You are on page 1of 22

DESCRIPCION Y CLASIFICACION DE RIZOBIOS: ENFOQUE HISTORICO, METODOS Y TENDENCIAS ACTUALES

C. J. Bcquer
Universidad de La Habana

BIOLOGA Vol. 18, No. 1, 2004


ISSN: 0864-3490

REVISTA BIOLOGIA

Vol. 18, No. 1, 2004

ARTICULO DE REVISION

DESCRIPCION Y CLASIFICACION DE RIZOBIOS: ENFOQUE HISTORICO, METODOS Y TENDENCIAS ACTUALES


C. J. Bcquer. Estacin Experimental de Pastos y Forrajes, Sancti-Spritus.

INTRODUCCION Mucho se ha investigado sobre la simbiosis leguminosa-rizobio, que es, sin lugar a dudas, una de las asociaciones ms eficientes entre el reino vegetal y los microorganismos. Los esfuerzos encaminados a caracterizar y clasificar las bacterias responsables de los procesos de fijacin simbitica del dinitrgeno en leguminosas, los rizobios, no siempre se han visto coronados por el xito. La carencia de equipos y tecnologas adecuadas para estos fines limitaron enormemente a los cientficos en pocas pasadas. No obstante, parte de la informacin que se posee en la actualidad acerca del fenotipo y genotipo de los rizobios descansa sobre los rsultados de las investigaciones llevadas a cabo hace ms de 60 aos. En esta resea, se pretende mostrar en orden cronolgico y de manera resumida, los principales avances en la caracterizacin y ubicacin taxonmica de los rizobios, as como las principales tcnicas que se utilizan para estos objetivos. BREVE RESEA HISTORICA DE LA CARACTERIZACION Y CLASIFICACION DE RIZOBIOS: A finales del siglo XVI, Dalechamps represent grficamente abundantes ndulos en races de Ornithopodium tuberosum (Martnez-Viera, 1986) y en los siglos posteriores, cientficos como Malphigi (siglo XVIII) y Ward (siglo XIX) llamaron la atencin sobre estas formaciones radiculares pero sin poder dar una explicacin real a este fenmeno. Schroeter en 1886 (citado por Drouin et al., 1996) present su propuesta de denominar como Phytomyxa a los organismos causantes de las formaciones nodulares Slo los estudios clsicos de Hellriegel y Wilfarth (1888) por primera vez establecieron claramente que eran microbios los que, en los ndulos radiculares,

permitan a las leguminosas obtener nitrgeno atmosfrico mientras que otras plantas no podan. En 1890, Beijerinck aisl y cultiv exitosamente la bacteria a partir de ndulos, denominndola Bacillus radicicola, casi al mismo tiempo, Frank (1889) la haba denominado Rhizobium leguminosarum, nombre que se mantiene actualmente (Young y Haukka, 1996; Sprent, 2001). Fred et al. (1932) editaron un libro acerca de los rizobios, donde se hace una revisin exhaustiva de los conocimientos existentes y propusieron una nomenclatura basada en las caractersticas fisiobioqumicas de estas bacterias, que prcticamente no admiti cambios hasta 1982. Ellos reconocieron 6 especies: Rhizobium leguminosarum, causante de nodulacin en los gneros Lathyrus, Pisum, Vicia y Lens; Rhizobium trifolii en Trifolium; Rhizobium phaseoli en Phaseolus; Rhizobium meliloti en Melilotus, Medicago, Trigonella; Rhizobium japonicum en Glycine max y Rhizobium lupin en Lupinus. En esta caracterizacin, lo ms importante era el rango hospedero de la leguminosa, aunque tambin se describan diferencias morfolgicas y fisiolgicas (Young y Haukka, 1996). Despus de pasados 50 aos, por primera vez se introdujeron cambios en la nomenclatura de los rizobios con la creacin del nuevo gnero Bradyrhizobium (Jordan, 1984), el cual incluye todas las cepas que forman ndulos en Glycine max, pero que no contemplaba la definicin de otras especies, pues aunque el nuevo gnero estaba basado en caracteres fisiolgicos que lo distinguen de Rhizobium, an no se haban introducido completamente tcnicas que pudieran establecer diferencias en el nivel gentico. (Young, 1996) A partir de la segunda dcada del siglo XX, se propuso por Dangeard (1926) el gnero Sinorhizobium, segregado a partir de subgrupos de

Email: becquer@pastos.yayabo.inf.cu

Rhizobium meliloti con caractersticas fisiolgicas que lo distinguen claramente. Ms tarde, se descubre a Sinorhizobium fredii (1984) el cual puede formar ndulos efectivos en Glycine max, Vigna unguiculata y Cajanus cajan, aunque algunas cepas no nodulan efectivamente la soya, constituyendo una estrecha base gentica. (Young, 1996) El gnero Mesorhizobium, como su nombre lo indica, agrupa aquellas especies que crecen en un rango intermedio entre Rhizobium (rpido crecimiento) y Bradyrhizobium (lento crecimiento) aunque esto no constituye una regla inviolable (Young, 1996). Por primera vez, Jarvis et al. (1982) propusieron la especie Mesorhizobium loti, la cual provoca ndulos efectivos en Lotus, Lupinus y Anthyllis. Los genes de nodulacin y de fijacin del nitrgeno se encuentran usualmente en los cromosomas de esta especie. Aunque la clasificacin taxonmica de los eucariontes contina sobre la base fundamentalmente de las diferencias morfolgicas, con alguna introduccin de tcnicas moleculares en los ltimos tiempos, la clasificacin de los procariontes no es posible sin la aplicacin de evaluaciones fenotpicas y moleculares, a pesar de las dificultades que an persisten con la clasificacin en este reino (Giller, 2001). Los mtodos moleculares, como la amplificacin y la secuenciacin de genes del ARNr 16S, as como la homologa ADN-ADN, revolucionaron la clasificacin de los rizobios y constituyen opciones seguras para analizar la filogenia de estas bacterias. (Woese, 1987; Young, 1996, Laguerre et al, 1996, y otros) ENFOQUE ACTUAL DE LA FAMILIA RHIZOBIACEAE: Gracias al avance tecnolgico, nuevos gneros y especies han sido propuestos, demostrndose, esta vez a nivel gentico, las caractersticas taxonmicas de estas bacterias. En 1996, Young y Haukka publicaron la relacin de especies de rizobios clasificados hasta esa fecha (Tabla I), la cual constituye una de las ms recientes revisiones de esta familia, aunque posteriormente se han propuesto otros gneros y especies. (Tabla II) ALGUNAS CARACTERISTICAS DE LOS GENEROS Y ESPECIES MAS REPRESENTATIVOS: Gnero Rhizobium (fig.1, fig. 2, fig. 3). Las clulas son aerobias, Gram negativas, en forma de bastn, colonias de crecimiento rpido y produccin de cido (Vincent, 1970). Algunas cepas de Rhizobium leguminosarum y Rhizobium trifolii (posteriormente Rhizobium leguminosarum bv. trifolii [Jordan, 1984]) contienen con frecuencia grnulos metacromticos (en clulas jvenes), son mtiles, con flagelos polares o pertricos y se tien fcilmente con las tinturas bsicas simples, aunque las ms 10

viejas necesitan ms tiempo para absorber el tinte y tienen zonas no teidas (de polihidroxibutirato), lo cual les da un aspecto lisado. (Hamdi, 1985) Con la excepcin de Rhizobium loti (posteriormente, Sinorhizobium meliloti [de Lajudie et al., 1994]) que posee ADN cromosmico, cuya informacin para la nodulacin est en el ADN cromosmico, en el resto de las especies la informacin gentica para la nodulacin (genes nod) y para la fijacin del nitrgeno (genes nif), se encuentran en los plasmidios. Se ha dado a conocer que estos componentes genmicos presentan rangos de 150 hasta 1500 kb (Martnez-Romero y Caballero Mellado, 1996) Las especies clasificadas hasta el ao 2001, son: x Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889). Este nombre describa originalmente slo los simbiontes de la tribu Viciae. Sin embargo, se esclareci que las bacterias aisladas en ndulos de Trifolium (Rhizobium tropici) y de Phaseolus (Rhizobium phaseoli) slo podan diferenciarse de Rhizobium leguminosarum por su hospedero. Por lo tanto, la posicin posteriormente aceptada (propuesta por Jordan, 1984) es que existen tres biovars de las especies Rhizobium leguminosarum: bv. viciae, que forma ndulos en Pisum, Vivia, Lathyrus y Lens; bv trifolii (Trifolium) y bv. phaseoli (Phaseolus) (Young, 1996). Actualmente, se ha determinado que Rhizobium tropici, Rhizobium etli, Rhizobium gallicum y Rhizobium giardinii tambin forman ndulos en Phaseolus (ver texto siguiente). x Rhizobium tropici (Martnez-Romero et al., 1991). Procede de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli de la revisin de Jordan (1984). A esta especie se le detectaron 2 grupos principales que se diferencian del resto por sus caractersticas genticas y fisiolgicas, entre las que se destacan la formacin de ndulos efectivos en Phaseolus vulgaris, Leucaena esculenta y Leucaena leucocephala. (Martnez-Romero et al., 1991) x Rhizobium etli (Segovia et al., 1993) es segregado del Rhizobium leguminosarum y forma simbiosis efectiva solamente con Phaseolus vulgaris, aunque Wang et al. (1999b) han encontrado lneas de Rhizobium etli que forman ndulos efectivos en Mimosa affinis, leguminosa nativa de la Sierra de Huautla, reserva ecolgica de Mjico Central. Esta especie tiene genes mltiples nifH comunes con Rhizobium leguminosarum (Quinto et al., 1982; Martnez- Romero et al., 1985; Segovia et al., 1993; Sessitsch et al., 1997) x Rhizobium rhizogenes (Sawada et al., 1993). Originalmente llamado Agrobacterium, este gnero ha cambiado tambin su nomenclatura, ya que el primero fue denominado tomando como base a los plasmidios Ti (que inducen tumores), mientras que los plasmidios Ri (formadores de pelos radiculares) son caractersticos del actual. (Bouzar, 1994; Oyaizu y Sawada, 1994; Sawada et al., 1993)

Tabla I: Lista de los gneros y especies de rizobios aprobados hasta el ao 1996 (adaptado de Young y Haukka, 1996) Rhizobium (Frank, 1889) Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889) Rhizobium tropici (Martnez-Romero et al., 1991) Rhizobium etlii (Segovia et al., 1993) Rhizobium (Agrobacterium) rhizogenes (Sawada et al, 1993) Sinorhizobium (de Lajudie et al., 1994) Sinorhizobium meliloti (previamente denominado Rhizobium meliloti por Dangeard, 1926) (de Lajudie et al., 1994) Sinorhizobium fredii (Scholla & Elkan, 1984; de Lajudie et al., 1994) Sinorhizobium saheli (de Lajudie et al., 1994) Sinorhizobium teranga (de Lajudie et al., 1994) Sinorhizobium medicae (Rome et al., 1996) Mesorhizobium (Lindstrom et al., 1995)

>Rhizobium@ loti (Jarvis et al., 1982) >Rhizobium@ huakuii (Chen et al., 1991) >Rhizobium@ ciceri (Nour et al., 1994) >Rhizobium@ tianshanense (Chen et al., 1995) >Rhizobium@ mediterraneum (Nour et al., 1995)
Otro gnero (?)*:

>Rhizobium@ galegae (Lindstrm, 1989)


Bradyrhizobium (Jordan, 1982) Bradyrhizobium japonicum (Kirchner, 1895; Jordan, 1982) Bradyrhizobium elkanii (Kuykendall et al., 1992) Bradyrhizobium liaoningense (Xu et al., 1995) Bradyrhizobium sp. (Young, 1996) Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988) Azorhizobium caulinodans (Dreyfus et al., 1988) Photorhizobium (Eaglesham et al., 1990; Young et al., 1991). No aprobado hasta la fecha

* En 1996, esta especie an no haba sido definida como perteneciente al gnero Rhizobium. El resto de las especies se mantuvieron dentro del gnero Mesorhizobium. Tabla II: Lista de los gneros y especies de rizobios propuestos en el periodo de 1997 hasta el ao 2001. Lin Rhizobium giardinii (Amarger et al., 1997) Rhizobium gallicum (Amarger et al., 1997) Rhizobium hainanense (Chen et al., 1997) Rhizobium huatlense (Wang et al., 1998) Rhizobium mongolense (van Berkum et al., 1998) Sinorhizobium arboris (Nick et al., 1999) Sinorhizobium kostiense (Nick et al., 1999) Mesorhizobium plurifarium (de Lajudie et al., 1998) Mesorhizobium amorphae (Wang et al., 1999) Allorhizobium undicola (de Lajudie et al., 1998) Methylobacterium nodulans (Sy et al., 2001). El gnero Methylobacterium es completemante diferente a los gneros pertenecientes a la familia Rhizobiaceae y comprende varias especies. Ralstonia taiwanensis (Chen et al., 2001). Esta especie forma ndulos en diferentes especies de Mimosa.

11

Fig. 1: Comparacin de las filogenias de Rhizobium y Sinorhizobium estimados sobre la base de la secuencia de los genes del ARN 16S y 23S ribosmicos. El nmero de las diferencias de nucletidos con Rhizobium leguminosarum han sido sealadas entre parntesis (tomado de van Berkum et al., 1999)

Fig. 2. Arbol filogentico de rizobios pertenecientes a los gneros Rhizobium,Sinorhizobium, Mesorhizobium,Bradyrhizobium y Azorhizobium, as como Agrobacterium y algunas bacterias cercanas de la subdivisin alfa de Proteobacteria. El rbol est construido por el mtodo de Neighbour-Joining de secuencias del ARN ribosmico (tomado de Young y Haukka, 1996)

12

Fig. 3: Cladograma de cepas de los gneros Rhizobium, Allorhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium, as como Agrobacterium, Methylobacterium y bacterias que participan en diferentes ciclos biogeoqumicos. Construido sobre la base del anlisis de los genes del ARNr 16S (tomado de Sprent, 2001)

13

Se supone que Rhizobium rhizogenes est ms cerca filogenticamente de Rhizobium tropici que de Agrobacterium (Young, 1996) x Rhizobium galegae (Lindstrm, 1989; Lindstrm et al., 1995a) es una especie que forma ndulos solamente en Galega orientalis y en Galega officinalis. La secuencia SSU del ARNr 16S ms cercana a sta es la de Agrobacterium vitis. No existen informes de otra especie ms cercana, lo cual ha sido tomado como base para una posible revisin de Rhizobium galegae como una especie de Rhizobium hacia una especie de Agrobacterium (de Lajudie et al., 1994). Esta especie no est oficialmente reconocida, ya que su diversidad gentica no est claramente definida. x Rhizobium gallicum (Amarger et al., 1997), aislado en ndulos de Phaseolus vulgaris. Esta especie posee genes nifH que comparten el mismo ancestro que los genes de Rhizobium etli bv. phaseoli. Tambin se determin que un subgrupo present especificidad simbitica con Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Rhizobium etli biovar phaseoli, y el otro subgrupo present caractersticas fenotpicas y genotpicas propias, por lo cual se dividi en dos biovars: Rhizobium gallicum biovar gallicum y Rhizobium gallicum biovar phaseoli. Graham et al. (2000) encontraron que rizobios aislados de Dalea purpurea y Dalea candida, en leguminosas de las llanuras de Minnesota, Estados Unidos, mostraron perfiles simbiticos y similitud en cuanto a los cidos grasos metilados de cepas de Rhizobium gallicum procedentes de Francia. x Rhizobium giardinii (Amarger et al., 1997), fue aislado tambin en Phaseolus vulgaris, aunque Wang et al. (2000) encontraron grupos genmicos de rizobios aislados en Leucaena leucocephala en Mjico que se relacionaron estrechamente con Rhizobium giardinii sobre la base de los patrones amplificados por PCR de los genes del ARNr 16S. Esta especie, al igual que Rhizobium gallicum fue dividida en dos biovars de acuerdo a su afinidad simbitica con los biovars phaseoli de Rhizobium leguminosarum y Rhizobium etli, por lo que se conoce como Rhizobium giardinii biovar giardinii y Rhizobium giardinii biovar phaseoli. x Rhizobium hainanense (Chen et al., 1997). Esta especie tiene su origen en un grupo de rizobios de rpido crecimiento aislados en leguminosas de la provincia Hainan, zona tropical de China, y fue propuesto sobre la base del secuenciamiento de genes del ARNr 16S, homologa ADN-ADN y caracterizacin fenotpica. Esta nueva especie pertenece a la rama filogentica que incluye a Rhizobium leguminosarum. x Rhizobium huatlense (Wang et al., 1998), tiene una relacin filogentica estrecha con Rhizobium galegae y son capaces de formar ndulos en Sesbania herbacea y Leucaena leucocephala. Tambin se diferencian de otras especies en la 14

secuencia de nucletidos de los genes del ARNr 16S. x Rhizobium mongolense (van Berkum et al., 1998), fue aislado de Medicago ruthenica y se le realiz un enfoque polifsico. Esta especie presenta caractersticas genmicas que hicieron pensar al principio en incluirlo en el gnero Sinorhizobium (van Berkum et al., 1999) pero posteriores estudios que comprendieron secuencias de genes del ARNr 16S-23S, permitieron definir su posicin en el gnero Rhizobium Gnero Sinorhizobium (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4). Las cepas son productoras de cido y de rpido crecimiento. Al igual que Rhizobium, contienen los genes nod, nif y los que controlan la especificidad de la infeccin radicular (hen) en los plasmidios de gran longitud (pSym) (Somasegaran y Hoben, 1994). Sinorhizobium posee especies que pueden tener grupos diferentes de genes nod, a pesar de poseer el mismo genotipo (MartnezRomero y Caballero-Mellado, 1996). Este gnero fue segregado de cepas de rizobios que forman ndulos en Glicyne max, especficamente Rhizobium fredii (Scholla y Elkan, 1984) y Rhizobium meliloti (Dangeard, 1926), los cuales presentaban caractersticas fenotpicas muy diferentes de las otras especies de Rhizobium y de ah surgi la propuesta de las especies Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium meliloti y Sinorhizobium xinjiangensis (Chen et al., 1988). No obstante, en la revisin hecha por De Lajudie et al. (1994), auxiliado por datos moleculares que hacen vlida la propuesta de este autor (homologa ADN-ADN y ARNr-ADN, secuenciamiento de genes del ARNr 16S), se mantuvieron Sinorhizobium fredii y Sinorhizobium meliloti, pero surgieron tambin las especies Sinorhizobium saheli y Sinorhizobium teranga (De Lajudie et al., 1994) (esta ltima especie aparece indistintamente como teranga o terangae en otras referencias), as como Sinorhizobium medicae (Rome et al., 1996); Sinorhizobium arboris (Nick et al., 1999) y Sinorhizobium kostiense. (Nick et al., 1999) x Sinorhizobium fredii puede formar ndulos efectivos en Glycine max, Vigna unguiculata y Cajanus cajan, aunque algunas cepas no pueden formar ndulos en algunos cultivares de soya en Estados Unidos por poseer stas una base gentica muy estrecha. x Sinorhizobium meliloti forma ndulos en Melilotus, Medicago y Trigonella, esta especie presenta dos grupos claramente definidos que pudieran resultar dos especies diferentes (Eardly et al., 1990) x Sinorhizobium medicae fue aislado de ndulos radiculares de Medicago truncatula, en Francia x Sinorhizobium saheli y Sinorhizobium teranga fueron aislados de Acacia y Sesbania (localizados en Senegal), aunque pueden formar ndulos en otros gneros de leguminosas. (Young, 1996)

Fig. 4 Arbol filogentico que muestra la posicin taxonmica, sobre la base del polimorfismo del ARNr 16S de cepas aisladas de Centrosema spp., Neonotonia wightii y Stylosanthes viscosa; as como cepas de referencia pertenecientes a los gneros Rhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium y Agrobacterium spp. Las lneas horizontales estn hechas proporcionalmente al nmero de cambios en los sitios de restriccin. Las cifras corresponden al nmero de veces (%) que las cepas han sido agrupadas despus de 200 repeticiones, mediante un anlisis `bootstrap` realizado por el Mtodo de Parsimonia Mxima (Swofford, 1998). Tomado de Bcquer (2002)

x Sinorhizobium kostiense y Sinorhizobium arboris (Nick et al., 1999) proceden de una coleccin de cepas aisladas de Acacia y Prosopis, leguminosas arbreas de Sudn. Gnero Mesorhizobium (Fig. 2, Fig. 3). Este nombre fue propuesto porque muchas cepas (aunque no todas) en sus especies muestran tasas de crecimiento que median entre las tpicas especies rpidas (Rhizobium) y especies lentas (Bradyrhizobium).

Generalmente, los genes nod y nif en este gnero son cromosmicos. (Young, 1996) Se conocen actualmente las especies: x Mesorhizobium loti. Nombrado inicialmente Rhizobium loti (Jarvis et al., 1992) y renombrado como Mesorhizobium (Lindstrm, et al., 1995b). Forma ndulos efectivos en Lotus, Lupinus y Antillus. Los genes de nodulacin y de fijacin de nitrgeno normalmente son cromosmicos y no

15

plasmdicos, como ocurre con la mayora de los rizobios de rpido crecimiento. (Young, 1996) x Mesorhizobium huakuii. (Chen et al., 1991) Este fue aislado en Astragalus sinicus y presenta caractersticas morfolgicas y genticas diferenciadas de otras especies. Por ejemplo, su perfil de cidos grasos celulares es muy similar al de Mesorhizobium loti pero diferente al resto de las especies (Choma, 1999) x Mesorhizobium ciceri (Nour et al., 1994). Se relaciona con Mesorhizobium loti por su secuencia de genes del ARNr 16S (Lindstrm et al., 1995b), pero se distingue principalmente por su homologa del ADN, por su fenotipo y por su afinidad a hospederos, con cepas que forman ndulos efectivos solamente en Cicer arietenum. x Mesorhizobium tianshanense (Chen et al., 1995). Este contempla un grupo de cepas aisladas de diferentes leguminosas, entre las que se incluye la soya en una zona rida salina de China. Algunas de estas cepas fueron idnticas a Mesorhizobium ciceri en la secuencia de ARNr 16S, mientras que otras presentan ms del 60 % de homologa del ADN con Mesorhizobium huakii. x Mesorhizobium mediterraneum (Nour et al., 1995) forma ndulos efectivos en Cicer arietenum, pero se diferencia de Mesorhizobium ciceri y otras especies por su secuencia de ARNr 16S y otras caractersticas. x Mesorhizobium plurifarium (de Lajudie et al., 1998b). Procede de cepas aisladas de Acacia spp. en Senegal. Estas cepas se dividieron en dos grupos en cuanto a ciertas evaluaciones del fenotipo, homologa ADN-ADN y ARNt-ADN, as como secuenciamiento de genes del ARNr 16S y composicin de base del ADN. Un grupo perteneci a Sinorhizobium teranga y el otro fue sometido a otras evaluaciones complementarias donde se incluyeron cepas de referencia de Sudn y otras cepas aisladas de Acacia senegal, Acacia tortilis subsp. Raddiana, Prosopis juliflora, Leucaena spp. y Chamaecrista spp. procedentes de Senegal, Sudn y Brasil. x Mesorhizobium amorphae (Wang et al, 1999a). Fue aislado de Amorpha fructicosa, arbusto nativo del Sureste y del Oeste de Estados Unidos (Allen y Allen, 1981) y ha sido cultivado en Asia por ms de medio siglo. Esta especie presenta una caracterstica inusual para el gnero Mesorhizobium y es que contiene plasmidios simbiticos, lo cual pudiera ser un precedente para la existencia de este componente genmico en algunas especies. (Wang et al.,1999a) Gnero Azorhizobium (Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4). Es el gnero que forma ndulos efectivos en tallos y races de Sesbania rostrata. Es la rama ms alejada de Rhizobium y slo posee reconocida la especie Azorhizobium caulinodans (Dreyfus et al., 1988), aunque se han determinado otras (no clasificadas an) mediante anlisis de homologa ADN-ADN (Rinaudo et al., 1991). La filogenia basada en los 16

genes nod muestran que estos genes en Azorhizobium caulinodans son los ms distantes en relacin con todos los dems genes (Lindstrom et al., 1995a). Es el nico gnero que puede crecer con nitrgeno atmosfrico en su estado libre de existencia (el trmino Azo se refiere a Nitrgeno) (Sprent y Sprent, 1990). Posee una gran definicin en cuanto a su posicin filogentica con respecto a Rhizobium y Bradyrhizobium, donde se encuentra alejado del primero (Young, 1996) Gnero Bradyrhizobium (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3 y Fig. 4). Las clulas bacterianas de este gnero son aerobias, Gram-negativas, con un flagelo polar o subpolar, su crecimiento en medio enriquecido con levadura es pobre y lento, son pleomrficas y no forman esporas (Jordan y Allen, 1980). Pueden formar colonias de tipo seco, opacas y frecuentemente punctiformes. (La Favre et al., 1991) La formacin de polisacridos extracelulares es comn en Bradyrhizobium, as como para todos los gneros (Jain et al., 1990), al igual que la presencia de grnulos de poli-E-hidroxibutirato, polmero que an sin constituir un lpido, absorbe los colorantes lipoflicos. (Martnez-Viera, 1986) Los bradyrizobios son productores de lcali, lo cual puede estar relacionado conque las cepas de este gnero son generalmente ms tolerantes a los suelos cidos que las de rpido crecimiento (Bordeleau y Prvost, 1994). Requieren de 3-5 das para provocar turbidez moderada en medio lquido y tienen un promedio de multiplicacin de 6-8 h. Muchas cepas crecen mejor en pentosas como nica fuente de carbono (Somasegaran y Hoben, 1994) a pesar de que Elkan y Kuykendall (1981) concuerdan que la arabinosa es la fuente de carbono preferida por las especies de este gnero. Owen y Wright (1965) afirmaron que algunas cepas de Bradyrhizobium producen un aminocido llamado rhizobiotoxina y est asociado a cierta clorosis de la soya, en tal sentido, Teaney III y Fuhrmann (1993) determinaron que la presencia de NO 3 en el suelo puede reducir el efecto de este aminocido en la planta. La secrecin de la toxina est relacionada con el gnero (La Favre y Eaglesham, 1986). El gnero Bradyrhizobium presenta una gran heterogeneidad, la cual ha servido como base para la propuesta de varias especies, como son Bradyrhizobium elkanii (Kuykendall et al., 1988; Kuykendall et al., 1992), Bradyrhizobium liaoningense (Young y Haukka, 1996) y Bradyrhizobium sp. (Young, 1996) La taxonoma de Bradyrhizobium se encuentra actualmente en un estado de confusin (Young y Haukka, 1996). Segn criterios de estos autores, incluso las cepas pertenecientes a Bradyrhizobium

japonicum son an muy diversas y se necesita investigar ms en ellas y en las que an se desconocen para ser reconocidas taxonmicamente. Se reconocen hasta el momento las especies: x Bradyrhizobium japonicum (Kirchner, 1895; Jordan, 1982): rizobio de crecimiento lento en LMA, productor de lcali. Forma ndulos efectivos solamente en Glycine max. x Bradyrhizobium elkanii (Kuykendall et al., 1992). Fue propuesto sobre la base del grupo II de cepas de Bradyrhizobium japonicum. No se ha formulado an su formal descripcin. x Bradyrhizobium liaoningense (Xu et al., 1995). Esta especie se ha definido como un rizobio de crecimiento extra lento, y al igual que el anterior, su caracterizacin est basada principalmente en anlisis de homologa del ADN, as como secuenciamiento de genes del ARNr 16S. x Bradyrhizobium sp. (Young, 1996) abarca aquellas cepas que pertenecen a Bradyrhizobium, pero que no forman ndulos en la soya, aunque s en otras leguminosas. No hay especies definidas an para este grupo, solamente son conocidas como Bradyrhizobium sp. seguido por el gnero de la leguminosa hospedera en parntesis (Young y Haukka, 1996). Otros autores (Bcquer, 1998; Prvost et al, 1998; Bcquer et al, 2000a; Bcquer et al., 2000b; Bcquer et al., 2002a; Bcquer et al., 2002b) han aislado y caracterizado cepas a partir de ndulos efectivos en leguminosas forrajeras nativas de Cuba (Centrosema plumieri, Centrosema pubescens, Centrosema virginianum; Neonotonia wightii y Stylosanthes viscosa). Se comprob pertenecen a Bradyrhizobium, pero con caracteres fenotpicos y genotpicos a nivel intraespecfico, diferenciados del resto de las especies conocidas, por lo cual se infiere la presencia de una nueva especie de Bradyrhizobium. OTROS GENEROS EN ESTUDIO Algunos simbiontes de Aeschynomene indica que pertenecen a Bradyrhizobium sp. han resultado ser fotosintticos, por lo que se propuso el nombre de Photorhizobium (Eaglesham et al., 1990; Young et al., 1991) pero que no se ha reconocido hasta el momento como gnero. Otro gnero ha sido propuesto por De Lajudie et al.,(1998a): Allorhizobium (tabla II), aislado a partir de ndulos de Neptuna natans, en Senegal y hasta el momento se conoce la especie Allorhizobium undicola. Segn Martnez-Romero et al. (2000), de acuerdo al secuenciamiento de los genes del ARNr 16S, Allorhizobium y Agrobacterium (Fig. 2, Fig. 3, respectivamente) pudieran ser includos en el gnero Rhizobium, aunque por el momento el primero debe verse como un gnero incipiente. Segn Giller (2001), las especies de Crotalaria sp. han sido informadas como leguminosas hospederas 17

promiscuas, en las que cepas de Bradyrhizobium sp. forman ndulos efectivos. Sin embargo, recientemente fueron estudiadas varias especies de esta leguminosa en Senegal, donde 6 de ellas fueron infectadas slo por Bradyrhizobium, y 3 especies (Crotalaria glaucoides, Crotalaria perrottetti y Crotalaria podocarpa) presentaron ndulos al ser infectadas slo por cepas de rpido crecimiento, con caractersticas inusuales y pertenecientes al gnero Methylobacterium (Sy et al., 2001). Este gnero abre una posible nueva categora de simbionte en leguminosas, ya que es completamente diferente a los dems gneros de la familia Rhizobiaceae, se encuentra situado taxonmicamente en una rama diferente de la subclase -2 de Proteobacteria, y adems crece en metanol (Sprent, 2001). Segn, Janet Sprent (com. pers.) ha sido propuesto ltimamente otra especie, perteneciente a beta proteobacteria, Ralstonia taiwanensis, y que forma ndulos en especies de Mimosa, incluyendo a Mimosa pudica. DATOS COMPLEMENTARIOS SOBRE LOS GENEROS DESCRITOS Los rizobios, segn Young (1996) son claramente polifilticos, o sea, no existen ramificaciones del rbol de evolucin que puedan contener solamente a los rizobios y no otras bacterias. Las pruebas modernas de biologa molecular nos permiten corroborar esta afirmacin. La diversidad gentica de los rizobios es muy amplia (Sawada et al., 1993) y podemos ver, como en Bradyrhizobium se pueden segregar otros gneros a partir de cepas con caractersticas en sus funciones simbiticas diferentes. Segn datos aportados por Oyaizu et al. (1993) se han aislado cepas de ndulos pertenecientes a Mimosa invisa y Mimosa pudica, en las Filipinas, las cuales fueron similares a Rhizobium leguminosarum y a Bradyrhizobium japonicum, as como a una nueva lnea de Rhizobium galegae, sobre la base de sus secuencias de genes del ARNr 16S. Otro ejemplo de esta diversidad lo vemos en el hecho que en Rhizobium los plasmidios son los responsables de mantener la informacin gentica, sin embargo, Mesorhizobium loti posee la informacin de la simbiosis en los cromosomas (Martnez-Romero y Caballero-Mellado, 1996). Tambin merece la atencin el hecho de que en las especies de Bradyrhizobium los genes de nodulacin y fijacin de nitrgeno estn localizados en los cromosomas (Long, 1989; Somasegaran y Hoben, 1994; Schlaman et al., 1992; MartnezRomero y Caballero-Mellado, 1996; Young, 1996; Young y Johnston, 1989). En cuanto a este ltimo gnero se ha dicho por Graham et al., 1991 que es una de las especies que rompe una de las bases de la taxonoma del rizobio, ya que posee cepas que presentan homologa de 40-60 %, lo cual ocurre tambin con Rhizobium tropici. (Wang et al., 1999b) Estudios ms recientes han esclarecido aspectos anteriormente desconocidos en el genoma de la

clula, como es la longitud de los cromosomas del rizobio, la cual alcanza 3500 kb en Rhizobium (Honeycutt et al., 1993) y 8700 kb en Bradyrhizobium. (Kndig et al., 1993) Existen referencias de una transferencia lateral de marcadores cromosmicos en Rhizobium (Demezas et al., 1995, Souza et al., 1992). Recientemente, la recombinacin gentica para generar biodiversidad ha sido explotada directamente en la prctica agrcola. Se conoce que plantas de Lotus corniculatus fueron inoculadas con una cepa comercial de Mesorhizobium loti en suelos de Nueva Zelanda, ricos en esta especie. La mayor parte de los rizobios recuperados de los ndulos de Lotus corniculatus parecan pertenecer a las cepas nativas, pero con la informacin gentica de los microsimbiontes procedentes del inculo comercial (Martnez-Romero y Caballero-Mellado, 1996). Estos autores plantearon que es difcil determinar si las poblaciones de Rhizobium son nativas de un rea, o introducidas. Ese es el caso de Rhizobium tropici y Rhizobium etli en suelos de Francia. Martnez-Romero (1994) consider que los plasmidios pueden ser transferidos de un gnero a otro, tanto en condiciones de laboratorio, como en el campo. Se conoce por Martnez-Romero et al. (1985) que el Agrobacterium que contenga plasmidios simbiticos puede formar ndulos e incluso fijar nitrgeno en la leguminosa hospedera correspondiente. Strain et al. (1995) sealaron: ....qu ignorantes somos acerca de los mecanismos por los cuales los procariontes estn distribudos por el planeta, y los factores que influyen en su establecimiento y adaptacin a los nuevos ambientes...!. No obstante, an parece razonable suponer que existe una distribucin natural y exitosa de Rhizobium y Bradyrhizobium, independiente de la accin del hombre. Segn Martnez Viera (1986) y Fernndez y Novo (1988), los rizobios pueden crecer en un rango o de temperatura de 20-31 C, as mismo Hamdi (1985) sita a los bradyrhizobios entre los menos tolerantes a la alcalinidad, sin embargo, Bcquer et al. (2000a) y Bcquer et al. (2001) han caracterizado cepas de Bradyrhizobium sp. (Centrosema sp.) que crecieron a 40 oC y toleraron pH de 11, lo cual demuestra la amplia diversidad gentica de estas bacterias. La secrecin de toxinas es otra de las caractersticas fisiolgicas que pudieran servir para diferenciar gneros. Los bradyrizobios producen rhizobiotoxina (La Favre y Eagleshman, 1986), sustancia encontrada solamente en este gnero, as como la melanina es producida por Rhizobium (Cubo et al., 1988). En trabajos realizados por Bcquer et al. (1997), se determin que Rhizobium sp. (Canavalia) puede formar halo de inhibicin frente a la presencia de micelios de Trichoderma sp. en medio LMA (Levadura-Manitol-Agar), lo cual indica la secrecin de algn metabolito capaz de 18

contrarrestar la presencia de otros microorganismos. Esto pudiera estar relacionado con molculas de alto peso molecular que segregan ciertas cepas de Rhizobium leguminosarum, llamadas rizobiocinas (o bacteriocinas medianas), descritas por Twelker et al. (1999), las cuales juegan un papel muy importante en la competencia a nivel rizosfrico por sus propiedades biocidas o inhibitorias. METODOLOGIAS MAS USADAS PARA LA CARACTERIZACION DE CEPAS DE RIZOBIOS Los estudios actuales que permiten identificar las diferentes especies y gneros de rizobios estn basados en criterios muy especficos con el fin de evitar posibles errores de clasificacin. Es por eso que existen criterios que sealan la taxonoma de los rizobios en una etapa de transicin (Graham et al., 1991) ya que algunos de los mtodos utilizados para clasificar esta bacteria en dcadas pasadas han dejado de ser nicos en su tipo y han cedido paso a tcnicas de biologa molecular, aunque se mantienen muchos de los anlisis fenotpicos y el estudio de la simbiosis leguminosa-rizobio, ya que en stas se evalan las funciones fisiolgicas y ecolgicas de la clula. (Vandamme et al., 1996) Por otra parte, Martnez-Romero y CaballeroMellado (1996) sealaron que, incluso unos pequeos cambios genticos pueden causar efectos profundos (pleiotrficos) en el fenotipo. Por esta razn, la sistemtica basada solamente en el fenotipo puede conllevar a resultados confusos, divergentes o distorsionados. Evaluaciones del fenotipo Las evaluaciones fenotpicas se basan principalmente en el crecimiento de las colonias en LMA, presencia o ausencia de deshidrogenasa 6fosfogluconato-NADP, utilizacin de carbohidratos como fuente de carbono para el crecimiento (Graham et al., 1991), resistencia a antibiticos (Prvost et al., 1987), respuesta a la presencia de metales pesados y diferentes niveles de NaCl y pH (Drouin et al., 1996), caractersticas fisiolgicas que aunque difieren entre gneros y especies, incluso entre cepas, son transmitidas por intercambio gentico (interaccin cooperativa) entre miembros de poblaciones bacterianas. (Hardy, 1981) Las enzimas son molculas responsables de la direccin de la compleja red de reacciones qumicas celulares, y representan los productos ms importantes de los genes contenidos en el ADN (de Robertis y de Robertis, 1986b). La electroforesis multilocus de enzimas es un mtodo muy til para la caracterizacin inicial de cepas (McLellan y Ranshaw, 1981; Young, 1985; Selander et al., 1986; Pinero et al., 1988; Young y Wexler, 1988; Harrison et al., 1989; Eardly et al., 1990; Martnez-Romero et al., 1991 y otros) que mayormente refleja las

propiedades de los genes localizados en los cromosomas, y por lo tanto, la diversidad gentica intraespecfica. La electroforesis de protenas (Costas, 1992; Kersters et al., 1994; Pot et al., 1994; Vauterin et al., 1993; de Maagd et al., 1988), es un mtodo que se basa en el punto isoelctrico de este componente celular que permite su separacin bidimensional y migracin en un gel de poliacrilamida a travs de un gradiente de pH (de Robertis y de Robertis, 1986a) y ha sido utilizado por Cloutier et al. (1992), entre otros autores, para el estudio de factores relacionados con la adaptacin de rizobios a bajas y altas temperaturas, sobre la base de que las llamadas protenas de choque trmico (HSPs) son rpidamente sintetizadas bajo esas condiciones extremas. Tambin Lipsanen y Lindstrm (1989) lo utilizaron en la caracterizacin de cepas aisladas en Galega officinalis para la propuesta de una nueva especie (Rhizobium galegae). Los liposacridos (LPS) son parte de la pared de las bacterias Gram negativas. Estos, conjuntamente con los exopolisacridos juegan un papel importante en la determinacin de la especificidad del hospedero (Gray et al., 1990; Reuber et al., 1991; Noel, 1992). Una parte de los LPS (antgeno-O) se supone que protege la bacteria contra las toxinas vegetales involucradas en el desarrollo del ndulo (Eisenschenk et al., 1994). La caracterizacin de los liposacridos (de Maagd et al., 1988; Cava et al., 1989; Lipsanen y Lindstrm, 1989) fue usada como uno de los mtodos para la propuesta de Rhizobium galegae (Lindstrom, 1989) como nueva especie en el gnero Rhizobium. Tambin se utiliza el mtodo del anlisis de la composicin de cidos grasos (FAME) (Welch, 1991; Vandamme et al., 1996). Los cidos grasos constituyen la mayor parte de los lpidos y los liposacridos y han sido analizados con propsitos taxonmicos. Este mtodo, segn Sasser y Wichman (1991) y Stead et al. (1992) es uno de los ms usados para los anlisis taxonmicos rpidos. Toda sustancia que provoque una respuesta inmunolgica al ser introducida en animales o humanos se le considera un antgeno. Los mtodos serolgicos (Vincent, 1941, 1942, 1970; Graham, 1963; Eaglesham et al., 1987) se utilizan con frecuencia por resultar de suma importancia por la especificidad en la identificacin y caracterizacin de los rizobios. (Selander et al., 1986; Pinero et al., 1988) Los resultados de estas tcnicas son procesados a travs del anlisis numrico, enfoque actual de la taxonoma numrica, la cual se desarroll paralelamente con la computacin (Sneath, 1984). Esta permite la comparacin simultnea de grandes cantidades de rasgos fenotpicos para grandes 19

cantidades de cepas (Vandamme et al., 1996). El anlisis numrico tambin es utilizado para la caracterizacin genotpica y se realiza tanto en una como en la otra, mediante programas computarizados o paquetes de software. (Legendre y Legendre, 1984; Sackin, 1987) Evaluaciones del genotipo Las evaluaciones del genotipo comprenden un conjunto de tcnicas moleculares, encaminadas a caracterizar el genoma celular y permite la comparacin de datos entre cepas desconocidas y aquellas de referencia ya clasificadas anteriormente. La tendencia que muestran dos hebras de ADN a por sus regiones aparearse y enrollarse complementarias para formar dobles hlices es una funcin de la proximidad (homologa) conque se encuentran en sus relaciones taxonmicas (Lehninger, 1982). El estudio de la homologa ADNADN de las cepas propuestas como nueva especie es determinada por las metodologas establecidas por de Ley et al. (1975); Jarvis et al. (1980); Lorgon et al. (1982); Wedlock y Jarvis (1986). Tambin otros autores, como Laberge et al. (1989); Brun et al., 1991 y Davis et al. (1986) han contribuido a enriquecerlas. Para esta tcnica se utilizan sondas de 32 ADN purificado marcadas con P , las cuales se hibridizan con el ADN a identificar y mediante el reconocimiento de secuencias especficas de nucletidos, se determina la homologa (Somasegaran y Hoben, 1994). Las sondas de genes con el uso de la hibridacin de cidos nucleicos constituyen, as mismo, la clave para la identificacin de cepas. (Somasegaran y Hoben, 1994) No obstante, otros autores, como Stackenbrandt y Goebel (1994) han considerado que las tcnicas de hibridacin del ADN presentan serias desventajas porque dependen de parmetros fisico-qumicos, no son acumulativas, son engorrosas en su realizacin y requieren de grandes cantidades de ADN. Tambin Martnez-Romero y Caballero-Mellado (1996), as como van Berkum et al. (1998, 1999) han sugerido que el concepto de especie bacteriana, basado en la homologa ADN-ADN, impone lmites arbitrarios en lo que es realmente una continuidad. Grimont et al. (1980) dieron a conocer hace dos dcadas que los datos de hibridacin del ADN obtenidos en diferentes laboratorios no siempre correlacionaron bien. Ejemplo de esta falta de correlacin lo constituyen los resultados de la hibridacin de ADN-ADN entre algunas subespecies de Campylobacter sputorum, que no presentaron la homologa apropiada entre s, a pesar de que mediante la aplicacin de otras tcnicas, haban sido formalmente clasificadas y agrupadas dentro de la misma especie sputorum (Vandamme et al., 1996). As mismo, Bcquer et al. (2001); Bcquer et al. (2002a), Bcquer et al. (2002b) reportaron cepas de

rizobios aisladas en leguminosas forrajeras que presentaron baja homologa de sus ADN con cepas tipos de Bradyrhizobium sp., mientras que los anlisis del fenotipo y otras tcnicas moleculares, como la amplificacin de los genes del ARNr 16S, demostraron la cercana filogentica de las cepas estudiadas con el gnero Bradyrhizobium. Mtodos como la determinacin de los valores de G+C en el ADN (Jordan, 1984; Chen et al., 1988), la hibridacin de cidos nucleicos (Scholla and Elkan, 1984) han sido utilizado con xito para la determinacin de los gneros Rhizobium y Bradyrhizobium, y la ubicacin de sus especies. (Graham et al., 1991) Woese (1987) consider el ARN ribosmico como lo ms til de las secuencias altamente conservadas y disponibles para la medicin de las relaciones filogenticas. As, el anlisis del polimorfismo del ARNr 16S, mediante la amplificacin de sus genes por PCR, o la hibridacin de ste con ADN debe ser aplicado a aquellas cepas que representan nuevos grupos de bacterias nodulares (Graham et al., 1991). Autores como de Smedt y de Ley (1977); Lane et al. (1985); Kaijalainen y Lindstrm (1989), Gray et al. (1990) as como Young et al. (1991), Laguerre et al. (1996), Herrera-Cervera et al. (1999) y van Berkum et al. (1999) han perfilado y mejorado estas tcnicas en la caracterizacin y clasificacin de rizobios. La secuencia de genes sufre cambios a travs de procesos de mutaciones al azar, pero a no ser por ciertas excepciones, el tiempo comprendido en estos cambios se calcula en billones de generaciones y es regulado por el proceso de seleccin natural (Giller, 2001). Para realizar estudios ms profundos en la organizacin del ADN, se desarroll en 1964 el mtodo de secuenciamiento de genes, el cual se aplic por primera vez a molculas pequeas del ARNt de levaduras que codifican para alanina (Watson et al., 1994), y posteriormente se obtuvo en 1975 la secuencia completa del ARN cromosmico de un fago, el MS2. En rizobios, el secuenciamiento de genes del ADN (Sanger et al., 1977; Sambrook et al., 1989), as como del ARN (Weisburg et al., 1991; Young y Haukka, 1996; Laguerre et al., 1997, Wang et al., 1998; Parker, 1999, Parker y Lunk, 2000 y otros) se consideran tcnicas para un nivel fino de caracterizacin y desde 1991 el mtodo de secuenciamiento de genes del ARNr 16S es recomendado como el primer mtodo a utilizar en ese nivel. (Stackenbrandt y GoodFellow, 1991) Segn Laguerre et al. (1997), el secuenciamiento de genes permite una resolucin suficiente para la clasificacin de microorganismos, mientras que la amplificacin de genes por PCR-RFLP del ARNr 20

16S slo puede usarse para la estimacin de la filogenia. Los datos que se obtengan pueden ser comparados con aquellos que ya se encuentran en bases de datos internacionales disponibles (de Rijk et al., 1992; Olsen et al., 1991) y los resultados, cuando conlleven a nuevas propuestas de gneros y especies, deben ser discutidos en un comit internacional oficial relacionado con el tema. (Murray et al., 1990) Los espaciadores intergnicos son segmentos de ADN que no se transcriben (de Robertis y de Robertis, 1986) y aunque pueden ser heterogneos por el nmero variable de secuencias repetidas de los 15 pares de bases, la amplificacin mediante PCR de los espaciadores intergnicos (IGS, en Ingls) del ARNr 16S-23S ofrece una gran confiabilidad en el examen de las variaciones genticas codificadas cromosmicamente en el nivel intraespecfico (Barry et al., 1991) y es un mtodo utilizado por diversos autores ( Ponsonnet y Nerwe, 1994; Laguerre et al., 1996, Bcquer et al., 2000b; Bcquer et al., 2002b y otros) en estudios de caracterizacin y clasificacin de especies. Por otra parte, los plasmidios son molculas pequeas de ADN bacteriano, que se replican con autonoma y que contienen genes resistentes a antibiticos especficos (Watson et al., 1994). La determinacin de perfiles de plasmidios es una de las evaluaciones de mayor importancia, ya que los diferentes patrones de migracin en geles de agarosa durante la electroforesis pueden valer en el reconocimiento de una cepa rizobiana especfica, as como en la deteccin de prdida de estas molculas (Somasegaran y Hoben, 1994). Una de las diferencias que se pueden ver con frecuencia entre gneros es la ubicacin del ADN; as como la localizacin de los genes nod ABC (genes comunes, responsables de la nodulacin) y otros genes con diferentes funciones en el genoma, como los nif, exo, lps, ndv, ya sea en el ADN cromosmico, o plasmdico (Sprent y Sprent, 1990). Un ejemplo de gneros bacterianos con genes en el ADN cromosmico lo constituyen Bradyrhizobium y Mesorhizobium, mientras que en el resto de los gneros rizobianos existe presencia de genes plasmdicos. (Young et al., 1996) CONCLUSIONES Los criterios para la caracterizacin y clasificacin de los rizobios son tan variados como las tcnicas que se emplean. Es imposible explicar la diversidad gentica de un microorganismo con un solo criterio. Po eso se impone preservar y aplicar evaluaciones que pueden parecer obsoletas, como las utilizadas para el fenotipo, ya que los caracteres fisiolgicos y bioqumicos de la clula, as como el rol ecolgico de sta en la naturaleza, no seran esclarecidos con la nica utilizacin de las actuales tcnicas de biologa molecular. La taxonoma polifsica es un

ejemplo de ese principio, ya que toda la informacin genotpica, fenotpica y filogentica es includa en su anlisis. Sin embargo, la profundizacin en el estudio del genoma constituye, sin lugar a dudas, una necesidad, tanto del bilogo molecular, como del eclogo microbiano. De la forma en que podamos encontrar las conexiones entre el genotipo y la expresin fisiolgica-bioqumica de la clula, nos dar la respuesta a las incgnitas que an subsisten en torno a la taxonoma y las aplicaciones agrcolas de los rizobios. Quizs por ese motivo debemos enfrentar la incertidumbre de encontrarnos con una transicin tecnolgica constante, lo que hace de la taxonoma una ciencia de alto nivel de discusin. El procesamiento de la informacin obtenida en los laboratorios juega un papel importante, pudiera decirse decisivo, en la interpretacin de las observaciones cientficas. La ltima dcada ha tenido una escalada inesperada en la informtica y la bioinformtica, lo que facilita enormemente este trabajo.

La amplia gama de gneros y especies que comprende la familia Rhizobiaceae en la actualidad no es ms que el resultado del aceleramiento tecnolgico en la taxonoma. Si analizamos las propuestas de especies, y el ritmo creciente que han tenido en los ltimos diez aos, aparece quizs como una progresin aritmtica. Gneros como Rhizobium y Bradyrhizobium han abierto su rango de especies, a tal extremo que parecen interminables las nuevas propuestas, ya que la situacin geogrfica, las condiciones edafoclimticas y la prospeccin de leguminosas hospederas nativas favorecen el estudio de la amplia diversidad gentica de estas bacterias. Finalmente, se debe prestar especial atencin a los rizobios aislados de ecosistemas sometidos a la accin de condiciones naturales adversas. Est comprobado que sus caractersticas fisiolgicas se diferencian notablemente de aquellos que son aislados de zonas agrcolas con condiciones edafoclimticas ms nobles. Esas caractersticas resultantes de mutaciones en el genoma, pueden y deben ser explotadas en la prctica agrcola.

REFERENCIAS Allen, O. N. and E. K. Allen (1981): The Leguminosae: a source book of characteristics, uses, and nodulation. Madison, W. I: University of Wisconsis Press. Amarger, Nelle; V. Marcheret. and Gisele Laguerre (1997): Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov.from Phaseolus vulgaris nodules. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 9961006. Barry, T. et al. (1991): The 16S/23S ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Applic. 1:51-56. Bcquer, C. J. (1998). Diversidad gentica y posicin taxonmica de rizobios, aislados de leguminosas forrajeras nativas en Sancti-Spritus, Cuba. Tesis de Maestra. Universidad de La Habana. 75 p. _____________ (2002): Caracterizacin y seleccin de rizobios aislados de leguminosas nativas de Sancti-Spritus, Cuba. Tesis en opcin al grado cientfico de Doctor en Ciencias Biolgicas. Universidad de La Habana. 130 p. Bcquer, C. J.; Danielle. Prvost, y J. Cloutier (2001): Aspectos fisiolgicos y genticos de rizobios aislados de leguminosas forrajeras. Pastos y Forrajes. 24:123-130. _________________________________________ (2002a): Diversidad gentica de rizobios, aislados de leguminosas forrajeras de Sancti-Spiritus. Biologa. 16:130-136. Bcquer, C. J.; Danielle. Prvost y A. Prieto (2000a): Caracterizacin fisiolgica y bioqumica de rizobios, aislados de leguminosas forrajeras. Biologa. Universidad de La Habana. 14:57-65. Bcquer, C. J.; Danielle Prvost; J. Cloutier and Gisele Laguerre (2000b): Diversity of rhizobia isolated from forage legumes indigenous to Cuba. 17th North American Conference on Symbiotic Nitrogen Fixation. July 23-28, Qubec, Canada. p. 25. _______________________________________________________(2002b):Enfoque taxonmico de rizobios aislados de leguminosas forrajeras. Biologa. 16:137-145. 21

Bcquer, C. J.; Yamilka Ramos.; Mirtha Valdivia y Maria Dolores Arioza (1997): Compatibilidad y antagonismo Trichoderma-rizobio. II Taller Internacional de colecta y evaluacin de recursos fitogenticos nativos. Sancti-Spritus, Cuba. p.37. Beijerinck, M. W. (1890): Knstliche infection von Vicia faba mit Bacillus radicicola: Ernrungsbedingungen dieser Bacterie. Botanische Zeitung. 48:837-843. Bordeleau, L. M. and Danielle Prvost (1994): Nodulation and nitrogen fixation in extreme environments. Plant and Soil. 161: 115-125. Bouzar, H. (1994): Request for a judicial opinion concerning the type species of Agrobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 373-374. Brun, Y.; R. Breton and J. Lapointe (1991): Large scale sequencing projects using rapidly prepared double-stranded plasmid DNA. J. DNA seq. Map. 1: 285-289. Cava, J. R.; P. M. Elas.; D. A. Turkowski and K. D. Noel (1989): Rhizobium leguminosarum, CFN 42, genetic regions encoding lipopolysaccharide structures essential for complete nodule development in bean plants. J. Bacteriol. 171: 8-15. Chen, W. X.; G. H. Yan and J. L. Li (1988): Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:85-91. Chen, W. X. et al. (1991): Rhizobium huakuii sp, nov, isolated from the root nodules of Astragalus sinicus. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 275-280. _______________ (1995): Characteristics of Rhizobium tianshanense sp. nov. a moderately and slowly growing root nodule bacterium isolated from an arid saline environment in Xinjiang, People`s Republic of China. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 153-159. _______________ (1997): Rhizobium hainanense sp. nov., isolated from tropical legumes. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:870-873. Chen W-M. et al. (2001): Ralstonia taiwanensis sp. nov., isolated from root nodules of Mimosa species and sputum of a cystic fibrosis patient. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:1729-1735 Choma, A. (1999): Fatty acid composition of Mesorhizobium huakuii liposaccharides. Identification of 27-oxooctasanoic acid. FEMS Microbiol. Ecol. 257-262. Cloutier, J.; Danielle Prvost.; P. Nadeau and H. Antoun (1992): Heat and cold shock protein synthesis in arctic and temperate strains of rhizobia. Appl. and Environ. Microbiol. 9:28462853. Costas, M. (1992): Classification, identification and typing of bacteria by the analysis of their onedimensional polyacrilamide gel electrophoretic protein patterns. Adv. Electrophor. 5 : 351-408. Cubo, M. T; A. M. Buendia-Claveria.; J. E. Beringer and J. E. Ruiz-Sainz (1988): Melanin production by Rhizobium strains. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1812-1817. Dangeard, P.A. (1926): Recherches sur les tubercles radicaux des legumineuses. Le Botaniste, Series 16, Paris. Davis, L. G.; M. D. Dibner and J. F. Batley (1986): Basic methods in molecular biology. Elsewvier Science, New York. De Lajudie, P. et al. (1998a): Allorhizobium undicola gen. nov., sp. nov., nitrogen-fixing bacteria that efficiently nodulate Neptunia natans in Senegal. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 1277-1290. ________________ (1998b). Characterization of tropical tree rhizobia and description of Mesorhizobium plurifarium sp. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:369-382. 22

De Lajudie, P. et al. (1994): Polyphasic taxonomy of rhizobia: emendation of the genus Sinorhizobium and description of Sinorhizobium meliloti comb. Nov., Sinorhizobium saheli sp. nov, and Sinorhizobium teranga sp. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:715-733. Ley, J. de; H. Cattoir and A. Reynaerts (1975): The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates. Eur. J. Biochem. 12: 133-142. Maagd, R. A .de; C. van Rossum and B. J. J. Lugtenberg (1988): Recognition of individual strains of fast-growing rhizobia by using profiles of membrane proteins and lipopolysaccharides. J. Bacteriol. 170: 3782-3785. Demezas, D. H. et al. (1995): Diversity and genetic structure of a natural population of Rhizobium leguminosarum bv trifolii isolated from Trifolium subterraneum L., Mol. Ecol. 4, 209. Rijk, P. de; J. M. Neefs.; Y. Van de Peer and R. de Wachter (1992): Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences. Nucleic acids Res. 20:2075-2089. Robertis, E. P. D. de y E. M. F. de Robertis (1986a): Componentes moleculares y metabolismo de la clula. En: Biologa Celular y Molecular I. Edicin Revolucionaria. La Habana. 5: 67-92. ____________________________________ (1986b): Enzimas, bioenergtica y respiracin celular. En: Biologa Celular y Molecular I. Edicin Revolucionaria. La Habana. 6:93-111. Smedt, J. de and J. de Ley (1977): Intra-and intergenic similarities of Agrobacterium ribosomal ribonucleic acid cistrons. Int. J. Syst. Bacteriol. 27: 222-240. Dreyfus, B.; J. L. Garca y M. Gillis (1988): Characterization of Azorhizobium caulinodans gen. Nov, a stem-nodulating nitrogen-fixing bacterium isolated from Sesbania rostrata. Int. J. Syst. Bacteriol . 38: 89-98. Drouin, P. D.; Danielle Prvost and H. Antoun (1996): Classification of bacteria nodulating Lathyrus japonicus and Lathyrus pratensis in Northern Qubec as strains of Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 1016-1024. Eaglesham, A. R. J. et al. (1990): The first photosynthetic N2-fixing rhizobium: characteristics. In: Nitrogen Fixation: Achievements and objectives. Eds. P. M. Gresshoff; L. E. Roth; G. Stacey and W. E. Newton. Chapman and Hall, New York, USA. Pp. 805-810. ______________________ (1987): Physiological and biochemical aspects of diversity of Bradyrhizobium sp. (Vigna) from three West-African soils. Soil Biol. Biochem. 19: 575-581. Eardley, B. D. et al. (1990). Genetic structure of natural populations of the nitrogen-fixing bacterium Rhizobium meliloti. Appl. Environ. Microbiol. 56: 187-194. Eisenchenk, L. et al. (1994): Inhibition of Rhizobium etli polysaccharide mutants by Phaseolus vulgaris root compounds. Appl. Environ. Microbiol. 60:3315-3322. Elkan, G. H. and L. D. Kuykendall (1981): Carbohydrate metabolism. In: Nitrogen Fixation. Vol. II. Edited by Oxford University. Press, London. Pp. 147-166. Fernndez, C. y R. Novo (1998): En: Vida microbiana en el suelo. Universidad de La Habana. 525 p. Frank, B. (1889): Uber die pilzsymbioseder leguminosen. Ver. Deut. Bot. Gesell. 7: 332-346. Fred, E. B.; I. Baldwin,; E. McCoy (1932): Root nodule bacteria and leguminous plants. Madison, W. I. University of Wisconsin. Giller, K. E. (2001): Nitrogen Fixation in Tropical Cropping Systems. CAB International. 423 p. Graham, P. H. (1963): Antigenic affinities of the root-nodule bacteria of legumes. Antonie van Leewenhoek. 29: 281-291. 23

Graham, P. H. et al (1991): Proposed minimal standards for the description of new genera and species of root and stem-nodulating bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 582-587. _________________ (2000): Rhizobium gallicum: a misplaced prairie rhizobium. In: Abstract Book 11th North American Conference on Symbiotic Nitrogen Fixation, Qubec, Canada. P.34. Gray, J. X.; M. A. Djordjevic and B. G. Rolfe (1990): Two genes that regulates exopolysaccarides production in Rhizobium sp. NGR 234: DNA sequences and resultant phenotypes. J. Bacteriol. 172: 193-203. Grimont, P. A. D. et al. (1980): Reproductibility and correlation study of three deoxyribonucleic acid hibridization procedures. Curr. Microbiol. 4: 325-330. Hamdi, Y. A. (1985): La fijacin biolgica del nitrgeno. FAO. 160 p. Hardy, K. (1981): Bacterial plasmids. Aspects of microbiology, series N 4. American Society for Microbiology, Washington, D. C. Harrison, S. P.; D. G. Jones and J. P. W. Young (1989): Rhizobium population genetic variation within and betwen populations from diverse locations. J. gen. Microbiol. 135: 1061-1069. Hellriegel, H. and H. Wilfarth (1888): Untersuchungen ber die Stickstoff-Nahrung der Gramineen und Leguminosen. Beilageheft zu der Zeitschrift des Vereins der Ruebenzucker-Industrie Deutschen Reiche. 1:234. Herrera-Cervera, J. A. et al. (1999): At least five rhizobial species nodulate Phaseolus vulgaris in a Spanish soil. FEEMS Microbiol. Ecol. 30:87-97. Honeycutt, R. J.; M. Mc Clelland and B. W. S. Sobral (1993): Physical map of the genome of Rhizobium meliloti 1021. J. Bacteriol. 17:6945. Jain, D. K.; Danielle Prvost and L. M. Bordeleau (1990): Role of bacterial polysaccharides in the derepression of ex-planta nitrogenase activity with rhizobia. FEMS Microbiol. Lett. 73: 167174. Jarvis, B. D. W.; A. G. Dick and R. M. Greenwood (1980): Deoxyribonucleic acid homology among strains of Rhizobium trifolii and related species. Int. J. Syst. Bacteriol. 30:42-52. Jarvis, B. D. W.; C. E. Pankhurst and J. J. Patel (1982): Rhizobium loti, a new species of legume root nodule bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 32: 378-380. Jordan, D. C. (1982): Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing, root nodule bacteria from leguminous plants. Int. J. Syst. Bacteriol. 32:136-139. Jordan, D. C. (1984): Rhizobiaceae. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. V. 1. Ed. N. R. Kreig. Pp. 234-256. Willians and Wilkins, Baltimore, USA. Jordan, D. C. and O. N. Allen (1980): Genus Rhizobium Frank. In: Buchanan and Gibson (ed.). Bergey's Manual of determinative bacteriology, 8th ed. The Williams and Wilkins Co.; Baltimore. pp. 128-129. Kaijalainen, S. and K. Lindstrm (1989): Restriction fragment length polymorfism analysis of Rhizobium galegae strains. J. Bacteriol. 171:5561-5566. Kersters, K. et al. (1994): Identification and typing of bacteria by protein electrophoresis. In: F.G. Priest; A. Ramos-Cormenzana and B. Tyndall (ed.). Bacterial diversity and Systematics. Plenum Press, New York.. 51-66. Kirchner, O. (1895): Die Wurzelnllchender Sojabohne. Beitrage Biologie Pflanzen (Cohn's). 7: 213-223. 24

Kundig, C.; H. Hennecke and M. Gottfert (1993): Correlated physical and genetic map of the Bradyrhizobium japonicum 110 genome. J. Bacteriol. pp. 175:613. Kuykendall, L. D; M. A. Roy.; J. J. O Neill and T. E. Devine (1988): Fatty acids, antibiotic resistance, and deoxyribonucleic acid homology groups of Bradyrhizobium japonicum. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 358. Kuykendall, L. D.; B Saxena.; T. E. Devine and S. E. Udell (1992): Genetic diversity in Bradyrhizobium japonicum, Jordan 1982, and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. Nov, Can. J. Microbiol. 38, 501-505. La Favre, J. S. and A. R. J. Eagleshmam (1986): Rhizobiotoxine: a phytotoxin of unknown function which is commonly produced by bradyrhizobia, Plant Soil. 92: 443-452. La Favre, A.; M. J. Sinclair.; J. S. La Favre and A. R. J. Eagleshmann (1991): Bradyrhizobium japonicum native to tropical soils: novel sources of strains for inoculants for US-type soybean. Trop. Agric. (Trinidad). Vol. 68.N 3. Laberge, S.; Y. Gagnon.; L. M. Bordeleau and J. Lapointe (1989): Cloning and sequencing of the glt gene, encoding the glutamyl tRNA synthetase of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 171: 3926-3932. Laguerre, Gisele; P. Van Berkum; Noelle Amarger and Danielle Prvost (1997): Genetic diversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within the genera Astragalus, Oxytropis and Onobrychis. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4748-4758. Laguerre, Gisele. et al. (1996): Typing of rhizobia by PCR-DNA fingerprinting and PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of chromosomal and symbiotic gene regions: application to Rhizobium leguminosarum and its different biovars. Appl. Environ. Microbiol. 63:4748-4758. Lane, D. J. et al. (1985): Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analysis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82: 6955-6959. Legendre, L. and P. Legendre (1984): Ecologie numrique. 2. La structure des donnes cologiques, 2 nd ed. Presse de l`Universit du Qubec, Qubec, Canada. Lehninger, A. L. (1982): Bioqumica. Editorial Pueblo y Educacin. La Habana. 1117 p. Lindstrm, K. (1989): Rhizobium galegae, a new species of root nodule bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 39, 365-367. Lindstrm, K.; L. Paulin., C. Roos and L. Suominen (1995a): Nodulation genes of Rhizobium galegae. In: Nitrogen Fixation Fundamentals and Applications, Thikhonovich, I. A. et al., Kluwer, The Netherlands. p.807. Lindstrm, K. et al. (1995b): Report from the roundtable on Rhizobium taxonomy, In Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications, Tikhonovich, I. A. et al. Eds. Kluwer, The Netherlands.. 807 p. Lipsanen, P and K. Lindstrm (1989): Lipopolysaccharide and protein patterns of Rhizobium sp. (Galega). FEMS Microbiol. Lett. 58: 323-328. Long, S. R. (1989). Rhizobium-legume nodulation: life together in the underground. Cell. 56: 203-214. Lorgon, J. M.; M. H. Scholla and G. H. A Elkan (1982.): Spectrophotometric DNA-DNA hybridization technique for studying the genetic taxonomy of the Cowpea rhizobia. In K. W. Clark and J. H. G. Stephens (eds.). Proceedings of the Eighth North American Rhizobium Conference. University of Manitoba, Canada. 481-489. Martnez-Romero, Esperanza. (1994): Recent developments in Rhizobium taxonomy. Plant Soil. 161, 11. 25

Martnez-Romero, Esperanza and J. Caballero-Mellado (1996): Rhizobium phylogenies and bacterial genetic diversity. Critical Reviews in Plant Sciences. 2: 113-140. Martnez-Romero, Esperanza; D. L. Kuykendall and J. M. Young (2000): Rhizobia Taxonomy 2000. 17th North American Conference on Nitrogen Fixation, Qubec, Canada. p. 33. Martnez-Romero, Esperanza; M. A. Pardo., R. Palacios and M. A. Cevallos (1985): Reiteration of Nitrogen Fixation gene sequences and specificity of Rhizobium in nodulation and nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris. J. Gen. Microbiol. 131:1779-1786. Martnez-Romero, Esperanza et al. (1991): Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris, L; beans and Leucaena sp. Trees. Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 417-426. Martnez-Viera, R. (1986): Ciclo biolgico del nitrgeno en el suelo. Editorial Cientfico-Tcnica. La Habana. 167 p. McLellan, T. and J. A. M. Ramshaw (1981): Serial electrophoretic tranfers: a technique for the identification of numerous enzymes from single polyacrilamide gels. Biochem. Genet. 19:647-654. Murray, R. G. E. et al. (1990): Report of the ad hoc committee on approaches to taxonomy within the Proteobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 213-215. Nick, G. et al. (1999): Sinorhizobium arboris sp. nov. and Sinorhizobium kostiense sp. nov., two new species isolated from leguminous trees in Sudan and Kenya. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:1359-1368. Noel, K. D. (1992): Rhizobial polysaccharides required in symbiosis with legumes. In: Verma, D. P. S. (ed.). Molecular Signals in Plant-Microbe Interactions. CRC Press, Boca Ratn. Pp. 341-347. Nour, S. M.; J. C. Cleyet-Marel; P. Normand and M. P. Fernndez (1995): Genomic heterogeneity of strains nodulating chickpea (Cicer arietenum, L) and description of Rhizobium mediterraneum sp. nov., Int. J. Syst. Bacteriol. p.45. Nour, S. M.; M. Fernndez; P. Normand and J. C. Cleyet-Marel (1994): Rhizobium ciceri sp. nov., consisting of strains that nodulate chickpeas (Cicer arietenum, L.). Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 511-522. Olsen, G. J.; G. Larsen and C. R. Woese (1991): The ribosomal RNA database project. Nucleic Acids Res. 19 (Suppl.): 2017-2021. Owen, L. D. and D. A. Wrighth (1965): Rhizobial-induced chlorosis in soybeans: isolation, production in the nodule, and varietal specificity of the toxin. Plant Physiol. 40: 927-930. Oyaizu, H. and I. Sawada (1994): Request for a judicial opinion concerning the type species of Agrobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 374. Oyaizu, H.; S. Matsumoto., K. Minamisawa and T. Gamou (1993). Distribution of rhizobia in: Leguminous plants surveyed by phylogenetic identification. J. Gen. Appl. Microbiol. 39:339-354. Parker, M. A. (1999): Relationships of Bradyrhizobia from the legumes Apios americana and Desmodium glutinosum. Appl. Environ. Microbiol. 11:4914-4920. Parker, M. A. and Alexandra Lunk (2000): Relationships of bradyrhizobia from Platypodium and Machaerium (Papilionoideae: tribe Dalbergiae) on Barro Colorado Island, Panama. Pinero, D; E. Martnez and R. K. Selander (1988): Genetic diversity and relationships among isolates of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli. Appl. Environ. Microbiol. 54: 28252832. Ponsonnet, C. and X. Nerwe (1994): Identification of Agrobacterium strains by PCR-RFLP analysis of pTi and chromosomal regions. Arch. Microbiol. 161:300-309. 26

Pot, B.; P. Vandamme and K. Kersters (1994): Analysis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints. In M. Goodfellow and A. G. O`Donnell (ed). Modern microbial methods. Chemical methods in prokaryotic systematics. John Wiley & sons Ltd., Chichester, England.. 493-521. Prvost, Danielle; C. J. Bcquer; J. Cloutier and Gisele Laguerre (1998): Genetic diversity of rhizobia isolated from forage legumes Neonotonia and Centrosema spp., native to Cuba. VIII International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), 9-14 August, Halifax, Canada. Poster No 33. Prvost, Danielle et al. (1987): Characteristics of rhizobia isolated from three legumes indigenous to the canadian high arctic: Astragalus alpinus, Oxytropis maydelliana, and Oxytropis arctobia. Plant and soil. 98 : 313-324. Quinto, C. et al. (1982): Reiteration of nitrogen fixation genes sequences, in Rhizobium phaseoli. Nature. 299:724-726. Reuber, T. L et al. (1991): Analysis of the roles of R. meliloti exopolysaccharides in nodulation. In: Hennecke, H. and verma, D. P. S. (eds). Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions. Kluwer Academic, Dordrecht. Pp. 182-188. Rinaudo, G. et al. (1991): DNA homologies among members of the genus Azorhizobium and other stem-nodulating bacteria isolated from the tropical legume Sesbania rostrata. Int. J. Syst. Bacteriol. 41:114-120. Rome, S. et al. (1996): Sinorhizobium medicae sp. nov., isolated from annual Medicago spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:972-980. Sackin, M. J. (1987). Computer programs for classification and identification methods. Microbiol. 19: 459-494. Sambrook, J.; E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989): Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd de. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. N.Y. Sanger, F; S. Nicklen and A.R. Coulson (1977): DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467. Sasser, M. and M. D. Wichman (1991): Identification of microorganisms through use of gas chromatography. In: Hausler, W. J. Jr. , Herrmann, K. L.; Isenberg, H. D. and Shadony, H. D. (eds.) Manual of Clinical Microbiology, 5th edn. American Society of Microbiology, Washington DC. pp. 111-118. Sawada, H; H. Leiki., H. Oyaizu and S. Matsumoto (1993): Proposal for rejection of Agrobacterium tumefaciens and revised descriptions for the genus Agrobacterium and for Agrobacterium radiobacter and Agrobacterium rhizogenes. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 694-702. Schlaman, H. R. M.; R. J. H . Okker and B. J. J. Lugtenberg (1992): Regulation of nodulation gene expression by nod D in rhizobia. J. Bacteriol. p. 5177-5182. Scholla, M. H. and G. H. Elkan (1984): Rhizobium fredii sp. nov., a fast-growing species that effectively nodulates soybeans. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 484-486. Segovia, L.; J. P. W. Young and E. Martnez-Romero (1993): Reclassification of American Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, type I strains in a new species, Rhizobium etlii sp.nov, Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 374-377. Selander, R. K. et al. (1986): Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol. 51: 873-884. Sessitsch, A.; G. Hardarson., A. D. L. Akkerman and W. M. De Vos (1997). Characterization of Rhizobium etli and other Rhizobium spp. that nodulate Phaseolus vulgaris, L. in an Austrian soil. Mol. Ecol. 6:601-608. 27

Sneath, P. (1984): Numerical taxonomy. In: N. R. Krieg and J. G. Hott (ed.). Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1. The Williams and Wilkins Co. Baltimore. pp. 11-118. Somasegaran, P. and H. J. Hoben, (1994): Handbook for Rhizobia. Springer-Verlag. New York. 450 p. Souza, V. et al. (1992): Hierarchical analysis of linkage disequilibrium in Rhizobium populations : evidence for sex ?. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:8389. Sprent, I. J. and P. Sprent (1990): Nitrogen Fixing Organisms-Pure and Applied Aspects. Chapman and Hall, London. 256 p. Sprent, J. I. (2001): Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew. 146 p. Stackenbrandt, E. and B. M. Goebel (1994): Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequences analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 846-849. Stackenbrandt, E. and M. Goodfellow (1991): Nucleic acid techniques in bacterial Systematics. John Wiley and Sons, New York. Stead, D. E.; J. E. Seilwood, J. Wilson and I. Viney (1992): Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid accurate identification of plant pathogenic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 72: 315-321. Strain, S. R.; T. S. Whittam and P. J. Bottomley (1995): Analysis of genetic structure in soil populations of Rhizobium leguminosarum recovered from the USA and the UK". Mol. Ecol. 4: 105. Swofford, D. L. (1998): PAUP*: Phylogenetic analysis using parsimony (*and Other Methods). Version 4.0b8. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Sy, A. et al. (2001): Methylotrophic Methylobacterium nitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol. 183: 214-220. nodulate and fix

Teaney III, G. B. and J. J. Furhmann (1993): Soybean response to nodulation by Rhizobitoxineproducing bradyrhizobia as influenced by nitrate application. Plant and Soil. 154: 219-225. Twelker, S.; L. J. Oresnik and M. F. Hynes (1999): Bacteriocins of Rhizobium leguminosarum. A molecular analysis. Highlights of nitrogen fixation research. Esperanza Martnez and Georgina Hernndez (eds.) Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. 20: 105-108. Van Berkum, P.; F. Ruihua., A. T. Campbell and B. D. Eardly (1999): Some issues of relevance in the taxonomy of rhizobia. In: Highlights of Nitrogen Fixation Research. Esperanza Martnez and Georgina Hernndez eds. Kluwer Academics/Plenum Publishers. New York. 54:267-269. Van Berkum, P. et al. (1998): Rhizobium mongolense sp. nov., is one of three rhizobial genotypes identified which nodulate and form nitrogen fixing symbioses with Medicago rhutenica [(L.) Lebedour]. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:13-22. Vandamme, P. et al. (1996): Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial Systematics. Microbiol. Rev. p. 407-438. Vauterin, L; J. Swings and K. Kersters (1993): Protein electrophoresis and classification.p. In: M. Goodfellow and A. G. O Donnell (ed.). Handbook of new bacterial systematics. Academic Press Ltd. London. 251-280. Vincent, J. M. (1941): Serological studies of the root-nodule bacteria. 1. Strains of Rhizobium meliloti. Proc. Linn. Soc. (NSW). 66:145-154.

28

_____________ (1942): Serological studies of the root-nodule bacteria. 2. Strains of Rhizobium trifolii. Proc. Linn. Soc. (NSW). 67:82-86. _____________ (1970): A manual for the practical study of root nodules bacteria. Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh. 164 p. Wang, E. T.; Z. Y. Tan., B. Reinhold-Hurek and Esperanza. Martnez-Romero (2000): A multiple antibiotic resistant Sinorhizobium group from Leucaena leucocephala. 17th North American Conference on Symbiotic Nitrogen Fixation, Qubec, Canada. p. 25. Wang, E. T. et al. (1998): Rhizobium huatlense sp. nov., a symbiont of Sesbania herbacea that has a close phylogenetic relationship with Rhizobium galegae. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:687699. ________________ (1999a): Diversity of rhizobia associated with Amorpha fruticosa isolated from Chinese soils and description of Mesorhizobium amorphae sp. Nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:51-65. Wang, E. T. et al. (1999b): Rhizobium etli bv mimosae, a novel biovar isolated from Mimosa affinis. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:1479-1491. Watson, J. D.; M. Gilman., J. A. Witkowski and M. J. Zoler (1994): In: Recombinant DNA. Scientific American Books. New York. 484 p. Wedlock, D. N. and B. D. W. Jarvis (1986): DNA homologies between rhizobia that nodulate Galega and other Rhizobium and Bradyrhizobium species. Int. J. of Syst. Bacteriol. 36:550558. Weisburg, W. G; S. M. Barns; D. A. Pelletier and D. J. Lane (1991): 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173:193-203. Welch, D. F. (1991): Applications of cellular fatty acid analysis. Clin. Microbiol. Rev. 4: 422-438. Woese, C. R. (1987): Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51: 221-271. Xu, L. M. et al. (1995): Bradyrhizobium liaoningensis sp. nov. isolated from the root nodules of soybean. In: Int. J. Syst. Bacteriol. 45:706. Young, J. P. W. (1985): Rhizobium population genetics: enzime polymorphism in isolates from peas, clover, beans and lucerne grown at the same site. J. Gen. Microbiol. 131: 2399-2408. _______________ (1996): Phylogeny and taxonomy of rhizobia. Plant and Soil. 186 : 45-52. Young, J. P. W. and K. Haukka (1996): Diversity and phylogeny of rhizobia. J. Phytol. 133: 87-94. Young, J. P. W. and A. W. B. Johnston (1989): The evolution of specificity in the Legume.Rhizobium Symbiosis. TREE. 4: 341-349. Young, J. P. W. and M. Wexler (1988): Sym plasmid and chromosomal genotypes are correlated in field populations of Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 134: 2731-2739. Young, J. P. W.; H. L. Downer and B. D. Eardly (1991): Phylogeny of the phototrophic Rhizobium BTAil by polymerase Chain Reaction based sequencing of a 16S rRNA gene segment. J. Bacteriol. 173:2271-2277.

Recibido: Febrero 2002 Aceptado: noviembre 2003

29