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CAPÍTULO 5
5.1 - Introdução
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2) Métodos de difusão (em meio sólido) - O método de difusão em agar é uma prova
qualitativa adequada para estudar a sensibilidade das bactérias de crescimento rápido.
Não é adequada para as bactérias de crescimento lento e baterias anaeróbias nem para os
antibióticos que difundem com dificuldade. É uma técnica sensível e flexível no que diz
respeito às substâncias que podem ser estudadas. Permite classificar o microrganismo
em sensível, intermédio ou resistente a determinado conjunto de antibióticos.
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Figura 5.2.
Representação
esquemática da
determinação da
CMI de um
antibiótico pelo
método de
diluição em meio
líquido.
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Figura 5.3 –
Representação
esquemática da
determinação da CMI
de um antibiótico
para seis espécies
bacterianas (A, B, C,
D, E, F) pelo método
de diluição em meio
sólido.
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Nesta técnica, discos de papel impregnados com uma quantidade definida de antibiótico
são dispostos à superfície de um meio gelosado de Mueller-Hinton previamente
semeado com zaragatoa com uma suspensão de bactérias em fase exponencial de
crescimento. A partir do disco, o antibiótico difunde na gelose. Após a incubação do
meio de cultura 18 h a 37 ºC, verifica-se se existe inibição do crescimento bacteriano ao
redor dos discos. A sensibilidade ou a resistência de cada estirpe bacteriana é função do
diâmetro do halo de inibição do crescimento formado à volta dos discos de antibióticos.
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Figura 5.5 -
Relação entre
a CMI e os
diâmetros dos
halos de
inibição.
Hoje em dia, o método dos discos é o mais utilizado e o mais rigoroso se forem
respeitados três parâmetros:
1) Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar deve ter de espessura 4 mm e de diâmetro 9 cm. O pH deve
ser igual a 7.3. Geralmente usa-se o meio de Mueller-Hinton que apresenta as seguintes
vantagens:
• Não é antagonista dos principais agentes antibacterianos.
• Não é sujeito a grandes variações de pH.
• É aproximadamente isotónico com o sangue podendo ser adicionado de 5% de
sangue para bactérias mais exigentes.
2) Densidade do inóculo
O inoculo tem de ser estandardizado pois uma má estandardização deste leva a uma
grande variabilidade dos diâmetros das zonas de inibição.
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3) Concentração de antibiótico
A concentração de antibiótico deve ser sempre a mesma para que possam ser usadas as
tabelas de resultados. A conservação dos discos de antibiótico deve ser feita no
frigorífico e o seu controlo de qualidade deve ser realizado com estirpes padrão de E.
coli, S. aureus e P. aeruginosa.
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Meio de cultura
O meio de cultura a utilizar é o meio sólido de Mueller-Hinton. O pH do meio deve ser
entre 7.2 e 7.4, verificado sempre para cada lote do meio. Nas placas, o meio deve ter
uma superfície plana e uma altura uniforme de 4mm aproximadamente. As placas de
meio devem ser conservadas no frigorífico. Quando vão ser inoculadas as placas não
devem apresentar gotas de água à superfície do meio nem na tampa, para o que são
postas a secar na estufa a 35 - 37ºC, geralmente 15 a 30 minutos.
Preparação do inóculo
A partir de uma cultura pura do microrganismo em estudo, em fase exponencial de
crescimento, escolhem-se 4 ou 5 colónias isoladas, morfologicamente semelhantes com
que se prepara uma suspensão em 5 ml de caldo nutritivo. Incubar 2 a 4h a 35 - 37º C
até obter turvação compatível à unidade 0.5 da escala de McFarland. Diluir em seguida
com soro fisiológico do seguinte modo:
Staphylococcus - 1 : 2
Enterobacteriaceae - 1 : 5
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deles uma ligeira pressão para assegurar um perfeito contacto com o meio. Deixar pré-
difundir durante cerca de 15 minutos. Os discos devem ser colocados a mais de 15 mm
do bordo da placa e distanciados uns dos outros de modo a evitar sobreposição das
zonas de inibição. Colocar as placas a 37º C.
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Figura 5.6 -
Representaçã
o esquemática
da
determinação
da CMB de
um antibiótico
pelo método
de diluição
em meio
líquido.
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Antibióticos utilizados:
Escherichia coli:
AM (ampicilina), NET (netilmicina), NA (ácido nalidíxico), CXM (cefuroxima), AMX
(amoxicilina), NOR (norfloxacina), SXT (trimetroprim-sulfametoxazole), CPX
(ciprofloaxina), GM (gentamicina), F (nitrofurantoína).
Staphylococcus aureus:
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Pseudomonas aeruginosa:
TIC (ticarcilina), PIP (piperazina), IMI (imipenem), CAZ (cefatazidima), TBR
(tobramicina), GM, NET, CPX, OFX (ofloxacina)
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5.3.1 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para Escherichia coli e o
resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
AMC
NET
NA
CXM
AMX
NOR
SXT
CPX
F
GM
5.3.2 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para o Staphylococcus aureus
e o resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
VN
F
TRT
AMC
AMX
NET
E
GM
KN
P
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5.3.3 - Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para a Pseudomonas aeruginosa
e o resultado final (Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)
Diâmetro do halo de inibição
Antibióticos Sensível Intermédio Resistente
(mm)
TIC
IMI
CAZ
TBR
GM
NET
CL
CPX
PIP
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