INTRODUCCION

La palabra cromatografa significa grfica de colores y fue diseada por Michael Tswett en el 1903. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas verdes y luego pas este extracto a travs de un tubo de vidrio empacado con carbonato de calcio; de esta forma logr separar los pigmentos presentes en las hojas. Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas utilizadas en la determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin de componentes de las mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta tcnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigacin como a nivel industrial. Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el mismo principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria y una fase mvil.

CROMATOGRAFIA
El termino cromatografa hace referencia a la escritura en colores, los cuales provienen de los diferentes elementos qumicos que son estudiados. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin

de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis). Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas.

Clasificacin

Las distintas tcnicas cromatogrficas se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:

Cromatografa de lquidos Cromatografa de gases Cromatografa de fluidos supercrticos La cromatografa de gases es til para gases o para compuestos relativamente voltiles, lo

que incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de "derivatizacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de anlisis. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.

Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina Cromatografa de gases Cromatografa lquida

Lquido Lquido Gas Lquido

Lquido ( molculas de agua contenidas en la celulosa del papel ) Slido Slido o lquido Slido o lquido

en fase inversa Cromatografa lquida en fase normal Cromatografa lquida de intercambio inico Cromatografa lquida de exclusin Cromatografa lquida de adsorcin Cromatografa de fluidos supercrticos

(polar) Lquido (menos polar) Lquido (polar) Lquido Lquido Lquido

(menos polar) Slido o lquido (polar) Slido Slido Slido Slido

Trminos empleados en cromatografa

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa. Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra. Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partculas de soporte o a las paredes internas de la columa.

Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por ejemplo, un

cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.

Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes que se van a

separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se mueve en una direccin definida.

Efluente es la fase mvil que atraviesa la columna. Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder de dilucin. Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre partculas de soporte,

o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase reversa para compuestos fenlicos

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un lquido

(cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa.

Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso

posterior, ms que para anlisis.

Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular en pasar a

travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Vase tambin: ndice de retencin de Kovats

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede consistir en un

simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separacin no resulta de inters es llamada residuo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase lquidamvil

en cromatografa de lquidos.

Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en el procedimiento de la

cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografa en capa fina.

DETECTORES
Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatgrafo. El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.

Clasificacin de los detectores

Detectores segn su Grado de Selectividad : Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l. Especficos Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mnimo de respuesta a otras.

Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificacin, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruida o no.

Detectores segn su Modo de Respuesta: Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin. Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l.

Detectores segn el proceso de deteccin: Ionizacin, ptico-espectroscpico, Electroqumico, etc.

 Caractersticas de los Detectores: Los detectores pueden ser clasificados segn:

Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible.

Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la curva de linealidad: El lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y, El lmite Superior, definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un 5% de desviacin.

Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante. Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal.

Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido.

Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.

Tipos de Detectores: Segn el proceso de deteccin pueden ser: Conductividad Trmica (TCD) Ionizacin de Llama (FID) Captura Electrnica (ECD) Ionizacin de Llama Alcalina (NPD) Fotomtrico de Llama (FPD) Emisin Atmica (AED) Espectrmetro de Masas Termoinico (TID) Detector de Fotoionizacin

Quimioluminiscencia de Azufre (SCD) Espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier Conductividad Electroltica (DELCD) Combustin Cataltica (CCD) Ionizacin del Helio (HID)

CROMATOGRAFIA DE GASES
La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC), y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). CROMATOGRAFIA DE GAS-SOLIDO: En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. CROMATOGRAFIA DE GAS-LIQUIDO: En la GLC, la fase estacionaria es lquida, y los analitos se separan mediante reparto. En ambas tcnicas, el desplazamiento de la fase mvil, se realiza mediante presin constante gracias al Regulador de Presin. La muestra se inyecta por medio de una jeringa en una cmara de vaporizacin, lugar donde se vaporiza; para despus ser arrastrada hacia la columna por medio de un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la columna. Una vez ocurrido este proceso, en donde la fase mvil pasa por la fase estacionaria, los resultados llegan al detector, que se hacen visibles en el ordenador. En la cromatografa de gases se usa como fase estacionaria un compuesto orgnico polimrico de baja volatilidad, estable trmicamente y con adecuadas caractersticas de disolvente. Es preciso sealar que deben usarse fases estacionarias, similares funcionalmente al compuesto a analizar. Componentes bsicos de un Cromatgrafo Gas - Lquido: De forma muy esquemtica podemos resumirlos en: 1. Gas portador 2. Sistema de Inyeccin de muestra 3. Columna 4. Detector 5. Registrador

1. Gas portador El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: -Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) -Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa -Fcilmente disponible y puro -Econmico -Adecuado al detector a utilizar El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno, hidrgeno o dixido de carbono, y la eleccin de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrgeno y del hidrgeno. Luego tenemos un sistema de manmetros y reguladores de flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratacin del gas, como puede ser un tamiz molecular. Generalmente la regulacin de la presin se hace a dos niveles: un primer manmetro se sita a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatgrafo, donde se regula el flujo. Las presiones de entrada varan entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para comprobar el

caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de pompas de jabn, el cual da una medida muy exacta del caudal volumtrico que entra a la columna. La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores es de cir 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la fase activa de la columna, se hace completamente necesario la instalacin de trampas a la entrada del Gas carrier, estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, pero son importantsimas al momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de Hidrocarburos, agua, CO entre otros.

2. Sistema de inyeccin de muestra

La inyeccin de muestra es un apartado crtico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapn de vapor") que sea rpida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El mtodo ms utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para introducir el analito en una cmara de vaporizacin instantnea. Esta cmara est a 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil, y est sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.

Inyector de muestra para un GC

3. Columnas y sistemas de control de temperatura En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o capilares. Estas ltimas son ms comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 60 metros, y estn construidas en acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno. La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullicin del analito o analitos, como tambin la mxima temperatura de funcionamiento de la columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de elucin va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada rampa de temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elucin ya que aunque a mayor temperatura la elucin es ms rpida, se corre el riesgo de descomponer el analito. 4. Detector El detector es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el analito por el final de la columna. Las caractersticas de un detector ideal son:

Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cundo sale analito y cuando sale slo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y 10-15 g/s de analito.

Respuesta lineal al analito con un rango de varios rdenes de magnitud. Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida. Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente hasta unos 350-400 C, temperaturas tpicas trabajo.

Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas de seal iguales.

Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos. Respuesta semejante para todos los analitos, o Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido nmero de analitos.

Detector de ionizacin de llama (FID)

En cromatografa de gases, el detector de ionizacin de llama (FID) es uno de los detectores ms extensamente utilizado y, por lo general, uno de los ms aplicables. En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrgeno y con aire para luego encenderse elctricamente. La mayora de los compuestos orgnicos, cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrgeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a travs de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios, y para la medicin de la corriente que resulta (de unos 10-12A) se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia. La ionizacin en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso bien establecido, aunque se observa que el nmero de iones que se produce es aproximadamente igual al de tomos de carbono transformados en la llama. El detector de ionizacin de llama debido a que es un detector que responde al nmero de tomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, es un detector sensible a la masa, ms que un sistema sensible a la concentracin. En consecuencia, este detector tiene la ventaja de que los cambios en el caudal de la fase mvil tienen poco efecto sobre la respuesta del detector. Grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halgeno y amina, originan en la llama pocos iones o prcticamente ninguno. Adems, el detector es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2, y NOx. Esas propiedades hacen del detector de ionizacin de llama uno de los detectores generales ms utilizado para el anlisis de la mayora de compuestos orgnicos, incluyendo aquellos que estn contaminados con agua y con xidos de nitrgeno y de azufre. El detector de ionizacin de llama posee una elevada sensibilidad (del orden de 10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (de 107), y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fcil de utilizar. Una desventaja del detector de ionizacin de llama es que se trata de un detector destructivo de la muestra.

Detector de conductividad trmica (TCD)

Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografa de gases, y uno de los que todava tiene una gran aplicacin, se basa en los cambios en la conductividad trmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las molculas de analito. Este dispositivo se denomina a veces un catarmetro. El sensor de un catarmetro consiste en un elemento calentado elctricamente cuya temperatura, a una potencia elctrica constante, depende de la conductividad trmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambin, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad trmica del gas. Para la configuracin de los componentes del detector se emplean dos pares de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna, y el otro en la corriente de gas previo a la cmara de inyeccin de la muestra. Alternativamente, la corriente de gas se puede dividir en dos corrientes una de las cuales atraviesa el inyector y la otra no. En cualquier caso, el efecto de la conductividad trmica del gas portador se compensa, y se minimizan los efectos de la variacin de caudal, presin y potencia elctrica. Las resistencias de los pares de detectores gemelos se comparan entre s, incorporndolos en un circuito sencillo de puente de Wheatstone. Las conductividades trmicas del helio y del hidrgeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayora de los compuestos orgnicos, de modo que, incluso en presencia de pequeas cantidades de materia orgnica, tiene lugar una disminucin relativamente grande de la conductividad trmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son ms parecidas a las de los constituyentes orgnicos y por esta razn con un detector de conductividad trmica debe usarse hidrgeno o helio como gas portador. Las ventajas del detector de conductividad trmica son su simplicidad, su amplio rango dinmico lineal (aproximadamente 105), su respuesta universal tanto a especies orgnicas como a inorgnicas, y su carcter no destructivo, lo que permite recoger los solutos tras la deteccin. Una limitacin del catarmetro es su sensibilidad relativamente baja (aproximadamente 10-8 g de soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 104 a 107 veces ms sensibles. Debera subrayarse que la baja sensibilidad de los detectores de conductividad trmica, hace imposible con frecuencia su utilizacin con columnas capilares, debido al pequeo tamao de muestra con el que estas columnas operan.

Detector termoinico de llama (FTD)

El detector termoinico (FTD) es un detector selectivo de los compuestos orgnicos que contienen fsforo y nitrgeno. Su respuesta a un tomo de fsforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un tomo de nitrgeno, y de 104 a 106 veces superior que a un tomo de carbono. En comparacin con el detector de ionizacin de llama, el detector termoinico es unas 500 veces ms sensible para los compuestos que contienen fsforo y unas 50 veces ms sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades hacen de la deteccin termoinica un sistema particularmente til para la deteccin y determinacin de muchos pesticidas que contienen fsforo. Un detector termoinico tiene una configuracin similar al detector de llama. El efluente de la columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de la llama, y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de slicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800C. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan inslitamente una gran cantidad de iones a partir de las molculas que contienen fsforo o nitrgeno, realmente no est bien establecido, pero el resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinacin de compuestos que contienen esos dos elementos.

Detector de captura de electrones (ECD)

El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiacin X. En este caso el efluente de la columna pasa sobre un emisor , como nquel-63 o tritio (adsorbido sobre una lmina de platino o de titanio). Un electrn del emisor provoca la ionizacin del gas portador (con frecuencia se trata de nitrgeno) y la produccin de una rfaga de electrones. De este proceso de ionizacin, en ausencia de especies orgnicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de molculas orgnicas que tiendan a capturar los electrones. La respuesta es poco lineal, a no ser que el potencial a travs del detector se aplique en forma de impulsos. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las molculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halgenos, perxidos, quinonas, y grupos nitro; en cambio, no es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e

hidrocarburos. Una aplicacin importante del detector de captura de electrones es la deteccin y determinacin de insecticidas clorados. Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del detector de llama). Por otra parte, su intervalo lineal de respuesta normalmente se limita a unos dos rdenes de magnitud.

Detector de emisin atmica (AED)

El detector ms reciente, y ya disponible en el comercio, para cromatografa de gases, se basa en la emisin atmica. En este dispositivo, el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un espectrmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente energtico como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y as obtener sus espectros de emisin caractersticos. Esos espectros son recogidos en un espectrmetro que utiliza una serie de diodos configurados en un plano mvil, que es capaz de detectar la radiacin emitida desde 170 a 780 nm. La serie de diodos movible es capaz de controlar simultneamente de dos a cuatro elementos en cada posicin. Hasta el momento, el programa de tratamiento de datos suministrado con el detector permite medir la concentracin de 15 elementos. Presumiblemente, un futuro software permitir tambin la deteccin de otros elementos.

Otros tipos de detectores

Un espectrmetro de masas unido directamente al cromatgrafo es otro medio de llevar a cabo la deteccin de los compuestos separados cromatogrficamente. El espectrmetro de masas es un instrumento que permite analizar con una gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos e istopos atmicos, separando los ncleos atmicos en funcin de su relacin masa-carga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos qumicos que forman un compuesto o determinar el contenido isotpico de diferentes elementos en un mismo compuesto. El espectrmetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes tomos. El haz de iones produce un patrn especfico en el detector que permite analizar el compuesto qumico. En trminos generales, molculas diversas tienen masas diversas, hecho utilizado por un espectrmetro de masas para determinar qu molculas estn presentes en una muestra Se vaporiza una muestra obteniendo iones que poseen pesos moleculares especficos y una carga y debido a ella tendrn movimiento bajo influencia de un determinado campo elctrico. Los iones se envan al compartimiento de aceleracin donde pasan a travs de una lmina metlica. Despus se aplica un campo magntico a un lado del compartimiento que atrae a cada uno de los iones con la misma fuerza (suponiendo que tengan carga idntica) y se los desva sobre el detector. Los iones ms ligeros se desviarn ms que los iones pesados porque la fuerza aplicada a cada ion es igual pero los iones ligeros tienen menos masa y se desviaran ms. El detector mide exactamente cunto de lejos se ha desviado cada ion y, a partir de ese, dato se calcula el "cociente masa por unidad de carga". Con esta informacin es posible determinar con un alto nivel de certeza cul es la composicin qumica de la muestra original. El detector registra la carga inducida o la corriente producida cuando un ion pasa cerca o golpea una superficie. En un instrumento de exploracin la seal es producida en el detector durante la trayectoria de la misma (en qu m/z) y producir un espectro de masa, un expediente del m/z's en el cual los iones estn presentes. Tpicamente, se utiliza un cierto tipo de multiplicador de electrones (electromultiplicador). Actualmente, el elemento de deteccin por excelencia es el ya nombrado electromultiplicador. Su funcionamiento se basa en el efecto cascada producido al impactar un determinado ion (o iones) en el mismo. Aplicando una diferencia de potencial entre sus extremos, se consigue el aumentar el factor de amplificacin, que vendr determinado por el nmero de subetapas amplificadoras que componen el detector. Normalmente es un componente sometido a desgaste que ha de reemplazarse con el tiempo al perder eficiencia de amplificacin.

Detector fotomtrico de llama

Se ha utilizado extensamente para el anlisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fsforo. En este detector, el eluyente se hace pasar a travs de una llama hidrgeno/aire a baja temperatura, la cual convierte parte del fsforo a una especie HPO que emite bandas de radiacin centradas alrededor de 510 y 526 nm. El azufre de la muestra se convierte simultneamente en S2, el cual emite una banda centrada en 394 nm. Para aislar esas bandas se emplean los filtros adecuados, y sus intensidades se registran fotomtricamente. Con la fotometra de llama se han detectado otros elementos entre los que se incluyen los halgenos, nitrgeno y diversos metales, como el estao, cromo, selenio y germanio.

Detector de fotoionizacin
El eluyente de la columna se irradia con un haz intenso de radiacin ultravioleta de energa variable desde 8.3 a 11.7 eV ( = 149 a 106 nm), la cual provoca la ionizacin de las molculas. Al aplicar un potencial a travs de una celda que contiene los iones producidos, se origina una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.

Detector de Quimioluminiscencia
Recientemente se ha incorporado a la gama disponible de detectores para cromatografa de gases el detector de quimioluminiscencia. La quimioluminiscencia se define como la emisin de radiacin lectromagntica (normalmente en le regin del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reaccin qumica. Como la intensidad de emisin es funcin de la concentracin de las especies qumicas implicadas en la reaccin quimioluminiscencia, las medidas de la intensidad de emisin pueden emplearse con fines analticos. Algunas limitaciones en el anlisis por quimioluminiscencia, como la dependencia de la emisin de varios factores ambientales que deben ser controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no se limita a un nico analito, y finalmente, como ocurre en otros sistemasde deteccin en flujo, la emisin quimioluminiscente no es constante sino que vara con el tiempo (el flash de luz est compuesto de una seal que se produce tras la mezcla de los reactivos, alcanzando un mximo y despus cae hasta la lnea base), y este perfil de emisin frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminscentes, por lo que hay que extremar el cuidado para detectar la seal en sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiempo bien definidos. En quimioluminiscencia, la emisin de luz es causada por los productos de una reaccin especfica qumica, se basa en la reaccin entre ciertos compuestos azufrados y el ozono. La intensidad de fluorescencia resultante es proporcional a la concentracin de azufre. Este detector ha

demostrado ser especialmente til en la deteccin de contaminantes como los mercaptanos. En el detector de quimioluminiscencia del azufre el eluyente se mezcla con hidrgeno y aire y se produce la combustin como en el detector de ionizacin de llama. Los gases as obtenidos se mezclan con el ozono, y se mide la intensidad de emisin resultante. El analizador de azufre utiliza un quemador dual para lograr la combustin a alta temperatura de los compuestos que contienen azufre para formar monxido de azufre (SO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reaccin de quimioluminiscencia del SO con el ozono. Esto resulta en una respuesta lineal y equimolar sin interferencia de las matrices de muestra. El detector de quimioluminiscencia del azufre tambin se ha adaptado para la cromatografa de fluidos supercrticos. Por su parte el detector de quimioluminiscencia de nitrgeno, produce una respuesta lineal y equimolar a los compuestos de nitrgeno. Esto se logra por medio de un quemador de acero inoxidable que permite una alta temperatura de combustin para pasar compuestos que contienen nitrgeno a xido ntrico (NO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reaccin subsecuente de quimioluminiscencia del NO con el ozono.

Aplicaciones de la cromatografa gas-lquido

Para evaluar la importancia de la GLC, es necesario distinguir entre los dos papeles que desempea la tcnica. El primero como herramienta para realizar separaciones; en este sentido, resulta inmejorable cuando se aplica a muestras orgnicas complejas, a organometlicos y a sistemas bioqumicos. El segundo, una funcin claramente distinta, es el de proporcionar un medio para llevar a cabo un anlisis. En este caso se emplean los tiempos o volmenes de retencin para la identificacin cualitativa, mientras que las alturas de los picos o sus reas dan informacin cuantitativa. Con fines cualitativos, la GLC es una tcnica mucho ms limitada que otros mtodos. En consecuencia, una tendencia importante en este campo ha consistido en la combinacin de las notables cualidades para el fraccionamiento que tiene la GLC con las mejores propiedades para la identificacin que tienen algunos instrumentos como los espectrmetros de masas, infrarrojo y NMR

1. Anlisis cualitativo: Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio de pureza de compuestos orgnicos. Los contaminantes, si estn presentes, se manifiestan por la aparicin de picos adicionales; las reas de estos picos proporcionan una estimacin aproximada del grado de contaminacin. La tcnica tambin es til para evaluar la efectividad de los procedimientos de purificacin. En teora, los tiempos de retencin deberan servir para la identificacin de los componentes de una mezcla. Sin embargo, la aplicabilidad de tales datos est limitada por el nmero de variables que han de controlarse para obtener resultados reproducibles. No obstante, la cromatografla de gases es un medio excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrn. Tras la adicin del compuesto conocido a la muestra, el cromatograma no debe presentar ningn pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos existentes. La prueba es particularmente convincente si el resultado se repite con columnas diferentes y a distintas temperaturas. 1.1. Factores de selectividad Si se elige una sustancia patrn B, entonces el factor de selectividad puede proporcionar un ndice para la identificacin del compuesto A, el cual es en gran parte independiente de las variables de la columna excepto la temperatura; esto es, pueden obtenerse tablas numricas de factores de selectividad para compuestos puros relativos a un estndar comn, y entonces utilizarse para la caracterizacin de solutos. Desafortunadamente, no es posible encontrar un patrn universal que permita obtener factores de selectividad de una magnitud razonable para todos los tipos de analitos. As, el conjunto de factores de selectividad disponibles actualmente en la literatura es limitado. 1.2. ndice de retencin El ndice de retencin I fue propuesto por primera vez por Kovats en 1958 como un parmetro para identificar solutos a partir de los cromatogramas. El ndice de retencin para un soluto dado puede deducirse del cromatograma de una mezcla del soluto y de al menos dos alcanos normales (de cadena lineal) que tengan unos tiempos de retencin tales, que el del soluto considerado quede entre los mismos. Esto es, los alcanos normales son los patrones en los que se basa la escala de ndices de retencin. Por definicin, el ndice de retencin para un alcano normal es igual a 100 veces el nmero de carbonos del compuesto sin considerar el relleno de la columna, la temperatura u otras condiciones cromatogrficas. El ndice de retencin para todos aquellos compuestos que no sean alcanos normales vara, a menudo varios cientos de unidades de ndice de retencin, con las variables de la columna. Es bien conocido que en una serie homloga al representar el logaritmo del tiempo de retencin ajustado frente al nmero de tomos de carbono se obtiene una grfica lineal. Los ndices de retencin de un compuesto se deducen por interpolacin a partir de un cromatograma de una mezcla del soluto de inters y dos o ms alcanos patrn. Es importante subrayar que el ndice de retencin para un alcano normal es independiente de la temperatura y del relleno de la columna. As, I para el heptano, por definicin, siempre es 700. Por el contrario, los ndices de retencin de los dems solutos con frecuencia pueden variar considerablemente de una columna a otra. Por ejemplo, el ndice de retencin del acenafteno en una fase estacionaria de polidimetilsiloxano polimerizado, a 140 C es 1460. Con 5% fenilpolidimetilsiloxano como fase estacionaria, a la misma temperatura resulta ser 1500, mientras que con polietilenglicol como fase estacionaria, el ndice de retencin es 2084.

El sistema de ndices de retencin tiene la ventaja de basarse en materiales de referencia disponibles fcilmente que cubren un amplio intervalo de puntos de ebullicin. Adems, la dependencia de los ndices de retencin con la temperatura es relativamente pequea. 2. Anlisis cuantitativo La seal del detector de una columna cromatogrfica gas-lquido se ha utilizado generalmente para anlisis cuantitativos y semicuantitativos. En condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa) del 1 %. Como con la mayora de los instrumentos analticos, la fiabilidad se relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud tambin depende en parte de la naturaleza de la muestra. La discusin general del anlisis cuantitativo cromatogrfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la cromatografia de gases como a otros tipos; por esta razn no se hacen aqu ms consideraciones sobre este aspecto.

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS
INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografia de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografia. La Figura adjunta muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Fig.1-Esquema de un aparato de HPLC

1. Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 1, sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin. Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. La Figura 2 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elucin isocrtica con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elucin con gradiente, que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentracin de metanol un 8%/min. Obsrvese que la elucin con gradiente acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la resolucin de los primeros picos. Ntese tambin que la elucin con gradiente produce unos efectos similares a los producidos por la programacin de temperatura en cromatografa de gases.

2. Sistemas de bombeo Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio.

Fig.2-Mejora de la eficiencia de la separacin mediante la elucin con gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotmetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60C, presin 80 kg/cm2. (a) elucin con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporcin de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) Elucin isocrtica con metanol 50% / agua 50%

2.1. Tipos de bombas Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia

dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente. 2.2. Amortiguadores de pulsos Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presin del sistema. 2.3. Control del caudal y sistemas de programacin Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada. 3. Sistemas de inyeccin de muestra A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 3. Estos dispositivos estn

normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 L.

Fig.3-Bucle de muestra para cromatografa de lquidos. 4. Columnas para cromatografa de lquidos Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas. 4.1. Columnas analticas La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.

4.2. Precolumnas En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. 4.3. Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante. 4.4. Tipos de rellenos de la columna En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas. Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes. Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.

5. Detectores A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda. Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil. En la Tabla adjunta se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tena un papel importante la cromatografia de lquidos, revel que el 71 % se utilizaban en la deteccin de la absorcin UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el ndice de refraccin, el 4,3% empleaba medidas electroqumicas y el 4,3% restante otras medidas.

5.1. Detectores de absorbancia La Figura 4 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.

Caractersticas de los detectores de HPLC

Figura 4-Celda de detector ultravioleta en HPLC

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos contrastados. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores de absorcin UV

ms simples son los fotmetros de filtros con una lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de esas longitudes de onda. Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores. La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan a la radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de longitud de onda que interesa. Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes son los instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la

columna. Una de las formas de presentacin de los datos espectrales, que resulta til para la identificacin de las especies y para elegir las condiciones de la determinacin cuantitativa, consiste en un grfico tridimensional tal como el que se muestra en la Figura 6. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparicin y desaparicin de cada uno de los esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

Figura 5-Espectros de absorcin del efluente de una columna de HPLC tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se ofrecen dos tipos de

detectores de infrarrojo. El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semicirculares. El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier. Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera anloga a los instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta que se han descrito en la seccin anterior. Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.

5.2. Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de lser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad. Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.

5.3. Detectores de ndice de refraccin Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de llama en cromatografia de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente.

5.4. Detector de dispersin de luz Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el detector de dispersin de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los solutos no voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el detector de ndice de refraccin.

5.5. Detectores electroqumicos Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la conductimetra.