alimentos derivados de la misma los cuales son particularmente ricos en isoflavonas. De acuerdo con los estudios se calcula que la poblacin japonesa ingiere una cantidad diaria aproximada de 30 a 40 mg/da de isoflavonas. Siendo el consumo en los pases occidentales inferior debido al menor consumo de soja y de productos derivados de la misma (Kimira et al., 1998). Considerando que la mayor parte de esos estudios fueron realizados teniendo como base una determinada prctica dietaria (rica en alimentos funcionales), y no en los compuestos individuales presentes en stos alimentos, se considera necesario llevar a cabo rigurosos estudios de caracterizacin qumica para determinar los compuestos individuales y las cantidades, que estn presentes en stos alimentos con propiedades beneficiosas. Utilizando para esto mtodos correctamente estandarizados, intentando establecer la eficiencia de absorcin en el tracto gastrointestinal, su biodisponibilidad y sus mecanismos de accin para posteriormente realizar recomendaciones para el consumo humano. Hasta el momento las evidencias cientficas son insuficientes y la mayor parte de la informacin proviene, con excepcin de los estudios epidemiolgicos, de estudios experimentales realizados en condiciones in vitro, adems poco se conoce sobre su metabolismo, distribucin en tejidos especficos, as como de la interaccin con metabolitos de relevancia biolgica como por ejemplo la molcula de ADN, los lpidos, las protenas, bien como las lipoprotenas (plasmticas o celulares) son objetivos poco explorados que requieren de mayores estudios para as comprender el efecto biolgico ejercido. En sta revisin se resumen los datos relacionados con los efectos antioxidantes de las frutas rojas particularmente ricas en antocianos, su metabolismo,

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Ramrez et al.

Propiedades antioxidantes de las frutas rojas

biodisponibilidad y distribucin tecidual. La propuesta radica en comparar de forma crtica la significancia biolgica de los resultados obtenidos en condiciones in vitro en relacin a los observados in vivo, particularmente, nos centraremos en la interaccin con la molcula de ADN y con los lpidos, como ejemplos ilustrativos de las complejas interacciones entre las molculas alimenticias y la respuesta de la clula/tejido. Metabolitos secundarios Las plantas producen una serie de compuestos orgnicos que no participan de forma directa en el desarrollo y crecimiento de las mismas. Esas substancias fueron tradicionalmente denominadas como metabolitos secundarios. De acuerdo con la nomenclatura adoptada por la British Nutrition Foundation, los metabolitos secundarios pueden ser divididos en 4 grupos mayoritarios: los compuestos polifenolicos e fenolicos los cuales corresponden aproximadamente a 8000 compuestos, los terpenoides ste grupo comprende cerca de 25000 compuestos, los alcaloides alrededor de 12000 (Goldberg, 2003). Los polifenoles, se caracterizan por presentar un anillo aromtico y un anillo benceno con uno o ms grupos hidroxilados incluyendo derivados funcionales, como por ejemplo steres, metilsteres, glucsidos, etc. Entre los mismos, se pueden distinguir dos grandes grupos los no flavonoides (acidos fenlicos, estilbenos, taninos hidrolizables) y los flavonoides (flavonas, Isoflavonas, flavonoles, flavanoles, antocianos, flavanonas, taninos condensados) (Manach et al., 2005). Los polifenoles en general son capaces de eliminar O2, O2, OH, NO y radicales libres alquilos y peroxilos, a travs de su capacidad de donar electrones, generando un radical fenoxilo estable. Los flavonoides que poseen un grupo O dihidroxifenilo como anillo B y un anillo C saturado, como las catequinas y algunas procianidinas, poseen el lugar de contacto con los radicales libres en el anillo B, y la sustitucin del anillo A solamente presenta una influencia limitada en los potenciales de reduccin del radical semiquinona formado, que se muestra relativamente estable. Las galocatequinas, con un anillo B 3, 4, 5trihidroxifenilo, eliminan radicales libres de una forma ms eficaz que las catequinas. Tambin, la galoilacin junto con el grupo 3, 4, 5trihidroxifenilo en la molcula, favorece la capacidad de eliminacin de radicales (RiceEvans et al., 1997).
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Esa propiedad antioxidante es de inters tanto tecnolgico como nutricional debido a que estos compuestos son antioxidantes naturales presentes en los alimentos de origen vegetal, por tanto la elaboracin de alimentos con una elevada concentracin de compuestos fenolicos supone una reduccin en la utilizacin de aditivos antioxidantes y de esa forma se obtendran alimentos ms saludables, que inclusive podran ser considerados como alimentos funcionales (MartnezValverde, 2000). Desde el punto de vista nutricional, este poder antioxidante se relaciona con el papel preventivo en diversas enfermedades crnicas no transmisibles como por ejemplo, las enfermedades cardiovasculares, cncer entre otras patologas, as como en el proceso normal y patolgico de envejecimiento, por ese motivo est siendo intensamente estudiado mediante ensayos tanto in vivo como in vitro (Li et al., 2009; Katsube et al., 2003; Dai et al., 2009). Adems a diferencia de otros antioxidantes presentes en la dieta como por ejemplo, el cido ascrbico y el - tocoferol que actan en medio acuoso y/o en la membrana fosfolipdica los polifenoles en cambio, son capases de actuar en ambas fases y a pesar de la reconocida capacidad antioxidante in vitro de estos compuestos su eficacia in vivo debe ser mas estudiada debido a que existen pocos datos con relacin a su biodisponibilidad. Los mecanismos de la absorcin gastrointestinal de los compuestos fenolicos son desconocidos. Estos compuestos se caracterizan por ser hidroflicos y por ese motivo no podran penetrar la barrera intestinal mediante difusin pasiva. Hasta el momento, el nico transportador activo de membrana descrito, que podra estar involucrado en la absorcin de stos metabolitos, es un mecanismo de transporte sodio dependiente vinculado con la absorcin de cido ferlico y cinmico en el intestino de roedores (Ader et al., 1996). Los flavonoides en general, con excepcin de los flavanoles se encuentran glicosilados o glucosilados en los alimentos, por ese motivo no pueden ser clivados por las enzimas digestivas humanas. Sin embargo estudios recientes demostraron aproximadamente, un 50% de absorcin para determinados flavonoides (Passamonti et al., 2003, 2005; Matuschek et al., 2006). En un estudio realizado con seres humanos a los cuales se les administr glicsidos de quercetina, fue observado que la absorcin ocurre aproximadamente 0,50,7 h despus de producirse la ingestin de quercetina 4glucsido

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y 69 h despus de la ingestin de rutina (quercetina 3rutinsido). Demostrndose a partir de stos resultados, que la absorcin de los glucsidos de quercetina ocurre en el intestino delgado, siendo la eficiencia de absorcin superior que la eficiencia de absorcin de sus agliconas. Por otro lado, los polifenoles que poseen una unidad ramnosa antes de ser absorbidos, son hidrolizados en el colon por las ramnosidasas presentes en la microflora intestinal (Hollman y Katan, 1999; Morand et al., 2000; Crespy et al., 2002; Mullen et al., 2002). En este mismo sentido, la deteccin en la sangre portal y mesentrica de metabolitos glucuronidados despus de realizar una perfusin con polifenoles en el intestino delgado de ratas comprueba que la glucuronidacin de estos compuestos ocurre en primer lugar en los enterocitos antes de que sean ms conjugados en el hgado (Sfakianos et al., 1997; Spencer et al., 2001). Probablemente, ste mismo proceso ocurre en seres humanos, debido a que se ha comprobado en condiciones in vitro, que la glucuronidacin de quercetina y luteolina en microsomas del intestino es ms elevada que la glucuronidacin existente en microsomas del hgado humano (Boersma et al., 2002). La absorcin y distribucin de estos compuestos tambin fue analizada utilizando mtodos cromatogrficos, en diversos tejidos de roedores como cerebro, clulas endoteliales, corazn, rin, bazo, pncreas, prstata, tero, ovario, glndula mamaria, testculos, vejiga, hueso y piel (Youdim et al., 2003; Maubach et al., 2003). En esos estudios fueron determinadas concentraciones que se extienden entre 30 a 3000 ng aglicona eq/g de tejido dependiendo de la dosis administrada y del tejido estudiado (Coldham y Sauer, 2000). En ste estudio fue tambin demostrado que despus de la administracin de altas concentraciones de quercetina (aglicona), ste compuesto as como sus metabolitos se distribuyen en diversos tejidos, alcanzando una concentracin de nanomoles por gramo de tejido, siendo que la concentracin ms alta fue detectada en pulmones y la ms baja en cerebro y bazo de ratas y de cerdos (de Boer et al., 2005). En seres humanos la cantidad absorbida es muy baja, siendo el acido galico y las isoflavonas los compuestos que mejor se absorben (0,22-1,8 mol/L y 0,5-1,65 mol/L respectivamente), seguidos por flavanonas y por quercetin glicosideo. Entre los fitoquimicos menos absorbidos se encuentran las proantocianidinas y los antocianos, las
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concentraciones detectadas oscilan entre 10-97 nmol/L dependiendo de la dosis administrada (Shahrzad et al., 2000; Goldberg et al., 2003; Graefe et al., 2001; Zubik y Meydani, 2003; Setchell et al., 2003; Manach et al., 2005). No obstante, experimentos realizados en condiciones in vitro demuestran un significativo poder antioxidante en concentraciones que oscilan entre 0,1 a 100 mol/L (Ludwig et al., 2004). De acuerdo con datos de la literatura cientfica, los niveles fisiolgicos se encuentran aproximadamente en 1 mol/L; por ese motivo se sugiere que no todos los polifenoles ingeridos presentan poder antioxidante. Inclusive ciertos compuestos testados no poseen relevancia biolgica in vivo y adems, durante el proceso de absorcin y metabolizacin gastrointestinal pueden ocurrir modificaciones qumicas, generalmente no consideradas debido a que la mayora de los estudios experimentales realizados fueron hechos en condiciones in vitro (por ejemplo cultivo de clulas) y los compuestos de inters fueron simplemente adicionados a los mismos, obviamente esas investigaciones no representan el metabolismo real de los fitoquimicos en condiciones in vivo, adems excluyen las posibles interacciones con otras molculas, as como las actividades sinrgicas y aditivas entre los componentes presentes en el extracto y/o alimento. En ese mismo sentido, los efectos de la matriz de los alimentos sobre la biodisponibilidad de los compuestos fenolicos es un hecho que tampoco se ha estudiado en detalle, podran darse interacciones entre stos compuestos y otros componentes presentes en los alimentos, como protenas y polisacridos, afectando de sta forma el proceso de absorcin de los mismos. Igualmente factores como el pH gstrico e intestinal, fermentaciones intestinales y la excrecin biliar, podran tambin afectar la absorcin de los polifenoles (Manach et al., 2004). Consecuentemente, estos diseos experimentales proporcionan informacin limitada y por ese motivo debe existir cautela antes de realizar una extrapolacin directa de los resultados obtenidos en condiciones in vitro a in vivo. Porque los efectos moleculares de los polifenoles observados en condiciones in vitro pueden no ser relevantes in vivo, como sugerido por varios autores (Manach et al., 2005).

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Antocianos En la actualidad, este grupo de compuestos fenolicos presentan un gran inters nutricional por su contribucin al mantenimiento de la salud humana. Asimismo, varias de las propiedades beneficiosas descritas en las frutas rojas, estn vinculadas con la presencia y el contenido de antocianos (Ramirez et al., 2005; Dai et al., 2009). Los antocianos, son pigmentos flavonlicos, que presentan una estructura qumica adecuada para actuar como agentes antioxidantes, donar hidrgenos o electrones a los radicales libres, as como capturarlos y desplazados en su estructura aromtica (Heim et al., 2002). La capacidad antioxidante de los mismos, se relaciona con la presencia de grupos hidroxilos en las posiciones 3 y 4 del anillo B, los cuales conceden estabilidad al radical formado. Por otro lado los grupos hidroxilos libres en las posicin 3 del anillo C y en la posicin 5 del anillo A, en conjunto con el grupo carbonilo en la posicin 4 actan como donadores de electrones (Tsuda et al., 1994; Espin et al., 2000; Prior y Wu, 2006.). Los antocianos, tambin conocidos como antocianinas y sus agliconas como antocianidinas, son los principales responsables del color caracterstico de las frutas rojas y vinos tintos. En la Tabla 1 se indican los diferentes nombres que reciben estos compuestos segn sean las sustituciones R1 y R2 (Tsuda et al., 1994).
Tabla 1. Nomenclatura de los antocianos. R1 OH OH OH OCH3 OCH3 R2 H OH OCH3 H OCH3 Compuesto Cianidina Delfinidina Petunidina Peonidina Malvidina

Las propiedades beneficiosas de los antocianos se han puesto de manifiesto en diferentes estudios, in vivo como in vitro realizados tanto en animales de experimentacin como en seres humanos. Si bien no se conocen los mecanismos de absorcin gastrointestinal de los compuestos fenolicos, se considera que los antocianos constituyen una excepcin a la regla, debido a que se han encontrado glicsidos intactos en el plasma, autores sugieren que este hecho podra estar relacionado con la
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inestabilidad de estos compuestos cuando se encuentran como agliconas o a la existencia de un mecanismo particular de absorcin e metabolismo para estos compuestos (Passamonti et al., 2005; Joseph et al., 2005). En ese sentido Passamonti et al. (2003), proponen un sistema de transporte para los antocianos por medio de translocasas a nivel gstrico, basndose en el hecho de que estos compuestos presentan una importante afinidad por el sistema previamente mencionado. Otros autores postulan que los antocianos podran ser convertidos en glucurnidos por la accin de una de las enzimas UDP glucosa deshidrogenada (Wu et al., 2005). Similarmente Felgines et al. (2002) comprobaron que despus de 8 das de administracin de extracto de blackberry, los antocianos pueden ser detectados de forma intacta o bien metilada, en la orina de estos animales demostrando de esa forma que su viabilidad es muy baja comparada con otros flavonoides (Ohnishi et al., 2006). Otros investigadores analizaron la distribucin de estos compuestos en diversos tejidos, confirmando la presencia de antocianos glicosilados como la cianidina, la peonidina y la delfinidina, y de sus agliconas, glucuronideos y derivados metilados en diversos tejidos como estomago, intestino delgado, hgado, rin, ojos y cerebro. Asimismo se ha comprobado que en estos 2 ltimos tejidos (ojos y cerebro) estos compuestos pueden ser detectados despus de media hora de administracin siendo que la cantidad total determinada oscila entre 100 a 200 ng/g (Passamonti et al., 2003, 2005; Manach et al., 2005; Matuschek et al., 2006). Del mismo modo, evidencias recientes indican que los antocianos son absorbidas y metabolizados en seres humanos y que sus metabolitos pueden ser detectados en la orina 24 h despus de la administracin y que los mismos conservan su estructura bsica. Resultados farmacocineticos demuestran que la concentracin de los glucsidos y sus derivados glucuronidos pueden ser detectados en sangre entre las 0-5 h despus de la ingesta, y que dentro de ese periodo, se observa un aumento en el grado de metilacin. Por ese motivo los autores sugieren que la bioactividad de los antocianos est probablemente condicionada a un determinado periodo de tiempo el cual estara relacionado con su transformacin metablica (Mazza, 2002; Prior y Wu, 2006)

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Del mismo modo se ha investigado la viabilidad de los antocianos utilizando diferentes dosis, fuentes (tipo de berry) y matrices (jugo, extracto, capsulas). Confirmndose que los mismos son rpidamente absorbidos, y pueden ser detectados 1,5 h despus de la administracin. Los autores sugieren que el proceso de absorcin ocurre probablemente en el estomago y/o en el intestino delgado (Manach et al., 2005; Prior y Wu, 2006). Sin embargo, las concentraciones plasmticas detectadas varan significativamente y en general se detectan niveles muy bajos menores a 1 M. Los autores tambin sugieren, que la actividad de la microflora del colon y la baja estabilidad de los antocianos frente al pH del intestino, serian en parte responsables por la conversin de estos compuestos en molculas menores, y que los mismos son eliminados a travs de la urina entre las 4-6 h despus de la administracin. Considerando que la proporcin de los antocianos excretados es menor al 0,1% de la suma total ingerida, gran parte del metabolismo de estos compuestos no esta completamente dilucidado. (Prior y Wu, 2006). Efectos fisiolgicos asociados a los antocianos Los efectos fisiolgicos dos antocianos se deben a su estructura qumica, siendo sus principales propiedades la capacidad de eliminar radicales libres, efectos sobre la fluidez de la membrana plasmtica, efecto antiinflamatorio y antinociceptivo, efecto cardioprotector y neuroprotector efecto antimutagnico, efecto anticarcinognico, efecto antivrico y antibacteriano (Espin et al., 2000; Cheplick et al., 2007). Dentro de estas propiedades la capacidad antioxidante es una de las ms analizadas. Diferentes estudios ponen de manifiesto que el poder antioxidante de los antocianos y de sus agliconas es equivalente a las vitaminas C y E, y que la capacidad de capturar radicales libres est directamente relacionada con el efecto anticarcinognico de estos compuestos (Bagchi et al. 1998). Resultados similares obtuvieron Narayan et al. (1999), al comparar la capacidad antioxidante de los antocianos con tocoferol, hidroxianisol butirato e hidroxitolueno butilado. Adems parece ser que existe una correlacin linear entre la cantidad de antocianos totales y la capacidad antioxidante en diversas frutas como: blackberries, red raspberries, black raspberries y strawberries (Henoinen et al., 1998; Kakonen et al., 1998, Sellappan et al., 2002).
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En nuestro laboratorio se han realizado varios estudios sobre la capacidad antioxidante de extractos provenientes de diferentes cultivares de Vaccinium ashei y de Rubus sp., utilizando la tcnica de 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), demostrndose que el extracto total, las fracciones aisladas (flavonidica, o cidos fenlicos) como tambin antocianos aislados exhiben significativo poder antioxidante cuando comparados al TROLOX (anlogo de la vitamina E). Se ha comprobado tambin que el extracto de Rubus presenta efecto antiinflamatorio en ratas, se cree que sta propiedad se debe a la capacidad de los antocianos para disminuir la liberacin de citocinas. Adems, los antocianos pueden efectuar su actividad antiinflamatoria debido principalmente a su capacidad para inhibir la liberacin del cido araquidnico, asi como las enzimas ciclooxigenasa y lipooxigenasa, o bien debido a la fosforilacin de protenas especficas causantes de la activacin de las mismas (Ramirez et al., 2009). Similarmente, Seeram y Nair (2002), tambin comprobaron que en condiciones in vitro, el poder antioxidante de los antocianos individuales esta directamente relacionado con la estructura qumica de los mismos, y que la eficacia aumenta de forma proporcional al nmero de grupos OH en el anillo B, y en el caso de la cianidina en particular, la presencia de unidades glicosiladas en la posicin 3 del anillo C decrece la actividad antioxidante, resultados similares fueron obtenidos por Tsuda et al.(1994). Matsumoto et al. (2004) analizaron los efectos de la administracin de extracto de chockeberry en un modelo animal de lesiones gstricas hemorrgicas inducidas con etanol, comprobando que el extracto exhibe propiedades teraputicas y/o preventivas gastrointestinales. Del mismo modo se ha evaluado la capacidad antioxidante de stas frutas rojas sobre la oxidacin de las LDL, demostrndose que el extracto de chokeberry y uvas disminuye los niveles sricos de colesterol total y triglicridos, al mismo tiempo que provoca un aumento de los niveles de colesterol ligado a HDL y una disminucin de los niveles de colesterol ligado a LDL y VLDL (Valcheva-Kuzmanova et al., 2007). Adicionalmente, Cooper et al. (2004) han demostrado en seres humanos, que el consumo moderado de vino tinto durante 10 das (200 mL), reduce los niveles de colesterol/LDL. Por otra parte se ha comprobado que extractos provenientes de diferentes cultivares de Rubus,

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pueden inhibir la actividad de las enzimas -amilasa, -glucosidasa y de la enzima conversora de angiotensina-1 (ACE) in vitro, las cuales estn asociadas con la diabetes del tipo II e hipertensin respectivamente (Cheplick et al., 2007). Asimismo Herrera-Arellano et al. (2007), comprobaron que el extracto de Hibiscus sabdariffa, rico en antocianos, disminuye la presin sangunea y reduce la actividad de ACE en pacientes hipertensos. Las propiedades antimutagnicas y anticarcinognicas de los antocianos se han puesto de manifiesto en numerosos estudios tanto in vitro como in vivo (Duthie et al., 2007). Segn datos bibliogrficos, durante el proceso de desarrollo del cncer se producen una secuencia de eventos denominados como iniciacin (induccin de mutaciones en el ADN), promocin (expansin tumorognica) y progresin (conversin de un tumor benigno/maligno a cancergeno). En ste sentido, debe considerarse el hecho de que una vez iniciado este proceso el mismo es prcticamente irreversible, por ese motivo es importante prevenir el desarrollo del cncer, e identificar los compuestos que puedan inhibir la propagacin del tumor cancergeno. De acuerdo con datos bibliogrficos, los puntos mas importantes que deben ser controlados son la produccin de hidroperxido, el incremento de la sntesis de ADN y la induccin de la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa (Li et al., 2009; Katsube et al., 2003). Para protagonizar un efecto real in vivo, los compuestos de inters deben ser absorbidos de la dieta y dirigidos hacia los rganos diana. En un estudio realizado in vivo, por Ramirez-Tortosa et al. (2001) con un extracto rico en antocianos (delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina, 1 g/kg) fue comprobado que cuando combinados stos compuestos, se observa una mejora significativa de la capacidad antioxidante plasmtica en los animales tratados y que adems existe una disminucin en los niveles de hidroperoxidos y 8oxo-deoxiguanosina en el hgado de esos animales, ambas sustancias son marcadores especficos de la dieta deficiente en vitamina E, e indicadores de peroxidacin lipidica y de dao endgeno en la molcula de ADN. Similarmente Duthie et al. (2004), investigaron las consecuencias de una dieta deficiente en vitamina E, juntamente con el efecto citoprotector del antociano cianidina (100 mg/kg) sobre la molcula de ADN y los lpidos celulares, utilizando un modelo in vitro de cultivo de clulas y otro in vivo en ratas previamente
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tratadas con los extractos. Observaron que, los niveles plasmticos y hepticos de -tocoferol en ratas, disminuyen significativamente despus de 12 semanas de tratamiento; la peroxidacin lipdica se incrementa significativamente en plasma, hgado y clulas sanguneas. Adicionalmente los niveles de especies reactivas de oxgeno y de piruvato kinasa estn aumentados en fagocitos y plasma. Por otro lado, los bajos niveles de vitamina E no alteran la estabilidad del ADN en linfocitos de ratas, hgado o colon. Similarmente el tratamiento con cianidina-3glicosideo no altera la peroxidacin lipdica o el ADN en ratas. Sin embargo produce un efecto quimioprotectivo en la molcula de ADN en colonocitos humanos como resultado del tratamiento con antocianos. Si bien se conoce que la vitamina E altera los niveles de oxidacin lipdica in vivo, su papel en el mantenimiento de la estabilidad del ADN todava no fue completamente dilucidado. Asimismo fue observado que el tratamiento con cianidina-3glicosideo protege a la molcula de ADN del dao oxidativo in vitro, en concentraciones nutricionalmente relevantes no altera el dao oxidativo in vivo. Los autores sugieren que esta discrepancia entre los resultados observados en condiciones in vitro/in vivo est relacionado con la baja biodisponibilidad y al metabolismo de los antocianos. Otros autores comprobaron, que es posible reducir hasta 50% la oxidacin de bases de la molcula de ADN despus del tratamiento con Aronia melanocarpa ELLIOT (black chokeberry), en colonocitos humanos extrados por biopsia. Estos autores determinaron, el dao endgeno bien como el dao inducido con perxido de hidrgeno (Rechkemmer y Pool-Zobel, 1998). Asimismo, PoolZobel et al. (1999) demostraron que compuestos aislados y purificados a partir de Aronia melanocarpa ELLIOT reducan el dao de ADN inducido por perxido de hidrogeno en una lnea de clulas tumorales humana, no obstante el tratamiento no altera el dao endgeno de la molcula de ADN. Tambin observaron que los compuestos purificados tanto las agliconas como los glicosideos presentan el mismo poder antioxidante, estos resultados sugieren que los antocianos podran ejercer efectos protectores en tejidos especficos como por ejemplo el colon humano. Del mismo modo, Lazz et al. (2003) comprobaron que el pretratamiento con antocianos y sus derivados: delfinidina y cianidina, protegen a la molcula de ADN del dao inducido con tert-butil-

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hidroperxido en msculo liso y en una lnea celular de hepatoma de ratos. Tambin observaron que stos compuestos inhiben la citotoxicidad, la peroxidacin lipdica y la formacin de aductos en la molcula de ADN, por el contrario, no modifican el estado redox de la clula y tampoco la oxidacin de bases de la molcula de ADN. No obstante, la presencia de azcar en la estructura de la molcula reduce el efecto protectivo principalmente en las clulas de hepatoma de ratos. Estos resultados ponen de manifiesto que existe una relacin estructura/funcin de los antocianos y de sus derivados, y que inclusive la sensibilidad especfica de cada tejido frente al estres oxidativo, la distribucin y localizacin intracelular de estos compuestos determinan el efecto protector. Diferentes estudios de intervencin nutricional ponen de manifiesto que extractos provenientes de frutas rojas en general as como sus antocianos aislados e purificados disminuyen o retardan los efectos deletreos relacionados con la edad e inclusive previenen enfermedades neurolgicas y alteraciones cognitivas. Del mismo modo fue demostrado que los antocianos presentes en esos extractos atraviesan la barrera hematoenceflica, y ejercen efectos en diversas estructuras cerebrales como crtex, cerebelo e estriado (Passamonti et al., 2003, 2005; Youdim et al., 2003, 2004; Andrs-Lacueva et al., 2005). En nuestro laboratorio se ha estudiado el efecto de la suplementacin por 30 das con extracto de blueberry (3.2 mg/kg/dia de antocianos) en cerebro de ratones, demostrandose que el extracto total ejerce un efecto protector del dao endgeno de la molcula de ADN en hipocampo y cortex cerebral de estos animales, por el contrario no presenta efectos protectivos frente al dao inducido con peroxido de hidrogeno en las mismas estructuras cerebrales. Para algunos autores estos resultados sugieren que los antocianos presentes en el extracto, forman un complejo con la cadena de ADN estabilizando de esta forma a la molcula frente al dao oxidativo (Ramirez et al., 2005; Barros et al., 2006). Resultados similares fueron encontrados en ratas idosas, despus de la suplementacion por un perodo de 6 meses con el mismo extracto no se observaron efectos protectores en la integridad de la molcula de ADN, no obstante despus de la induccin de dao con perxido de hidrgeno se comprob que el extracto protege de forma significativa al ADN en el crtex cerebral de los ratos tratados; por lo que se piensa que esos resultados estaran relacionados con las modificaciones en las propiedades fsicas de la
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membrana plasmtica relacionadas con el proceso de envejecimiento (por ej. rigidez), este hecho puede condicionar la distribucin intracelular de los componentes del extracto, as como los efectos biolgicos de ste (Ramirez et al., 2008). Noda et al. (2002) comprobaron que las antocianidinas aisladas y purificadas a partir de Punica granatum L.: delfinidina, cianidina y pelargonidina, inhiben en ese orden la peroxidacin lipdica inducida por perxido de hidrgeno en cerebro de ratas en condiciones in vitro. Asimismo, Narayan et al. (1999), demostraron que los antocianos aislados disminuyen significativamente la autoxidacin y la peroxidacin lipdica de forma no competitiva, en un modelo in vitro de peroxidacin lipdica enzimtica y no enzimtica. Similarmente, resultados provenientes de nuestro laboratorio demostraron que el extracto de Rubus promueve lipoperoxidacin en hipocampo, estriado y crtex cerebral de ratas despus de 30 das de suplementacin (3,2 mg/kg/da de antocianos). No obstante, fueron observados efectos protectivos despus de la suplementacin por 30 das con cianidina aislada a partir de la misma fruta (Ramirez et al., 2008). Tambin se ha observado que el extrato total de Rubus induce un aumento significativo de glutamato en ambas estructuras cerebrales estudiadas (cortex, hipocampo), en cambio la suplementacin con cianidina 3 glicosideo produce una reduccin significativa en las cantidades totales de ese neurotransmisor (Ramirez et al., 2009). De acuerdo con la literatura un aumento en las concentraciones de glutamato est asociado a la formacin de radicales libres. Como consecuencia de estos antecedentes, en nuestro laboratorio decidimos estudiar el efecto antinociceptivo del extracto de mirtilo. Comprobando que despus de 21 das de suplementacin oral, el extracto ejerce un efecto antinociceptivo de forma dosis dependiente por mecanismos todava desconocidos (Ramirez et al., 2009). No obstante, intervenciones dietticas realizadas en seres humanos muestran resultados controvertidos, se ha comprobado en individuos voluntarios que el tratamiento con aronia, blueberry y boysenberry, ejerce un efecto protector de la integridad del ADN (efecto antigenotxico), en clulas mononucleares (Rechkemmer y Pool-Zobel 1998). Del mismo modo, se ha observado que el consumo por 4 semanas de jugo proveniente de una mezcla de diferentes tipos de berries produce un disminucin del dao oxidativo

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celular y un aumento en los niveles de glutatin reducida (Weisel et al., 2006). Contrariamente, en otro estudio donde los voluntarios fueron divididos en dos grupos: el primer grupo recibi jugo de blackcurrant y el segundo grupo jugo de antocianos purificados a partir de la misma fruta durante un periodo de 3 semanas, no se observaron diferencias significativas en marcadores de dao del ADN entre los grupos tratados y controles (Moller et al., 2004). Senthilmohan et al. (2003) utilizaron el extracto comercial denominado Enzogenol, en un estudio donde individuos adultos de entre 55 a 75 aos de edad, recibieron 240 mg de Enzogenol y 120 mg de vitamina C durante un periodo de 6 o 12 semanas. Los autores demostraron que despus de 12 semanas de tratamiento se observ una reduccin en el dao endgeno de ADN en clulas sanguneas como en la oxidacin de protenas en suero. Por otra parte, se ha comprobado que si bien la capacidad antioxidante plasmtica es un indicador adecuado del estatus antioxidante, los marcadores biolgicos de estrs como de dao oxidativo se encuentran en niveles muy bajos en los individuos voluntarios (Mazza et al., 2002). Por ese motivo, en estudios subsecuentes se utilizaron voluntarios que habitualmente viven en condiciones de estrs, por ejemplo, fumadores, obreros que utilizan la fuerza muscular para realizar sus tareas o tambin individuos que pertenecen grupos de riesgo previamente identificados, dentro de este contexto fue observado que la ingesta de cpsulas de blackcurrant produce un incremento del flujo sanguneo perifrico y que tambin alivia la fatiga muscular caracterstica de las personas que realizan trabajos fsicos repetitivos (Matsumoto et al., 2005). Similarmente fue comprobado que el consumo de jugo de chokeberry estimula las defensas antioxidantes endgenas y limita el dao oxidativo despus de ejercicios fsicos regulares (PilaczynskaSzcesniak et al., 2005). Asimismo, en fumadores crnicos la ingesta prolongada de blueberry, reduce los niveles de lpidos hidroxiperxidos (McAnulty et al., 2005). En pacientes que padecieron ataque isqumico y que bebieron jugo de chokeberry en combinacin con estatina, durante 6 semanas, se observ una reduccin en los niveles sricos de isoprostanos y de LDL oxidada y un incremento de adiponectin y reduccin de la presin sangunea y consecuentemente una reduccin significativa de la inflamacin (Naruszewicz et al., 2007).

Por otro lado, varios autores describen que las propiedades antioxidantes de los compuestos fenlicos son reducidas in vivo por causa de su afinidad por las protenas (Serafn et al., 2009). Estudios recientes evaluaron la disponibilidad de los polifenoles en plasma de voluntarios humanos despus de la ingestin de jugo de blueberry sin leche y asociado con leche, las muestras de plasma fueron colectadas 1, 2, y 5 h despus de la ingesta. Los individuos que consumieron nicamente blueberry presentan un aumento en las concentraciones de los marcadores plasmticos cido ferlico y cido cafeico. En contraste, la ingesta de blueberry con leche produce una disminucin de stos compuestos, es decir no se detect un aumento en la capacidad antioxidante en el plasma. Esos resultados sugieren que la ingestin de blueberry en asociacin con leche perjudica las propiedades antioxidantes y reduce la absorcin in vivo de los compuestos bioactivos presentes en esas frutas (Serafn et al., 2009). CONCLUSIN Notablemente, numerosos trabajos cientficos demostraron una asociacin entre el consumo de frutas y verduras con el bajo riesgo de padecer ciertas enfermedades crnico-degenerativas, esa propiedad fue atribuida principalmente a la capacidad antioxidante de los componentes de esos alimentos. Si bien un amplio espectro de compuestos con propiedades antioxidantes estn presentes en los alimentos de origen vegetal en general, es necesario considerar que la capacidad antioxidante puede ser perdida o reducida durante el proceso de absorcin debido a la transformacin metablica que est comnmente asociada con la conjugacin de molculas. Adems las molculas que presentan una estructura qumica compatible con la propiedad antioxidante en condiciones in vitro podran in vivo ejercer otros efectos independientes de sus propiedades antioxidantes, por ejemplo alterar la actividad de ciertas enzimas, unirse a determinados receptores de membrana, o a receptores nucleares como ligando o imitadores. Otro importante aspecto a considerar son los efectos ejercidos por compuestos aislados con relacin a las matrices complejas que contienen una amplia gama de compuestos que interaccionan entre si. Deben ser realizadas ms investigaciones para explorar el mecanismo de accin de esos compuestos aislados, y de esta forma utilizarlos como referencia para el estudio de matrices complejas.

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Actualmente tambin se considera a la dieta como un factor clave para el mantenimiento de la estabilidad genmica, considerando que diversos micronutrientes son coenzimas de enzimas vinculadas con la sntesis y la reparacin de la molcula de ADN, otro aspecto que necesita ser mejor dilucidado es la interaccin de los compuestos fenolicos in vivo con metabolitos de relevancia biolgica como la molcula de ADN, las protenas y los lpidos. Esas interacciones, probablemente, desempean un importante papel en los efectos biolgicos comprobados de esos compuestos. Con relacin a este punto surge un nuevo paradigma, cul es la dosis adecuada de compuestos individuales o de extracto total que podr ejercer un efecto biolgico? Durante cunto tiempo deber ser realizada la suplementacin y cul es el momento adecuado para iniciar sta? En ese sentido tambin necesitan ser realizados estudios de toxicidad, principalmente para los trabajos en los cuales las suplementaciones son realizadas durante un periodo de tiempo prolongado. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 469 - 478 BLACPMA ISSN 0717 7917 Revisin | Review

Antioxidantes en berries nativos chilenos


[Antioxidants in Chilean native berries]
Carolina FREDES Facultad de Agronoma e Ingeniera Forestal, Pontificia Universidad Catlica de Chile, Santiago, Chile.

Abstract
Among plant natural products, interest in polyphenols is mainly due to its antioxidant properties. Many fruits recognized as berries have higher antioxidant capacity than other fruits and vegetables. In Chile, there are native berries with medicinal uses deep-rooted to mapuche culture and country people that have been studied by researchers both nationally and internationally. The aim of this article was to review the state of the art related to polyphenols identification, antioxidant capacity and polyphenols bioavailability of four native berries. Maqui fruits distinguish significantly for their polyphenols content and antioxidant activities. Research in Magellan barberry (calafate), Chilean guava (murta or murtilla) and Chilean strawberry deliver relative contributions of their antioxidant properties. However, higher scientific background is needed to validate the properties of these species so as to achieve a real appreciation of these unique raw materials for the development of functional foods and nutraceuticals. Keywords: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia; Polyphenols.

Resumen
Dentro de los productos naturales de origen vegetal, el inters por los polifenoles se debe principalmente a sus propiedades antioxidantes. Muchos frutos conocidos como berries presentan capacidades antioxidantes ms altas, en relacin a otras frutas y verduras. En Chile, existen berries nativos con usos medicinales muy arraigados a la cultura mapuche y rural del pas, que han sido estudiados tanto por investigadores nacionales como internacionales. El objetivo de esta publicacin fue revisar el estado del arte relacionado a la identificacin de polifenoles, la capacidad antioxidante y la biodisponibilidad de compuestos polifenlicos de cuatro berries nativos. Los frutos de maqui destacan significativamente por sus contenidos de polifenoles y capacidad antioxidante, e investigaciones en calafate, murtilla y frutilla chilena entregan aportes relativos a sus propiedades antioxidantes. Sin embargo, an, son necesarios mayores antecedentes cientficos que validen las propiedades de estas especies de manera de lograr su real valorizacin como materias primas nicas, para el desarrollo de alimentos funcionales y nutracuticos. Palabras Clave: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Fragaria chiloensis; Berberis buxifolia; Polifenoles. AOX, antioxidantes; AT, antocianos totales; BNCh, berries nativos chilenos; CA, capacidad antioxidante; DAD, detector con arreglo de diodos; ESI, Electro Spray Ionization, fma, forma botnica; ssp, sub-especie botnica; HPLC, cromatografa lquida de alta resolucin; ; PT, polifenoles totales; UV-vis, ultravioleta-visible; var, variedad.
Recibido | Received: May 15, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: July 27, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was not financed. This article must be cited as: Carolina Fredes. 2009. Antioxidantes en berries nativos chilenos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):469 478. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email cpfredes@uc.cl

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INTRODUCCIN Los productos naturales (metabolitos secundarios) son compuestos orgnicos, producidos por las plantas, que parecen no tener una funcin directa sobre su crecimiento y desarrollo (Taiz y Zeiger, 1991). Estos compuestos no tienen un rol reconocido sobre procesos como la fotosntesis, asimilacin de agua y nutrientes y la respiracin celular (Salisbury y Ross, 1994); sin embargo, tienen un rol importante en la defensa y adaptacin de las plantas a su ambiente y como fuentes de principios activos con uso farmacutico y alimenticio (Croteu et al., 2000). De acuerdo al origen de sus rutas de biosntesis, los productos naturales se dividen en terpenos o terpenoides, polifenoles y alcaloides. El inters principal sobre los polifenoles se debe a sus propiedades antioxidantes (AOX). Manach et al. (2004) clasifica los polifenoles de acuerdo al nmero de anillos aromticos de sus estructuras qumicas y las formas en que estos anillos se unen entre s. De acuerdo a esta clasificacin, los polifenoles se dividen en no flavonoides (cidos fenlicos), donde se encuentran los cidos hidroxibenzoicos (cido elgico) e hidroxicinmicos (cido cafeico), flavonoides, estilbenos y lignanos. Los flavonoides que poseen dos anillos aromticos, unidos por tres carbonos que forman un heterociclo oxigenado, se subclasifican en flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianidinas y flavanoles. Adems de esta variedad de molculas, las antocianidinas se pueden unir a diferentes azcares en distintas posiciones formando los antocianos. Por otro lado, los cidos hidroxibenzoicos (cido elgico) son componentes de compuestos de estructuras complejas como los taninos hidrolizables (elagitaninos) presentes en frutillas, frambuesas y moras, entre otras (Clifford y Scalbert, 2000). Los flavonoides (Espin et al., 2000; Heim et al., 2002) muestran una gran capacidad para captar radicales libres causantes del estrs oxidativo, atribuyndoseles a su vez un efecto beneficioso en la prevencin de enfermedades cardiovasculares, cancergenas y neurolgicas (Ishige et al., 2001; Katsube et al., 2003; Schramm y German, 1998). Existen diversos mtodos para evaluar la capacidad antioxidante (CA) (Gil et al., 2000; Mermelstein, 2008), ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias ms aplicadas en las determinaciones
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de la CA total in vitro de un compuesto, mezcla de AOX o alimento consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromgenas de naturaleza radicalaria, en que la prdida de color ocurre de forma proporcional con la concentracin. No obstante, las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro dan tan slo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo. Los resultados de la CA in vivo de muchos polifenoles pueden diferir significativamente de los resultados in vitro (Manach et al., 2005; Sies, 2007; Mermelstein, 2008), ya que la absorcin de los polifenoles en el organismo est determinada por sus estructuras qumicas por lo que la real efectividad en el organismo depender de la biodisponibilidad de estos compuestos. La CA de una mezcla de AOX no est determinada slo por la suma de las CAs de cada uno de sus componentes; tambin depende del microambiente en que se encuentra el compuesto. Los compuestos interactan entre s pudiendo producirse efectos sinrgicos o inhibitorios (Prior y Cao, 1999; Robards et al., 1999). Existe una gran variedad de especies de diversas familias botnicas (Rosaceae, Ericaceae, Myrtaceae, Berberidaceae, Elaeocarpaceae, entre otras), a cuyos frutos se les denomina berries o bayas. stas se caracterizan por sus frutos pequeos de colores rojo y prpura. En trminos botnicos, se define una baya como un fruto de mltiples semillas, de mesocarpio y endocarpio carnoso que proviene de una flor de ovario spero (Bowling, 2000). Por lo tanto, en trminos estrictamente botnicos, muy pocos de estos frutos son bayas verdaderas (s lo seran el maqui y el calafate). Sin embargo, el uso del trmino berries es muy extendido a nivel cientfico y comercial (Seeram, 2008), por lo que en esta revisin, sin desmedro del uso adecuado del trmino botnico, se referir a algunas especies que no poseen bayas verdaderas o que corresponden a otro tipo de frutos (por ejemplo, a poliaquenios). El inters por el estudio de los berries nativos de Chile (BNCh) obedece a una tendencia mundial de bsqueda de frutas y nuevas materias primas con altos contenidos de AOX. Muchos berries se destacan por sus contenidos altos de polifenoles (Kahkonen et al., 1999; 2001; Seeram, 2008; Speisky et al., 2008). Halvorsen et al. (2002) determinaron la CA (mtodo FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Noruega, en el que se destacaron las mayores CAs de algunas especies de berries silvestres (nativas), en

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relacin a las especies cultivadas. Es as como, por ejemplo, la frutilla silvestre europea (Fragaria vesca) present 6,88 mM equivalentes Trolox/ 100 g, en comparacin con la frutilla cultivada (Fragaria x ananassa) que present 2,17 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Algo similar se observ con el mirtilo (Vaccinium myrtillus) que present 8,23 mM equivalentes Trolox/ 100 g, en comparacin con el arndano (Vaccinium corymbosum) que present 3,64 mM equivalentes Trolox/ 100 g (de fruta fresca). Dada las condiciones edafoclimticas donde crecen muchas especies de BNCh y a que los polifenoles (en especial los flavonoides) son compuestos cuya sntesis es favorecida por condiciones de estrs, se esperara que estas especies presentaran contenidos altos de este tipo de AOX. El objetivo de esta publicacin fue revisar el estado del arte relacionado a la identificacin y cuanti-ficacin de polifenoles, CA y biodisponibilidad de polifenoles de BNCh. Usos tradicionales de algunas especies de BNCh La flora chilena representa un recurso gentico importante, especialmente si se considera su riqueza de especies. Chile central es un hotspot de biodiversidad. Tiene alrededor de 1.605 plantas endmicas, que equivalen al 0,5% de las 300.000 especies de plantas descritas mundialmente. Esto se traduce en que el 46,8% de las plantas descritas en Chile sean endmicas (Myers et al., 2000). La flora nativa fue utilizada por los habitantes prehispnicos con fines diversos, entre los cuales estuvo el uso alimenticio, combustible, religioso, ornamental, cestera, tintreo y medicinal. La tradicin de uso medicinal de las plantas chilenas por las poblaciones nativas ha quedado registrada en crnicas de los colonizadores quienes, a su vez, la enriquecieron con el aporte de plantas medicinales provenientes de Europa y otras regiones (Massardo y Rossi, 1996). Los libros de medicina naturista muestran que el uso medicinal de las plantas nativas de Chile incluye un amplio espectro de afecciones y prcticas curativas (Rozzi y Massardo, 1994 a, 1994 b). Esta revisin se concentr en cuatro BNCh (maqui, calafate, murtilla y frutilla) que poseen usos tradicionales muy difundidos por la poblacin rural del pas (Smith-Ramrez, 1994; Massardo y Rossi, 1996) y muy arraigados a la cultura mapuche (Houghton y Manby, 1985; Molares y Ladio, 2009). Para estas especies existen diferentes estudios
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cientficos que describen sus propiedades AOX que intentan validar sus usos tradicionales. El maqui (Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz), pertenece a la familia Elaeocarpaceae (Fig. 1). Es una especie siempre-verde nativa de Chile que se distribuye entre Limar (IV Regin) y Aisn (IX Regin), tanto en el valle central como en los faldeos cordilleranos, desde cerca del nivel del mar hasta los 2.500 m de altitud (Rodrguez et al. 1983). Posee una gran plasticidad morfolgica, presentndose como arbusto en la zona septentrional de su distribucin y como rbol en la zona meridional. Para la cultura mapuche es una especie sagrada, smbolo de Buena intencin (Hoffmann, 1982). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilizacin de infusiones de hojas para el tratamiento de enfermedades de la garganta, los frutos como antidiarreicos y el jugo de los frutos, para darle tinte al vino y otras bebidas (Muoz et al., 2001; Montenegro, 2002).
Figura 1. Maqui (Paredones, VI Regin)

El calafate (Berberis buxifolia Lam.) pertenece a la familia Berberidaceae (Fig 2). Es un arbusto con espinas, siempre-verde nativo de Chile que se distribuye desde la Regin Metropolitana a la XII Regin. Las races de esta especie han sido utilizadas para el control de fiebres e inflamaciones, dolores estomacales, indigestiones y colitis y los frutos, por sus pigmentos naturales (Muoz et al., 2001; Montenegro, 2002; Freile et al., 2003). La murtilla o murta (Ugni molinae Turcz), pertenece a la familia Myrtaceae (Fig. 3). Es un arbusto siempre-verde nativo de Chile que se distribuye desde el sur de Talca (VII Regin) a Ro Palena (XI Regin). La murta es conocida por este nombre en las provincias de Valdivia y Chilo, como murtilla ms al norte (Concepcin) y como ui, por los mapuches (Urban, 1934). Los usos tradicionales de esta especie se basan en la utilizacin de

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infusiones de hojas para el tratamiento de infecciones urinarias y enfermedades de la garganta y los frutos, por su poder astringente (Muoz et al., 2001; Montenegro, 2002).
Figura 2. Calafate (Puerto Williams, XII Regin)

Figura 4. Frutilla chilena: a) fma. patagonica (Chilo, X Region) y b) fma. chiloensis (Pichihuillinco, VIII Region).

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis (L.) Duch. ssp. chiloensis fma. patagonica Staudt y fma. chiloensis Staudt), pertenece a la familia Rosaceae. Es una planta herbcea perenne nativa de Chile que se distribuye entre la VIII y XII Regin (Darrow, 1996). Lavin et al. (2000) indican que la fma. patagonica de frutos rojos (Fig. 4a) se distribuye entre Iloca (VII Regin) y Chilo (X Regin), mientras que la fma. chiloensis (Fig. 4b) de frutos blancos se distribuye hasta la XII Regin. El fruto de la frutilla corresponde a un poliaquenio que consiste en un tlamo central carnoso con mltiples aquenios en su superficie (frutos verdaderos). Los aquenios contribuyen entre un 0,3 y 1,1 % al peso total del fruto fresco (Cheel et al. 2007). No se describen usos medicinales para hojas y frutos; sin embargo, los frutos han sido utilizados tradicionalmente para la elaboracin de mermeladas y conservas.
Figura 3. Murtilla (Caete, VIII Regin).

Identificacin y cuantificacin de polifenoles en BNCh La identificacin de polifenoles de BNCh se ha realizado mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) acoplada a diferentes tipos de detectores (DAD, ESI-MS). Para la cuantificacin de polifenoles totales (PT) se ha descrito el mtodo del reactivo de Folin-Ciocalteau (Singleton y Rossi, 1965) y para antocianos (AT), el mtodo diferencial de pH (Giusti y Wrolstad, 2001) mediante espectrofotometra UV-vis (ultravioleta-visible). El inters por el maqui se ha centrado principalmente en su contenido de antocianos. Escribano-Bailn et al. (2006) identificaron mediante HPLC-DAD-MS ocho antocianos, para los que propusieron las siguientes identidades: delfinidina-3- sambubisido -5-glucsido, delfinidina 3,5 diglucsido, cianidina-3- sambubisido-5glucsido, cianidina 3,5-diglucsido, delfinidina 3sambubisido, delfinidina 3- glucsido, cianidina 3sambubisido y cianidina 3- glucsido. Los derivados de delfinidina (73%) predominaron sobre los derivados de cianidina (37%), siendo la delfinidina-3sambubisido -5-glucsido el principal antociano (34% del total de antocianos). El contenido promedio de AT fue de 137,6 mg equivalentes de delfinidina 3glucsido/100 g de fruta fresca. El inters por el calafate, de manera similar al maqui, se ha centrado principalmente en sus contenidos de antocianos. No se han descrito los antocianos de calafate de manera pormenorizada, pero existen antecedentes de la evolucin del contenido de AT durante el crecimiento y desarrollo del fruto (Arena y Curvetto, 2008). En este estudio se determin que la mxima concentracin de AT (761,30 mg equivalentes de cianidina 3glucsido/100 g de fruta fresca) coincidi con la mayor concentracin de slidos solubles (24,88 Brix) a los 126 das despus de plena floracin. La determinacin de los slidos solubles mediante

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refractometra es un anlisis simple que se realiza en terreno, que permitira cosechar esta fruta en el momento de mxima acumulacin de AT. Los polifenoles en la murtilla han sido principalmente estudiados en sus hojas, donde se han descrito cidos fenlicos, taninos hidrolizables, flavanoles (epicatequina) y flavonoles (miricetina, quercetina) (Avello, 2000; Rubilar et al., 2006). Pea-Neira et al. (2007) determinaron los compuestos fenlicos de bajo peso molecular de frutos de murtilla de diferentes ecotipos mediante HPLC-DAD. Si bien los perfiles cromatogrficos variaron de acuerdo a los ecotipos analizados, los principales polifenoles identificados fueron elagitaninos y derivados de flavonoles (quercetina). Cheel et al. (2005) aislaron tres glicsidos de cido E-cinmico, triptfano y cianidina-3-O--dglucopiransido de frutos maduros de frutilla chilena (fma. chiloensis). Los extractos de las diferentes partes del fruto (aquenios y tlamo), analizados mediante HPLC, indicaron que los aquenios contienen cido elgico libre y cianidina-3-O--dglucopiransido, mientras que el tlamo contiene derivados del cido E-cinmico y triptfano. Simirgiotis et al. (2009) compararon la composicin fenlica de extractos de frutilla chilena (fma. chiloensis y fma. patagonica) con la frutilla comercial (cv. Chandler) mediante HPLC-DAD y
Tabla 1. Principales polifenoles descritos en BNCh. Especie Maqui Calafate Murtilla Parte de la planta Baya Baya Hoja Fruto Frutilla chilena Fruto Tlamo Aquenios No flavonoides ----Acidos fenlicos (ni) ----cido E- cinmico

HPLC-ESI-MS. La utilizacin combinada de LC DAD/ESI-MS ha sido descrita como un mtodo excelente y exacto para el anlisis de polifenoles en frutillas (Seeram et al., 2006; Aaby et al., 2007; Lopes da Silva et al., 2007). De acuerdo a ese estudio, los componentes fenlicos de las tres especies corresponden principalmente a proantocianidinas, taninos hidrolizables, antocianos y glucsidos de flavonol. En ambas frutillas chilenas el principal glucsido de flavonol fue la quercetina 3-Oglucurnido y los antocianos identificados en menores concentraciones la cianidina-malonilglucsido y pelargonidina-malonil-glucsido. La frutilla comercial present el mayor contenido de AT (27,90 mg/100 g de fruta fresca), mientras que la fma. chiloensis present el contenido ms bajo (2,20 mg/100 g de fruta fresca). La fma. patagonica present un contenido intermedio (22,53 mg/100 g de fruta fresca). El cido elgico fue el principal polifenol encontrado en la frutilla chilena blanca. Este estudio permiti una clara diferenciacin entre los compuestos qumicos de la frutilla comercial y de la frutilla chilena. La Tabla 1 resume los principales grupos de polifenoles identificados en BNCh, donde se destaca la presencia de flavonoles (quercetina) y antocianidinas (cianidina).

Flavonoides Antocianidinas (delfinidina, cianidina) Antocianidinas (ni), Flavanoles (epicatequina), flavonoles (miricetina, quercetina) Flavonoles (quercetina) Flavonoles (quercetina), antocianidinas (cianidina, pelargonidina) --Antocianidinas (cianidina)

cidos hidroxibenzoicos (cido elgico)

Adaptado de: Avello (2000), Cheel et al. (2005), Escribano-Bailn et al. (2006), Rubilar et al. (2006), Pea-Neira et al. (2007), Arena y Curvetto ( 2008), Simirgiotis et al. (2009). ni: compuestos qumicos no identificados.

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Capacidad antioxidante y biodisponibilidad de BNCh La determinacin de la CA de BNCh se ha realizado mediante diferentes mtodos: FRAP (ferric reducing activity power), TRAP (total radicaltrapping antioxidant parameter), TAR (total antioxidant reactivity), TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), radical DPPH (2,2-difenil-1picrilhidracil), ORAC (oxygen radical absorbance capacity). El mtodo FRAP mide la reduccin del in frrico (Fe+3) a ferroso (Fe+2) en la presencia de AOX, mientras que los mtodos TRAP, TAR, TBARS, radical DPPH y ORAC miden la capacidad de los AOX de atrapar diferentes tipos de radicales libres (Araya, 2002; Cspedes et al., 2008; Miranda-Rottmann et al., 2002). Miranda-Rottmann et al. (2002) compararon los contenidos de PT y CA (mtodos TRAP y TAR) de diferentes jugos concentrados (arndano, frambuesa, frutilla, cranberry, mora y maqui) y vino tinto. Las CAs fueron directamente proporcionales a los contenidos de PT, destacndose el jugo de maqui significativamente sobre el resto de los jugos concentrados y el vino tinto. Araya et al. (2006) determinaron la CA (mtodo FRAP) de una serie de frutas y verduras consumidas en Chile. El maqui destac significativamente sobre el resto de las especies analizadas. Los valores de frutas estuvieron comprendidos entre 0,02 mM Fe/100 g para el pepino hasta 12,32 mM Fe/100 g para el maqui, destacando el valor alto de otros berries como la frutilla y zarzamora (3,10 y 3,55 mM Fe/100 g). En la zona intermedia se ubicaron frutos como el limn y el membrillo con (0,25 y 0,23 mM Fe/100 g) y los valores ms bajos correspondieron a manzana (var. Fuji) y duraznos. Frente a estos resultados, el maqui sobresale por su CA determinada in vitro. Cspedes et al. (2008) determinaron que el extracto metanlico de frutos de maqui present actividad antioxidante y cardioprotectora sobre la isquemia/reperfusin aguda de corazn de ratas in vivo. Por otra parte, este extracto fue capaz de prevenir estos eventos nocivos en el corazn del animal, por la disminucin de la oxidacin de lpidos y la reduccin de la concentracin de TBARS. Adems, estos autores determinaron la CA del extracto metanlico de maqui mediante DPPH (IC50), ORAC, FRAP y TBARS. El extracto
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metanlico present un IC50 de 1,62 g/mL y para TBARS un valor de 2,51 g/mL, en comparacin con el jugo de maqui que present un IC50 de 12,1 g/mL y para TBARS un valor de 9,58 g/mL. La CA del extracto metanlico de maqui estuvo fuertemente correlacionada con el contenido de PT (12,97 M ECat/g), que se observ por los mayores valores de ORAC (29,69 M ET/g) y FRAP (25 M ECat/g). Estos resultados demostraron que estos frutos podran ser tiles como fuentes de AOX, cardioprotectores y nutracuticos. Avello et al. (2008) evaluaron la CA (mtodo TBARS) plasmtica antes y despus de la ingesta de infusiones de hojas de maqui (1%). El contenido de fenoles totales en la infusin fue de 0,074 mM equivalentes de cido glico. En este estudio, voluntarios sanos no fumadores y con ndice de masa corporal dentro del rango normal para cada uno, bebieron esta infusin dos veces al da durante tres das (dosis descrita por la etnomedicina para el tratamiento de distintos cuadros). Los resultaron indicaron un aumento promedio de la CA a las 24 h observado por medio de TBARS (30,27 %). Rubilar et al. (2006) determinaron la CA (radical DPPHy TBARS) de diferentes tipos de extractos de hojas de murtilla. Los solventes utilizados fueron etanol, metanol y agua. El mayor contenido de PT (2,6% de equivalentes de cido glico) fue obtenido con metanol, mientras que la mayor CA (IC50) fue obtenida con el extracto etanlico (0,12 M cido glico/M DPPH). El agua como solvente present el mejor resultado de CA por el mtodo TBARS. Avello y Pastene (2005) evaluaron la CA (mtodo ORAC) plasmtica antes y despus de la ingesta de infusiones de hojas de murtilla (1%). En este estudio, voluntarios sanos (normolipdicos y no diabticos), bebieron esta infusin dos veces al da durante tres das. Los resultados indicaron un aumento significativo (de 2.258 a 3.108 M ET/L), en la CA del plasma de los voluntarios. Estos antecedentes seran un aporte valioso en la validacin de los usos tradicionales de las hojas de esta especie. Cheel et al. (2007) determinaron la CA (radical DPPH) de la frutilla chilena (fma. patagonica y fma. chiloensis), frutilla comercial (var. Chandler) y de la frutilla silvestre europea. Los resultados de este anlisis fueron expresados como porcentaje de decoloracin del radical DPPH, el grado de decoloracin indic la eficiencia de las especies de atrapar radicales libres. La variedad Chandler present la mayor CA (86%), mientras que la fma.

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patagonica present la menor CA (43%). En este estudio, la frutilla silvestre europea present una CA menor que la frutilla cultivada, siendo estos resultados diferentes a los obtenidos por Halvorsen et al. (2002), lo que se podra deber a que ambos mtodos de CA (radical DPPH y FRAP) se basan en principios diferentes. Simirgiotis et al. (2009) determinaron la CA (radical DPPH) de extractos metanlicos de frutilla chilena (fma. chiloensis), de sus fracciones y compuestos purificados. Las fracciones etanlicas (B y E) presentaron CAs destacables que fluctuaron entre 20,3 y 41,4 g/mL. Los principales compuestos qumicos presentes en estas fracciones fueron pelargonidina-malonil-glucsido, elagitaninos, quercetina glucornido y canferol cumaril-hexsido (en fraccin B) y cido elgico pentsido y ramnsido, cido elgico y quercetina glucornido (en fraccin E). La Tabla 2 resume los principales mtodos de CA descritos en las publicaciones de BNCh. Es difcil establecer comparaciones entre los resultados obtenidos de estas publicaciones, ya que los mtodos utilizados se basan en principios diferentes y bajo la

utilizacin de un mismo mtodo, los resultados estn expresados en diferentes unidades. Adems, existen estudios de CA para jugos y extractos (con diferentes tipos de solventes) para los que los contenidos de PT y la CA pueden variar significativamente.

COMENTARIOS Y DESAFOS Los antecedentes cientficos de las propiedades AOX de BNCH publicados a la fecha presentan diferentes estados de avance; siendo los frutos de maqui los mayormente estudiados. De acuerdo a estas publicaciones, esta especie se destaca tanto por sus contenidos de PT y AT como por su CA in vitro e in vivo. Sin embargo, no existen estudios de biodisponibilidad de los polifenoles de maqui, calafate, murtilla y frutilla chilena. Para infusiones de hojas de maqui y murtilla existen resultados derivados de pequeas intervenciones en voluntarios sanos pero, no se sabe qu compuestos o metabolitos dan cuenta de la actividad antioxidante y si alcanzan concentraciones plasmticas relevantes.

Tabla 2. Mtodos descritos para la determinacin de CA de BNCh. Mtodo FRAP TRAP TAR TBARS Radical DPPH Expresin de resultados mM Fe/100 g M ECat/g M ET/L M E T/L g EMDA/mL g/mL M cido glico/M DPPH % decoloracin DPPH g/mL M ET/L M ET/g Referencia Araya, 2006 Cspedes et al., 2008 Miranda-Rottmann et al., 2002 Miranda-Rottmann et al., 2002 Cspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006 Cspedes et al., 2008 Rubilar et al., 2006 Cheel et al., 2007 Simirgiotis et al. 2009 Avello y Pastene, 2005 Cspedes et al., 2008

ORAC

ECat: equivalentes catequina. ET: equivalentes Trolox. EMDA: equivalentes malondialdehdo % decoloracin DPPH = absorbancia del blanco absorbancia del compuesto [o extracto] x 100

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Este tipo de evidencia es crucial para el desarrollo de alimentos saludables (funcionales). De acuerdo al Food and Drug Administration (www.cfsan.fda.gov/~dms/hpotguid.html), un mensaje que describe el nivel de nutrientes AOX presentes en un alimento es un mensaje de contenido de nutrientes, y un mensaje del contenido de nutrientes AOX slo se puede hacer para aquellos compuestos para los que est establecida una ingesta diaria de referencia (IDR). Para esto, los compuestos (o en este caso, los polifenoles) deben tener una actividad antioxidante reconocida, es decir, debe existir evidencia cientfica consistente que seale que el compuesto participa en procesos fisiolgicos, bioqumicos o celulares que inactivan los radicales libres o previenen las reacciones qumicas iniciadas por los radicales libres despus de haber sido ingerido y absorbido en el tracto gastrointestinal. El uso de los BNCh como materias primas para el desarrollo de colorantes naturales sera otra alternativa de I+D interesante. La utilizacin de antocianos para el desarrollo de colorantes naturales est siendo reconsiderada por la industria alimenticia, debido a la mayor demanda de los consumidores por productos ms naturales (Nachay, 2009). Esta tendencia se podra deber al cuestionamiento de la seguridad de los colorantes artificiales alimenticios y a estudios que los asocian con problemas de hiperactividad en nios entre 3 y 8-9 aos (McCann et al., 2007). Frente a esto, el maqui, el calafate y la murtilla representan fuentes alternativas de antocianos. En Chile, existen pocos antecedentes de cultivo comercial de BNCh. Cabe sealar los aportes que ha realizado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) en el estudio de la murtilla (http://www.murtillachile.cl/cultivo.asp) y diversas iniciativas locales para la frutilla chilena (fma. chiloensis) en la ciudad de Contulmo. Paralelamente a la generacin de nuevas investigaciones en torno a las propiedades saludables de estas especies, sera necesario avanzar en el desarrollo de manejos agronmicos que faciliten sus cultivos, no slo con el objeto de generar una oferta de materia prima que permita el escalamiento de productos a nivel industrial, sino para garantizar el uso sustentable de estos recursos nativos de Chile a mediano plazo. Finalmente, los BNCh podran constituirse en materias primas nicas para el desarrollo de nuevos productos, debido a la tendencia mundial hacia
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alimentos de carcter natural y con propiedades beneficiosas para la salud. Ante lo cual, las potencialidades de uso para los BNCh seran muy diversas y de grandes proyecciones. AGRADECIMIENTOS Beca CONICYT para realizar estudios de Doctorado en Chile. A los profesores Paz Robert (Dra. Qumica de la Facultad de Qumica y Farmacia, Universidad de Chile) y Miguel Gmez (Botnico de la Facultad de Agronoma, Pontificia Universidad Catlica) por sus aportes valiosos a la redaccin de este artculo. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 479 - 486 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosmticos
[Antioxidants and antimicrobial extracts of Aristotelia chilensis and Ugni molinae and its applications as preservatives in cosmetic products]
Marcia AVELLO1*, Rogelio VALDIVIA1, Ruth SANZANA1, Mara Anglica MONDACA2, Sigrid MENNICKENT1, Valeska AESCHLIMANN1, Magalis BITTNER3, Jos BECERRA3
1

Facultad de Farmacia; 2Facultad de Ciencias Biolgicas; 3Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.

Abstract
The global market for cosmetics preservatives and antioxidants has experienced a significant shift towards natural products, as it has been called into question the safety of preservatives used in industry. The aim of this study was to evaluate the potential of Aristotelia chilensis and Ugni molinae leaf extracts, for their use as natural antioxidants and preservatives in cosmetics. This study was motivated by background information on the presence of antimicrobial and antioxidant compounds in both species. Extracts from leaf of Aristotelia chilensis and Ugni molinae were evaluated by determination of their antimicrobial and antioxidant capacity. The extraction was developed in Soxhlet apparatus, the antioxidant capacity was tested through the stabilization of the radical free 1-1-diphenyl-2-picrilhydrazil (DPPH) and the antimicrobial was evaluated through inhibition activity on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, and Candida albicans, in addition the extracts were standardized in gallic acid equivalents (EAG) through the Folin-Ciocalteu method, which is a form of standardized extracts in a chemical marker. The best extracts were selected in terms of antimicrobial and antioxidant capacity to conduct trials of application in cosmetics. In these formulations, physicochemical, sensorial and microbial stabilities over time and in different storage conditions were determined. None of this products developed bacterial or fungal grow, and all of them maintained the physicochemical and sensorial features. Keywords: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Preservatives; Antioxidants; Cosmetics.

Resumen
El mercado mundial de los preservantes y antioxidantes cosmticos ha experimentado un importante vuelco hacia los productos naturales, puesto que se ha puesto en entredicho la seguridad de los preservantes ms utilizados en la industria. Este estudio tiene como objetivo evaluar el potencial de extractos de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae, para su uso como preservantes y antioxidantes naturales en productos cosmticos. Este estudio ha sido motivado por antecedentes acerca de la capacidad antimicrobiana y antioxidante de los compuestos presentes en ambas especies. A partir de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae se elaboraron extractos, determinando la capacidad antioxidante y antimicrobiana de stos. La extraccin se desarroll en aparato Soxhlet, la capacidad antioxidante se realiz a travs de la estabilizacin del radical libre 1-1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) y la actividad antimicrobiana se analiz frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, y Candida albicans, adems los extractos se estandarizaron en Equivalentes de cido glico (EAG) a travs del mtodo Folin-Ciocalteu, que es una forma de uniformar extractos en un marcador qumico. Se seleccionaron los mejores extractos en cuanto a capacidad antioxidante y antimicrobiana para realizar ensayos de aplicacin en productos cosmticos. En stos se determin la estabilidad fisicoqumica, sensorial y microbiana en funcin del tiempo, en diferentes condiciones de almacenamiento. De los productos elaborados, en ninguno se observ desarrollo bacteriano ni fngico, y se mantuvieron las caractersticas fsicoqumicas y sensoriales. Palabras Clave: Aristotelia chilensis; Ugni molinae; Preservantes; Antioxidantes; Cosmticos.
Recibido | Received: January 14, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: August 4, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by Proyecto Interno DIUC 207.074.038 and Proyecto Anillo PBCT ADI-38, from Universidad de Concepcin.. This article must be cited as: Marcia Avello, Rogelio Valdivia, Ruth Sanzana, Mara Anglica Mondaca, Sigrid Mennickent, Valeska Aeschlimann, Magalis Bittner, Jos Becerra. 2009. Extractos antioxidantes y antimicrobianos de Aristotelia chilensis y Ugni molinae y sus aplicaciones como preservantes en productos cosmticos. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):479 486. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email maavello@udec.vl .

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Avello et al.

Extractos de A. chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosmticos

INTRODUCCIN Los productos denominados cosmticos cumplen muy diversas funciones, incluyendo no slo los productos de belleza, sino tambin los productos para el cuidado personal, la higiene y el bienestar (Schrickel y Bittner, 2001). Aunque los representantes de la industria cosmtica mundial declaran que todos los componentes utilizados en sus productos estn sujetos a rigurosas pruebas de seguridad para garantizar la proteccin tanto de los usuarios como de sus trabajadores, lo cierto es que muchos componentes que alguna vez fueron considerados seguros han sido prohibidos, despus de dcadas de uso intensivo, por los organismos competentes, ante nuevas evidencias respecto de su falta de seguridad (Darbre, 2006). Debido a lo anteriormente expuesto, los consumidores perciben el segmento de los productos naturales como ms seguro para su salud y el ambiente, lo cual crea para los ingredientes de origen natural una oportunidad creciente en el mercado de los cosmticos. A la vez, el reemplazo de ingredientes sintticos por otros naturales de igual eficacia o desempeo constituye un importante desafo cientfico y tecnolgico. Los preservantes ayudan a mantener la estabilidad de un producto creando un ambiente inhspito para el crecimiento antimicrobiano. Adems, los productos deben poseer un efecto antioxidante que les permita evitar la rancidez por oxidacin de los componentes lipdicos de una formulacin o aquellos que sean susceptibles de degradacin oxidativa. Muchas molculas naturales cumplen, en general, una funcin o la otra, pero no ambas en la misma aplicacin. Entre los preservantes ms utilizados en cosmtica est el grupo de los parabenos, los cuales se han utilizado por ms de 20 aos tanto en alimentos como en cosmticos, y se encuentran presentes en ms del 50% de los productos cosmticos actualmente en estanteras (Soni et al., 2005) Los parabenos han sido el centro de una gran controversia desde que en el 2004 fue publicado un artculo que daba cuenta de la presencia de parabenos en el tejido canceroso de los tumores de mamas de varias mujeres (Darbre et al., 2004). Esta investigacin, aunque en forma equvoca, lig la presencia de parabenos con el riesgo de cncer de mama, y desencaden un importante debate entre las empresas y los investigadores involucrados. Aunque la Comisin Cientfica para Productos al
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Consumidor (SCCP) de la Unin Europea ha adoptado un postura moderada indicando que la evidencia cientfica es insuficiente para aseverar que los parabenos producen cncer, el mercado consumidor empez inmediatamente a ejercer una presin sobre los productores, demandando nuevas alternativas (Terasaka et al., 2006). La percepcin positiva de los consumidores acerca de la seguridad e inocuidad de los ingredientes naturales, ha estimulado la aparicin de nuevos sistemas preservantes de origen natural junto a sus homlogos sintticos; las mezclas de aceites esenciales tienen buena accin antimicrobiana pero, en general, pobre accin antioxidante. Adems, su potente aroma las hace poco aptas en un amplio rango de aplicaciones (Fundacin para la Innovacin Agraria, 2003). Los extractos de las especies chilenas Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz Elaeocarpaceae (Maqui) y Ugni molinae Turcz. Myrtaceae (Murtilla), han mostrado interesantes resultados tanto por su accin antioxidante, as como su capacidad antibacteriana, debido a la composicin fenlica de sus hojas (Rubilar et al., 2006; Suwalsky et al., 2008). Estas especies chilenas revisten gran importancia en el marco de la creacin de valor a partir de productos forestales no madereros mediante tecnologas sustentables (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrcola y Ganadero (SAG), 2006). El principal uso comercial de Aristotelia chilensis se concentra en extractos del fruto como colorante. En los ltimos aos, las investigaciones acerca de los extractos de Aristotelia chilensis se han volcado a la determinacin de propiedades teraputicas ms all de estudios farmacolgicos, utilizando modelos in vitro, basados en la premisa de que las capacidades antioxidantes especficas de Aristotelia chilensis tendran un efecto en eventos aterognicos tempranos (Avello et al., 2008). Por su parte, Ugni molinae ha recibido gran atencin en los ltimos aos, debido al impulso que le ha dado el Instituto de Investigaciones Agropecuarias del Ministerio de Agricultura de Chile (INIA) al promocionarlo como el primer berrie nativo que representa una real alternativa de cultivo para la zona sur (Ministerio de Agricultura, Servicio Agrcola y Ganadero (SAG), 2006) del pas. La composicin qumica de extractos de Ugni molinae, su contenido de polifenoles y sus capacidades antiinflamatoria y antioxidante han sido estudiados por investigadores de distintas universidades, y se encuentran detalladas en publicaciones de distinto

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Avello et al.

Extractos de A. chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosmticos

nivel de impacto (Avello y Pastene, 2005; Suwalsky et al., 2006; 2006a). Ciertamente existe una creciente oportunidad de mercado para nuevos extractos naturales como preservantes para productos cosmticos, ya sea por s solos si sus propiedades lo ameritan, o en mezclas, con otros productos naturales, y tambin con productos sintticos. El objetivo del siguiente estudio fue evaluar el potencial preservante y antioxidante de extractos de hojas de Aristotelia chilensis y Ugni molinae para su uso en productos cosmticos. No existen estudios preliminares de este tipo, radicando la originalidad de ste en la incorporacin de extractos biolgicamente activos para conservar productos comerciales. MATERIALES Y MTODOS Material Vegetal Se colectaron hojas de Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz (Elaeocarpaceae) (Maqui) y Ugni molinae Turcz. (Myrtaceae) (Murtilla), en los meses de diciembre del 2005 y marzo del 2006 en campos de la VIII de Chile. El material vegetal fue identificado en el Departamento de Botnica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas de la Universidad de Concepcin (CONC N 153285 y CONC N 146511, respectivamente). Las hojas cosechadas se deshidrataron a la sombra, y se procesaron deshidratadas. De cada muestra se tomaron 2000 gramos de material vegetal deshidratado, el cual se redujo de tamao hasta un tamao de partcula de 0,5 cm. Extraccin La extraccin se realiz con 50 gramos de muestra molida tanto de hojas de Aristotelia chilensis como de Ugni molinae en aparato Soxhlet. En cada caso, se ensayaron los siguientes solventes: H2O100%, mezcla EtOH-H2O (40%-60% / 60%-40%), EtOH 100%, mezclas MeOH- H2O (40%-60% / 60%-40%) y MeOH 100%. La relacin masa-solvente fue de 6:1. Cada extraccin se llev a cabo hasta agotar el material vegetal, lo cual se determin mediante la medicin del contenido de slidos en el extracto. Cada extracto se concentr en rotavapor y se llev a sequedad en liofilizador. Para cada extracto se determin el rendimiento total en base seca. Los extractos se guardaron en lugar seco y protegido de la luz hasta el momento de su utilizacin.
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Determinacin de Fenoles Totales Cada extracto se estandariz por su contenido fenlico en moles/L de Equivalentes de cido Glico (M EAG), que es una forma de uniformar extractos en un marcador qumico (Singleton y Rossi, 1965), medido por el mtodo de Folin-Ciocalteu (Velioglu et al., 1998), el protocolo fue el siguiente, a 0,5 mL de extractos al 1% preparados en agua, se le adicion 25 mL H2O destilada, 2,5 mL Reactivo Folin-Ciocalteu (Merck, Germany) y 10 mL Carbonato de Sodio 20%, en el mismo orden. Luego se enras a 50 mL con H2O destilada. Se agit, para homogeneizar y se dej reposar por 30 minutos. Paralelamente se prepar un blanco analtico con agua destilada. La absorbancia de la muestra fue medida a una longitud de onda de 765 nm en espectrofotmetro (Shimadzu UV-VIS 1601) y las absorbancias de las muestras fueron interpoladas en una curva de calibracin preparada con cido glico (Merck, Germany) en las condiciones antes descritas. La determinacin de fenoles totales se realiz por triplicado para cada extracto. Capacidad Antioxidante A cada extracto se le realiz anlisis de capacidad antioxidante de manera preliminar, con el fin de seleccionar aqullos que presentan una mayor capacidad, para su incorporacin en una frmula cosmtica. Se emple el modelo de decoloracin del radical libre DPPH (Joyeux et al., 1995). Se mezclaron 750 L de los extractos preparados en etanol a 6,0 y 0,6 M EAG con 1,5 mL de la solucin etanlica (20 mg/mL) del radical libre DPPH (Merck, Germany). La absorbancia se determin a 517 nm en espectrofotmetro (Shimadzu UV-VIS 1601) despus de 5 minutos de reposo. Como estndar se utiliz cido glico (Merck, Germany) y como blanco etanol. La capacidad antioxidante se expres en porcentaje de estabilizacin del radical. La capacidad antioxidante se realiz por triplicado para cada extracto. Capacidad Antimicrobiana A cada extracto se le realiz anlisis de capacidad antimicrobiana de manera preliminar cualitativa por inhibicin del crecimiento bacteriano, en triplicado para cada extracto, con el fin de seleccionar aqullos que presentan una mayor capacidad, para su incorporacin en una frmula cosmtica.

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Extractos de A. chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosmticos

La actividad antimicrobiana se determin por el mtodo de difusin en agar tripticasa para bacterias y agar Sabouraud para hongos, utilizando Staphylococcus aureus (ATTC 6538P), Pseudomonas aeruginosa (ATTC 27653), Enterobacter aerogenes (UC-1) y Candida albicans (UC-A), correspondientes a una concentracin de 106 ufc/mL. En orificios de 7 mm de dimetro se depositaron 100 L de los extractos a ensayar (4 mg/mL) en suero fisiolgico. Las placas se incubaron a 37C durante 24 h y se realizaron lecturas del dimetro del halo de inhibicin del crecimiento microbiano utilizando un pie de metro que da una precision de 1 mm. El parmetro de seleccin fue un dimetro del halo de inhibicin superior a 15 mm frente a los microorganismos. Se utilizaron como controles Amoxicilina (25 g/mL) (Lab. Chile) y Caspofungina (5 g/mL), (Lab. NeoSensitabs). Parmetros de Seleccin de Extractos Se seleccionaron los mejores extractos con respecto a capacidad antioxidante y antimicrobiana para incorporarlos en formulaciones cosmticas y estudiar su estabilidad en la formulacin y capacidad de proteccin en los productos terminados. Los parmetros fueron los siguientes: 100% de capacidad antioxidante frente a DPPH de extractos (6,0-0,6 M) EAG que corresponden a concentraciones similares a antioxidantes sintticos utilizados en formulaciones cosmticas, y un dimetro de halo de inhibicin igual o superior a 15 mm frente a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes y Candida albicans de los extractos en una concentracin de 4mg/L, que corresponde a la concentracin mxima de parabenos permitida por la legislacin chilena en productos cosmticos. Forma Cosmtica y Ensayos de Estabilidad
Cuadro 1. Composicion de la Crema de limpieza O/W (Aceite/Agua) Ingredientes: Aceite Mineral 65/67 Cera de abeja Tween 40 Atlas G 1726 Extractos Agua destilada Cantidad 50 g 7 g 2 g 8 g 4 g c.s.p 100 g

Como controles se utiliz la misma frmula sin preservantes ni antioxidantes sintticos ni extractos, y otra utilizando metil y propil parabenos (0,015 g) y BHT (0,02 g). Estabilidad de la Formulacin en el Tiempo Se estudi la estabilidad desde el punto de vista fsicoqumico, sensorial, rancidez y microbiolgico por un perodo de 6 meses. Paralelamente se estudiaron controles; formulaciones conteniendo parabenos y antioxidantes sintticos en las condiciones que a continuacin se detallan y tambin formulaciones sin extractos, preservantes ni antioxidantes sintticos. Estabilidad Fsicoqumica y Sensorial Los productos se almacenaron por 6 meses en las siguientes condiciones: Normales (N); luz natural, temperatura ambiente, Luz (); exposicin a la luz natural 5h/da, Oscuridad (O); estante cerrado, Fro (F); 4 C. En forma bisemanal se monitorearon las siguientes caractersticas fsicoqumicas y sensoriales: color, textura, olor, pH, separacin de fases y formacin de precipitado. Rancidez (ndice de Perxido) En matraz Erlenmeyer se agreg 500 mg de muestra y 160 L de mezcla cido acticocloroformo (6+4) y se agit hasta disolver la formulacin, se agreg 50 L de solucin saturada de KI al 5% en metanol, dejando reposar por 10 min en lugar oscuro. Se agreg 5 mL de agua y 50 L de almidn. El desarrollo de un color azul indica reaccin positiva y la intensidad del mismo denota mayor o menor concentracin de perxidos (Rondon et al., 2004). Esta reaccin se llev acabo en forma bisemanal por 6 meses. Estabilidad Microbiolgica En forma bisemanal y por 6 meses las cremas se inocularon en caldo de cultivo nutritivo, se incubaron a 37 C por 48 h y se observ si exista turbidez. En caso de observarse turbidez los productos se sembraron en agar tripticasa para el estudio de bacterias y agar Sabouraud para el estudio de hongos. Las placas se incubaron a 37 C durante 24 h y se realizaron lecturas del dimetro del halo de inhibicin del crecimiento microbiano.

Aceite Mineral 65/67, es una mezcla de aceites minerales de baja viscosidad y media viscosidad. Atlas G 1726, corresponde a PEG-20 Sorbitan Beeswax.

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Extractos de A. chilensis y U. molinae como preservantes en productos cosmticos

RESULTADOS Y DISCUSIN Este trabajo reporta en el potencial uso de extractos vegetales con alta capacidad antioxidante (100% de inhibicin en DPPH a 6,0-0,6 M EAG), y antimicrobiana (dimetro de halo de inhibicin igual o superior a 15 mm con extractos a 4mg/L), como conservantes en productos cosmticos. Los extractos seleccionados e incorporados a los productos cosmticos fueron lo siguientes: 1.Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con MeOH 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII regin de Chile, 2.-Extracto de hojas de Aristotelia chilensis, obtenido con 60% EtOH-40% H2O, colectadas en marzo, 2006 en la VIII regin de Chile, 3.-Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con 40% MeOH-60% H2O, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII regin de Chile y 4.- Extracto de hojas de Ugni molinae, obtenido con H2O 100%, colectadas en diciembre, 2005 en la VIII regin de Chile (Tabla 1). El contenido de fenoles totales de los extractos seleccionados se observa en la Tabla 1. Se observ un alto contenido de fenoles totales en el extracto hidroalcohlico de Aristotelia chilensis, y fue an mayor en el extracto hidroalcohlico de Ugni molinae, esto indica la naturaleza qumica de las molculas fenlicas que contienen las hojas de estas especies. Este resultado no tiene relacin con el

rendimiento de los extractos, que fue mayor en el extracto metanlico de Ugni molinae, simplemente los fenoles totales indican los compuestos fenlicos solubles en los solventes de extraccin y no tiene relacin con el rendimiento. Tampoco se observ variacin en la capacidad antioxidante, puesto que todos los extractos desarrollaron un 100% de capacidad antioxidante en las concentraciones estudiadas (6,0-0,6 M) EAG. Si hubo diferencia con respecto al dimetro del halo de inhibicin de crecimiento bacteriano, por lo tanto este fue el parmetro que condicion la seleccin. El extracto de las hojas de la especie Ugni molinae colectadas en la VIII regin en diciembre del 2005, fue el que obtuvo la mejor actividad antimicrobiana. De los productos elaborados, en ninguno se observ desarrollo bacteriano ni fngico, y el ndice de perxido fue negativo, los productos mantuvieron sus propiedades fsicoqumicas y sensoriales durante los 6 meses de observacin en las condiciones ensayadas. En los controles que contenan parabenos y antioxidantes sintticos, no se observaron cambios significativos en las propiedades estudiadas, durante los 6 meses. En los controles que no contenan extractos, parabenos ni antioxidantes sintticos se observaron cambios en el color, olor y se desarrollaron bacterias ambientales (Tabla 2).

Tabla 1. Extractos seleccionados; caractersticas de extraccin, contenido en fenoles totales, capacidad antioxidante y antimicrobiana. Muestra Especie (Mes Colecta / Regin) U. molinae (Dic / VIII) Solvente extraccin m/s Rendimiento (%) Fenoles Totales (M EAG) 0,031 0,035 0,032 0,040 Halo de Inhibicin ( 1 mm) Ps. Enter. St. Can 25 25 21 23 25 21 21 20 20 25

Especie

MeOH 100% MeOH 60%H2O 40% H2O 100%

6/1 6/1 6/1 6/1

37,9 16,3 11,4 5,9

28 25 24

A. chilensis (Mar / VIII)

EtOH 60%H2O 40%

26 19 20

m/s: relacin masa-solvente; Fenoles totales (M EAG): Fenoles totales en concentracin Molar equivalentes a cido glico; Bacterias: Ps.: Pseudomona aeruginosa. Enter.: Enterobacter aerogenes. St.: Staphylococcus aureus. Hongos: Can: Candida albicans; Rendimiento (%) Gramos de extracto por 100 g de planta seca

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La eficacia como preservantes y antioxidantes de los extractos seleccionados abre una nueva perspectiva no slo a la industria cosmtica, sino a toda aquella que requiera de preservantes y antioxidantes de origen vegetal. La coloracin caracterstica de cada extracto seleccionado, en un futuro puede ser modificada, sin alterar sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas, pensando en desarrollar materias primas que no afecten la frmula final. La capacidad antioxidante no fue determinante en la seleccin de extractos a incorporarlos en las formulaciones, puesto que, todos los extractos mostraron una capacidad del 100%, por lo tanto, la seleccin se bas en los estudios microbiolgicos. Los microorganismos fueron seleccionados debido a la resistencia antibitica que han desarrollado a travs del tiempo y a las infecciones intrahospitalarias que causan, pero sobre todo porque

un requisito para la venta al pblico de una formulacin cosmtica es ausencia absoluta de patgenos. La actividad microbiolgica observada es determinante, puesto que los agentes microbiolgicos expuestos a los extractos son altamente patgenos, sobre todo Pseudomona aeruginosa, que es un microorganismo que crece en condiciones adversas, siendo muy difcil el inhibir su desarrollo. Los extractos seleccionados mostraron una actividad antimicrobiana equivalente a un halo de inhibicin superior a 20 mm. La actividad de los extractos seleccionados frente a Candida albicans, muestran una potente actividad antifngica, resultado que enriquece las posibilidades de los extractos seleccionados como antimicrobianos. Estas propiedades biolgicas se deben principalmente a la composicin fenlica de los extractos estudiados (Avello et al., 2008; 2008a).

Tabla 2. Estabilidad sensorial, fsicoqumica y microbiolgica de productos cosmticos, durante el perodo de estudio (6 meses, Jun a Dic). Producto Condiciones Almacenamiento Normales Luz Oscuridad Fro Normales Luz Oscuridad Fro Normales Luz Oscuridad Fro Normales Luz Oscuridad Fro Normales Luz Oscuridad Fro Normales Luz Oscuridad Fro Parmetros Fisicoqumicos c o t pH sf pp Estables Rancidez Microbiolgico

Crema O/W Control Parabenos Antioxidante Sinttico Crema O/W Control sin Parabenos ni Antioxidantes Sintticos Crema O/W Extracto U. molinae MeOH 100% Crema O/W Extracto U. molinae MeOH 60%-H2O 40% Crema O/W Extracto U. molinae H2O 100% Crema O/W Extracto A. chilensis EtOH 60%H2O 40%

Negativo

Negativo

Estables Estables Estables Estables Estables

Negativo

Contaminacin Ambiental Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

Estables

Negativo

Negativo

Parmetros Fsicoqumicos: : cambios; c : Color ; o: Olor; t : Textura; sf : Separacin de Fases ; pp: Formacin de Precipitado

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La importante actividad antimicrobiana se proyecta tambin a la industria farmacutica, puesto que los antibacterianos convencionales presentan efectos adversos considerables, adems la eficiente actividad frente a Pseudomona aeruginosa es de especial inters, porque muchos enfermos crnicos (diabticos) y otros afectados (quemados) desarrollan infecciones recurrentes con esta bacteria que es multiresistente a estos agentes sintticos. Los extractos, segn nuestro estudio, pueden clasificarse como antibacterianos de amplio espectro, puesto que hipotticamente, si se tuvieran que controlar estas bacterias en su conjunto, se deben combinar antibacterianos sintticos o hemisintticos especficos. En el caso de los extractos seleccionados evitaran el desarrollo y consecuencias de las cepas estudiadas. La frmula escogida, es rica en materia lipdica, y agua, medios de cultivo para microorganismos y muy susceptibles a la oxidacin. El estudio de estabilidad mostr la capacidad de los extractos para conservar la frmula en diversas condiciones, siendo el extracto ms potente el obtenido con 100% H2O. Esto considera, tambin, aspectos ambientales, como por ejemplo, minimizar el uso de solventes. Los preservantes utilizados en formulaciones cosmticas, tomando como referencia los ms cuestionados (parabenos), son de amplio espectro y su actividad antimicrobiana frente a estos agentes es comparable a la de los extractos seleccionados. Por lo tanto, los extractos de las especies en estudio son comparables a productos preservantes y antioxidantes comerciales para formulaciones cosmticas. CONCLUSIONES La Los extractos de hojas de Ugni molinae (obtenidos con MeOH 100%, 60%, y H2O 100%) y de Aristotelia chilensis (obtenido con 60% EtOH) agregados como preservantes y antioxidantes mantuvieron las caractersticas sensoriales y fisicoqumicas de una formulacin cosmtica altamente lipdica demostrando su potencial como aditivos naturales de aplicacin cosmtica. AGRADECIMIENTOS Se agradece el financiamiento a la Direccin de Investigacin (Proyecto Interno DIUC 207.074.038), a la Direccin de Post grado y al Proyecto a Anillo PBCT ADI-38, de la Universidad de Concepcin.
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 487 - 497 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation


[Propiedades antioxidantes de Rosmarinus officinalis y sus efectos sobre la biotransformacin de xenobiticos]
Mara E. LETELIER, Araceli TERN, Marcela A. BARRA, Paula ARACENA-PARKS Laboratory of Pharmacology, Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, Chemical and Pharmaceutical Sciences School, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

Abstract
Rosmarinus officinalis (rosemary) extracts display antioxidant properties mainly due to the presence of polyphenols. These properties have yet to be systematically studied in biological systems. In this study, we used rat liver microsomes to evaluate the antioxidant capacity of a dry extract from rosemary leaves. Noteworthy, compounds occurring in herbal extracts are xenobiotics to animals, thus mainly biotransformed in the hepatic endoplasmic reticulum. Thus, we also studied the ability of this extract to inhibit different xenobiotics biotransformation pathways. The rosemary extract prevented all tested oxidative processes that were evaluated in rat liver microsomes. It also inhibited the activities of: 1) UDP-glucuronyltransferase; 2) microsomal GSHtransferase; and 3) cytochrome P450 system (N-demethylating activity). Our results indicate that herbal extracts, in addition to act as antioxidants, display a significant interaction with the metabolism of xenobiotics and/or endogenous compounds. Considerations about such interaction are discussed. Keywords: Rosmarinus officinalis; Rosemary; Herbal antioxidant; Cu2+/ascorbate; Oxidative stress; Cytochrome P450 system; UDP-glucuronyltransferase; GSH-transferase.

Resumen
Extractos de Rosmarinus officinalis (romero) presentan propiedades antioxidantes debido, principalmente, a la presencia de polifenoles. Dichas propiedades no han sido sistemticamente estudiadas en sistemas biolgicos. En el presente estudio, utilizamos microsomas de hgado de rata para evaluar la actividad antioxidante de un extracto seco de hojas de romero. Cabe destacar que los compuestos presentes en preparados herbales son xenobiticos para los animales, por lo que son biotransformados principalmente en el retculo endoplsmico heptico. Por ello, tambin estudiamos la capacidad de este extracto para inhibir diferentes vas de biotransformacin de xenobiticos. El extracto de romero protegi todos los procesos oxidativos que fueron evaluados en microsomas hepticos de rata. ste tambin inhibi las actividades de: 1) UDP-glucuroniltransferasa; 2) GSH-transferasa microsmica; y 3) el sistema citocromo P450 (actividad N-desmetilante). Nuestros resultados indican que los extractos herbales, adems de comportarse como antioxidantes, pueden interaccionar significativamente con el metabolismo de xenobiticos y/o compuestos endgenos. Consideraciones acerca de dicha interaccin son sometidas a discusin. Palabras Clave: Rosmarinus officinalis; Romero; Antioxidantes; Cu2+/ascorbato; Estrs oxidativo; Sistema citocromo P450; UDP-glucuroniltransferasa; GSH-transferasa. ABBREVIATIONS: ABTS, 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate); CYP450, cytochrome P450; DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; G-6-P, glucosephosphate; GST, glutathione S-transferase; ROS, reactive oxygen species; UDPGT, UDP-glucuronyltransferase.
Recibido | Received: March 2, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: May 12, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009. Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was not financially supported This article must be cited as: Mara E. Letelier, Araceli Tern, Marcela A. Barra, Paula Aracena-Parks. 2009. Antioxidant properties of Rosmarinus officinalis and its effects on xenobiotic biotransformation. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):487 497. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Mara Eugenia Letelier, M.Sc., Department of Pharmacological and Toxicological Chemistry, School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile. Olivos 1007, Independencia, Santiago, Chile. Phone: 56-2-9782885. Fax: 56-2-9782912. E-mail address: mel@ciq.uchile.cl

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Letelier et al.

Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis

INTRODUCTION All aerobic organisms generate reactive oxygen species (ROS) as part of highly regulated enzymes and as a by-product of oxygen metabolism. ROS, which include superoxide anion, hydroxyl radical, and hydrogen peroxide, are highly reactive species capable to oxidize biological molecules, such as lipids, proteins, and nucleic acids (Droge, 2002). Thus, several antioxidant mechanisms have evolved to prevent oxidative damage to cells. This antioxidant capacity includes non-enzymatic and enzymatic mechanisms (Benzie, 2000). GSH and vitamin E are classical examples of the non-enzymatic antioxidant mechanism, as these molecules act as free radical scavengers (Evstigneeva et al.,, 1998; Elias et al., 2008). The enzymatic antioxidant system of cells includes enzymes that catalyze the reduction of ROS, and include superoxide dismutase and catalase (Elias et al., 2008). GSH also plays a role in this system, as a cofactor of GSH-peroxidase. When ROS generation overwhelms the cells antioxidant capacity, oxidative stress is ensued. Oxidative stress can lead to cell damage and ultimately cell death (Halliwell and Gutteridge, 1988). During oxidative stress, some enzymes that are involved in drug metabolism, such as GSH-transferases (GSTs), can also act as antioxidants, through the metabolism of highly electrophilic and lipophilic compounds (van der Aar et al., 1996). In addition, some GSTs occurring in the endoplasmic reticulum also display peroxidase activity (Mosialou and Morgenstern, 1989). An increase in the expression of such enzymes has been also described during oxidative stress (Pinkus et al., 1996; Mari and Cederbaum, 2001). Increasing evidence has demonstrated that compounds occurring in plants have antioxidant capacity, mainly in virtue of their ability to scavenge free radicals (Masella et al., 2005). Systematic studies on the antioxidant capacity of total herbal extracts are missing. This is mainly due to the purification of specific compounds from extracts and assessment of their free radical scavenging properties using synthetic radicals such as 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) y 2,2'-azinobis-(3ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) (Antolovich et al., 2002). Isolation of compounds from herbal extracts allows the study and understanding of the antioxidant properties of these specific substances. Such studies, however, may
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overlook the potential synergy and/or additive antioxidant effects that the various molecules occurring in the whole extract exert through different mechanisms. On the other hand, synthetic free radicals are useful for the rapid screening of the antioxidant capacities of herbal extracts or isolated compounds. These free radicals display redox mechanisms that are very different from those of oxygen free radicals, which are the oxidants occurring in biological systems. Therefore, the use of such technique may not reflect a true biological antioxidant capacity of herbal compounds (Letelier et al., 2008). By definition, all herbal antioxidant substances are xenobiotics for mammals. Therefore, they are metabolized through the drug-metabolizing pathways, occurring mainly in the endoplasmic reticulum of liver cells. The enzymatic systems of such pathways include the cytochrome P450 (CYP450) system (Kramer and Tracy, 2008), UDPglucuronyltransferase (UDPGT) (Tephly and Burchell, 1990), and microsomal GST (Rinaldi et al., 2002). Thus, all herbal antioxidant substances, depending on their physicochemical properties, are likely to behave as competitive inhibitors of these enzymatic systems with respect to their activity towards endogenous compounds and drugs. Noteworthy, CYP450 is the main contributor of oxidative stress in the endoplasmic reticulum, because it catalyzes the generation of highly electrophilic metabolites and also directly releases ROS when uncoupled (James et al., 2003; Shimada, 2006). Thus, herbal compounds may display and additional antioxidant mechanism by inhibiting CYP450 (Johnson, 2008). Rosmarinus officinalis (rosemary) belongs to the Lamiaceae family, constituted by numerous medicinal plant species. Rosemary can be found in the Mediterranean basin of south Europe, north of Africa and southwest Asia. This plant is produced mainly in Spain, Tunisia, Morocco, and to a lesser extent, Portugal, Turkey and India. Rosemary can also be found in Chile, between the V and IX regions. Although mainly used as a condiment, several therapeutic actions are attributed to rosemary, including antimicrobial, antispasmodic, hypertensive and sedative activities (Simon et al., 1984). Antioxidant properties of plants are thought to be mainly due to polyphenols occurring in all herbal extracts (i.e. flavonoids, flavones, flavonols, anthocyanines, etc.) that are scavengers of ROS

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Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis

(Middleton et al., 2000). Alcoholic extracts from rosemary leaves, stems and flowers display antioxidant properties (Pathak et al., 1991; Caigueral et al., 1998). These extracts are enriched in polyphenols, such as carnosol, rosmanol, carnosic acid, and rosmarinic acid (del Bano et al, 2003; Moreno et al, 2006). In the present study, we first evaluated the antioxidant properties of a dry extract of rosemary leaves, in terms of protecting rat liver microsomes lipids, thiol-containing proteins, and UDPGT activity from damage induced by Cu2+/ascorbate, a ROS generating system. We compared the biological antioxidant activity of this extract with its free radical scavenging activity using DPPH. In addition, we evaluated the potential inhibitory effect of this extract on the activities of the CYP450 system, UDPGT, and microsomal GST. When evaluated separately, the rosemary extract behaved as an antioxidant and as an inhibitor of the tested enzymatic activities. When evaluated simultaneously, however, we found that the extract displayed a lower inhibitory effect, giving precedence to its antioxidant activity. The significance of these results on the potential toxicity of herbal extracts through the inhibition they exert on drug-metabolizing enzymes is discussed. MATERIAL AND METHODS Chemicals 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), GSH, p-Nitrophenol (PNP), UDP-glucuronic acid (UDPGA), p-Nitroanisole (PNA), Aminopyrine, NADP, glucose-6-phosphate (G-6-P), glucose-6phosphate dehydrogenase, Tris-HCl, and bovine albumin (Fraction IV) were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA), sodium ascorbate, FeCl3, CuSO4, MgCl2, and FolinCiocalteus reagent were purchased from Merck Co. Chile. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was purchased from ACROS Organics (New Jersey, NJ, USA). Other chemicals were of analytical grade. Dry extract of Rosmarinus officinalis leaves (vegetable drug) was graciously provided by Laboratorios Ximena Polanco (Santiago, Chile), along with proprietary information regarding yield. Stocks of this dry extract (0.2 to 1 mg/mL) were prepared in a mixture of water: ethanol (1:1) the same day of the experiments.

Animals Adult male Sprague Dawley rats (200-250 g), maintained at the vivarium of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences (Universidad de Chile, Santiago, Chile) were used. Rats were allowed free access to pelleted food, maintained with controlled temperature (22C) and photoperiod (lights on from 07:00 to 19:00 h). All procedures were performed using protocols approved by the Institutional Ethical Committee of the School of Chemical and Pharmaceutical Sciences, Universidad de Chile, and according to the guidelines of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NRC, USA). Isolation of rat liver microsomes Microsomal fraction was prepared according to Letelier et al. (2005). Rats were fasted for 15 h with water ad libitum, and sacrificed by decapitation. Livers were perfused in situ with 4 volumes of 25 ml 0.9 % W/V NaCl, excised, and placed on ice. All homogenization and fractionation procedures were performed at 4C and all centrifugations were performed using either a Suprafuge 22 Heraeus centrifuge or an XL-90 Beckmann ultracentrifuge. Liver tissue (9 -11 g wet weight), devoid of connective and vascular tissue, was homogenized with five volumes of 0.154 M KCl, with eight strokes in a Dounce Wheaton B homogenizer. Homogenates were centrifuged at 9,000xg for 15 min and sediments were discarded. Supernatants were then centrifuged at 105,000xg for 60 min. Pellets (microsomes) were stored at -80C until use. Protein determinations were performed according to Lowry et al. (1951). Determination of polyphenols Polyphenols were determined by the method described by Letelier et al. (2008). Fifty L herbal extract were mixed with 250 L Folin Ciocalteau reagent, 750 L 20% w/v sodium carbonate and distilled water to a final volume of 5 mL. Blanks contained all reagents other than herbal extract. Reaction mixtures were then incubated for 2 h protected from light. Afterwards, the absorbance of the samples was determined at 760 nm in a UV3 Unicam UVVIS spectrophotometer, using their respective blanks as reference. Catechin, a polyphenol compound, was used as a reference standard. Results were expressed as nmol catechin/g rosemary extract.

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Antioxidant properties and xenobiotic biotransformation of Rosmarinus officinalis

Determination of DPPH bleaching activity This assay was determined according to Letelier et al. (2008). In a final volume of 1 mL, increasing concentrations of rosemary extract were mixed with 20 g/mL of DPPH. Fresh DPPH stock solutions were prepared in ethanol. Blanks contained herbal extract and vehicle. DPPH bleaching activity of all mixtures was recorded continuously at 37 C for 20 min at 517 nm in a UV3 Unicam UV-VIS Spectrophotometer. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly dependent with time. Microsomal lipid peroxidation assay The extent of lipid peroxidation following pretreatment of microsomes with Cu2+/ascorbate was estimated assaying thiobarbituric acid reactive species (TBARS), according to Letelier et al. (2005). Mixtures (1 mL final volume) contained 1 mg/mL microsomal protein, 25 nM CuSO4, 1 mM sodium ascorbate in 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. Blanks contained all the reagents but microsomal protein. Blanks and samples were incubated for 20 min at 37C with constant agitation. TBARS were calculated using the 532=156/mM/cm and expressed as Data are presented as nmol TBARS/min/mg protein. Determination of microsomal thiol content Thiol groups were titrated with DTNB as described by Letelier et al. (2005). Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with 25 M CuSO4, 1 mM sodium ascorbate in 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. Blanks contained all reagents but microsomal protein. Blanks and samples were incubated for 30 min at 37 C with constant agitation. Afterwards, microsomal thiol content was titrated with 0.6 mM DTNB. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate prior determination of the microsomal thiol content. Thiol concentration was estimated on the basis of the equimolar apparition of 5-thio-2-nitrobenzoic acid (410=13,600/M/cm) and is presented as nmol thiols/min/mg protein. Assay of UDPGT activity p-nitrophenol conjugation with UDPGA, reaction catalyzed by UDPGT was assayed according to Letelier et al. (2007). Activity was assayed by
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determining the remaining p-nitrophenol after 15 min incubation of microsomes (2 mg protein/mL) in the following conditions: 0.5 mM p-nitrophenol, 2 mM UDPGA, 4 mM MgCl2, in 100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5. Blanks were assayed in the absence of UDPGA. Reactions were stopped by addition of TCA to 5% (W/V) final concentration; samples were then centrifuged at 10,000g for 10 min in a Suprafuge 22 Heraeus centrifuge and supernatants were collected. NaOH was added to the supernatants to final 0.5 M. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly-dependent to time and protein concentration. To calculate UDPGT activity, a standard curve of p-nitrophenol was generated. To evaluate the antioxidant effect of herbal extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining UDPGT activity. Data are presented as nmol conjugate/min/mg protein. Assay of GST activity Conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, reaction catalyzed by GST, was assayed according Letelier et al.(2006). The reaction mixture contained 0.1 mg/mL microsomal protein, 1 mM 1-chloro-2,4dinitrobenzene, and 4 mM GSH in 100 mM phosphate buffer, pH 6.5. Blanks were assayed in the absence of GSH. Apparition of the conjugated product was continuously recorded for 3 min at 25C, at 340 nm in a UV3 Unicam UV-VIS spectrophotometer. To calculate GST activity, the 340=9.6 mM/cm of the conjugate was used. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining GST activity. Data are presented as mol conjugate/min/mg protein. Assay of the CYP450 system activity Activity of the CYP450 system was assayed as the N-demethylating activity on Aminopyrine, according to Letelier et al. (1985). The reaction mixture contained microsomes (1 mg protein/mL), 5 mM aminopyrine, 3.5 mM MgCl2, 0.1 M G-6-P, 10 mM NADP, 5 Units/mL G-6-P dehydrogenase, in 35 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0. Blank contained all reagents but G-6-P dehydrogenase. All mixtures were incubated for 15 min at 37 C. Reactions were stopped by addition of TCA to 5% (W/V) final concentration; samples were then centrifuged at 10,000g for 10 min in a Suprafuge 22 Heraeus

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centrifuge and supernatants were collected. To develop the colorimetric reaction, 0.5 mL of a mixture of 0.1 mL of 2,4-pentanodione and 25 mL of 4 M ammonium acetate was added to 1 mL of supernatant and mixtures were incubated for 2 h protected from light. Absorbance of samples was then determined at 400 nm in a UV3 Unicam UV VIS spectrophotometer, using their respective blanks as reference. To calculate the N-demethylating activity of the CYP450 system, a standard curve of formaldehyde was generated. Reaction rates were determined in conditions where product formation was linearly-dependent to time and protein concentration. To evaluate the antioxidant effect of rosemary extract, microsomes (1 mg protein/mL) were incubated for 5 min with this extract and then 20 min with Cu2+/ascorbate before determining this activity. Generation of the CYP450 monooxygenase spectrum CYP450 monooxygenase spectrum was obtained according to Omura and Sato (Omura and Sato, 1964). This method uses the ability of the carbon monoxide to coordinate with the heme group of the monooxygenase; the resulting conjugate has a peak of maximum absorbance at 450 nm (=91/mM/cm. The reaction mixture (blank and sample) contained 1 mg/mL microsomal protein, 5 mM sodium dithionite and 50 mM phosphate buffer, pH 7.4. The spectrum was generated following addition of carbon monoxide to the sample in a UV3 Unicam UVVIS spectrophotometer. To assess the possible interaction of compounds occurring in the rosemary extract with the CYP450 monooxygenase, 28 g of extract were added to microsomes prior or after the addition of sodium dithionite. A decrease in the absorbance at 450 nm of the CYP450 monooxygenase when incubated with the rosemary extract was interpreted as an interaction. Statistical analysis Data presented correspond to the mean of at least 4 independent experiments SEM. Statistical significance (ANOVA) and regression analyses were performed using Graph Pad Prism 5.0. Differences were considered as significant when p<0.05.

RESULTS Antioxidant capacity of Rosmarinus officinalis We first studied the antioxidant properties of an aqueous solution of a dry extract from rosemary leaves. As an initial test, we determined the content of polyphenols of this aqueous preparation, as detailed in Materials and Methods. We obtained detectable values of polyphenols content, equivalent to 0.53 0.009 (n=4) mol of catechin/mg extract or 87.9 1.53 mol of catechin/g vegetable drug. Thus, most likely the rosemary extract used will display antioxidant properties. DPPH bleaching is a common measure of antioxidant capacity of herbal extracts. As depicted in Fig. 1, rosemary extract induced DPPH bleaching, in a concentration-dependent manner. The dependence with concentration followed a semi-logarithmic curve (r=0.983). From the semi-logarithmic regression, we calculated that 19.02 0.87 g extract/mL (n=4) elicited the half-maximum bleaching effect on DPPH in the conditions tested (see Materials and Methods).
Figure 1. Effect of the rosemary extract on DPPH bleaching.

The dry extract from rosemary leaves was dissolved in H2O: ethanol (1:1) to 0.2 mg/mL and DPPH was dissolved in ethanol. The DPPH bleaching assay was performed as detailed in Material and Methods. Data are plotted as the mean SEM (n>4) of DPPH in Abs517/20min in a semi-logarithmic scale against the extract concentration. The IC50 value was calculated from the dose-response inhibition regression using the log [extract] (r=0.983).

As expected, the rosemary extract used in our study displayed antioxidant capacity as measured by the DPPH method. In our experience, this antioxidant capacity must be validated with biological systems to allow conclusion regarding the overall antioxidant properties of any herbal extract (Letelier et al., 2008).

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For this purpose, we used rat liver microsomes as a biological system and Cu2+/ascorbate as a ROS generating system. We tested the antioxidant capacity of the rosemary extract, as its ability to prevent several oxidative consequences of ROS generation by the Cu2+/ascorbate system: 1) lipid and thiol oxidation, 2) oxidative activation of UDPGT activity, and 3) oxidative changes on the CYP450 monooxygenase. Effect of rosemary extract on microsomal lipid peroxidation Incubation of rat liver microsomes with Cu2+/ascorbate led to the generation of 2.36 0.018 nmol TBARS/min/mg protein (n=4). As depicted in Fig. 2, pre-incubation of microsomes with rosemary extract prevented this lipoperoxidative effect in a linear-dependent manner (r=0.999), with an IC50 value of 5.63 g extract/mg protein.
Figure 2. Effect of the rosemary extract on microsomal lipid peroxidation elicited by Cu2+/ascorbate.

reflected in functional changes. Thus, titration of thiol groups in biological samples can be used as a marker for oxidative damage in proteins. Incubation of microsomes with Cu2+/ascorbate decreased the microsomal thiol content from 28.4 0.12 to 19.4 0.23 nmol thiol/mg protein (about 30%, n=4). As shown in Fig. 3, pre-incubation with the rosemary extract prevented the thiol loss in a linear-dependent manner (r=0.994), with an IC50 value of 13.05 g extract/mg protein.
Figure 3. Effect of the rosemary extract on the microsomal thiol content loss elicited by Cu2+/ascorbate.

Microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; thiol groups were titrated with DTNB according to Material and Methods. Data are presented as % residual thiols using untreated microsomes as control (28.4 0.12 nmol thiol/mg protein, n=4) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.994).

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; lipid peroxidation was assayed as TBARS generation, as described in Materials and Methods. Data are presented as % lipid peroxidation using untreated microsomes as control (2.36 0.018 nmol TBARS/min/mg protein, n=4) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. The IC50 value was obtained from the linear regression of the data (r=0.999).

Effect of rosemary extract on the oxidative damage of CYP450 monooxygenase The Cu2+/ascorbate system causes conformational changes on the CYP450 monooxygenase, which are reflected as a loss in the characteristic absorbance at 450 nm of the protein conjugate with carbon monoxide (see Materials and Methods). As shown in Fig. 4, Cu2+/ascorbate led to a progressive loss of this absorbance in time, effect that was completely abolished when pre-incubating microsomes with the rosemary extract. Effect of rosemary extract on the oxidative activation of the UDPGT activity UDPGT is a microsomal enzyme that becomes activated by the Cu2+/ascorbate system (Letelier et al., 2007). Indeed, incubation of microsomes with

Effect of rosemary extract on microsomal thiol oxidation Thiol groups occurring in the lateral chain of proteins are reactive to oxidation by ROS, likely leading to structural changes in proteins that are
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this system elicited the increase in the UDPGT activity, in terms of p-Nitrophenol conjugation, from 12.57 0.30 to 26.6 0.16 nmol conjugate/min/mg protein (~2-fold, n=4). As depicted in Fig. 5, preincubation of microsomes with low concentrations of rosemary extract (up to 28 g extract/mg protein) prevented the UDPGT activation in a concentrationdependent manner. Remarkably, higher concentrations of rosemary extract (56 and 112 g extract/mg protein) elicited inhibition of the UDPGT activity compared with the untreated control without Cu2+/ascorbate. This is suggestive of additional nonoxidative mechanisms taking place under the conditions tested. It is possible that the polyphenols occurring in the rosemary extract may be inhibiting this enzymatic activity by competing with its substrate p-nitrophenol. In agreement to this postulate, pre-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract, in the absence of Cu2+/ascorbate, inhibited the conjugation of p-nitrophenol in a linear-dependent manner (r=0.999), as shown in Fig. 6.
Figure 4. Effect of the rosemary extract on the changes of UDPGT activity elicited by Cu2+/ascorbate.

Figure 5. Effect of the rosemary extract on the CYP450 monooxygenase content loss elicited by Cu2+/ascorbate.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; CYP450 monooxygenase content was assayed as described in Materials and Methods. Data are presented as a time plot of the % residual CYP450 monooxygenase content using the initial Abs450 as 100%, and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. Closed circles: control (without incubation with rosemary extract) and closed squares: microsomes pre-incubated with rosemary extract.

Figure 6. Effect of the rosemary extract on UDPGT activity.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract prior to incubation with Cu2+/ascorbate; UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, as detailed in Materials and Methods. Data are presented as fold UDPGT activity change in a semi-logarithmic plot, using untreated microsomes as control (12.57 0.30 nmol conjugate/min/mg protein, n=4, dotted line) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the doseresponse inhibition regression using the log [extract] (r=0.998).

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and UDPGT activity was assayed using p-Nitrophenol as substrate and UDPGA, according to Materials and Methods. Data are presented as % residual UDPGT activity using untreated microsomes as control (12.57 0.30 nmol conjugate/min/mg protein, n=4) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. The solid line depicts the linear regression of the data (r=0.999).

Effects of Rosmarinus officinalis on the drugmetabolism pathway The inhibition of UDPGT activity when microsomes are pre-incubated with rosemary extract
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in the absence of Cu2+/ascorbate (Fig. 6) is in agreement with the idea that polyphenols from this extract may behave as xenobiotic compounds. As such, they would be a substrate of drug-metabolizing enzymes occurring in rat liver microsomes, including UDPGT, explaining the inhibitory effect on the conjugation of p-nitrophenol. If this postulate is correct, then rosemary extract should also behave as an inhibitor of other drug-metabolizing enzymes, decreasing the activities of GST and/or the CYP450 system. Therefore, we studied the effect of the rosemary extract on: 1) the conjugation of 1-chloro2,4-dinitrobenzene with GSH, reaction catalyzed by GST, and 2) N-demethylation of aminopyrine reaction catalyzed by the CYP450 system. Effect of rosemary extract on GST activity GST isoenzymes, along with UDPGT, catalyze reactions of conjugation of xenobiotics (Phase II). GSTs catalyze the conjugation of lipophilic and highly electrophilic compounds with GSH. We assayed the microsomal GST activity using 1-chloro2,4-dinitrobenzene as a substrate, with a control value of 1.12 0.003 mol conjugate/min/mg protein (n=4). As shown in Fig. 7, re-incubation of microsomes with increasing concentrations of rosemary extract led to inhibition of microsomal GST activity, in a concentration-dependent manner. These data are in agreement with the rosemary extract potentially behaving as a competitor of the conjugation of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene with GSH by microsomal GST. Effect of the rosemary extract on the Ndemethylation of Aminopyrine by the CYP450 system The CYP450 system catalyzes the oxidation of lipophilic compounds (Phase I). We assayed the Ndemethylation activity of the CYP450 on Aminopyrine, and obtained a control value of 39.02 0.53 nmol product/min/mg protein (n=8). As depicted in Fig. 8, pre-incubation of microsomes with rosemary extract slightly inhibited this activity. As observed with GST, these data are in agreement with the idea that the rosemary extract may act as a competitor of the CYP450 system metabolism.

Figure 7. Effect of the rosemary extract on microsomal GST activity.

Rat liver microsomes (0.1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and GST activity was assayed using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene as substrate and GSH, according to Materials and Methods. Data are presented as residual GST activity (in mol conjugate/min/mg protein) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. * p<0.05 compared to control (one-way ANOVA).

As indicated above (Materials and Methods), to measure the structural changes of the CYP450 monooxygenase, microsomes are treated with sodium dithionite to reduce the heme group to a Fe2+ form. In this condition, the Fe2+ is able to react with carbon monoxide, and the product displays a characteristic and classical peak of absorbance at 450 nm (Omura and Sato, 1964). Substrates of the CYP450 system bind, as a first step, to the heme group of the CYP450 monooxygenase in the Fe3+ form. If the rosemary extract is competing CYP450 system substrates, preincubation of microsomes with this extract before reduction and formation of the CYP450 monooxygenase-CO complex should lead to a loss in the absorbance at 450 nm. The non-specific binding of rosemary extract compounds to the membrane was assessed by performing this assay incubating microsomes with this extract after reduction and formation of the CYP450-CO complex. Thus, the difference in the absorbance loss (Fig. 9, inset) will correspond to the specific binding. As shown in Fig. 9, both conditions led to a decrease in the absorbance at 450 nm, but this decrease was partially prevented by reduction and formation of the CYP450 monooxygenase-CO complex prior to incubation with the extract.

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Figure 8. Effect of the rosemary extract on the N-demethylating activity of the CYP450 system.

Figure 9. Effect of the rosemary extract on the CYP450 monooxygenase content.

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with increasing concentrations of the rosemary extract and the Ndemethylating activity of the CYP450 system was assayed using Aminopyrine as substrate and a NADPH-generating system, according to Materials and Methods. Data are presented as residual CYP450 activity (in nmol product/min/mg protein) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. * p<0.05 compared to control (one-way ANOVA).

Rat liver microsomes (1 mg protein/mL) were incubated with the rosemary extract prior to (closed circles, total loss) or following (closed squares, nonspecific loss) the reduction of the Fe3+-form of the CYP450 monooxygenase, formation of its complex with carbon monoxide, and measurement of the absorbance at 450 nm, according to Material and Methods. Data are presented as residual CYP450 monooxygenase (in nmol/mg protein) and represent the mean SEM of at least 4 independent experiments. The inset depicts the difference calculated between the total and non-specific loss.

These data confirm that there are some molecules occurring in the rosemary extract that are likely competitive inhibitors of the CYP450 system activity. DISCUSSION When employing widely accepted methods to study the antioxidant capacity of the rosemary extract used in this study, we detected polyphenols occurring in the hydro-alcoholic solution of the dry extract. In addition, this extract displayed DPPH bleaching activity (Fig. 1). In our experience, the use of DPPH is only useful when screening the relative antioxidant capacity of several herbal extracts or isolated compounds. This determination, however, may underestimate the true antioxidant capacity of compounds in biological systems, since DPPH and oxygen free radicals display different redox mechanisms (Letelier et al., 2008). In agreement with this, the IC50 for the antioxidant activity of the rosemary extract in terms
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of microsomal lipid peroxidation and thiol oxidation by the Cu2+/ascorbate system were 4- and 2-fold lower, respectively, than that obtained for the DPPH bleaching assay (Figs. 2 and 3). Moreover, this extract was able to completely prevent the oxidative structural damage on the CYP450 monooxygenase elicited by the Cu2+/ascorbate system (Fig. 4). In summary, the antioxidant capacity of a substance is a property comprising much more than just a free radical scavenging activity. Therefore, we strongly advice a systematic analysis of the antioxidant capacity of herbal extracts/compounds using biological systems, in addition to the screening with synthetic free radicals, such as DPPH or ABTS. Remarkably, when studying the antioxidant capacity of the rosemary extract in terms of protecting UDPGT from oxidative activation by the Cu2+/ascorbate system (Letelier et al., 2007), we found that the extract inhibited this activity at the highest concentrations tested (Fig. 5). The inhibitory

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property of the rosemary extract on the UDPGT activity, however, gave precedence to its antioxidant capacity. On the other hand, this result suggested that compounds found in the rosemary extract could behave as inhibitors of the drug-metabolizing enzymes occurring in microsomes: UDPGT, microsomal GST and the CYP450 system. A systematic analysis of the concentration-dependent effect of the rosemary extract on reactions catalyzed by each of these enzymes (Figs. 6, 7, and 8) showed the inhibitory properties of the rosemary extract on all reactions tested. This strongly suggested that molecules occurring in this extract, being xenobiotic compounds, are likely to be substrates of these enzymes and, consequently, competitive inhibitors of the reactions these enzymes catalyze. This was further confirmed for the case of the CYP450 system, in which we could detect specific binding of compounds occurring in the herbal extract to the Fe3+-form of the CYP450 monooxygenase (Fig. 9). Taken together, these findings indicate that the rosemary extract must contain lipophilic substances that are substrates of the CYP450 system. Because this extract is able to inhibit the N-demethylation activity of this system, we postulate that is likely to contain lipophilic substituted amines. Noteworthy, most of the drugs used for the treatment of psychotropic disorders, such as antidepressants and anxiolytic medications, contain substituted amine groups. Therefore, it can be postulated that this rosemary extract may display psychotropic activity. Recently, it has been reported (conference abstract) that the same extract indeed displays antidepressant and anxiolytic activity in rats, mimicking the activities of fluoxetine and diazepam, respectively (Diaz-Veliz et al.,, 2008). Additional research is needed to test our postulates. In addition to a potential competitive effect of rosemary compounds on N-demethylation by the CYP450 system, there are other possible mechanisms for rosemary extract to have a psychotropic activity, such as the presence of sedative compounds (Gonzalez-Trujano et al, 2007; Machado et al, 2009). In this regard, it has been shown that rosemary extract contain certain polyphenols with sedative activity (Machado et al, 2009). Because polyphenols are biotransformed mainly by UDPGT, we believe it is unlikely these type of compounds can be substrates (and therefore, competitive inhibitors) of the CYP450 system. More research will be required to address if these are exclusive mechanisms or not.
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Rosemary is mainly used as a condiment. Our data demonstrate that a dry extract from rosemary leaves displays antioxidant activity in biological systems, as evaluated in rat liver microsomes. Furthermore, compounds occurring in this extract are able to inhibit the drug-metabolizing pathways in a manner that gives precedence to their antioxidant capacity. CONCLUSION Our results suggest that the presence of compounds with substituted amine groups in herbal extracts, assessed as their capacity to competitively inhibit the N-demethylating activity of the CYP450 system, is related to a potential psychotropic activity. To the best of our knowledge, this is the first indication of potential psychotropic activity in an herbal extract. We are currently researching this possibility for rosemary and other herbal extracts. REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 498 - 508 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes
[Capacidad antioxidante y contenido polifenlico de doce infusiones medicinales usadas tradicionalmente en los Andes sudamericanos]
Leonel E. ROJO 1, Julio BENITES 1, Jos LPEZ 1, Mauricio ROJAS 1, Pilar DAZ 1, Jos ORDEZ 2, and Edgar PASTENE 2*
1

Laboratorio de Productos Naturales, Departamento de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile
2

Laboratorio de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.

Abstract
Twelve plants used traditionally in ethno-medicine from the South American Andes were studied. Infusions were compared in terms of their free radical scavenger properties, using four different methods (AAPH-induced haemolysis, TEAC-DPPH, FRAP and TEAC-crocin). All herbal teas showed a strong antioxidant capacity, the results obtained with FRAP and TEAC-DPPH being very similar. When compared at a dilution of 0.03%, Parastrephia lucida, Parastrephia lepidophylla, Senecio nutans, Azorella compacta and Baccharis tola, showed a protective effect against oxidative damage on human erythrocytes greater than that of Trolox (p < 0.001). Upon correlating the polyphenolic contents with the antioxidant capacity a positive association for all plants (TEAC-DPPH vs GAE; r2 = 0.7437) was found. Interestingly, there was a better correlation between polyphenolic contents and the protective effect against APPH-induced haemolytic activity. Keywords: Antioxidants; Free radical scavengers; Herbal infusion; Oxidative damage; Crocin assay.

Resumen
Se estudiaron doce plantas de los Andes Sudamericanos, tradicionalmente usadas en etno-medicina. Las infusiones preparadas fueron comparadas en cuanto a sus propiedades atrapadoras de radicales libres, mediante cuatro mtodos diferentes (hemlisis inducida por AAPH, TEAC-DPPH, FRAP y TEACcrocina). Todas las especies demostraron una marcada capacidad antioxidante, siendo los resultados obtenidos con TEAC-DPPH y FRAP muy similares. Al ser comparados a una dilucin de 0,03%, las especies: Parastrephia lucida, Parastrephia lepidophylla, Senecio nutans, Azorella compacta y Baccharis tola, mostraron un efecto protector del dao oxidativo sobre eritrocitos humanos superior al de Trolox (p < 0,001). Al correlacionar el contenido polifenlico con la capacidad antioxidante se encontr una asociacin positiva para todas las plantas (TEAC-DPPH vs EAG; r2 = 0,7437). Interesantemente, se observ una mejor correlacin entre los niveles de polifenoles y el efecto protector de la actividad hemoltica inducida por AAPH. Palabras Clave: Antioxidantes; Atrapadores de radicales libres; Infusiones herbales; Dao oxidativo; Ensayo de Crocina.

Recibido | Received: April 6, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 20, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009. Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financially supported by Direccin de Investigacin UNAP, Grant: Efecto protector de Plantas Altiplnicas de la I Rregin sobre biomembranas expuestas al dao oxidativo causado por radicales libres This article must be cited as: Leonel Rojo, Julio Benites, Jos Lopez, Mauricio Rojas, Pilar Daz, Jos Ordez, and Edgar Pastene. 2009. Antioxidant capacity and polyphenolic content of twelve traditionally used herbal medicinal infusions from the South American Andes. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):498 508. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email edgar.pastene@gmail.com

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Rojo et al.

Antioxidant capacity of herbal medicinal infusions from the South American Andes

INTRODUCTION For hundreds of years, since the pre-Hispanic period, the intake of herbal infusions has been deeply rooted among South Andean Amerindian Cultures (Aymara and Quechua) mainly based on the ethnomedicinal purposes attributed to these plants, e.g. for cardiovascular and gastrointestinal disorders (Villagrn et al., 2003). These plant species grow mainly in the Northern Chilean and Southern Peruvian Highlands, which are commonly known as the Altiplano. This geographical region is a unique environment located more than 3,000 meters above sea level (Rojo et al., 2006). The herbal teas brewed from these plants are claimed to have interesting biological properties such as anti-inflammatory, antimicrobial and antioxidant activities (Villagrn et al., 2003; Rojo et al., 2006). This suggests that local effects on the gastrointestinal tract may have a role in the pharmacological effects attributed to these infusions. Recent phytomedicinal studies have shown that a variety of compounds isolated from these species display strong anti-inflammatory, antimicrobial and antioxidant effects (Khknen et al., 1999; Wojdlo et al., 2007). However, to the best of our knowledge, there is no evidence available comparing the antioxidant activity of these medicinal beverages to date. This is an important shortcoming, since these herbal teas are widely consumed among the populations of Chile, Peru, Bolivia and Argentina and could be an important source of natural antioxidants. Today, a consistent body of evidence has been published supporting the role of oxygen and nitrogen derived reactive species (ROS and RNS) in the pathogenesis of cancer, cardiovascular diseases, chronic inflammatory processes and neurodegenerative disorders (Lai et al., 2001). Indeed, natural antioxidants can delay or inhibit lipid peroxidation and oxidative damage of DNA and proteins, which are molecular events that typically occur during chronic disease (Velioglu et al., 1998; Wang and Ballington, 2007). Thus, the consumption of natural antioxidants can offer protection against epidemiologically relevant diseases and also can be a potential source of natural antioxidants to be included in nutraceutical formulations or functional foods (Wong et al., 2006). In addition, several reports show that antioxidant properties of herbal teas and foods are positively correlated with their total polyphenol content (TPC) (Lu and Foo, 2001; Murthy et al.,
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2002). Thus, it is likely that those plants containing high levels of water-soluble polyphenols are of major interest as potential sources of natural antioxidants (Lu and Foo, 2001; Murthy et al., 2002; Revilla and Ryan, 2000; Gktrk et al., 2007) and aqueous infusions prepared with these plants can provide the intestine with water-soluble free radical scavengers acting either on locally generated ROS/RNS or as a systemic pool that could prevent the oxidation of biomolecules (Djeridane et al., 2006, Speisky et al., 2006). Based on this evidence, the interest in natural antioxidants, especially from plant sources, has progressively increased during the last fifteen years (Jayaprakasha et al., 2003). The purpose of this work is to study the antioxidant capacities of twelve herbal teas widely consumed by South-American populations, mainly those living in the highlands of northern Argentina and Chile, southern Per and western Bolivia. These herbal teas were prepared from plants grown under similar climatic conditions and were assessed for their in vitro antioxidant capacities. In this study, the free radical scavenging capacities of the herbal teas were followed via their reaction with the stable DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) free radical, their capacity to inhibit AAPH-induced haemolysis, their ferric reducing antioxidant power (FRAP) and their capacity to delay the bleaching of crocin induced by the radical initiator AAPH. For these twelve aqueous extracts (infusions or teas), correlations were established between the total polyphenol content and the result of different assays addressed to evaluate the antioxidant capacity. MATERIAL AND METHODS Plant material Twelve plant species were collected fresh in July 2004 in the province of Colchane located at 3500 m.a.s.l., in the region of Tarapac in Chile. The plant material was identified and authenticated by Prof. Dr. Roberto Rodriguez at the Universidad de Concepcin. Voucher specimens are deposited in the Herbarium of the University of Concepcin and in the Laboratory of Natural Products at Arturo Prat University. The plants studied here and their specific locations were as follows: Aawaya (Adesmia melanthes Philippi, Fabaceae, 191782S, 684084W), Chachacoma (Senecio nutans, Asteraceae, 191786 S, 684083 W), Chana (Chuquiraga atacamensis Kuntze, Asteraceae,

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191786S, 684083 W) Kipa hembra (Fabiana densa J. Remy, Solanaceae, 191869 S, 684047 W), Kipa macho (Fabiana squamata, Solanaceae, 192119S, 684285 W), Lampaya (Lampaya medicinalis Phil., Verbenaceae, 191786S, 684083W), Llareta (Azorella compacta, Apiaceae, 198686S, 684095W), aca (Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig, Asteraceae, 191786 S, 684083 W), Puskayu (Opuntia ignescens, Cactaceae, 191781S,684389W), Rika-Rika (Acantholippia deserticola, Verbenaceae, 1918194S, 6841125 W), Tola (Parastrephia lepidophylla Wedd, (Asteraceae, 191888S, 684385W), Umatola (Parastrephia lucida. Meyen. Cabrera, Asteraceae, 191772 S, 683896 W). Upon arrival at the laboratory, herbal samples were cleaned with tap water to remove debris. Then the plant material was air-dried at room temperature in a ventilated area. The dried leaves were stored in sealed polyethylene bags with silica gel included as a desiccant. Chemicals AAPH (2,2-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride) and DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) and TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine) were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Folin-Ciocalteu reagent, and other chemicals and solvents were procured from Merck (Darmstadt, Germany) and were of analytical grade. Extraction Dried samples (20 g) were ground using a domestic blender and extracted with 80 mL of deionised water. Next, the mixtures were heated for 5 min, with occasional agitation. Then the herbal teas were passed through 40 m filter paper (Whatman). Determination of total polyphenolic content The total polyphenolic contents in the herbal teas were evaluated with Folin-Ciocalteu reagent according to the method of Singleton and Rossi (1965), using gallic acid as a standard. Briefly, 100 L of aqueous extracts were mixed with 200 L of Folin-Ciocalteau reagent, 2 mL of distilled water, and 1 mL of 20 % Na2CO3, and the absorbance of the mixture was measured at 765 nm after incubation for 1 hour at room temperature. Standard plots were made from gallic acid solutions (5 20 mg/L, final
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concentration). The equation of the gallic acid calibration curve was y = 0.091x + 0.0229 (r2 = 0.9951) and results were expressed as mg per litre of gallic acid equivalents (GAE). Samples were analyzed in triplicate. Antioxidant assays DPPH radical scavenging assay (TEAC-DPPH) For radical scavenging capacity the DPPH assay was used with slight modifications (Bonoli et al., 2004). Briefly, a 100 L sample of each extract was added to 2.9 mL of 100 mol/L DPPH solutions in methanol-water (8:2 v/v). A decrease in absorbance was determined at 517 nm during 30 min at 25C. The blank reference cuvette contained only methanol-water (8:2 v/v). Differences in absorbance were compared with a standard plot made from Trolox solutions (20 200 mol/L), and results were expressed as mol of Trolox equivalents per litre of infusion (TEAC). All measurements were performed in triplicate. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) For the FRAP assay (Cao and Prior, 1998), a mixture of 100 mmol/L acetate buffer (pH 3.6), 10 mmol/L TPTZ, and 20 mmol/L ferric chloride (10:1:1 v:v:v) was prepared (FRAP reagent). To 900 L of FRAP reagent, 90 L of water and 30 L of sample were added. The absorbance readings started immediately after the addition of the sample, and were performed at 593 nm during 10 min. The blank consisted of 120 L of water and 900 L of reagent. The final absorbance of each sample was compared with those obtained from the standard curve made from Trolox (10 100 mol/L) and results were expressed as mol of Trolox per litre of infusion. All measurements were performed in triplicate. Crocin bleaching assay (TEAC-crocin) The crocin bleaching assay was used with minor modifications to the original protocol suggested by Tubaro et al., (1996). Briefly, crocin was extracted and purified from saffron according to the method of Ordoudi et al., (2006). A stock solution of crocin was prepared in methanol and was diluted with 0.1 mol/L phosphate buffer, pH 7.0 in order to obtain a 1.35 x 10-5 mol/L crocin solution (the absorption coefficient of crocin at 443 nm is 1.33 x 105/mol/cm). As initiator, a stock solution of AAPH (250 mmol/L) was prepared in phosphate buffer (10 mmol/L; pH 7.0). The assay was performed in the cuvettes adding

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the reactants in the following order: 20 L of sample (conveniently diluted in water) or standard, 80 L of AAPH (250 mmol/L) and finally 1000 L of crocin solution. The bleaching rate of crocin was monitored at 443 nm and 40 C during 25 min using a Jasco V500 spectrophotometer (Easton, USA). The blank reference cuvette contained only methanol-water (8:2 v/v). Antioxidant capacity was calculated using similar expressions adapted from ORAC methodology (Wang et al., 2000; Naguib, 2000). The corrected area under the relative absorbance curve (AUC) of each sample was compared with those obtained from the standard curve made from Trolox (3.5 60 mol/L) and results were expressed as mol of Trolox equivalent (TEAC) per litre of infusion. These TEAC values refer to the net protection (AUC) of crocin in presence of an herbal antioxidant. All measurements were performed in duplicate. Inhibition of AAPH-induced haemolysis Blood samples were obtained from healthy donors by venipuncture (Laboratory of Natural Products, Universidad Arturo Prat, Iquique, Chile), according to bioethical protocols approved by this institution. The citrated blood samples were centrifuged at 1000 xg for 10 min and washed three times with phosphate-buffered saline (PBS). Supernatant and buffy coat were carefully removed by aspiration after each wash. Washed erythrocytes were finally suspended in PBS. The haemolysis of erythrocytes induced by AAPH was assessed by using a modification of a method described previously (Miki et al., 1987). Briefly, 25 L aliquots of erythrocyte suspension were incubated at 37 C for 2.5 h in the presence of 100 mmol/L-AAPH to induce haemolysis. The advantages of this method were that the AAPH decomposes thermally to generate radicals without biotransformation or enzymes and the rate of radical generation is easily controlled by adjusting the concentration of initiator (Ko et al., 1997). The concentration that inhibited AAPH induced haemolysis by 50% (IC50) was determined for each herbal infusion. Haemolysis was monitored by spectrophotometry at 540 nm. All measurements were performed in triplicate.

experimental data. One-way analysis of variance (ANOVA) was used for statistical analysis. P-values less than 0.05 were considered statistically significant.

RESULTS Total polyphenol content (TPC) As shown in Table 1, total polyphenol content (TPC) values varied from 3668 to 31389 mg GAE/L of herbal infusion (average 15717 mg/L). Among these 12 Andean herbal infusions the lowest TPC (< 8000 mg GAE/L) was for Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig, and the order of TPC values was as follows: Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig < Chuquiraga atacamensis Kuntze < Azorella compacta < Fabiana squamata < Acantholippia deserticola. Seven infusions showed TPC > 10000 mg GAE/L: the order being as follows: Opuntia ignescens < Parastrephia lepidophylla (Wedd) Cabr. < Parastrephia lucida (Meyen) Cabr. < Lampaya medicinalis < Senecio nutans < Adesmia melanthes Philippi < Fabiana densa J. Remy. Antioxidant capacity (TEAC-DPPH, TEACcrocin and FRAP) The results described in Table 2 and Fig. 1 summarizes all the antioxidant studies we have performed in this work. In Table 2 we show the antioxidant capacity of 12 aqueous extracts addressed by different methods. By far the most potent antioxidant species according to the FRAP assay were Opuntia ignescens and Acantholippia deserticola. This is not the same pattern observed when analyzed by the TEAC-DPPH and TEACcrocin assays, which also differ between each other. Inhibition of AAPH induced haemolysis In our study, herbal teas from Parastrephia lucida, Baccharis tola, Azorella compacta and Senecio nutans displayed around twice the antioxidant activity displayed by 0.03% Trolox (Fig. 3). Fabiana densa, displayed an anti-haemolytic activity equivalent to Trolox (0.03% w/v). These results are in agreement with the high TPC of these species (Table 1). When concentrations of herbal infusions were increased up to 0.066 and 1.33% (w/v) a significantly greater antihaemolytic effect was observed only for Acantholippia deserticola infusion (Fig. 4).

Statistical analysis Data are reported as mean standard deviation. GraphPad Prism (Windows Release Version 4.0) software was used for statistical analysis of the
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Figure 1. Linear correlation between antioxidant capacity (TEACDPPH) and total phenolic content in 12 herbal infusions: A positive correlation is observed between TEAC-DPPH (Trolox equivalents), and total polyphenolic content (GAE mg/L) with a coefficient of determination r2 = 0.7239. The two-tailed P value is < 0.0001, considered highly significant.

Figure 2. TEAC-crocin assay results for 12 herbal infusions. (A) Representative kinetic curves from crocin bleaching (absorbance at 443 nm) induced by AAPH in the presence of different standard solutions of the water soluble antioxidant Trolox (3.5 60 mol/L). In the secondary plot (B) the AUC was plotted against Trolox concentration. The net AUC was equal to AUCstandard AUCblank. Graph B shows that AUC is proportional to the antioxidant activity.

1750 1500
TEAC-DPPH (mol L -1)

1250 1000 750 500 250 0 0 100 200


mg GAE L-1

300

400

Figure 3. Inhibition of AAPH induced haemolysis by herbal teas (0.033 % w/v). Parastrephia lucida, Senecio nutans, Azorella compacta and Baccharis tola displayed the highest protective effect (** p<0,001) when compared to Trolox. Also, herbal tea from Parastrephia lepidophylla, displayed a significantly higher antioxidant-antihemolitic effect than Trolox (* p < 0,01).

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Figure 4. Effect of tea concentration on antioxidant effect. The plot shows the inhibition of AAPH induced hemolysis by different concentrations of herbal teas. Herbal infusions form Acantholippia sp., Baccharis sp., Parastrephia lepidophylla, Azorella compacta, Senecio nutans and Adesmia melanthes (A) displayed a protective effect against RBC oxidative damage in a concentration dependent manner only in a narrow concentration range, from 0.0 to 0.3 % (w/v). For Lampaya medicinalis, Fabiana squamata, Chuquiraga atacamensis Kuntze and Opuntia ignescens (B) this protective effect was concentration dependent only from 0.0 to 0.15 % (w/v)

100

Acantholippia deserticola Antihaemolytic effect (%)


80

Baccaris tola Parastrephia lepidophyla

60

Azorella compacta Senecio nutans

40

Adesmia melanthes

20

0.0
100 90

0.2

0.4

0.6

0.8 Fabiana densa

Concentration (m/v)

Antihaemolytic effect (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0

Fabiana squamata Lampaya medicinalis Chuquiraga atacamensis Parastrephia lucida Opuntia ignescens

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Concentration (m/v)

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Table 1. Taxonomic data of 12 species used as herbal infusions in the Southern Andes

Family Fabaceae Asteraceae Asteraceae Solanaceae Solanaceae Verbenaceae Apiaceae Asteraceae Cactaceae Verbenaceae Asteraceae Asteraceae

Scientific name Adesmia melanthes Philippi Senecio nutans Chuquiraga atacamensis Kuntze Fabiana densa J. Remy Fabiana squamata Lampaya medicinalis Azorella compacta Baccharis tola Phil. subsp. altiplanica Hellwig Opuntia ignescens Acantholippia deserticola Parastrephia lepidophylla (Wedd.) Cabr. Parastrephia lucida (Meyen) Cabr.

Common name Aawaya Chachacoma Chana Kipa hembra Kipa macho Lampaya Llareta aca Puskayu Rika-rika Tola Umatola

Table 2. Summary of antioxidant capacity of species used as herbal infusions assessed by different methods.

Name Adesmia melanthes Phil. Senecio nutans Chuquiraga atacamensis K. Fabiana densa Fabiana squamata Lampaya medicinalis Azorella compacta Baccharis tola Opuntia ignescens Acantholippia deserticola Parastrephia lepidophylla Parastrephia lucida

Total phenolics a GAE mg/L 303 272 54 314 71 220 70 37 116 72 164 194

TEACb DPPH mol/L 1523 609 77 1026 74 1045 459 67 6 222 265 541

TEACb Crocin mol/L 1667 837 3660 8820 337 898 452 101 101 1169 1139 1072

FRAPc mol/L 7000 4100 2500 5700 3300 1870 2300 1800 51800 56200 4200 4400

a b

mg of gallic acid equivalents per litre of aqueous extract.

The antioxidant capacities estimated by crocin and DPPH assays were expressed as Trolox equivalents per litre of aqueous extract. The data are displayed with mean standard deviations of three replications. The antioxidant capacities estimated by FRAP assay were expressed as Trolox equivalents per litre of aqueous extract.

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DISCUSSION It is important to highlight the fact that FRAP reflects the presence of all reducing substances in a certain matrix, not only polyphenolic compounds. Thus, the presence of non-phenolic substances, such as vitamin C and Cu (I) cannot be ruled out. Hence, interpretations of FRAP results must consider these potential limitations. As well, in order to avoid incorrect interpretation of TPC measurements by the Folin-Ciocalteu method, the same consideration must be taken into account. Despite these limitations in the FRAP and TPC methods, correlations between total polyphenolic content and FRAP values are widely used to assess the antioxidant potential of herbal infusions and other foodstuffs (Heimler et al., 2007). Currently, many investigators use the TAC assay to assess the antioxidant capacity of a wide variety of samples. Usually, the method is based on an endpoint measurement after an incubation period during which the azo-initiator (AAPH) promotes crocin bleaching. An important scientific contribution of our work is to improve on the classical TAC methodology, where the area under the relative absorbance decay versus time curve is used as an index of antioxidant capacity (Figure 2). This approach is similar to what is done in the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay, in which the oxidation of the fluorescent probe fluorescein is monitored over time. Area under the curve (AUC) determination has remarkable advantages in comparison with endpoint measurements (Cao et al., 1998). Thus, these kinetic approaches allowed us to combine information from two measurements; (i) the rate of crocin bleaching over time and (ii) the endpoint value, both in a single parameter. TEAC-crocin antioxidant capacity, calculated this way, positively correlated with the total polyphenol content (TPC) in these twelve herbal teas (Table 2). The oxidation of red blood cells (RBC) by molecular oxygen was performed in an aqueous suspension with the azo-compound AAPH as a freeradical initiator. The RBC membranes are oxidized at a constant rate by a free-radical chain mechanism, resulting in haemolysis. The extent of haemolysis is proportional to the concentration of free radicals and is inhibited by water-soluble antioxidants. This is an excellent model to study RBC free radical damage in animals and humans. Compared to other in vitro assays, the best correlations between antioxidant capacity and TPC for these herbal teas were observed
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when using the AAPH-induced haemolysis assay. This difference may be explained by the lipidic and proteinic environment used as the substrate for oxidation reactions. A new method recently developed (Wolfe and Liu, 2007), provides promising avenues to understand the mechanisms of protection against oxidative damage in cell systems. The method is based on the use of HepG2 cell lines, AAPH and the intracellular probe 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). In this system the production of reactive oxygen species (ROS) is monitored spectrofluorometrically while DCFH-DA diffuses through the cell membrane and is enzymatically hydrolyzed by intracellular esterases to the nonfluorescent derivative dichlorofluorescin (DCFH). The latter can be rapidly oxidized to the highly fluorescent dichlorofluorescin (DCF) in the presence of ROS (Wolfe and Liu, 2007). This is relevant if we consider that several of the herbal species studied in this work have been reported to contain non-phenolic liposoluble compounds that could participate in the protection against ROS damage in cell systems. Despite the high TPC determined for Lampaya medicinalis infusions, a low anti-haemolytic activity was observed. The latter suggests that other hydrosoluble compounds such as carbohydrates, saponins, lignans, alkaloids, tannins and small proteins could exert haemolytic effects, thus decreasing the protective effect of soluble phenolic antioxidants. These interesting results encourage us to undertake further investigations to increase the phytochemical information on this species in order to fully understand which the main contributors to the overall antioxidant power are. Nevertheless, in some cases the available chemical information does not allow us to predict potential antioxidant effects at all. For example, in the case of Senecio nutans several volatile compounds were identified by De Feo et al., (2003). They highlighted the presence of sabinene and -terpinene as main components of the essential oil. Without proper experimental evidence it is difficult to address the question if some of the volatile compounds themselves or their mixture displays an antioxidant effect. . An increasing body of evidence suggests that some volatile constituents of essential oils have potential roles as antioxidants in human health and food preservation (Takahashi et al., 2003; Grassmann et al., 2003; Kulisic et al., 2005). Other examples of isolated volatile phenolic compounds from essential oils are: thymol, carvacrol

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and eugenol, which have been reported to display an elevated antioxidant activity when assessed in vitro and also in vivo (Rao et al., 1999; Yanpallewar et al., 2004; Lee et al., 2005). Hitherto, Fabiana densa infusions have not been reported to display antioxidant activity. Only one report was found in the literature describing the isolation of two antibacterial compounds: ent-beyer15-en-18-O-succinate and ent-beyer-15-en-18-Ooxalate (Erazo et al., 2002). In the case of Azorella compacta, several reports have been published describing diterpenoids as the major compounds with biological activity. Many of these molecules are structurally related to the mulinane and azorellane nuclei (Loyola et al., 1997; Araya et al., 2003). These compounds have also been assessed for their hypoglycaemic and anti-Tripanozoma cruzi activities (Araya et al., 2003; Fuentes et al., 2005). However, no reference to the antioxidant activity of this species or its major secondary metabolites has been reported to date. The background for the herbal tea from Ch. atacamensis is quite different. In this case aerial parts of the plant have proved to be rich in vanillin, lupeol, betulin, erythrodiol, and the triterpene taraxast20(21)-ene-3,6-diol (Hoeneisen et al., 2000). Lupeol and betulin display strong free radical scavenging activity (Nagaraj, 2000; Oh et al., 2006) but the overall antioxidant capacity of this herbal tea is more likely associated with its polyphenolic content instead of these kinds of substances. Indeed, Jurez et al., (2002) identified some ubiquitous flavonoids in Ch. atacamensis, among them quercetin-3-O-glucoside, quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside, whose antioxidant properties have been widely reported and reviewed elsewhere (Silva et al., 2002; Heim et al., 2002). We have recently reported the composition of the essential oil of Acantholippia sp. The latter contains two major compounds ( and -thujones) accounting for almost 98% percent of the essential oil composition. Interestingly, the thujone diasteromers are convulsivant agents acting as non-competitive blockers of the gamma-aminobutyric acid-gated chloride channel. Therefore studies on the concentrations of these metabolites in herbal infusions are essential steps to understanding their overall effects on human health. It is important to highlight the potential neurotoxic effect of this herbal tea, since infusions of Acantholippia can extract substantial amounts of the essential oil increasing the risk of toxic effects from thujones in humans. To the
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best of our knowledge no previous evidence on antioxidant effects of this plant has been reported. CONCLUSION In the Chilean Andes and highlands peculiarly adverse environmental factors occur, such as frost and drought, which dramatically affect the length of the growth season. When the environmental temperature varies so dramatically, critical chill stress reduces the photosynthetic rate and promotes free radical damage (Wise and Naylor, 1987). Therefore we hypothesize that herbal species growing under these uniquely extreme environmental conditions have developed particularly potent non-enzymatic antioxidant mechanisms such as free radical scavengers and also photoprotective molecules. REFERENCES Araya J, Neira I, da Silva S, Mortara R, Manqu P, Cordero E, Sagua H, Loyola A, Bohrquez J, Morales G, Gonzlez J. 2003. Diterpenoids from Azorella compacta (Umbelliferae) active on Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 98(3):413-417. Bonoli M, Verardo V, Marcioli E, Caboni M. 2004. Antioxidant phenols in barley (Hordeum vulgare L.) flour: Comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds. J Agr Food Chem 52:51955200. Cao G, Prior R. 1998. Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clin Chem 44:13091315. De Feo V, Soria E, Urrunaga R, Senatore F. 2003. Chemical composition of essential oil of Senecio nitans Sch.-Bip. (Asteraceae). Flavour Frag J 18(3):234-236. Djeridane A, Yousfi M, Nadjemi B, Boutassouna D, Stocker P, Vidal N. 2006. Antioxidant activity of some Algerian medicinal plant extracts containing phenolic compounds. Food Chem 97:654-660. Erazo S, Zaldivar M, Delporte C, Backhouse N, Tapia P, Elmonte E,, Franco DF, Negrete. 2002. Antibacterial diterpenoids from Fabiana densa var. ramulosa. Planta Med 68, 361-363. Fuentes N, Sagua H, Morales G, Borquez J, San Martin A, Soto J, Loyola L. 2005. Experimental antihyperglycemic effect of diterpenoids of

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 509 - 518 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maz morado (Zea mays L.): Mtodo de extraccin
[Anthocyanins, total phenolic compounds and antioxidant activity of purple corn (Zea mays L) cobs: Extraction method]
Arilmi GORRITI GUTIERREZ1, Jorge ARROYO ACEVEDO1, Luisa NEGRON BALLARTE1, Bertha JURADO TEIXEIRA1, Harold PURIZACA LLAJARUNA1, Ilario SANTIAGO AQUISE1, Evelyng TAYPE ESPINOZA1, Fredy QUISPE JACOBO2
1

Facultad de Farmacia y Bioqumica. Universidad Nacional Mayor de San Marco, Lima, Per. 2 Empresa AGRONEGOCIOS PERUAGRO S.R.L., Lima, Per

Abstract
Anthocyanins, total phenolic compounds and antioxidant activity of the extracts of purple corn cobs were evaluated in the investigation. The extractions were carried out in ethanolic solutions to 20% and pH 2 conditioned according to a factorial design with the factors temperature and times both in 4 levels. The results indicate anthocyanins between 11.567 and 37.127 mg/g cob, total phenolic compounds expressed as GAE between 23.426 and 76.962 mg GAE/g cob, and DPPH remaining between 17.06 and 68.80 %. The analysis of lineal regression indicates highly significant dependences between the antioxidant activity and total phenolic compounds (r2 = 0.9974). Keywords: Corn purple cob; Zea mays; Anthocyanins; Phenolic compounds; Antioxidant activity, DPPH.

Resumen
Las antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de los extractos de corontas de maz morado fueron evaluados en la investigacin. Las extracciones se realizaron en soluciones etanlicas al 20 % y pH 2 acondicionadas segn un diseo factorial con los factores temperatura y tiempo ambos en 4 niveles. Los resultados indican antocianinas entre 11.567 y 37.127 mg/g de coronta, fenoles totales expresados como GAE entre 23.426 y 76.962 mg GAE/g de coronta, y DPPH remanente entre los 17.06 y 68.80 %. El anlisis de regresin lineal indica dependencias altamente significativas entre la actividad antioxidante y fenoles totales (r2= 0.9974). Palabras Clave: Maz morado; Zea mays; Antocianinas; Fenoles totales; Actividad antioxidante; DPPH.

Recibido | Received: January 30, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 15, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa de Per CONCYTEC, Proyecto No. 317-2007-CONCYTEC. This article must be cited as: Arilmi Gorriti Gutierrez, Jorge Arroyo Acevedo, Luisa Negron Ballarte, Bertha Jurado Teixeira, Harold Purizaca Llajaruna, Ilario Santiago Aquise, Evelyng Taype Espinoza, Fredy Quispe Jacobo. 2009. Antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas del maz morado (Zea mays L.): Mtodo de extraccin. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):509 518. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email arilmigorritig@gmail.com, agronegocios.peruagro@gmail.com.

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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Fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas de Zea mays

INTRODUCCIN El maz morado es una variedad pigmentada de Zea mays L., cultivado en Amrica Latina, principalmente en Per y Bolivia, donde se utiliza en la elaboracin de bebidas Chicha morada, mazamorras y otros alimentos (Escribano-Bailn et al., 2004); el maz morado es uno de los cereales donde la composicin de antocianinas ha sido definida por estudios de espectrometra de masas (LCDAS-MS), 1H y 13C RMN bidimensional homo y heteronuclear, HSCCC y HPLC-MS (Escribano-Bailn et al., 2004), el estudio de componentes desarrollado por Pascual-Teresa et al. (2002) y Schwartz et al. (2003) de un extracto comercial de corontas de maz morado revela la presencia de un dmero y derivados mono y di-glicosidados de cianidina, pelargonidina y peonidina, Tabla 1. Las caractersticas estructurales de las antocianinas y los colores atractivos que presentan, su relativa estabilidad en medio acuoso segn el pH con la presencia de estructuras tales como el catin flavilium, una base quinoidal, una pseudo base carbinol y

una chalcona (Mazza & Miniati, 1993; Giusti & Wrosltad, 2001; Cabrita et al., 2004), determinan una mayor estabilidad frente a cambios de pH, temperatura y exposicin a la luz, debido a procesos de copigmentacin y asociacin intermolecular e intramolecular que se desarrollan en el medio (EscribanoBailn et al., 2004; Salas et al., 2004), convierten a estos compuestos en fuentes potenciales de colorantes naturales (Escribano-Bailn et al., 2004; CevallosCasals y Cisneros-Zevallos, 2004; Giusti & Wrolstad, 2003), y sustancias activas de alimentos funcionales, nutracuticos y medicamentos (Korhonen, 2002). Los dobles enlaces deslocalizados en estos polifenoles y la presencia de otros compuestos fenlicos en las corontas de maz morado determinan una serie de propiedades que fueron demostradas en estos compuestos (Duhard et al., 1997). El objetivo principal de la presente investigacin fue la identificacin de las condiciones de extraccin de los compuestos activos de las corontas del maz morado a travs de la determinacin de antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante.

Tabla 1 - Componentes de un extracto comercial de antocianinas de corontas de maz morado Pico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Compuesto Dmero
a

Rf 14,0 28,8 34,8 37,2 39,8 42,3 43,2 47,7 48,9 49,5

[M]+ 899 449 433 463 535 519 549 563 547 577

Fragmentos [M+H]+ 737; 575; 423 287 271 301 449; 287 433; 271 463; 301 449; 287 433; 271 463; 301

AR (%) 1,8 54,3 6,1 14,7 11,6 3 5,5 2,6 0,2 0,1

Cianidina-3-glucsido Pelargonidina-3-glucsido Peonidina-3-glucsido Cianidina-3-(6-malonilglucsido) Pelargonidina-3-(6-malonilglucsido) Peonidina-3-(6-malonilglucsido) Cianidina-3-(6-etilmalonilglucsido) Pelargonidina-3-(6-etilmalonilglucsido) Peonidina-3-(6-etilmalonilglucsido)

a: Dmero formado por la condensacin directa de un flavan-3-ol y cianidian-3,5-diglucsido, AR: Abundancia relativa. Resultados encontrados por Pascual-Teresa et al. (2002).

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Fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas de Zea mays

MATERIALES Y MTODOS Materiales y reactivos Las corontas de maz morado del cultivar testigo Joya (TJ) utilizados en la investigacin se obtuvieron de mazorcas recolectadas en un campo experimental del distrito de la Joya del Departamento de Arequipa, Per, ubicado aproximadamente en latitud sur 162527 y longitud oeste 714843 sobre los 1644 metros sobre el nivel del mar, entre los meses de febrero y abril del 2008. Todos los reactivos y solventes utilizados fueron de grado analtico Sigma Aldrich Chemical Co. y Merck. Mtodos Preparacin del extracto y determinacin de antocianinas segn el mtodo de pH diferencial Alrededor de 2,5 g de muestra (coronta molida y tamizada de maz morado) fueron extrados con 200 mL de solucin etanlica al 20 % y pH 2, bajo determinadas condiciones de tiempos de extraccin (30, 60, 120 y 240 min.) y temperaturas de extraccin (25, 60, 75 y 90 C). Los extractos obtenidos fueron filtrados a travs de papel filtro (Whatman No.1) con la ayuda de una bomba de vaco (COPELAMETIC, USA), y una alcuota del extracto se diluyen convenientemente en una fiola de 25 mL con las soluciones buffer de cloruro de potasio (pH 1) y acetato de sodio (pH 4.5). En las soluciones preparadas se determin el contenido de antocianinas segn el mtodo de pH diferencial, de acuerdo a Giusti & Wrosltad (2001) utilizando un espectrofotmetro UV-Vis (PHARO 300, Merck) y su contenido se expres como cianidina-3-glucsido de acuerdo a la siguiente expresin:
Antocianinas (mg/L)= A MW FD 1000/( l) (1)

Determinacin de fenoles totales La cantidad de fenoles totales se determin segn el mtodo de Folin-Ciocalteu usando cido glico como estndar, para esto se prepararon soluciones de 40, 80, 120, 160 y 200 ppm con las que se construy la curva de calibracin, dando un r2= 0,9994. El procedimiento para la evaluacin de fenoles totales fue el siguiente, una alcuota de la muestra (0,7 mL) se mezcl con 7 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu, (10 %) dejndose en reposo por 3 min, seguidamente se mezclaron con 7 mL de carbonato de sodio (7,5 %) y la solucin resultante se dej en reposo por 2 horas a temperatura ambiente y en oscuridad, las absorbancias de las muestras fueron ledas a 760 nm en un espectrofotmetro UV-Vis. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado, y los fenoles totales fueron expresados como equivalentes en miligramos de cido glico (GAE) por g de muestra (Fiskaa et al., 2007; Hlya, 2007; Zheng et al., 2007). Determinacin de la actividad antioxidante segn DPPH El efecto antioxidante de las muestras sobre el radical estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) se evalu de la siguiente manera, 0.1 mL de la muestra se procede a mezclar con 3.9 mL de una solucin 0,25 mM del radical DPPH, se homogeniza y dejan en reposo por 90 minutos en la oscuridad a 25 C, transcurrido el tiempo se procede a medir la absorbancia a 517 nm en el espectrofotmetro UVVis. El porcentaje remanente de DPPH en solucin fue calculado segn la ecuacin:
DPPH remanente (%) = (Ao Af)/ Ao x 100 (2)

Donde A (cambio en la absorbancia) = (A510 A700) a pH 1,0 (A510 A700) a pH 4.5; MW (del ingls molecular weight, masa molecular) = 449.2 g/mol para cianidina-3-glucsido; FD = factor de dilucin; l = longitud de paso de celda en cm; = 26900 (coeficiente de extincin molar) para cianidina-3-glucsido; 1000 = factor de conversin de gramos (g) a miligramos (mg); todos los anlisis fueron realizados por triplicado (n = 3), (Yang et al., 2007a; Wrolstad et al., 2003).

Donde: Ao, Af, representan respectivamente las absorbancias inicial del DPPH y de la muestra con DPPH despus de 90 min. Todos los anlisis fueron realizados por triplicado (n= 3), (Prez et al., 2003; Llorach et al., 2008; Iqbal et al., 2007).

Anlisis estadstico Todos los resultados fueron analizados en el paquete estadstico SAS V7 (SAS Institute Inc.), el anlisis factorial implementado a nivel de laboratorio para la preparacin de los extractos contemplo los factores: temperatura de extraccin (25, 60, 75 y 90 C; 4 niveles) y tiempo de extraccin (30, 60, 120 y 240 min; 4 niveles) bajo un pH de extraccin de 2 y una solucin etanlica al 20%. Los resultados fueron

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sometidos a un anlisis de varianza y prueba de rangos mltiples de Duncan (p<0,05) empleando el procedimiento GLM en un diseo completo al azar con arreglo factorial en el programa SAS, la hiptesis planteada en los experimentos fue que todos los tratamientos a la muestra (temperatura de extraccin y tiempo de extraccin) tienen el mismo efecto sobre la concentracin de antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante (Salinas y Daza, 1996; Chipana, 1997). RESULTADOS Y DISCUSIN Antocianinas La extraccin de antocianinas de las corontas de maz morado en solucin etanlica al 20% y pH 2, segn el diseo factorial que considero los factores temperatura de extraccin con los niveles 25, 60, 75 y 90 C, y tiempo de extraccin con los niveles 30, 60, 120 y 240 min, indica que existen diferencias altamente significativas con p < 0,01 para los diferentes tratamientos realizados a la muestra segn

el anlisis de varianza, y prueba de rangos mltiples de Duncan con p < 0,05, Tabla 2. Los valores encontrados para las antocianinas extradas de las corontas de maz morado, segn las diferentes condiciones de extraccin y la expresin (1), indican valores entre 11,567 mg/g coronta para el tratamiento 1 (Temperatura de 25 C y tiempo 30 minutos) y 37,127 mg/g coronta para el tratamiento 12 (temperatura de 75 C y tiempo de 240 minutos). De acuerdo al anlisis de significancia de Duncan con p < 0,05 se observa que las mejores condiciones de extraccin de antocianinas de las corontas de maz morado se realizan a la temperatura de 75 C y en tiempos de 120 y 240 min, Tabla 2 y Fig. 1, las condiciones extraccin con bajos contenidos de antocianinas corresponden a la temperatura de 25 C y el tiempo de 30 minutos. Las condiciones de extraccin en solucin etanlica al 20% y pH 2 se encuentran consideradas en la patente No. US 7, 192,456 B2 (Method of preparing a purified purple corn colour agent) que recomienda soluciones hidroalcohlicas al 20 40% y pHs cidos, (Takahito et al., 2007).

Tabla 2 - Antocianinas, fenoles totales y DPPH remanente en los diferentes tratamientos


Temperatura T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (C) 25 25 25 25 60 60 60 60 75 75 75 75 90 90 90 90 Tiempo (minutos) 30 60 120 240 30 60 120 240 30 60 120 240 30 60 120 240 Antocianinas (mg/g muestra) 11,567 1,272 e 15,322 0,564 e,d 15,721 0,717 e,d 22,000 0,840 c,d 21,130 2,039 c,d 29,437 3,330 a,b,c 34,629 2,290 a,b 34,734 3,793 a,b 25,939 1,543 b,c 32,649 0,986 a,b 35,233 0,733 a 37,127 10,226 a 26,177 3,493 b,c 32,841 4,605 a,b 33,286 2,705 a,b 34,010 10,421 a,b Fenoles totales (GAE mg/g muestra) 23,426 0,233 m 29,081 0,178 k 27,337 0,102 l 29,995 0,128 j 70,037 0,058 i 70,748 0,155 h 71,561 0,077 g 72,442 0,051 f 73,796 0,058 e 73,830 0,155 e 74,761 0,106 d 75,337 0,134 c 75,202 0,178 d 75,658 0,205 b 76,962 0,254 a 76,945 0,178 a DPPH remanente (%) 68,80 0,087 a 65,95 0,121 b 65,90 0,158 b 65,39 0,139 c 17,07 0,451 k 18,28 0,138 i,j 19,47 0,190 g 20,11 0,359 f 27,11 0,190 d 21,71 0,139 e 20,06 0,263 f 20,21 0,182 f 20,03 0,124 f 18,98 0,155 h 18,63 0,268 i,h 18,11 0,155 j

T: tratamiento, solucin de extraccin: 20% etanol, pH de extraccin: 2, valores promedio de 3 repeticiones desviacin estndar. Las medias seguidas por las mismas letras dentro de cada columna no son significativas en p < 0,05.

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Figura 1 - Contenido de antocianinas segn temperatura y tiempo de extraccin en los diferentes tratamientos.
40 A n to c ia n in a s (m g /g m u e s tr a )
25 C 60 C 75 C 90C

Figura 2 - Contenido de antocianinas segn factores individuales de temperatura y tiempo de extraccin


40

30

Antocianina (mg/g muestra)

32.737 a 29.983 a 30

31.579 a

20

20

16.279 b 2 (a)

10

10

0 30 60 120 240

0 0 30 60 90

Tiempo de extraccin (min)

Tem peratura de extraccin (C)

Yang et al. (2007a), en un trabajo relacionado con la optimizacin de extraccin de antocianinas de corontas de maz morado de un cultivar de la China en soluciones etanolicas y metanolicas en medio cido acondicionados con cido actico y ctrico, encontraron valores cercanos a 6 mg/g muestra (5,90 mg de antocianina/g muestra) segn diseo factorial, ese mismo ao Yang et al. (2007b) en otra investigacin relacionada con la cintica de degradacin trmica de antocianinas del maz morado en medio acuoso encontraron el valor de 0,680 mg de antocianina/g muestra, en ambos casos los valores fueron inferiores a los hallados en la investigacin. Escribano-Bailn et al. (2004) en una revisin de antocianinas en cereales mencionaron contenidos de 1642 mg/100g en base hmeda para el maz morado y 1779 mg/100g en base seca, cercanos a los encontrados en la investigacin. La investigacin desarrollada por Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2007) sobre antocianinas de un extracto comercial de antocianinas del maz morado proveniente de Per, determin contenidos de antocianina/g de la fraccin acuosa (FA) segn HPLC-DAD en los niveles de 15,43 mg de cianidina 3-glucsido/g de FA, 2,33 mg de pelargonidina 3-glucsido/g de FA, 4,44 mg de peonidina 3-glucsido/g de FA, 10,37 mg de cianidina acilada 3-glucsido/g de FA, 2,83 mg de pelargonidina acilada 3-glucsido/g de FA y 4,85 mg de peonidina acilada 3-glucsido/g de FA, que hacen un total de 40,25 mg de antocianinas/g de FA, valores superiores a los encontrados en la investigacin.

40 Antocianina (mg/g m uestra) 28.675 a 30.990 a 31.968 a

30

20 21.203 b 10 2 (b)

0 0 50 100 150 200 250

Tiem po de extraccin (m in)

La evaluacin de los efectos individuales de la temperatura y el tiempo de extraccin sobre el contenido de antocianinas en los diferentes tratamientos segn pruebas de rangos mltiples de Duncan con p < 0,05 para determinar las mejores condiciones de extraccin considerando un solo factor (tiempo, temperatura), muestra que no existen diferencias de extraccin de antocianinas a las temperaturas de 60, 75 y 90 C, a pesar de que a los 75 C se observa el mayor valor promedio (32,737 mg/g de coronta), Fig. 2(a); segn el tiempo de extraccin las antocianinas extradas a 60, 120 y 240 min son estadsticamente similares, los valores se etiquetan como a, Figura 2(b); resultados que difieren cuando se evalan las interacciones entre ambos factores tiempo *temperatura, Tabla 2 y Fig.1, donde las mejores condiciones de extraccin

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corresponden a los tratamientos 11 y 12 con 35,233 y 37,127 mg/g de coronta, respectivamente. Fenoles totales El contenido de fenoles totales segn la metodologa de Folin-Ciocalteu muestra valores promedio expresados como equivalentes en mg de cido glico (GAE) por g de coronta para los extractos entre, 23,426 mg/g para las condiciones temperatura y tiempo de extraccin de 25 C y 30 min y 76,945 mg/g para la temperatura de 90 C y tiempo de 240 minutos. El anlisis de varianza de los fenoles totales encontrados en los diferentes extractos (16 tratamientos), de acuerdo al diseo factorial planteado indica diferencias altamente significativas con p < 0,01 para las diferentes condiciones de extraccin. Las mejores condiciones de extraccin de estos compuestos corresponden a los tratamientos 15 y 16 (temperatura de 90 C y tiempos de 120 y 240 min), segn la prueba de rangos mltiples de Duncan con p < 0,05 que en la Tabla 2 se etiquetan con letra a de la columna respectiva, Fig. 3.
Figura 3 - Fenoles totales segn temperatura y tiempo de extraccin en los tratamientos
100 25 C 80 G A E ( m g /g m u e s t ra ) 60 C 75 C 90 C

60

40

20

0 30 60 120 240

Tiempo de extraccin (min)

Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2007) en un estudio sobre compuestos fenlicos del maz morado, al analizar por HPLC-DAD la fraccin de acetato de etilo (FAE) de un muestra comercial de antocianinas de maz morado, determinaron los siguientes compuestos fenlicos segn tiempos de retencin (tr): 14,61 mg de cido protocatechuico/g de FAE con un tr de 4,62 min, 8,46 mg de cido vanillico/g de FAE con un tr de 8,87 min, 6,98 mg de un fenlico
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desconocido/g de FAE con un tr de 14,36 min, trazas de cido p-coumarico con un tr de 14,67 min, 20 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 15,90 min, 5,36 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 16,40 min, 20,02 mg de derivado de quercetina/g de FAE con un tr de 16,92 min, 11,55 mg de derivado de hesperitina/g de FAE con un tr de 18,67 min, 23,10 mg de fenlico desconocido/g de FAE con un tr de 18,95 min, y 25,79 mg de compuestos fenlicos derivados del cido hidroxicinmico/g de FAE con tr de 21,01; 21,64; 22,44 y 22,81 min, haciendo un total de 135 mg de fenoles totales/g de FAE, resultado que se encuentra por encima de los encontrados en la investigacin donde se alcanzaron los 76,962 mg GAE/g de coronta; sin embargo es necesario indicar que la muestra investigada por Pedreschi y CisnerosZevallos (2007) corresponde a una FAE de una muestra comercial de antocianinas (extracto atomizado), mientras que la muestra investigada por nosotros fueron corontas de maz morado. Los efectos individuales de la temperatura y el tiempo sobre la extraccin de los fenoles totales en los diferentes tratamientos segn el anlisis de varianza indica diferencias altamente significativas con p < 0,01 para las temperaturas y tiempos de extraccin, las pruebas de rangos mltiples de Duncan con p < 0,05 para determinar las mejores condiciones de extraccin considerando un solo factor (tiempo, temperatura), muestran que existen diferencias de extraccin de estos compuestos a las temperaturas de 25, 60, 75 y 90 C, Fig. 4(a); y diferencias de extraccin segn los tiempos de 30, 60, 120 y 240 min para estos compuestos, la Fig. 4(b) grafica y etiqueta estos resultados; siendo estos diferentes cuando se evalan las interacciones entre ambos factores, Tabla 2 y Fig. 3, donde las mejores condiciones de extraccin corresponden a los tratamientos 15 y 16 donde se alcanzaron los 76,962 y 76,945 mg GAE/g de muestra respectivamente. Luque-Rodrguez et al. (2007) al investigar la extraccin liquida en soluciones calientes de etanolagua de antocianinas y otros compuestos fenlicos de residuos de cscaras de uva producidos en la elaboracin del vino, produjo en muestras deshidratadas a 40 C valores de fenlicos totales iguales a 126 mg GAE/g de cscara y 17 mg de antocianina/g de cscara a los 60 min, valores que fueron superiores en fenoles totales pero similares en antocianinas a los encontrados en la investigacin.

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Figura 4. Fenoles totales segn factores individuales de temperatura y tiempo de extraccin.


100 74.431 b GAE (mg/g muestra) 80 71.197 c 76.192 a

< 0,01 en el anlisis de varianza, es decir el diseo factorial implementado con los factores temperatura y tiempo en sus diferentes niveles permite rechazar la hiptesis planteada segn los resultado de la actividad antioxidante (similares comportamientos se observaron en antocianinas y fenoles totales).
Figura 5 - DPPH remanente (%) al variar las condiciones de temperatura y tiempo de extraccin

60 40 27.459 d 20 0 -10 10 30 50 70 90

4(a)
240

18.11 90C 20.21 75C 20.11 60C 65.39 25C

Tiempo de extraccin (min)

Tem peratura de extraccin (C)

120

18.63 90C 20.06 75C 19.47 60C 65.90 25C 18.98 90C 21.71 75C 18.28 60C 65.95 25C 20.03 90C 27.11 75C 17.06 60C 68.80 25C

66 62.329 c GAE (mg/g muestra) 62 60.615 d 58 62.655 b

63.679 a

60

4(b)
30
54

50 0 50 100 150 200 250

20

40

60

80

100

Tiem po de extraccin (m in)

DPPH rem anente (%)

Actividad antioxidante La actividad antioxidante de los fenoles simples y polifenoles presentes en los diferentes extractos obtenidos segn diferentes tiempos y temperaturas de extraccin, frente al radical estable 2,2-difenil-1picrilhidracilo (DPPH) se realiz segn la metodologa descrita, donde una alcuota de la solucin antioxidante de los extractos hidroalcohlicos de la coronta de maz morado diluidos convenientemente (1/4) se hicieron reaccionar con la solucin de DPPH (Prez et al., 2003; Llorach et al., 2008; Iqbal et al., 2007). Los resultados hallados al finalizar el tiempo de reaccin muestran valores de DPPH remanente (%) entre 68,80 % para el tratamiento 1 y 17,06 % para el tratamiento 5, Tabla 2, Figs. 5 y 6. Los valores de DPPH remanente (%) para ser evaluados estadsticamente en un anlisis de varianza y prueba de significancia de contrastes mltiples de Duncan con p < 0,05 se transformaron a ar cos eno DPPH .remanente.(%) , los resultados indican que existen diferencias altamente significativas con p
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Figura 6 - DPPH remanente (%) en los diferentes tratamientos.


16 15 14 13 12 11 Tratamientos 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Blanco 0 20 40 60 80 18.11 j 18.63 i,h 18.98 h 20.03 f 20.21 f 20.06 f 21.71 e 27.11 d 20.11 f 19.47 g 18.28 i,j 17.07 k 65.39 c 65.90 b 65.95 b 68.80 a 100 100

DPPH rem anente (%)

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El anlisis de contrastes mltiples de Duncan con p < 0,05 muestra que los tratamientos 1-4 presentan la mayor cantidad de DPPH en solucin, siendo en consecuencia los tratamientos con las mas bajas capacidades antioxidantes, el anlisis tambin indica que los extractos con mayor capacidad antioxidante se encuentran en los tratamientos 5, 16, 15 y 14 debido a que presentaron las mas bajas cantidades de DPPH remanente (17,06; 18,11; 18,63 y 18,98%), las Figs. 5 y 6 describen estos resultados. El anlisis de significancia tambin indica que las extracciones de compuestos antioxidantes de las corontas de maz morado se realizan eficientemente a temperaturas entre los 60 y 90 C, y tiempos entre 60 y 240 minutos. Relaciones entre antocianinas, fenoles totales y actividad antioxidante El anlisis de varianza de la regresin lineal entre antocianinas y fenoles totales de los diferentes extractos de las corontas de maz morado indica relaciones altamente significativas con p< 0,01 y un r2= 0.5888, Fig. 7.
Figura 7 - Anlisis de regresin entre antocianinas y fenoles totales
60 Antocianina (mg/g muestra) 50 40 30 20 10 0 20 40 60 80

expresado en equivalentes Trolox con los fenoles totales de los frutos, encontrando relaciones cercanas a 1 (r2= 0,949).
Figura 8 - Anlisis de regresin entre DPPH remanente en solucin (%) y fenoles totales
80

y=
DPPH remanente (%) 60

-0. 9 893 x+

9 3.

269

R2

40

=0 . 97

74

20

0 20 40 60 80

GAE (m g/g m uestra)

6.7 33 3 5 5x + y = 0.3

2 0.588 8 8R =

GAE (m g/g m uestra)

Netzel et al. (2007) en el anlisis de frutos australianos nativos como origen de antioxidantes para alimentos, encontr relaciones similares a los encontrados en la investigacin con valores de r2= 0,545 entre antocianinas (mol/g peso fresco) y fenoles totales (mol/g peso fresco). La evaluacin de DDPH remanente en solucin (%) con los fenoles totales en los diferentes extractos a travs del anlisis de varianza de la regresin lineal muestra relaciones altamente significativas con p< 0,01 y r2=0,9774, indicando que la actividad antioxidante de los extractos del maz morado se debe a la presencia de compuestos fenlicos, Fig. 8; similares resultados hallaron Netzel et al. (2007) al evaluar la actividad antioxidante de los frutos nativos
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Por otro lado, Cai et al. (2004) en una investigacin relacionada con la actividad antioxidante y los compuestos fenlicos de 112 plantas de la medicina tradicional China asociadas con terapias del cncer, encontraron correlaciones altamente significativas en los extractos metanlicos (r2= 0,9638, 112 plantas; r2= 0,9530, 110 plantas) y acuosos (r2= 0,9580, 112 plantas, r2= 0,9504, 110 plantas) preparados a partir de las 112 plantas de la medicina tradicional China, sugiriendo que los compuestos fenlicos contribuyen significativamente a la capacidad antioxidante de las plantas. Entre los compuestos fenlicos se encuentran los polifenoles del tipo antocianina y otros fenlicos sencillos; dentro de la investigacin se evalo la relacin entre el DPPH remanente en solucin (%) con las antocianinas en los diferentes extractos, y los resultados del anlisis de varianza de la regresin lineal indican relaciones altamente significativas con p< 0,01 y r2= 0,5367, Fig. 9. CONCLUSIONES La extraccin de antocianinas en soluciones de etanol al 20 % y pH 2 de corontas de maz morado se realizan eficientemente a la temperatura de 75 C y tiempos entre los 120 y 240 minutos donde se alcanzaron los 35,233 mg/g coronta y 37,127 mg/g coronta, respectivamente, mientras los fenoles totales expresados como equivalentes de cido glico en mg/g de coronta llegaron a los 76,962 y 76,945 para los tratamientos 15 y 16 correspondientes a los 120 y 240 min y la temperatura de 90 C.

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Figura 9 - Anlisis de regresin entre DPPH remanente en solucin (%) y antocianinas


80

DPPH remanente (%)

60

y=40

1. 03 7

9x + 5 6. 3 18

R2

= 0.

536 7

20

0 0 10 20 30 40

Antocianina (m g/g m uestra)

La actividad antioxidante de las corontas de maz morado, expresada como porcentaje de DPPH remanente en solucin, se debe principalmente a los compuestos fenlicos presentes en solucin, estando en concordancia con lo informado en literatura. AGRADECIMIENTOS Los autores expresamos nuestro agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa de Per CONCYTEC, por el financiamiento a la presente investigacin del Proyecto No. 317-2007CONCYTEC.

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Gorriti Gutierrez et al.

Fenoles totales y actividad antioxidante de las corontas de Zea mays

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 519 - 528 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Actividad antioxidante e inhibicin de la peroxidacin lipdica de extractos de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)
[Antioxidant activity and inhibition of lipid peroxidation of mortio fruits extracts (Vaccinium meridionale SW]
Carlos GAVIRIA MONTOYA1, Clara OCHOA OSPINA1, Nelly SNCHEZ MESA1, Clara MEDINA CANO2, Mario LOBO ARIAS2, Paula GALEANO GARCA1, Ana MOSQUERA MARTNEZ1, Anglica TAMAYO TENORIO1, Yasmin LOPERA PREZ1, Benjamn ROJANO1*
1

Laboratorio de Ciencia de Alimentos. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln, Universidad Nacional de Colombia 2 CORPOICA La Selva, Km 7 va Rionegro Llanogrande, Antioquia, Colombia

Abstract
Mortio (Vaccinium meridionale fruits) is considered as a functional food. It is rich in polyphenolic compounds that have colorant and antioxidant properties, and these structures are potential health protectors. In this work phenol an anthocyanic contents were determined with values of 201 10 y 609 39 respectively; antioxidant activity was studied with the methodologies DPPH (2404 120 TEAC values), ABTS (8694 435 TEAC values) and FRAP (581 29 AEAC values); all results are comparable or higher than the Vaccinium reported in other researches. The effects of anthocyanic extracts of mortio were also studied over the lipidic peroxidacin of corn oil, analyzing the evolution of conjugated diene (CD), the value of peroxides (PV) and the formation of reactive substances with 2-thiobarbituric acid, as indicators of oxidation, expressed as the inverse of the rate of oxidation () with values of 3.0 10-4 8.9 10-6, 8.0 10-4 6.1 10-5 y 4.0 10-4 1.0 10-4, respectively. Keywords: peroxidation, mortio, antioxidant, Vaccinium

Resumen
El mortio (o frutos del Vaccinium meridionale) se puede considerar como un alimento nutracutico, porque es rica en compuestos polifenlicos que tienen la propiedad de ser colorantes y antioxidantes potencialmente protectoras de la salud. En este trabajo se determino el contenido de antocianinas y fenoles con valores de 201 10 y 609 39 respectivamente; la actividad antioxidante se estudio por las metodologas DPPH (2404 120 valores de TEAC), ABTS (8694 435 valores de TEAC) y FRAP (581 29 valores de AEAC), todos estos resultados son comparables o superiores a los Vaccinium reportados en otras investigaciones. Adems, se estudiaron los efectos de los extractos antocinicos del mortio sobre la peroxidacin lipdica de aceite de maz, analizando la evolucin de dienos conjugados, el valor de perxidos y la formacin de sustancias reactivas con el cido 2-tiobarbitrico, como indicadores de la oxidacin, expresados como el inverso de la tasa de deterioro () con valores de 3,0 10-4 8,9 10-6, 8,0 10-4 6,1 10-5 y 4,0 10-4 1,0 10-4, respectivamente. Palabras Clave: peroxidacin, mortio, antioxidantes, Vaccinium
Recibido | Received: August 10, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: October 30, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Los autores no tienen conflicto de intereses declarados. Financiacin | Funding: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) de Colombia, por el apoyo econmico a travs del proyecto numero 2008L1363-333 Citenlo como | This article must be cited as: Carlos Gaviria Montoya, Clara Ochoa Ospina, Nelly Snchez Mesa, Clara Medina Cano, Mario Lobo Arias, Paula Galeano Garca, Ana Mosquera Martnez, Anglica Tamayo Tenorio, Yasmin Lopera Prez, Benjamn Rojano. 2009. Actividad antioxidante e inhibicin de la peroxidacin lipdica de extractos de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):519 528. {EPub November 30, 2009}.

*Contactos | Contacts: brojano@gmail.com

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas

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Rojano et al.

Actividad antioxidante de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)

INTRODUCCIN Los antioxidantes son sustancias que disminuyen o retardan las reacciones de oxidacin sobre diferentes sustratos y pueden ser naturales o sintticos. El butilhidroxianisol (BHA), y el butil hidroxitolueno (BHT) son los antioxidantes sintticos de mayor uso en la industria de alimentos y farmacutica; sin embargo, se han encontrado efectos secundarios, como el aumento del colesterol, hepatomegalia e induccin de cncer heptico, entre otras (Fuchs, 1998; Bush and Taylor, 1998; Ito et al., 1983); debido a esto, y a la creciente importancia de los antioxidantes en la industria farmacutica y alimenticia es necesaria la bsqueda de molculas alternativas de origen natural con gran actividad y que no tengan efectos citotxicos, ni genotxicos (Lpez et al., 2008; Rojano et al, 2008a, Rojano et al, 2008b). Los productos vegetales, son entonces una alternativa para usar como antioxidantes, porque poseen una variedad de compuestos como: antocianos, flavonoides, carotenoides, acido ascrbico entre otros que pueden ser inocuos para la salud y que adems, actan a bajas concentraciones. Muchos antioxidantes son usados en la industria de alimentos por su capacidad conservadora; porque, retardan el proceso de rancidez, disminuyen la posibilidad de generacin de compuestos txicos, evitan la decoloracin de los pigmentos, no permiten los cambios en la textura, disminuyen la prdida de valor nutricional causada por la degradacin de los cidos grasos esenciales y por la destruccin de las vitaminas A, E y D (Parr and Bolwell, 2008; Rojano et al., 2008a; y muchos de estos compuestos o sus fuentes naturales, se consideran como nutracuticos. La industria qumica en las areas farmacuticas y de alimentos, consideran que el crecimiento del mercado de los antioxidantes requiere de la educacin apropiada del consumidor y de investigaciones cientcas pertinentes. Los estudios deben estar dirigidos a la bsqueda de compuestos puros o extractos activos como nuevas fuentes antioxidantes; y que a su vez, deben focalizarse hacia los benecios que producen los antioxidantes en la salud de modo preventivo (Cornelli, 2009). El gnero Vaccinium (Ericaceae) tiene cerca de 400 especies y los frutos han atrado el inters de muchos investigadores alrededor del mundo, debido al alto contenido de compuestos polifenlicos, tales como cido cinmico, flavonoles, antocianinas y
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antocianidinas (Parr and Bolwell, 2008; Kahkonen, 2001; Kalt et al., 2001; Prior et al., 1998). La actividad antioxidante de las bayas del gnero Vaccinium como: arndano (blueberry) y arndano rojo (lingonberry) se ha encontrado que est influenciada por el contenido de antocianinas y fenoles totales, los genotipos, la variacin en las condiciones ambientales, el estado de madurez de las frutas y de las condiciones de almacenamiento en poscosecha. (Beccaro et al., 2006; Cho et al., 2004; Lohachoompol, 2008; elik, 2008; Conner et al., 2002a, 2002b; Kalt et al., 1999, 2003). En la Zona alto Andina en Amrica del Sur, se reportan 3 especies de Vaccinium: V. corymbodendrum, V. floribundum y V. meridionale; distribuidas desde Venezuela hasta Bolivia a una altitud entre 2600 a 4000 m. En Colombia la especie Vaccinium meridionale es conocida como Mortio y la colecta se realiza de forma extractiva en los bosques, ocasionando dao a las poblaciones naturales debido a la gran demanda de los frutos. La agroindustria del mortio en Colombia es incipiente y el fruto es transformado en diferentes productos como dulces, mermeladas y vinos. Teniendo en cuenta el creciente inters en las propiedades nutraceticas de los frutos del genero Vaccinium y la gran demanda de aditivos naturales en los mercados internacionales; en este trabajo, se estudian las propiedades antioxidantes del mortio (V. meridionale), y se determina el contenido de compuestos polifenlicos; adems, se evalan los efectos de los extractos antocinicos sobre la conservacin a la peroxidacin lipdica de aceite de maz; analizando la evolucin de la formacin de dienos conjugados, valor de perxidos y la determinacin del contenido de sustancias reactivas con el cido 2-tiobarbitrico, como indicadores de la oxidacin. Todo esto, para sealar el uso potencial del mortio, como alimento nutracutico y aditivo conservante de la peroxidacin. MATERIALES Y MTODOS Material vegetal Los frutos evaluados fueron obtenidos de la coleccin de germoplasma de Vaccinium, ubicada en el Centro de Investigaciones La Selva de Corpoica, localizado en el municipio de Rionegro, Antioquia (Colombia) a 2120 msnm, a una temperatura promedia de 17 C y humedad relativa media del 78%. El lugar experimental pertenece a la zona de

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vida bosque hmedo Montano Bajo (bh-MB) y est ubicado a 06 08 06 de latitud norte y 75 25 03 de longitud oeste. El aceite de maz es libre de aditivos proveniente de Industrias del Maz, Cali, Colombia (libre de aditivos). Reactivos y equipos El radical libre DPPH (1,1-difenil2picrilhidrazilo), fosfato cido de sodio, MeOH, cido actico, tricloruro de hierro, 2,4,6-tri (2-piridil) triazina (TPTZ) fueron comprados a Aldrich Chem. Co (Millwakee, WI), cido 2,2-azinobis-(3etilbenzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS), cido tiobarbiturico (TBA), butilhidroxitolueno (BHT), 1,1,3,3 tetraetoxipropano (TEP) fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO), ciclohexano, acido clorhdrico, n-hexano, 2-propanol, 1-butanol, sulfato de hierro, cloruro de bario, tiosulfato de amonio y sulfato de bario fueron obtenidos de Merck (Alemania). El agua usada en los experimentos fue grado HPLC. Todos los experimentos se realizaron en un espectrofotmetro UV-Vis Jenway 6405. Preparacin de extractos para medir la actividad antioxidante Los extractos se obtuvieron de la siguiente forma: 20 g. de cada una de las muestras fueron homogenizadas, usando como solvente de extraccin metanolHCl 1% en una relacin (6:1 p/v). Este procedimiento se repiti hasta agotar la muestra. Los extractos fueron filtrados en papel Wathman No 4 y concentrados en un rotavapor a 40 C. Los extractos se almacenaron a 20 C durante el periodo de estudio. Preparacin de las muestras para la peroxidacin lipdica A 50 g de aceite de maz libre de aditivos, se adiciona el extracto antocinico mezclado con el agente emulsificante NP10, hasta obtener concentraciones finales de 250, 500 y 750 g/mL. Como patrn se utiliz BHT a una concentracin de 500 g/mL y como blanco de muestra se prepar una muestra de aceite sin antioxidantes. Se almacenaron en recipientes de vidrio a una temperatura de 30 C por 10 das. Los productos de oxidacin se evaluaron determinando el Valor de Perxido (PV), sustancias reactivas al cido 2-tiobartiurico (TBARS) y la formacin de dienos conjugados (DC).

Evaluacin de la capacidad antioxidante por el mtodo del DPPH Se emple el mtodo de Brand-Williams et al (1995) con algunas modificaciones (Rojano et al, 2008a). El 1,1-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), es un radical libre estable que presenta una coloracin prpura en medio metanlico, como consecuencia de la donacin de un electrn o un protn por un compuesto con poder antioxidante la tonalidad desaparece. Este procedimiento se lleva a cabo utilizando 10 L del compuesto estudiado y 990 L de la solucin metanlica de DPPH (20 mg/L). Como referencia se us la misma cantidad de DPPH y 10 L del solvente de la muestra (DMSO). Luego de 30 minutos de reaccin a temperatura ambiente y en la oscuridad, se lee la absorbancia a una longitud de onda de 517 nm. Para cada muestra estudiada se calcula el porcentaje de inhibicin del radical y los resultados se expresan como valores TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) mediante la construccin de una curva patrn usando varias concentraciones de antioxidante TROLOX. Evaluacin de la capacidad antioxidante por el mtodo del radical catinico ABTS+. La generacin del radical catinico ABTS+. constituye la base de uno de los mtodos espectrofotomtricos que mas se ha utilizado para determinar la actividad antioxidante total de extractos, compuestos puros, mezclas acuosas y bebidas (Re et al., 1999). El radical es un cromforo que absorbe a una longitud de onda de 415 732 nm y se genera por la reaccin de oxidacin del ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio)) (3,5 mM) con persulfato de potasio (1,25 mM). Despus de 24 h de reaccin, se ajusta la absorbancia con PBS pH 7,4 hasta 0,70 unidades, a una longitud de onda de 732 nm. Para la evaluacin se emplean 10 L del compuesto y 990 L de la solucin del radical ABTS+. Luego de 30 min de reaccin a temperatura ambiente y en la oscuridad, se lee el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo. La referencia consiste 10 L del solvente de la muestra y 990 L de la solucin del radical ABTS+. Los resultados se expresan como valores TEAC mediante la construccin de una curva patrn usando diferentes concentraciones de TROLOX (Arts et al., 2004).

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Actividad antioxidante de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)

Evaluacin de la capacidad reductora FRAP El principio de este mtodo est basado en el incremento en absorbancia debido a la formacin del complejo 2,4,6-tripyridil-s-triazina (TPTZ)-Fe(II) en presencia de un agente reductor (Benzie and Strain, 1996). El reactivo es una disolucin de TPTZ (10 M en HCl 40 M) y FeCl3 0,3 M en buffer cido actico-acetato de sodio (pH 3,4); la mezcla de reaccin consisti en 900 L de sta solucin, 50 L de una solucin del extracto en MeOH y 50 L de agua destilada. Luego de 7 min de reaccin se ley la absorbancia a una longitud de onda de 593 nm. Los valores FRAP son expresados teniendo en cuenta una curva de referencia de cido ascrbico como patrn primario; la actividad de cada muestra se expres como valor FRAP (mg de cido ascrbico por cada 100 g de antioxidante). Determinacin de fenoles totales La determinacin de fenoles se realiz por el mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi, 1965). Se construye una curva patrn usando como estndar cido glico. Se diluye el extracto a una concentracin en la cual el contenido de fenoles se encuentra dentro del intervalo de la curva patrn. Los resultados se expresaron como mg de cido glico/100g de fruta fresca. Las lecturas se realizan a 760 nm. Determinacin de antocianinas totales Las antocianinas totales se determinaron mediante el mtodo diferencial de pH (Gaviria et al., 2007). Las absorbancias fueron medidas a 530 nm y 700 nm en buffers de pH 1,0 y 4,5; usando la expresin A = [(A530 - A700)pH1.0 - (A530 - A700)pH4.5], y el cianidin-3glucsido con un coeficiente de extincin molar de 26900. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de cianidin-3-glucsido por 100 g de fruta fresca. Determinacin de dienos conjugados (DC) El contenido de DC se determin por un procedimiento descrito previamente (Zuta et al., 2007), con algunas modificaciones: 10 L de muestra se mezclan con 2990 L de ciclohexano y se agita en un vortex por 10 s, luego se toman 500 L de la mezcla y se le adicionan 1500 L de ciclohexano. La absorbancia de los dienos conjugados se mide a 234 nm. Los resultados se expresaron como valores de dienos conjugados (DC), el BHT se uso como
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referencia a una concentracin de 500 g/mL. Los valores de dienos conjugados (DC, adimensionales) se calculan segn la expresin: CD = A/C*L, donde A: Absorbancia de la muestra a 234 nm, C: Concentracin de la muestra (g/100 mL) y L: Longitud de la celda (cm) = 1 cm. Determinacin del valor de perxidos (PV) El valor de perxidos se determin mediante el mtodo descrito por Shanta & Decker (1994), con algunas modificaciones realizadas por Rojano et al. (2008c). Este mtodo se fundamenta en la capacidad de los perxidos lipdicos de oxidar el Fe2+ hasta Fe3+. A 300 L de muestra, se adicionan 20 mL de hexano-2-propanol (3:2) y se agita por 10 segundos, luego se toma 1,5 mL de la mezcla y se adiciona 2,8 mL de una solucin de metanol-1-butanol (2:1). De esta mezcla se toman 100 L y se adiciona 900 L de la solucin estndar, preparada mediante la adicin de NH4SCN 0,44 M al sobrenadante formado por la mezcla FeSO4 0,144 M y BaCl2 en HCl 0,4 M, se agita y se incuba por un periodo de 20 min en la oscuridad. Se ley la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm. Los resultados se expresaron como meq de perxido/kg de muestra, mediante el uso de una curva estndar construida usando perxido de cumeno, como patrn. Determinacin del contenido de sustancias reactivas con el cido 2-tiobarbitrico (TBARS) La determinacin del contenido de sustancias reactivas con el cido 2-tiobarbitrico (TBARS) se realiz mediante el procedimiento de GuzmnChozas et al. (1997), con algunas modificaciones realizadas por Rojano et al. (Guzmn-Chozas et al., 1997; Rojano et al., 2008c). En un tubo de ensayo se colocan 5 mL del reactivo de TBA (cido 2tiobarbitrico 0,7% en cido actico glacial al 99,9%), y 0,4 g de muestra y se agita por 10 s y fueron llevados a un bao de agua a 90 C por 1 hora. Los tubos, enfriados en agua, se centrifugaron a 5000 rpm por 20 min tras lo cual se elimin el sobrenadante. Una porcin de la muestra se llev a una cubeta de vidrio y su absorbancia fue leda a 532 nm. Los resultados se expresaron como mg de malonadialdehdo/kg (MDA) de muestra usando una curva estndar. La curva estndar fue construida realizando diluciones apropiadas de una solucin acuosa de 1,1,3,3 tetraetoxipropano 1,0x10-3 M. Estas soluciones fueron tratadas con el reactivo de TBA (cido 2- tiobarbitrico 0,02 M en cido actico

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Actividad antioxidante de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)

glacial al 90%) y la absorbancia fue medida a 532 nm. Anlisis estadsticos Las regresiones fueron calculadas con un nivel de significancia del 95% (p<0,05), usando el programa Statgraphics Plus versin 5.1 (Statistical Graphics Corp., Rockville, MD). RESULTADOS Y DISCUSIN El contenido de antocianinas totales expresados como mg eq de cianidin - 3- glicosido/100 g fruta fresca (Tabla 1), encontradas en los frutos del mortio (Vaccinium meridionale), es alto (201 10) comparado con los reportados para los frutos de otras especies. Prior et al. (1998), encontr que el contenido de antocianinas totales valores de 92 235 para el Northern Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum), 60 187 para el Rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) y 290 300 para Lowbush blueberry (Vaccinium angustifolium) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008). Wang & Ballington (2007), encontraron para el deerberry (Vaccinium stamineum) un contenido de 371 630. La coloracin de la piel de los frutos de mortio vara entre azul a rojo o azul intenso y depende de la presencia de antocianinas. En los frutos del mortio (Vaccinium meridionale), el contenido de fenoles totales (mg eq de acido galico/100 g de fruta fresca) es bastante alto comparado con los frutos de otros Vaccinium e incluso de otras especies. El mortio presenta un contenido de fenoles totales de 609 39, l es comparable con el presentado por el Northern Highbush blueberry, Rabbiteye blueberry, Lowbush blueberry, los cuales son de 181 473, 230 457, 290 495, respectivamente y 151 246 para la uva (Vitis vinifera) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008; Wang & Ballington 2007). Los mtodos DPPH y ABTS, evalan la capacidad de los extractos de mortio para atrapar radicales libres en medios orgnicos y acuosos respectivamente. La actividad antioxidante del mortio expresada por la metodologa del radical DPPH, fue mucho menor a los valores obtenidos para el radical ABTS. Esto puede ser debido a que la fraccin evaluada del fruto es un extracto metanlico acidificado, con una alta concentracin de compuestos polares que presentan una mejor
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solubilidad en los medios acuosos donde se realiza el ensayo con el radical ABTS. Los frutos del genero Vaccinium, se caracterizan por poseer una gran cantidad de diferentes compuestos con actividad antioxidante (Beccaro et al., 2006). La actividad antioxidante evaluada con el radical DPPH de los frutos del Vaccinium meridionale Sw., presenta un valor de 2404 TEAC, ligeramente mayores a los reportados para blueberry (1035) y menores que los encontrados en Andean blackberry (4100 TEAC) (Prior et al., 1998; Kalt and Dufour, 1997; Capocasa et al., 2008; Wang & Ballington, 2007). La actividad antioxidante evaluada con el radical ABTS+ de los frutos del Vaccinium meridionale Sw., presenta un valor de 8694 TEAC; mucho mayor que los reportados para blueberry (Vaccinum spp. cv. Biloxi) 3945 TEAC, Rabbiteye blueberries (Vaccinium ashei) 1973 3829 TEAC, Southern highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L. Hybrids) 811-2645 TEAC y blackberries (Rubus L.) con un valor de 1804-2650 TEAC. (Netzel et al., 2007; Vasco et al., 2008; Sellappan et al., 2002). Son pocos los reportes sobre el valor FRAP expresado como AEAC para el gnero Vaccinium, sin embargo los extractos de mortio con un valor de 581 mg de acido ascrbico por cada 100 g de fruta fresca son mejores reductores que la mayora de las frutas reportadas, excepto la curuba y la mora (Botero et al., 2007). Peroxidacin lipdica de aceite de maz En los alimentos con alto contenido de lpidos, la etapa ms importante de la peroxidacin, es la formacin y descomposicin de los hidroperxidos; que generan una serie de compuestos oxidados como cetonas, aldehdos, alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad, que determinan el valor sensorial del alimento; proceso denominado rancidez oxidativa. Los antioxidantes pueden retardar la rancidez, pero nunca la detienen, porque la oxidacin ocurre a bajas presiones de oxigeno y se hace inevitable, a pesar del uso de todas las metodologas de conservacin, como frio, escaldado y empaque (Rodrguez et al., 2007; Nedyalka and Emma, 2001; Aubourg et al., 2004).

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Actividad antioxidante de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)

Tabla 1. Contenido de antocianinas, fenoles totales, porcentaje de slidos extrables y actividad antioxidante. Antocianinas totales Fenoles totales Rendimiento TEAC-DPPH TEAC-ABTS FRAP

200,6 10,2 mg eq de cianidin 3glicosido/ 100g fruta fresca 609 31 mg eq de cido glico/ 100g de fruta fresca 13,26 0,34 % 2404 120 M de Trolox/ 100g de fruta fresca 8694 435 M de Trolox/ 100g de fruta fresca 581 29 mg de cido Ascrbico/ 100g de fruta fresca

la oxidacin, seguido por las muestras con extractos a las concentraciones de 250, 500, 750 g/mL y BHT respectivamente. El contenido de DC de la muestra a la concentracin de 250 g/mL, fue el ms alto de las muestras evaluadas, con valores menores que el blanco, durante todo el periodo de almacenamiento. Valor de perxido (PV) El valor de perxido es un buen indicador del grado de oxidacin inicial en aceites. La Fig. 2, muestra el incremento de VP para todas las muestras durante el tiempo de almacenamiento. El incremento del VP es debido a la formacin de hidroperxidos, productos de la oxidacin primaria (Abdulkarim et al., 2007).
Figura 1. Efecto del extracto antocinico a diferentes concentraciones y BHT en la formacin de DC en aceite de maz durante diez das de almacenamiento a 30 C.

base hmeda

Dienos Conjugados

Las muestras de aceite de maz, se monitorearon por un periodo de 10 das midiendo los niveles de DC, PV expresado como meq de perxido/kg. de muestra (meq/kg) y TBARS muestra). El proceso de oxidacin se inhibi usando extractos metanlicos de mortio como antioxidante a diferentes concentraciones metanlicas (250, 500, y 750 g/mL), y BHT a 500 g/mL, que es la concentracin mxima permisible en alimentos. Dienos conjugados (DC) La formacin de dienos conjugados (DC) ocurre durante las primeras fases de la oxidacin lipdica. La evaluacin del contenido de DC es un buen parmetro para la valoracin del deterioro oxidativo de aceites, y a la vez indica la efectividad del antioxidante (Aubourg et al., 2004). La Fig. 1 muestra el incremento relativo del contenido de DC en las muestras de aceite de maz con extracto antocinico, BHT y blanco a una temperatura constante de almacenamiento de 30 C, como una funcin del tiempo. Se observ un patrn regular de incremento para todas las muestras durante el tiempo de experimentacin; hasta el da tres el incremento de DC en las muestras con antioxidante no fue apreciable, mientras que el blanco aument considerablemente hasta el da cuatro. Las muestras con extractos de antocianinas presentaron un incremento entre el da tres y el da cuatro y a partir de all todas ellas exhibieron un comportamiento aproximadamente constante. En el da ocho todas las muestras presentaron un incremento grande en el contenido de DC hasta el da diez. Los valores DC de todas las muestras estabilizadas fueron mucho menores que el blanco; indicando una buena actividad antioxidante de los extractos. Se observaron altos contenidos de DC para el blanco, indicando una intensidad considerable de
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6500 5500 4500 3500 2500 2 4 6 8 10 Tiempo (das)

BHT Blanco 250 500 750 12

El incremento del VP fue aproximadamente constante durante los cuatro primeros das de experimentacin, pero a diferentes gradientes segn la concentracin de extracto o del BHT. A partir del da cuatro el incremento en el VP del blanco y la concentracin de 250 g/mL de extracto fue mayor que el obtenido con las otras muestras. Los valores de perxido estuvieron en el rango de 0,238 a 0,252 meq/kg para las muestras que contenan el extracto antocinico, mientras que para el BHT fue de 0,235 meq/kg y 0,259 meq/kg para el blanco en el dcimo da. El blanco present el contenido ms alto de VP, seguido de 250, 500, 750 g/mL y BHT, respectivamente. La velocidad de incremento de VP permaneci uniforme para 500 y 750 g/mL durante todo el periodo de almacenamiento, sugiriendo una buena eficiencia de los extractos a 500 y 750 g/mL para la estabilizacin del aceite de maz (Abdulkarim et al., 2007).

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Actividad antioxidante de frutos de mortio (Vaccinium meridionale SW)

Sustancias reactivas al acido tiobarbitrico (TBARS) La Fig. 3 muestra el efecto de las diferentes concentraciones del extracto antocinico, BHT y el blanco sobre la formacin de las sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS) en las muestras de aceite de maz en el tiempo. Un incremento continuo de TBARS fue observado en todas las muestras durante el tiempo de almacenamiento. El blanco exhibi los valores ms altos de TBARS en todas las etapas de anlisis durante el almacenamiento. El aumento en la concentracin de TBARS fue lento y similar para todas las muestras hasta el da 3, a partir del cual se aceler la formacin en el blanco y las concentraciones de 250 y 500 g/mL hasta el ltimo da. El incremento en el contenido de TBARS fue ms intenso y de comportamiento lineal para el blanco y las muestras con 250 y 500 g/mL de extracto antocinico. Las muestras de 750 g/mL y BHT se comportaron igual entre el da 3 y el da 4, y a partir del cual mostraron un comportamiento exponencial, exhibiendo un mayor contenido de TBARS la muestra de 750 g/mL, en especial entre los das 8 y 10 donde el incremento fue ms pronunciado. El comportamiento de la formacin de DC, PV y TBARS en el tiempo, puede modelarse mediante regresiones exponenciales cuyas pendientes dependen de la concentracin y de la naturaleza del antioxidante. Por esto, se hace necesario obtener un parmetro () que determine la accin antioxidante de cualquier compuesto en un proceso oxidativo en particular. Para calcular el valor del compuesto en los ensayos DC, se realiz el siguiente procedimiento descrito por Rojano et al. (2008c): se determin i que es la pendiente de la regresin exponencial de los DC contra el tiempo, para cada concentracin. Con los valores de i, se calcul la relacin 0/i; donde 0 es la pendiente del blanco. El valor de la pendiente de la regresin lineal de 0/i contra la concentracin es el valor de la constante , que en este caso particular, refleja el efecto total de las antocianinas como antioxidante, con respecto a la inhibicin del proceso de oxidacin del aceite de maz, en la formacin de DC. El clculo de , se hizo a partir de la siguiente ecuacin:
0/i = 0,0003(mg/kg de muestra) + 0,9413

extracto antocinico es: = 3,0 10-4 8,9 10-6 mg/kg de muestra; con una r2 = 99,93%, F = 1342,71 y p = 0,0174.
Figura 2. Efecto del extracto antocinico a diferentes concentraciones y BHT en la formacin de PV en aceite de maz durante 10 das de almacenamiento a 30 C

Valor de Perxidos (meq / Kg)

0,27 0,26 0,25 0,24 0,23 0,22 0,21 0,2 1 6 11

BHT Blanc 250 500 750

Figura 3. Efecto del extracto antocinico a diferentes concentraciones y BHT en la formacin de TBARS en aceite de maz durante diez das de almacenamiento a 30 C.
7000

Tiempo (das)

TBARS (mg / Kg de muestra)

6000 5000 4000 3000 0 2 4 6 8 Tiempo (das) 10 12

BHT Blanco 250 500 750

De otro lado, a partir de los valores de 0/i se pudo calcular el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de antioxidante, expresado como:
% de inhibicin = (1 - 0/i) * 100 (1)

La constante global de inhibicin () de la formacin de DC en el aceite de maiz por efecto del


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El BHT present mayor capacidad para inhibir los procesos oxidativos acelerados a 30 C en aceite, en comparacin con los extractos de antocianinas, porque a la concentracin de 500 g/mL inhibi un 37,7%, mientras que las antocianinas a 750 g/mL, inhibieron solamente el 15,7%; estos resultados estn acordes con diversos reportes bibliogrficos (Abdulkarim et al., 2007). Para calcular la constante () en los ensayos PV, se procede como en el caso anterior; se calculan los valores de 0, i y las relaciones de 0/i; se calcula el valor de la constante global para la inhibicin de

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formacin de hidroperxidos en el proceso de oxidacin de aceite a 30 C. El valor resultante es: = 8,0 10-4 6,1 10-5; con una r2 = 99,45%, r = 0,995, F = 181,8 y p = 0,0471. Con los valores de 0/i se calcul el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de antioxidante, con la ecuacin (1). Al comparar los resultados obtenidos para las muestras con contenido de antocianos y BHT se pudo observar una mayor capacidad de inhibicin del proceso oxidativo para el BHT, porque la concentracin de 500 g/mL inhibi un 41,4 %, en comparacin con un 34,1% obtenido con las antocianinas a 750 g/mL; resultados que concuerdan con diversos reportes bibliogrficos (Wanasundara and Shahidi, 1998). Los tratamientos con el extracto antocinico de mortio redujeron la oxidacin del aceite de maz durante la incubacin a 30 C, demostrando un efecto inhibitorio en la formacin de TBARS e indicando una proteccin potencial de la oxidacin para el aceite. Con los datos de la figura 3, se calcularon los valores de 0, i y las relaciones de 0/i. De igual manera, que en el caso anterior se calcul el valor de la constante global para inhibir la formacin de TBARS en el proceso de oxidacin de aceite a 30 C. El valor resultante fue = 4,0 10-4 1,0 10-5, con una r2 = 91,52 %, F = 10,80 y p = 0,1881. De otro lado, a partir de los valores de 0/i se calcul el porcentaje de inhibicin para cada concentracin de antioxidante, con la ecuacin (1). El BHT present mayor capacidad para inhibir el proceso oxidativo a 30 C en aceite de maz, en comparacin con los extractos antocinicos, porque la concentracin de 500 g/mL inhibi un 37,2%, mientras que las antocianinas a 750 g/mL, inhibieron solamente el 19,6%; estos resultados estn acordes con diversos reportes bibliogrficos para otras estructuras qumicas (Siriwardhana and Jeon, 2004; Rojano et al., 2008c). CONCLUSIONES El mortio (Vaccinum meridionale SW) es una fruta con alto contenido de compuestos polifenlicos, que se expresan a travs de su alta capacidad antioxidante, con valores comparables o superiores a los diversos Vaccinium encontrados en diferentes latitudes del mundo; los cuales tienen ndice alto de comercializacin, como alimentos nutracuticos o como fruta fresca. Una limitacin de las tcnicas usadas es que el comportamiento reductor de los extractos del mortio se puede ver afectado por el
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contenido de azucares reductores y acido ascrbico. Teniendo en cuenta esto, el extracto antocinico de mortio, present una buena eficiencia inhibitoria de la peroxidacin lipdica en comparacin con el blanco, sin embargo el antioxidante sinttico BHT mostr el mayor efecto inhibitorio de la oxidacin lipdica. Por lo tanto, se puede concluir que el extracto antocinico, en las concentraciones estudiadas, es capaz de proteger el aceite de maz contra la oxidacin y se puede recomendar como una buena fuente de antioxidantes naturales para la estabilizacin de sistemas alimenticios, especialmente los aceites vegetales. Estos resultados estn acordes con los conceptos sobre la paradoja polar planteada por Frankel et al. (1997); de tal manera, que en fase continua como los aceites, los antioxidantes hidroflicos (extractos antocinicos) pueden ser efectivos por concentrarse en la interfase aire-aceite, que es donde ocurre el fenmeno oxidativo. AGRADECIMIENTOS Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) de Colombia, por el apoyo econmico a travs del proyecto numero 2008L1363-333 y a la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln, Facultad de Ciencias. Igualmente, se agradece el suministro de materiales por parte de CORPOICA, en el marco de un trabajo apoyado por Corantioquia. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 529 - 539 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina)
[Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales de 21 extractos acuosos de plantas nativas del Valle de Traslasierra (Argentina)]
Martin M. DAD*1, Daniel E. FIORAVANTI1, Guillermo R. SCHINELLA1,2, Horacio A. TOURNIER1,2
1

Ctedra de Farmacologa Bsica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de La Plata. 2Comisin de Investigaciones Cientficas, Provincia de Buenos Aires. Argentina.

Abstract
The use of medicinal herbs derivatives is an alternative to conventional medicine to treat diseases associated with oxidative stress. In this study we assessed the antioxidant capacity (AC) and the total phenolic (TP) and flavonoid content (FV) of 21 extracts obtained from commercially available supplies of native plants of Traslasierra valley, Crdoba; Hedeoma multiflorum, Minthostachys mollis, Lippia turbinata, Satureja parvifolia, Aloysia triphylla, Aloysia gratssima, Aloysia polystachya, Heterothalamus allienus, Xanthium spinosum, Gnaphalium gaudichaidianum, Flaveria bidentis, Hypericum connatum, Larrea divaricata, Aristolocchia macroura, Erythraea quitensis, Geoffroea decorticans, Solanum rutilum, Urtica dioica, Usnea gracilis, Anemia tomentosa and Lycopodium saururus. AC was assessed on the basis of different methods: The scavenging of stable free radicals ABTS and DPPH, the ability to reduce Fe+3 in the FRAP assay, and the capacity to inhibit the lipid peroxidation of copper-induced human plasma oxidation. All extracts were able to bleach the radicals in the range of 0.03 - 4.48 mol of Trolox equivalent/mg dry extract. S. parvifolia and H. connatum extracts exhibited the highest scavenging activity for both, DPPH radical (1.48 and 1.77 mol Tx eq/mg dry extract) and ABTS radical (3.20 and 4.48 mol Tx eq./mg dry extract). S. parvifolia, L. divaricata and H. connatum showed the highest reducing capacity (8.89, 8.44 and 7.72 mol eq. of ascorbic acid/mg dry extract) following by H. allienus and H. multiflorum. At 100 g/mL, S. parvifolia and H. connatum also showed a very high capacity (> 85%) to inhibit Cu 2+ - induced human plasma peroxidation. E. quitensis, L.divaricata and H. multiflorum were also potent inhibitors of lipoperoxidation. There was a significant correlation between the TP and FV content and the AC (P<0.001). Taken together, our results suggest that the aqueous extracts of H. multiflorum, H. allienus, L. divaricata, H. connatum and S. parvifolia may be important sources for the isolation of compounds with potential use as pharmacological or nutritional tools.. Keywords: Antioxidant capacity; Herbal antioxidant; ABTS; DPPH; Oxidative stress; Argentina

Resumen
El empleo de plantas medicinales constituye una alternativa a la medicina convencional para el tratamiento de patologas asociadas con la produccin de estrs oxidativo. En este estudio evaluamos la capacidad antioxidante total (AC) y el contenido de fenoles (TP) y flavonoides (FV)de 21 extractos obtenidos de plantas nativas del valle de Traslasierra, Crdoba, Argentina. Las especies estudiadas fueron Hedeoma multiflorum, Minthostachys mollis, Lippia turbinata, Satureja parvifolia, Aloysia triphylla, Aloysia gratssima, Aloysia polystachya, Heterothalamus allienus, Xanthium spinosum, Gnaphalium gaudichaidianum,Flaveria bidentis, Hypericum connatum, Larrea divaricata, Aristolocchia macroura, Erythraea quitensis, Geoffroea decorticans,Solanum rutilum, Urtica dioica, Usnea gracilis, Anemia tomentosa y Lycopodium saururus. AC se evalu utilizando diferentes mtodos: La capacidad de captacin de los radicales libres estables ABTS y DPPH; la capacidad de reduccin del Fe +3 mediante el ensayo FRAP y la capacidad de inhibicin de la peroxidacin lipdica del plasma humano inducida por cobre. Todos los extractos tenan capacidad de captacin de ABTS y DPPH en el rango de 0,03- 4,48 mol de Trolox equivalentes /mg extracto seco. La mayor potencia fue encontrada en S. parvifolia y H. connatum (1,48 and 1,77 mol Tx eq. / mg extracto seco para DPPH y 3,20 and 4,48 mol Tx eq./mg extracto seco para ABTS). S. parvifolia, L. divaricata y H. connatum mostraron la mayor capacidad reductora (8,89, 8,44 and 7,72 mol eq. de cido ascorbico/mg extacto seco) seguidos por H. allienus y H. multiflorum. A la concentracin de 100 g/mL, S. parvifolia y H. connatum, E. quitensis, L. divaricata y H. multiflorum mostraron tambin una muy alta capacidad de inhibicin de la peroxidacin lipdica del plasma inducida por Cu 2+. Se encontr una significativa correlacin entre el contenido de TP y FV y la actividad antioxidante (P<0,001). Tomados en conjunto, nuestros resultados permiten sugerir que los extractos acuosos de H. multiflorum, H. allienus, L. divaricata, H. connatum y S. parvifolia pueden constituir importantes fuentes para el aislamiento de compuestos con alta actividad antioxidante de uso potencial desde el punto de vista farmacolgico y nutricional. Palabras Clave: Capacidad antioxidante; Antioxidantes herbales; ABTS; DPPH; Estrs oxidativo; Argentina.
Recibido | Received: October 7, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: November 1, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: November 30, 2009. Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plata (Programa de Incentivos X 446) This article must be cited as: Martin M. Dad, Daniel E. Fioravanti, Guillermo R. Schinella, Horacio A. Tournier. 2009. Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(6):529 539. {EPub November 30, 2009}. *Contactos | Contacts: Horacio Tournier. Ctedra de Farmacologa Bsica 60 y 120 La Plata (1900), Argentina. E-mail: htournier@biol.unlp.edu.ar. Telefax: 54 21 421 6932

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Dad et al.

Antioxidant capacity of native plants from Traslasierra valley (Argentina)

INTRODUCTION Medicinal herbs are some of the oldest medicines around the world and their increased use in recent years is an evidence of public interest in having alternatives to conventional medicine. There is growing evidence that consumption of certain foods, dietary supplements or traditional beverages, guide to a reduction in some parameters of oxidative damage in biological systems (Aruoma et al., 2003; Juan et al., 2006). Oxidative damage is produced by reactive oxygen species (ROS) which are continuously produced during the aerobic life. ROS seems to be involved in the pathogenesis of several human diseases including cancer, diabetes, cardiovascular diseases, ageing, etc. (Gutteridge, 1994). Aerobic organisms are protected from oxygen toxicity by a natural antioxidant defence system constituted by enzymatic and non enzymatic mechanisms (Halliwell, 1996). If this endogenous system is inadequate for the purpose of scavenging the ROS completely, oxidative damage to important macromolecules occurs (Halliwell, 1999). ROS neutralization by natural antioxidants could attenuate the oxidative damage tissue (Delaporte et al., 2002 ). The roles of medicinal herbs in the prevention and cure of disease associated with oxidative stress have been attributed, in part, to antioxidant properties of their constituents. Many herbs are rich in compounds with demonstrated antioxidant capacity, particularly the liposoluble and water soluble vitamins (E and C, respectively) and other compounds like the amphipatic polyphenols which can act as reducing agents, hydrogen donators, singlet oxygen quenchers and metal chelators (Morel et al., 1998; UlrichMerzenich et al., 2009). Frequently used plants in traditional medicine are assumed to be safe, due to their long-term use and natural origen. Many Elgorashi et al., 2002 tific articles have been published on natural products and their diverse effects, but each plant species has several different natural constituents, many of which have not been studied. South America countries have a long history of using and producing medicinal and aromatic plants. In the Argentine traditional medicine, this kind of plants is used in the form of infusions or decoctions and this is a common practice among people of rural and also urban communities (Ratera and Ratera, 1980; Toursarkissian, 1980; Alonso, 2004).
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Although many pharmacological as well as toxic actions have been reported for Argentinean plants, more information is needed about different properties of those plants widely used as foods, nutritional supplements or in the traditional medicine. In Argentina, the Cordoba province is remarkable for its diversity and it is a rich source of medicinal plants, many of them used as part of folk remedies (Zuloaga, 1999). In Cordoba, Traslasierra valley is today, one of main center in the country for medicinal and aromatic herbs production (Fig. 1).
Figure 1. Geographic location of Traslasierra valley, Crdoba, Argentina

Valle de Traslasierra (Provincia de Crdoba)

Map from Wikimedia Commons.

Located at the foot of the highest peak in Cordoba, the Champaqu hill (2800 m.o.s.l.), the Traslasierra Valley is flanked to the east by the Sierras Grandes or Sierra de Comechingones, which drop abruptly downwards, and the Sierras of Altautina, Pocho and Guasapampa to the west. Goleniowski et al. (2006) reported that medicinal native plants from Sierras Grandes make up aproximately 30% of the total Argentina medicinal

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native flora. More recently, 41 plants of Crdoba province were tested for their phenol content and antioxidant capacity using a model food system (Borneo et al., 2009) Apart from these 41 plants, numerous other natives plants of Traslasierra valley are used in Argentina traditional medicine but they have not been yet investigated for their antioxidant activity. The aim of the present study was to examine the total antioxidant potential and the total phenolic and flavonoid content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Table 1).

MATERIAL AND METHODS Plant material and preparation of extracts Commercially available supplies of dried plant materials used throughout the study were bought in bulk from the Almacn Natural Prama, Villa de las Rosas, Crdoba, Argentina. Herbal samples were authenticated by Dr. E.Spegazzini (Departamento de Ciencias Biologicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata) and they were free of preservative and artificial flavoring. Herbal were maintained preserved from light and humid and processed before 3 month of the purchased. Extracts were obtained from infusions or decoctions prepared in common way in which teas are consumed for human population.

Table 1. Botanical species and their popular use Plant Hedeoma multiflorum (Benth) Minthostachys mollis (Kunt, Griseb) Lippia turbinata (Griseb) Satureja parvifolia (Philippi) Epling Aloysia triphilla (L'Hrit.) Britt. Aloysia gratssima (Gill. et Hook) Aloysia polystachya (Griseb et Moldenke) Heterothalamus allienus (Spreng.) O.Kuntze Xanthium spinosum (Lam.) Gnaphalium gaudichaidianum DC Flaveria bidentis (L.) O. Kuntze Hypericum connatum (Lam.) Larrea divaricata (Cav.) Aristolocchia macroura (Gomez) Erythraea quitensis (HBK) Geoffroea decorticans (Gill. ex Hook. & Arn.) Burkart) Solanum rutilum (Gr.) Urtica dioica (L.) Usnea gracilis (Stirt) Anemia tomentosa (Sav.) Swartz. Lycopodium saururus (Lam.) Family Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Lamiaceae Verbenaceae Verbenaceae Verbenaceae Asteraceae Asteraceae Asteraceae Asteraceae Clusiaceae Zygophyllaceae Aristoloquiaceae Gentianaceae Fabaceae Solanaceae Urticaceae Parmeliaceae Esquiceaceae Licopodeaceae Popular name Tomillo serrano Peperina Poleo Mua mua Cedrn Palo amarillo Te de burro Romerillo Cepa caballo Vira Vira Contrayerba Cabotoril Jarilla Mil hombres Canchalagua Chaar Espina colorada Ortiga Barba de la piedra Doradilla Cola de quirquincho Popular use Digestive tract diseases, Flavoring Anti-inflammatory, Digestive tract diseases, spasmolytic. Flavouring, Digestive tract diseases, sedative Anti- rheumatic, spasmolytic, aphrodisiac Spasmolytic, sedative Cholagogue, gastric and duodenal ulcer Digestive tract diseases, gastric disorders Antifungal, ornamental Diuretic Antipyretic, antitussive, fatigue Antiseptic, vermifuge, diuretic Cardiotonic Anti-rheumatic, antigout, bruises Anti-rheumatic, diuretic Anti-rheumatic, digestive tract diseases Antitussive, expectorant Diuretic, antigout Depurative, antihypertensive, diabetes Antimicrobial Diuretic, antihypertensive, antitussive Aphrodisiac

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Briefly, herbal samples (10 g) were weighed into 250 mL Erlenmeyer flasks and 200 mL of boiling distilled water were added and left to cool down to 40 C. Decoctions were prepared by boiling 10 g of herbal samples in 250 mL of distilled water for 20 min. After cooling, the extractives were filtered, lyophilized and the dry matter was maintained at -20 C until use it. For bioassay analyses, samples of each extract were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 10 mg/mL). Stock solutions were serially diluted with the solvent to obtain different concentrations (1-250 g/mL). Chemicals 2, 2-Diphenyl - 1-picryl hydrazyl (DPPH), 2, 4, 6tripyridyl-s-triazine (TPTZ ) and 2, 2- azino-bis (3ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), and quercetin-3-rutinoside (rutin), were obtained from Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. All other chemical used were of the highest analytical grade. Determination of total phenol and total flavonoid content Total phenol concentration in selected medicinal plant extractives were determined spectrophotometrically according to the Folin Ciocalteu colorimetric method (Singleton and Rossi, 1965), using caffeic acid as the standard and expressing the results as mol equivalents of caffeic acid (CAE) per mg of dry extract. Total flavonoids were estimated in the plant extract using a colorimetric method, based on the formation of a complex flavonoid-aluminium (Sakanaka et al., 2005). Briefly, aliquot of extracts or standard solutions (rutin) were mixed with 400 l of distilled water and 30 L of a 5% sodium nitrite solution. After 6 minutes, a 10% aluminium chloride sodium (30l) was added and the mixture was allowed to stand for 5 minutes. After that, 200 L of 1M NaOH solution and 240 l of distilled water were added and the absorbance was measured at 510 nm. All determinations were done in triplicate and values were calculated from a calibration curve obtained with rutin. Final results were expressed as mol of rutin equivalents (RE) per mg dry extract.

DPPHradical scavenging activity Reduction of this radical was determined according to Cavin (1998) with some modifications. For the assay, 10 L of the plant extract was added to 990 L of a 0.04 mg/mL DPPH solution in methanol. A series of concentrations ranging from 1 to 100 g dry extract/mL were tested. The mixtures were shaken vigorously and incubated in the dark for 20 min after which the reduction of DPPH absorption was measured at 517 nm. A calibration curve was constructed by measuring the reduction in absorbance of the DPPH solution in the presence of different concentrations of Trolox (0400 M). Results were expressed as mol of Trolox equivalents (TE)/ mg dry extract. All determinations were performed in triplicate. In the scavenging assays, DMSO was used as negative control. ABTS+ radical scavenging activity Other assay used to determine the antioxidant capacity of extracts was the TEAC assay (scavenging of the radical 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)6 sulphonic acid, ABTS) (Re et al., 1999) with some modifications. ABTS+ radical was generated by reacting 7 mM ABTS+ solution in water with 2.45 mM potassium persulfate in the dark for 12 16 h. Absorbance of the reactant was later adjusted to 0.700 0.02 with PBS at a wavelength of 734 nm. Radical scavenging reaction was started by addition of 10l of appropriately diluted extracts to 990 l the ABTS+ solution. The absorbance of the mixture was recorded at 734 nm 25 min after addition of the sample. A Trolox calibration curve (0-200 M) was constructed. Results were expressed as mol equivalent of Trolox (TE)/mg dry extract. All determinations were performed in triplicate. Ferric reducing activity (FRAP assay) The ferric reducing activity of the plant extracts was estimated based on the FRAP assay (Benzie, 1996). The solutions for this assay consisted of 300 mmol/L acetate buffer, 10 mmol/L TPTZ (2,4,6tris(2-pyridyl)-s-triazine) in 40 mmol/L of HCl and 20 mmol/L FeCl3 6H2O. Reagent for this assay was prepared on the day of assay by mixing 25 mL acetate buffer with 2.5 mL TPTZ solution and 2.5 mL FeCl3 6H2O. The assay was performed as followed: 990 L of the FRAP reagent were added to 10 L of appropriately diluted extracts or buffer. Absorbance readings at 593 nm were recorded 20 min after the

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start of the reaction. The change in absorbance was related to the absorbance changes of a standard solution of ascorbic acid tested in parallel. Results were expressed as mol of ascorbic acid equivalents (AAE) / mg of dry weight of the extract. Lipid peroxidation assays Human plasma was oxidatively modified by a non-enzymic method. 100 L of heparin plasma (200 20 g total cholesterol) was diluted with 350 L PBS and the oxidation was started by adding 50 L CuSO4 10 mM. After 180 min of incubation at 37 C the reaction was stopped by adding EDTA. These incubations and relevant controls were performed in the presence of the different extracts (100 g/mL). Only one time point at 3 h for incubation was selected. This was in accordance with previous studies which indicated that this was the optimal period for oxidative modification of human plasma to occur. (Schinella et al., 2007). Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) production were used as an indicator of lipid peroxidation (Pompella et al., 1987). Results are expressed as percentage of inhibition related to controls without the extract. Butylated hydroxytoluene (BHT) was used as a positive control. Statistics Data were expressed as means SD. Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Turkey-Kramer multiple comparisons test. Differences were considered significant at p < 0.05. The inhibitory concentration 50% (IC50) was calculated from concentration/effect regression line. RESULTS AND DISCUSSION Scavenging of free radicals The antioxidant capacities of plant extracts largely depend on their composition and conditions of the test system and they are influenced by many factors, which cannot be fully described with one single method. Therefore, it is necessary to perform more than one type of antioxidant capacity measurement to take into account the various mechanisms of the antioxidant action. The antioxidant activity of plant extract was evaluated on the basis of different methods: the scavenging effects of the stable ABTS and DPPH free radicals, the ability to reduce ferric(III) iron to ferrous (II) iron in the FRAP
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reagent, and the capacity to inhibit the lipid peroxidation using as biological system the copperinduced human plasma oxidation. Because of their high reactivity, most free radicals react rapidly with oxidizable substrates. Methods used for evaluation of radical-trapping properties often utilize stable model free radicals as indicators for radical-scavenging abilities, among which 1,1diphenyl-2-picrilhydrazyl radical (DPPH.) and 2,2azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) radical cation (ABTS.+), have gained the highest popularity. Plants extracts may contain a wide variety of radical scavenging molecules, such as phenolic and nitrogen compounds , vitamins, terpenoids and some other endogenous metabolites (Cai et al., 2004) which act by mechanisms that may involve hydrogen atom transfer or electron transfer (Litwinienko and Ingold, 2007; Musalik et al., 2009). The results on the free radical scavenging activity of the different extracts are shown in Table 2. The data presented in this study demonstrate that all the reported species possess free radical scavenging activity although in a wide range. The preparations were able to reduce the stable free radical DPPH to the yellow-coloured 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl. The highest DPPH scavenging activity was observed with H. connatum and S. parvifolia extracts. (1.77 and 1.48 mol TE/mg dry extract respectively). Lower but important scavenging activities were observed with L. divaricata and H. multiflorum. The lowest radical scavenging activity was exhibited by U. dioica, L. saururus and U. gracilis ( < 0.1 mol TE/mg dry extract) ABTS radical cation decolourization assay is another excellent tool for determining the antioxidant capacity of different compounds or herbal extracts. In this assay, again H. connatum and S. parvifolia extracts showed the highest scavenging capacity (4.48 and 3.20 mol TE /mg dry extract respectively). Lowest activity were observed with U. dioica, L. saururus and U. gracilis (< 0.2 mol TE/mg dry extract). Reducing activity Antioxidant activity of plant extracts was also tested using the FRAP assay, which is a simple assay that gives fast, reproducible results. Benzie and Strain (1996) FRAP is versatile and can be readily applied to different kind of materials like teas, wines, plant

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extracts and biological fluids. In this assay, the antioxidant activity is determined on the basis of the ability of an extract to reduce ferric (III) to ferrous (II). Table 2 show a wide range of differences in the reducing capacity of the studied extracts. The FRAP values varied from 0.28 to 8.89 mol of AAE / mg dry extract. S. parvifolia, L. divaricata and H. connatum were found to have the highest antioxidant
Table 2. Antioxidant activity of plant extracts

activity (8.89, 8.44 and 7.72 mol AAE/mg dry extract respectively) followed by H. allienus (5.20 mol AAE/mg), H. multiflorum (3.66 mol AAE/mg) and A. macroura (3.16 mol AAE/mg). Lowest FRAP values were founded in U. dioica, L. saururus and U. gracilis extracts (< 0.5 mol AAE/mg dry extract).

Plant Hedeoma multiflorum Minthostachys mollis Lippia turbinata Satureja parvifolia Aloysia triphylla Aloysia gratsima Aloysia polystachya Heterothalamus allienus Xanthium spinosum Gnaphalium gaudichaidianum Flaveria bidentis Hypericum connatum Larrea divaricata Aristolocchia macroura Erythraea quitensis Geoffroea decorticans Solanum rutilum Urtica dioica Usnea gracilis Anemia tomentosa Lycopodium saururus
a

DPPHa 0.70 0.12 0.27 0.04 0.18 0.02 1.48 0.10 0.35 0.06 0.34 0.05 0.51 0.06 0.59 0.05 0.12 0.02 0.42 0.02 0.23 0.01 1.77 0.09 0.76 0.06 0.10 0.01 0.39 0.04 0.16 0.03 0.20 0.03 0.03 0.01 0.03 0.01 0.43 0.03 0.04 0.02

ABTSa 1.02 0.04 0.70 0.02 0.64 0.02 3.20 0.15 0.52 0.05 0.49 0.01 0.75 0.01 2.41 0.04 0.53 0.02 2.32 0.07 0.79 0.02 4.48 0.07 0.70 0.01 0.49 0.03 0.76 0.02 0.92 0.01 0.74 0.02 0.19 0.02 0.16 0.01 1.28 0.08 0.16 0.01

FRAPb 3.66 0.40 2.32 0.34 1.50 0.16 8.89 0.90 2.92 0.25 2.59 0.21 2.55 0.28 5.20 0.32 0.88 0.08 2.89 0.72 2.14 0.16 7.72 0.67 8.44 0.64 3.16 0.39 2.43 0.14 1.44 0.17 1.11 0.10 0.49 0.04 0.28 0.02 2.42 0.54 0.48 0.02

lpid peroxidation (% inhibition)c 89.4 3.2 23.1 9.9 23.9 2.6 90.1 1.2 49.4 11.6 27.0 7.1 42.4 3.6 91.2 2.0 ND 41.7 4.3 36.1 1.9 86.5 3.9 80.1 2.6 60.4 4.3 83.7 2.0 27.4 1.7 38.1 1.3 28.0 2.6 ND 20.6 1.0 13.5 2.3

Results are expresed as mol equivalents of Trolox/ mg dry extract b Results are expresed as mol equivalents of ascorbic acid/mg dry extract c Extracts were assessed at a final concentration of 100 g/ml ND: not determined

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Inhibition of lipid peroxidation Proteins, nucleic acids and lipids are significant targets of cellular injuries. Lipid peroxidation is an oxidative alteration of polyunsaturated fatty acids components of different cellular structures. (Janero, 1990) Metal ions, at micromolar concentrations, plays a role in human plasma lipids oxidation (Gaut and Heinecke, 2001). It has been suggested that low density lipoprotein (LDL) oxidation induced in vitro in whole plasma is expected to reflect the oxidation in vivo more adequately than in vitro oxidation of the isolated lipoprotein (Spranger et al., 1998). For that reason we assessed the antioxidant capacity of extracts for lipoperoxidation protection using whole human plasma. All extracts were tested at a final concentration of 100 g/mL and the inhibition of human plasma lipids peroxidation was assayed by the TBARS test. Almost all tested extracts inhibited peroxidation and among those, S. parvifolia, L. divaricata, H. connatum, E. quitensis, H. multiflorum and H. allienus were the most active extracts with values of percentage of inhibition greater than 80% while A. tomentosa and L. saururus showed the lowest activity (< 20% of inhibition). Total phenolics and flavonoids content Table 3 reports the results of percentage of yield, the total phenolics and total flavonoids content of each plant extract. The amounts of total phenolics varied widely in the different analysed extracts and ranged from 0.16 to 2.07 mol equivalents of caffeic acid/mg of dry extract. This variation can be expected for plant extracts due to the presence of other constituents and/or the presence of different types of phenols. Among plant extracts, H. connatum, S. parvifolia and A. triphylla contained the highest amount of phenolics (2.07, 1.90 and 1.70 mol CAE/mg dry extract respectively). The lowest level of phenolic content was observed in U. dioica, U. gracilis and L. saururus. (0.21, 0.19 and 0.16 CAE/mg dry extract, respectively). Among plant extracts, H. connatum and S. parvifolia contained the highest amount of flavonoids (0.94 and 0.91 mol RE/ mg dry extract) whereas the lowest level was found in U. gracilis, L. saururus, U.dioica and A. macroura (0.05 to 0.08 RE/mg dry extract).
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Several studies have evaluated the relationships between antioxidant activities of plant products and their phenolic contents (Shahidi, 2003). In our case, comparison of total phenolics and flavonoid contents with antioxidant activities show significant correlations (Fig. 2). In our work, L. divaricata and A. macromoura extracts showed a high ability to reduce the FRAP reagent and to inhibit the lipoperoxidation with relatively low concentrations of total phenols and flavonoids. This relatively high antioxidant activity of extracts with low phenolic content suggests that the type of phenolics could be a determinant of these activities rather than their amounts. Conversely, A. triphylla is relatively rich in total phenolics, but its activity as scavenger of free radicals is low. Our results agree with those of Shahidi (2003) who reported that differences in antioxidant activities of plant extracts could be due to different qualitative and quantitative composition of their phenolic constituents. The data presented in this study demonstrate that almost all the reported species possess antioxidant activity. Indeed, their aqueous extracts scavenged the free radicals DPPH and ABTS, reduced the Fe+3 of FRAP reagent and inhibited the lipid peroxidation of human plasma. Among the assessed extracts, Satureja parvifolia (mua mua) and Hypericum connatum (cabotoril) showed the highest activity to scavenge DPPH and ABTS free radicals, to reduce the Fe(III) to Fe (II) in FRAP reagent and a very high capacity to inhibit lipid peroxidation of human plasma. Also Heterothalamus allienus demonstrated high capacity to scavenge ABTS radical, reducing activity and inhibition of lipid peroxidation. Oxidative damage is considered a likely cause of arsenic-induced tissue damage, particularly those with high oxygen consumption rate. The high antioxidant activity of H. allienus could explain the demonstrated protective activity of this plant against the arsenite-induced renal injury (Soria et al., 2008). On the other hand, some biological and pharmacological actions have been reported for S. parvifolia and H. connatum, the two plants with the highest antioxidant capacity in the all studied models. S. parvifolia showed antiprotozoal and antiplasmodial activity (Van Baren et al., 2006) and it was very active against different microorganisms and

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was suggested that this might be due to high concentration of flavonoids (Hernandez et al., 2000) H. connatum also demonstrated to have other pharmacological actions. Previous investigations of extracts of this plant showed them to be active against the feline immunodeficiency virus (FIV), which shares biological and pathogenic features with the human immunodeficiency virus (HIV) (Schmitt et al., 2001). In Argentina, the plant is widely used as cardiotonic
Table 3. Extracts yield and total content of phenolics and flavonoids Plant Hedeoma multiflorum Minthostachys mollis Lippia turbinata Satureja parvifolia Aloysia triphylla Aloysia gratissima Aloysia polystachya Heterothalamus allienus Xanthium spinosum Gnaphalium gaudichaidianum Flaveria bidentis Hypericum connatum Larrea divaricata Aristolocchia macroura Erythraea quitensis Geoffroea decorticans Solanum rutilum Urtica dioica Usnea gracilis Anemia tomentosa Lycopodium saururus
* **

and recently antiherpetic and antifungal activities were also demonstrated. (Fusco et al., 2007; Fritz et al., 2007). Nevertheless, to our best knowledge, the potent antioxidant properties of these two plants have not been yet reported. Further investigations are necesary to determine which components of mua mua (Satureja parvifolia ) and cabotoril (Hypericum connatum)extracts are responsible for such antioxidant capacity.

Extract infusion infusion infusion infusion infusion infusion infusion infusion decoction infusion decoction infusion infusion decoction infusion decoction decoction infusion decoction infusion infusion

Yield (%) 12.9 20.8 16.8 14.9 14.9 17.6 14.4 15.9 23.1 5.9 12.8 16.1 17.1 12.1 18.5 7.1 17.8 18.5 9.9 14.9 5.2

Total polyphenols* 1.01 0.04 0.48 0.01 0.41 0.04 1.90 0.05 1.70 0.19 0.80 0.03 0.65 0.04 1.48 0.02 0.51 0.02 1.34 0.04 0.86 0.01 2.07 0.14 1.07 0.02 0.44 0.05 0.59 0.04 0.97 0.01 0.63 0.03 0.21 0.02 0.19 0.02 0.64 0.01 0.16 0.01

Total flavonoids** 0.70 0.07 0.24 0.01 0.12 0.01 0.91 0.02 0.50 0.04 0.33 0.03 0.41 0.01 0.54 0.03 0.17 0.02 0.42 0.02 0.18 0.02 0.94 0.02 0.38 0.03 0.08 0.01 0.32 0.02 0.13 0.01 0.13 0.02 0.06 0.02 0.05 0.01 0.27 0.03 0.05 0.02

Results are expressed as mol of cafeic acid equivalents / mg dry matter. Results are expressed as mol of rutin equivalents /mg dry matter.

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Figure 2. Correlations between total phenolics and flavonoids content and antioxidant activity.

DPPH vs. TP
DPPH ( mol Tx eq/mg dry extract)
DPPH ( mol Tx eq./mg dry extract)

DPPH vs. FV
2
r = 0.8655; P< 0.001
2

r = 0.6689; P< 0.001

0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

TP ( m ol caffeic acid eq/m g dry extract)

FV ( m ol rutin eq./m g dry extract)

ABTS vs. TP
ABTS ( mol Tx eq./mg dry extract)

ABTS vs. TP
5
ABTS ( mol Tx eq./mg dry extract)

5 4 3 2 1 0 0.0

r2 = 0.6729; P< 0.001

r2 = 0.6729; P< 0.001

4 3 2 1 0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

TP ( m ol caffeic acid acid eq/m g dry extract)

TP ( m ol caffeic acid acid eq/m g dry extract)

FRAP vs. TP
FRAP ( mol AA eq./mg dry extract)
FRAP ( mol AA eq./mg dry extract)

FRAP vs. FV
10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.00
r2 = 0.6625; P< 0.001

10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0.0

r2 = 0.6072; P< 0.001

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.25

0.50

0.75

1.00

TP ( m ol caffeic acid eq/m g dry extract)

FV ( m ol rutin eq./m g dry extract)

LP vs TP
100
Lipid peroxidation (%)

LP vs. FV
100
Lipid peroxidation (%)

r2 = 0.4061; P< 0.01

r = 0.5603; P< 0.001

75 50 25 0 0.0

75 50 25 0 0.00

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.25

0.50

0.75

1.00

TP ( m ol caffeic acid eq/m g dry extract)

FV ( m ol rutin eq./m g dry extract)

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CONCLUSION Extracts of vegetables rich in phenolics are increasingly of interest in several fields. In the food industry because they could retard oxidative degradation of lipids and thereby improve the quality and nutritional value of food. From the medical point of view, supplementation with antioxidants would be useful for diseases associated with oxidative stress. In terms of in vitro antioxidant activities and phenolic content, Hedeoma multiflorum, Heterothalamus allienus, Larrea divaricata, and particularly Hypericum connatum and Satureja parvifolia, could be excelent sources of antioxidant products with potential use as pharmacological or nutritional tools. ACKNOWLEDGMENTS We thank Ramn Martinez for excellent technical assistance. This work has been supported by a grant from the Universidad Nacional de La Plata (Programa de Incentivos X 446) REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (6), 540 BLACPMA ISSN 0717 7917 Eventos | Events

Eventos
4th Global Summit on Medicinal and Aromatic Plants
December 1-5, 2009 Kuching, Sarawak, Malaysia

14th International Congredd "Phytopharm 2010"


July 1 - 3, 2010 St. Peterburg, Russia Flyer: First Announcement

2010 Trends in Natural Products Research


A PSE Young Scientist Meeting. 11 - 14 April, 2010 Leicester School of Pharmacy - Leicester, UK Contact: Dr Randolph Arroo

25th International Conference on Polyphenols


Joint meeting with Groupe Polyphnols 23 - 27 August, 2010 Montpellier, FRANCE Contact: cheynier@supagro.inra.fr Web site:

Terpenes- Application, Activity & Analysis


26-29 September 2010 Istanbul, TURKEY Contact: Dr Fatih Demirci

9th Annual Oxford International Conference on the Science of Botanicals


April 12 - 15, 2010 Mississippi, U.S.A.

33rd annual Ethnobiology

meeting

of

the

Society

of

11th International Ethnopharmacology

Congress

of

"The Meeting Place: Integrating Knowledge" May 5-8, 2010 Victoria, British Columbia, Canada

Ethnobiological

Continuity and Change in Ethnopharmacology: Transdisciplinary Science for our Future September 21-24, 2010 Albacete, Castilla La Mancha, Spain

12th ISE Congress, International Society of Ethnobiology


May 9-14, 2010 Tofino, British Columbia, Canada.

51st Annual Meeting of the Society for Economic Botany


June 6-10, 2010 Xalapa, Mexico, Centro de Investagaciones Tropicales, Universidad Veracruzana (CITRO) and Insituto de Ecologa, A. C. (INECOL)

58th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research Gesellschaft fr Arzneipflanzen-und Naturstoff-Forschung e.V. Aug 29 - Sep 2, 2010 Berlin, Germany Flyer

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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas

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ISSN 0717 7917

Fragaria vesca (from Wikipedia commons/ public domain) Descripcin BLACPMA es una revista cientifica dedicada a las plantas medicinales, aromticas, y econmicas y a los productos naturales bioactivos. Publica contribuciones originales en ocho reas importantes: 1. Caracterizacin de los ingredientes activos de las plantas medicinales 2. Desarrollo de mtodos para la estandarizacin para los extractos bioactivos y los productos naturales de la planta. 3. Identificacin de la bioactividad de productos naturales vegetales. 4. Identificacin de blancos y mecanismo de la actividad de productos naturales. 5. Produccin y caracterizacin genmica de la biomasa de especies medicinales. 6. Qumica y bioqumica de productos naturales bioactivos. 7. Revisiones crticas de la personalidad histrica, clnica y jurdica de plantas medicinales. 8. Aspectos agrcolas de plantas medicinales y aromticas. Descargue el MODELO DE ARTICULO con las instrucciones de autor Detalles Bibliogrficos ISSN: 0717 7917 Publicado por CLACPMA 6 numeros / 1 Volumen ao Licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional Precio y Encargos Los articulos publicados electronicamente son gratuitos. Visite nuestro sitio web www.blacpma.org Separatas impresas pueden ser encargadas a editorial@blacpma.org (10 separatas: USD $25 + cargas postales) Audiencia Farmaclogos, Etnofarmacologos, farmacuticos, farmacognostas, fitoqumicos, qumicos orgnicos, toxiclogos, botnicos y antroplogos, entre otros. Impacto 2009: 9.00 Index Copernicus; La evaluacin del Journal Citation Reports (Thomson Reuters) ESTA EN CURSO.

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