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REML-41; No. of Pages 9 Rev Esp Med Legal. 2012;xxx(xx):xxx-xxx

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REVISTA ESPAOLA DE

MEDICINA LEGAL
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REVISIN

Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense

Pedro A. Barrio-Caballero
Servicio de Biologa, Departamento de Barcelona, Instituto Nacional de Toxicologa y Ciencias Forenses, Barcelona, Espa na Recibido el 5 de septiembre de 2012; aceptado el 5 de noviembre de 2012

PALABRAS CLAVE
ADN; ADN antiguo; Restos humanos; Huesos; Dientes; Extraccin ADN; Identicacin

Resumen En el campo de la identicacin humana, la gentica forense est teniendo un papel relevante en los ltimos a nos. Sin embargo, existen circunstancias en las que su labor puede verse dicultada. Tal es el caso del hallazgo de restos humanos esqueletizados, en los que las condiciones tafonmicas de dicho hallazgo pueden suponer una limitacin en la obtencin de ADN a partir de ellos en cantidad y calidad suciente para su identicacin. En estos casos se han de aplicar estrategias especiales y diferentes a las habitualmente empleadas en los laboratorios forenses. En la presente revisin, en primer lugar, se valora la idoneidad del uso de restos seos para la obtencin de ADN, que ser empleado en los subsiguientes estudios genticos de identicacin. En segundo lugar, se comentan los problemas de preservacin del ADN obtenido a partir de este tipo de muestras. Igualmente se exponen las complicaciones metodolgicas que implica la obtencin de este ADN. Aunque no debe olvidarse la degradacin y las modicaciones moleculares de este tipo de ADN, la presente revisin se centra en su coextraccin junto con inhibidores de la PCR. Finalmente, se valoran los principales protocolos de extraccin de ADN a partir de restos seos, encaminados precisamente a la eliminacin de dichos inhibidores. 2012 Asociacin Nacional de Mdicos Forenses. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

KEYWORDS
DNA; Ancient DNA; Human remains; Bones; Teeth; DNA extraction; Identication

Revision of DNA extraction methods from bone fragments in forensic laboratories

Abstract In the human identication eld, Forensic Genetics serves an outstanding role every time. However, there are circumstances where its task could be obstructed. This is the case of human dried bones discovery. The taphonomic conditions of this nding could imply a limitation on adequate quantity and quality of obtaining DNA for bone identication. In these cases, special and different strategies to the usual ones must be executed on forensic laboratories. In the present revision, rstly, the adequacy of using bone fragments to obtain DNA is assessed. This extracted DNA will be employed on subsequent identication genetic studies. Secondly, preservation problems of DNA obtained from this type of samples will be presented. Likewise, methodological complications to obtain this DNA will be set out. In particular, the co-extraction

Autor para correspondencia. Correo electrnico: pedroalberto.barrio@mju.es

0377-4732/$ see front matter 2012 Asociacin Nacional de Mdicos Forenses. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002

Cmo citar este artculo: Barrio-Caballero PA. Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense. Rev Esp Med Legal. 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002

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with PCR inhibitors will be considered, although degradation and molecular modication of DNA must not be forgotten. Finally, principal DNA extraction protocols of bone fragments will be evaluated. The protocols, which are designed to eliminate those PCR inhibitors, will be especially considered. 2012 Asociacin Nacional de Mdicos Forenses. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Introduccin
En la actualidad, frecuentemente se producen circunstancias en las que aparecen restos humanos y/o cadveres, que deben ser identicados y en los que es necesaria la exhumacin de los restos seos (RO). Tal es el caso de personas desaparecidas, de restos de vctimas de atentados terroristas o grandes catstrofes, restos procedentes de fosas comunes de conicto blicos y casos de litigios de liacin o de adopciones irregulares. En todos ellos, se trata de asignar a los restos humanos una identidad, entendida como el conjunto de elementos que individualizan a una persona y la diferencian de las dems1 . La identicacin de un cadver constituye una prioridad por razn propiamente humanitaria y social2,3 , por el hecho en s mismo de perder a un ser querido y la necesidad netamente humana de tener conocimiento de dicho fallecimiento, saber dnde se encuentran los restos y poder despedirlos en las condiciones que se crean necesarias. Pero adems, dentro de nuestro mbito, son fundamentales las implicaciones legales que tiene el fallecimiento de toda persona. En todos los Estados de Derecho, las distintas regulaciones legales atribuyen una relevancia jurdica esencial al hecho del fallecimiento, y nuestro ordenamiento lo regula tanto en el mbito civil4 como en el penal5 . El proceso de identicacin suele tener una complejidad variable, que a menudo requiere de la intervencin de equipos multidisciplinares, integrados por especialistas en medicina forense, antropologa forense, odontologa forense, dactiloscopia y gentica forense6 . En algunas situaciones, como en excavaciones de fosas comunes de conictos blicos, tambin se puede requerir la participacin de especialistas en arqueologa e historia7 , cuyas tcnicas de excavacin arrojan informacin adicional que contribuye al proceso de identicacin. Cuando nos enfrentamos a cadveres bien conservados, existen multitud de herramientas que permiten resolver el proceso de identicacin de forma rpida. Estas van desde los datos sonmicos (peso, talla, defectos fsicos aparentes, marcas, tatuajes, etc.), pasando por la propia documentacin personal encontrada con el cadver, hasta la identicacin necrodactilar, principal mtodo empleado en las identicaciones8---10 . Sin embargo, en muchos casos, estos mtodos no pueden ser aplicados o se han de complementar y/o conrmar mediante el estudio comparativo del perl de ADN obtenido a partir del cadver, con el de familiares, muestras biolgicas antemortem del difunto (muestras hospitalarias) o con el de restos biolgicos encontrados en objetos atribuidos al fallecido11---13 . Pero incluso en estos casos existe un tipo de muestras (huesos y dientes) que presentar dicultades a nadidas. Estos obstculos adicionales habitualmente

sern resultado de las propias condiciones en las cuales se encontraron los restos (condiciones tafonmicas), que llevarn aparejada, aparte de la degradacin y/o modicacin del material gentico que pueda ser obtenido de los mismos, la presencia de sustancias inhibidoras, que interferirn en las subsiguientes etapas de la identicacin gentica. La variabilidad en la preservacin de las muestras que lleguen al laboratorio obliga a la aplicacin de distintas estrategias para la extraccin del material gentico presente en dichas muestras. De este modo, la presente revisin se centra en la valoracin de los principales mtodos de extraccin de ADN a partir de las muestras de restos cadavricos esqueletizados.

Muestras ms adecuadas para la obtencin de ADN a partir de estructuras esquelticas

Numerosos estudios14---17 se nalan que el material gentico se degrada ms rpidamente en tejidos blandos que en huesos, debido a la estructura ms resistente del hueso que acta como barrera fsica frente a las inuencias tafonmicas. La densidad del hueso tambin es un factor importante que inuye en su preservacin18 . De este modo, el ADN est normalmente menos degradado en las porciones ms densas del esqueleto, como el fmur y la tibia11,19,20 . Pese a todo, existen pocos estudios que hayan valorado las diferencias de las tasas de xito en obtener un perl gentico entre los diferentes elementos esquelticos21,22 . Algunas publicaciones sugieren que el ADN est mejor preservado en clavculas que en costillas19 , en huesos largos ms densos que en elementos menos densos23,24 , y en hueso compacto que en hueso esponjoso o trabecular25 . En un interesante estudio de Mils et al.24 se registraron las tasas de xito para obtener un perl gentico a partir de 25.361 huesos y dientes de restos recuperados de vctimas de fosas comunes en la antigua Yugoslavia, enterrados en un intervalo de 4-11 a nos. Sus resultados indicaron que el ADN est mejor preservado en fmures y dientes, seguido por tibias, perons, hmeros, crneos, radios y cbitos. Estos hallazgos son acordes con la literatura tafonmica que muestra una robusta relacin entre la densidad del hueso y la preservacin esqueltica26 . Est claro que las tasas de xito para obtener un perl gentico varan entre estructuras esquelticas, aunque la razn de este hecho no es del todo bien conocida22 . Leney27 ha argumentado que las reas bajo una carga mecnica alta, tales como la mandbula y las estructuras poscraneales densas, tienen una cortical ms gruesa que podra actuar como una barrera protectora frente a la degradacin del ADN. En cambio, en el caso de los dientes, es el esmalte dental el que protege al ADN de la degradacin y la contaminacin24 .

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3 endonuclesica38---40 . Tambin se ha documentado la posibilidad de que la unin del ADN con los cidos hmicos del suelo causara el mismo efecto protector41 . Sin embargo, otros componentes propios del suelo pueden ejercer el efecto contrario, como se detallar a continuacin.

Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense De este modo, y siendo sensible a dichas peculiaridades, la legislacin espa nola, cuando detalla las muestras que se han de enviar para su identicacin gentica en el caso de cadveres en avanzado estado de descomposicin o esqueletizados, recomienda especcamente el envo de piezas dentales y/o un hueso largo, preferiblemente el fmur28 .

Factores que inuyen en la preservacin del ADN

En el momento en que un organismo muere, comienzan los procesos de degradacin de sus biomolculas, entre ellas el ADN. Los agentes causantes de esa degradacin sern las propias enzimas del organismo (autolisis29 ), la posterior invasin de los restos por bacterias, hongos e insectos, y, nalmente, procesos qumicos, principalmente hidrlisis y oxidacin, que completarn la degradacin del material gentico30 . Sin entrar en el proceso qumico que lleva a esa degradacin del ADN, ampliamente descrito en la bibliografa29---34 , cabe destacar que estos procesos llevarn tanto a la propia fragmentacin del ADN (proceso de hidrlisis) como a la modicacin del mismo (da no oxidativo). La velocidad y el grado de descomposicin del material gentico de un resto va a depender de diversos factores endgenos y exgenos35 . El xito en la obtencin de informacin gentica a partir de estructuras seas est condicionado, aparte de por el tipo de estructura, por la condiciones del enterramiento. Las caractersticas del ambiente en el que se encuentra depositado un resto pueden ralentizar o incluso detener el proceso de degradacin. As las condiciones que ms afectarn a la degradacin del ADN sern la temperatura, la humedad, el pH o la presencia de ciertos compuestos en el suelo: - La temperatura es el factor que ms condiciona la preservacin del material gentico. Las temperaturas bajas durante el perodo de deposicin de un resto favorecen su conservacin ptima30,36 , debido a que, a bajas temperaturas, se produce una ralentizacin de las reacciones qumicas responsables de la degradacin orgnica32 . En el lado opuesto, la presencia de elevadas temperaturas puede favorecer la deshidratacin parcial del ADN, deteniendo los procesos de hidrlisis30 . - La humedad ejerce un efecto adverso sobre la preservacin del material gentico. Debido a la porosidad propia del hueso y a la accin disolvente de la humedad, se favorece la penetracin de las sustancias orgnicas del sedimento en el interior del resto. Esto incrementa la posibilidad de que el extracto de ADN presente molculas inhibidoras, adems de favorecer la degradacin hidroltica y oxidativa36 . - Un pH neutro o ligeramente alcalino en el enterramiento favorece la preservacin del ADN30 . Sin embargo, Herrmann y Newesely37 , demostraron que una disminucin paulatina del pH provocaba la degradacin de la hidroxiapatita de los huesos o dientes. - Los compuestos del suelo. Se ha apuntado la posibilidad de que ciertos compuestos minerales del suelo, como la montmorilonita, la kaolinita, el feldespato o el cuarzo, podran asociarse al ADN protegindolo frente a la accin

Problemas metodolgicos en la obtencin de ADN a partir de restos seos

La obtencin de material gentico endgeno a partir de restos seos se enfrenta con una serie de dicultades de tipo tcnico, relacionadas la mayor parte de las veces con el estado de preservacin del ADN. Este tipo de ADN presenta un conjunto de caractersticas fsico-qumicas, similares al ADN antiguo, que lo diferencian del procedente de organismos vivos, tambin denominado ADN fresco35 . Se podran resumir fundamentalmente en 4: escasez, fragmentacin de las cadenas, modicaciones moleculares y la presencia de inhibidores de la PCR en los extractos. Escasez y fragmentacin de las cadenas de ADN: son manifestaciones de un mismo fenmeno, la degradacin posmortem del material gentico35 . As, la longitud de los fragmentos amplicables depende de las condiciones de preservacin de los restos seos36 . Adems, las modicaciones moleculares del ADN, consecuencia tambin de dicha degradacin posmortem, provocan sobre el ADN lesiones que bloquearn la polimerasa, como las modicaciones oxidativas de las bases nitrogenadas y los residuos de azcar32 , o la creacin de puentes cruzados (cross-links) entre las propias cadenas de ADN o entre el ADN y las protenas del medio (reaccin de Maillard)42---44 . Estas modicaciones tambin provocan lesiones que causarn la incorporacin incorrecta de bases, miscoding lesions45---48 . La presencia de inhibidores de la PCR en los extractos est ntimamente relacionada con el resto de caractersticas. La naturaleza y mecanismos de accin de muchos de dichos inhibidores resultan todava hoy desconocidos35,44 , y lo que queda claro es que el protocolo de extraccin convencional de ADN (mtodo de extraccin orgnica), no consigue eliminar gran parte de las molculas inhibidoras, pues aparecen en los extractos nales. As pues, se pueden enumerar dichos posibles inhibidores, segn la naturaleza de los mismos y que bsicamente sern compuestos del suelo, o subproductos de la degradacin orgnica. Respecto a los componentes del suelo, se suele hablar de la posible accin inhibidora de los cidos hmicos y flvicos sobre las enzimas biolgicas43,49 . Estos compuestos, muy abundantes en el suelo, pueden acompa nar al ADN en el proceso de extraccin y son inhibidores muy potentes de la reaccin de PCR34,35,50 . Por otro lado, los residuos derivados de la porrina o sus productos de degradacin podran ser responsables de la actividad inhibidora de la PCR51,52 , por su capacidad para secuestrar iones metlicos, necesarios para el funcionamiento de la polimerasa53 . Las porrinas se encuentran presentes en algunas hojas vegetales, adems de en la sangre y en los tejidos blandos34,35 . Asimismo, muchos autores29,30,43,44,54---56 han relacionado los productos de la reaccin de Maillard con la capacidad inhibidora de algunos extractos de ADN de muestras antiguas. Esta reaccin es muy conocida en el campo de la tecnologa de los alimentos, y sus productos son muchos y

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P.A. Barrio-Caballero 3 mtodos para asegurar la eliminacin de cualquier posible contaminacin exgena61,62 o aplican tratamientos an ms elaborados de descontaminacin65 . Una vez limpiadas las muestras (descontaminadas), si se trata de huesos largos se cortan en fragmentos35,61,62 . Y sean huesos largos o dientes, siempre se pulverizan mediante un molino de impactacin electromagntica refrigerado con nitrgeno lquido, para as aumentar la supercie disponible para los tratamientos qumicos posteriores60 . El nitrgeno lquido congela la muestra, facilitando as su pulverizacin y evita la posible degradacin del material gentico del hueso por el exceso de calor generado con la trituracin mecnica35 . Para Rohland y Hofreiter66 este paso es crucial, pues han detectado diferencias estadsticamente signicativas entre pulverizar los huesos o tan solo pasar las muestras por un mortero manual. Antes del propio proceso de extraccin, algunos protocolos recogen un paso previo de descalcicacin del polvo de hueso mediante lavados con EDTA, que es un quelante inico que acta secuestrando las sales inicas contenidas en la muestra, incluyendo el calcio de los huesos35,56,67---69 . Aunque en la actualidad, la mayor parte de los protocolos prescinden de este paso, pues dichos lavados previos podran eliminar el posible ADN libre en suspensin existente, no obstante, incluyen el EDTA en la propia solucin de digestin62,70,71 .

4 variados, pudiendo tener numerosos grupos reactivos, entre los que se cuentan los grupos hidroxilo, carbonilo y metilo, que pueden reaccionar con el ADN34,44 . Y por ltimo, los propios productos de degradacin del material gentico, sea por rotura de sus enlaces o por modicaciones qumicas tales como la reduccin de azcares, generan ciertos productos capaces de inducir la inhibicin directa de su propia ampliacin44,57,58 .

Proceso de extraccin de ADN a partir de estructuras seas

Un alto porcentaje de los problemas que afectan al xito en la obtencin de ADN a partir de RO son debidos a la accin de los inhibidores. Independientemente de la naturaleza o de sus mecanismos de accin, constituye una prioridad la eliminacin o atenuacin del efecto inhibidor. Aunque se podran tomar medidas para minimizar su efecto durante la propia amplicacin del ADN (PCR)29,51,52,59 , es mejor eliminar el problema en su inicio. Por ello, todo el proceso de extraccin de ADN se convierte en un paso primordial a la hora de obtener resultados positivos. Esto ha obligado, en muchos casos, a la implementacin de protocolos especcos. Antes de valorar el proceso de extraccin, conviene comentar por su importancia la necesidad de aplicacin de una serie de medidas de seguridad para evitar y/o controlar posibles problemas de contaminacin. Van desde la propia infraestructura del laboratorio (separacin fsica de reas), pasando por las recomendaciones especcas de limpieza del propio laboratorio y material empleado, preparacin asptica de reactivos, hasta llegar a la inclusin de controles a lo largo de todas las etapas del proceso y la aplicacin de criterios de autenticacin. No obstante, sobre estas normas se ha escrito ampliamente25,34,35,43,45,60,61 y no es la nalidad de esta revisin.

Extraccin
Finalmente, el ltimo paso consistir en la propia digestin de la muestra, mediante proteinasa K, y puricacin del extracto resultante. De este modo, como mtodos ms ampliamente extendidos se pueden destacar el basado en la extraccin mediante disolventes orgnicos (fenol:cloroformo)56,67 o mediante resinas quelantes (mtodo de unin a glass-milk o suspensin de silica)32,69,72 . Tambin han sido sugeridos otros como el uso de otro tipo de resinas, tipo Chelex73 , poco ecaz y que actualmente no se emplea debido a la escasa o nula eliminacin de sustancias inhibitorias74 , o el empleo de dispositivos de ultraltracin (ltros de distinto tama no de poro)54,69,75 . Por otro lado, algunos protocolos incluyen sustancias reductoras. Se sospecha que el ADN de calidad suciente presente en las muestras pueda fallar cuando se analiza. Poinar et al.76 registran que una de las potenciales razones de esto es la masiva unin cruzada de macromolculas (cross-linking) que ocurre posmortem. Estos investigadores sugieren que el ADN puede quedar atrapado con productos entrecruzados, impidiendo su amplicacin. Para liberar el ADN de tales matrices, Poinar et al.76 emplean N-fenacil tiazolio bromido (PTB) para romper los entrecruzamientos, y registran tanto un incremento en la tasa de xito por muestra, como un incremento en la fuerza de la se nal obtenida. Algunos autores66 sugieren el uso de otras sustancias reductoras, como el DTT, y se nalan la inefectividad del PTB. En la actualidad, uno de los mtodos ms comnmente usados es el basado en la combinacin de descalcicacin con EDTA y puricacin con silica69,77,78 . Sin embargo, existen otras muchas variaciones, por lo que a continuacin se detallan aquellos ms ampliamente empleados y establecidos en la mayora de los laboratorios, y que han demostrado

Pretratamiento (descontaminacin)
Uno de los primeros pasos, previos a la propia etapa de extraccin, suele consistir en un pretratamiento de los RO, encaminado a acondicionar y/o mejorar el rendimiento en la posterior extraccin de ADN. La mayor parte de los protocolos recomiendan una limpieza supercial de los RO o dientes, para la eliminacin de los posibles contaminantes (material exgeno y/o bacterias). Esta limpieza puede basarse en lavados con leja diluida y/o agua destilada62 . Sin embargo, algunos estudios63 han demostrado que se trata de un procedimiento demasiado agresivo y que puede ser contraproducente para el posterior xito en la obtencin de ADN60 , proponindose mtodos qumicos alternativos64 . La mayor parte de los protocolos propone la eliminacin de dicha capa supercial mediante abrasin mecnica o lijado. Algunos emplean dispositivos (arenadora) que inyectan un material abrasivo (xido de aluminio) a presin sobre la supercie de la pieza, provocando la eliminacin de la capa ms externa35 . Otro mtodo alternativo, aunque la mayora de los protocolos lo recogen como complementario a los otros 2, suele consistir en la irradiacin de las piezas a analizar con luz ultravioleta35,60 . Existen protocolos que combinan los

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5 de lavado (washing buffer) de base etanlica (EtOH 50%, NaCl y EDTA). Y nalmente se le a nade la cantidad requerida de tampn TE para eluir el ADN retenido en la silica. Aunque se trate de un mtodo largo y, en algunos puntos complejo, se ha demostrado su rendimiento en la obtencin de ADN66 , sobre todo en la obtencin de un ADN libre de inhibidores. En la actualidad, hay disponibles columnas comerciales en las cuales se introduce la suspensin de silica o glass-milk, a travs de los cuales se hace pasar el digerido60,86 , que permiten simplicar y estandarizar este mtodo, automatizndolo y miniaturizndolo. Protocolo Desmineralizacin-silica (International Commission on Missing Persons) Este protocolo podra ser considerado como una variacin del anterior, pues se basa tambin en la retencin en silica (comercial), aunque no incluye la sal GuSCN. Se valora de forma independiente, pues es el procedimiento operativo estndar de la Comisin Internacional de Personas Desaparecida (International Commission on Missing Persons [ICMP])61,87 . Es similar a otros recientemente publicados88,89 , y ha sido perfeccionado gracias al desarrollo de multitud de proyectos de identicacin de personas desaparecidas en todo el mundo61,90,91 . Presenta 2 claves fundamentales: la digestin completa, aumentando la proporcin de tampn de digestin y polvo de hueso; y la eliminacin de inhibidores, mediante la puricacin con resina. Una vez pretratada la muestra, el mtodo consiste en una digestin inicial de toda la matriz sea, lo que supone una desmineralizacin total de la misma. Es decir, no se pasa a la siguiente fase hasta que casi no quede ningn resto de matriz sea61 . El tampn de desmineralizacin consiste bsicamente en EDTA (0,5 M), N-laurilsacnosinato sdico (1%) y proteinasa K. Una vez digerido, el sobrenadante es ltrado en dispositivos de ultraltracin92 , y el volumen recuperado pasa a ser procesado siguiendo las especicaciones de la casa comercial del kit QIAquick 92 , con algunas modicaciones introducidas por la ICMP61 . Aunque este kit comercial ha sido dise nado para la puricacin de productos de PCR, segn los autores61 parece ofrecer un buen rendimiento en la puricacin de ADN total. Adems, proponen un proceso de repuricacin61 , en aquellos casos extremos en los que se detecte la copuricacin de inhibidores durante el proceso de extraccin (a travs de algunos mtodos de cuanticacin de ADN humano o en la posterior obtencin de perles). Este proceso puede ser aplicado tanto en este protocolo de extraccin como en extractos obtenidos a partir de otros protocolos. El proceso de repuricacin consiste en procesar de nuevo el extracto con el kit QIAquick 81 , siguiendo prcticamente las especicaciones de la casa comercial. Protocolo Fishing (puricacin) Este mtodo de extraccin est basado en la hibridacin y separacin magntica que proporciona ADN puro sin ningn inhibidor detectable71,93 . Previo al propio proceso de captura de ADN, la muestra (polvo de hueso/diente) es sometida inicialmente a una extraccin con el tampn estndar ampliamente descrito (EDTA, SDS y proteinasa K). El sobrenadante obtenido se somete de forma repetitiva a una solucin de unin y lavado (binding/washing buffer) y

Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense sobradamente su rendimiento en determinado tipo de muestras. Protocolo Fenol:cloroformo Este protocolo es una adaptacin del procedimiento estndar de extraccin de ADN por fenol:cloroformo79 , en el cual las muestras son digeridas con proteinasa K y un detergente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas celulares. El digerido es mezclado con una solucin de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:25:1), paso que es repetido hasta eliminar la coloracin. Se ha escrito mucho sobre esta coloracin marroncea del extracto29,35,60,76 , pero no siempre existe coloracin y, si existe, no siempre se consigue eliminar. De la fase anterior de fenolizacin se descarta la fase orgnica. Dependiendo del protocolo aplicado, para eliminar las trazas de fenol, se puede a nadir una solucin de cloroformo:alcohol isoamlico (24:1). La fase acuosa, que contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio. A partir de este punto, el protocolo estndar inclua una fase de precipitacin con acetato amnico y etanol absoluto fro, pero los ltimos protocolos desarrollados introducen la concentracin en peque nos volmenes usando sistemas de ltracin por centrifugacin54,69,74 . Dicha concentracin se realiza mediante dispositivos de ultraltracin80,81 , que permiten la retencin selectiva del ADN extrado. Aunque la fase acuosa normalmente se encuentra por encima de la fase orgnica durante la extraccin de fenol:cloroformo, es importante indicar que, en ocasiones, altas concentraciones de sales pueden causar inversin de fase82 . Este hecho podra darse en el caso de extractos a partir de RO, debido a la composicin de la propia matriz sea y, en ocasiones, a las condiciones de preservacin. No obstante, suele ser bastante marginal. Protocolo Silica-sal Aunque este protocolo fue inicialmente descrito por Hss y Pbo83 , adaptado de Boom et al.84 , ha sufrido muchas modicaciones a lo largo de los a nos85 . La ltima y mejorada versin es de Rohland y Hofreiter70 ; ha sido ampliamente testada en comparacin con otros mtodos66 y nalmente adaptada para estudios a gran escala86 . Este protocolo se fundamenta en la adicin al polvo de hueso/diente de una solucin de extraccin (extraction buffer), consistente en EDTA y proteinasa K, y su incubacin toda la noche. Al sobrenadante obtenido se le a nade una solucin de unin (binding buffer) de base de tiocianato de guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sdico (NaCl/Ac), y la suspensin de silica, todo lo cual se incuba en oscuridad. Para muestras que no contienen inhibidores de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes al GuSCN, como por ejemplo el cloruro sdico66 . Estas sales no caotrpicas son mucho ms baratas y actan igual de bien o incluso mejor en trminos de recuperacin de ADN. Sin embargo, tienden a copuricar inhibidores de la PCR y, por tanto, no deben ser usadas con muestras que probablemente contengan inhibidores70 . El siguiente paso es el de puricacin y elucin, en el que, una vez descartado o almacenado el sobrenadante (el cual puede pasar por un nuevo proceso de binding), al precipitado de silica se le somete a lavados sucesivos con solucin

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Tabla 1 Tabla resumen con las ventajas e inconvenientes de cada uno de los protocolos de extraccin de ADN a partir de muestras de restos humanos esqueletizados Protocolo Fenol:cloroformo Ventajas Mayor cantidad de ADN (rendimiento) Pureza (eliminacin de compuestos orgnicos) Procedimiento habitual en la mayora de los laboratorios (simplica su uso) Inconvenientes No eliminacin completa de inhibidores de la PCR Uso de disolvente orgnicos (muy txicos) Protocolo Silica-sal (GuSCN) Protocolo Desmineralizacin-silica (ICMP) Mayor posibilidad de obtener un perl gentico Eliminacin eciente de inhibidores de la PCR Permite procesado a gran escala Protocolo Fishing (puricacin)

Mayor posibilidad de obtener un perl gentico Eliminacin eciente de inhibidores de la PCR Posibilidad de automatizacin

Eliminacin eciente de inhibidores de la PCR Protocolo rpido (todo el procesamiento se puede realizar en un da) y sencillo Procesado de elevado nmero de muestras (hasta 16 muestras en una nica tanda) Automatizacin Menor cantidad de ADN recuperado Elevado coste, fundamentalmente por el uso de sistemas automatizados

Procedimiento largo Procedimiento complejo (aunque se han conseguido estrategias de simplicacin)

Posibilidad de contaminacin cruzada An no ha sido validado para su automatizacin

Procedimiento largo

posterior ltrado, mantenindolo nalmente en dicha solucin. El siguiente paso consiste en la incubacin de la muestra con iniciadores (primers) marcados con biotina, para posteriormente inmovilizar el ADN en partculas magnticas recubiertas de estreptavidina, usando un concentrador de partculas magnticas. El ADN inmovilizado es lavado con la solucin anterior y con otras soluciones que contienen KCl. Finalmente, el ADN es resuspendido en agua ultrapura u otro tampn (como TE), para as poder almacenar el extracto de ADN que vaya a ser utilizado en los siguientes pasos de amplicacin por PCR. En la actualidad, existen multitud de kits comerciales basados ms o menos en este mtodo, y que permiten una agilizacin, estandarizacin y automatizacin del procedimiento. De este modo, se pueden destacar los siguientes kits comerciales orientados a su uso forense: - El PrepFilerTM Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystem Inc.94 ) es un sistema con una qumica que permite una unin especca del ADN a partculas magnticas y la posterior elucin del mismo altamente eciente, con la capacidad de eliminar inhibidores y adaptarlo a sistemas automticos. Un punto interesante es precisamente la posibilidad de automatizacin con su propio sistema AutoMate ExpressTM Forensic DNA Extraction System (Applied Biosystem Inc.95 ), en el que todos los reactivos del kit vienen en cartuchos individuales (Applied Biosystem Inc.96 ), y que permite procesar hasta 13 muestras en una nica tanda, sin apenas intervencin manual. - El DNeasy Tissue Kit (QIAGEN Inc.97 ) tiene un protocolo ajustado a muestras de hueso98 . De este surgi la aplicacin directa al campo forense, QIAamp DNA Investigator (QIAGEN Inc.99 ), asimismo con su protocolo especco para huesos y dientes. Este kit tambin posee una adaptacin

para su automatizacin con su propio sistema, el BioRobot EZ1 (QIAGEN Inc.100 ), con los reactivos en cartuchos individuales101 , y que permite procesar en una nica tanda desde 6 muestras (EZ1 y EZ1 Advanced) hasta 14 (EZ1 Advanced XL), segn el modelo de equipo empleado. - Por ltimo, el DNA IQTM System (Promega102,103 ), que usa una resina paramagntica patentada para puricar el ADN. Posee tambin su propio sistema de automatizacin, el Maxwell 16 Forensic Instrument (Promega104 ), que con cartuchos individuales105 puede procesar en una nica tanda hasta 16 muestras. Pero, adems, este sistema ha sido probado con estaciones de trabajo de otras casas comerciales, como: Beckman Coulter Biomek NXP106 , Tecan Freedom EVO 100107 , Biomek 3000108 , o el sistema en soporte slido SlicprepTM 96 Device109 . nalar Para el caso especco de huesos, es interesante se que tanto los kits PrepFilerTM (Applied Biosystem Inc.94 ) como el DNA IQTM System (Promega103 ), aparte de sus propios reactivos, en la fase de lisis se nalan la necesidad de incluir DTT (agente reductor). No queda claro la justicacin de su empleo y si el mismo ofrece un rendimiento signicativamente mejor en la obtencin de cantidad y calidad de ADN. No obstante, es interesante rese nar el estudio comparativo realizado por Rohland y Hofreiter66 , en el que, aunque no detectaban diferencias estadsticamente signicativas, s hallaban que la adicin de DTT pareca mostrar un ligero efecto positivo sobre la cantidad de ADN recuperado.

Valoracin nal de los mtodos de extraccin de ADN considerados

En el caso de la identicacin gentica de restos humanos esqueletizados, uno de los principales factores limitantes,

Cmo citar este artculo: Barrio-Caballero PA. Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense. Rev Esp Med Legal. 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002

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7 por su profunda revisin y aportaciones, que indudablemente han completado y mejorado el texto. Y por ltimo, agradecer tambin a los revisores annimos y editores sus comentarios y sugerencias para mejorar este manuscrito.

Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense adems de la degradacin y modicacin del ADN, es la presencia de inhibidores de la PCR. Por ello, el proceso de extraccin de ADN constituye un paso primordial, igual que en el mismo sean eliminados en la medida de lo posible dichos inhibidores. Algunos estudios60,66 han se nalado al mtodo de extraccin de ADN basado en silica-sal como el ms ventajoso frente al mtodo de fenol:cloroformo, porque todo aquello que no se une a la silica es eliminado mediante lavados. Similares ventajas ofrece el protocolo desarrollado por la ICMP61 , basado tambin en la puricacin con silica, el cual viene avalado por a nos de aplicacin y perfeccionamiento, y miles de identicaciones en todo el mundo61,88,89 . Sin embargo, algunos investigadores60 han encontrado que este tipo de ADN no se une a la silica tan ecientemente como el ADN fresco, probablemente porque el ADN en este tipo de muestras puede estar da nado. Por ello, el mtodo de fenol:cloroformo podra extraer mayor cantidad de ADN (tabla 1). No obstante, segn diversos estudios, el mtodo silica-sal66,70 o el de desmineralizacin-silica de la ICMP61 ofrecen un mayor porcentaje de muestras extradas y amplicadas exitosamente. Este mayor rendimiento en relacin cantidad/calidad del ADN recuperado, hacen a estos protocolos especialmente indicados en la casustica forense. Adems, como ventaja adicional, estos mtodos eliminan el uso de disolventes orgnicos (fenol:cloroformo) propios del mtodo estndar de extraccin y que son perniciosos para la salud del investigador (tabla 1). No obstante, debido a la alta cantidad de ADN recuperado con el mtodo fenol:cloroformo, y a la limpieza en inhibidores de la PCR de los mtodos comerciales (automatizados o no), se podra plantear una estrategia combinada de mtodos, en funcin de las peculiaridades de cada muestra analizada. De este modo, en aquellas muestras que se presupusiera una alta cantidad de inhibidores, se podra aplicar el mtodo de fenol:cloroformo, para la obtencin de la mayor cantidad de ADN posible. Y una vez extrado, junto con los posibles inhibidores que no hubieran sido eliminados, el extracto resultante, se podra puricar mediante un sistema automatizado de captura de ADN, o mediante la repuricacin planteada en el protocolo de la ICMP61 . Mediante dichos mtodos se lavaran los restos de posibles inhibidores existentes. En cualquier caso, si se sospecha que sern mnimas las cantidades de ADN existentes en la muestra, se hace recomendable la aplicacin directa del mtodo silica-sal66,70 o el de desmineralizacin-silica de la ICMP61 . En denitiva, el analista deber valorar el mtodo de extraccin de ADN a partir de restos esqueletizados ms apropiado a emplear, en funcin de las caractersticas y condiciones de la muestra que llegue al laboratorio.

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Conicto de intereses
El autor declara no tener ningn conicto de inters.

Agradecimientos
El autor quiere mostrar su agradecimiento a M. Jos Escudero por sus aportaciones en los aspectos jurdicos, as como a Eva Fernndez por sus comentarios y perspectiva desde el estudio del ADN antiguo. Adems, quiere mostrar su ms sincero agradecimiento a Manuel Crespillo y Miguel Paredes,

Cmo citar este artculo: Barrio-Caballero PA. Revisin de mtodos de extraccin de ADN a partir de restos seos en el laboratorio forense. Rev Esp Med Legal. 2012. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.002

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