BLACPMA0803

Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas
ISSN 0717 7917
Pylaisia polyantha (Schreb.) Bruch et Schimp.
Volumen 8, Nmero 3, Mayo de 2009

Nota Editorial Martnez. En el sptimo aniversario de BLACPMA. Editorial Taylor et al. Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA, Chilln 2009. Revisiones Diniz et al. (Brasil) Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review. Artculos Hernndez et al. (Chile) Heliopsis longipes anti-inflammatory effects in vitro. Gutirrez & Londoo (Colombia) Plaguicidas en tomates de mercados de cadena colombianos. Oliveira et al. (Brasil) Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum. Machn et al. (Cuba) Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas. Martnez et al. (Argentina) Trypanocidal activity of Castela coccinea Griseb. extracts. Barni et al. (Argentina) Eficacia antibitica de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en ratones. Cariddi et al. (Argentina) Immunomodulatory effects of Minthostachys verticillata essential oil. Comunicaciones Chopa et al. (Argentina) Actividad repelente de los extractos hexnicos y etanlicos de frutos de Solanum eleagnifolium sobre adultos de Blattella germanica. Gutirrez et al. (Argentina) Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora sobre adultos de Pediculus humanus capitis. Pino Bentez y Ramrez (Colombia) Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mgico-religiosos en comunidades del Pacfico colombiano norte. Marinoff et al. (Argentina) Precauciones en el empleo de plantas medicinales.
Publicada por | Published by: Cooperacin Latinoamericana y Caribea en Plantas Medicinales y Aromticas Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List , Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).
2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), i-ii BLACPMA ISSN 0717 7917
Comit Editorial | Editorial Board

Fundadores
Jos L. Martnez (Chile) - Jorge Rodrguez (Cuba) Edgar Pastene Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Chile. Janet Piloto Ferrer Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos La Habana, Cuba, Edgar Puente Centro de Toxicologa y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba, Gabriela Ricciardi Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina, Gloria Saavedra Centro de Tecnologa Agroindustrial, Universidad Mayor de San Simn, Cochabamba, Bolivia,
Editores
Jos L. Martnez Escuela de Kinesiologa, Universidad Santo Tomas, Talca, Chile. Jos M. Prieto School of Pharmacy, London University, Reino Unido. Gabino Garrido Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile.
Editores Ejecutivos
Damaris Silveira Facultade de Cincias da Sade, Universidade de Braslia, Brasil. Peter Taylor Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Carla Delporte Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Chile.
Editores Asesores
Arnaldo Bandoni Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Armando Cceres Universidad de San Carlos, Guatemala, Norman Farnsworth College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Estados Unidos. Michael Heinrich The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Peter Houghton Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College, London, Reino Unido. Leonora Mendoza Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Francisco Morn Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Mdicas de La Habana, Cuba. Patrick Moyna Facultad de Qumica, Universidad La Repblica, Montevideo, Uruguay. Pulok K. Mukherjee School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata, India. Lionel Robineau Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de las Antillas y Guyana (UAG), Pointe Pitre, Guadalupe. Elisabeth Williamson School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido.
Editores de Eventos
Mara Ins Isla Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad Nacional de Tucumn, Argentina. Marcelo Wagner Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
Co - Editores
Brbara Arias Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. Marco Dehesa Laboratorio RENASE, Quito, Ecuador. Jeannette Gavillan Instituto de Investigaciones Interdisciplinarias, Universidad de Puerto Rico. Harold Gmez Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Cartagena, Colombia. Vicente Martnez Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos, Guatemala.
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (3) 2009 | i
2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), i-ii BLACPMA ISSN 0717 7917
Consejo Editorial
Talal Aburjai, Faculty of Pharmacy, University of Jordan, Amman, Jordan Christian Agyare, College of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcn, Departamento de Ciencias Bsicas, Universidad del Bio Bio, Chilln, Chile. Roco Alarcn, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociacin de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia. Elizabeth Barrera, Seccin Botnica, Museo Nacional de Historia Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, India Salvador Caigueral, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Espaa. Sergio Castro, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos. Rene Delgado, Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clnicos, La Habana, Cuba. Saikat Dewanjee, Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Qumico Farmacuticas y Bioqumicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia. Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnologa Farmacutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorologa, Holgun, Cuba. Mildred Garca, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. rea de Biologa Vegetal, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronoma, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana Gonzlez, Universidad Catlica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers University, New Jersey, Estados Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecologa, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile.
Suzana Leitao, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Catlica del Per. Victor Lpez, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, Espaa. Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia. Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas e Biolgicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabin Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Miguel Morales, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. John A.O. Ojewole, Faculty of Health Sciences, University of KwaZuluNatal, Sudfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazona Peruana, Iquitos, Per. Jos Lus Ros, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Espaa. Alicia Rodrguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia. Aurelio San Martn, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. Guillermo Schinella, Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia. Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Troms, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panam. Ren Torres, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Anglica Urbina, Facultad de Agronoma, Universidad de Concepcin, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-Notre-Dame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia Saudita.
BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas

This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (3) 2009 | ii
2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), 237 - 238 BLACPMA ISSN 0717 7917 Nota Editorial
En el sptimo aniversario de BLACPMA

[In the seventh anniversary of BLACPMA]
Jos L. MARTNEZ Editor de BLACPMA
Contacto: e-mail: blacpmachile@gmail.com
Han transcurrido 7 aos desde aquel da a principios del mes de Mayo de 2002 en Buenos Aires, Argentina, en que se lanzara la idea ya concretizada por entonces junto a Jorge Rodrguez Chanfreau (Cuba) de editar un Boletn noticioso sobre el quehacer en torno a las plantas medicinales de las Amricas. Han sido 7 aos en los que hemos crecido da a da, nacimos bajo el alero de la Sociedad Latinoamericana de Fitoquimica y en la actualidad, a partir de nuestra Tercera Reunin Editorial realizada en enero de este ao en la ciudad de Chilln (Chile), bajo nuestro propia organizacin denominada Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas (CLACPMA) cuyo primer Presidente para el periodo Chilln (Chile) 2009 Albacete (Espaa) 2010 es el Dr. Jos Mara Prieto, de la Universidad de Londres quien podramos decir que es el padre de CLACPMA y el brazo derecho de este Boletn. En el transcurso de estos aos, este Boletn ya ha dejado de ser nuestro y es de todos ustedes. Antes solo llegaban dos o tres artculos al mes, hoy llegan como promedio 13 artculos mensualmente. La informacin incluida en BLACPMA se ha extendido por todo el mundo y esto ha hecho posible que en este ao hayan llegado manuscritos de India, Arabia Saudita, Sudn, y con artculos excelentes. Artculos publicados en BLACPMA son citados por autores de otras latitudes y no solo por autocitas. La revista se encuentra en un nivel muy alto y esperamos posicionarla mucho mas arriba. Con la entrada de la revista en ISI la atencin de autores de otras latitudes ha sido sorprendente. Sin embargo no olvidamos nuestras races y las puertas estn abiertas para publicar como Comunicaciones las presentaciones a Congresos que sean auspiciados por BLACPMA. Uno de los objetivos que me propuse como fundador de BLACPMA fue la idea de que investigadores de diferentes latitudes se pudieran reunir y trabajar en torno a esta Revista y eso ocurri
en Chilln, donde se encontraron 15 personas de diferentes latitudes y todos, a pesar del idioma, hablaron de la misma temtica, desde Abdul Manan Mat Jais de Malasia hasta mis compaeros de Chile que poco a poco han ido tomando conciencia de la presencia de una Revista especializada en plantas medicinales y aromticas nacida en Chile. Ya aquella propuesta ofrecida por Lionel Robineau (Guadalupe) de tener nuestras propias reuniones, cuestin que propuso un da all en Ro de Janeiro, esta tomando vuelo y en 2011 en Ecuador tendremos una Reunin Congreso solo de BLACPMA que ser encabezada por Marco Dehesa, uno de mis amigos de muchos aos y aventuras en torno a esta temtica. En el momento de los agradecimientos, que siempre son buenos, no debemos dejar de olvidar a aquellos que hacen posible este enorme trabajo. Tratar de ser ordenado, a mi hermano chico y grande a la vez Jos Mara Prieto (Reino Unido), sin su esfuerzo all en Londres esto no sera una revista cientfica. A Damaris Silveira (Brasil), la reina de BLACPMA elegida en Chilln, cuyo esfuerzo por indexar BLACPMA en ISI y en otros ndices internacionales ha sido tan fructfero como todo aquello que ella emprende gracias Damaris! A Gabino Garrido (Chile) que en este momento edita los artculos con pautas y polticas estndares de revistas internacionales para que estos queden uniformes como usted los lee, sin su profesionalismo y su espritu crtico no estaramos ascendiendo cada da ms alto. A Peter Taylor (Venezuela) y Carla Delporte (Chile) quienes junto a Leonora Mendoza (Chile) son verdaderos biblioteclogos intentando establecer que los artculos sean inditos. A mis cuatro amigos de muchos aos que ayudaron a que este Boletn naciera Arnaldo Bandoni (Argentina), Francisco Morn (Cuba), Lionel Robineau (Guadalupe) y Patrick Moyna (Uruguay) sin olvidar a Jorge Rodrguez Chanfreu que dio su
Martnez
Nota Editorial. El sptimo aniversario de BLACPMA
apoyo inicial como fundador. Adems, al espritu joven de Brbara Arias (Argentina) y la experiencia de Mara Ins Isla (Argentina) que han permitido en sus respectivas reas tomar un lugar de muy buena reputacin. A Jeannette Gavilln (Puerto Rico), un hallazgo de Lionel Robineau, por ser un muy buen soporte en el Caribe para BLACPMA. A mi amigo Jos Vicente Martnez (Guatemala), quien desde el punto de vista agronmico aporta su experiencia en establecer estndares buensimos en los artculos que coordina en esa rea. No debemos dejar de mencionar la experiencia de dos personas que se han entregado por completo a BLACPMA, me refiero a Michael Heinrich (Inglaterra) y Geoffrey Cordell (USA), sus aportes son las mejores herramientas para seguir con elevado rigor el trabajo editorial. Siempre lo destaco pues hay alguien que es como mi hermano mayor en este tipo de cosas, que siempre me gui cuando estaba solo en BLACPMA y alguna vez tambin nos ha dado su granito de arena en tiempos recientes, de una mente desarrolladsima y muy visionario en cuestiones de edicin y publicacin, me refiero a Guillermo Padrn (Cuba) y
que hoy trabaja en Quertaro (Mxico) para un organismo internacional. A Claudio Laurido (Chile) y Aurelio San Martn (Chile) que siempre como mis buenos amigos personales por ms de 25 aos, me han apoyado en todo lo que emprendo. Hay rostros que solo conocemos por fotos hasta el da de hoy, Talal Zari (Arabia Saudita), Christian Agyare (Ghana), Talal Aburjai (Jordania), Mahendra Rai (India), Chaiyong Rujjanawate (Tailandia) as como la sabia joven de nuestros recientes miembros Victor Lpez (Espaa), Edgar Puente (Cuba), Edgar Pastene (Chile), Janet Piloto (Cuba), Gabriela Ricciardi (Argentina), Gloria Saavedra (Bolivia), Harold Gmez (Colombia), Brenda Modak (Chile) entre otros nos llevan a tener confianza de que BLACPMA subir en los prximos aos a un sitial inigualable y envidiable dentro del mbito cientfico internacional. Gracias a todos, gracias a quienes confan por publicar en las pginas de BLACPMA sus trabajos, gracias a aquellos que nos leen, gracias a aquellos que nos citan, gracias a aquellos que nos dan su apoyo, gracias a todos.
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (3) 2009 | 238
2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), 234 - 236 BLACPMA ISSN 0717 7917 Editorial
Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA, Chilln 2009

[Third Editorial Meeting of BLACPMA, Chilln 2009]
Peter TAYLOR , Gabino GARRIDO1,3, Damaris SILVEIRA1,4, Jos M. PRIETO1,5 & Jos L. MARTNEZ1,6*
1 Editor de BLACPMA; 2Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas; Caracas, Venezuela; 3Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile; 4Universidad de Brasilia; Brasilia, Brasil; 5University of London, Londres, Reino Unido; 6Universidad Santo Toms, Talca, Chile 1,2
*Contacto: e-mail: blacpmachile@gmail.com
Entre el 6 y 9 de enero se realiz en la Facultad de Agronoma, Universidad de Concepcin, sede Chillan, el Primer Congreso Internacional de Farmacobotnica de Chile y junto a l la Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA. A dicha reunin asistieron Jos L. Martnez (Chile), Jos M. Prieto (Reino Unido), Gabino Garrido (Chile), Dmaris Silveira (Brasil), Mara Ins Isla (Argentina), Julio Alarcn (Chile), Manan Mat Jais (Malasia), Patricia Arenas (Argentina), Janet Piloto (Cuba), Carlos Cspedes (Chile), Edgar Pastene (Chile), Vicente Martnez (Guatemala) y Peter Taylor (Venezuela). Estuvieron ausentes, por razones de salud o familiares, Marcelo Wagner (Argentina), Geoffrey Cordell (Estados Unidos), Bruce Cassels (Chile), Elsa Rengifo (Per), Ana Ladio (Argentina) y Marta Ana Gattuso (Argentina). En la relacin de invitados se encontraban Anglica Urbina (Chile), Claudia Jamal (Brasil), Marie Christine Ruiz (Venezuela), Fabin Michelangeli (Venezuela) y Hctor Rodrguez (Colombia). Jos Lus Martnez, como Editor Jefe de BLACPMA, asumi la coordinacin de la reunin con unas breves palabras de bienvenida. En ellas se agradeci a la Dra. Anglica Urbina que representaba al comit organizador del Primer Congreso Internacional de Farmacobotnica de Chile - la oportunidad de colaborar con el desarrollo del evento y se anunci que las actas de este sern motivo de un suplemento de la revista que se publicar durante este 2009. Se evalu la situacin actual de la revista como altamente satisfactoria, ya que su evolucin sigue los objetivos marcados en FAPRONATURA 2006 (Varadero, Cuba) e incluso se han sobrepasado ampliamente en algunos aspectos. La prospectiva es que BLACPMA se situara como referente cientfico de Latinoamrica en un plazo mas corto del anticipado.
Tras esto se procedi a tratar la serie de temas que llenaban la agenda de la reunin. Proclamacin de CLACPMA (Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas) como la entidad sustentadora de BLACPMA y la eleccin de su Junta Directiva CLACPMA es el organismo que actuar como rgano editor de BLACPMA. CLACPMA se constituye como una red de profesionales que desearan generar redes de conocimiento, intercambio de informacin y/o grupos de trabajo gracias a las oportunidades que BLACPMA proporciona para comunicarse con otros profesionales de Latinoamrica y el resto del Mundo. La primera eleccin de los directivos de CLACPMA qued integrada de la manera siguiente: Presidente: Jos Mara Prieto (Reino Unido) Vicepresidente: Jos Lus Martnez (Chile) Secretario: Peter Taylor (Venezuela) Tesorero: Marcelo Wagner (Argentina) Primer Director: Gabino Garrido (Chile) Segundo Director: Edgar Pastene (Chile) La declaracin de principios de CLACPMA es pblica en www.blacpma.org/clacpma.htm Situacin financiera de BLACPMA BLACPMA sigue -y seguir siendo- una publicacin gratis y que funciona gracias al trabajo desinteresado de sus miembros. Sin embargo, existen unos ciertos costes mnimos que toda publicacin electrnica debe proveer y que hasta ahora se cubren por las aportaciones mnimas de un grupo muy reducido de miembros. El comit reconoci que la tendencia actual de las publicaciones Open Access es pedir a los autores una aportacin que pueda asegurar la existencia a largo plazo de su trabajo en Internet.
Taylor et al.
Este dinero sirve para costear la WEB, el alquiler del dominio y la adquisicin de un d.o.i. que es vital para una publicacin electrnica. El remanente costeara pequeos gastos de correo postal y material de oficina necesario para el desarrollo de la actividad editorial.
evaluacin. Se sugiri, por ejemplo, que el coordinador de la evaluacin de un manuscrito debe evaluar su originalidad, que sea un tema apropiado para BLACPMA y que conforme al formato de presentacin, mientras que los revisores harn hincapi en el contenido cientfico. Se form una comisin para establecer las Pautas de revisin conformada por Carlos Cspedes (Coordinador), Julio Alarcn (Qumica) y Gabino Garrido (Farmacologa). Mayoritariamente se sugiri mantener la pauta de aceptar envos en los tres idiomas ms importantes de Amrica Latina y el Caribe: espaol, ingls y portugus.
Participantes en la Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA. I D: Marie Christine Ruiz (Venezuela), Manan Mat Jais (Malasia), Carlos Cspedes (Chile), Peter Taylor (Venezuela), Patricia Arenas (Argentina), Jos L. Martnez (Chile), Janet Piloto (Cuba), Gabino Garrido (Chile), Mara Ins Isla (Argentina), Vicente Martnez (Guatemala), Dmaris Silveira (Brasil), Julio Alarcn (Chile), Edgar Pastene (Chile) y Jos M. Prieto (Reino Unido).
Se habl de las diferentes maneras de efectuar los posibles pagos, que idealmente estara integrado en el sistema online. El sistema PayPal result particularmente interesante porque salvaguarda los datos sensibles del autor y de BLACPMA, adems de ser una referencia internacional. Se form una comisin integrada por Dmaris Silveira (Brasil), Julio Alarcn (Chile), Mara Ins Isla (Argentina) y Marcelo Wagner (Argentina) para tomar decisiones sobre estos asuntos financieros e informar a la comunidad de sus recomendaciones antes de mayo 1 de 2009. Evaluaciones y pautas de revisin de manuscritos Jos L. Martnez hizo un anlisis del flujo de las evaluaciones de manuscritos y entreg un documento con el estado actual de los manuscritos en proceso de evaluacin. Se dio la bienvenida a Anglica Urbina y Fabin Michelangeli como nuevos evaluadores. Se cre una comisin para renovar el formato de evaluacin a ser usado en el futuro por BLACPMA adems de establecer un nuevo proceso interno de
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Los Editores de BLACPMA Jos M. Prieto (I) y Jos L. Martnez (D) recin elegidos Presidente y Vicepresidente de CLACPMA, respectivamente.
Prximas Reuniones Editoriales y Congresos Se estableci el probable cronograma de reuniones editoriales. Se acord realizar en los aos pares la Reunin del Comit Editorial junto a un congreso y en los aos impares de forma autnoma (CLACPMA). De esta forma se propuso realizar la Cuarta Reunin del Comit Editorial de BLACPMA (o BLACPMA 4) junto al Congreso de la International Society of Ethnopharmacology en Albacete (Espaa) en septiembre de 2010 al cual hemos sido invitados por su presidente. Existen al menos tres pre-acuerdos y/o invitaciones para las Reuniones Editoriales BLACPMA 5-6-7 o Congresos CLACPMA 1-2 en Quito (Ecuador) en 2011, ofrecida por el Dr. Marco Dehesa y un pre-acuerdo sostenido por Jos L. Martnez y el Dr. Hctor Rodrguez para realizar BLACPMA 6 junto al Congreso de Plantas Medicinales de Colombia en
Taylor et al.
Palmira o Cali en 2012 y se invit al Dr. Vicente Martnez (Guatemala) la organizacin de BLACPMA 7 junto a CLACPMA 2 en Antigua (Guatemala) en 2013.
Asuntos varios El Prof. Manan Mat Jais inform de la posibilidad de invitar a BLACPMA a participar en un acuerdo sur-sur con BIOASIA. Esto abrira posibilidades de colaboracin entre ambas regiones a travs de BLACPMA. Los presentes felicitaron a todos los que han trabajado arduamente en BLACPMA y CLACPMA y muy especialmente a Jos Lus Martnez y a Jos Mara Prieto. Tras la Reunin Editorial se celebr una Cena de Hermandad BLACPMA, la primera en su gnero, a la que acudieron tanto miembros del comit como amigos.
Vista de la celebracin de la Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA.
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), 188 - 194 BLACPMA ISSN 0717 7917 Revisin | Review
Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review

[Recientes avances del uso del Panax ginseng como analgsico: una revisin sistemtica]
Alessandra de Sousa BRAZ, Margareth de Ftima F. Melo DINIZ, Reinaldo Nbrega de ALMEIDA* Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Universidade Federal da Paraba.Caixa Postal 5009, CEP 58051-970, Joo Pessoa, Paraba, Brazil.
Abstract
Ginseng is a widespread herbal medicine that has been used in China, Korea and Japan for thousands of years. Ginsenosides or ginseng saponins are the active principles of Panax ginseng. Ginseng is widely used as a general tonic and adaptogen; however, experimental and clinical studies have shown it to have beneficial effects on a wide range of pathological conditions including cardiovascular diseases, cancer, immune deficiency and neurodegenerative disorders. Recent studies have also suggested that some of the active ingredients of ginseng may exert a beneficial effect on nociception. This review focuses on the recent scientific evidence of the reported medicinal effects of ginseng with particular emphasis on its analgesic-like effects.
Keywords: Ginseng extract; Ginsenoside; Antinociception; Analgesia.
Resumen
El ginseng es una hierba medicinal que est difundida en todo el mundo. Pases como China, Corea y Japn la han utilizado por muchos siglos. Los ginsensidos o saponinas de ginseng son los principios activos del Panax ginseng. Este es ampliamente utilizado como un tnico y adaptgeno; sin embargo, algunos estudios experimentales y clnicos han demostrado efectos beneficiosos en gran variedad de condiciones patolgicas como enfermedades cardiovasculares, cncer, deficiencia inmune y desrdenes neurodegenerativos. Recientes estudios sugieren que algunos de los componentes activos del ginseng pueden ejercer un efecto beneficioso en la nocicepcin. Esta revisin se centra en la evidencia cientfica mas reciente de los efectos medicinales anteriormente citados del ginseng, con especial nfasis en sus efectos analgsicos.
Palabras Clave: Extracto de ginseng, Ginsenosides, Antinocicepcin, Analgesia.
Recibido | Received: February 2, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: April 10, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 13, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: none stated. This article must be cited as: Alessandra de Sousa Braz, Margareth de Ftima F. Melo Diniz, Reinaldo Nbrega de Almeida. 2009. Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):188 194. {EPub April 13, 2009}.
*Contacto | Contact: e-mail: reinaldoan@uol.com.br
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Braz et al.
Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review.
INTRODUCTION For hundreds of years, traditional Chinese, Korean and Japanese medicine has used medicinal herbs such as ginseng as an essential therapy for weakness and fatigue. Ginseng is derived from the roots of several species of plants (Kiefer and Pantuso, 2003). The types of ginseng most frequently used are Asian or Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer), American ginseng (Panax quinquefolius C.A. Meyer) and Japanese ginseng (Panax japonicus C.A. Meyer) (Yuan and Dey, 2001; Coleman et al., 2003). The genus Panax (Araliaceae) is comprised of around 11 slow-growing species (perennial plants with strong roots) that grow in the northern hemisphere, typically in the cold climates of eastern Asia, particularly northern Korea and eastern Siberia and Russia. The Table 1 summarizes the scientific classification of the Panax genus (Winston and Maimes, 2007). Ginseng is used in several ethnomedical systems as an adaptogen. However, other species endowed with similar adaptogenic effects are popularly also known as gingseng. These include -among othersEleutherococcus senticosus (Siberian ginseng), Pseudostellaria heterophylla (Prince ginseng), Withania somnifera (Indian ginseng) and Pfaffia paniculata (Brazilian ginseng) (Davydov and Krikorian, 2000; Radad et al., 2006). The chemical composition of the different Panax species is relatively similar; however, in general each species exerts a specific effect on the body (Vuksan et al., 2000; Radad et al., 2006). The principal active components of ginseng are the ginsenosides or ginseng triterpenoid saponins. Approximately 38 types of ginsenosides have been identified (Rhim et al., 2002; Leung et al., 2007; Choi et al., 2008), which account for the pharmacological effects of these plants in the modulation of angiogenesis, for their popular adaptogenic properties and their effects on the central nervous system (CNS). The concentration of each ginsenoside varies depending on the species of Panax, the time of the year, the time it takes to be collected, the part of the plant and the methods of preservation or extraction used. Some studies have indicated steroid hormone receptors as possible molecular targets of ginseng, which may explain the diverse cellular and physiologic effects of this plant (Rege et al., 1999; Yuan and Dey, 2001; Coleman et al., 2003; Leung et al., 2007). According to Attele et al. (1999), some of the pharmacological effects of ginsenosides may be
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explained by their capacity to target multiple receptors at the plasma membrane as well as by their ability to cross the membrane freely and induce effects by acting directly on the nucleus. However, in many cases, the mechanisms of action of the ginsenosides remain unknown.
Table 1. Scientific classification of the Panax genus.
Kingdom Division Class Order Family Subfamily Genus Main species
Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Apiales Araliaceae Aralioideae Panax Panax notoginseng (San Qi) Panax bipinnatifidus (Seem.) Panax ginseng (C.A. Meyer) Panax japonicus (C.A. Meyer) Panax quinquefolium (C.A. Meyer) Panax vietnamensis (Ha eand Grushv) Panax wangianum (Suu) Panax zingiberensis (Wu and Feng.) Panax pseudoginseng (Wall) Panax stipuleanatus (Tsai and Feng.) Panax trifolium L.
The basic chemical structure of all ginsenosides is similar, consisting of a gonane steroid nucleus with 17 carbon atoms arranged in four rings. The characteristic biological responses for each ginsenoside are attributed to the differences in the type, position, and number of sugar moieties attached by the glycoside bond at C-3 and C-6. Based on their structural differences, they can be classified into three categories: the panaxadiol group (Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Rs1), the panaxatriol group (Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1), and the oleanolic acid group (Ro) (Radad et al., 2006). This review focuses on the recently reported medicinal effects of ginseng and summarizes the current body of evidence supporting the use of ginseng particularly with respect to its antinociceptive / analgesic properties. General use of Panax ginseng Based on experimental studies, an effect of some types of ginseng on the central nervous system (CNS) has been suggested, particularly in neurodegenerative disorders such as senile dementia and Parkinsons disease. Following the rapid exposure of cortical cell culture to glutamate, an excitatory neurohormone of
Braz et al.
the CNS, significant neuronal death occurred. This damage was significantly reduced when the cell cultures were pretreated with the Rb1 and Rg3 ginsenosides, resulting in inhibition of the overproduction of nitric oxide, which is routinely followed by neurotoxicity. In glutamate-treated cells, these ginsenosides inhibited the formation of malondialdehyde and reduced calcium influx, suggesting a significant neuroprotective effect (Kim et al., 1998). It has been suggested that Rg3 ginsenoside inhibits both N-methyl-D-aspartate (NMDA) and non-NMDA glutamate receptors, which contribute significantly to many neurological disorders particularly brain ischemia, trauma, stroke, and seizures (Radad et al., 2006). The neuroprotective effect of the Rb1 and Rg1 ginsenosides (extracted from ginseng roots) has been demonstrated in vitro in spinal cord neurons. These ginsenosides were found to protect the spinal neurons from the excitotoxicity induced by glutamate and kainic acid, as well as from the oxidative stress induced by H2O2, in a dose-dependent manner (20-40 micro M), thereby reinforcing the need for more studies on its therapeutic use in spinal cord injuries (Liao et al., 2002). It has also been shown to have an effect on the immune system by enhancing phagocytosis, the activity of natural killer cells and interferon production (Kiefer and Pantuso, 2003), and has beneficial effects as an antioxidant (Hofseth and Wargovich, 2007). Kim et al., 2007, found that transgenic P. ginseng inhibited the production of tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-6, IL-8, and the expression of cyclooxygenase-2 in phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) plus calcium ionophore A23187 (PMACI)stimulated human mast cells (HMC-1). Additionally, they have shown that transgenic P. ginseng suppressed the intracellular calcium level induced by PMACI. These results provide new insights into the pharmacological actions of transgenic P. ginseng as a potential molecule for use in therapy in mast cellmediated inflammatory diseases (Kim et al., 2007). Studies carried out in vivo have shown the beneficial effects of P. ginseng in a wide range of pathological conditions such as diabetes mellitus (Suzuki and Hikino, 1989), cardiovascular diseases (Buettner et al., 2006) cancer (Panwar, 2005; Mannaa et al., 2006), inflammatory processes (Li and Chu, 1997; Park et al., 2005; Raddad et al., 2006) and in animal models of behavioral disorders (Einat, 2007).
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Clinical use of Panax ginseng In clinical studies, ginseng led to an improvement in climacteric symptoms, particularly fatigue, insomnia and depression, in postmenopausal women (Tode et al., 1999). In addition, a positive effect has been shown on the immune system (Kaneko and Nakanishi, 2004) in the control of arterial hypertension and on cardiovascular function (Zhou et al., 2004), in the treatment of psychological abnormalities and in conditions associated with diabetes mellitus (Buettner et al., 2006). It has also been found to reduce the occurrence of viral respiratory infections in the elderly when compared to a placebo group (McElhaney et al., 2004). Nevertheless, controversial results have been published in the literature with respect to the use of ginseng for the treatment of psychological abnormalities and only a modest effect has been reported with respect to its hypoglycemic activity (Kiefer and Pantuso, 2003). Ginseng has been reported to have a positive effect in the treatment of herpes simplex virus type II infection, the common cold, ethanol-induced gastric lesions and aspirininduced gastric ulcers (Kaneko and Nakanishi, 2004). Used primarily as a general tonic and to restore homeostasis, and despite reports of improvements in psychomotor performance in healthy volunteers (D'Angelo et al., 1986), there are contradictory reports in the literature (Coleman et al., 2003; Kiefer and Pantuso, 2003). The use of ginseng was found to result in an improvement in the quality of life of patients with chronic renal failure and an improvement in mental and psychosocial health following four weeks of treatment; however, these effects tended to attenuate with prolonged use (Ellis and Reddy, 2002). In 2003, Coleman et al. analyzed studies carried out on the effects of this plant on quality of life and found that, although the majority of studies failed to find any significant differences associated with the use of ginseng in the final scores, the possibility that an improvement in some of the parameters of quality of life was indeed related to its use could not be discarded. The efficacy of ginseng as a therapeutic option for the treatment of male erectile dysfunction (Hong et al., 2002), and the improvement in the survival of patients with advanced stomach cancer during postoperative chemotherapy (Suh et al., 2002) have been demonstrated in double-blind clinical trials.
Braz et al.
Panax ginseng and analgesia: possible molecular mechanisms Several studies have demonstrated the antinociceptive effects of ginseng extract in experimental models in vitro (Nah and Mccleskey, 1994; Hahn et al., 2000; Sampson et al., 2000) and in vivo (Ramarao and Bhargava, 1990; Mogil et al., 1998; Yoon et al., 1998; Shin et al., 1999; Nah et al., 2000; Suh et al., 2000; Choi et al., 2003; Nemmani and Ramarao, 2003). Studies using the whole-cell and inside-out configurations of the patch-clamp technique showed that the total saponins of ginseng (ginsenosides), when applied at the dose of 100 g/mL concomitantly with capsaicin (1 g/mL), directly blocked the capsaicinactivated calcium channels, resulting in attenuation of the currents of these ions in sensorial neurons of rats (Hahn et al., 2000). The Rg3 ginsenoside was also able to inhibit calcium channels in the rat dorsal root ganglion neurons. Studies using the patch-clamp technique found that the application of the entire extract of ginseng suppressed calcium channel currents in a dose-dependent manner. The experimental use of selective blockers showed that the ginseng saponins are able to modulate the currents in the L, N and P calcium channels, suggesting that part of the pharmacological basis of the antinociceptive effect of ginseng, particularly the Rg3 ginsenoside, involves modulation of the calcium channels (Rhim et al., 2002). Voltage-gated Na+ channels in primary sensory neurons play important roles in pain perception. The effects of a polyacetylenic compound, (9R,10S)epoxyheptadecan-4,6-diyn-3-one (EHD), isolated from ginseng extract, were investigated in tetrodotoxinsensitive (TTX-S) and tetrodotoxin-resistant (TTX-R) Na+ currents in acutely dissociated rat dorsal root ganglion neurons. In this study, EHD inhibited both Na+ currents in a concentration-dependent manner, accelerated the inactivation of both Na+ currents and produced a hyperpolarizing shift of the steady-state inactivation curve. In addition, EHD suppressed the maximal Na+ current at negative holding potentials at which the channels are relieved from inactivation. Thus, EHD appears to bind both resting and inactivated channels. According to these authors, EHD, a polyacetylene derived from ginseng, by inhibiting Na+ currents in primary sensory neurons, may contribute to the analgesic effect of ginseng (Choi et al., 2008).
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In vivo studies, the effects of the administration of ginseng extract on nociception and colonic temperature in Sprague-Dawley rats, and the possible involvement of opioid receptors in its pharmacological activities were evaluated by Ramarao and Bhargava in 1990. Following intraperitoneal administration of the extract at doses of 25, 50, 100 and 200 mg/kg, either alone or in combination with morphine (8 mg/kg), ginseng was found to induce analgesia and hypothermia at high doses (100 and 200 mg/kg) through a non-opioid mechanism, since these effects were not antagonized by naloxone. Since ginseng was able to induce analgesia, its interaction with morphine was investigated and results showed that when the extract was administered together with morphine, the acute pharmacological effects evoked by morphine in rats, such as analgesia and hyperthermia at a dose of 8 mg/kg, and catalepsy at a dose of 50 mg/kg were antagonized by ginseng in a dose-dependent manner. In other words, to antagonize the analgesic effect of morphine, only intermediate doses (25 to 50 mg/kg) were effective. Next, it was found that, like opioid analgesics, the Rf ginsenoside inhibited calcium channels in primary sensorial neurons using an unidentified receptor bound to the G protein, unlike the alpha-2 adrenergic receptors, gamma-amino butyric acid type B (GABAB), muscarinic or opioid receptors (Nah and Mccleskey, 1994). Since inhibition of the calcium channels in sensorial neurons contributes towards antinociception by the opioids, Mogil et al. (1998) tested the analgesic effects of the Rf ginsenoside in experimental models of acute and chronic pain, and reported a dosedependent, antinociceptive effect in the models used to evaluate chronic pain. This effect was accompanied by inhibition of the calcium channels in the large nociceptors. Additionally, the authors reported an antinociceptive effect with the use of the raw, unprocessed extract of ginseng, suggesting that Rf was not the only component of the extract that participated actively in the antinociceptive effect. The effects of ginsenosides on the nociceptive response to intrathecally-administered substance P (SP) were also investigated in mice. Using this route of administration, both pretreatment and concomitant treatment with ginsenosides inhibited the SP-induced nociceptive responses (scratching, biting or licking the distal portion of the paw) in a dose-dependent manner. In this study, Yoon et al. (1998) reported that ginsenosides showed antinociceptive activity in the
Braz et al.
formalin test and that this effect was due to substance P-mediated blockade of the postsynaptic nociceptive information at spinal level. Choi et al. (2003) obtained similar results with Rb2, Rc, Rd and R2 ginsenosides injected supraspinally and Rb1, Rb2, Rd and Rf ginsenosides administered into the spinal cord. Following confirmation that ginsenosides were effective in inhibiting SP-induced nociceptive responses, Nah et al. (2000) demonstrated their central activity following inhibition of the pain induced experimentally by an injection of capsaicin into the hind paw of the animal. These investigators reported that the plant inhibited pain in a dose-dependent manner only when administrated intrathecally or intracerebroventricularly, while this effect was not found when the ginsenoside was applied subcutaneously to the plantar surface prior to the injection of capsaicin. As in the study carried out by Shin et al. (1999) with Rc, Rd and Re ginsenosides in models of chronic pain in which significant responses related to the noxious chemical stimulus were obtained, pretreatment with naloxone failed to block the antinociceptive effect of the intrathecal administration of the ginsenoside, suggesting that the latter exerts central antinociceptive effects in the spine and/or supraspinal region but not in peripheral nociceptors. Moreover, these investigators found that their effects were not mediated by the opioid receptors (Shin et al., 1999; Nah et al., 2000). Rb1, Rb2, Rc, Rd and Rg1 ginsenosides blocked the antinociceptive effect induced by a kappa-opioid agonist (U50,488H) when administered into the spinal cord and in the supraspinal region of mice, and the same response was obtained by Rb2 and Re ginsenosides administered into the supraspinal region (Suh et al., 2000). Interference by the Rf ginsenoside in the analgesic effect induced by the opioid agonist U50,488 H was reported by Nemmani and Ramarao in 2003 using the tail-flick test in mice. Intraperitoneal administration of 40 mg/kg of the agonist produced analgesia, and the inhibition of tolerance of the agonist to analgesia by Rf remained unaffected by flumazenil (0.1 mg/kg), a benzodiazepine receptor antagonist, and by picrotoxin (1 mg/kg), a chloride channel blocker in the GABAA receptor. The results showed that Rf potentiated U-50, 488H-induced analgesia and inhibited its tolerance to analgesia, suggesting that the effect of Rf on U50,488H, in mice occurs through a non-opioid path insensitive to the calcium channels, sensitive to dihydropyridine and not GABAergic.
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Clinical studies with analgesic activities of P. ginseng on literature are insufficient. Others saponins were studied. To evaluate the therapeutic effect and possible mechanism of total Panax notoginseng saponins (PNS) for treatment of rheumatoid arthritis (RA), and to observe its safety and influence on RA immune related inner environment, 84 patients were randomly assigned to two groups. All were treated with the routine therapy with diclofenac sodium, Leflunomide and prednisone, but for the 43 patients in the treatment group PNS was given additionally. Significant improvement of clinical symptoms and change of indexes including platelet counts, immnuoglobulins (IgG, IgA, IgM), complement (C3), rheumatoid factor (RF), C-reactive protein (CRP), ceruloplasmin (CER), haptoglobin (HPT), and alpha1acid glycoprotein (AAG) were observed in both groups after treatment, and the effect in the treatment group was better (P<0.05 or P<0.01). PNS can significantly improve the condition of patients enhance the therapeutic effect in treating RA, through regulating the disordered immunity and improving the effect of anti-inflammatory and analgesia (Zhang et al, 2007). CONCLUSION In experimental models, the antinociceptive/analgesic effects of ginseng extract, particularly the effect of ginsenosides on inhibition of substance P-induced nociceptive response and the inhibition of calcium channels in the sensorial spinal and or supraspinal neurons of rats, suggest that ginseng has a potential analgesic effect and a central antinociceptive effect; rather than on the peripheral nociceptors. Clinical studies with analgesic activities of P. ginseng on literature are scarce. Therefore, in view of the positive findings of clinical trials performed with appropriate methodology, the medicinal and analgesic effects of ginseng extract may represent an option for the treatment of acute and/or chronic pain, particularly since the costs involved in marketing this substance appear to be accessible. REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), 160 - 164 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article
Anti-inflammatory effect of an ethanolic root extract of Heliopsis longipes in vitro

[Efecto anti-inflamatorio in vitro del extracto etanlico de la raz de Heliopsis longipes]
Ivones HERNNDEZ1, Yeny LEMUS1, Sylvia PRIETO1, Jorge MOLINA-TORRES2, Gabino GARRIDO1,3* Laboratorio de Farmacologa, Centro de Qumica Farmacutica, La Habana, Cuba. Departamento de Biotecnologa y Bioqumica, CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato, Mxico. 3 Departamento de Qumica y Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile.
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Abstract
Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) is a species broadly used in Mexican Traditional Medicine. The present study illustrates the effects of the root ethanolic extract from this species on the production of tumor necrosis factor alpha (TNF) and nitric oxide (NO) by activated RAW264.7 macrophage. The extract showed an inhibitory activity on TNF (IC50= 223.0 g/mL) and NO (IC50 = 136.9 g/mL). These results represent a contribution to the elucidation of the mechanism involved in the analgesic and anti-inflammatory effects reported for the H. longipes extract. Keywords: Heliopsis longipes; inflammation; tumor necrosis factor alpha; nitric oxide; macrophages.
Resumen
Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) es una especie ampliamente utilizada en la Medicina Tradicional Mexicana. El presente estudio ilustra los efectos del extracto etanlico de la raz de esta especie sobre la produccin del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y el xido ntrico (NO) en macrfagos RAW264.7 activados. El extracto mostr una actividad inhibitoria sobre TNF (IC50= 223.0 g/mL) y NO (IC50 = 136.9 g/mL). Estos resultados representan una contribucin a la elucidacin del mecanismo involucrado en los efectos analgsico y anti-inflamatorio publicado para el extracto de H. longipes. Palabras Clave: Heliopsis longipes; inflamacin; factor de necrosis tumoral alfa; xido ntrico; macrfagos.
Recibido | Received: February 3, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 4, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was partially supported by the Ministry of Public Health, Republic of Cuba (Project MINSAP/Cuba 0008001) and Integral Project CONACYT/Mxico E120,941/2002. This article must be cited as: Ivones Hernndez, Yeny Lemus, Sylvia Prieto, Jorge Molina-Torres, Gabino Garrido. 2009. In vitro anti-inflammatory effect of Heliopsis longipes roots ethanolic extract. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):160 164. {EPub April 10, 2009}.
*Contactos | Contacts: Prof. Gabino Garrido Garrido. Departamento de Qumica y Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile. E-mail: gabino.garrido@gmail.com; ggarridog@ucn.cl
Hernndez et al.
Heliopsis longipes anti-inflammatory effects in vitro
INTRODUCTION Heliopsis longipes (A. Gray) Blake (Asteraceae) is a species broadly used in Mexican Traditional Medicine for the treatment of dental pain (GutierrezLugo et al., 1996) and is also used by indigenous and rural peoples of Central and South America for its analgesic, anti-inflammatory and anti-ulcerative properties (Colvard et al., 2006). Studies carried out with extracts obtained of this plant have demonstrated its capacity to inhibit the constrictions induced by intraperitoneal administration of acetic acid in a murine model of pain (Ogura et al., 1982). It is relevant to note the presence of affinin in the extract obtained from H. longipes roots (MolinaTorres and Garca-Chvez, 2001). Also, the alkamides has been studied in vitro for their inhibitory action on the enzymes cyclooxygenase and 5-lipoxygenase (Mller-Jakic, 1994). Taking in to account these reports, we have proposed to determine the anti-inflammatory effects of the ethanolic extract of of H. longipes roots. In this paper, we have evaluated the in vitro effects on tumor necrosis factor (TNF) and nitric oxide (NO) production by activated macrophages. MATERIALS AND METHODS Plant Material H. longipes (Gray) Blake (Asteraceae) specimens, as authenticated by Dr J. Rzedowski, Instituto de Ecologa, Ptzcuaro, Michoacan, Mexico, were collected in Sierra Gorda in the state of Guanajuato, Mexico at an altitude of between 2000 and 2500 meters above sea level. Voucher specimens (H. longipes JMT, IED) were deposited at the above mentioned institution. Preparation of the extracts Dry roots were ground and extracted with absolute ethanol in a continuous extraction system (Tecator, Soxtec System HT 1043 Extraction Unit) for 2 h at 80C. The ethanolic extract was then freed from solvent in a rotary evaporator at 60 C under reduced pressure (Molina-Torres et al., 1999). Dry extract was maintain at 20 oC until its use when it was dissolved in DMEM for in vitro pharmacological studies.
Chemical characterization of the extract The chemical characterization of this ethanolic extract was reported by Molina-Torres et al. (1996; 2004). It contains affinin, as the major alkamide, along with N-isobutyl-2E-decenamide, and N-isobutyldecanamide. Interestingly, sesquiterpene lactones bioactive secondary metabolites commonly present in Asteraceae- were not found in the extract. Reagents Dexamethasone, lipopolysaccharide (LPS, from Escherichia coli Serotype: 055:B5), recombinant murine gamma interferon (IFN), tumor necrosis factor (recombinant murine TNF, specific activity: 107 U/mg), actinomycin D were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). N-monomethylL-arginine (L-NMMA) was from Cayman Chemical, Ann Arbor, MI. Cell lines Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, GIBCO-BRL, Pisley, UK) and RPMI 1640 (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) were supplemented with 10% FBS, 1% de L-glutamine and 0.5% penicillin-streptomycin solution. The murine macrophage RAW264.7 cell line and murine fibrosarcoma L929 cell line were cultured in DMEM medium and RPMI 1640, respectively, and incubated at 37 C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Cytotoxicity assays The H. longipes extract was not cytotoxic ( 500 g/mL) according to previous studies of cytotoxicity. This was assessed by dimethyl-diphenyl-tetrazolium (MTT) incorporation for each experimental condition. The viability was consistently > 97% (Delgado et al., 1998). Dexamethasone and L-NMMA were used as positive control for TNF and NO inhibition, respectively. Tests were repeated in at least three independent experiments and the assays were performed in triplicate. Pro-inflammatory challenge (RAW264.7 activation) RAW264.7 cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with trypsin-EDTA, without calcium or magnesium, for 3 min at 37 oC to detach the cells from the culture flask. Cells were resuspended in DMEM and incubated in
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Hernndez et al.
24-well tissue-culture plates at a concentration of 105 cells/mL for 24 h in a humidified incubator at 37 oC, with 5% CO2. Growth medium was removed and cell monolayers were stimulated with 10 ng/mL LPS and 2 U/mL recombinant murine IFN. To test the effects of the H. longipes extract, concentrations (1-200 g/mL) were dissolved in DMEM medium and added to wells 10 min before treatment with LPS + IFN. Cell-free supernatants were harvested after 1 h incubation and kept at -70 oC until use to assay TNF and NO2 levels. Cytokines (TNF) determination TNF production by macrophages was determined by the L929 cell lysing assay as described GomezFlores et al. (1997) in supernatants of cell cultures in the presence of actinomycin D 1 g/mL. Recombinant TNF was used as standard (specific activity, 107 U/mg). Nitrite determination NO is rapidly oxidized to nitrite in culture medium, and nitrite (NO2) concentration is an indicator of NO production. Cell-free culture supernatants were mixed with equal amounts of Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylenediamide in 2.5% phosphoric acid) in 96-well ELISA plates. Samples were incubated at room temperature for 10 min and the absorbance was measured at 540 nm with the use of a microplate reader. Nitrite concentrations were calculated using a sodium nitrite standard curve (Jun et al., 1994). Statistical analysis Effects of H. longipes extract on TNF and NO production represent the means SEM of three determinations. Analysis of variance followed by Dunnets test for specific comparisons were performed. Probability values less than 0.05 (p<0.05) were considered significant. Regression analysis was used to calculate the effective inhibitory concentration 50 (IC50), defined as the concentration necessary to produce a 50% of inhibition on TNF and NO on in vitro endotoxic shock. RESULTS AND DISCUSSION Few studies have demonstrated the pharmacological activity of ethanolic extracts of H. longipes. In this paper, when macrophages RAW 264.7 were stimulated with LPS and IFN, the production of TNF and NO was triggered. However, Fig. 1 shows
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the inhibition of TNF production by the extract in this cell line with an IC50 of 223.0 g/mL. This activity is very important for the anti-inflammatory actions of this extract. The action is in correspondence with the effects of other natural inhibitors on this cytokine in the inflammatory process (Manthey et al., 1999). The NO production (equivalent to levels of NO2) was also reduced when stimulated cells were pre-incubated with the H. longipes extract (IC50= 136.9 g/mL) as shown in Fig. 2. The inhibitory effects of the H. longipes ethanolic root extract may be explained, at least in part, by the presence of alkamides (mainly affinin) in the root extract. This family of chemical compounds has been studied as cytokine and NO inhibitors in in vitro models of activated macrophages (Murakami et al., 2000). Experiments using extracts from Echinacea angustifolia and alkylamide derivatives have reported anti-inflammatory (Tragni et al., 1985; Tubaro et al., 1987; Raso et al., 2002) or immunosuppression (Matthias et al., 2007) activities including the inhibition of TNF and NO in macrophages. Macrophages are important cells of the immune defense system because they participate in the processing and presentation of antigens to T cells, the phagocytosis of foreign particles, and killing of microorganisms. During these process, high levels of NO and reactive oxygen intermediates are generated contributing to intracellular destructive mechanisms, and can be activated some metabolic pathway to production of cytokines such as TNF and IL-1, eicosanoids like prostaglandins, leukotrienes, and other mediators of inflammatory response (Macmicking et al., 1997). On the other hand, activated macrophages produce mediators of cytotoxicity (such as NO and TNF), which protect the host against the infections development. One important mediator of the inflammatory process is NO of which excessive or inappropriate production can lead to tissue damage through peroxynitrites formation in a reaction that takes place between NO and the superoxide anions. It is of interest to note that the inhibitory action observed in macrophages activated with LPS and IFN, is directly related to the effect on the induction of the enzyme inducible NO synthase in these cells (PaulClark et al., 2001). However, TNF is one the pro-inflammatory cytokines that are primarily released by activated monocytes and macrophages (Vilcek and Lee, 1991). The results shown in this study would also explain at
Hernndez et al.
Figure 1. Effect of an ethanolic root extract of H. longipes on tumor necrosis factor (TNF) production in activated murine macrophages.
600 500 TNF (pg/mL) 400 300 200 100 0 Control Hl-250 Hl-500 L+ I L+ I + Hl-10 L+ I + Hl-1 L+ I + Hl-250 L+ I + Hl-100 L+ I + Hl-500 L+ I + Dexa
RAW264.7 cells (105 cells/mL) were activated with LPS (L, 10 ng/mL) and IFN (I, 2 U/mL) and treated with H. longipes (Hl) 1, 10, 100, 250, 500 g/mL. Dexamethasone (DEXA, 1mM) was used as the reference drug. Each group represents the mean S.E.M of three independent experiments. *p< 0.05 statistical significance compared with the group treated only with LPS plus IFN.
Figure 2. Effect of an ethanolic root extract of H. longipes on nitric oxide (NO) production in activated murine macrophages.
30 25 20 NO2 ( M) 15 10 5 0
L+I+Hl-500 L+I+H l-10 HL-100 HL-250 Hl-10 HL-500 L+I+Hl-100 L+I+H l-250 L+I+H l-1 L+I
* *
Control
*
LNMMA
-5
RAW264.7 cells (105 cells/mL) were activated with LPS (L, 10 ng/mL) and IFN (I, 2 U/mL) and treated with H. longipes (Hl) 1, 10, 100, 250, 500 g/mL. L-NMMA 1 mM was used as the reference drug. Each group represents the mean S.E.M of three independent experiments. *p< 0.05 statistical significance compared with the group treated only with LPS plus IFN.
least partially, the analgesic effect reported for H. longipes, which inhibits the abdominal writhing induced by the intraperitoneal administration of acetic acid in mice (Ogura et al., 1982) where these pro-inflammatory mediators play an important role. CONCLUSION The ethanolic extract of H. longipes shows antinociceptive and anti-inflammatory activities in vitro.
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We report that here they may be mediated, at least in part, by the inhibition of pro-inflammatory cytokines (such as TNF) and free radicals (such as NO). These results represent the first contribution towards the full elucidation of the pharmacological activities exhibited by H. longipes extracts, which are rich in alkamides.
Hernndez et al.
ACKNOWLEDGEMENTS Specially thanks to Prof. Enrique CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato, Mxico. Ramrez,
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Determinacin de plaguicidas organoclorados y organofosforados en tomates de mercados de cadena en las ciudades de Pereira y Armenia, Colombia
[Organophosphorus and organochlorine pesticides determination in tomatoes from Armenia and Pereira cities` local market: Colombia]
Jorge A. GUTIRREZ*, Alfonso LONDOO Facultad de Ciencias de la Salud, Grupo de Investigacin Plaguicidas y Salud, Universidad del Quindo, Colombia (CP057).
Abstract
Tomatoes from Armenia and Pereira cities` local market were analyzed. Using Liquid liquid extraction method (LLE) have been found: 3 organophosphorus and 5 organochlorine by gas chromatography; from a standard organophosphorus and organochlorine pesticides mix, used in its calibration curve. This analysis showed the highest concentration for Sulfotep and Forato organophosphorus pesticides. In spite of, any of these pesticides detected by this method overcame the maximum limits allowed by legislation. In other way we have been found higher concentrations in organics tomatoes were it wasnt expected Keywords: Pesticides; Organochlorine; Organophosphorous; Tomato; Gas chromatography; Liquid-liquid extraction.
Resumen
Se analizaron tomates obtenidos en mercados de cadena en las ciudades de Armenia y Pereira y se determin por medio de la extraccin liquido-liquido por lotes un total de 3 plaguicidas organofosforados y 5 organoclorados, donde el Sulfotep y el Forato fueron los que presentaron mayores concentraciones, a pesar de ello ninguno de los analitos superaron los lmites mximos permitidos por legislacin, adems se encontr inesperadamente altas concentraciones en tomates orgnicos donde se esperaba ausencia de este tipo de compuestos. Palabras Clave: Plaguicidas, Organoclorados, Organofosforados, Tomate, Cromatografa gaseosa; Extraccin lquido-lquido. List of Abbreviations LLE: liquid liquid extraction method; BHC: hexaclorociclohexano; DDE: diclorodifeniletano; DDD: diclorodifenildicloroetano; Dimetoato: ditiofosfato de O,O-dimetilo y de metilcarbamoilmetilo. DDT: diclorodifeniltricloroetano;
Recibido | Received: April 21, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 30, 2009 Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by Universidad del Quindio. This article must be cited as: Jorge A. Gutirrez, Alfonso Londoo. 2009. Determinacin de plaguicidas organoclorados y organofosforados en tomates de mercados de cadena en las ciudades de Pereira y Armenia, Colombia. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):165 171.{EPub 10 April 2009}.
*Contactos | Contacts: jorgeandresgut@gmail.com ; alfonsolo@uniquindio.edu.co; Tel (+57)6-7460100.
Gutirrez y Londoo
Plaguicidas en tomates de mercados de cadena colombianos
MATERIALES Y MTODOS INTRODUCCIN El uso de plaguicidas es una de las prcticas que ms ha contribuido al incremento de la produccin agrcola en las ltimas dcadas, y que junto al empleo de fertilizantes sintticos, sistemas de riego, compuestos orgnico-sintticos, son en la actualidad indispensables para satisfacer la creciente demanda de alimentos de la produccin mundial (Ministerio de la Proteccin Social, 2003). Con el uso de plaguicidas, la produccin de alimentos ha aumentado en un 50%, pero infortunadamente forjando riesgos que se manifiestan en nuevas patologas, resultantes de la exposicin a estos txicos (Idrovo, 1999). En Colombia existe una alta dependencia hacia los plaguicidas por ser un pas principalmente agrcola, ya que estos favorecen el rendimiento de las cosechas, pero su uso desmesurado ha generado consecuencias que no solo afectan los ecosistemas sino tambin a agricultores y consumidores; esto gracias a su residualidad en los alimentos; como en el tomate, uno de vegetales en el cual se almacenan ms contaminantes junto con las papas, espinacas y lechugas (Castro et al., 2005). La presencia de plaguicidas organofosforados en diferentes tipos de alimentos es indiscutible y ha sido demostrada previamente en muestras de frutas y hortalizas (Barber, 1989). El tomate, objeto de este estudio, es tradicionalmente uno de los cultivos con mayor control qumico de plagas. Teniendo en cuenta la estricta normatividad existente, que limita el contenido de plaguicidas en los alimentos (Tabla 1), se han venido desarrollando tecnologas como la cromatografa de gases para el anlisis cualitativo y cuantitativo de este tipo de analitos; sta representa un mtodo eficaz de separacin, identificacin y control de estos txicos en diferentes matices de estudio (Nez, 1986, Cabras et al., 1998). La presente investigacin se basa en la determinacin de residuos de plaguicidas organofosforados y organoclorados en tomates obtenidos de mercados de cadena de la ciudad de Armenia Larga vida contrastados con tomates de la ciudad de Pereira comercializados como orgnicos. Material Vegetal Frutos de Licopersicon sculentum L. (tomate), familia Solanaceae, procedentes de mercados de cadena de las ciudades Armenia y Pereira. Para este estudio se seleccionaron dos variedades: la larga vida de mercados de cadena en la ciudad de Armenia (Colombia) y consisten en una variedad hibrida de alto consumo. Las muestras de tomates orgnicos se obtuvieron de mercados de cadena en la ciudad de Pereira (Colombia). Se obtuvieron 10 kg de tomates en estado de madurez comercial de consumo (madurez intermedia) en cada uno de los cuatro mercados seleccionados. Caracterizacin de la materia prima Se realizo un anlisis fisicoqumico (peso, pH, grados brix (Bx), actividad de agua (aw), % humedad, color) de las muestras. Reactivos Los estndares de plaguicidas organoclorados y organofosforados: Sulfotep (ditiopirofosfato de O,O,O,O-tetraetilo cido tiodifosfrico); Forato (ditiofosfato de o,o-dietilo y etiltiometilo); -BHC, BHC, -BHC, -BHC (ismeros de hexaclorociclohexano); Dimetoato (ditiofosfato de O,O-dimetilo y de metilcarbamoilmetilo); heptacloro (1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7metanoindeno); heptacloro epxido (1,4,5,6,7,8,8aheptacloro-2,3epoxi-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metanoindeno); Disulfoton (O,O-dietil S-2-etiltioetil fosforoditioato); Aldrin (1,2,3,4,10,10-hexacloro1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-exo-1,4-endo-5,8-dimetanonaftaleno); Endosulfan I, Endosulfan II, Endosulfan sulfato (ismeros de: 6,7,8,9,10,10-hexacloro1,5,5a,6,9,9a-hexahidro-6,9-metano-2,4,3-benzodioxatiopeno-3-oxido); 4,4`-DDE (diclorodifeniletano); 4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano); 4,4`-DDD (diclorodifenildicloroetano); Endrin (3,4,5,6,9,9,hexacloro-1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahidro 2,7:3,6-dimetanonaft[2,3-b]oxireno); Endrin aldehdo (3,4,5,6,9,9-hexachloro-1a,2,2a,3,6,6a,7,7a-octahydro2,7:3,6-dimethanonaphth[2,3b]-oxirene, aldehdo) fueron adquiridos a Supelco (Bogota, Colombia). Tolueno, hexano y diclorometano grado HPLC (Fisher Scientific), acetato de etilo grado analtico (Carlo Erba reagents), florisil (Sigma-Aldrich), sulfato de sdio anhidro (Carlo Erba reagents).
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Preparacin de las muestras Procedimiento de extraccin: El proceso de extraccin utilizado es una modificacin del descrito por Murcia (2001). La homogenizacin de las muestras se realiz en Ultraturrax digital modelo IKA T25 y vortex IKA JK MS1. La evaporacin del solvente se llev a cabo en Rotavapor Heidolph Laborota 4003. El fruto se separ en dos matrices: piel (epicarpo) y pulpa (mesocarpo, endocarpo, placenta y semillas) realizando dos cortes transversales con cuchillo convencional y posterior pelado del fruto; el procedimiento completo se muestra en el esquema siguiente:
Figura 1: Procedimiento de extraccin e identificacin de plaguicidas en tomate.
molecular que contienen las matrices en estudio, como son clorofilas, pigmentos, ceras, protenas y carotenos, entre otros. Cromatografa de Gases-ECD La determinacin de los plaguicidas se realiz en un cromatgrafo de gases HP 6890 N dotado con un detector de microcaptura de electrones -ECD, un inyector split/splitless, las temperaturas del inyector y del detector permanecieron a 250 y 300 C respectivamente, columna Supelco Equity-5 (0,25 mm I.D x 0,25 m film x 30 m) 95% polidimetilsiloxano, 5% polidifenilsiloxano. Rampa de temperatura: 110 C (2 min) hasta 163 C (1 min) a 7 C/min, despus a 1 C/min, hasta 180 C (1 min), sube a 5 C/min, hasta 209 C (1 min), luego hasta 225 C(0 min) a 2 C/min. Y por ltimo sube a 7 C/min, hasta 280 C (4 min), como gas de arrastre (fase mvil) se utiliz nitrgeno grado UAP con un flujo de 1,7 mL/min. Para la curva de calibracin se utiliz el mtodo del estndar externo, utilizando soluciones de trabajo de 1,5 partes por billn (ppb); 15; 25,5; 35,5 y 45 ppb. La sensibilidad se determin evaluando el lmite de deteccin (LD) y de cuantificacin (LC) para cada plaguicida (Tabla 1). Estadsticas Se hicieron ensayos por triplicado para cada muestra. Se realiz un anlisis de varianza utilizando el programa Statgraphics plus versin 5.1 estudiando cada uno de los plaguicidas (variables dependientes), respecto a las variables independientes (Matriz trabajada y Tipo de cultivo). Se realiz un diseo factorial con dos factores 2 * 2 con un nivel de significacin de 0,05. La prueba de comparacin utilizada fue el mtodo de la mnima diferencia significativa (LSD). Factores: A: Matriz trabajada: 1. Piel, 2. Pulpa. B: Tipo de cultivo: 1. Cultivo orgnico (Pereira), 2. Cultivo larga vida (Armenia). Modelo matemtico Yijk = + ti + j + (t)ij + Eijk (Ec. 1)
Proceso de Limpieza (Clean up): Teniendo en cuenta las caractersticas de la matriz y de los analitos a determinar, la limpieza para este tipo de compuestos organoclorados y organofosforados, se realiz mediante una columna empacada con sulfato de sodio anhidro para reducir el porcentaje de humedad y florisil para eliminar interferentes de alto peso
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Tabla1: Resultados de los LD y LC determinados por cromatografa de gases y lmites legales de acuerdo a la normativa establecida por el Codex Alimentarius (1996) para tomate. Plaguicida Lmites legales (mg/kg) 0,01 0,01 0,02 0,05 0,05 0,01 0,20 Lmites Analticos LD (mg/kg) LC (mg/kg) 0,00072 0,00079 0,00010 0,00063 0,00248 0,00048 0,00058 0,00082 0,00085 0,00127 0,00067 0,00042 0,00103 0,00068 0,00070 0,00113 2,00000 0,00093 0,00773 0,00079 0,00081 0,00011 0,00063 0,00264 0,00050 0,00059 0,00084 0,00022 0,00128 0,00067 0,0005 0,00104 0,00068 0,00091 0,00116 0,00203 0,00094 0,00809
Aldrin -BHC -BHC -BHC Dimetoato Disulfoton 4,4`-DDD 4,4`-DDE 4,4`-DDT Endosulfan I Endosulfan II Endosulfan sulfato Endrin Endrin aldehido Forato -BHC Heptacloro Heptacloro epoxido Sulfotep
Tabla 2: Resultados de los anlisis por cromatografa de gases de muestras de tomates Larga Vida (valores en ng/mL expresados como Media SEM/SD) Matrices Tomates Larga Vida Piel Pulpa 4,9230 0,0010 2,3560 0,0030 0,6230 0,0002 0,2280 0,0002 0,5570 0,0001 3,0610 0,0010 2,3140 0,0004 20,040 0,0005 18,9200 0,0040 1,0030 0,0002 1,1350 0,0009 0,8700 0,0030 3,1850 0,0010 5,2640 0,0170
Aldrin -BHC -BHC Disulfoton Forato -BHC Heptacloro Sulfotep
Tabla 3: Resultados de los anlisis de cromatografa de gases de muestras de tomates Orgnicos (valores en ng/mL Media SEM/SD). Matrices Tomates Orgnicos Piel Pulpa 3,7450 0,0005 3,1580 0,0003 0,6950 0,0003 0,3780 0,0009 0,2290 0,0004 3,5710 0,0006 3,1780 0,0008 33,9300 0,0010 33,7700 0,006 0,3390 0,0001 0,3000 0,0002 3,3360 0,0005 3,3130 0,0003 38,1700 0,0150 43,510 0,0240
Aldrin -BHC -BHC Disulfoton Forato -BHC Heptacloro Sulfotep
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RESULTADOS Y DISCUSIN El mtodo de extraccin lquido-lquido por lotes result ser una tcnica muy eficiente para plaguicidas en alimentos, siendo ms favorecida en matrices como pieles y cuenta con el aval de la EPA (EPA / USEPA, 1970) y la AOAC. (AOAC, 1990, 1997). Comparacin de de la presencia de plaguicidas en tomates larga vida vs orgnicos Al estudiar la residualidad de plaguicidas en tomate, se esperaban altas concentraciones en los comercializados como Larga Vida. Inesperadamente, se encontraron altas concentraciones tambin en el fruto orgnico donde se esperaba ausencia de residuos debido a que es un alimento certificado, por ello se evaluaron las diferentes matrices en los dos tipos de cultivos. Los tomates orgnicos son productos comercializados en mercados de cadena a un alto costo donde el consumidor espera obtener un vegetal limpio y libre de plaguicidas y a cambio de ello est consumiendo altas concentraciones de fitosanitarios que van a ser retenidos fcilmente en todo el tejido adiposo gracias a su liposolubilidad, pasando por alto y violando todo tipo de legislacin y normatividad. Comparacin de la presencia de plaguicidas en piel y pulpa Al evaluar las muestras de piel y pulpa de los dos tipos de cultivos, se observ que para la mayora de los casos existe ms residualidad en la piel, por lo que se realiz la comparacin entre las matrices (Piel) de los dos tipos de cultivos (Fig. 2). El anlisis estadstico determin una diferencia significativa en la concentracin de Aldrin (p=0,0323; para el anlisis de las matrices donde la mayor concentracin se encontr en la piel). Con respecto al tipo de cultivo, se hall diferencia significativa en Sulfotep (p= 0,0350; mayor concentracin en cultivo orgnico) y Aldrin (p=0,009; mayor concentracin en cultivo Larga vida), en todos los casos para un nivel de significancia de 0,05. En piel los plaguicidas Sulfotep y Forato (compuestos organofosforados) son los ms representativos, de igual manera se encontr la presencia de plaguicidas organoclorados de alta toxicidad prohibidos por la legislacin actualmente vigente, como el Heptacloro y Aldrin, que generan
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grandes desequilibrios ecolgicos bioacumulandose y biomagnificandose.

Figura 2: Comparacin de plaguicidas encontrados en la piel de tomates Orgnicos y Larga Vida obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Armenia y Pereira (ELL extraccin lquidolquido).
En las Figs. 3 y 4 se puede observar que para cada tipo de cultivo la concentracin de plaguicidas no difiere mucho entre piel y pulpa, pero a excepcin del Sulfotep estn todos en mayor concentracin en la piel, debido a la poca disponibilidad de agua en ella, lo que evita las emulsiones formadas por diferencias de polaridades entre el agua del fruto y los solventes orgnicos gracias a la agitacin donde se pierde solvente y algunos analitos. Adems de ello, la piel funciona como un escudo de proteccin que retiene los fitosanitarios antes de llegar a la pulpa del fruto; a pesar de ello se notan concentraciones muy altas de Forato en ambos cultivos, evidenciando que este plaguicida es aplicado de forma indiscriminada en los tipos de cultivos estudiados. Comparando las pieles evaluadas entre los dos cultivos, del cultivo orgnico del cual esperaramos los mejores resultados (ausencia de plaguicidas), segn el Reglamento de Productos Agropecuarios Ecolgicos del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de la Repblica de Colombia (2006), se obtuvieron concentraciones por encima de 0,035 ppm indicando una alta residualidad de plaguicidas organofosforados. Se detectaron ms residuos de plaguicidas, un total de 8, entre los cuales se hallan: Sulfotep, Forato, alfa-BHC, gamma-BHC, Heptacloro, Disulfoton, sigma-BHC y Aldrin. De estos, el Aldrin y el Heptacloro son plaguicidas organoclorados prohibidos en la Legislacin (ICA, 1987; 1988) y Presidencia de la Repblica (1988), teniendo en cuenta que todos son de categoras toxicolgicas I y II.
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Gutirrez y Londoo
Figura 3: Tomates Larga Vida obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Armenia.
presencia cuantificable de plaguicidas ilegales como Aldrin y Heptacloro, lo que genera un riesgo toxicolgico real en la poblacin tanto adulta como infantil. Ms alarmante es la elevada cantidad de plaguicidas en las variedades vendidas como orgnicas donde el Forato y el Sulfotep son los ms representativos, con concentraciones por encima de 0,035 y 0,03 ppm y algunos prohibidos como Aldrin y Heptacloro. Esto constituye una prctica ilegal, pasando por alto cualquier tipo de normativa y engaando irresponsablemente a la poblacin en general. Ante estos resultados se impone la gran urgencia de implementar ms programas de vigilancia y monitoreo de residuos de plaguicidas en alimentos en Colombia. AGRADECIMIENTOS Al Laboratorio Plaguicidas y Salud, la Qumica Diana Blach Vargas y al Laboratorio de Investigaciones en Postcosecha (LIP). REFERENCIAS
AOAC. 1990. Association of official Analytical Chemist. Arlington. Official Methods of Analysis. AOAC 985.22, pp. 282-284. AOAC. 1997. Association of official Analytical Chemist. Official Methods of Analysis. 16 th Edicin, 3era revisin. Washington, DC. Barber C. 1989. Plaguicidas agrcolas. Editorial Omega, Barcelona, Espaa, pp. 144-170. Cabras P, Angioni A, Garau V. 1998. Determination of buprofezin, pyridaben, and tebufenpyrad residues by Gas Chromatography-Mass Selective Detection in Clementine citrus. J Agric Food Chem 46:4255-4259. Castro PA, Ramos JP. 2005. Determinacin de residuos de plaguicidas organofosforados en muestras de tomate de la ciudad de Bogot (Universidad de los Andes, Bogot, Colombia), Disponible en: http://www.guaica.uniandes.edu.co:5050/dspace/bitstre am/1992/661/1/mi_1106.pdf. (Consultada el 10 de agosto de 2007). Codex Alimentarius. 1996. Programa Conjunto FAO/OMS sobre normas alimentaras. 2 ed. Roma: Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, Organizacin Mundial de la Salud. Roma. 473 p. Disponible en (www.codexalimentarius.net). (Consultada el 6 de agosto de 2007). EPA / USEPA. 1970. Environmental Protection Agency. Federal government of the United States. Disponible en: (www.epa.gov/oppbead1/methods/index.htm). (Consultada el 7 de agosto de 2007).
Figura 4: Tomates Orgnicos obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Pereira.
En los tomates Larga Vida la mayor concentracin fue de Forato con 0,02 ppm junto con el Sulfotep y Aldrin por encima de 0,0045 ppm, estas son concentraciones altas teniendo en cuenta que son plaguicidas de alta toxicidad y son muchos los riesgos que se corren al ingerir este tipo de compuestos. CONCLUSIONES Se identificaron y cuantificaron un total de 8 plaguicidas entre organoclorados y organofosforados, unos a nivel de trazas y otros con altas concentraciones tanto en piel como en pulpa, tanto para los tomates Larga Vida, como para los Orgnicos. El tomate, es un alimento bsico consumido por la poblacin en la dieta alimentara diaria. Nuestros resultados no solo demuestran la presencia de altas concentraciones de plaguicidas permitidos como Forato, y Sulfotep (indicando que los cultivos se estn fumigando de manera desmesurada), sino tambin la
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Gutirrez y Londoo
ICA. 1987. Resolucin 366. Cancelan las Licencias de Venta de los insecticidas Organoclorados que contengan los ingredientes activos: Aldrin y Heptacloro en su composicin. Disponible en: (www.ica.gov.co). (Consultada el 28 de octubre de 2007). ICA. 1988. Resoluciones 531, 540, 723, 724 y 874. Cancelan las Licencias de Venta de los insecticidas Organoclorados que contengan los ingredientes activos: Aldrin, Heptacloro, Dieldrin, Clordano y Canfecloro en su composicin. Disponible en: (www.ica.gov.co). (Consultada el 28 de octubre de 2007). Idrovo AJ. 1999. Intoxicaciones masivas con plaguicidas en Colombia. Rev Biomdica 19:67-76. Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. 2006. Reglamento para la produccin primaria procesamiento, empacado, etiquetado, almacenamiento, certificacin, importacin y comercializacin de Productos Agropecuarios Ecolgicos. pp. 1-48.
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Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum leaf essential oil
[Tamizaje fitoqumico y propiedad anticonvulsivante del aceite esencial de hojas de Ocimum basilicum]
Juliana S OLIVEIRAa,1, Lvia A. PORTOa,1, Charles S. ESTEVAMa, Rosana S. SIQUEIRAa, Pricles B. ALVESb, Edenilson S. NICULAUb, Arie F. BLANKc, Reinaldo N. ALMEIDAd, Murilo MARCHIOROa, Lucindo J. QUINTANS-JNIORa* Departamento de Fisiologia, bDepartamento de Qumica, cDepartamento de Agronomia. Universidade Federal de Sergipe. Campus Universitrio Prof. Alosio de Campos CEP: 49100-000, So Cristvo, SE, Brazil. d Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Universidade Federal da Paraba (LTF/UFPB), Cx. Postal 5009, CEP: 58051-970, Paraba, PB, Brazil. 1 These authors contributed equally to the present work.
a
Abstract
Ocimum basilicum (Lamiaceae) and other species of the same genus are used as medicines for the treatment of central nervous system (CNS) diseases. In this report, we have investigated the possible CNS depressant and anticonvulsant effects of Ocimum basilicum (access Maria Bonita) leaf essential oil (EO) in different experimental models. GC-MS and GC-FID analysis of the essential oil resulted in the identification of 7 compounds constituting 98.8% of the total oil. 1.8-cineole, linalool, and geraniol were the principal components, comprising 92.9% of the oil. EO, at all doses, showed depressant CNS activity as revealed in the general pharmacological screening: decrease of spontaneous activity, ptosis, ataxia, and sedation. Additionally, all doses of EO induced a significant increase of sleeping time (p < 0.05) and decrease in the latency to sleep (p<0.01). EO also increased the latency for development of convulsions in pentylenetetrazol (PTZ) and picrotoxin tests (p < 0.05). For PTZ, the effects of EO were reversed by flumazenil. EO did not interfere with the convulsions induced by strychnine (p>0.05). Our data suggests that EO possesses CNS depressant and anticonvulsant properties which could be mediated by an interaction with central GABAergic receptors. Keywords: Ocimum basilicum; CNS depressant; Anticonvulsant; Pentylenetetrazole; Picrotoxin.
Resumen
Ocimum basilicum (Lamiaceae) y otras especies del mismo gnero son usadas como medicamentos en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC). En este reporte, hemos investigado los posibles efectos anticonvulsivantes y depresivos del SNC del aceite esencial (EO) de las hojas de Ocimum basilicum (conocida como Maria Bonita) en diferentes modelos experimentales. Los anlisis por GC-MS y GC-FID del aceite esencial permitieron la identificacin de 7 compuestos constituyendo el 98.8% del aceite total. Los principales componentes fueron 1.8-cineol, linalol y geraniol que comprendieron el 92.9% del aceite. EO, a todas las dosis, mostr actividad depresora del SNC revelado en el tamizaje farmacolgico general: decrecimiento de la actividad espontnea, ptosis, ataxia y sedacin. Adems, todas las dosis de EO indujeron un incremento significativo del tiempo de sueo (p<0.05) y disminuyeron la latencia de sueo (p<0.01). EO tambin increment la latencia para el desarrollo de convulsiones en las pruebas de pentilenetetrazol (PTZ) y picrotoxina (p<0.05). Para PTZ, los efectos de EO fueron revertidos por flumazenil. EO no interfiri con las convulsiones inducidas por estricnina (p>0.05). Nuestros datos sugieren que EO posee propiedades anticonvulsivantes y depresoras del SNC lo que podra estar mediado por una interaccin con los receptores GABArgicos centrales. Palabras Clave: Ocimum basilicum; Depresores del SNC; Anticonvulsivante; Pentilenetetrazol; Picrotoxina.
Recibido | Received: February 3, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: April 25, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 29, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by National Council of Technological and Scientific Development (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico CNPq, Brazil) and the Research Supporting Foundation of State of Sergipe (Fundao de Amparo Pesquisa e Inovao Tecnolgica do Estado de Sergipe/FAPITEC-SE). Juliana Santos de Oliveira and Lvia Amorim Porto have scholarships from CNPq-UFS and Murilo Marchioro has a research scholarship from CNPq. This article must be cited as: Juliana S Oliveira, Lvia A. Porto, Charles S. Estevam, Rosana S. Siqueira, Pricles B. Alves, Edenilson S. Niculau, Arie F. Blank, Reinaldo N. Almeida, Murilo Marchioro, Lucindo J. Quintans-Jnior. 2009. Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum leaf essential oil. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):195 202. {EPub April 29, 2009}.
*Contactos | Contacts: L.J. Quintans-Jnior, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, 49.000-000, So Cristvo-SE, Brazil, Tel/Fax: 55-79-2105-6645; +55-79-2105-6474; E-mail address: lucindo_jr@yahoo.com.br, lucindo@pq.cnpq.br
Oliveira et al.
Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum
INTRODUCTION Epilepsy continues to be a neurological disorder awaiting safer drugs with improved anticonvulsant and anti-epileptogenic effectiveness, as currently available drugs fail to provide adequate control of epileptic seizures in about one-third of patients and do not prevent progressive epileptogenic changes (Jeub et al., 2002). Traditional systems of medicine are popular in developing countries, and up to 80% of the population relies on traditional medicines or folk remedies for primary health care needs (Akerele, 1988). A great number of scientists and organizations turn their attention to traditional therapies in order to find and conserve important resources (Akerele, 1990). However, medicinal plants have been an important source of new drugs with biological activity (Almeida et al., 2005; Quintans-Jnior et al., 2008). Several Ocimum species (Lamiaceae) are used to treat central nervous system (CNS) disorders in various parts of the world and its antidepressive activity is frequently reported (Corra, 1984). Leaves from Ocimum species release a pleasing odor when squashed between the fingers and could be used as a culinary condiment (Mkinen and Paakkonen, 1999) and for insect control (Holm, 1999). Brazilian Tropical Atlantic Forest inhabitants use a decoction of Ocimum gratissimum L. roots as a sedative for children (Di Stasi et al., 2002). Sedative and anticonvulsant activities were experimentally detected in Ocimum tenuiflorum (Ocimum sanctum) (Prez de Alejo et al., 1996). The genus Ocimum is included in the Lamiaceae family and is distributed worldwide from the tropical and subtropical regions of Asia, Africa, and Central and South America (Suppakul, et al., 2003). This genus is characterized by a great variability in its morphology and chemotypes (Lawrence, 1988). The ease of its cross-pollination contributes to a myriad of subspecies, varieties, and forms (Guenther, 1975). The reason for this complexity stems from the fact that botanists have assigned several designations to the same varieties and, in some instances, have confused some varieties with forms of other species. Different chemotypes have been reported for Ocimum basilicum (Grayer et al., 1996), Ocimum canum, and Ocimum gratissimum (Martins et al., 1999). Two morphological varieties of Ocimum gratissimum (gratissimum var. and macrophyllum var.) were found to have their volatile oil constituents based into six groups, which were aggregated into three chemotypes (eugenol,
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thymol, and geraniol) according to genetic markers and volatile oil constituents (Vieira et al., 2001). According to Mazutti et al. (2006), the volatile oil constituents of O. basilicum were: -cadinol (10.2%), estragole (22.6%), and linalool (47.3%). The aim of this work was to perform phytochemical screening of the essential oil of Ocimum basilicum (access Maria Bonita) and to investigate its possible anticonvulsant effects in mice. MATERIALS AND METHODS Animals Male Swiss mice (30-35 g), with 2-3 months of age, were used throughout this study. The animals were randomly housed in appropriate cages at 252 oC on a 12 h light/dark cycle (lights on 06:00-18:00) with free access to food (Purina) and water. They were used in groups of 10 animals each. All experiments were carried out between 9.00 h and 16.00 h in a quiet room. Experimental protocols and procedures were approved by the Universidade Federal de Sergipe Animal Care and Use Committee (CEPA/UFS N010/07). Plant material and essential oil (EO) extraction Leaves were collected from the cultivation of the O. basilicum access Maria Bonita obtained at the Research Station "Campus Rural da UFS" of the Universidade Federal de Sergipe, Brazil. O. basilicum access Maria Bonita was derived from the accession PI 197442 of the Germplasm Bank North Central Regional PI Station, USA. It's a basil cultivar with a rounded canopy, rose petals and purple sepals and is indicated for brazilian northeast region (Blank et al., 2008). The leaves of O. basilicum were dried in an oven with air renewal and circulation (model MA037/18) at 40 C until complete dehydration has been achieved. The essential oil was obtained by hydrodistillation in a Clevenger-type apparatus using 100 g of dried leaves. The oil obtained was dried over anhydrous sodium sulphate, producing yields of 2.34% (v/w). Gas Chromatography Mass Spectrometry Oil sample analysis was performed on a Shimadzu QP5050A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) system comprising a AOC -20i autosampler and gas chromatograph interfaced to a mass spectrometer (GCMS) instrument employing the following conditions: column J&W Scientific DB-5MS fused silica capillary
Oliveira et al.
column (30 cm x 0.25 mm i.d, 0.25 m coating thickness, composed of 5% phenylmethylpolysiloxane), operating in electron impact mode at 70 eV; helium (99.99%) was used as carrier gas at a constant flow of 1.2 mL/min and an injection volume of 0.5 L was employed (split ratio of 1:83) injector temperature 250 C; ion-source temperature 280 C. The oven temperature was programmed from 50 C (isothermal for 2 min), with an increase of 4 C/min., to 200 C, then 10 C/min to 300 C, ending with a 10 min iso-thermal at 300 C. Mass spectra were taken at 70 eV; a scan interval of 0.5 s and fragments from 40 to 550 Da. Gas Chromatography (GC-FID) Quantitative analysis of the chemical constituents was performed by flame ionization gas chromatography (FID), using a Shimadzu GC-17A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) equipment, under the following operational conditions: capillary ZB-5MS column (5% dimethylpolysiloxane) fused silica capillary column (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 m coating thickness) from Phenomenex (Torrance, CA, USA), under the same conditions GC-MS. Quantification of each constituent was estimated by area normalization (%). Compounds concentrations were calculated from the GC peak areas and they were arranged in order of GC elution. Identification of essential oil constituents Identification of individual components of the essential oil was performed by computerized matching of the acquired mass spectra with those stored in NIST21 and NIST107 mass spectral library of the GCMS data system. Retention indices (RI) for all compounds were determined according to the Van den Dool and Kratz (1963) for each constituent as previously described (Adams, 2007). Drugs Diazepam (DZP), Pentylenetetrazole (PTZ), picrotoxin (PIC), phenytoin (PHE), Strychnine (STR), polyoxyethylene-sorbitan monolated (Tween 80) and cremophor was purchased from Sigma (USA), Diazepam (DZP), Flumazenil (FLU) from Roche (Brazil) and sodium thiopental from Cristlia (Brasil). Agents were injected intraperitoneally (ip) at a dose volume of 0.1 mL/10 g. Behavioural effects The behavioural screening of the mice was performed following the parameters described in Almeida
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et al. (1999) and animals were observed at 0.5, 1, and 2 h after administration of EO (100, 200 and 400 mg/kg, ip). Thiopental-induced hypnosis Sodium thiopental at a hypnotic dose of 50 mg/kg i.p. was injected into four groups (n= 8) of mice 30 min after pretreatment with saline/tween-80 (vehicle), EO (10, 50, 100 and 200 mg/kg, ip) and DZP (3 mg/kg, ip). The latency (the interval between the injection of sodium thiopental and the loss of the righting reflex) and the duration of sleeping (the interval between loss and recovery of the righting reflex) was recorded (Elisabetsky et al., 1995). PTZ- and PIC-induced convulsion A modified method from Vellucci and Webster (1984) was used to assess the anticonvulsant effect of the EO. Mice were kept individually in transparent mice cages (25 cm 15cm 15cm) for 30 min to acclimatize to their new environment before the beggining of the experiments. Seizures were induced with PTZ (60 mg/kg, ip) or PIC (8 mg/kg, ip) and the animals were observed for a period of 15 or 20 min., respectively (Oliveira et al., 2001; Ngo Bum et al., 2001). The onset of tonic-clonic convulsion and the number of animals convulsing or not convulsing within the observation period were recorded. Experiments were repeated following the pretreatment of animals with either (EO 100, 200 or 400 mg/kg), DZP (3 mg/kg, ip) or control vehicle thirty minutes prior to the administration of one of the convulsant agents. The ability of the EO to prevent or delay the onset of tonic and tonic-clonic convulsions was taken as an indication of anticonvulsant activity. STR-induced convulsion This method has been described previously (Lehmann et al., 1988). In brief, strychnine (STR) seizures followed by death were induced in male mice by the ip injection of 3 mg/kg of the STR nitrate. The treatment of the EO was similar to those used in the PTZ- and PIC-tests. A protective effect of the EO (100, 200 or 400 mg/kg) given (ip) 0.5 h prior to STR (3 mg/kg, ip) was recorded and compared to the one of 30 mg/kg PHE and with the control group (vehicle). The number of animals, which survived more than 10 min served as criterion of protection. The time to onset of death was recorded in non-protected mice.
Oliveira et al.
Statistical analysis The data on the thiopental-induced hypnosis and on the convulsion experiments (PTZ, PIC and STR) were expressed as the mean S.EM. The differences of the means among the groups were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Tukey multiple comparison test (thiopental-induced hypnosis) or the Dunnetts t test (for the convulsion experiments). The incidence (%) of clonic or tonicclonic seizures as well as the mortality were evaluated by the Fisher`s Exact Test. Differences were considered to be statistically significant when p<0.05. RESULTS Phytochemical screening GC-MS and GC-FID analysis of the essential oil resulted in the identification of 7 compounds, constituting 98.8% of the total oil. 1,8-cineole, linalool, and geraniol were the principal components, comprising 92.9% of the oil (Table 1). This result is similarl to Lee et al. (2005). Behavioral effects Animals treated with EO, at all doses, showed signs of CNS depressant activity. They decreased in spontaneous activity and to the response to touch; they also showed palpebral ptosis, ataxia, and sedation. These effects were observed from thirty minutes to two hours after the treatment.
Thiopental-induced hypnosis One way ANOVA revealed differences between the experimental groups for the onset of sleeping (p<0.001) and sleeping duration (p<0.001). EO, at the doses of 10, 50, 100, or 200 mg/kg consistently decreased the latency for the onset of sleeping (p<0.01; p<0.001) (Fig. 1A) and, at the same doses, increased the sleeping time induced by sodium thiopental (10, 50, 100, and 200 mg/kg; p<0.001) (Fig. 1B). The reference drug, diazepam, produced similar results for the onset of sleeping (p<0.001) and sleeping duration (p<0.001).
Table 1. Chemical composition of the essential oil of Ocimum basilicum TR (min) 8.458 10.358 12.908 16.383 18.382 22.900 24.750 31.358 Total Compound sabinene 1,8-Cineole linalool unknown geraniol linalool isobutanoate - trans- bergamotene epi--cadinol (%) 0.89 7.90 72.14 0.68 12.95 2.30 1.21 0.80 98.87 RRIa 974 1030 1099 1192 1248 1375 1430 1638 RRIb 975 1031 1096 1252 1375 1434 1640
RT Retention time; RRI relative retention indices a Experimental (Van Den Dool and Kratz 1963) b As compared with those reported by Adams (2007)
Figure 1. Effect of EO on thiopental-induced hypnosis in mice. The parameters evaluated were the onset of sleeping (A) and duration of sleeping (B). A
10.0
Duration of sleeping (min) 150 *** 100 *** 50 *** *** ***
Onset of sleeping (min)
7.5 ** 5.0 *** 2.5 0.0 *** *** ***
0
Vehicle 50 100 200 400 DZP 3 mg/kg
Vehicle 50
100
200
400
DZP 3 mg/kg
EO (mg/kg)
EO (mg/kg)
Values are mean SEM of 8 mice, ** p < 0.01, *** p < 0.001, as compared to vehicle (control), one-way ANOVA followed by Tukeys test.
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Oliveira et al.
Effect of EO on PTZ- and PIC-induced convulsion One way ANOVA revealed differences between the experimental groups for the onset of convulsions induced by pentilenotetrazole (p<0.0001) (Table 2) and picrotoxin (p<0.0001) (Table 3). Diazepam (p<0.01) and EO, at the doses of 200 and 400 mg/kg (p<0.01), increased the latencies for the onset of the tonic-clonic convulsions induced by PTZ. The percentage of animals that convulsed was decreased by diazepam (p< 0.01) and by EO at the doses of 200 (p<0.05) and 400 mg/kg (p<0.01). The number of animal deaths was also decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the three doses tested (100 mg/kg and 200 mg/kg, p<0.05; 400 mg/kg, p<0.01). The effects of diazepam and EO (200 and 400 mg/kg), for the three parameters, were reversed by flumazenil 10 mg/kg (Table 2).
Diazepam (p<0.01) and EO, at the doses of 200 (p<0.01) and 400 mg/kg (p<0.01) increased the latencies for the onset of the tonic-clonic convulsions induced by PIC. The percentage of animals that convulsed was decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the doses of 200 (p< 0.05) and 400 mg/kg (p<0.01). And finally, the number of animal deaths was also decreased by diazepam (p<0.01) and by EO at the doses of 200 and 400 mg/kg (p<0.01). Effect of EO on STR-induced convulsion One way ANOVA revealed differences between the experimental groups for the onset of convulsions induced by strychnine (p<0.0001). Phenytoin increased the latency for the onset of convulsions (p<0.01), and decreased the percentage of animals that convulsed (p < 0.01) and the number of animal deaths (p<0.05). These parameters were not changed by EO in any of the doses tested (p>0.05) (Table 4).
Table 2. Effect of EO on convulsions induced by PTZ. Treatment Control DZP EO EO EO DZP + FLU EO + FLU EO + FLU Dose (mg/kg) 3 100 200 400 3 + 10 200 + 10 400 + 10 Latency (s)a 212.0 41.5 835.1 12.9
c
Table 3. Effect of EO on the convulsions induced by PIC Treatment Dose (mg/kg) 3 100 200 400 Latency (s)a 534.0 121.3 1200.0 0.0c 454.0 94.2 781.2 93.4b 1045.3 109.6c % Convulsion 100 0e 100 70d 30e % Death 90 0e 90 30e 20e
% % Convulsion Death 100 10

e
100 0e 70d 50
d
Control DZP EO EO EO
369.0 209.3 421.2 132.8c 459.1 149.7b 341.3 112.8 310.5 87.9 285.4 94.1
90 70
d
60e 100 100 100
40e 90 90 100
n = 10 a Values represent mean S.E.M. b P < 0.05 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control d P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. e P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.
n = 10 a Values represent mean S.E.M. b P < 0.05 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control d P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. e P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.
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Oliveira et al.
Table 4. Effect of EO on the convulsions induced by STR Treatment Dose (mg/kg) 30 100 200 400 Latency (s)a 121.3 12.6 532.1 23.7b 164.2 41.4 203.4 82.9 189.3 78.2 % Convulsion 100 20d 100 100 100 % Death 100 60c 100 100 100
Control PHE EO EO EO
n = 10 a Values represent mean S.E.M. b P < 0.01 (one-way ANOVA and Dunnett`s test), significantly different from control c P < 0.05 (Fisher`s test), significantly different from control. d P < 0.01 (Fisher`s test), significantly different from control.
DISCUSSION Major volatiles detected in this study (Table 1) were different with those of previously published studies in which volatile components were isolated by various organic solvent extractions (Lee et al., 2005; Zhang et al., 2009). However, in our study of essential oil produced from O. basilicum, access Maria Bonita, linalool (72.14% of total quantified volatile compounds), geraniol (12.95%), and 1,8cineole (7.9%) were also determined as major constituents (Hasegawa et al., 1997). This result showed that essential oil produced from O. basilicum, access Maria Bonita, is very rich in linalool. In the present study, the CNS depressant and anticonvulsant activities of Ocimum basilicum leaf essential oil (EO) were investigated in different animal models. Additionally, the chemical composition of the oil was evaluated. Our results demonstrate that the acute administration of EO (200 and 400 mg/kg, i.p.) increases the hypnosis induced by sodium thiopental and prevents the convulsions induced by -PTZ and -PIC, but not by STR. 1,8cineole, linalool, and geraniol were the main components of the essential oil. Mice treated with EO (100, 200, and 400 mg/kg, i.p.) presented behavioral alterations, such as: reduction of spontaneous activity, decrease of response to touch, palpebral ptosis, ataxia, and sedation. These behaviors suggest that the effects of EO are similar to those of known CNS depressant natural products (De Sousa et al., 2006; 2007). The
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general depressant activity of EO was confirmed by the decrease in the latency to sleep and its tendency to increase thiopental-induced sleeping (De Sousa et al., 2006). The PTZ test represents a valid model for human generalized myoclonic convulsions (Malawska, 2003). PTZ induces convulsions in rodents by blocking the Cl- channel of GABAA receptors. It has been reported that GABAergic neurotransmission plays an important role in stress, anxiety (Zwanzger and Rupprecht, 2005), pain (Rode et al., 2005), and epilepsy (Perucca, 2005). In fact, drugs that inhibit convulsions or increase the latency of PTZ-induced convulsions are suggested as having anticonvulsant activity (Haruna, 2000). Benzodiazepines and many barbiturates potentiate the inhibitory action of GABAA receptors, reducing neuronal excitability and increasing the threshold for convulsions (Lscher and Schmidt, 2006). According to Nicoll (2001), picrotoxin, a GABAA-receptor antagonist, produces seizures by blocking the chloride-ion channels linked to GABAAreceptors, thus preventing the entry of chloride ions into the brain and, consequently, inhibitory transmission in the brain (Lscher and Schmidt, 1988). The findings of the present study, therefore, suggest that EO might have inhibited and/or attenuated the PIC-induced convulsions of mice by interfering with GABAergic neurotransmission. In addition, the antagonism of PTZ and its reversion by flumazenil (Table 2), an agonist of GABAA receptors, further supports the hypothesis of an interaction of EO with these receptors. Strychnine causes convulsions by antagonizing the activity of glycine receptors and increasing postsynaptic excitability and ongoing activity in the brain stem and spinal cord (Webb and Lynch, 2007). Since EO did not prevent the convulsions induced by strychnine, an interaction of the extract with glycine receptors is unlikely. According to Quintans-Jnior et al. (2005), linalool, the major monoterpene found in Ocimum basilicum leaf essential oil (Table 1), possesses anticonvulsant properties and Elisabetsky et al. (1995) showed sedative effects. However, Re et al. (2000) showed that linalool had inhibitory properties in acetylcholine (ACh) release and induces a reduction of the ACh-evoked release. Nevertheless, autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE), characterized by partial seizures that occur predominantly during sleep, has been
Oliveira et al.
associated in some families with mutations involving either the or subunit in 42 nicotinic acetylcholine receptors (Meldrum and Rogawski, 2007). Carbamazepine is a noncompetitive inhibitor of nicotinic receptors that blocks acetylcholineevoked currents at concentrations in the therapeutic range (Picard et al., 1999). On the other hand, linalool is a competitive antagonist of NMDA receptors (Elisabetsky et al., 1999; Silva Brum et al., 2001) and blockade of the NMDA subtype of glutamate receptor has been reported to contribute to the antiepileptic effects of felbamate (Deckers et al., 2003). CONCLUSION All together, the data presented in this study suggests that EO extracted from the leaves of Ocimum basilicum, access Maria Bonita, possesses CNS depressant properties and anticonvulsant effects in mice. However, the precise mechanisms involved in these properties are not clear, although our evidence points to an involvement of EO with GABAergic neurotransmission. Nevertheless, further studies will be required for elucidation of the mechanisms involved. Patch-clamping experiments would be highly recommendable. REFERENCES
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Efecto de la administracin oral continuada de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas
[Effect of the continuing oral administration of Boldoa purpurascens Cav. on different physiological variables in rats]
Maykel PREZ MACHN1*, Mara BOFFIL CRDENAS2, Dulce M. GONZLEZ MOSQUERA3, Emilo E. MONTEAGUDO JIMNEZ2, Rayza MNDEZ TRIANA1, Luis E. DAS COSTA2, Freiman BLANCO MACHADO2, Nieve IGLESIAS RODRGUEZ1, Belkis VERDECIA MACHADO2
1
Instituto Superior de Ciencias Mdicas Dr. Serafn Ruiz de Zrate Ruiz. Vicerrectorado de Investigaciones. Carretera a Acueducto y Circunvalacin. Santa Clara. Cuba 2 Unidad de Toxicologa Experimental. Instituto Superior de Ciencias Mdicas de Villa Clara, Cuba. 3 Departamento de Farmacia. Universidad Central Marta Abreu de las Villas. Santa Clara, Cuba.
Abstract
A study was conducted to verify the diuretic effect of the aqueous extract of Boldoa purpurascens Cav. And evaluate the different physiological variables upon continued implementation (14 days). 5 rats were used S / D to check the diuretic effect of the raw material and 40 rats in the same line for the continuous dose evaluation. There was a great diuretic activity of the plant at a dose of 400 mg / kg. During clinical evaluations no abnormalities were observed in the behavior of the animals studied. There were statistical differences in the values of hemoglobin, hematocrit, glucose, sodium and potassium, being highly significant in the three last parameters. The administration of the plant presents diuretic effect to the dose studied, its continued administration decreases significantly Hb values and hematocrit, affecting mostly potassium homeostasis and decreases the glucose at 14 days. Keywords: Boldoa purpurascens; Diuretics; Herbal medicine; Sprague Dawley rats.
Resumen
Se realiz un estudio para comprobar el efecto diurtico del extracto acuoso de Boldoa purpurascens Cav. y evaluar las diferentes variables fisiolgicas tras su aplicacin continuada (14 das). Se utilizaron 5 ratas S/D para comprobar el efecto diurtico de la materia prima y 40 ratas de la misma lnea para la evaluacin a dosis continuada. Se observ una gran actividad diurtica de la planta a la dosis de 400 mg/Kg. Durante las evaluaciones clnicas no se evidenciaron anormalidades en el comportamiento de los animales estudiados. Se encontraron diferencias estadsticas en los valores de hemoglobina, hematocrito, glicemia, sodio y potasio, siendo muy altamente significativos los tres ltimos parmetros. La administracin de la planta presenta efecto diurtico a la dosis estudiada, su administracin continuada disminuye significativamente los valores de Hb y Hto, afecta fundamentalmente la homeostasis del potasio y disminuye la glicemia a los 14 das. Palabras Clave: Boldoa purpurascens; Diurticos; Medicina herbolaria, Ratas Sprague Dawley.
Recibido | Received: October 22, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: April 25, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: May 4, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by Cuban Ministery of Public Health. This article must be cited as: Maykel Prez Machn, Mara Boffil Crdenas, Dulce M. Gonzlez Mosquera, Emilo E. Monteagudo Jimnez, Rayza Mndez Triana, Luis E. Das Costa, Freiman Blanco Machado, Nieve Iglesias Rodrguez, Belkis VerdecIa Machado. 2009. Efecto de la administracin oral continuada de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):203 210. {EPub May 4, 2009}.
*Contactos | Contacts: E-mail: maykelpm@iscm.vcl.sld.cu
Prez Machn et al.
Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas
INTRODUCCIN En la actualidad, a pesar de los nuevos frmacos disponibles, el uso de los diurticos todava representa una excelente alternativa de tratamiento antihipertensivo en diversos grupos de pacientes y constituyen una de las clases ms valiosas de medicamentos a elegir como terapia inicial en la Hipertensin Arterial Esencial. Existen muchas plantas medicinales, que son utilizadas tradicionalmente por la poblacin cubana, a las cuales se les atribuyen propiedades diurticas. Boldoa purpurascens Cav. conocida comnmente como nitro blanco, ha sido utilizada tradicionalmente por gran parte de la poblacin cubana atendiendo a su poderosa accin diurtica (Hernndez et al., 2006; Rojas et al., 2004; Gonzlez y Carvajal, 1998). Esta planta fue descubierta por Cavanilles en Amrica, depositada en el jardn botnico de Madrid en 1816 por Lagasca, un discpulo de Cavanilles e introducida en Cuba en 1842 (Hernndez et al., 2006; Rojas et al., 2004). Pertenece a la familia de las Nyctaginceas y se le conoce tambin como: Boldoa ovatifolia Lag, Cryptocarpus globosus H.B.K, Salpianthus purpurascens Hook & Arm. Es la ltima especie de su gnero y en Cuba tambin recibe el nombre vulgar de tostn. Es una yerba de un metro o poco ms de altura, con tallo erecto, ramoso y las ramas delgadas, angulosas, lampias. Hojas alternas, pecioladas, anchamente ovales, agudas, enteras, con base subtruncada y decurrente en el pecolo; lampias de color verde claro; flores verdosas, pequeas, ssiles, conglomerado racemosas. El cliz es fructfero, pubescente, cuadridentado en el pice. Presenta cuatro estambres, con hipoginos libres, anteras biloculares, ddimas. Los ovarios son ovoideos, ssiles. Los estilos son simples, adelgazndose insensiblemente hasta terminar en el estigma aleznado, agudo. Aquenio comprimido, apeciolado. Embrin subanular, endospermo carnoso-farinceo (Roig, 1998). Las hojas de la planta y los aspectos taxonmicos ms importantes pueden apreciarse en la Fig. 1. La medicina popular refiere la utilizacin de una taza de cocimiento de sus hojas, incluso la recomienda varias veces al da (Gonzlez y Carvajal, 1998; Roig, 1998). Sin embargo, no se han desarrollado estudios farmacolgicos con una administracin continuada que justifiquen esta forma de uso. La actividad diurtica de Boldoa purpurascens Cav. tras su administracin oral nica ha sido
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comprobada en estudios preclnicos (Rojas et al., 2004; Gonzlez y Carvajal, 1998). Los diurticos se utilizan fundamentalmente por largos periodos de tiempo para tratar enfermedades crnicas, por lo que resulta de gran inters conocer la influencia del uso continuado de la planta sobre diferentes parmetros fisiolgicos.
Figura 1. Hojas de Boldoa purpurascens Cav. y clasificacin taxonmica.
El objetivo de este estudio consisti en evaluar el efecto de la administracin oral continuada de un extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas. MATERIALES Y MTODOS Se realiz un estudio preclnico en la Unidad de Toxicologa Experimental (UTEX) del Instituto Superior de Ciencias Mdicas de Villa Clara Dr. Serafn Ruiz de Zrate Ruiz, abarcando un perodo de cuatro meses desde enero hasta mayo de 2007. Este se llev a cabo mediante dos fases experimentales: una primera de comprobacin del efecto diurtico de la materia prima a utilizar (extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascens Cav.) y una segunda de evaluacin del efecto de la administracin oral continuada de la planta sobre diferentes variables fisiolgicas. La planta fue recolectada en marzo de 2006, en el semillero del Huerto las Antillas de la Universidad Central Marta Abreu de las Villas (UCLV) en horas de la maana, procedente de un suelo carbonatado. La identificacin de la misma fue realizada por una especialista de dicha estacin experimental y una
Prez Machn et al.
muestra de ella se conserv en el herbario del Jardn Botnico de la propia UCLV con el nmero de Vaucher 3012. Las hojas se dividieron en partes pequeas y se extendieron sobre bandejas metlicas realizndose un secado mediante calor artificial en estufa, a una temperatura de 40 0C durante 72 h. Luego se moli el material vegetal seco empleando un molino de cuchillas Resteh alcanzndose un tamao de partcula de 0.75 mm. A partir del material vegetal seco y pulverizado se procedi a la elaboracin de un extracto a mediana escala y su posterior liofilizacin en el Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Se elabor un extracto acuoso al 10% mediante el uso de 2 kg de la droga seca depositada en un reactor con capacidad para 20 L y con agitacin. Se procedi a la filtracin de este a travs de varios filtros de membrana y posteriormente se concentr hasta obtener una concentracin de slidos totales de 10 mg/mL. A continuacin se someti el extracto a un proceso de liofilizacin, empleando una liofilizadora Edward modelo L-40, procedente del Reino Unido, pasando por las tres etapas que rigen este ciclo (congelacin, secados primario y secundario). Comprobacin del efecto diurtico de la materia prima a utilizar Esta etapa preliminar persigui comprobar si el producto de estudio despus de 6 meses de elaborado mantena actividad diurtica, pues no se dispona de referencias sobre su estabilidad. Para ello se utilizaron cinco ratas Sprague Dawley, sanas, con un peso comprendido entre 180-220 g, procedentes del Centro Nacional de Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB), que fueron recibidas con el correspondiente Certificado de Calidad Gentico e Higinico Sanitario. Los animales fueron sometidos a un perodo de cuarentena de cinco das para lograr su aclimatacin a las condiciones experimentales (temperatura 20 2 C), con una humedad relativa de 30-70% y ciclos de luz/oscuridad de 12/12 h). Se alojaron en una caja T-4 con fondo de rejilla, privados del alimento desde las 3:00 pm del da anterior y se les suprimi el agua a las 7:00 am del siguiente da. A partir de estudios previos donde se evaluaron varios niveles de dosis, se seleccion una dosis oral nica de 400 mg/kg por resultar la de mayor actividad diurtica de la planta (Rojas et al., 2004). El producto de ensayo se reconstituy en agua destilada, preparndolo diariamente a una concentracin de 10 mg/mL,
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administrando una dosis de 400 mg/kg considerando una hidratacin a razn de 4 mL por cada 100 g de peso corporal. La administracin del extracto se realiz mediante una cnula intragstrica 18 G a las 8:00 am. Las ratas fueron colocadas en jaulas metablicas y se registr el volumen de orina acumulado a las 1, 2, 4, 6 y 24 h post-administracin segn aparece descrito en las guas y en varios estudios publicados en la literatura sobre plantas con actividad diurtica atribuida (Jimnez et al., 2004; Boffill et al., 2006). Una vez concluido el experimento los animales fueron sacrificados mediante anestesia con ter. Para efectuar la comparacin del extracto acuoso liofilizado de la planta se utilizaron dos controles histricos, un control negativo administrado con cloruro de sodio 0,9% y uno positivo tratado con furosemida 20 mg/kg. Ambos controles se tomaron de un estudio anterior realizado en la misma institucin (UTEX), donde se trabaj bajo iguales condiciones experimentales e hidratacin de los animales a razn de 4 mL por cada 100 g de peso corporal, lo que permiti la comparabilidad de los grupos y justific el empleo de este tipo de control (Boffill et al., 2006). Evaluacin del efecto de la administracin oral continuada de Boldoa purpurascens Cav La sustancia de estudio se administr diariamente durante 14 das, realizndose un anlisis a los 7 y 14 das respectivamente. Se utilizaron 40 ratas de la lnea Sprague Dawley procedentes del Centro Nacional para la Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con un rango de peso comprendido entre 200-220 g, una edad de 40-60 das de nacidas y de ambos sexos. El producto de ensayo (extracto acuoso liofilizado) se reconstituy con NaCl, preparando diariamente a una concentracin de 10 mg/mL para garantizar su estabilidad. Se administr una dosis diaria por va oral de 400 mg/kg mediante una cnula intragstrica 18 G con una hidratacin de 4 mL/100 g de peso para el grupo tratado con la planta y el control negativo (NaCl) y no se utiliz control positivo, pues no era objeto de la investigacin medir la actividad diurtica, sino evaluar el efecto de la administracin continuada sobre diferentes variables bioqumicas. La dosis propuesta en nuestro ensayo (400 mg/kg) es la recomendada en la literatura como la dosis adecuada a emplear en la evaluacin de plantas con actividad diurtica atribuida (Jimnez et al., 2004; Boffill et al., 2006). Se tomaron para la evaluacin variables informativas, de control y de respuesta.
Prez Machn et al.
Todos los datos obtenidos durante el estudio fueron tabulados y almacenados en una base de datos confeccionada en SPSS versin 11.0 para Windows. En el procesamiento estadstico se determin la media y la desviacin estndar de cada uno de los grupos. Para establecer si las diferencias entre ambos grupos (tratado y control) fueron estadsticamente significativas se utiliz la prueba no paramtrica U de Mann-Whitney (M-W). Se consideraron los niveles de significacin: p<0,05 (significativo); p<0,01 (altamente significativo) y p<0,001 (muy altamente significativo). RESULTADOS Comprobacin del efecto diurtico de la materia prima Al comparar los controles histricos que aparecen publicados en la literatura con los valores medios de diuresis obtenidos del estudio preliminar, se comprob que en el grupo control negativo (NaCl), la diuresis comenz dos horas despus del inicio del experimento y se obtuvieron bajos volmenes de orina excretada hasta completar 62,56 mL/kg al ser medidos a las 24 h. Por el contrario, en el grupo tratado con furosemida, el inicio de la accin diurtica comenz durante la primera hora, alcanzndose finalmente un volumen de 80,19 12,49 mL/kg. El extracto acuoso del nitro blanco logr superar el efecto de la furosemida a partir de las 6 h, alcanzando un volumen final de 130 10,12 mL/kg. No fue necesario determinar las concentraciones urinarias de Na+ y K+ por encontrase disponible varias referencias en la literatura sobre la eliminacin de estos iones tras las aplicacin de la planta en estudio, considerndose como una expoliadora de iones potasio (Gonzlez, 2006; Cabrera, 1997). Esta fase permiti dar continuidad al segundo estudio al comprobarse actividad diurtica de la materia prima. Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas Durante las evaluaciones preclnicas no se evidenciaron anormalidades en el comportamiento de ninguno de los animales estudiados. Siempre se registr una conducta normal en los animales, con reflejo postural normal, hbitos de aseo y respuesta habitual a los estmulos nociceptivos, as como el consumo de alimentos y agua como corresponde a esta especie (Gonzlez et al., 2006). El anlisis de signos clnicos manifest buen estado general de los animales
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y apariencia normal, caracterizada por pelos brillantes, ojos claros y brillantes, mucosas normocoloreadas. Los signos vitales fueron normales, no existiendo alteraciones en las frecuencias cardacas y respiratorias. En cuanto al anlisis de la conducta se determin un comportamiento normal exploratorio. La respuesta a los estmulos fue normal y estuvo caracterizada por una uniformidad en la movilidad del total de los animales ante el toque y fuera de sus jaulas. El resultado del peso corporal evidencia un incremento progresivo de esta variable en ambos grupos: tratado (B. purpurascens) y control (NaCl). Al concluir los 14 das de experimentacin cada uno de los grupos mostr una ganancia de peso por encima de los 15 g y no se presentaron diferencias estadsticas entre grupos y sexos. Comportamiento hematolgico y bioqumico El anlisis intermedio de los 7 das (Fig. 2) mostr diferencias estadsticas significativas en la hemoglobina y hematocrito y se evidenciaron diferencias altamente significativas en el comportamiento bioqumico del in potasio. En el anlisis final por grupo del da 14 (Tabla 1) se observaron diferencias significativas en algunos de los ndices hematolgicos.
Figura 2. Variacin de la hemoglobina en ambos grupos.
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 7 Das
**
C(g/L)
Grupo tratado Grupo control
14
Significacin estadstica: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney
La hemoglobina disminuy tanto al sptimo como al da 14 en relacin con el grupo control, mostrando en esta ltima evaluacin diferencias que resultaron ser estadsticamente significativas. (Fig. 2). A pesar de las diferencias encontradas los niveles de Hb siempre se encontraron dentro del rango de valores normales establecidos para esta lnea, no obstante, debemos prestarle un inters especial a este hallazgo, pues solamente se administr el producto durante 14 das.
Prez Machn et al.
En el Conteo Diferencial de Leucocitos se observa una disminucin de los eosinfilos en el grupo tratado que no llega a ser estadsticamente significativa (p=0,057). En el anlisis de M-W no se presentaron diferencias estadsticas para ninguno de los grupos en cuanto al sexo y los valores ms bajos se encontraron en el grupo tratado y correspondieron a las ratas machos. Los valores obtenidos para el grupo tratado indican que la administracin del producto de ensayo no produce eosinofilia, la cual muchas veces aparece por causas farmacolgicas (Prez et al., 2004). No obstante, se encontraron diferencias estadsticas entre ambos sexos para est ndice a los 14 das, pero no entre el grupo tratado y control, lo que demuestra que el extracto de la planta no tuvo influencia sobre los eosinfilos. Los efectos de los medicamentos sobre los eosinfilos son mltiples y presumiblemente se incrementarn a medida que se incorporen nuevos principios activos al arsenal teraputico. Por ello, es esencial conocer la relacin la relacin que guarda la administracin de un frmaco con los niveles de
eosinfilos, ya que algunos medicamentos (incluso aquellos de empleo muy comn) pueden ser los responsables de esta alteracin analtica. El resto de las clulas del diferencial no mostr ninguna diferencia entre grupos y sexos y se apreci un predominio de linfocitos sobre el resto de las clulas, situacin similar a la reportada en la literatura para los valores normales de estos ndices hematolgicos (Gonzlez et al., 2006). La Tabla 2 refleja el comportamiento de los indicadores medios de qumica sangunea. Todos los indicadores evaluados se encontraron dentro de los lmites normales establecidos para la especie menos el potasio y la glicemia, esta ltima se encontr en ambos grupos experimentales por debajo de su valor normal. Al analizar las diferencias estadsticas entre grupos para esta variable se apreciaron diferencias estadsticas significativas (p=0,030), encontrndose sus valores ms bajos en el grupo tratado con la planta. Al aplicar la prueba de M-W no se evidenciaron diferencias entre sexos para ninguno de los grupos estudiados.
Tabla 1. Valores medios de los ndices hematolgicos de ratas Sprague Dawley de ambos grupos (media aritmtica desviacin estndar, n=40) Grupo Hb (g/L) 142,16 12,88** 154,02 10,39 Hto (%) 42,74 2,94*** 48,70 2,41 Leuc (x109 /L) 7,81 0,77 8,15 0,92 P L M E
Tratado Control
0,14 0,05 0,15 0,07
0,85 0,49 0,83 0,07
0,004 0,006 0,003 0,005
0,0005 0,002 0,007 0,010
Leyenda: Hb: hemoglobina, Hto: hematocrito, Leuc: leucocitos, P: polimorfos, L: linfocitos, M: monocitos, E: eosinfilos Significacin estadstica: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney
Tabla 2. Valores medios de los ndices hematolgicos de ratas Sprague Dawley de ambos grupos (media aritmtica desviacin estndar, n=40) Grupo Crea mol/L 47,38,96 82,605,38 Gluc mmol/L 3,191,08* 3,850,88* ASAT U/L 69,7622,6 82,9311,54 ALAT U/L Alb g/L 39,682,93 39,523,15 Chol-T Mmol/L 1,521,21 1,750,24 Na+ mEq/L 133,1513,06* 142,634,47 K+ mEq/L 9,091,19*** 3,300,54
Tratado Control
35,295,19 35,734,85
Leyenda: Crea: creatinina, Gluc: glucosa, ASAT: Aspartato aminotrasnferasa ALAT: Alanino aminotrasnferasa Alb: albmina, Chol-T: colesterol, Na+: sodio, K+: potasio Significacin estadstica: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney
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Prez Machn et al.
El anlisis estadstico pone de manifiesto la existencia de otras diferencias para los niveles plasmticos de iones sodio y potasio. Las ms acentuadas se encontraron en el potasio llegando a ser muy altamente significativas (p=0,000). Es vlido destacar que el potasio se increment de manera muy significativa tanto al sptimo como al decimocuarto da (Tabla 2), aprecindose en este ltimo mucho ms las diferencias con respecto al grupo control, sobrepasando el rango de valores normales (Fig. 3), y segn estos resultados se demuestra un incremento considerable de potasio tras la administracin continuada de 400 mg/kg de peso.
Figura 3. Variacin de potasio en ambos grupos.
12 10 C(mEq/L) 8 6
** ***
Grupo Tratado Grupo Control
4 2 0 7 Das 14
Significacin estadstica: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney
DISCUSIN En Cuba existen varias plantas medicinales de uso tradicional a las cuales se les atribuyen propiedades diurticas. Solo en algunas de ellas se ha comprobado experimentalmente gran efectividad diurtica: Costus cylindricus, Biden alba, Xanthium strumarium y Boldoa purpurascens (Jimnez et al., 2004; Boffill et al., 2006). Las administraciones de Costus cylindricus y Bidens alba, administradas a una misma dosis (400 mg/kg) y volumen (4 mL/100g), han mostrado menor actividad diurtica que la propia Boldoa prupurascens. Los valores medios de volumen de orina reportados a las 24 h tras la aplicacin de la Bidens alba fueron aproximadamente de 89 mL/kg (Jimnez et al., 2004; Gonzlez, 2006) y para Costus cylindricus fue de 78,04 10,69 mL/kg. Comparando estos resultados con los obtenidos en nuestro estudio
corroboramos la marcada diuresis atribuida a Boldoa purpurascens Cav. Los estudios etnomdicos y de toxicidad disponibles de la planta no han mostrado evidencia de anemia. El presente estudio emplea por primera vez un esquema de administracin oral continuada de la planta que permiti observar los efectos de esta sobre los ndices hematolgicos. La evidente tendencia a la disminucin de la hemoglobina (Hb) y el hematocrito (Hto) en el grupo tratado con la planta nos hace pensar que esta pudiera estar afectando la sntesis de la Hb. Los taninos, metabolitos secundarios presentes en la planta, pudieran guardar relacin con estos efectos perjudiciales, ya que se conoce que bloquean la absorcin del hierro (Hernndez et al., 2006). La literatura refiere varias clases de diurticos que afectan las concentraciones de glicemia. Para las tiazidas se ha reportado hiperglicemia por inhibicin de la liberacin pancretica de insulina y bloqueo de la activacin perifrica de glucosa; pero este mecanismo no est del todo demostrado (Mudge, 1994; Centro para el Desarrollo de la Farmacoepidemiologa, 2001). Por otra parte, en los diurticos de alto techo como la furosemida se han reportado algunos casos de tolerancia a los hidratos de carbono, pero en un menor grado que las tiazidas. La hipoglicemia aguda de origen desconocido se ha observado como manifestacin de sobredosis (Mudge, 1994; Centro para el Desarrollo de la Farmacoepidemiologa, 2001). Aparecen referidos en la literatura varios estudios sobre el efecto hipoglicemiante de algunos flavonoides; sin embrago, hasta la fecha no se ha encontrado ningn estudio que muestre el efecto hipoglicemiante de la planta, a pesar de tener un elevado contenido de estos metabolitos. Se ha planteado la existencia de flavonas que aumentan la liberacin de insulina de los islotes de Langerhans de una forma dependiente a su concentracin. El aspecto ms importante a considerar desde el punto de vista teraputico para la Boldoa purpurascens es su aporte considerable de iones potasio al organismo, tenindose en cuenta que el principal inconveniente de los diurticos es la deplecin electroltica, especialmente el de este in. De acuerdo a los resultados obtenidos la planta se comporta como un diurtico aportador de potasio capaz de inducir hiperpotasemia, que para esta lnea
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Prez Machn et al.
de ratas (SD) se reporta como valor umbral 8.5 mEq/L (Iffa Credo, 1998; Wolford et al., 1986). No se conoce en la teraputica ningn diurtico que no sea capaz de provocar alteraciones en la homeostasis del potasio y el nitro blanco tampoco es la excepcin. Existe un nmero considerable de frmacos diurticos disponibles en el mercado y dentro de ellos un grupo muy reducido denominado ahorradores de potasio, entre los que se encuentran amiloride, triantereno y espironolactona (Jackson, 1998). En Cuba solamente se encuentra dentro del cuadro bsico de medicamentos la espironolactona como diurtico ahorrador de potasio, este se utiliza en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva que no mejora a pesar del tratamiento con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAs) ms diurtico y digoxina. La asociacin de espironolactona con los IECAs no produce hiperpotasemia y para el caso de la digoxina mejora la carditoxicidad. Estas asociaciones han mostrado un grado de evidencia A o categora I, basada en los datos procedentes de ensayos clnicos controlados y aleatorizados, metaanlisis y revisiones sistemticas (Centro para el Desarrollo de la Farmacoepidemiologa, 2001). Existen dos posibilidades de reducir el riesgo de hipopotasemia (hipokalemia): dar aportes de potasio o aadir al tratamiento un diurtico, un ahorrador de potasio. La mayor parte de los autores se inclinan por intentar prevenir suplementos de potasio, pues el cumplimiento de la prescripcin puede ser un problema en este ltimo caso, pues no todos los enfermos tienen problemas de hipokalemia (Club de Atencin Farmacutica, 2006; Cohn et al., 2000; Genneri, 1998). Disponer en la teraputica de un medicamento natural que posea gran eficacia como diurtico y a la vez sea un aportador de potasio resulta muy alentador para la farmacologa de la insuficiencia cardaca. CONCLUSIONES 1. Se comprob el efecto diurtico del extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurasces Cav. a la dosis de 400 mg/kg. 2. No se presentaron signos clnicos asociados a la administracin de la sustancia en ensayo. 3. La administracin continuada del extracto acuoso liofilizado disminuy significativamente los niveles de Hb y Hto, a pesar de encontrarse
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ambos parmetros en el rango establecido de valores normales para la lnea de estudio. 4. Se present una disminucin significativa de la glicemia en el grupo tratado con relacin al control. 5. Las concentraciones de sodio disminuyeron significativamente en el grupo tratado, mientras que el potasio mostr diferencias muy altamente significativas y sobrepas los lmites normales de laboratorio clnico a los 14 das de administracin. REFERENCIAS
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Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb. extracts

[Actividad tripanocida de extractos de Castela coccinea Griseb.]
Mara L. MARTNEZ , Mara NOEL CAMPAGNAa, Mara S. RATTIa, Isabel NOCITOb, Esteban SERRAb, Susana GATTUSOa and Martha A. GATTUSOa*
a a*
Farmacobotnica. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario, Argentina. bParasitologa. Fac. Cs. Bioq. y Farm. UNR. Rosario, Argentina.
Abstract
Castela coccinea Griseb is a small tree that belongs to Simaroubaceae family. This work shows that this plant extracts present in vitro a strong activity against Trypanosoma cruzi epimastigotes. Particularly, wood dichloromethane extract displayed the most intensive trypanocide effect. A fraction of this extract, purified by column chromatography over Silica-gel, was enriched in coumarins, phenolic acids and alkaloids. This fraction was even more effective with an IC50 of 15 g/mL. Our results suggest that alkaloids could be the responsible compounds for this activity. The 8-amino-6-methoxyquinoline group was detected by GC-MS, even though the whole molecule could not be identified yet. On the other hand, all extracts have exhibited cytotoxicity against the human cell line K-562, at high concentrations. However, the selectivity index of wood dichloromethane extract has been 7.5. Keywords: Castela; Simaroubaceae; Trypanocide activity; Cytotoxicity.
Resumen
Castela coccinea Griseb es un rbol de pequeo porte que pertenece a la familia Simaroubaceae. En el presente trabajo los extractos de esta planta muestran una fuerte actividad in vitro contra epimastigotes de Trypanosoma cruzi. El extracto diclorometnico de madera es el que presenta mayor efecto tripanocida. Una fraccin de este extracto, purificada por cromatografa en columna, est enriquecida en cumarinas, cidos fenlicos y alcaloides. Esta fraccin es an ms activa con una CI50 =15 g/mL. Nuestros resultados sugieren que los alcaloides son los responsables de esta actividad. Ms an, se ha detectado la presencia del grupo 8-amino-6-metoxiquinolina por cromatografa gaseosa acoplada a un espectrmetro de masa, pero todava la molcula entera no ha sido identificada. Por otro lado, todos los extractos mostraron actividad citotxica contra la lnea celular humana K-562, a altas concentraciones. Sin embargo, el ndice de selectividad para el extracto diclorometnico de la madera es de 7.5. Palabras Clave: Castela; Simaroubaceae; Actividad tripanocida; Citotoxicidad.
Recibido | Received: March 5, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: April 30, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: May 10, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: None declared. This article must be cited as: Mara L. Martnez, Mara Noel Campagna, Mara S. Ratti, Isabel Nocito, Esteban Serra, Susana Gattuso and Martha A. Gattuso. 2009. Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb. extracts. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):211 218. {EPub May 10, 2009}.
*Contactos | Contacts: Facultad Cs. Bioqumicas y Farmacuticas. Suipacha 531 S2002LRK Rosario, Argentina. E-mails: mlmartin@fbioyf.unr.edu.ar; marthagattuso@fibertel.com.ar
Martnez et al.
Trypanocide activity of Castela coccinea Griseb
MATERIALS AND METHODS INTRODUCTION Castela coccinea Griseb. mainly grows in South America and belongs to the Simaroubaceae family. This family has played a prominent role in folk medicine because of its anthelmintic and antiamoebic properties (Polonsky, 1973). Chemical examination of these plants has been carried out by several groups resulting in the isolation of quassinoids (Ogura et al.,1977; Grieco et al., 1999; Jiwajinda et al., 2001; Jacobs et al., 2007), alkaloids (Sanchez and Comin, 1971; Ogura et al., 1978; Ouyang et al., 1995; Readel et al., 2003) and terpenoids (Sherman et al., 1980). In recent years, attention has been focused on quassinoids, bitter principles of the family, as several of them have shown promising antitumor, antiviral, antimalarial, antileukemic and antifeedant properties (Polonsky, 1985). Bourdy et al. has demonstrated that leaf extracts of Castela coccinea Griseb display strong activity against Plasmodium falciparum, which is the etiological agent of the most severe form of malaria (Bourdy et al., 2004). Malaria has low incidence in South America. On the other hand, South America is the endemic zone for Chagas, another parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi. Although the incidence of Chagas has declined over the past 20 years mainly due to the efforts made towards the control and elimination of the vector, American trypanosomiasis remains a sickness difficult to eradicate (Moncayo, 2003). Current therapy is based on two drugs, nifurtimox and benznidazole, which have been proved effective against the acute phase of the disease. Otherwise, their effectiveness in the chronic stage is controversial. Additionally, serious side effects have been reported in about 50 % of treated patients (Castro et al., 2006). Therefore, it still remains a compelling need to develop safer and more efficient drugs, as well as new approaches to overcome the drawbacks of this chemotherapy strategy. The aim of this work is to examine antitrypanosomal activity of Castela coccinea Griseb extracts. Cell viability was also evaluated after treating cells with different extracts of Castela coccinea Griseb to investigate the behaviour in biological systems, because it is well-know that many Simaroubaceae plants show cytotoxic activity (Among others, Cuendet and Pezzutto, 2004; Guo et al., 2005; Lopez Saez et al., 2008). Plant Material Castela coccinea Griseb. (Simaroubaceae) was collected from Argentina: Santa Fe Province, General Department Obligado, Berna Locality in December 2004 and October 2007 and was authenticated by Luis Oakley, Departamento de Biologa y Recursos Naturales, Universidad Nacional de Rosario (UNR). A voucher specimen was deposited in the Herbarium of SF referring Pensiero 6943 to material collected in 2004 and in the Herbarium of UNR referring Oakley et al. 053 to material collected in 2007. Chemicals 1,1-diphenyl-2-picryldydrazyl (DPPH), dimethyl sulfoxide (DMSO), 2-aminoethyl diphenylborinate and anisaldehide were purchased from Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA. The culture media Eagles minimum essential medium (MEM), Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), trypsin, penicillin G, streptomycin were purchased from Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). All other chemicals and reagents used were of the highest commercially available purity. Preparation of extracts and partial purification The bark (100 g) and the wood (100 g) of Castela coccinea Griseb were extracted three times with ethanol (EtOH) or dichloromethane (DCM) at room temperature and then concentrated under reduce pressure yielding the residues: BarkEtOH (2.0 g), WoodEtOH (2.0 g), BarkDCM (1.24 g) and WoodDCM (0.93 g). Each of them was resuspended in the corresponding solvent or in DMSO. WoodDCM extract was subjected to chromatography on a Silica gel-60 column (40 cm length, 2 cm i.d.) equilibrated with hexane and eluted with a stepwise gradient of hexane and ethyl acetate. 90 fractions of 5 mL each were collected and analyzed by TLC aluminium sheets. On the basis of the TLC profile the similar fractions were pooled into 5 fractions: I, II, III, IV and V. Trypanocide assay Epimastigotes from CL Brener and Y strains were cultured in modified liver infusion tryptose (LIT) medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 28 0.5 C in 24 wells culture flasks (Camargo, 1964). Cultures (3 - 4 x 106 parasites/mL)
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where incubated with increasing amounts of each extract. The parasites growth was monitored by counting them in a Neubauer chamber. Percentage of inhibition was calculated as the ratio between parasites growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture. IC50 was obtained by plotting the percentage of inhibition against extract concentration. Each experiment was performed in triplicate and trypanocide drug benznidazole (BZL) was used as positive control. Cytotoxicity assay Human myelogenous leukaemia K-562 cell line was cultured in DMEM supplemented with penicillin G (100 units/mL), streptomycin (100 g/mL) and 1015% fetal bovine serum in a 5% CO2 humidified incubator at 37 C. The extracts were first dissolved in DMSO and then in MEM. Confluent cultures were treated with medium containing the extracts at concentrations ranging from 1 up to 450 g/mL or the solvent alone (control) for 24, 48 and 72 h. Each drug concentration was tested in quadruplicate. Final concentration of DMSO in the test medium and controls was 1%. After the indicated treatments, cells were removed from culture flasks by treatment with trypsin. The effect of the DMSO 1% was analyzed in all experimental procedures and there was no significant difference between the solvent and the control on all the measured parameters. Cell death was determined by incubating with 0.4% Trypan Blue, and then the stained cells were counted in a Neubauer haemocytometer. The results were expressed as the percentage of cell death relative to solvent-treated control incubations and the IC50 values were calculated using non-linear regression analysis (percentage of cell death vs. concentration). In vitro cytotoxicity effect was calculated as the ratio between cells growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture. Morphological features of the cells (variation in size or nuclear/cytoplasmic ratio, presence of granules) were monitored by light microscopy. General experimental procedures The extracts were subjected to thin layer chromatography (TLC) examination on aluminium sheets pre-coated with silica gel 60 F 254 (Merck). Mobile phase I Toluene: ethylacetate: formic acid (9:3:0.7), II: ethylacetate: Acetic Acid: Formic acid: water (10:1.1:1.1:2.6), III Toluene: ether (1:1
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saturated with 10% acetic acid). The chromatograms were observed first without chemical treatment, under UV 254 and UV 365 nm light, and then using the spray reagents: NP/PEG, Dragendorff, KOH 5%, Liebermann-Burchard reagent or FeCl3 3% (Wagner et al., 2001). TLC sheet was also immersed in a 0.4 mM DPPH methanolic solution for 10 s. GC-MS analysis was carried out on PERKIN ELMER Gas Chromatograph attached to a TURBOMASS Mass Spectrometer. SE-30, 25 m x 0.22 mm de ID column was used for fraction IV separation. Helium was used as the carrier gas and kept at 1 mL/min. Oven temperature was programmed at 100 C (5 min) to 310 C at a rate of 10 C/min (10 min). The mass-scanning was done by electron impact (EI) source with electron energy set to 70 eV and mass range m/z 50-450. RESULTS Cytotoxicity The in vitro cytotoxic effect was determined using the haemocytometer to estimate the total number of viable and non-viable cells and was also evaluated by Trypan-blue exclusion method (Fig. 1A). All extracts have shown significant cell death at the highest dosage of 0.45 mg/mL. IC50 was estimated from graphical interpolation. Among the tested fractions, BarkEtOH extract has shown the strongest inhibition with an IC50 of 0.20 mg/mL. IC50 for wood extracts was 0.45 mg/mL. Microscopically detectable alterations were observed in the cell morphology. When cells were incubated with bark extract granulation and vacuolization in the cytoplasm were observed, as well as irregular borders and a lower number of cells were detected (Fig. 1B). Antitrypanosomal activity of the extracts Ethanolic and DCM extracts of Castela coccinea Griseb bark and wood were screened for antiprotozoal activity against Trypanosoma cruzi epimastigotes (Fig. 2). WoodDCM extract showed the strongest activity with an IC50 = 60 g/mL. BZL was used as positive control and showed an IC50 = 10 g/mL. Cytotoxicity did not correlate with antiprotozoal activity. Wood extracts were more selective against the parasites than against mammalian cells. This was demonstrated by their Selectivity Index (SI = IC50 for K-562 cells/ IC50 antiprotozoal activity) values > 1. WoodDCM SI has been 7.5.
Martnez et al.
Figure 1. Effect of Castela coccinea Griseb extracts on inhibition of the leukemic cell line K-562. A. In vitro cytotoxicity effect calculated as the ratio between cells growth in the presence or absence of each extract, after 72 h of culture. B. Photomicrographs 1) Cells incubated with solvent alone (Control) 2) BarkEtOH (100 g/mL) treated cells and staining with Trypan blue. Death staining cells are shown with an arrow. It was observed a lower number of cells, irregular borders and cytoplasmic granules. 3) BarkEtOH (200 g/mL) treated cells without staining. A very low number of cells and abundant granules were observed. A
Wood DCM 100 Wood EtOH Bark DCM Bark EtOH
80
60
% Cell death
40
20
0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
-20 Concentration (g/ml)
Fractionation and phytochemical screening of WoodDCM extract The WoodDCM extract was purified by column chromatography. When tested against the parasite, Fraction I, the high non-polar fraction, showed an IC50 value of 185 g/mL, while fraction III exhibited an IC50 value of 60 g/mL. The highest activity was concentrated at fraction IV (Fig. 3), and this fraction also had activity against DPPH. Phytochemical analysis by TLC has demonstrated the presence of alkaloids and terpenoids in fraction III and alkaloids, phenolic acids and coumarin in fraction IV. When this fraction (IV) was subjected to GC-MS,
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scopoletin and an 8-amino-6-methoxyquinoline group were detected, however the identity of the whole alkaloid molecule could not be determined. Despite scopoletin being the main component of fraction IV (Fig. 4), it did not show any trypanocide activity up to 6 g/mL. On the other hand, the phenolic acids detected in fraction IV were also detected in fraction V (the most polar fraction). It is a very interesting fact that this last fraction had not trypanocide activity at all. Therefore, trypanocide activity would not be caused by effect of these phenolic acids. On the contrary, they were responsible for DPPH scavenging activity.
Martnez et al.
Figure 2. In vitro trypanocide activity of Castela coccinea Griseb extracts expressed as percentage of parasites growth inhibition..
Woodol 120 WoodDCM Barkol BarkDCM
100 Trypanocide activity (%
80
60
40
20
0 1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 0.015 Extract Concentration (mg/mL)
Figure 3. In vitro trypanocide activity of different wood DCM fractions expressed as percentage of parasites growth inhibition.
FI 120 FII FIII FIV
100 Trypanocide activity (%
80
60
40
20
0 1 0.5 0.25 0.125 0.06 0.03 0.015 Extract Concentration (mg/mL)
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Martnez et al.
Table 1. In vitro trypanocide activity and cytotoxicity of Castela coccinea Griseb extracts. Cytotoxicity IC50 (g /mL) T. cruzi Woodol FI FII FIII FIV FV WoodDCM Barkol BarkDCM 81 185 60 15 60 220 168 K-562 450 450 200 300 5.5 7.5 0.9 1.78 Selectivity indexa
(a) Selectivity index was determined by the ratio of the IC50 value on K-562 cells to the IC50 value on T. cruzi.
Figure 4. Analysis of fraction IV by TLC. TLC plate was stained with NP-PEG. Fraction IV exhibited eight to ten blue fluorescent zones from the start up to Rf 0.53. Solvent system III. S: commercial scopoletin 0.1% in ethanolic solution (5 L).
Rf
0.53
0.23
IV
DISCUSSION This work showed that Castela coccinea Griseb presents a strong trypanocide activity and particularly wood extracts displayed the most intensive effect. On the other hand, all extracts have exhibited cytotoxicity at high concentrations. However, WoodDCM was more selective against parasites than against mammalian cells with a selectivity index of 7.5. A fraction of this extract enriched in coumarins, phenolic acids and alkaloids was more effective against Trypanosoma cruzi with an IC50 of 15 g/mL.
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Several coumarins and indol or quinoline alkaloids exhibit remarkable parasitaemia suppression against different strains of Plasmodium or Trypanosoma (among others Phillipson, 1999; Camacho, 2004; Muhammad et al,. 2003 and 2004; Argotte-Ramos et al., 2006; Huang et al., 2006; Fournet et al., 2007; Bringmann, 2007; Frederich, 2008). Our results suggest that alkaloids could be responsible for this activity. The 8-amino-6-methoxyquinoline group was detected but the whole molecule could not be identified yet. Interestingly, compounds containing this group, as for example, primaquine (CAS N 6345-6) are already being used to produce radical cure and prevent relapse of vivax and oval malarias following treatment with blood schizontocide (Dongre et al., 2005; Musonda et al., 2007; Kaur et al., 2007). The fraction with the highest trypanocide activity also showed antioxidant capacity. It has been proven that Trypanosoma is sensitive to oxidative stress, in particular by reactive oxidant species produced during the immune response of the host. The fact that this fraction both show radical scavenging and kill parasites suggests that these activities should be associated with two different molecules present in the extract. The detected antioxidant compounds were phenolic acids, also present in the most polar fraction without show trypanocide activity. However, the possibility that the same molecule works as a radical scavenger in mammalian cells and as a radical inducer in parasites could not be completely missconsidered.
Martnez et al.
The screening of natural products provides the chance to discover new molecules of unique structure with high activity and selectivity, which can be further optimized by semi- or fully synthetic procedures. Alkaloids are one of the most fascinating natural products, providing many drugs for human use (Phillipson et al., 1999; Kayser et al., 2003). The results of this work show that Castela coccinea Griseb extracts are potentially a rich source of bioactive compounds and the search of these entities is carried out. A preliminary phytochemical study is done but further studies are needed as this plant is unknown from the phytochemical point of view. CONCLUSION Castela coccinea Griseb has not been previously studied for their trypanocidal effect. Wood DCM showed strong activity against Trypanosoma cruzi with an IC50 of 15 g/mL. Our results suggest that alkaloids could be responsible for this activity. Interestingly, although the whole molecule identity could not be assessed, an 8-amino-6-methoxyquinoline group was detected. A bioguided fractionation is in progress to identify the active compounds. REFERENCES
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Estudio de la eficacia antibitica de un extracto etanlico de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en dos modelos de infeccin en piel de ratn
[Study of the antibiotic efficacy of an ethanolic extract from Rosmarinus officinalis against Staphylococcus aureus in two skin infection models in mice]
Mara V. BARNI, Adriana FONTANALS y Silvia MORENO* Fundacin Instituto Leloir I.I.B.B.A-CONICET, Patricias Argentinas 435, C1405FFX, Ciudad de Buenos Aires, Argentina.
Abstract
In this paper we examined the antibacterial efficacy of an ethanolic extract of Rosmarinus officinalis L. containing a high amount of antioxidant polyphenols against the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus in two skin infection models in mice, superficial and subcutaneous. Results obtained showed that the rosemary extract containing 2.3% of polyphenols had bacteriostatic activity against S. aureus on the skin infection. Using a double concentration of bioactive polyphenols in the treatment (4.6% of polyphenols), a total bacterial growth inhibition on the skin was suggested since we did not recover any bacteria viable in the skin mouse. A similar effect was observed in two skin models. Our results also showed that the antibacterial efficacy of the bioactives of rosemary is comparable with the antibiotic action of the well recognized antibiotic fusidic acid. All findings indicated that bioactive polyphenols of rosemary are able to carry out bactericide as well as bacteriostatic action against S. aureus in the skin mouse. Keywords: Rosmarinus officinalis L;, Antimicrobial activity; Superficial skin infection model in mouse; Subcutaneous skin infection model in mouse.
Resumen
En este trabajo evaluamos la eficiencia antibacteriana de un extracto etanlico de Rosmarinus officinalis L. que contiene altas concentraciones de polifenoles antioxidantes, en dos modelos de infeccin en piel de ratn: superficial y subcutneo contra la bacteria patgena Staphylococcus aureus. Los resultados obtenidos muestran que el extracto de romero que contiene 2,3% de polifenoles bioactivos present una accin bacteriosttica contra S. aureus sobre la piel del ratn, mientras que ensayando una doble concentracin de polifenoles bioactivos (4,6%) se observ una inhibicin total del crecimiento bacteriano. En los dos modelos de infeccin experimentados se observaron efectos similares. Los datos obtenidos tambin demuestran que la eficacia antibacteriana del extracto de romero es comparable con la accin del antibitico comercial cido fusdico. Los resultados indican que los polifenoles bioactivos del romero, dependiendo de su concentracin, pueden ejercer in vivo acciones bacteriostticas y bactericidas contra S. aureus. Palabras Clave: Rosmarinus officinalis L.; Actividad antimicrobiana, Modelo de infeccin superficial en piel de ratn, Modelo de infeccin subcutneo en piel de ratn.
Recibido | Received: December 30, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: May 18, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: May 29, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET) and ANPCyT, proyecto PICT2005-35401 This article must be cited as: Mara V. Barni, Adriana Fontanals y Silvia Moreno. 2009. Estudio de la eficacia antibitica de un extracto etanlico de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en dos modelos de infeccin en piel de ratn. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):219 223. {EPub May 29, 2009}.
*Contactos | Contacts: E-mail: smoreno@leloir.org.ar
BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.
Barni et al.
Eficacia antibitica de Rosmarinus officinalis L. contra Staphylococcus aureus en ratones
INTRODUCCIN Las enfermedades infecciosas representan en la actualidad una importante causa de mortalidad en humanos, especialmente en los pases en desarrollo. Actualmente la emergencia de resistencia a antibiticos de uso comn en la clnica, se ha incrementado en algunas bacterias patgenas (Cabrera Cao et al., 2005) y es un problema particular en pacientes infectados con Staphylococcus aureus debido al aumento de variantes resistentes a lacatamasas, aminoglicsidos (Styers et al., 2006). Esta bacteria puede ingresar al cuerpo a travs de heridas, quemaduras, lceras o puede ser trasportada a travs de sondas o cnulas en los pacientes hospitalarios, pudiendo llegar al torrente sanguneo y as diseminarse en el organismo, comprometiendo el corazn, la sangre o los huesos (Naimi et al., 2003). Adems, recientemente se encontraron bacterias resistentes en mbitos hospitalarios que fueron transmitidas en la comunidad (Kollef et al., 2006). En consecuencia, dichos sucesos impulsan la bsqueda de nuevas drogas para controlar las bacterias resistentes. La obtencin de nuevos agentes antimicrobianos de origen vegetal es una estrategia competente en la farmacologa actual (Cowan et al., 1999). Se sabe que las plantas bajo condiciones de estrs bitico y abitico sintetizan metabolitos secundarios que incluyen flavonas, taninos, antocianinas y terpenos (mono-di y sesqui terpenos) para adaptarse al medio que las rodea (DemmingAdams et al., 2002, Kliebenstein, 2004). Algunos de estos compuestos presentan actividad antimicrobiana (Lewis et al., 2006). Las plantas pertenecientes a la familia Lamiaceae crecen en zonas ridas y de alta irradiacin UV, por lo tanto acumulan una gran cantidad de metabolitos secundarios, en particular el gnero Rosmarinus officinalis L. es una fuente importante de compuestos antioxidantes de naturaleza polifenlica que presenta propiedades biolgicas como antibacteriano, antiinflamatorio y antitumoral. Previamente reportamos que la eficacia antimicrobiana in vitro de diferentes extractos de romero estandarizados en el contenido de cido rosmarnico, cido carnsico y carnosol dependa de la composicin de sus polifenoles (Moreno et al., 2006). El objetivo de este trabajo es estudiar la eficacia antibacteriana in vivo de un extracto etanlico de R. officinalis contra la bacteria patgena Staphylococcus aureus, en dos modelos de infeccin en piel de ratn comparando su potencia
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antimicrobiana con el antibitico comercial cido fusdico. MATERIALES Y MTODOS Material vegetal El material vegetal fue cosechado en marzo del 2008 en el Valle de Lerma (Salta, Argentina). El extracto de R. officinalis L. fue obtenido a partir de hojas secas por extraccin etanlica y se determin por HPLC la composicin de polifenoles (cido carnsico, carnosol y cido rosmarnico) como se describi previamente (Moreno et al., 2006). El extracto de romero seco se almacen a -20 C. Preparacin de inculo bacteriano Se prepar un cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus ATCC 25923 en caldo Mueller Hinton (DIFCO) que se creci durante 20 horas a 37 C con una agitacin de 250 rpm, luego se midi la concentracin bacteriana por densidad ptica a 625 nm y se diluy a una concentracin final de 0,5 Mc Fardland correspondiente a 1 x 108 UFC (unidades formadoras de colonias)/mL. Animales y modelos de infeccin en piel de ratn Se utilizaron ratones hembras BALB/cAnNCrl de 2 meses de edad y peso variable (19-21 g), criados en la Fundacin Instituto Leloir. El protocolo de trabajo fue aprobado por el bioterio del Instituto Leloir, y cumple con el reglamento interno vigente y con la legislacin nacional (Disposicin 6344/96 de la Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica y Resolucin 617/2002 del Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria). Responsable a cargo del bioterio Adriana Fontanals. Los ratones fueron anestesiados va intraperitoneal con una dosis de 100 mg/kg de ketamina (Ketonal, Richmond) y 5 mg/kg de clorhidrato de xilacina (Xilacina 20, Richmond). Luego se procedi a rasurar con gillette la parte dorsal izquierda del animal para eliminar el pelaje. Se establecieron dos modelos de infeccin en piel de ratn: Modelo de infeccin superficial. Se utiliz el modelo de infeccin superficial previamente descripto por Kugelberg et al. (2005), con algunas modificaciones. Se removieron las primeras capas drmicas del rea de la piel de ratn rasurada, con tres pasajes de hoja de afeitar de acero inoxidable
Barni et al.
para facilitar la infeccin bacteriana. Bajo campana de flujo laminar se colocaron 5 L del inculo bacteriano (5 x 105 bacterias) sobre una superficie de piel de 2 cm2. Pasados 5 min, para dar lugar a la absorcin de las bacterias en la piel del ratn, se coloc un apsito estril sobre el rea inoculada. Modelo de infeccin subcutnea: Como describi Gisby et al. (2000), se estableci el nmero de bacterias adsorbidas en 1 cm de hilo de ciruga en ensayos in vitro (7,5 x 104 bacterias). Para llevar a cabo la infeccin subcutnea se colocaron hilos de ciruga de 10 cm en tubos con 5 mL del inculo bacteriano (1 x 108 UFC/mL) y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Luego cada hilo inoculado se enhebr en una aguja de ciruga. Esta se introdujo en la parte rasurada del ratn de modo de atravesar la dermis sin llegar al msculo carnoso y dejando 1 cm de hilo bajo la piel. Luego se anudaron y se cortaron los extremos del hilo. Para permitir la penetracin de las cremas de tratamiento se realiz un incisin con bistur por debajo de la sutura en la misma direccin que el hilo (Gisby et al., 2000). Posteriormente se coloc un apsito estril sobre la herida. Tratamientos El extracto seco de R. officinalis L., empleado para la preparacin de los tratamientos, contiene un porcentaje total de compuestos fenlicos de 23%, que comprende un 20% de diterpenos fenlicos (cido carnsico 10% y su derivado carnosol 10%) y un 3% de cido rosmarnico, determinados por HPLC. Se realizaron dos preparaciones del extracto de romero que contienen diferentes concentraciones de compuestos polifenlicos bioactivos: 2,3% (p/p) y 4,6% (p/p), respectivamente. Para ello, se emulsion de manera homognea el extracto de R. officinalis L. con crema base hidrosoluble comercial. El placebo consisti en la aplicacin de la crema base hidrosoluble sin ningn agregado, y se consider como control negativo. Como control positivo se utiliz el antibitico tpico comercial, cido fusdico (FUSIMED, Laboratorio Cassar) al 0,5; 1 y 2%. Las dosis aplicadas fueron de 20 mg/2 cm2 de piel. Ensayos y diseo experimental Para el modelo de infeccin subcutneo se realizaron 2 ensayos que difieren en el diseo temporal y cantidad de dosis aplicadas. Uno consisti en la aplicacin de 2 dosis a las 4 y 6 h postinoculacin y la recuperacin de bacterias de la piel a
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las 8 h post-inoculacin (Fig. 1A). En el otro ensayo se aplic una nica dosis de tratamiento a las 4 h post-inoculacin y la recuperacin de bacterias se realiz a las 6 h post-inoculacin (Fig. 1B). Para el modelo de infeccin superficial se realiz el ensayo que consisti en la aplicacin de 2 dosis a las 4 y 6 h post-inoculacin y la recuperacin de bacterias se realiz a las 8 h post-inoculacin (Fig. 1A). La primera dosis de los tratamientos se aplic a las 4 h post-inoculacin como se describi previamente (Gisby et al., 2000) dado que la colonizacin bacteriana se establece dentro de dicho perodo.
Figura 1. Diseo experimental. A - Modelo de infeccin subcutneo y superficial (2 dosis). B - Modelo de infeccin subcutneo (1 dosis).
Por lo tanto, para evaluar la accin antibitica del extracto de romero se realizaron 3 tipos de ensayos diferentes en total, considerando los dos modelos de infeccin, variable tiempo y dosis aplicadas. En cada ensayo se incluyeron los controles: placebo, sin tratamiento y el control positivo (cido fusdico a tres concentraciones). Recuperacin de bacterias de la piel de ratn La determinacin de la concentracin bacteriana post-tratamiento en ambos modelos se realiz segn Gisby et al. (2000). Se retir con bistur el rea de 2 cm2 de la piel tratada, se coloc en un tubo con 1 mL de caldo Mueller Hinton donde se homogeneiz con un grinder. Luego se realizaron diluciones del homogenato en solucin fisiolgica y se sembraron alcuotas de 100 L en placas de Petri con agar Mueller Hinton. Las placas se incubaron a 37 C durante 24 h y posteriormente se determinaron las UFC/mL. Se realiz un control de inculo recuperando las bacterias de la piel del ratn sin tratamientos previos para confirmar su viabilidad en la piel.
Barni et al.
Anlisis estadstico Se utiliz el programa Info Stat para el anlisis estadstico. El test t de Student ( = 0,001) se aplic a muestras independientes para cada grupo de tratamiento (n = 6). El promedio del nmero de bacterias (UFC) recuperadas de la piel de ratn (n = 6) en cada tratamiento con su respectiva barra de error se transform a log10 UFC/herida. RESULTADOS Y DISCUSIN Se utilizaron dos modelos de infeccin en piel de ratn para determinar la actividad antibitica del extracto de R. officinalis. El modelo de infeccin subcutneo fue ensayado para estudiar el efecto del extracto de romero sobre infecciones que se producen a niveles intradrmicos, como por ejemplo las infecciones producidas en heridas quirrgicas. Por el contrario, el modelo superficial fue diseado para estudiar infecciones provocadas en zonas drmicas expuestas al ambiente. En el modelo de infeccin superficial los promedios de concentracin bacteriana recuperados de la piel de ratn para cada tratamiento expresados en UFC/herida fueron: placebo (1,55 x 104 5,47 x 102), no tratado (1,25 x 104 8,99 x 102), extracto de R. officinalis 2,3% (2,02 x 101 4,12), extracto de R. officinalis 4,6% (0), cido fusdico 0,5% (1,27 x 101
1,63), cido fusdico 1,0% (0), cido fusdico 2,0% (0). Mientras que para el modelo de infeccin subcutneo con el diseo experimental (Fig. 1A), los promedios para cada tratamiento fueron: placebo (1,95 x 104 5,47 x 102), no tratado (1,72 x 104 5,61 102), extracto de R. officinalis 2,3% (2,57 x 102 22,03), extracto de R. officinalis 4,6% (0), cido fusdico 0,5% (1,78x 101 3.33), cido fusdico 1,0% (0), cido fusdico 2,0% (0). En el tercer ensayo, modelo de infeccin subcutneo con el diseo experimental (Fig. 1B) los resultados fueron: placebo (1,02 x 104 5,63 x 102), no tratado (1,10 x 104 1,74 103), extracto de R. officinalis 2,3% (1,21 x 102 30,09), extracto de R. officinalis 4,6% (0), cido fusdico 0,5% (1,27 x 102 27), cido fusdico 1,0% (4,40 x 101 3,52), cido fusdico 2,0% (0). Para los 3 ensayos se determin que los resultados individuales de los tratamientos: placebo y no tratado, no fueron significativamente diferentes ( = 0,001). En cada ensayo se compararon los resultados individuales de los tratamientos: extracto de R. officinalis 2,3% y cido fusdico 0,5% y se obtuvo que no fueron significativamente diferentes ( = 0,001) para el modelo de infeccin superficial y para el subcutneo con una dosis, mientras que para el modelo subcutneo con dos dosis si fueron significativamente diferentes (P<0,001).
Tabla 1. Actividad antibitica in vivo del extracto de R. officinalis. log10 UFC/herida Tratamiento Modelo de infeccin superficial (2 dosis)* Modelo de infeccin subcutneo (2 dosis)* Modelo de infeccin subcutneo (1 dosis)**
Extracto de R. officinalis (%) 2,3 4,6 cido fusdico (%) 0,5 1 2 1,30 0,24 2,41 0,27 2,07 0,08 -
1,11 0,04 -
1,24 0,16 -
2,10 0,07 1,64 0,03 -
4,19 0,38 4,29 0,30 4,01 0,02 Placebo 4,10 0,35 4,23 0,24 4,00 0,02 No Tratado * Se realiz segn diseo experimental A. ** Se realiz segn diseo experimental B. ( - ) Ausencia de crecimiento bacteriano. Los tratamientos fueron realizados con al menos n = 6 animales. cido fusdico, control positivo. www.blacpma.org Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (3) 2009 | 222
Barni et al.
Se determin que los resultados de los tratamientos con extracto de R. officinalis 2,3% y 4,6%, lograron ser significativamente diferentes (P<0,001) a los obtenidos con el tratamiento placebo para los tres ensayos realizados. El extracto de R. officinalis 2,3% logra reducir entre 2-3 log10 UFC/herida segn el modelo de infeccin y diseo experimental utilizado, logrando una accin bacteriosttica sobre S. aureus (Tabla 1). Mientras que el tratamiento con extracto 4,6% logra inhibir el crecimiento bacteriano en su totalidad ejerciendo un efecto bactericida en los tres ensayos evaluados. Es importante destacar que el mismo efecto se logra por la aplicacin de una nica dosis en el modelo subcutneo. Estos resultados demuestran que el extracto vegetal presenta una accin antibitica eficaz in vivo contra la infeccin de la bacteria patgena S. aureus. CONCLUSIN Los resultados evidenciaron la accin bacteriosttica del extracto de R. officinalis que contiene un 2,3% de polifenoles activos y la accin bactericida del extracto que contiene un 4,6% de polifenoles activos contra la bacteria patgena S. aureus en los dos modelos de infeccin en piel de ratn. Adems se estableci que el extracto de romero tuvo una potencia antibitica in vivo comparable a la del cido fusdico. Los sistemas ensayados, de carcter preclnico, aportan informacin cientfica y son tiles para la evaluacin de los compuestos vegetales como potenciales drogas teraputicas que podran ser competentes con los antibiticos de uso comn que actualmente ya no son efectivos contra las bacterias resistentes. Por dicha razn es pertinente la evaluacin que hoy en da se lleva a cabo en nuestro laboratorio, sobre los mecanismos de accin de los compuestos activos que componen el extracto de R. officinalis L. y el estudio de la accin antibitica de los bioactivos combinados con otras drogas, para aumentar su eficiencia antimicrobiana sobre un amplio espectro bacteriano.
REFERENCIAS
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The effect of Minthostachys verticillata essential oil on the immune response of patients allergic to dust mites
[Efecto del aceite esencial de Minthostachys verticillata sobre la respuesta inmune de pacientes alrgicos a caros del polvo]
Laura CARIDDI1,*, Marina MOSER1, Melisa ANDRADA1, Mirta DEMO1, Julio ZYGADLO2, Liliana SABINI1, Ana MALDONADO1
1
Department of Microbiology and Immunology, Universidad Nacional de Ro Cuarto, Ro Cuarto, Crdoba, Argentina 2 Faculty of Exact, Physical and Natural Sciences, Universidad Nacional de Crdoba, Crdoba, Argentina.
Abstract
The essential oil from leaves of Minthostachys verticillata was obtained by steam distillation and analyzed by gas chromatography. Peripheral blood mononuclear cells from allergic patients were stimulated with essential oil. By application of MTT or 3,(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide colorimetric test the proliferation was assayed. In lymphocyte cultures CD4+, CD8+ and B cells were quantified, and in supernatants, IFN- and IL13. The liberation of -hexosaminidase enzyme was determined for basophils with essential oil added and challenged with allergen and its effects were compared with those of anti-allergic drugs. The main constituents identified were pulegone, menthone and limonene. Essential oil increased absolute values of CD4+, CD8+ and B cells (p<0.002), stimulated IFN- synthesis and reduced IL-13 levels. Essential oil diminished -hexosaminidase liberation by basophils (p<0.0001), with effects majors to those of the drugs tested. Essential oil stimulated the Th1 deviation and reduced -hexosaminidase enzyme liberation by basophils from allergic patients. Keywords: Minthostachys verticillata; Essential oil; Immunomodulator; Basophil degranulation; -hexosaminidase.
Resumen
El aceite esencial de hojas de M. verticillata fue obtenido por destilacin en corriente de vapor y analizado por cromatografa gaseosa. Clulas mononucleares de sangre perifrica de pacientes alrgicos, fueron estimuladas con aceite esencial. La proliferacin fue ensayada mediante mtodo colorimtrico del MTT o 3,(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide. Se cuantificaron clulas CD4+, CD8+ y B en cultivos de linfocitos y en sobrenadantes, IFN- e IL-13. Se determin la liberacin de la enzima -hexosaminidasa de basfilos adicionados de aceite esencial, y desafiados con el alergeno. Los efectos del aceite esencial fueron comparados con los de drogas antialrgicas. Los principales constituyentes identificados fueron pulegona, mentona y limoneno. Aceite esencial increment los valores de clulas CD4+, CD8+ y B (p<0.002), estimul la sntesis de IFN- y redujo los niveles de IL-13. El aceite esencial disminuy la liberacin de -hexosaminidasa de basfilos (p<0.0001) con mayores efectos que los de las drogas ensayadas. Aceite esencial estimul la desviacin Th1 y redujo la liberacin de la enzima -hexosaminidasa de basfilos de pacientes alrgicos. Palabras Clave: Minthostachys verticillata; Aceite esencial; Inmunomodulador; Desgranulacin de basfilos; -hexosaminidasa.
Recibido | Received: March 19, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: May 18, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: May 25, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was supported by grants from PICTOR 8/20325 BID 1728/OC-AR, Agencia Crdoba Ciencia-Nacin, Resolution #222, years 2007/09, and SeCyT, Resolution #425, years 2007/09, from Universidad Nacional de Ro Cuarto and CONICET. This article must be cited as: Laura Cariddi, Marina Moser, Melisa Andrada, Mirta Demo, Julio Zygadlo, Liliana Sabini, Ana Maldonado. 2009. The effect of Minthostachys verticillata essential oil on the immune response of patients allergic to dust mites. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(3):224 233. {EPub May 25, 2009}.
*Contactos | Contacts: E-mail: lcariddi@exa.unrc.edu.ar; Tel.: 54-0358-4676433; Fax: 54-0358-4676231.
BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.
Cariddi et al.
Immunomodulatory effects of Minthostachys verticillata essential oil
INTRODUCTION Allergic pathologies occur at an incidence of up to 30% in the population. Allergic patients are generally treated with corticoids and/or antihistamines, which constitute the anti-inflammatory therapies of choice because they block many inflammatory routes that are abnormally activated in this type of pathology (Barnes, 2001). Nevertheless, these methods are not always effective and can produce several adverse effects. Corticoids suppress both the innate inflammatory response and cellular immunity, inhibiting synthesis of IL-1, on behalf of macrophages, and of IL-2, on behalf of T cells. A correlation has also been discovered between their anti-lymphoproliferative effects and capacity to produce apoptosis in lymphocyte populations (Winiski et al., 2007). Antihistamines can produce diverse adverse effects such as anemia or reduced platelets, reduced white cells and bone marrow failure (Leonardi et al., 2007). In addition, some allergic patients display no response to treatment with these drugs, which, in conjunction with the fact that this resistance has also been observed in other inflammatory diseases (Barnes, 2001), justifies the search for new immunomodulators. A quarter of the drugs used in industrialized countries are obtained from the Plant Kingdom. Current investigations aim to find plant/herbal medicines whose therapeutic indices: permit phytomedicinal application, are low-priced and do not bring about adverse reactions or undesirable indirect effects, in order to be administered as an alternative or complementary therapy for conventional treatments. Several in vitro or in vivo investigations have demonstrated that different extracts or pure compounds derived from medicinal plants can modulate the Th1/Th2 response, towards the Th1 profile, producing a beneficial effect for allergic patients (Na et al., 2002; Ko et al., 2004; Lee et al., 2006; Park et al., 2009). Minthostachys verticillata (Griseb.) Epling, (Labiatae) commonly referred to as peperina', has a wide geographical distribution and is known for its ethno-medicinal properties. It is used as a digestive, a sedative, an anti-spasmodic, a stimulant and a bronchial-dilating agent (Ratera & Ratera, 1980). Previous studies have revealed that the essential oil derived from this herb presents antimicrobial activity against some staphylococcal strains and antiviral properties against HSV-1, strain RC/79 of PrV and Herpes Suis Virus (Primo et al., 2001). Furthermore, in
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an in vitro study carried out on patients allergic to environmental fungi, essential oil, in concentrations of mg/mL, revealed mitogenic properties similar to those of PWM on human lymphocytes (Cariddi et al., 2005), were able to stimulate CD8+ T cells, increased levels of IFN- and demonstrated anti-allergic properties majors to those of dexamethasone and theophylline (Cariddi et al., 2006). The purpose of this investigation was to determine if the essential oil from M. verticillata, at concentrations smaller than previously evaluated, can modulate the Th1/Th2 response in allergic patients with history of allergies and asthma, and to verify if it maintains its inhibiting properties on basophil degranulation in these patients, comparing its effects with those of conventional anti-allergic drugs. MATERIALS AND METHODS Plant samples Green leaves and thin stems of Minthostachys verticillata (Griseb.) Epling (Labiatae) were collected, during morning hours, from the city Santa Rosa in the Crdoba province, Argentina, in April 2004. The plant was identified by Dr. Margarita Grosso, professor in the Area of Botany of the Universidad Nacional de Ro Cuarto, and a voucher specimen was stored in the RCV (Ro Cuarto Vasculares) herbarium as file #1955. The morphological characterization of the plant was executed macro-and microscopically to confirm the identity of these specimens. The aerial parts of the plant were made up of the leaves and parts of the stem. The oil was isolated from the aerial parts. Oil isolation To prepare the essential oil (EO), 60 g of ground plant material were hydro-distilled for 3 h using a Clevenger-type apparatus, yielding 4.8% of the oil. The oil was separated from the aqueous phase, dried over anhydrous Na2SO4 and stored in the dark at -20 C until use (Senatore, 1998). In order to perform the immunological in vitro assays, various concentrations were obtained, and the oil was emulsified in dimethylsulfoxide (DMSO) and diluted in Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) medium. Identification and quantification of EO compounds by Gas chromatography (GC) Quantification of components present in the oil sample was made by measuring the area under each peak of the chromatogram (Zygadlo et al., 1996;
Cariddi et al.
Cariddi et al., 2007). Briefly, analytical GC was performed on a Shimadzu GC-R1A gas chromatograph fitted with a DB5 capillary column (30 x 0.25 m). Carrier gas N2, flow rate 1.5 mL/min, split mode. Oven temperature programmed from 40260 C at 3 C/min. Injector temp 280 C. Detector used FID, temperature 300 C. The identification of the compounds was made comparing their retention times against standard pure drugs injected in the same conditions. Human blood sample The sample included peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and basophils from 57 allergic patients, 27 male and 30 female (ages 1 to 30, average value: 17) with positive prick tests for allergy to dust mites (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae). This study was approved by the Universidad Nacional de Ro Cuarto Institutional Review Board. In accordance with ethical standards, parents of underage children were properly informed of the study and signed an agreement authorizing the test. The characteristics of these patients are shown in Table 1. Skin prick testing was performed using a standard technique (single-headed lancet technique) and standard commercial solutions (International Pharmaceutical Immunology SA). All tests were performed by a single operator, an allergist doctor. Each patient underwent skin prick testing for allergens. Saline solutions and histamine were used as negative and positive controls, respectively. The size of the wheal was measured after 15 min and a positive result was noted if the wheal size was at least 3 mm greater than the negative saline control (Barbaud 2001). The allergen extracts were provided by International Pharmaceutical Immunology, S.A. (Alicante, Spain) Dropper vials were used, containing 3 mL of the antigen extract in 50% glycerin solution, plus 0.42% phenol each (concentration = 10.000 PNU/mL). The in vitro assays were performed with the same extracts. Ten milliliters of venous peripheral blood were obtained from each patient and stored in sterile tubes containing heparin. PBMCs cultures The effects of different concentrations (6 x 103, 600, 60, 6, 0.6, 0.06 and 0.006 g/mL) of EO on the proliferation of lymphocyte from healthy individuals
were evaluated. A dose-response curve was constructed in a previous in vitro assay. EO visibly demonstrated lymphoproliferative capacity, with dosedependency. The concentration of 6 g/mL obtained constituted the highest Proliferation Index (PI) PBMCs were isolated from blood samples using Ficoll-Hypaque (Hystopaque-1077; Sigma, St. Louis, US) centrifugation. The cellular proliferation assays were carried out with the Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes Invitrogen Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA). Cells (2 x 105/mL), with a final volume of 200 l, were cultured in 96-well sterile microplates containing RPMI-1640, to which was added 25 mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 5% FCS, 50 mM 2-ME, 100 g/mL streptomycin and 100 g/mL penicillin (Merck). Cultures were stimulated with 10 g/mL PHA, 5 g/mL ConA and 6 g/mL oil. Control lymphocyte cultures were performed using only media. Cells were incubated during 72 h at 37 C with 5% CO2 in a humid atmosphere. An aliquot of 100 L of fresh RPMI-1640 and 10 L of MTT (3,(4,5-dimethyl2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) solution (1 mg/mL of MTT in PBS 0.01 M pH 7.2) was added to each well and the plate was incubated at 37 C with 5% CO2 for 4 h. After incubation, the plate was centrifuged and supernatants, removed. DMSO (50 L) was added to each well in order to dissolve the formazan crystals that resulted from the conversion of the salt (MTT). The plate was read in a UV spectrophotometer (Labsystems Multiskan MS) at 570/690 nm wave lengths. The cellular expansion reached by the classic mitogens was compared with that produced by EO by calculating the PI according to the following formula: PI = stimulated cells/ non-stimulated cells > 1.20 (Tuchscherer et al., 2002). CD4+ and CD8+ T cells and B cells quantification by immunofluorescence (IF) The CD4+ and CD8+ T cells present in the EOstimulated cultures were counted with the indirect IF technique using anti-human CD4 and anti-human (Sigma, St. Louis, US) CD8 monoclonal antibodies (Sigma, St. Louis, US), and B cells were counted with direct IF using anti-human -globulin-FITC (Sigma, St. Louis, US) (Edidin, 1989).
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Cariddi et al.
Table 1. Characterization of select allergic patients, including: age in years, symptoms, total IgE values and skin prick testing results. Skin prick testing with dust mite N clinical history 5 9 10 12 13 14 15 16 18 20 21 23 27 28 33 35 36 38 39 41 44 45 47 50 51 52 53 54 55 56 57 Age (years) 2 5 5 6 6 7 8 8 9 11 11 12 15 17 19 21 21 23 23 26 27 27 28 29 29 29 29 30 30 30 30 Symptoms As Rh Rh Ecz As Rh As Rh Sin Pr As Rh Rh, As Rh Si As Rh As Rh Rh As As Rh Rh Si Rh Rh Ecc As Rh As Rh Ecz As Rh Ecz Rh Ecz As Rh As Rh As As RhEcz Rh Ecz As Ecz Rh As Rh Sin Pr As Rh Rh, As As Ecz Rh As Rh Sin Pr As Rh Rh, As IgE (UI/mL)* 618 190 790 1133 1664 1236 365 760 1000 1321 786 420 460 350 512 122 122 280 139 141 512 123 790 1560 1133 355 236 568 1233 965 1236 D. pteronyssinus ++ +++ +++ ++ ++ ++ + ++++ + ++ ++ ++ +++ + ++++ + + + + + + + + + ++ + ++ + ++ + ++ D. farinae +++ + ++ +++ + + + ++ + ++ ++ ++ +++ + ++ + + + + + + + + + +++ + + + +++ + +
As - Asthma; Rh - Rhinitis; Ecz - Eczema; Pr - Prurigo; Si - Sinusitis. D. Pteronyssinus - Dermatophagoides pteronyssinus; D. Farinae Dermatophagoides farinae. Prick test: scale from + to ++++ according to Bousquet (1988). * IgE was measurement by ELISA Kit (Iema Well de Radim, Rome, Italy)
IFN- and IL-13 measurement IFN- and IL-13 synthesis was quantified in EOstimulated supernatants of PBMC cultures from allergic patients, collected at 60 h incubation to optimize the detection of cytokine levels. IFN- detection was performed using a commercial Human Interferon Gamma (Hu- IFN-) ELISA kit (PBL Biomedical Laboratories, USA) and the lower limit of detection for the cytokine assay was less than 2 pg/mL (Kelder et al., 1986). IL-13 detection was performed using a commercial EHIL13 Human Interleukin-13 ELISA Kit (Pierce Endogen, France) and the lower limit of detection for the cytokine assay was less than 7 pg/mL (Ly et al., 2005). This assay was carried out with PBMC cultures stimulated with: a) allergen alone (a suspension of dust mite at 10.000 PNU/mL) and b)
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6 g/mL of EO, plus allergen. As a control, these cytokines were quantified in PBMC cultures with media alone. Each instance was triplicated. -hexosaminidase enzyme release assay The effects of different concentrations (160, 80, 40, 20, 10 and 1 g/mL) of EO on the release of - hexosaminidase enzyme were evaluated constructing a dose-response curve in a previous assay. It was observed that EO reduced the levels of enzyme released in a dose-dependent way. The concentration of 10 g/mL was that which produced the highest diminution of the release of enzyme. Basophils of peripheral blood were obtained by density gradient using 6% of dextran 70 with NaCl 0.9%. The interphase that contained the cells was centrifuged and re-suspended in RPMI-1640. An
Cariddi et al.
aliquot from the cellular suspension was taken and the cells were dyed with Toluidine Blue that it dyes only basophils. The cellular count was realized in camera Fuch Rosenthal in optical microscope. The concentration of basophils was increased 100 to 200 times after the treatment with dextran (from 1-2 to 128-256 cells in 64 fields). It had contamination by other PMN, such as neutrophils and eosinophils. Fifty microliters of the basophil suspension at a concentration of 1 x 105 cells/mL were placed in each well of the 96-well microplate and pre-incubated for 15 min at 37 C with the specific allergen alone (dust mite suspension), and the allergen plus: a) 0.04 mg/mL dexamethasone (Sidus); b) 0.2 mg/mL theophylline (Phoenix); c) 0.2 mg/mL disodium cromoglicate (Phoenix); d) 0.05 mg/mL ipratropium bromide (Altana Pharma), or e) 10 g/mL essential oil. The negative control values were obtained using RPMI1640 and the cells alone, without any allergen stimulation, in order to view unspecific spontaneous degranulation. In addition, montelukast (0.04 mg/mL) (Merck) was used as a negative control of hexosaminidase enzyme inhibition because it acts in the late phase of the allergic reaction, inhibiting leukotriene receptors. Blank values were obtained using just the media or DMSO. Following incubation, 50 L of the chromogenic substrate for the enzyme hexosaminidase (4-nitrophenyl-N-acetyl--D-glucosaminide) (Sigma-Aldrich, Inc, St. Louis, USA) 1 mmol/L, was added to each well and dissolved in 0.1 mol/L of citrate buffer, pH 5. The system was incubated at 37 C for 1 h. The reaction was stopped with 200 L of carbonate buffer 0.1 M, pH 10.5 per well. The product of the cleavage (4-nitrophenol) was interpreted by reader ELISA (Labsystems Multiskan MS) at 405 nm (Shibata et al., 1996). The percentage of - hexosaminidase release inhibited was calculated according to the formula: Inhibition % = (A B) x 100/A, where A is the amount of -hexosaminidase released by basophils in the presence of the specific allergen alone and B, in the presence of the allergen aggregates from the anti-allergic drugs or oil (Na et al., 2002). Statistical analysis All of the values obtained in the assays carried out during this investigation were expressed in averages and standard deviation. The parameters were evaluated using the program GraphPad Prism version 4.0 (Inc. San Diego, USA, 2004) and compared with the parametric test t-Student for twin samples. Statistical
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differences were considered significant when the value was p <0.05. RESULTS Identification and quantification of essential oil compounds GC analysis revealed a composition not significantly different than those reported previously by the authors (Zygadlo et al., 1996; Cariddi et al., 2007). The main components were pulegone 63.0%, menthone 16.4% and limonene 1.9%, accompanied by other minor terpenoid components such as -pinene (0.2%), -pinene (0.3%) and 1,8-cineole (0.1%) were found in lower quantities in accordance with previous reports. Lymphocyte response to stimulation with essential oil EO (6 g/mL) stimulated the proliferation of lymphocyte from allergic patients, revealing significant statistical differences in comparison with the cultures lacking stimulus (p<0.0001) and no differences when compared to PHA (p=0.1396) or ConA (p=0.1749). The PI calculated for EO, PHA or ConA, were > 1.20, indicating cellular proliferation (Fig. 1). Absolute values of CD4+ and CD8+ T cells and B cells in cellular cultures stimulated with EO revealed an increase (p<0.002 to each one of cell types) in regard to the cultures without stimulus (Table 2). In supernatants of EO-stimulated cultures, values of IFN- revealed an increase in regard to cultures without stimulus (p<0.001) and cultures stimulated with allergen alone (p<0.0001) (Fig. 2). IL-13 levels were greater in the cultures stimulated with allergen than in cultures without stimulus (p<0.0001). In allergen-stimulated cultures with EO, the levels of IL13 were visibly reduced in regard to cultures stimulated with the allergen alone (p<0.0001) (Fig. 2). Effects of essential oil on basophil degranulation Basophils of all the allergen-challenged patients released high amounts of -hexosaminidase enzyme in comparison with the values of enzyme released spontaneously (p<0.01) (Fig. 3). The anti-allergic drugs, excluding montelukast, reduced the in vitro levels of released enzyme in comparison with basophils challenged with the allergen alone (p<0.02) (Fig. 3). This result demonstrated that the plant fraction did not reveal allergenic effects in vitro. The
Cariddi et al.
addition of EO to allergen-challenged basophils reduced -hexosaminidase liberation to the same levels as those of the spontaneous release of the enzyme. The inhibiting activity of the oil at 10 g/mL on the enzyme was higher than the one produced by standard drugs at concentrations: 0.04 mg/mL of dexamethasone, 0.2 mg/mL of theophylline, 0.2 mg/mL of
disodium cromoglicate and 0.05mg/mL of ipratropium bromide (p<0.05 for each one) (Fig. 3). The percentage of inhibition of -hexosaminidase released under different treatments is shown in Table 3 and the essential oil is significantly active.
Tabla 2. Average absolute values + SD of total leukocytes from allergic patients and T CD4+, T CD8+ and B cells in cultures without stimulus (W/S) or stimulated with essential oil (EO). n Total leukocytes/mm3 CD4+ W/S cultures CD8+ B cells Cultures stimulated with EO CD4+ CD8+ B cells
22
6432.6 + 1321,6
1677 + 65
714 + 60
705 + 57
2174 + 82
988 + 60
916 + 61
Table 3. Percentage + SD of inhibition of -hexosaminidase enzyme release from basophils of allergic patients by anti-allergic drugs or essential oil. Anti-allergice drugs or essential oil n=57 Inhibition (%) dexa 44.8 + 8 theo 47.6 + 10 crom 44.7 + 7 Ip 46.9 + 5 EO 54.2 + 7
Dexa - dexamethasone; theo - theopylline; crom - disodium cromoglicate; Ip - ipratropium bromide; EO - essential oil.
Figure 1. Proliferation of lymphocytes from allergic patients (n=57), stimulated with 6 g/mL essential oil (EO) from M. verticillata, according to MTT colorimetric assay.
allergic patients 2.5
Figure 2. Quantification of IFN- and IL-13 in supernatants of lymphocyte cultures from allergic patients (n=38).
IL-13 200 IFN-
e c f
concentration (pg/ml)
c b
150
Lymphocyte proliferation (OD 570/690 nm)
2.0
100
1.5
a
50
b d
a
1.0
0.5
0
/S m L) /S en en al le rg (6 m g/ m L) EO + al le rg (6 m g/ rg en al le W W
0.0
W/S
ConA (5 ug)
PHA (10 ug)
EO (6 ug)
PHA (10 g/mL) or ConA (5 g/mL) were used as positive controls of proliferation, and lymphocyte cultures without stimulus, as negative controls. W/S, without stimuli; a vs d p < 0.0001; b vs d p = 0.1396; c vs d p = 0.1749; PI (PHA) = 1.81 + 0.12; PI (ConA) = 1.90 + 0.11; PI (EO) = 1.87 + 0.10 www.blacpma.org
IFN- was quantified in lymphocyte cultures without stimulus or stimulated with 6 g/mL essential oil (EO) from M. verticillata. IL-13 was quantified in lymphocyte cultures without stimulus, stimulated with allergen alone or stimulated with allergen and with 6 g/mL EO from M. verticillata added. W/S, without stimuli; a vs b p= 0.1332; a vs c p<0.001; b vs c p<0.0001, d vs e p<0.0001; d vs f p<0.0001, e vs f p<0.0001.
EO
Cariddi et al.
Figure 3. The amount of -hexosaminidase enzyme released by allergen-challenged basophils from allergic patients (n=57) was reduced by essential oil (EO) and several anti-allergic drugs, excluding montelukast.
80
70 60 50 40
*
d e f g h
30 20 10 0
a b
Basophils were incubated with EO alone, without allergen, and no significant liberation of the enzyme was observed. Cells without the addition of allergen and cells with addition of dimethylsulfoxide (DMSO) were also evaluated as controls. a vs c p< 0.0001; a vs b p = 0.3373; b vs c p <0.002; c vs d p < 0.01; c vs e p < 0.002; c vs f p< 0.01; c vs g p < 0.002; c vs h p < 0.0001; c vs i p = 0.8245; h vs * p = ns; h vs i p<0.0001; d vs i p < 0.01; e vs i p< 0.002; f vs i p< 0.02; g vs i p<0.003. blank, media alone; DMSO, dimethylsulfoxide; bas, basophils; allerg, allergen ; dexa, dexamethasone ; theo, theopylline ; crom, disodium cromoglicate; iprat, ipratropium bromide; EO, essential oil; mont, montelukast
DISCUSSION In the present study, the essential oil from M. verticillata was composed mainly by mono-and sesquiterpenes. Zygadlo et al. (1996) analyzed oils of M. verticillata of different geographic areas from Argentina. They found that the main components are terpenes and seem to be divided in three chemotypes: carvone, thymol-carvacrol and predominantly pulegone-menthone. Our results agree those of De Feo et al. (1998), Gonzlez Pereyra et al. (2005), Cariddi et al. (2007), Maldonado et al. (2007), who studied M. verticillata oil and reported the composition. At optimal concentrations, EO from M. verticillata was able to stimulate in vitro the lymphocyte proliferation in patients allergic to dust mites with effects similar to those of PHA or ConA. These lectins bond specifically to carbohydrate components, including proteins of the TcR-CD3 complex. This produces the activation of several
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types of enzymatic routes which involve Ras-Map kinases, calcium-dependent PLCl and PLClDAG, key participants in cellular proliferation, differentiation and apoptosis (Crespo & Gutkind, 2004). According to some authors in vitro studies of allergic patients have shown increased values of CD4+ T cells (1500-1750 cells/mm3), differentiating towards the Th2 profile; a decrease in CD8+ T cells (370-520 cells/mm3) (Bratke et al., 2006) and high values of B cells (480-650 cells/mm3) (Mohamed et al., 2003) in comparison with non-allergic individuals. In this study EO (6 g/mL) increased in vitro absolute values for both T CD4+ and CD8+ cells subpopulations in patients allergic to dust mites, indicating that this plant fraction stimulated cellular immunity. These data are compatible with those from a previous in vitro study in which high EO concentrations (mg/mL) increased values of CD8+ T cells in both patients allergic to environmental fungi and healthy individuals alike (Cariddi et al., 2006). The EO also increasing the absolute values of B cells. Previously we demonstrated that EO had effects similar to those of PWM, mitogen of B and T cells, on lymphocyte proliferation in both allergic and healthy individuals (Cariddi et al., 2005). These results correspond with those of this investigation, where we demonstrated that EO was able to stimulate both T and B cells. Treatment with the EO increased the levels of IFN-, which is why it is suggested that the EO-activated CD4+ T cells in this study could be Th1 cells, which produce IFN-. EO was able to stimulate in vitro CD8+ T cells as well, also producers of IFN-. In addition, we observed that EO reduced IL-13 values in lymphocyte cultures co-stimulated with the allergen, as compared to cultures stimulated with allergen alone. These data demonstrated that EO modulated the in vitro Th1/Th2 response, favoring Th1 deviation. Anti-allergic therapies aim to redirect the profile of Th2 cells towards Th1, increasing IFN- synthesis and decreasing IL-4 and IL-13 values, thus reducing IgE levels (Bang & Plosker, 2004). It was confirmed that the vegetal derivative acts on the immune response by means of the stimulation of the Th1 profile. In previous studies this was deduced of the cuantification of IFN- and LT CD8+ (Cariddi et al., 2006, 2007; Maldonado et al., 2007). -hexosaminidase, an acid hydrolase, is released along with histamine when basophils are activated. Therefore, -hexosaminidase is accepted as a degranulation marker (Shibata & Yagi, 1996).
-hexosaminidase released (%)
bl an k D M S ba O so ph ba ils s ba + E O s ba s+ + a lle al rg l ba erg +d s+ ex al le a ba s+ rg+ th al eo l ba erg +c s+ r al om le ba rg+ ip s+ ra al ba t s+ ler g+ al EO le rg + m on t
Cariddi et al.
During the -hexosaminidase enzyme release assay, we confirmed that the anti-allergic drugs tested, excluding montelukast, were able to reduce the levels of enzyme released, as compared to basophils challenged with allergen alone. Dexamethasone, in addition to bonding to the cytoplasmic specific receptor that enters the nucleus and attaches itself to the DNA, works by stimulating cAMP production, inhibiting the degranulation process in basophils and mast cells (Fukui, 2008). Theophylline acts as inhibitor of phosphodiesterase. This enzyme deactivates cAMP forming icAMP, which favors cell degranulation (Lipworth, 2005). Cromoglycate is a basophil and mast cell membrane stabilizer, as it prevents their degranulation (Gotua et al., 2008). Ipratropium inhibits the liberation of chemical mediators, increased by acetylcholine, by blocking cholinergic receptors on the surface of basophils and mast cells (Spooner et al., 2003). In contrast, montelukast, a leukotriene receptor antagonist (Kawai et al., 2008), which was used in this study as a negative control for inhibition of the immediate reaction, did not decrease the levels of hexosaminidase released by basophils challenged with allergen, as expected in this model. EO, at a concentration of 10 g/mL, reduced the levels of -hexosaminidase released by basophils, with effects majors to the anti-allergic drugs tested, excluding montelukast, which is why it has been suggested that this plant fraction could act upon cell membranes with a mechanism similar to that of one of these drugs. These results demonstrated that EO maintained its inhibiting properties on basophil degranulation at high (Cariddi et al., 2006) and small concentrations alike. Some of main components of EO identified by GC could be responsible for its biological activity. Numerous investigations demonstrate the protective effects of terpenes on cell membranes. These substances also carry out a regulating activity on T cells, the synthesis of cytokines and inhibition of the apoptosis processes (Yeh et al., 2006; Ashibe et al., 2007). Essential oils are complex mixtures of numerous molecules and their biological effects are the result of a synergy between all of them or the reflection of main molecules present at high levels according to analysis by GC (Bakkali et al., 2008). According to the aforementioned, EO could have displayed protective effects on cell membranes when added to the basophils. This indicates that the
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increase in basophil membrane permeability may be an essential trigger for the release of -hexosaminidase. The terpenes from EO may have acted upon basophil membranes, avoiding the disturbance induced by the specific allergen. There would not be modifications related at least to types of allergens both tried (fungi and dust mite) (Gonzlez Pereyra et al., 2005; Cariddi et al., 2006, 2007; Maldonado et al., 2007). Moreover the active concentrations seem to be much lower than previously thought, as this work found activity in the range 6 mg/ml at 0.006 g/mL, in contrast with our previous tests at only 150 mg/mL (Cariddi et al., 2005). CONCLUSION The EO from leaves of Minthostachys verticillata at small concentrations acted as a mitogen, increasing proliferation of T and B cells from allergic patients. As an immunomodulator, it favored Th1 deviation by increasing IFN- synthesis and decreasing IL-13 production. EO maintained its inhibiting effects on basophil degranulation, reducing the levels of -hexosaminidase released. Additional studies are being realized along the same line of investigation to reveal if the terpenes identified can have therapeutic applications in allergies. In the future, these products could be applied in alternative or complementary therapies with patients who do not respond to conventional treatment. ACKNOWLEDGEMENTS We would like to thank Mnica Wagner for the English version. REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (3), 172 - 175 BLACPMA ISSN 0717 7917 Comunicacin | Communication
Actividad repelente de los extractos hexnicos y etanlicos de frutos de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) sobre adultos de Blattella germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae)*
[Repellent activity of hexanic and ethanolic extracts from fruits of Solanum eleagnifolium (Solanaceae) against Blattella germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae) adults]
Carolina SNCHEZ CHOPA1,2, Vernica BENZI1,2, Ral ALZOGARAY3 y Adriana A. FERRERO1 Depto de Biologa, Bioqumica y Farmacia. UNS. San Juan 670, Baha Blanca, Argentina. 2 Becario CONICET. 3 Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CITEFA/CONICET). Villa Martelli, Bs. As, Argentina.
1
Abstract
Plant extracts have been used all over the world as an alternative method to control pests. Hexanic and ethanolic extracts from fruits of Solanum eleagnifolium were tested for repellent activity against adult males of Blattella germanica in a choice-test arena. Half of a circular filter paper (9 cm diameter) was treated with the hexanic and ethanolic extracts (50, 100 and 150 mg/mL) and the other half only with the solvents. The activity of the extracts was compared to DEET. The repellency response to S. eleagnifolium extracts was significantly different from the control at all concentration. In both cases, the lowest concentration produced the same IR = 0.93 at one hour. At 24 h, hexanic extract at 50 mg/mL produced the higest effect (IR = 0.9).The response of the cockroaches to both extracts did not differed from DEET. Both extracts could be use for the control of B. germanica.
Keywords: Plant extracts; Repellency; Blattella germanica; Solanum eleagnifolium.
Resumen
Los extractos vegetales cobraron importancia como mtodo alternativo para el control de insectos-plaga. El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto repelente de extractos hxanicos y etanlicos de frutos de Solanum eleagnifolum en adultos de Blattella germanica. Mitades de discos de papel de filtro (9 cm dimetro) fueron rociadas con soluciones de los extractos (50, 100 y 150 mg/mL) y la otra mitad con solvente solo. Como control positivo se utiliz DEET. El efecto repelente de ambos extractos fue significativamente distinto del control a todas las concentraciones. A la menor concentracin, ambos extractos produjeron a la hora el mismo IR = 0,93. A las 24 h el extracto hexnico de frutos a la menor concentracin produjo la mayor repelencia (IR = 0,9). La respuesta de las cucarachas a los dos extractos empleados no difiri del DEET. Ambos extractos podran usarse en el control de B. germanica.
Palabras Clave: Extractos vegetales; repelencia; Blattella germanica; Solanum eleagnifolium.
Recibido | Received: December 23, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 10, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This work was financed by SECyT-UNS and CONICET, Argentina. This article must be cited as: Carolina Snchez Chopa, Vernica Benzi, Ral Alzogaray y Adriana A. Ferrero. 2009. Actividad repelente de los extractos de hexnicos y etanlicos de frutos de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) en adultos de Blattella germanica (Insecta, Dictyoptera, Blattellidae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):172 175. {EPub April 10, 2009}.
*Contacto | Contact: cschopa@uns.edu.ar
Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotnica. Enero de 2009, Chilln, Chile.
Snchez Chopa et al.
Actividad repelente de Solanum eleagnifolium (Solanaceae) contra Blattella germanica
INTRODUCCIN La cucaracha Blattella germanica (L.) (Dictyoptera, Blattellidae) es de suma importancia para la salud humana debido a que acta como vector mecnico de agentes patgenos y sus secreciones, heces y regurgitaciones causan reacciones alrgicas en personas sensibles (Chang & Anh, 2001). Adems, esta plaga es cosmopolita y de gran abundancia dentro de los hogares ocasionando no solo los problemas mencionados anteriormente sino tambin prdidas y daos en una gran variedad de productos alimenticios almacenados (Appel & Mack, 1989). En estos ltimos aos se ha puesto nfasis en la bsqueda de mtodos alternativos de control a los insecticidas sintticos debido a los problemas ambientales, a la salud humana as como al fenmeno de resistencia que generan estos (WHO, 1999; Pridgeon & Liu, 2003; Limoee et al., 2007). Dentro de estos mtodos alternativos se encuentran las sustancias derivadas de plantas como aceites esenciales o extractos vegetales con marcada repelencia que se han estudiado sobre B. germanica (Appel & Mack, 1989; Peterson et al., 2002a,b; Snchez Chopa et al., 2006; Ferrero et al., 2007). El objetivo de nuestro trabajo fue evaluar la repelencia de los extractos hexnico y etanlico de frutos de Solanum eleagnifolium (L.) (Solanaceae) sobre machos adultos de B. germanica y comparar dicha repelencia con la ocasionada por el DEET. MATERIALES Y MTODOS Obtencin de los extractos Los extractos polares y no polares de los frutos de S. eleagnifolium se obtuvieron por maceracin (extraccin en fro) del material vegetal fresco. La muestra de material vegetal se extrajo sucesivamente con hexano y etanol. Los solventes orgnicos fueron evaporados a presin reducida y se obtuvieron los extractos hexnico y etanlico de frutos. Estos extractos se almacenaron a 5 C hasta el momento de su utilizacin. Insectos Los machos adultos de B. germanica utilizados provinieron de una colonia criada en el Laboratorio de Zoologa de Invertebrados II, Universidad Nacional del Sur (Baha Blanca, Argentina). Todos los insectos se mantuvieron en condiciones fijas de temperatura y
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humedad relativa ambiente (25 C y 60-70% de humedad relativa) y fotoperodo 0L:24O. Los ejemplares se alimentaron con dieta artificial. Actividad repelente Se us la prueba de preferencia descripta por Scheffler y Dombrowski (1992). Discos de papel de filtro de 9 cm de dimetro se dividieron en dos mitades. Una de las mitades se roci con 0,5 mL de solucin hexnica o etanlica de los extractos; la otra, con solvente solo. Se trabaj con tres concentraciones de cada extracto: 50, 100 y 150 mg/mL. Se dej evaporar el solvente y los papeles fueron colocados en el fondo de cajas de Petri. En los controles, una de las mitades se roci con el solvente correspondiente y la otra mitad no recibi tratamiento alguno. Como control positivo se utiliz dietiltoluamida (DEET, N, N dietil-m-toluamida, pureza 98%, Aldrich, Milwaukee, USA) un conocido repelente de insectos de amplio espectro, en las mismas concentraciones empleadas en los extractos. Grupos de diez insectos se liberaron en el centro de las cajas de Petri y se registr su ubicacin sobre los discos de papel 1 y 24 h despus del comienzo del experimento. Finalmente se calcul el ndice de Repelencia (IR = NT / T; donde NT es la cantidad de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T es el nmero total de insectos). Los datos fueron analizados mediante anlisis de varianza ANOVA y las medias de cada concentracin se compararon mediante la prueba de diferencias mnimas (DMS, p<0,05). RESULTADOS Todas las concentraciones de los extractos hexnicos y etanlicos frutos de S. eleagnifolium tanto a la hora como a las 24 h produjeron repelencia en B. germanica significativamente diferente del control (DMS, p<0,05). A la menor concentracin (50 mg/mL), ambos extractos produjeron el mismo efecto repelente a la hora con un IR de 0,93. Este efecto repelente no se diferenci significativamente de la repelencia ocasionada por el DEET (DMS, p>0,05) (Fig. 1). A las 24 h el extracto hexnico de frutos a la menor concentracin evaluada produjo la mayor repelencia con un IR = 0,9 y no se hallaron diferencias significativas entre este extracto y el resto de los compuestos utilizados (DMS, p>0,05) (Fig. 2).
Snchez Chopa et al.
Figura 1. ndice de Repelencia a la hora de los extractos hexnico y etanlico de frutos de S. eleagnifolium y de DEET sobre machos adultos de B. germanica.
1 0,9 0,8
Indice de Repelencia (NT/T)
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Control 50 100 150 Concentraciones (mg/mL) a
Control
Fruto Hexano
Fruto Etanol
DEET
NT/T: NT: nmero de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T: nmero total de insectos. Cada valor es la media de tres rplicas independientes (n=10). Valores seguidos por la misma letra no difieren estadsticamente (DMS, p>0,05)
Figura 2. ndice de Repelencia a las 24 horas de los extractos hexnico y etanlico de frutos de S. eleagnifolium y de DEET sobre machos adultos de B. germanica.
1 0,9 0,8
Indice de repelencia (NT/T)
b b
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Control 50 100 150 Concentraciones (mg/mL) a
Control
Fruto Hexano
Fruto Etanol
DEET
NT/T: NT: nmero de insectos en la mitad no tratada con el extracto y T: nmero total de insectos. Cada valor es la media de tres rplicas independientes (N=10) Valores seguidos por la misma letra no difieren estadsticamente (DMS, p>0,05)
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Snchez Chopa et al.
DISCUSIN Varios autores han demostrado que ciertos extractos botnicos o aceites esenciales derivados de plantas poseen efecto repelente sobre B. germanica (Appel & Mack, 1989; Peterson et al., 2002a,b; Snchez Chopa et al., 2006; Ferrero et al., 2007). Los resultados presentes indican que los extractos hexnico y etanlico de frutos de S. eleagnifolium producen un gran efecto repelente sobre B. germanica y este se mantiene a lo largo del tiempo. Scheffler & Dombrowski (1992) usando extractos etanlicos de diferentes familias de plantas a concentraciones de 500, 700 y 960 mg/mL encontraron considerables fluctuaciones del efecto repelente de estas. En nuestro estudio con menores concentraciones (50, 100 y 150 mg/mL), se obtuvieron siempre efectos repelentes. CONCLUSION Los extractos hexnico y etanlico de S. eleagnifolium podran incluirse en el manejo integrado de B. germanica al producir barreras de exclusin para la entrada y establecimiento de esta plaga en reas de difcil tratamiento. REFERENCIAS
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Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle (Anacardiaceae) y Tagetes terniflora (Asteraceae) sobre adultos de Pediculus humanus capitis (Insecta; Anoplura; Pediculidae) *
[Fumigant activity of essential oils of Schinus molle (Anacardiaceae) and Tagetes terniflora (Asteraceae) against adults of Pediculus humanus capitis (Insecta; Anoplura; Pediculidae)]
Mara M. GUTIRREZ1, Natalia STEFANAZZI1,2, Jorge WERDIN GONZLEZ1,2, Vernica BENZI1,2, Adriana A. FERRERO1
1
Dpto de Biologa, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670, (8000) Baha Blanca, Argentina. 2 Becario CONICET
Abstract
Dried leaves of each species were hydrodistilled. The bioassays were performed at 28 2 C, 65% 5 RH and in darkness. Each experimental unit consisted of a glass Petri dish (5cm diameter) containing 50 L of the essentials oils on a micro coverglass. Then, it was covered with a lid with a fine wire sieve attached over the central hole. Batches of 10 adults were placed over the sieve. Each unit was then covered with another Petri dish. Control units were the same but without addition of any substance. All treatmentes wre replicated three times. The percentage of knockdown was evaluated every 5 min for one hour. The KT50 value was calculated by probit analysis. The results showed that the KT50 for Schinus molle was 12.75 min and for Tagetes terniflora was 23.44. Both essential oils could be considered for the control of Pediculus humanus capitis.
Keywords: Essential oils; Pediculus humanus capitis; Fumigant toxicity.
Resumen
Los aceites esenciales de hojas se aislaron por hidrodestilacin. Los bioensayos se realizaron a 28 2 C, 65% 5 H.R y en oscuridad. Se utilizaron cajas de Petri de vidrio (5cm de dimetro), en sus bases se colocaron 50 L de los aceites puros. La caja se cubri con una tapa plstica perforada que posee un tejido de hilo. Sobre este se liberaron 10 insectos protegidos por una segunda caja con dimetro equivalente. El conjunto de cajas se cerr con cinta adhesiva. Se realizaron tres rplicas por tratamiento. Como control se utilizaron cajas sin aceites. El porcentaje de volteo se evalu cada 5 minutos durante una hora. Se calcul el TV50 por un anlisis Probit. El TV50 fue 12,75 min para el aceite de Schinus molle y para el de Tagetes terniflora de 23,44 min. Ambos aceites podran ser utilizados para el control de Pediculus humanus capitis.
Palabras Clave: Aceites esenciales; Pediculus humanus capitis; Toxicidad fumigante
Recibido | Received: December 23, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 10, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This work was financed by SECyT-UNS y CONICET, Argentina. This article must be cited as: Mara M. Gutirrez, Natalia Stefanazzi, Jorge Werdin Gonzlez, Vernica Benzi, Adriana A. Ferrero. 2009. Actividad fumigante de aceites esenciales de Schinus molle (Anacardiaceae) y Tagetes terniflora (Asteraceae) en adultos de Pediculus humanus capitis (Insecta; Anoplura; Pediculidae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):176 179. {EPub April 10, 2009}.
*Contacto | Contact: aferrero@uns.edu.ar
Gutirrez et al.
Actividad fumigante de Schinus molle y Tagetes terniflora contra Pediculus humanus capitis
INTRODUCCIN Pediculus humanus capitis De Geer (piojo de la cabeza), agente causal de la Pediculosis capitis, es un ectoparsito obligado del hombre confinado a los pelos del cuero cabelludo (Ko y Elston, 2004). Es un insecto cosmopolita que afecta a individuos de todos las edades, sexos, razas y niveles socioeconmicos (Burkhart y Burkhart, 2005). El control qumico de esta plaga comenz en la dcada del 40 utilizando DDT y ha continuado a nivel mundial con insecticidas organoclorados y piretroides. Actualmente el uso de estos compuestos est limitado por el desarrollo de resistencia (Picollo et al., 2000; Vassena et al., 2003; Burgess, 2004). En contraposicin a los insecticidas antes mencionados, los insecticidas naturales basados en aceites esenciales representan una alternativa interesante en el control de insectos-plaga. Entre sus efectos biolgicos podemos mencionar la toxicidad por contacto y fumigante, la repelencia, las alteraciones en la fisiologa nutricional y el efecto fagodisuasivo (Yang et al., 2005; Snchez Chopa et al., 2006; Stefanazzi et al., 2006; Werdin Gonzlez et al., 2008). Por otra parte se ha demostrado que los aceites esenciales tienen accin neurotxica, citotxica, fototxica, mutagnica, etc. sobre distintos organismos (Isman, 2000; Bakkali et al., 2008). Debido a los mltiples blancos sobre los cuales el aceite esencial puede actuar, la posibilidad de desarrollar el fenmeno de resistencia en insectos resulta poco probable. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad fumigante de los aceites esenciales de hojas de Schinus molle L. (Anacardiacea) y Tagetes terniflora Kunth (Asteraceae) en adultos de Pediculus humanus capitis. MATERIALES Y MTODOS Obtencin de los aceites esenciales Las hojas de S. molle y T. terniflora se recolectaron durante la poca estival en la ciudad de Baha Blanca, Buenos Aires, y en la ciudad de Salta, Salta, Argentina. Los aceites esenciales se aislaron a partir de material vegetal fresco, por destilacin por arrastre de vapor de agua en un aparato tipo Clevenger durante 3 a 4 h, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se
almacenaron en oscuridad a 4 C. Los mismos se analizaron por Cromatografa Gaseosa y Espectrometra de Masas. Recoleccin de P.h. capitis Los piojos fueron recolectados de cabezas de nios infestados de entre 3 a 6 aos de edad pertenecientes a instituciones educativas de la ciudad de Baha Blanca, provincia de Buenos Aires, Argentina siguiendo el protocolo de Picollo et al. (1998). Bioensayo Se utilizaron cajas de Petri de vidrio de 5,5 cm de dimetro por 1 cm de altura. En la base de la caja se coloc un cubreobjeto de 18 x 18 mm con 50 L del aceite esencial puro. Al control no se le adicion sustancia alguna. Cada caja se cubri con una tapa con un orificio central recubierta con un tejido de hilo para permitir la circulacin de aire; sobre este tejido se liberaron 10 insectos protegidos por una segunda caja de dimetro equivalente para evitar su fuga. El conjunto de cajas fue hermticamente sellado con cinta adhesiva a fin de constituir una cmara fumigante. Cada tratamiento se repiti 3 veces. Se observ el porcentaje de volteo cada 5 min durante una hora. Se calcul el parmetro TV50 (tiempo de volteo) utilizando el programa Micro Probit 3.0. El modelo de regresin fue verificado usando el estadstico Chicuadrado. RESULTADOS Y DISCUSIN La evaluacin del porcentaje de volteo es un buen estimador de la potencialidad de un compuesto qumico para actuar como pediculicida debido a que estos productos deben poseer accin potente sobre el parsito en el menor tiempo de exposicin posible sobre el hospedador. Los aceites esenciales de hojas de Schinus molle y Tagetes terniflora produjeron actividad de volteo dependiente del tiempo de exposicin en Pediculus humanus capitis. El aceite esencial de T. terniflora produjo a los 5 min de exposicin un 6% de volteo. A los 60 min de exposicin este aceite provoc un 80% de actividad (Fig. 1). El TV50 fue de 23.44 min (Tabla 1). Stefanazzi et al. (2006) al ensayar este aceite en adultos y larvas de Tribolium castaneum no observaron efecto fumigante.
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Gutirrez et al.
Figura 1. Actividad fumigante de los aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora sobre Pediculus humanus capitis.
Tabla 1: Actividad fumigante de los aceites esenciales de Schinus molle y Tagetes terniflora en Pediculus humanus capitis. Aceite Schinus molle Tagetes terniflora TV50 (min) 12,75 23,44 I.C. a 5,44 17,51 20,22 27,00 b (E.E) b 6,34 (0,68) 2,90 (0,47)
a: Intervalos de Confianza del 95% b: Pendiente de la recta de regresin (error estndar) TV: Tiempo de volteo
El aceite esencial de S. molle produjo a los 5 min de exposicin un porcentaje de volteo superior al 35% mientras que a los 35 min provoc un 100% de actividad ((Tabla 1). El TV50 fue de 12.75 min (Tabla 1). Toloza et al. (2006) utilizando aceite esencial de esta especie sobre P. h. capitis demostraron que el TV50 fue de 40.40 min. Estas diferencias podran deberse a variaciones en la composicin qumica del aceite esencial influenciadas por las condiciones biogeogrficas. CONCLUSION Los aceites esenciales de hojas de Schinus molle y Tagetes terniflora podran ser utilizados en el control de Pediculus humanus capitis. REFERENCIAS
Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. 2008. Biological Effects of Essential oils A review. Food Chem Toxicol 46:446-475. Burgess IF. 2004. Human lice and their control. Ann Rev Entomol 49:457-481. Burkhart CN, Burkhart CG. 2005. Head lice: Scientific assessment of the nit sheath with clinical ramifications
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Gutirrez et al.
Toloza AC, Zygadlo J, Mougabure Cueto GA, Biurrun F, Zerba E, Picollo MI. 2006. Fumigant and repellent properties of essential oils and componentes compounds against permethrin-resistant Pediculus humanus capitis (Anoplura: Pediculidae) from Argentina. J Med Entomol 43:889-895. Vassena CV, Mougabure Cueto GA, Gonzlez Audino P, Alzogaray RA, Zerba EN, Picollo MI. 2003. Prevalence and levels of permethrin resistance in Pediculus humanus capitis De Geer (Anoplura: Pediculidae) from Buenos Aires, Argentina. J Med Entomol 40:447-450.
Werdin Gonzlez JO, Murray AP, Ferrero AA. 2008. Bioactividad de aceites esenciales de Schinus molle var. areira (Anacardiaceae) en ninfas II de Nezara viridula (Hemiptera: Pentatomidae). Bol San Veg (Plagas). 34:367-375. Yang Y, Lee H, Lee S, Clark JM, Ahn Y. 2005. Ovicidal an adulticidal activity of Cinnamomum zeylanicum essential oils compounds and related compounds against Pediculus humanus capitis (Anoplura: Pediculicidae). Int J Parasitol 35:1595-1600.
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Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mgico-religiosos en comunidades del Pacfico colombiano norte *
[Traditional knowledge of vegetable species used with magic-religious purpose in communities of the Northern Colombian Pacific]
Nayive PINO BENTEZ y Giovanni RAMREZ Universidad Tecnolgica del Choc, Bloque 6, Laboratorio 316, Grupo de Productos Naturales, Quibd-Choc, Colombia.
Abstract
To know about effective medicinal plants and to know about the existence of a power that involves forces that are above the human understanding, it is to know about plants with magic-religious uses. Their methodological framework is based on the exchange of experiences of faith healers that for more than 15 years have been working on this occupation, registrations in database Spica, of the herbarium CHOC and bibliographical revisions. They were 129 species contained in 91 genders and 53 families, being the most representative Piperaceae 19 spp (15%) followed by Lamiaceae 10 spp (8%). According to the use purpose they are classified in 3 subcategories: beneficent, malicious and rituals.
Keywords: Traditional medicine; Magic-religious plants; Piperaceae; Lamiaceae.
Resumen
Conocer sobre plantas medicinales eficaces y sobre la existencia de un poder que entraa fuerzas que estn por encima de la comprensin humana, es conocer de plantas con usos mgico-religiosos. Su marco metodolgico se fundamenta en el intercambio de experiencias con curanderos que por ms de 15 aos vienen ejerciendo este oficio, registros en Base de datos Spica, del herbario CHOC y revisiones bibliogrficas. Resultaron 129 especies agrupadas en 91 gneros y 53 familias, siendo la ms representativa Piperaceae 19 spp (15%) seguida de Lamiaceae 10 spp (8%). Segn la finalidad de uso se clasifican en 3 subcategoras: benficas, malficas y rituales.
Palabras Clave: Medicina tradicional, Plantas mgico-religiosas, Piperaceae, Lamiaceae.
Recibido | Received: March 1, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 7, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This work was financed by UTCH (Cod. 019) This article must be cited as: Nayive Pino Bentez y Giovanni Ramrez. 2009. Conocimiento tradicional de especies vegetales usadas con fines mgico-religiosos en comunidades del Pacfico colombiano norte. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):182 183. {EPub April 10, 2009}.
*Contacto | Contact: E-mail: nayivepino@yahoo.com, Tel, 57 3104559617, Fax: 57 46712492
Benzi et al.
Efecto insecticida de dos especies de Aloysia (Verbenaceae) sobre Rhizopertha dominica
INTRODUCCIN Esta investigacin muestra resultados del proyecto Especies tiles del departamento del Choc, ejecutado en el marco de las investigaciones del grupo Productos Naturales, busca corroborar, que el conocimiento y aplicacin que algunos pobladores del pacfico colombiano norte, han dado a travs del tiempo a las plantas, obedece a una gran experiencia emprica obtenida a travs de generaciones sucesivas, la cual, se desarrolla bajo estricta confidencialidad y dedicacin para el aprendizaje de dicho conocimiento. La medicina tradicional de los curanderos herbolarios del Pacfico colombiano, ha coexistido con un conocimiento de las plantas medicinales eficaces que entraan ciertas fuerzas que estn por encima de la comprensin humana y la creencia de un poder Divino (religioso) o sobrenatural que le da un carcter mgico. Hablar de plantas con uso mgico-religioso es hablar de plantas que pueden ser utilizadas con fines curativos, de prosperidad, de hechicera, de tramas u otros, que para su efectividad requieren el empleo de secretos, rezos, cantos u oraciones, tcnicas que ejercen fuerzas ocultas o ritos de invocacin de espritus, las cuales favorecen el acto de curar o daar, puesto que pueden ser utilizadas con fines bondadosos o malignos. MATERIALES Y MTODOS El marco metodolgico se fundamenta en el intercambio de experiencias con curanderos que por ms de 15 aos vienen ejerciendo este oficio, realizado por observacin directa en campo; registros en la base de datos Spica del herbario CHOC, iniciadas desde 1983 y reportes bibliogrficos para la regin. En campo se visitaron 12 comunidades de cinco municipios (Atrato, Certegu, Itsmina, Quibd y Unin Panamericana) del pacfico colombiano norte, socializacin a los miembros de las comunidades, teniendo en cuenta lineamientos para el trabajo tal como lo propone Phillips & Gentry (1993), mediante talleres y presentaciones orales donde se genera un espacio de discusin sobre el desarrollo del mismo, lo que permite participacin activa, previamente al aval de los miembros de los consejos comunitarios y autoridades locales tal como lo reza la ley 70/93 o ley de las comunidades negras. Las entrevistas se disearon con base a las interacciones estructuradas sugeridas por TRAMIL (Weniger y Robineau, 1988). Fueron seleccionados 20 curanderos, a los cuales se les
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tom testimonios, vivencias y datos biogrficos en cintas de video y magnetofnicas. Para la identificacin de las especies inicialmente se llev a cabo en el herbario CHOC, para posteriormente ser corroboradas o determinadas en el herbario nacional colombiano COL del instituto de ciencias naturales de la universidad nacional de Colombia. RESULTADOS Y DISCUSIN Pegue aqu el texto. Se registran 129 especies, 128 determinadas a Familia y Gnero, y 115 a especie, agrupadas en 91 gneros y 53 familias, de las cuales 50 familias pertenecen a Magnoliophyta y 3 a Pteridophyta, siendo las ms representativas en nmero de especies las Piperaceae 19 spp (15%), seguida de Lamiaceae 8% (10 spp), Asteraceae, Gesneriaceae y Leguminosae 7spp c/u (5%), Acanthaceae 6 spp (5%) y Liliaceae y Solanaceae 4 spp c/u (3%), observados en la Fig. 1, en la Fig. 2, se registran los gneros con mayor nmero de especies usados con fines mgico-religiosos. Segn la finalidad de uso se clasifican en 3 subcategoras: benficas (94), malficas (31) y rituales (13), solo 9 especies comparten en ms de una subcategora. El conocimiento que poseen estas comunidades es tratado como un tesoro, al que consideran sagrado, el cual no permiten que quede en manos de alguien que no est lo suficientemente preparado para ello, de los 20 curanderos 12 aprendieron desde nios a conocer y trabajar con las plantas, constituyndose en el relevo generacional de sus antepasados, otros 4 dicen haber obtenido el conocimiento siendo ya adultos de espritus (nimas) y los ltimos 4 aprendieron de otros adultos (indgenas y/o negros), de los cuales solo uno ya haba transmitido su conocimiento a un heredero, el resto manifestaron no haber encontrado la persona idnea aduciendo que aun no estaban preparados para salvaguardar su conocimiento; en dichas acciones no se visualizan actos de egosmo, ellos consideran que la juventud actual no est por aprender este tipo de saber. Resulta preocupante la forma acelerada como se pierde el saber, a la fecha han fallecido 7 curanderos y de los 13 restantes la mayora son angrafos con edades entre los 60 aos hasta mayores de 90. En poblaciones como las del pacfico colombiano el concepto de cultura se entiende fcilmente cuando se estudian etnociencias como la etnobotnica, que es una aproximacin a las formas de vida de los grupos tnicos, donde se involucran las visiones culturales como la relacin hombre-planta; lo anterior hace parte de lo que hoy conocemos como etnobiologa, la cual
Benzi et al.
es entendida aqu, en el sentido que le dio Castetter (1944) inventor del trmino, conjunto formado por la etnobotnica y la etnozoologa, en realidad se la podra considerar como la que trata del saber popular en materia de historia natural. Lo anterior concuerda con Acosta et al. (1997), cuando menciona que el conocimiento de una cultura en una sociedad, comprende, entre otros aspectos, el anlisis de las costumbres, las creencias, la forma de percibir el mundo y las ideas mgico-religiosas, que forman parte de su realidad. En la concepcin que el hombre ha tenido sobre la enfermedad, sus causas, sus formas de prevencin y curacin, se identifican 3 tipos de conocimientos: el mgico- religioso, el emprico y el cientfico. Lemos (1998) enmarc la visin mgicoreligiosa de la naturaleza, como el territorio o escenario ritual con connotaciones no solo naturales sino tambin culturales, menciona que la selva, el
monte, el ro son espacios habitados por los espritus, las divinidades y los ancestros, aunque se trata de poblaciones afrobrasileras, al igual que los pobladores del pacfico colombiano en su mayora afrocolombianos, piensan que all estn presentes las fuerzas naturales y sobrenaturales con quienes es preciso mantener un dilogo, a quienes hay que tener en cuenta y pedir su permiso a la hora de intervenir. Aunque existe esta convivencia en la regin, no existen suficientes trabajos publicados en ese sentido, aunque existen reportes de estudios sociolgicos donde se hace alusin (Velsquez, 1961; Crdoba, 1983; Echavarra, 1999, 2000). En otros registros etnobotnicos como lo citan Duke (1970, 1975), Forero-Pinto (1980), Cayn y Aristizbal (1980), Garca (1995), Mahecha (1994), Giraldo (1995), Gmez (1996), Medina y Medina (1999), Pino-Bentez (2000). Recientemente Pino-Bentez (2008).
Figura 1. Familias de plantas usadas como mgico-religiosa en el Pacfico colombiano norte.
20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Malvceas
Marantceas
Melastomatcea
Morceas
Asterceas
Ericceas
Gesnericeas
Rubiceas
Rutceas
Arceas
Poacas
Solanacas
Araliceas
Liliceas
Piperceas
Aristoloquiceas
Zingiberceas
Acantceas
Verbenceas
Arecceas
Gnero
Espcie
Figura 2: Gneros ms representativos registrado en plantas con fines mgico-religioso.
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Resto Familias
Lamiceas
Leguminosas
Benzi et al.
CONCLUSION Los pobladores del pacfico colombiano y su medio ambiente, tienen como eje central la selva que a la vez se convierte no solo en la despensa para conseguir el sustento diario, sino tambin, en su templo o sagrario, sitio donde relajan su espritu y se llenan de sabidura, especialmente curanderos que adems de usar las plantas en tratamientos para enfermedades del cuerpo, refirindose a enfermedades naturales, tambin las usan para curar enfermedades adquiridas por males (maleficios, hechizos o hechicera), y al igual que los mdicos ortodoxos se especializan en la cura de un solo tipo de enfermedad, es por ello que se puede encontrar curanderos para: tramas, cogida del rastro, tamborito, locura, mordeduras de serpientes, mal de ojo, males de nacimiento (mal de ombligo o mal de los 8 das, mal de baba o mal de los 13 das y mal de los 40 das); las que atienden partos son parteras o comadronas, los que atienden fracturas y luxaciones son pegahuesos y sobanderos. Cuando un curandero usa las plantas con el nimo de hacer maldad se considera brujo y este acto se denomina brujera. Los curanderos aqu mencionados no se consideran brujos pero saben curar la brujera causada por otros. REFERENCIAS
Acosta M, Alegra L, Cajiao G, Llano AM, Valencia S, Zuluaga P. 1997. Creencias populares sobre el autocuidado durante el puerperio, en las instituciones de salud de nivel 1. Colombia Medica 28(1):42-50. Castetter EF. 1944. The Domain of Etnobiology. Am Natur 78:158-170. Cayn E, Aristizbal S. 1980. Lista de plantas utilizadas por los indgenas Chami de Risaralda. Cespedesia 9(3334):6-114. Crdoba J. T. 1983. Etnicidad y estructura social en el Choc Ed. I Editorial Lealon, Medelln, Colombia, pp. 32-37.
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Precauciones en el empleo de plantas medicinales*

[Precautions in the use of medicinal plants]
Mariela A. MARINOFF1, Jos L. MARTNEZ2 & Mara A. URBINA3
1
Facultad de Agroindustrias, Farmacia, Cdte. Fernndez N 755, H3700LGO Senz Pea, Chaco, Argentina. 2 Escuela de Kinesiologa, Universidad Santo Toms, Talca, Chile. 3 Facultad de Agronoma, Universidad de Concepcin, Campus Chilln, Chile.
Abstract
In our country, almost medicinal plants are not scientifically validated and their safety and effectiveness are frequently unknown; therefore, like any other medicines, they should be used with caution because toxic plants consumption may carry intoxication and even death. Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., among others may be referred to as risky. Fatal cases are recorded due to the misuse of Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et. al., Illicium verum Hook. F. Although they may possess curative properties, they may leave their innocuous conditions for different reasons. But this doesnt mean all phytotherapy is harmful; many drugs come from plants, and an appropiate knowledge and information about healing herbs is necessary to prescribe and administrate them accurately.
Keywords: Phytotherapy; Curative properties; Intoxication; Folk medicine.
Resumen
En nuestro pas, las plantas medicinales prcticamente no estn validadas cientficamente y se desconoce si son seguras y eficaces por lo que, como todo medicamento, deben ser empleadas con cautela, ya que pueden aparecer cuadros txicos derivados del consumo de plantas. Mencionadas como riesgosas: Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., entre otras. Casos letales se registran con el uso inadecuado de Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et al., Illicium verum Hook. F. Si bien pueden poseer propiedades curativas, por distintas causas pueden transformarse en factores de intoxicacin. Esto no quiere decir que toda la fitoterapia sea nociva, muchos medicamentos proceden de plantas, pero el conocimiento de las hierbas curativas muchas veces es limitado y se desconocen sus efectos, lo que hace necesario informar y alertar sobre su correcta administracin y prescripcin.
Palabras Clave: Fitoterapia; Propiedades curativas: Intoxicacin; Medicina tradicional.
Recibido | Received: March 22, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 28, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: April 10, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This study wasnt supported. This article must be cited as: Mariela A. Marinoff, Jos L. Martnez & Mara A. Urbina. 2009. Precauciones en el empleo de plantas medicinales. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):184 187. {EPub April 10, 2009}.
*Contacto | Contact: e-mail: marinoff@fai.unne.edu.ar Tel: 00.54.3732.420137
Marinoff et al.
Precauciones en el empleo de plantas medicinales
INTRODUCCIN El uso de hierbas con fines medicinales es una costumbre ancestral (Martinez & Marinoff, 2008), desconocindose en muchos casos que debe ser controlado y hasta mortal. Si bien estos productos pueden poseer propiedades curativas, por distintas causas pueden transformarse en factores de intoxicacin. En el proceso de infusin y decoccin, algunas alcanzan una gran concentracin de sus sustancias activas, por lo tanto es necesario conocer con exactitud la cantidad de hierba a usar, el volumen de agua y el tiempo de coccin. Ya sea por una idealizacin de lo natural o por la situacin de pobreza de grandes sectores de la poblacin, echar mano a las plantas para curarse de diversos males es una prctica que ha ido en aumento en los ltimos tiempos. En nuestros pases, las plantas medicinales prcticamente no estn validadas cientficamente y se desconoce si son seguras y eficaces y, como todo medicamento, deben ser empleadas con cautela. (Rizzo, 2000). Muchas hierbas medicinales son vendidas en farmacias y herboristeras, inclusive sin la debida autorizacin de las autoridades correspondientes e ignorndose adems lo que ocurre con la automedicacin de las mismas (Medina, 1999). Si bien la utilizacin de plantas curativas es una medicina alternativa vlida, en algunas oportunidades su uso es emprico y hasta fraudulento. Pueden aparecer cuadros txicos derivados del consumo de plantas. Nios, desde el nacimiento, ancianos, mujeres en gestacin o lactancia, son los individuos ms propensos. Existen tipos de intoxicaciones agudas, las cuales son fcilmente detectables, por cuanto los sntomas de la intoxicacin aparecen en el corto tiempo despus de su administracin e intoxicaciones crnicas, no son fcilmente detectables, resultando difcil atribuir la presencia de algn trastorno de la salud por consumo de alguna planta medicinal, dado que el individuo se relaciona en forma permanente con su medio. Se puede considerar adems, que las plantas medicinales pueden presentar dos tipos de toxicidad: a) Toxicidad intrnseca, en la cual la planta produce metabolitos txicos para el ser humano. La presencia de sntomas depender de la dosis (intoxicacin aguda) o del tiempo de empleo (intoxicacin crnica). Ejemplos de metabolitos txicos: alcaloides, algunos flavonoides, glicsidos cardiotnicos y cianogenticos, c. aristolquicos, derivados terpenoides (taxol, ascaridol, cucurbitacinas). b) Toxicidad extrnseca, la planta no produce sustancias potencialmente txicas.
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La toxicidad proviene de la presencia de contaminantes (mezclas con especies txicas, metales pesados, pesticidas de la agricultura, micotoxinas, alta carga microbiana). Los resultados de trabajos regionales entre otras cosas permitieron determinar la existencia de plantas con uso medicinal que en otros lugares se vuelven txicos. Es por ello que se vuelve trascendente estudiar la composicin fitoqumica. (Ricciardi, 2001). MATERIALES Y MTODOS Se indag acerca de ideas, conocimientos y prcticas de curacin con plantas medicinales, a fin de contribuir al conocimiento de sus beneficios y riesgos, consideracin obtenida mediante datos registrados de casos clnicos en hospitales y salas de primeros auxilios en zonas del Dpto. Comandante Fernndez, Provincia del Chaco, Argentina. Los datos fueron registrados a partir de informacin aportada voluntariamente por profesionales de la salud, sobre casos reportados. Los mismos fueron analizados, corroborados y justificados mediante bibliografa especializada. RESULTADOS Y DISCUSIN Entre plantas medicinales mencionadas como riesgosas: Lippia turbinata Gris., poleo; Aristolochia triangularis Cham., mil hombres; Ruta graveolens L.,ruda; Huperzia saururs (Lam.) Trevis, cola de quirquincho; Brugmansia arborea (L.) Lagerh., floripn; entre otras. Casos letales se registran con el uso inadecuado de Chenopodium ambrosioides L., paico; Alternanthera pungens Humb. et al., yerba del pollo e Illicium verum Hook. F., ans estrellado. La ingesta de yerba del pollo sirve para combatir el estreimiento, pero adems es un potentsimo diurtico; entonces, si no se tiene cuidado, el nio puede terminar deshidratado; el paico, tiene alto grado de ascaridol, que lo hace txico, siendo el principal motivo de intoxicacin en nios, ambas han registrado casos letales. El ans estrellado, en nios y lactantes, se suele utilizar en casos de gastroenteritis y espasmos gstricos e intestinales, sin embargo tambin se sabe que, por su alto contenido en anetol, esta esencia puede resultar txica y hasta mortal, si se la suministra en dosis elevadas, produciendo delirio, irritacin GI y convulsiones. El poleo, que se utiliza como digestivo en la regin noreste, en otras regiones tiene distinta composicin pudiendo generar contracciones uterinas en mujeres embarazadas. La
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mil hombres (Aristolochia spp), que figura en el listado negativo de drogas vegetales para medicamentos fitoterpicos del INAME, es una planta particularmente peligrosa, se trata de un muy buen antirreumtico, pero tambin tiene compuestos que producen intoxicacin crnica, uno de los primeros sntomas es el decaimiento debido a la anemia que produce. (Gurni, 2000). La cola de quirquincho, de propiedades diurticas, es utilizada como afrodisaco, especialmente en los casos de impotencia masculina, puede traer problemas serios en el sistema nervioso central. El t de ruda, utilizado por las adolescentes como abortivo, no slo puede producir convulsiones, sino tambin hemorragias graves, pudiendo ocasionar la muerte. (Usandizaga, 2000). Las plantas medicinales sufren modificaciones cuantitativas en sus constituyentes principales originados por efectos climticos o de crecimiento de la misma, el contenido de ciertas sustancias vara cuando la planta alcanza su mximo desarrollo. La concentracin del principio activo depende de la poca y lugar de recoleccin de las hierbas, de la parte de la planta recolectada, de la forma de preparacin. Muchos principios activos de estos preparados interfieren o interactan con medicamentos prescriptos por el mdico. Adems, quien los usa muchas veces se evita la consulta mdica y se autoprescriben estas hierbas. Tambin se debe evaluar que el gran peligro de estas prcticas radica en que es muy difcil controlar la dosis. Las intoxicaciones por plantas medicinales afectan principalmente a lactantes y nios entre 1 y 5 aos, en un 50% de los casos. La va oral es forma la ms frecuente de administracin, seguida por la transdermal (a travs de la piel) y la inhalatoria. Los grupos de individuos ms propensos a sufrir intoxicaciones por las plantas medicinales son: Nios desde el momento del nacimiento hasta los 2 aos de edad. Es el ms vulnerable de todos los grupos. El sistema enzimtico heptico an no est maduro y por lo tanto no los protege contra posibles intoxicaciones. Esto es vlido para cualquier tipo de medicamento, se deben extremar los cuidados para su administracin. En ancianos el problema es inverso. El estado en que se encontrar el hgado depende del tipo de vida que haya llevado la persona, adems del deterioro lgico debido a la edad. En casos de mujeres en gestacin o lactancia se debern administrar bajo estricta vigilancia mdica. Mujeres frtiles, hay plantas medicinales que poseen principios activos de naturaleza esteroide, que podran interactuar. Otros factores que pueden dar lugar a intoxicaciones
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provienen del mal empleo de la especie (dosis inadecuadas, errores en la va de administracin, errores en la preparacin), de la sustitucin de la parte usada del vegetal y de la confusin con otras especies vegetales. Esto no quiere decir que toda la fitoterapia sea nociva, muchos medicamentos proceden de plantas, pero el conocimiento de las hierbas curativas muchas veces es limitado y se desconoce sus efectos. Por ello, es necesario informar y alertar sobre su correcta administracin y prescripcin. No se recomienda la mezcla de plantas medicinales, por desconocerse la interaccin de sus principios activos y sus efectos an en el mbito del uso tradicional. Tener siempre presente que automedicarse constituye un riesgo. No existen reglas ni mtodos prcticos seguros para determinar cundo una planta puede ser txica. (Chifa, 2005). Todo esto influye en la calidad de vida de la poblacin, si bien esta es sinnimo de progreso (Joo, 1999), las condiciones en que viven, con remuneraciones muy bajas y en donde deben realizar actividades extras, para sobrevivir les llevan a la cultura de la automedicacin sin control empeorando muchas veces sus condiciones de vida. CONCLUSIN En el presente estudio se demostr que las especies Lippia turbinata Gris., Aristolochia triangularis Cham., Ruta graveolens L., Huperzia saururs (Lam.) Trevis, Brugmansia arborea (L.) Lagerh., Chenopodium ambrosioides L., Alternanthera pungens Humb. et al., Illicium verum Hook. F. presentan un riesgo potencial y real de intoxicacin y muerte por el uso indiscriminado y no controlado de su ingesta. Esto demuestra una vez ms que no por ser natural, las plantas con atributos medicinales son inocuas; son medicamentos y deben ser utilizados con cautela, contienen principios activos y actividad farmacolgica, pueden ser tiles para tratar determinadas patologas pero tambin producir efectos adversos. Se debe prestar mayor atencin al consumo y expedicin de este tipo de material sin el debido control de especialistas en la materia. REFERENCIAS
Chifa C. 2005. Plantas Medicinales Usadas por las Comunidades Aborgenes del Chaco Argentino. (Castellano, Mocov, Wich, Toba). Universidad Nacional del Nordeste. Editorial Universitaria de la Universidad Nacional del Nordeste. Edicin realizada
Marinoff et al.
por Estudio Sigma S.R.L.. Buenos Aires, Argentina. P.p.28. Joo I. 1999. Tesis para optar al ttulo de Qumico Farmacutico, Pontificia Universidad Catlica de Chile. Gurni AA. 2000. Las hierbas curativas y un trgico final.. De inters general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15. Martnez JL & Marinoff MA. 2008. Historia de las plantas medicinales: su evolucin e implicancias en Chile, Capitulo 8 en: Comprender el mundo a travs de la Historia de la Ciencias. Mario Quintanilla y Gerardo Saffer, compiladores. Una produccin G.R.E.C.I.A. Universidad Catlica de Chile, Santiago de Chile. Pp 49 58.
Medina E. 1999. Autoatencin domstica de la salud en Chile Rev Chilena Salud Pblica 3(2-3):118-125. Ricciardi AIA. 2001. Toxicologa de las Especies Vegetales Autctonas e Implantadas del centro Norte Argentino. Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Norte. 124pp. Rizzo, 2000. La idealizacin de un producto que muchas veces resulta peligroso para el ser humano. De inters general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15. Usandizaga, 2000. Recomendaciones para tener en cuenta. De inters general, Diario Hoy. Ed. Diario Hoy S.A.. La Plata, Buenos Aires, Argentina. p.p.15.
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas

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Pylaisia polyantha (Schreb.) Bruch et Schimp.

Volumen 8, Nmero 3, Mayo de 2009

Comit Editorial | Editorial Board

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas

En el sptimo aniversario de BLACPMA

Nota Editorial. El sptimo aniversario de BLACPMA

Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA, Chilln 2009

*Contacto: e-mail: blacpmachile@gmail.com

Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA, Chilln 2009

Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA, Chilln 2009

Vista de la celebracin de la Tercera Reunin del Comit Editorial de BLACPMA.

Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review

*Contacto | Contact: e-mail: reinaldoan@uol.com.br

Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review.

Kingdom Division Class Order Family Subfamily Genus Main species

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Anti-inflammatory effect of an ethanolic root extract of Heliopsis longipes in vitro

Heliopsis longipes anti-inflammatory effects in vitro

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*Contactos | Contacts: jorgeandresgut@gmail.com ; alfonsolo@uniquindio.edu.co; Tel (+57)6-7460100.

Plaguicidas en tomates de mercados de cadena colombianos

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Aldrin -BHC -BHC Disulfoton Forato -BHC Heptacloro Sulfotep

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grandes desequilibrios ecolgicos bioacumulandose y biomagnificandose.

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Figura 3: Tomates Larga Vida obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Armenia.

Figura 4: Tomates Orgnicos obtenidos en mercados de cadena de la ciudad de Pereira.

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Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum

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Onset of sleeping (min)

7.5 ** 5.0 *** 2.5 0.0 *** *** ***

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% % Convulsion Death 100 10

60e 100 100 100

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*Contactos | Contacts: E-mail: maykelpm@iscm.vcl.sld.cu

Prez Machn et al.

Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas

Prez Machn et al.

Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas

Prez Machn et al.

Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas

Grupo tratado Grupo control

Significacin estadstica: *p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001, test Mann-Whitney

Prez Machn et al.

Efecto de Boldoa purpurascens Cav. sobre diferentes variables fisiolgicas en ratas

0,14 0,05 0,15 0,07

0,85 0,49 0,83 0,07

0,004 0,006 0,003 0,005

7.5 5.0 * 2.5 0.0 * * ***

Significacin estadstica: p<0.05, p <0.01, p<0.001, test Mann-Whitney

Significacin estadstica: p<0.05, p <0.01, p<0.001, test Mann-Whitney