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MTODOS OFICIALES DE ANLISIS DE VINOS

A. LEGISLACIN VIGENTE SOBRE LOS MTODOS OFICIALES DE ANLISIS DE VINOS A.1. REGLAMENTO DE LA (CCE) PARA LA DETERMINACIN DE LOS MTODOS DE ANLISIS APLICADOS EN EL SECTOR DEL VINO B. MTODOS EMPLEADOS EN ANLISIS DE VINOS 1. DETERMINACIN DE MASA VOLUMTRICA Y DENSIDAD RELATIVA 2. GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO 3. EXTRACO SECO 4. AZCARES REDUCTORES 5. SACAROSA 6. GLUCOSA Y FRUCTOSA 7. CENIZAS 8. ALCALINIDAD DE CENIZAS 9. CLORUROS 10. SULFATOS 11. ACIDEZ TOTAL 12. ACIDEZ VOLTIL 13. CIDO TARTNICO 13.1 MTODO GRAVMETRO 14. CIDO L-MLICO 15. CIDO CTRICO 16. CIDO LCTICO 17. CIDO L-MLICO 18. CIDO SRBICO 18.1. DETERMINACIN POR ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA 18.2. MTODO DE DETERMINACIN POR CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA 18.3. MTODO DE DETECCIN DE TRAZAS DE CIDO SRBICO POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA 19. CIDO L-ASCRBICO 19.1. MTODO COLORMETRO 20. PH 21. DIXIDO DE AZUFRE 22. SODIO 23. POTASIO 23.1. MTODO POR FOTOMETRA DE LLAMA 24. MAGNESIO 25. CALCIO 26. HIERRO 27. COBRE 28. CADMIO 29. PLATA 30. CINC 31. FLUORUROS 32. DIXIDO DE CARBONO 33. CIANO-DERIVADOS 33.1. MTODO DE ENSAYO RPIDO 34. ISOTIONATO DE ALILO 35. NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU

A. LEGISLACIN VIGENTE SOBRE LOS MTODOS OFICIALES DE ANLISIS DE VINOS. A.1. REGLAMENTO DE LA (CCE) PARA LA DETERMINACIN DE LOS MTODOS DE ANLISIS APLICADOS EN EL SECTOR DEL VINO. El presente reglamento sobre mtodos de analtica de vino est formado por diferentes artculos que expresan las medidas que se deben de emplear para su analtica. Se citarn algunos de ellos: Articulo 1. Debe figurar en el anexo del presente reglamento los mtodos de anlisis aplicados al sector del vino, para su debido control y para las operaciones comerciales. - Se debe comprobar si dichos anlisis o tratamientos responden a prcticas enolgicas autorizadas. Articulo 3. Se admiten anlisis mecanizados, siempre bajo la responsabilidad del director de laboratorio y siempre que se asimilen a los resultados de anlisis que figuran en el anexo. En caso de dar resultados inequivalentes los mtodos que figuran en el anexo no deben ser sustituidos por los obtenidos de forma automatizada. El mtodo automatizado que mide la densidad basado en un resonador de flexin es considerado equivalente a los mtodos de anexo del reglamento. Articulo 4. Cuando se haga referencia a agua para lavado. Soluciones o diluciones siempre debe tratarse de agua destilada o desmineralizada

B. MTODOS EMPLEADOS EN ANLISIS DE VINOS. DETERMINACIN DE LOS MTODOS DE ANLISIS APLICADOS EN EL SECTOR DEL VINO. 1. MASA VOLUMTRICA A 20 C Y DENSIDAD RELATIVA A 20 C. Masa volumtrica a 20 C: Trata del cociente de masa de un determinado volumen de vino o mosto a una temperatura de 20 C por ese volumen. Se expresa como grados por mm y el smbolo que adopta es r2 20 C. Densidad relativa a 20 C: Es la relacin en forma decimal, entre la masa de un cierto volumen de vino o mosto a una temperatura de 20 C y la masa del mismo volumen de agua tambin a 20 C. Fundamento del mtodo. La masa y densidad a 20 C se determinan en una muestra de ensayo mediante: - Picnometra - Aerometra o densiometra con balanza hidrosttica. Material de laboratorio. Picnmetro. Es de vidrio con una capacidad de 100 ml, con termmetro mvil, sus mediciones estn graduadas en dcimas de grado. El picnmetro se compone de un tubo de 25 mm de largo con 1 mm de dimetro y colocado en posicin lateral. El tubo lateral est cubierto por un tapn que sirve de cmara de dilatacin. Frasco. Es del mismo volumen y masa que el picnmetro. Se ajusta este recipiente a la estructura global del picnmetro. Balanza de dos platos: Tiene una capacidad mnima de 300g Procedimiento del mtodo. Se incorpora el frasco en el plato izquierdo de la balanza y el picnmetro en el derecho y equilibrar. Se llena con cuidado el picnmetro con agua destilada, se coloca el termmetro y se introduce dentro del recipiente termostato. Se agitan continuamente hasta que el termmetro marque una temperatura cte. Se enrasa con agua todo el tubo lateral, se seca y se incorpora el tapn y se va observando la temperatura. Se pesa el picnmetro lleno de agua. Se debe efectuar las siguientes mediciones, - Tara del picnmetro en vacio. - Volumen de 20 C. - Masa de agua a 20 C. AEROMETRA. Para Este mtodo se utiliza un aparato llamado aremetro . Los aremetros son de cuerpo cilndrico y de un dimetro de 3 mm. Para medir la densidad de los vinos desalcoholizados, vinos dulces, mostos se usan por lo menos cinco juegos de aremetros de: 1000->1030 1030->1060 1060->1090 1090->1120 1120->1150 Estos cinco aparatos se gradan segn la masa volumtrica a 20 C. Material Termmetro contrastado, graduados en grados Celsius Probeta cilndrica. De 36 mm de dimetro interno y 320 mm de altura. Procedimiento Se vierte en la probeta cilndrica de 36 mm una cantidad de 250 ml de muestra preparada en el ensayo (3); se introduce el aremetro y el termmetro. Se observa lo que marca el termmetro pasado 1 min de tiempo, despus de haber equilibrado la temperatura. Se retira el termmetro y se anotan las mediciones de masa volumtrica que queda sobre el tallo del termmetro. BALANZA HIDROSTTICA Tiene una capacidad mxima de 100g. Debajo de cada plato lleva incorporado un flotador de vidrio con un volumen aproximado a 20 ml y que ambos flotadores se encuentran suspendidos de un hilo En el flotador del plato derecho se introduce una probeta cilndrica con una marca de nivel y de dimetro interno superior a 6 mm al dimetro del flotador. El flotador debe introducirse por completo en el volumen de probeta situada debajo de la marca. Solo puede atravesar el liquido el hilo suspendido. La temperatura del liquido de la probeta se medir mediante un termmetro El calibrado de la balanza hidrosttica es mediante la suspensin de los dos flotadores. Procedimiento El flotador de la derecha se sumerge en la probeta llena de vino ( o de mosto) hasta la marca. Se lee la temperatura del vino en (C). 2. GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO Se define como grado alcohlico volumtrico a los litros de etanol contenidos en 100 ml de vino medidos ambos volmenes a una temperatura de 20 C y se representa el grado alcohlico como ( % vol ). Fundamento del mtodo. - Destilacin del vino mediante suspensin de hidrxido de calcio. - Determinacin de la masa volumtrica del destilado por picnometra.

- Mtodos usuales: * Determinacin del grado alcohlico por aerometra. * Determinacin del grado alcohlico por desiometra o con balanza hidrosttica * Determinacin del grado alcohlico por refractomera. Para la obtencin del destilado se utiliza el siguiente material. Material - Matraz de fondo redondo de l de capacidad. - Columna rectificadora de 20 cm de altura. - Fuente de calor. - Una probeta tipo Watson. - Refrigerante terminado en tubo que conduce el destilado hasta el matraz, conteniendo este ltimo una cantidad de pocos mml de agua destilada. - Aparato de arrastre de vapor de agua, formado por: 1. generador de vapor de agua. 2. borboteador. 3. columna rectificadora. 4. recipiente. Se debe destilar 5 veces consecutivas una mezcla hidroalcohlica de 10% en vol. Despus de la quinta destilacin la muestra debe presentar un grado de 9.9 % vol. sin que se produzca una prdida de moles superior a 0.02% vol durante el proceso de cada destilacin. Los reactivos utilizados son: - Hidrxido de calcio 2M, en suspensin. En los vinos jvenes y espumosos deben de eliminarse previamente la presencia de dixido de carbono de forma que se agita una cantidad de vino de 250 a 300 ml en un erlenmeyer de capacidad 500 ml. Se incorpora de nuevo a un matraz una cantidad de 200 ml de vino, se anota su temperatura, se vierte a un aparato de destilacin o al borboteador del aparato de arrastre por vapor de agua, se aaden 20 ml de hidrxido clcico y fragmentos porosos inertes. Se recoge un volumen de estilado de 198-199 ml y se completa a 200 ml con agua destilada y a una TI igual a la inicial del destilado. Ejemplo de clculo del grado alcohlico de un vino, mediante PICNOMETRA CON BALANZA DE DOS PLATOS. Primeramente SE deben de determinar las constantes del picnmetro y el clculo de la masa volumtrica y la densidad relativa. Para el picnmetro lleno de destilado. Ejemplo: Tara = Picnmetro +destilado a T (C). T=28.70 C P= 2.8074 g

Masa del destilado a T(C) = P+ mP"

3. EXTRACTO SECO. DETERMINACIN Se entiende por extracto seco o materia seca al conjunto de substancias que no se volatizan en unas determinadas condiciones fsicas. Extracto reductor: Es el extracto seco menos los azcares totales que exceden de 1 g/l, el sulfato potsico y todas aquellas substancias qumicas que pudieran haberse aadido al vino. El extracto se expresa en ( g/l ) y presenta un porcentaje que va desde 0.5 a 2 g. Fundamento del mtodo. "Mtodo densmetro". El extracto seco total se calcula a partir de la densidad del vino desalcoholizado y se expresa el extracto como la cantidad de sacarosa disuelta en una cantidad de agua que llegue a formar una cantidad de 1 l. Para dar una solucin con la misma cantidad de residuo de vino sin alcohol. Procedimiento Se calcula la densidad del vino desalcoholizado (dr) dv = densidad relativa del vino a 20 C da = densidad relativa de la mezcla hidroalcholica que tiene el mismo grado alcohlico que tiene el mismo grado alcohlico que el vino, medida tambin a 28C. 1,000 = Coeficiente. dr = dv + da + 1,000 En cuanto a la expresin de los resultados, el extracto seco total se expresa en g/l cm con 1 decimal. 4. AZCARES REDUCTORES Los azucares reductores estn formados por un conjunto de azcares con una funcin cetnica o aldehdica con accin reductora sobre la solucin cupro-alcalina. Fundamento El vino neutralizado y sin alcohol pasa por una columna donde sus aniones son cambiados por iones y posteriormente se realiza la defecacin por acetato neutro de plomo. El vino se trata con uno de los dos siguientes reactivos: a). Acetato neutro de plomo b). Ferrocianuros de cinc. Determinacin Se hace reaccionar el vino defecado con una cierta cantidad de solucin cuproso-alcalina determinndose el exceso de iones cpricos por yodometra. Se debe evitar diluir el vino seco durante la defecacin, mientras que el vino dulce es lo contrario para as conseguir mayor contenido en azcares. La defecacin con acetato neutro de plomo, se procede en vinos secos de la siguiente forma: Se aaden 50 ml en un matraz de 100 ml aadiendo 1/2 (n 0.5) ml de solucin molar M de hidrxido de sodio donde n es el volumen de solucin 0.1 M para determinar la acidez de 10 ml de vino, se aaden 2.5 ml de solucin saturada de acetato de plomo y 0.5 g de carbonato clcico y dejar en reposo unos 15 minutos. Por ltimo se enrasa con agua y se filtra 1 ml de este preparado. Se toman 100ml de vino seco. Dicho procedimiento de defecacin debe utilizarse para vinos blancos, dulces poco coloreados y mostos.

5. SACAROSA. FUNDAMENTO DEL MTODO. Para la deteccin de la sacarosa de un vino se utiliza el mtodo de DETECCIN CUALITATIVA POR CROMOTOGRAFA EN CAPA FINA con placas de celulosa. La sacarosa interacciona con el reactivo Urea-cido clorhdrico en estufa a 105 C. Material. - Capas de cromatografa de caspas de capa fina de celulosa. - Cubeta de cromatografa. - Jeringa micromtrica o micropipeta. - Estufa - Reactivos - Carbn activo - Revelador, Urea 5g cido clorhdrico 2M 2 ml, Etanol 100 ml, - Solucin de referencia glucosa de 35 g. Preparacin de la muestra Si el vino tiene mucho color la decoloracin se hace con tratamiento de carbn activo. Se determinar el pH y se diluir la cantidad de 25 ml de solucin en un matraz aforado hasta alcanzar una medida de 25 ml. Para obtener el cromatograma se aaden 2.5 cm 10(l de la muestra y 10(l de solucin de referencia. Se coloca la placa en la cubeta y se deja ascender el lquido hasta una altura de 1 cm del borde superior. Se retira la placa de la cubeta y se seca. Repetir dos veces esta misma operacin. Se pulveriza la placa con 15 ml de revelador y se mantiene en estufa a 105 C durante un tiempo aproximado de 5 minutos. Resultado La sacarosa y fructosa aparecen en una tonalidad azul oscura en forma de mancha sobre un fondo blanco, la fructosa adoptas una tonalidad ms bien verdosa. 6. GLUCOSA Y FRUCTOSA La glucosa y fructosa se determinan por un proceso enzimtico para calcular la relacin glucosa/fructosa. Fundamento El fundamento consiste en fosforilizar la glucosa y fructosa con adenosn-trifosfato (ATP) mediante una reaccin enzimtica catalizada por la hexoquinasa (HK) obtenindose como resultado glucosa -6-fosfato (G6P) y fructosa-6-fosfato (F6P). Glucosa + ATPG6P + ADP Fructosa + ATPF6P + ADP. La glucosa 6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato mediante (NADP) en presencia de (G6PDH). La cantidad de (NADPH) corresponde a la cantidad de glucosa-6-fosfato por la accin de la fosfoglucosa-isomerasa (PGI) Preparacin de la muestra Se efectan las diluciones segn la cantidad de glucosa + fructosa/ litro. Regulando el espectrmetro a una longitud de onda de 340 nm, se toman las medidas con respecto al aire y al agua. Temperatura de 20 a 25 C. En las cubetas se introducen: - Testigo determinacin solucin 2.50 ml - Muestra que va a determinarse 0.20ml. - Agua destilada 0.20 ml. Se mezclan y transcurridos 3 minutos, se lee las absorbancias de la solucin. Posteriormente se desencadena la solucin con una solucin 0.02 ml. Se mezcla y se mantiene un tiempo de 15 min. Se mide la absorcin y se aporta la disminucin de la reaccin. Clculo La frmula para el clculo de concentracin es: V = Volumen del ensayo (ml) v = Volumen de la muestra. PM = Peso molecular de la sustancia que se va a determinar. d = Trayecto ptico de la cubeta. E = Coeficiente de absorcin del NADPH a 340 nm. V = 2.92 ml para la determinacin de la glucosa. V = 2.92 ml para la determinacin de la fructosa. v = 0.20 ml PM = 180 d=1 para glucosa se obtiene Cg/l = 0.417 DAG para fructosa se obtiene Cg/l = 0.420 DAF. 7. CENIZAS Las cenizas son un conjunto de productos obtenidos como el resultado de la incineracin de residuos de evaporacin del vino, llevada a cabo esta incineracin para la obtencin de la totalidad de los cationes. Mtodo. Incineracin del extracto de vino a una temperatura de 500 a 550 C hasta la combustin del carbono. Material 1. Bao de agua a 100 C. 2. Balanza. 3. Placa calefactora. 4. Horno elctrico (con temperatura de regulacin). 5. Desecados. 6. Cpsula de platino de 70 mm de dimetro y de 25 mm de altura. Proceso Se coloca 20 ml de vino en una cpsula de platino, evaporando a una temperatura de 100 C en agua y se calienta el residuo en esa placa calefactor a 200 C hasta la carbonizacin. Se aaden 50 ml de agua destilada y se calienta de nuevo a 525 C durante un tiempo de 10 minutos ( En vinos ricos en azcares se recomienda aadir gotas de aceite vegetal puro antes de realizar la primera incineracin). Despus se seca y se pesa la cpsula y se obtiene un peso que ser: P1 g. Peso de las cenizas ser: P = (P1 - Po) g/l 8. ALCANILIDAD DE LAS CENIZAS

La alcalinidad de las cenizas trata de la suma de los cationes de amonio que se encuentran mezclados en los cidos orgnicos del vino. Fundamento del mtodo. Valoracin por retroceso de las cenizas solubilizadas en caliente por exceso de cido valorado. Reactivos 1. Solucin de cido sulfrico 0.05 M. 2. Solucin hidrxido sdico 0.1 M. 3. Solucin de naranja de metilo al 0.1% en agua destilada. 4. Bao de agua a una temperatura igual a 100 C. Proceso Se aade a la cpsula que ya contiene las cenizas, 10 ml de cido sulfrico. Luego se coloca en agua a 100 C durante 15 minutos. Se aade de 2 a 3 gotas de naranja de metilo y se valora el exceso de cido sulfrico con una solucin 0.1 M de hidrxido de sodio hasta que el indicador adopte una tonalidad amarilla. Clculo Alcalinidad de las cenizas = meqv/l A = 5 (10n)n igual al nmero de milmetros de hidrxido sdico. 9. CLORUROS Los cloruros son determinados en el vino de forma directa por Potenciometra con la utilizacin de un electro. Material 1. pH. 2. Agitador magntico. 3. Electrodo de Ag/AgCl. 4. Microburetra con medidores de centsimas de milmetro. 5. Cronmetro. Reactivos a) Solucin patrn de cloruros. 2.1027g de cantidad de cloruro potsico (KCl) desecado previamente antes de su utilizacin, se diluye en agua destilada y se completa a 1l. b) Solucin valorada de nitrato de plata (AgNO3) 4.7912g para anlisis. Se disuelven y se enrasan hasta 1l con solucin alcohlica del 10% (v/v) 1 ml. c) cido ntrico puro al menos del 65%. Proceso 1.) Se introducen 5 ml de solucin patrn (cloruros) en un vaso precipitado. Se agita con agitador magntico y se diluye a 100 ml con agua destilada y se aade cido ntrico 1 ml al 65%. Se introduce el electrodo en el vaso de precipitado y se determina aadiendo por medio de la microburetra la solucin valorada de nitrato de plata. 2.) 5ml de solucin patrn de cloruros se introduce en un vaso de precipitado a 150 ml y 1ml de cido ntrico del 65%. Se introduce el electrodo y se valora hasta obtener un punto de equivalencia. Esta operacin se repite tantas veces hasta alcanzar una buena homogeneidad en los resultados. 3.) Se introducen 50 ml de vino a analizar en un vaso de precipitado a 150 ml de cido ntrico y 1 ml de cido ntrico de 65% y se valora como en el apartado 2. Clculos N = nmero en mml de solucin patrn de (AgNO3) nitrato de plata. 20x n expresado en mml de Cl por litro. 10. SULFATOS Mtodo. Precipitacin del sulfato de bsico y pesado del mismo. El fosfato de bario precipitado se elimina por lavado con cido clorhdrico. Reactivo 1. Soluciones. 2. cido clorhdrico solucin 2 M. 3. Cloruro brico en solucin de 200 g/l. Proceso En un vaso de centrifugacin se introducen de 40 a 50 ml de muestra a analizar, aadiendo 2 ml de cido clorhdrico 2M y 2 ml de cloruro de bario. Se agita y se deja en reposo 5 minutos. Posteriormente se realiza centrifugacin durante 5 minutos y se lava el precipitado de sulfato brico. Posteriormente se transvasa el precipitado a una cpsula de platino que se coloca en un bao de vapor a 100C hasta evaporacin. El precipitado se calcina varias veces hasta obtener un residuo de color blanco. Este residuo es pesado. Proceso de eliminacin de anhdrido sulfuroso En un matraz cnico de 500 ml se introducen 25 ml de agua y 1 ml de cido clorhdrico puro. Se hierve para expulsar el aire y por el embudo se introducen 100 ml de vino manteniendo la ebollucin hasta que el contenido del matraz pase a 75 ml y posteriormente se enfra en un matraz aforado de 100 ml. Se completa el volumen con agua destilada y se valora los sulfatos. Expresin de los resultados a) Contenido de sulfatos en (mmg/l) de sulfato potsico (SO4K2). b) Contenido en sulfatos de vino (mmg/l) sulfato de potasio sin diluir. 11. ACIDEZ DE TOTAL La acidez es la suma de los cidos cuando se lleva a un pH=7 aadiendo una solucin alcalina. La valoracin se hace mediante potenciometra o valoracin con azul de bromotimol como indicador de final reaccin. Reactivos - Solucin tampn pH= 7. - Fosfato monopotsico (KH2PO4) - Solucin molar de hidrxido sdico 0.01 M (NaOH). - Solucin de azul de bromotiol de 4g/l. Al 96% (C27H28Br2O5S)4. Material.

1.Trompa de vaco. 2.Matraz kitasaco de 500ml. 3.Potenciometro con escala graduada en unidades de pH y electrodos. 4.Vasao de precipitado. Proceso Se prepara la muestra. Al vino se le elimina el dixido de carbono. Se coloca 50 ml de vino en un matraz kitasato y se realiza el vaco con trompa de agua. Se efecta un calibrado de pH a 20 C, mediante la solucin tampn de pH=7 a 20 C Para obtener el patrn de coloracin, se vierte en un vaso de precipitado 25ml de agua destilada hervida con 1ml de azul de bromotimol y 10ml de vino. Se aade a la solucin hidrxido de sodio 0.1 M hasta obtener una coloracin verde azulada. Se denominar n al nmero de mililitros de solucin de hidrxido sdico 0.1 M. Clculo La acidez expresada en meqv/l ser: A = 10 n A2 = 0.075 acidez total expresada en gramos de cido tartmico/l 12. ACIDEZ VOLATIL La acidez voltil es la formada a partir de los cidos grasos pertenecientes a la serie actica de los vinos. Fundamento. Valoracin de los cidos voltiles del vino por arrastre de vapor de agua y rectificacin de los vapores( previamente se elimina el dixido carbono del vino). Reactivos 1.cido tartnico cristalizado. 2.Solucin hidrxido sdico 0.1 M (NaOH). 3.Solucin de fenolftalena al 1% en alcohol neutro de 96% vol. 4.cido clorhdrico. 5.Solucin yodo 0.005 M. 6.Yoduro potsico cristalizado (KI). 7.Engrudo de almidn de 5g/l. 8.Solucin saturada de borato sdico (Na2B4O7.10H2O) Material - Aparato de arrastre de vapor de agua. - Trompa de vaco. - Matraz kitasato. Proceso Preparacin de la muestra eliminando el dixido de carbono. Se aaden 50 ml de vino al kitasato y se hace vaco por trompa de agua y de 1 a 2 minutos de agitado.. Se realiza el arrastre por vapor de agua. Se hecha al borboteador 20 ml de vino sin carbnico. Se aade 0.5g de cido tartnico . Se recoge una cantidad de 250 ml de destilado y se valora. Tambin se puede valorar aadiendo una solucin de hidrxido sdico 0.1 M con 2 gotas de fenolftaleina n (ml) volumen utilizado. Se aaden 4 gotas de cido clorhdrico diluido, 2 ml de engrudo de almidn y cristales de yoduro de potasio. Se valora el dixido de azufre con una solucin de yodo 0.005 M. Clculo La acidez voltil se expresa en meqv/l. A = 5( n 0.1 n2 0.05 n" ). Acidez voltil se expresa en gramos de cido acetico/l con dos decimales , ser 0.300(n 0.1 n2 0.05 n" ). R = 0.7 meq/l = 0.04g de cido actico/l. 13. CIDO TARTNICO El cido tartnico se determina como racemato de calcio y se determina gravimtricamente. Se determina con una comparacin volumtrica. Las condiciones de precipitacin es volumen empleado, pH, concentracin de iones que precipita. Se le aade al vino cido metartnico , se hidroliza. El cido tartnico se asla mediante una columna cambiadora de aniones. El diluido se determina por espectrofotometra dando una coloracin roja el cido vandico. 13.1 MTODO GRAVMETRO En este mtodo se utilizan los siguientes reactivos: 1.Solucin de acetato clcico. 1.1.Carbonato de calcio 10g/l. 1.2.cido actico 25g. 2.Racemato de calcio cristalizado (CaC4O6H4.4H2O). 3.Licor de precipitacin. (1). A los vinos que no se les hallan incorporado cido metartnico, se realiza el siguiente procedimiento: Se aade en un vaso de precipitado 500 ml de licor de precipitacin y 10 ml de vino y se deja en reposo durante 12 horas. Secar en estufa a una temperatura de 70 C hasta que se alcance un peso constante y por ltimo pesar. (2). A los vinos que se les hallan aadido cido metatartnico se proceder a una hidrlisis de este cido de la siguiente forma: Se aade en un erlenmeyer 10 ml de vino y 0.4 ml de cido actico puro, se cierra y lleva a ebollucin media hora. El lquido una vez fri se pasa a un vaso de precipitado y se procede como el paso (1). El cido metatartnico, se expresa como cido tartnico. La cantidad de cido tartnico por litro de vino ser: - 384.5 p, expresada en meqv. - 28.84 p, expresada en gramos de cido tartnico. - 36.15 p, expresada en gramos de tartrato cido de potasio. Reactivos 1.cido clorhdrico. 2.Solucin EDTA 0.05 M. 3.Solucin hidrxido sdico del 40% (NaOH). 4. Indicador complexiometrico del EDTA. Proceso Despus del pesado se incorpora el precipitado de racemato de calcio en un matraz y se disuelve en 10 ml de cido clorhdrico.

Se aade 5 ml de hidrxido sdico al 40% y 30 mg de indicador. Se denominar n al nmero de milmetros empleados. La cantidad de cido tartnico por litro de vino en meqv es igual a 5 n La cantidad de cido tartnico por litro de vino, expresado en gramos de cido tartnico es igual a 0.375n. La cantidad de cido tartnico por litro de vino expresado en gramos de cido potasio es igual a 0.470n. 14. CIDO CTRICO El cido ctrico se transforma en oxaloacetato mediante una reaccin catalizada por la citrato-liasa (CL) citrato oxalato + acetato. En presencia de malato-deshidrogenasa (MDH) y de lactato deshidrogenasa (LDH), el oxalacetato y su derivado de descarboxilacin, el piruvato se reduce en L-malato y L-lactato por la nicotinamida -adenina -dinucletida reducida (NADH). Oxaloacetato + NADH+H+L-malato+NDA+Piruvato+NADH+H+L-lactato+NAD+. La cantidad de NADH oxidada a NAD+ en estas reacciones es proporcional al citrato presente. La oxidacin de la NADH se mide mediante la disminucin de su absorbancia a una longitud de onda de 340 nm2. Reactivos 1. Tampn pH=7.8 2. Solucin de nicotinamida-adenin-dinucletido -reducida (NADH). 3. Solucin de malato-deshidrogenasa lactato (MDH/LDH). 4. Citrato liasa (CL). 5. Polivinil polipinolidona (PVPP). Material - Espectofotmetro con medidas de 340nm de absorcin de NADH. - Cubetas de vidrio de 1 cm de trayecto ptico. - Micropipetas para tomar volmenes entre 0.02 ml y 2 ml. Preparacin de la muestra - La determinacin de citrato se efecta directamente sobre el vino sin decoloracin ni dilucin, cuando el contenido de cido ctrico sea menor a 400 mg/l. - El vino tinto se recomienda tratarlo antes con PVPP, se pone en suspensin al agua alrededor de 0.2g de PVPP y se deja 15 minutos en reposo. Se filtra sobre filtro de pliegues. - Se aade una cantidad de vino de 10ml a un erlenmeyer, el PVPP hmedo se extrae con una esptula de vidrio. Se agita durante 3 minutos y se filtra de nuevo. Proceso Se ajusta la cantidad de onda a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm. La absorbancia de debe ajustar con respecto al aire. Se coge una cantidad de 1 ml de testigo muestra solucin. Se mezcla transcurridos unos 5 minutos, se espera a que finalice la reaccin y se leen las absorbancias de la muestra DA = DAM.DAT. Mtodo de clculo. El contenido de cido ctrico se expresa en (mg/l) miligramos litro. La concentracin en mg/l viene dada por la frmula general: V= volumen total en mml. V= volumen de la muestra. PM = peso molecular de la sustancia que se va a diluir. (cido ctrico). d= trayecto ptico de la cubeta. e= coeficiente de excitacin del NADH a 340 nm, e=6.3 mmol/cm. C= 479.DA. 15. CIDO LCTICO En presencia de nicotinamida -adenin-dinucletido (NAD) el cido lctico total (L-lactato y D-lactato) se oxida a piruvato mediante una reaccin que es catalizada por L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) y D-lactato deshidrogenasa (D-LDH). El equilibrio de la reaccin se desplaza en el sentido del lactato. La eliminacin del piruvato del medio de reaccin desplaza el equilibrio hacia la formacin de piruvato. En presencia de L-glutamato, el piruvato se transforma mediante una reaccin catalizadora en L-alanina esta reaccin catalizadora es llevada a cabo por la glutamato-piruvato-transaminasa (GTP). L-lactato+NAD+piruvato+NADH+H+Dlactato+NAD+piruvato+NADH+H, 3 piruvato+L-glutamato, L-alamina+acetoglutamato. La formacin de NADH que se mide por el muestreo de absorbancia a una longitud de onda de 340nm es siempre proporcional a la cantidad de lactato presente. El cido L-lctico se determina mediante dos reacciones: El cido lctico, separado mediante una columna separadora de aniones, pasa a oxidarse a etanol y es determinado por colorimetra despus de que halla reaccionado con nitroprusiato y pipesidina. Reactivos 1.Solucin tampn pH= 10 2.Solucin de nicotinamida-adenin-dinucletido (NAD) de alrededor de 40 a 10 y 3M, se disuelven 900g en 30 ml de agua destilada. Se mantiene estable la solucin hasta 1 mes aproximadamente a una temperatura de 4 C. 3.Suspensin glutamato-piruvato-transaminasa (GPT) de 20 mg/ml. 4.Suspensin de L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) de 5mg/ml. Material - Espectrofotmetro con mediciones de 340nm, mximo de absorcin de la NADH. - Cubetas de vidrio de 1 cm de trayecto ptico. - Micropipetas. Proceso Si la concentracin de cido lctico es menor a 100mg/l, la concentracin de lactato se efecta directamente sobre el vino, pero si no diluir con agua bidestilada. Determinacin del cido lctico. La solucin tampn se lleva a una temperatura entre 20 a 25 C antes de proceder a la dosificacin. Se ajusta la longitud de onda a 340nm. Posteriormente se introducen en las cubetas de vidrio las siguientes soluciones: Una vez preparada la solucin muestra y blanco, se mezcla con un agitador de vidrio y pasados unos 5 minutos se miden las absorbancia de la solucin blanco y muestra. Se aaden 0.02 ml de (L-LDH) y 0.05 ml de (D-LDH), se mezcla y se espera a que finalice la reaccin y se miden las absorbancia. Por ltimo se determina las diferencias de absorbancia para el blanco y la muestra. Diferencia absorbancia blanco (DAB). Diferencia absorbancia muestra (DAM). DA= DAM.DAB determinacin del cido L-lctico y del cido D-lctico. La concentracin del cido lctico se expresa en (g/l) con 1 decimal.

Mtodo de clculo Frmula general 1. V= volumen total en mml de cido L-lctico. 2. V= volumen total en mml de cido D-lctico. 3. v= volumen de la muestra en mml. 4. PM= peso molecular de la sustancia que se va a determinar. 5. EeE= coeficiente de excitacin de la NADH a 340nm. C= 0.164.DA. 16. CIDO L-MLICO Fundamento del mtodo En presencia de nicotamina-adenin-dinucletido (NAD) el cido L-mlico (L-malato) se oxida y pasa a oxaloacetato en una reaccin catalizada por la L-malato-deshidrogenasa (L-.MDH). El equilibrio de la reaccin se desplaza en sentido de malato. La eliminacin del oxalato de la reaccin desplaza el equilibrio a la formacin de oxaloacetato. En presencia de L-glutamato el oxaloacetato se transforma en L-aspartato, que es una reaccin catalizada por (GOT) glutamato-oxaloacetato-transminasa. (1) L-malato+NAD+oxaloacetato+NADH+H+ La formacin de NADH, medida por el aumento de la absorbancia con longitud de onda de 340nm es proporcional a la cantidad de L-malato presente. Reactivos 1.Solucin tampn pH= 10. 2.Solucin de nicotamina-adenin-dinucletido (NAD). Se disuelven 420mg de NDA en 12 ml de agua bidestilada mantenindolo en solucin estable durante 1 mes a 4 C. 3.Suspensin del glutamato-oxaloacetato (GOT9 de 2 mg/ml. 4.Suspensin de L-malato-deshidrogenasa (L-MDH) de 5 mg/ml. Material - Espectrofotmetro de medidas de longitud de onda de 340nm. - Cubetas de vidrio. - Micropipetas. Proceso Se ajusta la longitud de onda del espectrofotmetro realizndose las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm de trayecto ptico con respecto al agua. Mtodo de clculo (Se procede igualmente que en el caso de cido lctico. Del apartado 16) 17. CIDO D-MLICO Fundamento En presencia de D-malato deshidrogenasa decarboxil (D-MDH) el cido D-mlico (D-malato) se oxida a oxalacetato con la nicotinamida-adenin-dinucletido (NAD). El oxalacetato que se ha formado se transforma posteriormente en piruvato y cido carbnico . D-malato+NAD+piruvato+CO2+NADH+H. La formacin de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a una longitud de onda de 334nm, 340nm y 365nm es proporcional a la cantidad de D-malato presente. 18. CIDO SRBICO 18.1 DETERMINACION POR ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN EN EL ULTARVIOLETA El cido srbico se separa por destilacin de arrastre de vapor de agua determinado en el destilado mediante la espectrofotometra de absorcin en ultravioleta. Los contenidos inferiores a 20 mg/l deben confirmarse por cromatografa en capa fina. Reactivos 1.cido tartnico C4H6O6 cristalizado. 2.Solucin 0.02M de hidrxido de calcio Ca(OH)2. 3.Solucin de referencia de cido srbico de 20mg/l. Se disuelven 20g de cido srbico en 2 ml aproximadamente de solucin molar 0.1M. Se vierte en un matraz aforado de capacidad 1000ml y se enrasa con agua hasta 1000ml. Material - Aparato de destilacin con arrastre de vapor de agua. - Bao de agua a 100 C. - Espectrofotmetro con medidas de longitud de onda de 256nm. Proceso Destilado: Se introduce en el borboteador de arrastre de agua; 10 ml de vino y se aaden de 2 a 3 gotas de cido tartnico. Curva patrn: Se realizan 4 soluciones de referencia con unas cantidades de 0.5, 1, 2.5 y 5 mg respectivamente de cido srbico. Se mide con el espectrofotmetro las absorbancias a una longitud de onda de 256nm. Como resultado aparece una relacin lineal. Se introduce una cpsula con 5 ml de destilado, se aade 1 ml de hidrxido de calcio y una gota de sulfato de cobre. Posteriormente la solucin se evapora mediante un bao de agua. Se lleva una cantidad de muestra de 70 ml y se enrasa con agua de lavado. Se mide la absorbancia en una solucin testigo a 256nm. La solucin testigo es obtenida a partir de 1 ml de hidrxido clcico y dilucin a 20 ml de agua. Mtodo de clculo La concentracin de cido srbico de vino expresad en mg/l es igual a 1000 x C donde C representa la concentracin de cido srbico de la solucin analizada mediante espectrofotometra.

18.2 MTODO DE DETERMINACIN POR CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA Reactivos 1.ter etlico (C2H5)O2 destilado en el momento de su utilizacin. 2.Solucin del patrn interno y solucin del cido undecanoico C11H22O2 en etanol al 95% vol g/l. 3.Solucin acuosa de cido sulfrico H2SO4 en una cantidad de 1.84g/l. Material - Cromatografa de gases equipado mediante un detector de ionizacin de llama con columna de acero inoxidable. - Microjeringa. Para el tratamiento con dimetil cloro (DMDCS), se hace pasar por la columna una solucin de tolueno, lavndose de inmediato la columna con metanol y secndola con una corriente de nitrgeno. Posteriormente se rellena la columna. Proceso Se aaden 20 ml en un tubo de vidrio provisto de un tapn. Se aaden 2 ml de solucin de patrn interno y 1 ml de solucin diluida de cido sulfrico. (1) Se agita el tubo y se aade una cantidad de 10 ml de ter etlico . El cido srbico se extrae en la fase orgnica agitando el tubo durante 5 minutos. Se selecciona el vino cuyo cromatograma de extracto etreo no presente ningn pico de cido srbico. Se aade al vino cido srbico hasta alcanzar una concentracin de 100 mg/l. Se inyecta sucesivamente en el cromatgrafo (2) de la fase etrea obtenida en (1) y se realiza la cromatografa. Hay que comprobar la presencia de cido srbico y patrn interno. Se mide la altura de cada uno de los picos registrados. Mtodo de clculo La concentracin de cido srbico, viene expresada en mmg/l. H= altura del pico del cido srbico en la solucin de referencia. h= altura del pico del cido srbico en la muestra para anlisis. I= altura del pico del patrn interno en la solucin de referencia. i= altura del pico del patrn interno para muestra de anlisis.

18.3 MTODO DE DETECCIN DE TRAZAS DE CIDO SRBICO MEDIANTE CROMATOGRAFA DE CAPA FINA Reactivos 1.ter etlico (C2H5)O2. 2.Solucin acuosa de cido sulfrico H2SO4. 3.Solucin de referencia de cido srbico en una mezcla hidroetanica a 10% de etanol (vol).aproximadamente unos 20 mg de etanol. 4.Fase mvil hexano-pentano-cido actico C6H14-C5H2-CH3COOH. Material - Placas para cromatografa de capa fina de 20x20 recubiertas donde se les aadir un indicador de fluorescencia. - Cubeta para cromatografa. - Micropipeta o microjeringa. - Lmpara de ultravioleta. Proceso Se introducen 10 ml de vino en un tubo de vidrio, se aade 1 ml de solucin de cido sulfrico diluido y 5 ml de ter etlico. Se agita y se deja decantar. Por ltimo se prepara las soluciones diluidas de 2, 4, 4, 8 y 10 mg/l de cido srbico. Cromatografa: Con una jeringa o micropipeta se deposita una cantidad de 2 cm de fase etrea obtenida en una de las dos placas y tambin una cantidad de 5 l. de cada una de las soluciones diluidas. La distancia entre los puntos ser 2 cm. Se introduce la fase mvil en la cubeta de cromatografa y se coloca la placa en la cubeta. Se deja desarrollar el cromatograma entre 12 a 15 cm un tiempo aproximado de 30 minutos. Posteriormente las placas se secan bajo una corriente de aire fri. El cromatograma se examina bajo una lmpara ultravioleta a 250nm. Las manchas de cido srbico, de color oscuro, destacan sobre el fondo amarillo de la placa La comparacin entre la intensidad de la mancha de la muestra para analizar y las manchas de las soluciones de referencia permiten evaluar la concentracin de cido srbico entre 2-10 mg/l.

19. CIDO L-ASCRBICO Fundamento del mtodo. El mtodo aqu empleado determina el cido L-ascrbico dehidroascrbico presentes en el vino. Este cido se oxida por accin del carbn activo a cido dehidroascrbico. El cido dehidroascrbico forma un compuesto fluorescente por su reaccin con la ortofenilendiamina (OPDA) mediante la realizacin de una prueba testigo con cido brico se determina la fluorescencia. Reactivo 1.Solucin de hidrocloruro de ortofenilendiamina a 0.02g/100ml (C6H10Cl2N2). 2.Solucin compuesta de cido brico y cromato de sodio. 3.Solucin de cido actico cristalizado al 56% con pH =1.2. 4.Solucin de cido L-ascrbico de 1g/l (C6H8O6) 5.Carbn activo puro. Material - Fluormetro. - Filtro de vidrio poroso. - Tubos de ensayo. - Agitador para tubos. Proceso de preparacin de la muestra Se ponen en un matraz de 100ml de vino y se enrasa con cido actico. Se homogeneiza el contenido del matraz agitando y se aaden 2g de carbn activo, dejndolo reaccionar un tiempo de 15 minutos. Por ltimo se pasa por papel de filtro. Se introducen en dos matraces aforados de capacidad 100ml, 5ml de filtrado y 5 ml de solucin mixta de cido brico y malato de sodio. Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua. Se extraen 2ml de cada uno de los matraces y se le aaden una cantidad de 5 ml de ortofenilendiamina y se agita. Debe de permanecer en reposo media hora y en oscuridad. Posteriormente se mide con el espectrofotmetro.

Se introducen 2, 4 y 6 ml en tres matraces de solucin de cido L-ascrbico y se emplea con cido actico hasta 100ml y se agita hasta homogeneizar la solucin. Se aaden 2g de carbn activo en cada uno de los matraces y se dejan 15 minutos agitando de vez en cuando , se filtra y se aade 5 ml de cada filtrado en matraces aadiendo posteriormente una solucin de 5ml de cido brico y de acetato de sodio y a los matraces de segunda serie se le aaden 5ml de acetato de sodio. Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua hasta 100ml. Se extraen 2 ml de cada matraz y se le aaden 5 ml de ortofenilendiamina , se agita y se deja 30 minutos en oscuridad y se mide con el espectrofluormetro. La curva patrn que se obtiene de las medidas del espectrofluormetro, debe ser una curva de regresin lineal y que pase por el punto origen. La concentracin de cido L-ascrbico ms cido dehidroascrbico en el vino se expresa en mmg/l.

19.1 MTODO COLORMETRO Reactivos 1.Solucin de cido metafosfrico al 30% (m/v). 2. Solucin de cido metafosfrico al 3% (m/v). 4. Solucin de cido metafosfrico al 1% (m/v). 5. Suspensin de poliamida. 6. Tiourea. 7. Solucin 0.05M de yodo (I2). 8. Solucin dinitrofenilhidrazina al 6% (m/v). 9. Acetato etlico. 10. Cloroformo CHCl3. 11. Solucin acuosa de almidn al 0.5% (m/v). 12. Fase mvil de acetato etlico. 13. cido actico glacial. 14. Solucin de cido L-ascrbico de 0.1g por cada 100ml de solucin. 15. Tubos de centrifugacin. 16. Bao de agua refrigerada a 20 C. 17. Placas de cromatografa en agua de 20x20. 18. Cubetas para cromatografa. 19. Micropipetas. 20. Oxidacin del cido L-ascrbico en cido dehidroascrbico. Proceso (1) Se introduce 50ml de vino en un matraz de 100ml, se aade 15ml de poliamida y se enrasa con cido metafosfrico 3%. Tras un tiempo de reposo se filtra y se introducen 20ml de filtrado y se centrifugan y se aade 1 ml de (I2) 0.05M, se agita y tras 1 minuto se reduce el exceso de yodo con 25mg de tiourea. Se realiza un nuevo preparado para la extraccin y formacin de las bis 2,4 dinitrofenilhidrazona del cido dicetogulnico. (2) Se introduce en la placa inferior del calormetro 0.2ml de extracto de acetato de etilo. Se introduce la fase mvil en la cubeta hasta una altura de 1cm. Se introduce la placa hasta que el disolvente cubra todo su borde superior. Aparece una coloracin roja sobre ella que es tpica de las bis (2,4-dinitrofenilhydrazona) que se rasgan con una esptula para quitarlas de la placa. Se recogen los residuos y se posan en un erlenmeyer y se aaden 4ml de cido actico, se dejan 30 minutos y se filtran con papel de filtro sobre la cubeta del espectrofotmetro. Se mide la absorbancia de la solucin para obtener la curva patrn. (3) En tres matraces aforados se introducen igualmente 5, 10 y 15ml de cido L-ascrbico se enrasa con cido metafosfrico al 1% y se trata cada una de estas soluciones segn el procedimiento (1) y (2) y se traza la curva patrn Clculo La curva patrn se lleva a la lectura realizada en el apartado de (3) y se lee la concentracin de cido ascrbico + cido dehidroascrbico de la solucin analizada. 20. PH Fundamento El pH se obtiene a travs de la medida realizada entre dos electrodos sumergidos en el lquido que se estudia para la medida de la diferencia de potencial. Material - pH neutro graduado. - Electrodo - Electrodo de colomenados de cloruro potsico. - Electrodo combinado. Reactivos Solucin tampn: 1. Solucin de tratato de cido de potasio (C4H5KO6) a 20 C. 2. Solucin de ftalato cido de potasio 0.05M. 3. Solucin compuesta por. fosfato monopotsico (KH2PO) y fosfato bipotsico (K2HPO). Proceso - Preparado de la muestra de vino para su anlisis. - Se introduce el electrodo en la muestra analizada cuya temperatura debe estar programada entre 20-25 C y se lee el valor del pH. - De cada muestra se efecta dos determinaciones de lectura. Expresin del resultado El pH del vino se expresa con dos decimales. 21. DIXIDO DE AZUFRE El dixido de azufre est presente en el vino de la siguiente forma HSO3, cuyo equilibrio viene en funcin del pH y de la temperatura. El dixido de azufre total para expresarlo, su funcin viene dado como: - Mtodo de referencia para el caso del vino. Arrastre del dixido de azufre en una corriente de aire o de nitrgeno, fijacin y oxidacin por borboteo en una solucin diluida y muestra de perxido de hidrgeno. Se valora el cido sulfrico valorado con hidrxido sdico. - El arrastre en fro(10 C) extrae la concentracin del dixido de azufre. En caliente esta corriente a 100 C se extrae el dixido de azufre total.

- Se determina el dixido de azufre por valoracin y yodometra directa tras una hidrlisis alcalina. La suma del dixido de azufre libre permite obtener el dixido de azufre total. Material y aparatos 1 Se utilizan 4 tubos de ensayo que se refrigeran a 45, 31527 y 10 mm. El flujo de gas recorre el aparato de 40l/h con una trompa de agua de 20 a 30 cm para que as el caudal sea constante. Conviene colocar un medidor de flujo de tubo en el borboteador y frasco. 2 Microburetra. 3.cido fosfrico al 85% 4.Perxido de hidrgeno H2O2. 5.Reactivo indicador rojo de metilo. Alcohol del 50%. 6.Solucin hidrxido de sodio (NaOH) 0.01M. Proceso Determinacin del dixido de azufre libre. El vino se debe mantener en un frasco lleno y cerrado durante dos das antes de proceder a la determinacin. Se coloca en el borboteador de 2 a 3 ml de solucin de perxido de hidrgeno con 2 gotas de reactivo de indicador, se neutraliza la solucin de perxido de hidrgeno con solucin de hidrgeno de sodio 0.01M y se acopla el borboteador al aparato. En el matraz de 250ml se coloca el matraz en el borboteador durante 15 minutos. El dixido de azufre libre se oxida a cido sulfrico, se retira del borboteador y se valora el cido formado con la solucin de hidrxido sdico 0.01M. Se expresa el dixido de azufre en mg/l sin decimales. 22. SODIO El sodio se determina en el vino de forma directa mediante espectrofotometra de absorcin atmica con la adicin de cloruro de cesio como solucin tampn para evitar as la ionizacin del sodio. Reactivos - Solucin de sodio 1g/l. - Espectrofotmetro de absorcin atmica. - Lmpara de ctodo hueco. Proceso Se toman 25 ml de vino y se incorporan a un matraz, se aade un ml de solucin de cloruro de cesio y se enrasa finalmente con agua destilada. Las soluciones patrn tienen un contenido de 0, 0.25, 0.50, 0.75 y 1 mg de sodio por litro y 2 ml de cloruro de cesio en cada matraz. La longitud de onda se selecciona a 589 nm. Se aspira el vino diluido en un mechero de espectrofotmetro y rpidamente se realiza el mismo proceso con las soluciones patrn. Clculo - Se traza la curva de absorbancia en funcin de la concentracin en sodio. - Se lleva a esta curva el valor de las absorbancia obtenidas en las muestras para determinar la concentracin C de sodio en mmg/l. -La concentracin de sodio de vino ser: * 20C2.4.2. * Repetivilidad =r donde r= 1+0.024 Xi = concentracin de sodio en la muestra en mg/l. * Reproductividad = R =2.5+0.006Xi mg/lxi = concentracin de sodio en la muestra en mg/l. 23. POTASIO El potasio se determina directamente en el vino diluido por espectrofotometra de absorcin atmica con una solucin tampn de cloruro de cesio para evitar la ionizacin del potasio con la utilizacin de la llama de acetileno.

23.1 MTODO POR FOTOMETRA DE LLAMA Reactivos Solucin de potasio 1g/l. Solucin de referencia: cido ctrico Sacarosa. Cloruro clcico anhdrido Solucin de cloruro de cesio 5%. Material 1. Espectrofotmetro de absorcin atmica con un mechero de acetileno. 2. Lmpara de catado hueco de potasio. Proceso Se toman 2.5 ml de vino, se pasan a un matraz, se aade 1 ml de cloruro de cesio y se enrasa con agua destilada. En varios matraces se introducen 5 ml de solucin referencia y se aaden 2, 4, 6 y 8 ml de solucin de potasio de 1 g/l. Se aaden en todos los matraces 2 ml de cloruro de cesio, las cuatro soluciones preparadas con contenido en potasio debe ser conservadas en frascos de polietileno. Se selecciona la longitud de onda a cero de absorbancia con la solucin de referencia, se aspira el vino directamente por el mechero del espectrofotmetro y seguidamente se hace lo mismo con la solucin patrn. Clculo El mismo proceso del caso anterior 23. sodio. F.CF = factor de dilucin. Repetibilidad = r-35 mg Reproductividad = 66 mg Meqv7l = 0.256.F.C en tartrato cido de potasio en mmg/l 4.1813.F C3. 24. MAGNESIO El magnesio se determina directamente en el vino por espectrofotometra de absorcin atmica. Reactivos - Solucin patrn concentrada en magnesio con contenido de 1g/l. Dicha solucin se prepara disolviendo una cantidad aproximada de 8 g de cloruro de magnesio en agua destilada enrasando a un

litro. Material - Espectrofotmetro de absorcin atmica equipado de un mechero alimentado por aire y acetileno. - Lmpara de ctodo hueco de magnesio. Proceso Se diluye el vino con agua destilada. Para el calibrado en una serie de matraces de capacidad 100 ml se aaden 5, 10, 15 y 20 ml de solucin patrn diluida con magnesio y se enrasa con agua. Estas soluciones se conservan en frascos de polietileno. Seleccin de longitud de onda 285 nm; se regula a cero de absorbancia con agua destilada, se aspira el vino en el mechero de espectrofotmetro con las soluciones patrn preparadas. Clculo Se traza la curva patrn de absorbancia en funcin de la concentracin de magnesio. La concentracin de magnesio se expresa en mmg/l de vino en decimales y ser 100.C 5.2. Repetibilidad r = 3mg/l Reproductividad R = 8 mg/l. 25. CALCIO El calcio se determina de forma directa sobre el vino que ya se ha diluido por medio de absorcin atmica y con la incorporacin de un tampn espectral. Reactivos - Solucin de calcio con contenido de 1g/l. Se disuelven 2.5 g de carbonato clcico (CaCO3) en una cantidad de HCl, se enrasa el volumen a un litro de agua destilada. Solucin patrn diluida de calcio a un contenido de 50 mg/l. Las soluciones patrn conservadas en frascos de polietileno. Solucin de cloruro lantano de ,50g/l Se disuelve el cloruro lantano en agua destilada y se le aade 1 ml de HCl y se enrasa a 100ml. Material - Espectrofotmetro de absorcin atmica equipado con mechero de lmpara de ctodo hueco de calcio. Proceso Se hecha 14 ml de vino en un matraz, 2 ml de solucin de cloruro de lantano y se enrasa con agua destilada. El vino diluido contiene 5 g de lantano por litro. En cinco matraces aforados de 100 ml se aaden una cantidad de 0, 5, 10, 15 y 20 ml de solucin patrn diluida de Ca y se le aaden a todos los tubos una cantidad de 10 ml de cloruro de lantano y se enrasa a100 ml con agua destilada. Las soluciones patrn preparadas tienen unas cantidades en Ca de 0, 2.5, 7, 5 y 10 mg/l y 5g lantano/l. Estas soluciones se conservan en frascos de polietileno y se determina por medio del espectrofotmetro a una longitud de onda de 422.7nm. Se regula la absorbancia a cero con la solucin que contiene los 5g de lantano. Se aspira el vino diluido en el mechero por el espectrofotmetro y lo mismo se hace con las soluciones patrn. Se leen las absorbancias. Clculo sobre la expresin de los resultados. Se traza la curva de variacin de absorbancia en funcin de la concentracin de calcio de las soluciones patrn. La concentracin de Ca (mg7l) de vino sin decimales ser de 20.C5.2. Contenido < 60 mg/l implica que r = 2.7 mg/l. Contenido > 60 mg/l implica que r = 4 mg/l. R = 0.114Xi 0.5Xi = concentracin mg muestra. 26. HIERRO El hierro se determina directamente por medio de espectrofotometra de absorcin atmica, habiendo antes diluido el vino y eliminado el alcohol incorporado. Se hidroliza el vino con perhidrol y despus de esto el hierro III que se encuentra en el vino se reduce y pasa a hierro II y se determina por coloracin roja producida por la ortofenantrolina Reactivos 1. Solucin patrn concentrada de hierro III de 1g/l. 2. Solucin patrn diluida de hierro (100g/l). 3. Rotovapor con bao de agua. 4. Espectrofotmetro de absorcin atmica equipado de mechero alimentado con aire y acetileno. 5. Lmpara de ctodo hueco de hierro. Proceso Se elimina el alcohol del vino mediante un rotovapor a 60 C y con agua destilada. Para el calibrado. En una serie de matraces de 1. 2. 3. 4. 5 ml de solucin de hierro (100mg/l) y se completa a 100 ml con agua destilada. Estas soluciones se conservan en frascos de polietileno. Se selecciona una longitud de onda de 248.3n. Se regula a cero la absorbancia con agua destilada. La muestra se aspira con mechero del espectrofotmetro y se hace lo mismo con las soluciones ya preparadas. Se leen las absorbancias y se determinan los clculos. Clculos Se traza la curva de variacin de absorbancia en funcin de las concentraciones de hierro de las soluciones patrn. Se lleva a la curva el valor obtenido de la absorbancia con la muestra de vino ya diluida y se determina la concentracin de hierro (C) C = concentracin de hierro (mg/l) con un decimal y ser C.FF = factor diluido. 27. COBRE El cobre se determina mediante el empleo de espectrofotometra de absorcin atmica. Material 1. 2. 3. 4. Cpsula de platino. Espectrofotmetro de absorcin atmica. Lmpara de ctodo hueco de cobre. Gas de alimentacin de aire, acetileno.

Reactivos - Cobre metlico. - cido ntrico al 65% (HNO3).

- cido ntrico diluido. - Solucin de cobre 1g/l. Proceso Se prepara la muestra y se determina el contenido en cobre . Para el calibrado se toman 0.5, 1 y 2 ml de solucin de cobre que se incorporan a matraces donde posteriormente se enrasan con agua bidestilada a 100ml. Las soluciones obtenidas tendrn un contenido de 0.5, 1 y 2 mg/l de cobre que se incorporan a matraces posteriormente se enrasan con agua bidestilada hasta 100 ml. Las soluciones obtenidas tendrn un contenido de 0.5, 1 y 2 mg/l de cobre. Con los valores de absorbancias de estas soluciones ya medidas. Se selecciona la longitud de onda a 324.8nm y se lleva a cero la escala de absorbancia con agua bidestilada. Se aspira la muestra mediante el mechero del espectrofotmetro y a continuacin las soluciones patrn y por ltimo se leen las absorbancias. Clculo y expresin de los resultados Se analiza la curva de variacin de absorbancia dependiendo de la concentracin de cobre obtenida de la solucin patrn. Se traslada la curva patrn a la absorbancia leda para esa muestra de vino y se halla la concentracin C del vino en (mg/l). F.C y se da en dos decimales. Se procede a otro mtodo cuando las concentraciones de cobre son muy bajas y sera aadir 100 ml de muestra a una placa de platino , se evapora con agua a 100 C hasta quedar en forma de jarabe, se aaden 2.54 ml de cido ntrico concentrado. Incinerar el residuo en una placa elctrica. Se introduce la placa en un humo a 500 C . Las cenizas se humedecen con 1 ml de cido ntrico concentrado y se trituran y se mete de nuevo la cpsula en el horno 15 minutos. Tres veces se repite la operacin. Solubilizar las cenizas aadiendo a la cpsula 1 ml de cido ntrico concentrado y 2 ml de agua bidestilada, se pasa a un matraz de 10 ml y se enrasa con agua bidestiolada 28. CADMIO El cadmio se determina directamente del vino por espectrofotometra de absorcin atmica sin llama. Material. - Espectrofotmetro de absorcin atmica con horno de grafito. - Lmpara de ctodo hueco de cadmio. - Micropipetas con puntas desechables. Reactivos 1. Agua bidestilada. 2. cido fosfrico 85%. 3. cido fosfrico obtenido por dilucin a partir de cido fosfrico a 100ml con agua. 4. Solucin 0.02M de cido etilen diaminotetractico (EDTA). 5. Solucin tampn pH=9. 6. Negro de eriocro T:1% dilucin de cloruro sdico. 7. Sulfato de cadmio. Proceso Se diluye el vino a 1/2 (v/v) con cido fosfrico. Preparacin de las curvas de calibrado de 2.5, 5, 10 y 15 microgramos/l de cadmio. Para su determinacin se necesita la utilizacin de un programa de horno. Se realiza previamente un secado a 100 C en un tiempo de 30 minutos. La mineralizacin se realiza a t de 900 C en un tiempo de 20 segundos. La automatizacin a 2250 C en 3 segundos. Para las medidas de absorcin atmica se selecciona una longitud de onda de 228.8nm, se ajusta a cero la escala de absorbancia mediante agua destilada. Se inyecta al horno mediante micropipetas 5(l( tres veces ) de las soluciones y de la muestra que se va a realizar. Se miden las absorbancias a partir de la muestra de los resultados de las tres inyecciones. Clculo Se expresa la curva de absorbancia en funcin de la concentracin de cadmio de las soluciones patrones. La curva resultante es lineal como resultado de la obtencin de la concentracin de cadmio expresada en mg/l de vino. 29. PLATA Para su determinacin es el empleo del espectrofotmetro de absorcin atmica con previa mineralizacin de la muestra. Material - Cpsula de platino. - Bao de agua a una temperatura de 100 C. - Horno de 500-525 C. - Espectrofotmetro de absorcin atmica. - Lmpara de ctodo hueco de plata. - Gas de alimentacin de aire-acetileno. Reactivos 1. Nitrato de plata (AgNO3). 2. cido ntrico diluido. 3. Solucin de plata. Proceso (1) Se aaden 25 ml de muestra en una cpsula de platino y se evapora en bao de agua. Se incineran en horno hasta pasar a cenizas de color blanco. Se aaden a las cenizas 1 ml de cido ntrico y se evapora de nuevo. Se aaden tambin 50 ml de cido ntrico diluido y se calienta hasta disolucin. Para el calibrado de los matraces se utilizan 6 matraces con 2, 4, 6, 8, 10 y 20 m l de solucin de plata de 10 mg/l y se enrasan a 100ml con cido ntrico diluido. Se determina mediante una longitud de onda de 328.1 nm, ajustando a cero las absorbancias mediante cido ntrico, se aspira el lquido obtenido mediante el mechero del espectrofotmetro y seguidamente la solucin patrn. Se leen las absorbancias y se efecta la determinacin. Clculo y expresin de los resultados Se traza la curva patrn de absorbancia en funcin de la concentracin de plata de las soluciones patrn. Llevar la absorbancia leda a la solucin obtenida (1) y obtener la concentracin C de plata en vino que viene expresada en (mg/l). El contenido en plata de vino es 0.25 C y se da en dos decimales. 30. CINC Se determina directamente del vino que previamente ha sido retirado el alcohol por espectrofotometra de absorcin atmica. Reactivos.

1. Agua bidestilada. 2. Solucin patrn de cinc 1g/l. 3. Solucin patrn diluida de cinc 100 mg/l. Material - Retovapor con termostato. - Lmpara de ctodo hueco de cinc. - Espectrofotmetro de absorbancia atmica de mechero alimentado con aire y acetileno. Proceso Se elimina el alcohol del vino en un retovapor a 60 C. Se completa con agua bidestilada hasta un volumen de 100 ml. Para el calibrado se emplean 4 matraces de 100 ml con un preparado de solucin de cinc de 0.5, 1, 1.5 y 2 ml y se enrasan con agua bidestilada. Se determina seleccionando una longitud de onda de 213.9 nm regulando hasta el cero de la escala de absorbancia con agua bidestilada. Se aspira el vino en el mechero del espectrofotmetro y seguidamente lo mismo para las soluciones patrn. Se leen las absorbancias y se efectan las determinaciones. Clculo y expresin de los resultados Trazar la curva de absorbancia en funcin de la concentracin de cinc. Se trasladan el valor de medio de las absorbancias obtenidas del vino y se determina la concentracin de cinc en (mg/l) con un decimal. 31. FLUORUROS La determinacin del contenido de fluoruros en el vino es realizada por un electrodo especfico con membrana slida. E = E0.I.S.log a FE: Potencial del electrodo inico medido con referencia al electrodo en el medio estudiado. E0 = Potencial patrn de la clula medida. S = Pendiente del electrodo inico especfico. AF = Actividad de los iones fluoruros en la solucin estudiada. Material - Electrodo con membrana cristalina (del in flor). - Electrodo de referencia. - Milivoltmetro. - Agitador magntico con placa de aislante para proteger la solucin del calor del motor. Imn agitador. - Vasos de plstico de 30-50 ml. - Pipetas de precisin. Reactivos 1. Solucin madre de fluoruro 1g/l. 2. Solucin patrn de fluoruro. 3. Solucin tampn, pH = 5.5. Proceso En un vaso de plstico se introduce un volumen de vino y un volumen igual de solucin tampn. Se agita moderadamente. Con el aparato de medida se lee el valor del potencial en mv. Se aade a la muestra mediante pipeta un volumen determinado de solucin patrn de fluoruros de la muestra estudiada, el volumen del medio estudiado debe parecer constante (aumento del volumen en el 1%). La concentracin del medio ya estudiado se lleva sobre una resta de calibrado trazada en coordenadas con las soluciones patrn que contengan 0.1, 0.2, 0.5, 1 y 2 mg/l de fluoruros. Clculos El contenido en fluoruros del estudiado se expresa en (mg/l) y se obtiene de la siguiente forma: CF.: Concentracin en fluoruro del medio estudiado (mg/l). Ca : Concentracin de fluoruro aadido en (mg/l) en el medio estudiado (Va). Va : Volumen inicial del medio estudiado. DE : Diferencia entre los potenciales E1 y E2. Si Va es prximo a Vo, la frmula se simplifica y el valor obtenido debe de multiplicarse por el factor de dilucin que proviene de la adicin del tampn. 32. DIXIDO DE CARBONO Fundamento Se toma un volumen del vino como muestra y se lleva a una temperatura de 0 C y se vierte en una solucin valorada de hidrxido de sodio para alcanzar un pH=10-11. Se valora con una solucin cida en presencia de anhidrasa carbnica. El contenido en dixido de carbono se obtiene al pasar el pH=8.6 a 4, ya que, de 8.6 est en la forma de carbonato cido y 4 en forma de cido carbnico. Una valoracin testigo efectuada en las mismas condiciones sobre el vino desprovisto de CO2 permite tener presente el volumen de solucin de hidrxido de sodio consumido por el cido del vino. Material - Agitador magntico. - pH-metro. Reactivos 1. Solucin de hidrxido de sodio (NaOH) 0.1 M. 2. Solucin de cido sulfrico (H2SO4) 0.05M. 3. Solucin 1g/l de anhidrasa carbnica. Proceso Se enfra la muestra de vino hasta 0 C y tambin la pipeta< que sirva para la toma de muestra. En un vaso de precipitado se toman 25 ml de solucin de hidrxido de sodio al que se le aaden 2 gotas de solucin acuosa de anhidrasa carbnica. Se introducen 10 ml de vino con ayuda de la pipeta enfriada a 0 C. Se pone el vaso de precipitado en el agitador magntico, y se coloca el electrodo y la varilla magntica. Cuando el lquido alcance una temperatura ambiente se incorpora la solucin de cido sulfrico hasta un pH=4. Sea n2 de volumen ante el pH=8.6 a 4. Por otro lado se elimina el CO2 de 50 ml de viono, agitando bajo vaco durante un tiempo de 3 minutos y calentando el material en un bao de agua a una temperatura de 25 C. Se aplica este procedimiento igualmente a una cantidad de 10 ml de vino desprovistos de CO2 sea n2 ml en el volumen utilizado. La expresin de los resultados da como 12 ml de solucin valorada de hidrxido de sodio 0.1M corresponde a 4.4 ml de CO2. La cantidad de CO2 en (g/l) de vino se expresa mediante 0.44 (n n2) con dos decimales. 33. CIANO-DERIVADOS

33.1 MTODO DE ENSAYO RPIDO

"Control de los vinos tratados con hexacianoferrato (II) de potasio)"."Verificacin de la ausencia de precipitado de hexacianoferrato II de hierro III por adicin de sal de hierro III al vino acificado. Verificacin de la presencia de hierro que puede precipitar por adicin al vino Acidulado de una mezcla de hexacianoferrato II y de hexanocianoferrato III alcalinos. ( Determinacin del cido cianhdrico total liberado por hidrlisis cidas y separado mediante destilacin. Material.( uno de los dos aparatos ). - Centrifugadora que aplique una fuerza centrfuga de 1200 a 1500g. - Dispositivos de filtracin para filtros de membrana (dimetros de los poros 0.45 (m). Reactivos. 1. cido clorhdrico diluido a 1/2 (v/v) obtenido por dilucin en volmenes de cido clorhdrico (HCl) r = 20 = 1.18 a 1.19 g/ml. 2. Solucin de sulfato de hierro III y de amonio al 15% (m/v) Fe2(SO4)3 3. Solucin de hexacianoferrato II de potasio al 10% (m/v) K4[Fe(CN)6], 3H2O. 4. Solucin de hexacianoferrato III de potasio al 10% (m/v) K3[Fe(CN)6] Proceso. (Deteccin de trazas de hexacianoferrato II de hierro III en suspensin). Tras agitar la muestra se introducen 20 ml de vino en un tubo para centrifugar y se aade 1 ml de cido clorhdrico. Se centrfuga durante 15 minutos y se filtra. Para la deteccin de trazas de iones de hexacianoferrato II en solucin. Se aaden una gota de solucin de sulfato de hierro III y de amonio. Agitar y dejar en reposo durante 24 horas. S centrifuga en 15 minutos y se filtra. Para comprobacin de presencia de iones hierro en el vino. En un tubo de ensayo se introducen 20 ml de vino, 1 ml de cido clorhdrico, 1 gota de solucin de cido hexacianoferrato II de potasio y 1 gota de solucin de hexacianoferrato III de potasio. Debe aparecer en un transcurso de menos de media hora una precipitacin de color azul. Tras la centrifugacin o filtracin seguida de un lavado dos veces con 5 ml de agua, deber observarse un precipitado de fondo azul en el tubo para centrifugar. 34. ISOTIOCIANATO DE ALILO Fundamento El Isotiocianato de alilo presentado en el vino es recuperado por destilacin y se identifica mediante tcnica de cromatografa en fase gaseosa. Reactivos 1. Etanol absoluto. 2. Solucin estndar. Solucin en alcohol absoluto de isotionato de alilo con 15 mg/l de principio activo. 3. Mezcla refrigerada formada por etanol y nieve carbnica. Material - Aparato de destilacin por muestra mediante corriente de nitrgeno. - Envuelta trmica termoregulable. - Medida de flujo. - Cromatgrafo de fase gaseosa con detector fotomtrico. - Columna de cromatografa de acero inoxidable con dimetro interno de 3nm, longitud 3 m, rellena de carbowax 20M al 10%. - Microjeringa de 10l. Proceso Se toman 2l de vino y se introducen en un matraz. Se aaden algunos ml de etanol en dos tubos de recuperacin hasta producirse una inmersin en la parte porosa para la dispersin gaseosa. Se enfran los tubos por la parte inferior, con una mezcla refrigerante y se comunican con el matraz enviando al aparato una corriente de nitrgeno de 3 l/h. Se calienta el vino a 80 C recuperando un total de 45-50 ml de destilado. El cromatgrafo se estabiliza a una temperatura de inyeccin de 200 C, una temperatura de columna de 130 C y un gas portador hecho con flujo de 20 ml por minuto. Con microjeringa se inyecta una cantidad de solucin estndar de tal manera que el pico formado por el isitiocianato de alilo sea identificado sobre el cromatograma. Se inyecta de la misma forma una parte de destilado y se realiza una comparacin entre el tiempo de retencin del isotocianato de alilo y el pico de obtenido En ningn ensayo el vino produce interferencias con el tiempo de retencin de las substancias analizadas. 35. NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU Este ndice se determina con la aplicacin del siguiente mtodo: Fundamento Los compuestos fenlicos del vino se oxidan por el reactivo Foln-Ciocalteu el cual est formado por mezcla de cido fosfotngstico (H3HW12O40) y cido fosfomolibdico (H3PMo12O40) que se reduce, por accin de fenoles, en una mezcla de xidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23). La coloracin azul produce una absorbancia mxima de 750nm. Reactivos 1. Reactivo de Foln-Ciocalteu. Se prepara de la siguiente forma: disolviendo 700 ml de agua destilada en 100g de tungstato de sodio Na2WO4-2H2O y 25g de molibdeno de sodio Na2MoO4.2H2O. Aadir 50 ml de cido fosfrico del 85% (r20 = 1.71g/ml) 100ml de cido clorhdrico concentrado (r20 = 1.19g/ml). Se lleva a ebollucin en un tiempo de 10 horas y se aade a continuacin 150g de sulfato de litio, algunas gotas de bromo, y se hierve de nuevo durante 15 minutos. Se deja enfriar y se completa con agua destilada. 2. Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro en solucin 20% (m/v). Material - Matraz aforado. - Espectrofotmetro de 750 nm. Proceso (en vino tinto). En un matraz aforado se introducen siguiendo un orden: 1 ml de vino, 50ml de agua destilada, 5ml de reactivos de FolnCiocalteu y 20 ml de solucin carbonato de sodio. Se usa con agua destilada. Se agita y se espera 30 minutos. Se determina la absorbancia a 750 nm en una cubeta de 1cm con relacin a un testigo preparado con agua destilada en lugar de vino. Si la absorbancia no es prxima a 0.3 se debe modificar la dilucin del vino.

Proceso (en vino blanco). Se opera de la misma manera con 1 ml de vino sin diluir. Clculo El resultado es la expresin de un ndice obtenido al multiplicar la absorbancia por 100 cuando se trata de vinos tintos diluidos al 1/5 por 20en el caso de vinos blancos. Repetibilidad: La diferencia entre los resultados de las determinaciones efectuadas de forma simultanea o despus de otra, no debe superar a 1. La repetibilidad depende de la utilizacin de instrumentos bien limpios.

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