UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA MODALIDAD PRESENCIAL

Profesor: Ing. Rubn Wilcacundo Ayudante: Egdo. Guido Paredes Estudiante: Diana Carolina Villarroel Morales Semestre: Septimo U Prctica: #1 TEMA: CENTRIFUGACION 1. INTRODUCCION: En esta tcnica de separacin de slidos y lquidos se emplea la fuerza centrfuga de un sistema (mecnico o elctrico) que hace girar la muestra a gran velocidad (de unas 2000 a unas 80000 rpm), lo que acelera la separacin de fases con respecto a las otras tcnicas en que slo se emplea la fuerza gravitatoria. Los tubos empleados son de un diseo especial, con el fondo cnico y, dada su fragilidad, van colocados en unos soportes metlicos. Es muy importante, para evitar vibraciones debidas a descompensaciones en el peso, llenar todos los tubos de la centrfuga (incluso los que no se utilicen para la separacin) con pesos aproximadamente iguales (OSORIO; 2006). Es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentacin del slido o de las partculas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas las partculas, por poseer masa, se ven afectadas por cualquier fuerza (origen de una aceleracin). La centrifugacin impone, gracias a la aceleracin centrfuga, un efecto parecido al gravitacional (YAEZ et al; 2009). Las partculas experimentan una aceleracin que las obliga a sedimentar. La centrifugacin puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analtica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que en la segunda se procede al anlisis de las macromolculas en una ultracentrifugacin. Existen diversos mtodos de centrifugacin y una extensa variedad de tcnicas derivadas de esta. El objetivo de la centrifugacin es separar partculas de diferentes caractersticas. Para ello, se aplica un fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del medio en el que se encuentren con la aceleracin G (RODRIGO; 1996). G=velocidad angular 2 x radio de giro. O otra frmula es G=velocidad angular + radio Tipos de centrifugacin Centrifugacin diferencial: Este mtodo es inespecfico, por lo que se usa como centrifugacin preparativa para separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de ncleos y membrana) pero no es til para separar molculas.

Centrifugacin isopcnica: Partculas con el mismo coeficiente de sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separacin de ADN con mucha frecuencia. Centrifugacin zonal: Las partculas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentacin a causa de la diferencia de masa de cada una. Por la fuerza centrfuga las partculas sedimentan a distinta velocidad a traves del gradiente de densidad segn su masa. Ultracentrifugacin: Permite estudiar las caractersticas de sedimentacin de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomolculas. (WIKIPEDIA, s/f) 2. OBJETIVOS: 2.1 Objetivo General: Determinar experimentalmente el rendimiento sedimentado en las suspensin de levadura y leche descremada 2.2 Objetivos Especficos: Calcular el factor centrifugo atreves del proceso de centrifugacin. Comparar la velocidad de sedimentacin en soluciones de levadura y leche descremada

3. MATERIALES Y REACTIVOS: 3.1 3.1 Materiales: 3.2 3.3 3.2Material Biolgico: Levadura para panificacin Leche descremada,

Pipetas de vidrio Agitador de vidrio Vasos de precipitados Probetas Masking Balanza analtica Cronmetro Vernier Flexmetro Equipo Centrfuga

4. PROCEDIMIENTO:

Reconocimiento fsico del equipo y caracterizacin

Para operar el equipo de centrifugacin es necesario considerar previamente las limitaciones y las caractersticas fsicas del equipo, realizar una tabla al respecto.

Caracterizacin del sistema a centrifugar: Seleccin del sistema a centrifugar

Escoger un material en polvo que forme una suspensin sedimentable. Se recomienda que la concentracin de la suspensin sea inferior al 3%

Determinacin de la velocidad de sedimentacin libre :

Si la distribucin de tamao del slido fuera homognea, la velocidad de sedimentacin sera constante; sin embargo como se tiene una distribucin de poblaciones, se tiene un caso de sedimentacin impedida

COLOCAR 100 ml de la suspensin en una probeta de vidrio

MEDIR La altura del lquido a tiempo cero y a intervalos de tiempo el desplazamiento de la interfase lquido claro - suspensin (altura de la suspensin).

OBTENER Una grfica tiempo vs. altura de la suspensin

4.4 Determinacin del rendimiento del proceso

PREPARAR Una muestra al 3% de slido

REGISTRAR Los pesos iniciales de slido y agua y el volumen de agua empleado.

CENTRIFUGAR Las muestras

% =

( + ) 100 Donde:

MA = masa de agua inicial (gramos) MS = masa de slido inicial (gramos) MLR = masa de lquido recuperado (gramos) R(%) = rendimiento del proceso

RENDIMIENTO Del proceso es obtenido, a partir de la ecuacin

RETIRAR El lquido claro con una pipeta y pesarlo

DATOS OBTENIDOS: Tabla 1: PESOS DE LAS DOS MUESTRAS DURANTE EL PROCESO DE CENTRIFUGACIN Muestra Levadura Leche Descremada P 5 4,98 tubo E 17,49 13,28 tubo + agua S 0,45 0,45 Muestra O 10,48 13,27 Sobrenadante S Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

Tabla 2: TIEMPO Y ALTURA EN EL PROCESO DE CENTRIFUGACION PARA LA LECHE DESCREMADA Tiempo Tiempo Altura (seg) (min) (cm) 1 0 0 18,0 2 1 60 17,9 3 2 120 17,9 4 7 420 17,8 5 12 720 17,3 6 17 1020 17,1 7 22 1320 16,9 Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial N

Elaborado por: Diana Villarroel Tabla 3: TIEMPO Y ALTURA EN EL PROCESO DE CENTRIFUGACION PARA LA LEVADURA

#
1 2 3 4 5

Tiempo Tiempo (min) (seg)

0 5 10 15 20 0 300 600 900 1200

Altura (cm)
18,2 18,1 18 18 18

Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

CALCULOS Y RESULTADOS:

6.1 Clculos: FACTOR DE CENTRIFUGACIN: = 0 00111

= 0 00111 (0 11 )(2500 ) = 1 53 5

(%) =
Leche Descremada 0 45 13 2 + 0 45 13 2 (%) = 2 (%) = 100

Levadura 0 45 12 4 + 0 45 10 4 (%) = 1 2 (%) = 100

6.2 Resultados: Tabla 4: RENDIMIENTO DE LAS SOLUCIONES DE LECHE DESCREMADA Y LEVADURA Solucin Rendimiento (%) LECHE LEVADURA DESCREMADA 97.82 18.29

Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

Tabla 5: FACTOR DE CENTRIFUGACION = 1 53 5 Factor de centrifugacion Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

Tabla6: REGRESION POLIGONEAL EN RELACION A INTERVALOS DE TIEMPO PARALA LECHE DESCREMADA

Intervalos de Tiempo (seg) 0-60 0-120 0-420 0-720 0-1020 0-1320

Regresin poligoneal y = -0,0017x + 18 R = 1 y = -0,0008x + 18 R = 1 y = -0,0005x + 18 R = 1 y = -0,001x + 18 R = 1 y = -0,0009x + 18 R = 1 y = -0,0008x + 18 R = 1

Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

Tabla 5: REGRESION POLIGONEAL EN RELACION A INTERVALOS DE TIEMPO PARA LA LEVADURA.

Intervalos de Tiempo (seg) 0-300 0-600 0-900 0-1200

Regresin poligoneal y = -0,0003x + 18,2 R = 1 y = -0,0003x + 18,2 R = 1 y = -0,0002x + 18,2 R = 1 y = -0,0002x + 18,2 R = 1

Fuente: Laboratorio de Bioseparaciones de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

5.3 Grficos: Grafico 1: TIEMPO (MIN) VRS ALTURA (CM) DE LA SUSPENSIN DE LEVADURA APLICANDO ECUACIN LINEAL Y POLIGONEAL
18.25 18.2 18.15 Altura (cm) 18.1 18.05 18 17.95 17.9 0 500 1000 1500 Tiempo (seg) y = -0.0002x + 18.16 R = 0.7812 y = 2E-07x2 - 0.0005x + 18.203 R = 0.9821 Series1 Linear (Series1) Poly. (Series1)

Fuente: Laboratorio de Bioprocesos de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

Grafico 2: TIEMPO (MIN) VRS ALTURA (CM) DE LA SUSPENSIN DE LECHE APLICANDO ECUACIN LINEAL Y POLIGONAL
18.2 18 Altura (cm) 17.8 17.6 17.4 17.2 17 16.8 0 500 1000 1500 Tiempo (seg) MEDIDA cm Linear (MEDIDA cm) Poly. (MEDIDA cm) Power (MEDIDA cm) Poly. (MEDIDA cm) Poly. (MEDIDA cm) y = -3E-08x2 - 0.0008x + 18 R = 0.9699 y = -0.0009x + 18.005 R = 0.9697

Fuente: Laboratorio de Bioprocesos de la Fcial Elaborado por: Diana Villarroel

DISCUSION:

En la presente practica acerca de la centrifugacin siendo uno de los mtodos que puede usarse cuando la sedimentacin es muy lenta; para acelerar esta operacin la mezcla se coloca en un recipiente que se hace girar a gran velocidad; por accin de la fuerza centrifuga los componentes ms pesados se sedimentan ms rpidamente y los livianos quedan como sobrenadante. Se aplico en muestras de leche, levadura y caf en la que su medicin de sedimentacin y su altura se lo determino de acuerdo al tiempo, para despus realizar el proceso de centrifugacion y obtener el sedimento y el sobrenadante, tomando muy en cuenta que la muestra de caf no nos sirvi para realizar el experimento ya que es muy soluble y no se va a sedimentar el soluto. A partir de esto se determino varios parmetros como el calculo del factor centrifugo atreves del proceso de centrifugacin, mediante la formula = 0 00111 obteniendo un valor adimensional de 1 53 5 ya que determina el grado de separacin en la centrifuga y el nmero de veces que la fuerza centrfuga supera a la fuerza de gravedad permitiendo evaluar la eficiencia de una centrfuga operada bajo estas condiciones al compararla con el proceso regulado solo por la gravedad. Adems la velocidad de sedimentacin en soluciones de levadura y leche a travs de regresin lineal con la interpretacin de la pendiente y adems se una relacin polinomial. Obteniendo una velocidad mayor en la levadura con 0.002s y en la leche con 0.0009 s mediante la grafica de altura vr tiempo siendo que La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula, a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula. Finalmente se determino el rendimiento sedimentado en las suspensin de levadura y leche con los pesos del tubo, muestra y sobrenadante mediante la aplicacin de la frmula planteada obteniendo de resultados para la leche el 97,82% y para la levadura 18,29%, tomando muy en cuenta que el rendimiento va a ir dependiendo de la velocidad que se utilizo ya que minimiza el efecto de la concentracin.

CUESTIONARIO:

7.1 Investigar que es la velocidad de sedimentacin de las partculas. Describir el mtodo para obtener experimental y tericamente ste. Velocidad de sedimentacin: Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partculas para realizar una centrifugacin en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Despus de un tiempo las diferentes poblaciones de partculas se sitan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeo orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas. Este es el fundamente de la ultracentrifugacin preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentacin de una partcula (medida en unidades Svedverg, S). Determinacin Terica de la velocidad de sedimentacin Donde: V =velocidad de sedimentacin d = dimetro de la partcula = densidad de la partcula L = densidad del lquido

 = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional Se cumple: - La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula - La velocidad de sedimentacin es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula - La velocidad de sedimentacin es 0, cuando la densidad de la partcula e igual a la densidad del medio circundante - La velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio - La velocidad de sedimentacin aumenta al aumentar la fuerza del campo centrfugo (JAVERIANA, 2006) Determinacin experimental de la velocidad de sedimentacin v =f (C) Para esta determinacin se utilizan los datos obtenidos en una sedimentacin discontinua, realizada con suspensiones de diferente concentracin inicial, Co. La forma de operar con cada una de las probetas es la siguiente: 1. Se mide la mide la altura inicial de la suspensin, ho, usando la regla acoplada a cada probeta. 2. Se toma la probeta de concentracin y se agita intensamente para que la concentracin sea lo ms uniforme posible a lo largo de toda la probeta. 3. Se deja la probeta en reposo y se va determinando la altura que ocupa la suspensin en funcin del tiempo, tomando para ello medidas de la altura de la suspensin (h) cada minuto. Una vez determinadas las parejas de valores de la altura en funcin del tiempo, se puede utilizar el mtodo de Coe y Clevenger para determinar la velocidad de sedimentacin (OSORIO; 2006). 7.2 Investigar el proceso de centrifugacin. En el proceso de centrifugacin se toma un tubo de centrfuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugacin se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es una tcnica muy til, sobre todo para aislamiento de clulas y orgnulos subcelulares. Es un tipo de separacin logrado en base al tamao de las partculas.

Esta tcnica consiste en someter a una muestra heterognea de partculas a fuerzas de centrifugacin crecientes por perodos de tiempo crecientes. Los precipitados obtenidos luego de cada centrifugacin estarn enriquecidos en una determinada partcula. Para lograr la separacin, los coeficientes de sedimentacin de las partculas deben diferir en al menos un factor de tres (molculas con s mayores precipitan primero).

(EVANGELISTA; 2006) Aplicaciones: Es muy usada en laboratorios de control de calidad, de fbricas que elaboran zumos a base de ctricos, para controlar el nivel de pulpa fina de estos, separando la pulpa fina del zumo exprimido, o en la elaboracin de aceite de oliva. En ella las aceitunas una vez molidas y batidas se introducen en una centrfuga horizontal en la que se separa el aceite que es la fraccin menos pesada del resto de componentes de la aceituna; agua, hueso, pulpa etc (WIKIPEDIA,s/f). 7.3 Enlistar los tipos de centrifugas y su funcionamiento. Hay diferentes tipos de centrfugas segn el rango de velocidades de giro: Centrfugas de baja velocidad, de sobremesa o clnicas. De pequeo tamao y sin refrigeracin. Alcanzan una velocidad mxima de 5000 rpm. Son tiles para la separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles. Las centrfugas micrfugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de ms de 10.000 rpm, Los volmenes de trabajo son muy pequeos. Son tiles en el campo de la biologa molecular. Centrfugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vaco para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son tiles en la separacin de fracciones celulares, pero insuficientes para la separacin de ribosomas, virus o macromolculas en general. Ultracentrfugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeracin i de alto vaco. Hay ultracentrfugas analticas que permiten la obtencin de datos precisos de propiedades de sedimentacin (coeficientes de sedimentacin, pesos moleculares), y preparativas, tiles para aislar partculas de bajo coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus, macromolculas). Centrifugacin diferencial Es el proceso que tiene como resultado la obtencin de un sobrenadante y un material sedimentado. Centrifugacin mediante un gradiente de densidades: Este tipo de centrifugacin es un proceso mediante el cual las partculas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido lquido. El mtodo es un poco ms elaborado que la centrifugacin diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo aadido. La tcnica permite la separacin de varios o todos los componentes de la muestra y la realizacin de medidas analticas. El mtodo de gradiente de densidades implica la utilizacin de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solucin resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacridos sintticos, derivados yodados del cido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separacin de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas).

Hay dos variantes de este mtodo, la centrifugacin zonal y la centrifugacin isopcnica: Centrifugacin zonal En la centrifugacin zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrfuga las partculas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La densidad mxima del gradiente no ha de exceder a la de las partculas a separar. Centrifugacin isopcnica La centrifugacin isopcnica separa les partculas en un gradiente de densidades en funcin de la densidad de las mismas. Las partculas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de stas i la del gradiente son idnticas (de aqu el nombre de isopcnico). En este caso, es condicin fundamental que la densidad mxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partculas. Por este motivo la sedimentacin final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugacin, ya que las partculas flotan sobre un "colchn" de material que posee una densidad superior a la de stas. Esta tcnica se utiliza, por ejemplo, para separar partculas similares en tamao pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugacin isopcnica es un mtodo adecuado para separar cidos nucleicos o diferentes orgnulos celulares. (MUOS; 2006). 7.4 Investigar el significado de rea equivalente. Describe el rea equivalente para una centrifuga tubular y una de discos. Detallar para qu es til esta variable. El rea equivalente () de una separadora centrfuga se define como la superficie que debera tener un tanque de sedimentacin natural para entregar un flujo clarificado (m3 / h) igual al de la centrfuga en cuestin de cualquier suspensin. Se encuentran relacionadas por la siguiente relacin Charles M.Ambler desarroll para los diferentes tipos de tambores las ecuaciones correspondientes para el clculo del rea equivalente. a) Centrfuga tubular

Debido a que aumenta con la longitud axial del rotor (L) y con su dimetro (2R) y velocidad (), el comportamiento mejora utilizando rotores ms largos o ms rpidos yanchos. Los valores que se pueden conseguir de Z vienen limitados por el material deconstruccin
b) Centrifuga de discos y de cmaras El flujo es funcin de las propiedades del caldo contenidas en Vg, y de las caractersticasde la centrfuga contenidas en . El Area equivalente de la centrfuga, , es una constante que contiene slo parmetros relacionados a la geometra de la centrifuga velocidadangular (es independiente de las propiedades del caldo). Se utiliza para efectuar comparaciones entre distintas centrfugas y para escalamiento de equipos. En donde:

r1= Radio interno superior del tambor r2 = Radio interno de la base del tambor N = nmero de discos, para la centrfuga de cmaras N = 1 = velocidad angular radianes /s L = Altura del tambor = 450 C = 1.8 Constante del equipo (EVANGELISTA; 2006) 7.5 Enlistar los equipos auxiliares que se necesitaran para operar una centrfuga. Mangueras, Vlvulas neumticas, Embudo de alimentacin, Tubos y bombas centrifugas. 6.6 Investigar el significado de tiempo de residencia y tiempo de sedimentacin. EL TIEMPO DE RESIDENCIA es el tiempo requerido para que un determinado material complete su ciclo de ingreso, permanencia y egreso en un medio permeable. Para estimar el tiempo de residencia promedio, deben conocerse: El volumen total , el porcentaje y el caudal. EL TIEMPO DE SEDIMENTACIN es el tiempo requerido para lograr la sedimentacin total de las partculas de una suspensin ser igual a la velocidad de sedimentacin (OSORIOS; 2006) 9 . CONCLUSIONES:

Se determino experimentalmente el rendimiento sedimentado en las suspensin de levadura y leche con los pesos del tubo, muestra y sobrenadante mediante la aplicacin de la frmula planteada obteniendo de resultados para la leche el 97,82% y para la levadura 18,29%, tomando muy en cuenta que el rendimiento va a ir dependiendo de la velocidad que se utilizo ya que minimiza el efecto de la concentracin. Se calculo el factor centrifugo atreves del proceso de centrifugacin, mediante la formula = 0 00111 obteniendo un valor adimensional de 1 53 5 ya que determina el grado de separacin en la centrifuga y el nmero de veces que la fuerza centrfuga supera a la fuerza de gravedad permitiendo evaluar la eficiencia de una centrfuga operada bajo estas condiciones al compararla con el proceso regulado solo por la gravedad. Se comparo la velocidad de sedimentacin en soluciones de levadura y leche a travs de regresin lineal con la interpretacin de la pendiente obteniendo una velocidad mayor en la levadura con 0.002s y en la leche con 0.0009 s mediante la grafica de altura vr tiempo siendo que La velocidad de sedimentacin es proporcional al tamao de la partcula, a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partcula.

10 ZBIBLIOGRAFIA: OSORIO,N.2006.Practicas de Ciencia. Disponible http://colegiocristorey.com/nenuca/nenina/quimica1/1Ct%C3%A9cnicas%20de%20separaci%C3%B3n.pdf. 09/05/2013 en:

YAEZ, J., RUEDAS , M & GONZALES, G.2009. Manual de laboratorio de bioseparaciones. Disponible en: http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/MANUAL_BIOSEPARACIONES09.pdf. 09/05/2013 RODRIGO, M.1996. Tcnicas Bsicas en el Laboratorio de Qumica. Captulo V.4. Ed. Universidad de Valladolid, Mxico. pp 96-98. MUOZ,D.2006. Operaciones bsicas en el laboratorio http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/index1.html# 09/05/2013 de Quimica. Disponible en:

JAVERIANA. 2006. Centrifugacion zonal. Disponible http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r14985.PDF.10/05/2013

en:

EVANGELISTA, G; 2006. Centrifugacion. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/94827194/CENTRIFUGACIONBlgo-Erick-Estrada.pdf. 29/05/2010