CONCEITOS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Jorge Mondego

Biologia Molecular

Genome

Transcriptome

The OME-Era

Proteome

Metabolome

- Entendimento da fisiologia e reproduo de microorganismos - Entendimento dos mecanismos de replicao, transcrio e traduo - Enzimas de restrio - Plasmdeos - Purificao de protenas e Enzimologia - Polymerase Chain Reaction (PCR) - Transcriptase reversa e RT-PCR - Sequenciamento - Fluorforos - Automao

Plasmdeos

Cromossomo bacteriano

Plasmdeos

DNA extracromossmico capaz de se replicar independentemente da replicao cromossomal - Resistncia a antibiticos - Produo de toxinas - Conjugao (transmisso de material gentico entre as bactrias) - Origem de replicao prpria

Transferncia horizontal de genes Conjugao

Transmisso de material gentico entre as bactrias

Transferncia de material gentico entre reinos Agrobacterium tumefaciens

Transformao
Competncia Habilidade de uma clula receber DNA extracelular vindo do meio ambiente. -Natural: Bactrias adquirem DNA do meio para nutrio, reproduo e reparo de seu DNA, atravs de mecanismo de transporte membranar. - Artificial: Uso de procedimentos de laboratrio que tornam as clulas passveis de serem transformadas.

Transduo

Fagos vrus que infectam bactrias

Enzimas de restrio (endonucleases)

Daniel Nathans, Werner Arber, Hamilton Smith - 1978

Sistema de modificao - restrio - Enzimas bacterianas que reconhecem e clivam DNA invasor - Reconhecimento de seqncia palindrmica de DNA exgeno - Seqncias bacterianas equivalentes so metiladas

Seqncia palindrmica

5'-GTATAC-3' |||||| 3'-CATATG-5'

Pontas coesivas Cohesive ends

Pontas cegas Blunt ends

Manipulao dos plasmdeos e a tecnologia do DNA recombinante

Stio de clonagem

Resistncia a antibiticos

Origem de replicao

Clonagem em vetores
-Plasmdeo digerido com enzimas -Gene especfico ligado no plasmdeo, replicado em diversas cpias

Transformao

Choque trmico Choque osmtico

Shuttle vectors
Plasmdeos que se propagam em duas espcies

-Transformao de plantas, leveduras, fungos filamentosos e clulas animais

Bacterifagos

Fagos como vetor

Vetores

Tamanho do inserto

Plasmdeos de alta cpia Bacterifago (insero) Bacteriophage (substituio) Cosmdeos Bacterifago P1 BAC (cromossomos artificiais de bactrias) YAC (cromossomos artificiais de leveduras)

010 kb 010 kb 923 kb 3044 kb 70100 kb at 300 kb 0.22.0 Mb

PCR - A REVOLUO DA TAQ

Kari Mullis 1985 Premio Nobel de qumica -1993

PCR 1

PCR 2

95C

Tm 72C

n Ciclos de PCR

PCR Otimizao da reao

- Concentrao dos reagentes Tris-HCl pH 8,8 (20 mM) KCl (10-50 mM) MgCl2 (1 a 4 mM) Menos Mg mais especificidade Glicerol (menos que 5%) dNTPs (200 a 10 M Menos dNTP - mais especificidade) Taq (1 unidade) -Condies dos ciclos Etapa de denaturao inicial (1-3 min a 95 C) Etapa de denaturao (30 seg a 2 min a 95 C) Etapa de anelamento Etapa de extenso (30 seg a 1min e 30 seg a 70-75 C) - Desenhos dos primers

Caractersticas desejveis em um Primer Temperatura de melting (Tm) na faixa de 50 C a 65 C. Tamanho de 15 a 28 pares de bases Ausncia da capacidade de dimerizao. Ausncia significativa da formao de grampos (>3 bp) Inexistncia de stios secundrios de anelamento dos primers. Temperaturas de anelamento de primers formando um par devem ser prximas

Comprimento - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores sero as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer no deve ser inferior a 15 bases para assegurar a unicidade. - A existncia desta faixa est baseada no fato de se buscar unique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.

Temperatura de Melting (TM) - a temperatura na qual metade das fitas de DNA est na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hlice. - Tm dependente da composio do DNA, de modo que aumento do contedo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior nmero de ligaes de H. Temperatura de Anelamento a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm . T anneal = Tm_primer 4 C

Estringncia no Anelamento do Primer - A estringncia determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado. - T anneal o fator mais significante que afeta a estringncia no anelamento do primer. -T anneal : Muito baixa = menor estringncia = primer pareia em qualquer lugar. muito alta = maior estringncia = primer pode no parear.

Estrutura interna do primer

- Evitar essas estruturas...

..Pode-se utilizar primers com estas estruturas se estas forem formadas a uma temperatura em torno de 30 C menor que a Tm

atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaa MIEALEAEVTRRTLEFDTCK gtcgtcgctctcccaatggtataa VVALPMV*

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

5- atgatagaggctctcgaagctgaggtgaccaggagaacgctcgagtttgacacgtgtaaagtcgtcgctctcccaatg 3- tactatctccgagagcttcgactccactggtcctcttgcgagctcaaactgtgcacatttcagcagcgagagggttac gtataa 3 catatt 5

5- atgatagaggctctcgaag 3 5- ttataccattgggagagcg 3

TRANSCRIPTASE REVERSA e A QUEBRA DO PARADIGMA

DNA

RNA

Protena

Quebra do paradigma

RT REVOLUTION

PRIMERS UTILIZADOS

Oligo(dT)15-25 -Somente mRNA Hexmeros randmicos - Anelamento em regies aleatrias Primer especfico do gene - Amplificao somente do gene alvo

Bibliotecas

Expressed Sequence Tags (ESTs)

Extrair RNA de diferentes tecidos/condies cDNA

5 EST

3 EST

Clonar em vetor

Bibliotecas

Full-Lenght cDNA

Controle

Northern Eletrnico Tratado

Extrao de RNA e sntese de cDNA

sequenciamento

sequenciamento
Sequncia consenso

clusterizao
tratado controle =

2x

Biblioteca subtrativa
RNA Pools Control Driver Treated Tester
1-cDNA synthesis 2-cDNA digestion with 4 cutter enzyme
Adaptors 3-Adaptor ligation to tester

sample

Driver

Driver and Tester

Tester
4-Tester/ driver hybridization 5-PCR with primers that anneal specifically to adaptor previously ligated to tester sample

No amplificated Eliminated

Linear Amplification Eliminated

Exponential Amplification Enriched Tester

6-Enrichment of cDNA library in genes preferentially expressed in tester sample

Fluorforos e molecular beacons

Cianinas
Emisso fluorescente - 570 nm (regio do verde do espectro de luz)

Emisso fluorescente - 670 nm (regio do verde do espectro de luz)

Emisso fluorescente - 522 nm (regio do verde do espectro de luz)

SYBR GREEN

molecular beacons

Loop complementar a seqncia alvo

PCR Quantidade X Qualidade

Anlise Qualitativa Visa detectar a presena ou no do gene Anlise Quantitativa Visa detectar a quantidade (expresso) do gene na amostra

Difcil diferenciar 10 cpias de 50 cpias em gel de agarose

Deteco do PCR tradicional

Deteco do Real Time PCR

SYBR green assay

SYBR se liga a DNA dupla fita e fluoresce. Durante o processo de amplificao, a fluorescncia vai aumentando, tornando mais fcil a quantificao de DNA

Taq Man
Sonda anela no gene alvo Polimerase desloca reprter liberao de fluorescncia verde

Polimerase desloca quencher

www.appliedbiosystems.com

Desenho de primers real time

Juno xon - ntron TTGTTCGAAGACTGGAAaCAACAGGTCGTCAGGCAGCAT AACGAGTACAGGGCCCGTTATGGTGCACCCAACCTGTCC TGGAGCGATGCTCTGTACCCGGATACTGCTCGATATGCC GGACAGTGCAAGTTCcAACACAGGTATGACACGTCGTTG GTTCGTCGACATGTAAGGGTACTGACGACACATTCAAAG CAACAGTGGCGGCAAGTACGGCGAAAACTTGGCTGCTG GTACTGGAAACGCCTATGGTTTCTCGAGCGGCTTGAAGT CGTGGATGGATGAAGCTTGTATGTCTAC

http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/primer_genscript.cgi

Clonagem de genomas
DNA genmico Quebrar em pedaos aleatrios ~2000pb (shotgun) reads clonar em vetor

sequenciamento

Reconstruo do DNA original a partir do fragmentos (clusterizao)

reads Sequncia consenso (DNA original)

A reconstruo feita a partir de sobreposio dos fragmentos

Shotgun de pedaos do genoma

DNA genmico Quebrar em pedaos aleatoriamente desde 50Kpb at 300Kpb

Clonar em BACs e sequenciar apenas as pontas de cada fragmento

~800 bp

~800 bp

Quebrar em pedaos de 2000pb

clonar em vetor e sequenciar os fragmentos

Primer Walking
Vector Clone to sequence

Primer

Sequence

New Primer

Sequence

Repeat

Sempre desenhar o primer de forma que a sequncia amplificada tenha sobreposio com a anterior (tipicamente 100 pb de sobreposio)

anelamento dos primers

denaturao

TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC

O programa PHRED l o chromatograma identificando e dando uma nota para cada base que forma a sequncia :
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...

- A identificao dos picos feita atravs de uma transformada de fourier do sinal - A nota ligada com a resoluo entre os picos vizinhos e a altura do background

Analisando o cromatograma Regio de qualidade alta

Picos bem definidos e grandes. Linha de base boa. Distncia entre picos anterior e posterior constante.

Regio de qualidade mdia poucas ambigidades

Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho mdio. Linha de base boa a razovel. Distncia entre picos anterior e posterior razovel.

Regio de qualidade baixa baixa confiabilidade

Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Linha de base confusa. Distncia entre picos anterior e posterior inconstante.

Pirosequenciamento
Roche (454) GS FLX sequencer

http://www.454.com/

Fita simples

Cmera de CCD

Reao de degradao

Shotgun do genoma inteiro

DNA genmico Quebrar em pedaos aleatrios ~2000pb (shotgun)

Ligao do adaptador e separao em fita simples

- O adaptador permite que o DNA se ligue em grnulos minsculos (dimetro de 28 mm). Apenas um DNA ligado em cada grnulo - Os grnulos so envolvidos em gotas de leo que contm todos os reagentes necessrios para amplificar o DNA - Cada gota contendo o grnulo mantida isolada para evitar contaminao e consegue produzir 10 milhes de cpias numa reao de pirosequenciamento - Um pmol de DNA numa reao de pirosequenciamento produz 1011 molculas de ATP gerando mais de 109 ftons, num comprimento de onda de 560 nm, e num perodo de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma cmera de CCD

O sequenciador 454

Cmara de fluxo contendo as amostras e as fibras pticas (1,6 milhes/slide) Cmera de CCD Bombeamento de fludos

Computador

Pirograma

Linearidade mantida at homopolmeros de 8 nt

Illumina/Solexa Genome Analyzer Sequenciamento por sntese + clustering PCR

http://www.illumina.com/

- O adaptador permite que o DNA se ligue a uma placa na superfcie dos canais de fluxo - PCR em fase slida permite que as molculas resultantes de uma PCR fiquem prximas. Ciclo repetido vrias vezes - Adio de polimerase, primers e de nucleotdeos, marcados por fluorforos, com o 3OH inativado adio de um nucleotdeo por vez. Aps incorporao, h a deteco do fluorforo, reverte-se a inativao do 3OH e e retira-se o fluorforo. Ciclo se repete.

Applied Biosystems SOLiDTM Sequencer

http://www.appliedbiosystems.com.br/site/abhome.jsp

- O adaptador ligado ao DNA e a grnulos magnticos. Ocorre PCR em emulso e as fitas de DNA so depositadas numa placa - Ligao de primer universal n ao adaptador e de ligos degenerados (7 bases) marcados contendo duas primeiras bases fixas. - Ocorre deteco do sinal, clivagem das duas ltimas bases e adio de novos ligos - Ao fim de n rounds, a fita resultante liberada e h a ligao de um novo primer universal, (agora n-1). Ciclo se repete mais trs vezes (at n-4).

Sanger vs Novas tecnologias

SANGER

Novas tecnologias No h clonagem Milhes de bp em menos de 4 horas Reads de 200 a 25 pb Fragmentos fita simples no permitem seqenciamento em ambas direes. Aplicao da tcnica de paired-end 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo

Depende de clonagem em bactria (2 semanas de trabalho) 1 milho de pb em 24 horas Reads de ~700 bp Clones de fita dupla permitem seqenciamento em ambas direes (facilita orientao e montagem) 6 meses de sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo

Concluso : a unio faz a fora

Novas Tecnologias 454

Sequencing chemistry Amplification approach Paired ends/separation Mb/run Time/run (paired ends) Read length Cost per run (total directa) Cost per Mb
Pyrosequencing

Solexa
Polymerase-based sequencingby-synthesis

SoliD
Ligation-based sequencing

Emulsion PCR Yes/3 kb 100 Mb 7h 250 bp $8439 $84.39

Bridge amplification Yes/200 bp 1300 Mb 4 days 3240 bp $8950 $5.97

Emulsion PCR Yes/3 kb 3000 Mb 5 days 35 bp $17 447 $5.81