GUIA DE LABORATORIO QUMICA APLICADA A LA INDUSTRIA PREPARADA POR: SONIA M BUITRAGO M. PRODUCCIN DE METABOLITOS DE INTERS A PARTIR DE INCULOS MICROBIANOS.

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1. INTRODUCCIN El crecimiento de un microorganismo se define como un incremento progresivo de clulas cuando se les proporciona un sustrato adecuado rico en nutrientes, vitaminas y minerales. Durante este proceso, muchos microorganismos son capaces de usar estos nutrientes para llevar a cabo sus procesos celulares y muchos de sus funciones eliminando productos de desecho al medio. Para la obtencin de metabolitos de inters, es necesario el uso de bioprocesos para tal fin. En un proceso fermentativo, los sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana. El microorganismo de inters va aumentando su biomasa en el transcurso del proceso y al mismo tiempo el sustrato se va consumiendo con formacin de productos como consecuencia de las actividades catablicas y anablicas. Los dos fenmenos tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultneamente. Para que se lleve a cabo el proceso fermentativo es necesario conocer las variables involucradas en el proceso como tiempos, temperatura, disponibilidad de oxgeno, pH, fase de crecimiento de los microorganismos y disponibilidad de nutrientes entre otras. Con el control de estos parmetros, se garantiza que los procesos que ocurren en el interior del fermentador sean los apropiados y ptimos para el desarrollo del microorganismo y la produccin de los metabolitos de inters. 2. OBJETIVOS - Evaluar la produccin del metabolito de inters con los microorganismos seleccionados, usando como fuente de carbono azcares fermentables. - Manejar las variables de un proceso fermentativo como pH, contenido de azcares fermentables, temperatura y tiempo. - Cuantificar por medio de la tcnica de espectrofotometra la biomasa en funcin del tiempo. - Determinar el consumo de sustrato en funcin del tiempo utilizando la tcnica de azcares reductores 3,5 Dinitrosaliclico. - Cuantificar por medio de tcnicas directas como recuento en cmara de Neubauer y recuento en placa la cantidad de microorganismos obtenidos en el inculo en funcin del tiempo.

3. METODOLOGA 3.1 Elaboracin del mosto a utilizar De acuerdo a la materia prima que el grupo proyecto est trabajando, pesar los siguientes reactivos y agregarlos al sustrato.

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REACTIVO Azcares fermentables Extracto de levadura KH2PO4 MgSO4 7H2O Peptona (NH4)2 SO4

CANTIDAD g/L 200 3 1 0,5 5 0,5

Ajustar el pH a 5,5 con una solucin de NAOH al 0,1N 3.2 Montaje de la fermentacin discontinua - Lleve a autoclavar el mosto a 7 lb de presin por 7 minutos despus de haberlo filtrado y clarificado. - Deje enfriar el mosto hasta 30 C 1 - Tome una alcuota de 50 ml , centrifguelos a 4600 rpm por un periodo de 15 minutos. Tome el sobrenadante, descartando el precipitado y realice la medicin de azcares reductores con lo que comenzar su fermentacin. Para esto utilice la tcnica de DNS explicada en el numeral 6.3 - Para la realizacin del inculo, tome el 10% del total del medio de cultivo y ajuste su turbidez al 8 patrn nmero 2 de MacFarland. La concentracin de este patrn 6x10 UFC/ml. - Tome 0,5 ml del inculo puro y dilyalo con 4,5 ml de solucin salina estril. - Agregue una gota de azul de metileno a cada uno de los tubos. - Colocar con la ayuda de un capilar tome 10 L de la dilucin y realice el montaje en la cmara de Neubauer. - Enfoque primero a 4X la cmara y luego psela a 40X con el cuidado de no partir la laminilla ni la cmara. - Revise que las clulas se encuentren en proceso de gemacin y que se encuentren viables. - Realice una coloracin de Gram - Una vez confirmado la viabilidad de las levaduras, adicione el inculo a la fermentacin, homogenice y tome una muestra de 5 mL en condiciones estriles. Esta muestra la utilizar ms adelante para determinar la curva de crecimiento microbiano, el recuento por espectrofotometra y el recuento en placa. - Tapa bien el frasco de su fermentacin y llvelo al agitador por un periodo de 7-12 das a 20 C y 120 rpm. - Usted debe realizar muestreos de un volumen final de 20 mL a las siguientes horas Hora 0 (inicio de la fermentacin), Hora 48 (2 das), Hora 60 (3 das), Hora 120 (6 das), Hora 144 (7 das), Hora 192 (9 das), Hora 240 (da 11). Deposite estos muestreos en tubos estriles para evitar cualquier tipo de contaminacin. 3.3 Curva patrn para la determinacin de azcares reductores 3.3.1 Preparacin base del reactivo DNS - Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alto poder cancergeno.

Esta solucin la deber mantener estril y se utilizar en el numeral 6.3 cuando se mida recuento de biomasa por espectrofotometra, usndola como blanco.

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Para la adicin del DNS, se debe tener en cuenta, que este en solucin es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente mbar o en su defecto cubrir el erlenmeyer con papel aluminio Disuelva 1,6 g de NaOH al en agua destilada. Llevar a agitacin hasta obtener una solucin homognea. A esta solucin se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y 1 gramo de DNS (cido 3 5 dinitrosaliclico). Aforar a 100 ml con agua destilada Almacenar en frascos mbar a 4 C

3.3.2 Preparacin de las soluciones de concentraciones conocidas 0.5-2 g/L Prepare las muestras a diferentes concentraciones a partir de la solucin concentrada de glucosa 2 g/L/. Tenga en cuenta que esta concentracin es la C1 y que el volumen final de cada concentracin ser de 10 ml. Con la ayuda de la siguiente frmula prepare las diferentes concentraciones
V1 x C1 = V2 x C2 Donde C1: concentracin de glucosa concentrada 2 g/L V1: volumen de la solucin concentrada C2: concentracin de la solucin diluida V2: volumen del diluyente

Una vez tenga los clculos complete la tabla que se tiene en los resultados

3.3.3. Determinacin de la concentracin de glucosa por la tcnica de DNS Con las soluciones anteriores preparadas y de concentracin conocida, depositar 0.25 mL de cada una en tubos de ensayo. Cuando las haya dispuesto en cada tubo, contine con el procedimiento lo descrito en la siguiente tabla, no olvide antes de comenzar colocar papel de aluminio a cada tubo para cubrirlo de la luz.
Blanco 0.5 0.5 0.7 0.5 1 0.5 Concentracin g/L 1.5 0.5

Reactivo

2 4 Glucosa 0.5 0.5 (mL) Agua 0.5 (mL) Reactivo DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 (mL) * Calentar a ebullicin los tubos de ensayo sin el papel de aluminio por 5 minutos y posteriormente detener la reaccin por inmersin de los tubos en hielo durante 5 minutos. Agua 5 5 5 5 5 5 5 Destilada (ml) Agitar y dejar en reposo por 15 minutos. Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio y realizar las determinaciones de absorbancia a 540 nm, ajustar a cero de absorbancia con el blanco.

(Miller, G. 1959)

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Realice las mediciones de las absorbancia a 540 nm y complete la tabla que se encuentra en los resultados.

3.4 Determinacin de biomasa por espectrofotometra - De cada una de las horas muestreadas, tome 5 ml y llvelas al espectrofotmetro para medir el 2 aumento de la biomasa. Tome como blanco la alcuota de 50 ml que tom del medio estril sin inocular. 3.5 Determinacin de biomasa por tcnica de recuento en placa en profundidad - De los muestreos respectivos, realizar un recuento en placa en profundidad. - Realice los recuentos sugeridos en la tabla para realizar esta determinacin Hora a muestrear Hora 0 (inicio de fermentacin) Hora 48 (2 da) Hora 60 (3 das) Hora 120 (6 da) Hora 144 (7 da) Hora 192 (9 da) 3 Hora 240 (11 das) Diluciones a sembrar -6, -7, -8 10 10 10 10 10 10 -10, -11, -12 10 10 10 -10, -11, -12 10 10 10 -10, -11, -12 10 10 10 -10, -11, -12 10 10 10 -7, -8, -9 10 10 10
-9, 10, -11

la

Tincin de Gram Tincin

Tincin Tincin

Realice la siembra de 1 ml de cada dilucin por duplicado en cajas de Petri estriles. Inmediatamente despus, agregue 20 ml del agar seleccionado (Saboroaud) que se encuentre a una temperatura de 42 C sobre la caja de Petri con la muestra y homogenice, siguiendo estos movimientos

Deje gelificar el agar, marcar las cajas en el reverso de la caja y sobre los bordes. Llevar a incubar a 30 C por un periodo de 72 horas. Despus del periodo de incubacin realice el recuento de cada una de las cajas de petri. Informe en la tabla de resultados.

2 3

La solucin que utilizar como blanco, es la que se obtuvo en el numeral 6.2 Despus de este tiempo prepare una solucin de agar agar al 1,5% y agregue 15 ml de esta solucin al fermento. Esto con el fin de comenzar a suspender los slidos suspendidos.

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3.6 Medicin de pH De cada uno de los muestreos y con ayuda de un pH metro, realice la medicin de pH durante su fermentacin. Si el pH baja ms de 4,5 agregue NAOH 0,1 N estril a su fermento para evitar inhibicin por pH bajo.

3.7 Proceso de separacin de clulas del producto de inters - Centrifugue su fermento a 7000 rpm por 5 minutos. - En el proceso separe el sobrenadante en un frasco plstico estril y descarte el precipitado que corresponde a las clulas. - Guarde el sobrenadante (extracto crudo) a una temperatura de refrigeracin para sus posteriores anlisis.

RESULTADOS 4.1. Absorbancias de la curva patrn

Concentracin g/L 0.5 0.7 1 1.5 2 4 Absorbancia 540 nm

Realice la regresin lineal de los datos de absorbancia en funcin de la concentracin (ABS Vs Conc) y determinar la ecuacin de la lnea recta. Abs 540 nm = m*s+b Donde: S: concentracin de glucosa en g/L b: punto de corte (intercepto) con el eje Y m: pendiente de la recta 4.1.1 Representacin grfica de resultados Graficar la absorbancia en funcin de la concentracin de glucosa e incluir la ecuacin de la lnea 2 recta con el coeficiente de determinacin (R ) 4.2 Determinacin de azcares reductores - Con la ayuda de la ecuacin de la lnea recta Y=mx+b obtenida en la curva patrn de la glucosa, remplace x para obtener la concentracin de azcares reductores presentes en cada hora de fermentacin. No olvide que Y= a la absorbancia obtenida.

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Tiempo (horas) Hora 0 (inicio de la fermentacin) Hora 48 (2 da) Hora 60 (3 das) Hora 120 (6 da) Hora 144 (7 da) Hora 192 (9 da) Hora 240 (11 das)

ABS

Sustrato residual

Realice una grfica donde se represente el consumo de sustrato respecto al tiempo de fermentacin. el tiempo y las clulas que conto en la cmara por mililitro. 4.3 Determinacin de biomasa por espectrofotometra
Tiempo (horas) Hora 0 (inicio de la fermentacin) Hora 48 (2 da) Hora 60 (3 das) Hora 120 (6 da) Hora 144 (7 da) Hora 192 (9 da) Hora 240 (11 das) ABS

Realice una grfica donde se represente el tiempo y la absorbancia obtenida durante la fermentacin.

4.4 Determinacin de microorganismos por recuento en placa

Tiempo (horas) Hora 0 (inicio de la fermentacin) Hora 48 (2 da) Hora 60 (3 das) Hora 120 (6 da) Hora 144 (7 da) Hora 192 (9 da) Hora 240 (11 das) UFC/mL

Realice una grfica donde se represente el tiempo y las UFC/mL que conto en caja de Petri.

4.5 Determinacin de pH
Tiempo (horas) Hora 0 (inicio de la fermentacin) Hora 48 (2 da) Hora 60 (3 das) Hora 120 (6 da) Hora 144 (7 da) Hora 192 (9 da) Hora 240 (11 das) pH

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Realice una grfica donde se represente el tiempo y el pH obtenido durante la fermentacin.

ANLISIS DE RESULTADOS CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS BIBLIOGRAFA CONSULTADA

Alarcn, A.V. (2010). Produccin de bioetanol con Zymomonas mobilis. Tesis de Maestra, Instituto Politcnico Nacional. Mxico. Pedroza, A.M, et al. (2007). Manual de laboratorio de procesos biotecnolgicos. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Bogot (Colombia). p 47-51. Pedroza, A.M, et al. (2007). Manual de introduccin a la Biotecnologa. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Bogot (Colombia). p 81-86