Anlisis Instrumental

Tema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.

Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.

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Tema 6: Espectroscopa de dispersin Raman. Turbidimetra y Nefelometra.

Espectroscopa de dispersin Raman Dispersin Raman (fenmeno y tcnica espectroscpica). El Espectrofotmetro Raman. Comparacin con la Espectroscopia IR Turbidimetra y nefelometra Dispersin de Tyndall(fenmeno y tcnica no espectroscpica). Instrumentacin de la turbidimetra y nefelometra. Aplicaciones.

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Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin

Dispersin Rayleigh Dispersin Raman Dispersin Tyndall

Choques elsticos con molculas o partculas de tamao atmico

Choques inelsticos con molculas

Espectroscopa Raman Turbidimetra y nefelometra

Choques elsticos con macromolculas o partculas coloidales

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Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin

La dispersin de radiacin tiene lugar cuando un haz de radiacin incidente UVvisible choca con partculas atmicas, moleculares o coloidales. Se observa que una pequea fraccin de la radiacin se difunde a partir del haz en todas las direcciones.

Radiacin incidente Radiacin transmitida Radiacin dispersada

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Tema 6: Fundamento de los tipos de Dispersin
Los fotones de un rayo de luz monocromatico de la regin vis- IR cercano pueden experimentar el fenmeno de una dispersin debido a: 1) Colisiones elsticas en algunas regiones de la molecula: es la dispersin Rayleigh (tamao de partcula pequeo) o dispersin Tyndall (tamao de partcula grande), que ocurre sin prcticamente prdida de energa. 2) Colisiones inelsticas (donde una parte de la energa del fotn se absorbe y el resto se dispersa: dispersin Raman), que inducen vibraciones moleculares cuantizadas segn los modos normales de vibracin posible en la molcula. Se pueden dar dos casos: Raman Stokes y Raman AntiStokes. Stokes: 0 < F o o Anti-Stokes: 0 > F

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Tema 6: Dispersin Raman.

ESPECTROSCOPIA RAMAN
La tcnica analtica espectroscopia Raman se basa en un fenmeno especfico de dispersin de la luz que presenta alguna similitud y recuerda a la fluorescencia. En Espectroscopa Raman, las vibraciones moleculares se miden en forma de emisin de energa luminosa (radiacin Raman dispersada ) como consecuencia de la excitacin con una fuente monocromtica de luz visible generalmente del rojo o IRC ( la intensidad de luz dispersada es slo de 10-5 a 10-6 de la incidente). Para evitar la aparicin de emisiones de fluorescencia, el haz excitante es de la zona del rojo (600-1000 nm), donde la energa del fotn es insuficiente para activar la molcula al nivel electrnico excitado y desencadenar fluorescencia. Se evitar as un elevado fondo que podra suponer una fluorescencia simultnea.

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Tema 6: Dispersin Raman.

El haz excitador debe ser:

a) de elevada intensidad b) altamente monocromtico c) De elevada (zona visible)

Las fuentes lser de luz roja o similar cumplen estos requisitos, por lo que son las usadas habitualmente en esta tcnica analtica espectrocpica.

En los espectros Raman se representa la diferencia en cm-1 de la radiacin dispersada con respecto a la radiacin original. Este desplazamiento en energa de las emisiones Raman de una molcula con respecto a la energa asociada la longitud de onda incidente es una importante arma analtica complementaria en cuanto a aplicaciones a la espectroscopia de absorcin infrarroja.

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Tema 6: Dispersin Raman.
Dispersin Rayleigh Choque elstico

ho

S0
Raman Stokes (o>f) Choque inelstico

S0

ho

S0
Raman Anti-Stokes (o<f) Choque inelstico

S0

ho

S0

S0

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Tema 6: Dispersin Raman.
Como regla, la dispersin Raman de la luz es solo observada para un ngulo de 90 y se usan principalmente las lneas Raman Stokes que son ms intensas y contienen toda la informacin de la molcula.

Rayleigh

S0
Las diferencias de energa entre la Incidente y las Stokes se corresponden con las energas necesarias para producir transiciones vibracionales. Por lo tanto, midiendo dicha diferencia de energa es posible obtener informacin sobre estas transiciones (es decir, sobre la estructura).

Intensidad

Stokes

Anti-Stokes

Incidente

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Tema 6: Dispersin Raman.

Espectroscopa Raman

Radiacin

Se reemite sin intercambio de E Induce vibraciones, reemite a menor E Toma E de molculas vibrando

Complementa a IR

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Tema 6: Dispersin Raman.

Si se representa la intensidad de radiacin dispersada en funcin de su , el espectro obtenido depende de la incidente

fuente = 532 nm

fuente = 785 nm

Intensidad

Intensidad

= 576 nm

= 885 nm

A) Espectro Raman con una fuente de excitacin de 532 nm

B) Espectro Raman con una fuente de excitacin de 785 nm

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Tema 6: Dispersin Raman.

pero si se trabaja en nmero de ondas en unidades relativas (asignando a la radiacin incidente un valor de 0), el espectro es independiente de la fuente empleada. A
N ondas absolutas 18797 cm-1 17355 cm-1 532 nm 576 nm

B
N ondas absolutas

785 nm

885 nm

12739 cm-1

11297 cm-1

N ondas relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

N ondas relativas 0 cm-1 -1142 cm-1

1142 cm-1

Intensidad

relativas

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Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.

El ESPECTROFOTMETRO RAMAN
Espejo concentrador Radiacin incidente Radiacin dispersada

Fuente Laser Filtro bloqueante

Muestra
Radiacin transmitida

Monocromador

Detector

Fuente Debe proporcionar una radiacin de monocromtica intensa con visible/IR cercano. Hoy da, los lser se usan para esto (haz de luz muy estrecho e intenso que puede ser focalizado perfectamente hacia la muestra). Una lnea de un plasma gaseoso productor de radiacin lser (lser inico de Ar o Kr) es enfocada en la muestra.

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Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.

Raman-FT

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Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.

Compartimento de muestra Las muestras pueden ser dispuestas en tubos de punto de fusin cuando se trata de slidos en polvo, lquidos puros o disoluciones, y para gases en cubetas de mltiples reflexiones. Se requiere un sistema de enfriamiento efectivo para sustancias termosensibles o que pueden experimentar degradacin fotoltica, por eso las medidas se hacen mientras la muestra est rotando. Filtro bloqueante Para eliminar la dispersin Rayleigh proveniente de la fuente laser. Monocromador (tambin existen espectrmetros Raman-FT) Debido a la dbil intensidad de la radiacin de dispersin Raman y la necesidad de separar sta de la radiacin Raleigh, el monocromador equipado debe ser de alta calidad ptica. Con el monocromador de rejilla de difraccin hologrfica se alcanza una muy buena resolucin.

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Tema 6: Espectrofotmetro de Raman.

Detector En el fotomultiplicador los fotones, que corresponden a la regin visible/IR cercano pero cuyos desplazamientos de con respecto a la incidente se dan en una extensin de la zona IR medio, producen una corriente fotoelctrica. A pesar de que la intensidad de la luz Raman producida es muy pequea, el detector fotomultiplicador es muchsimo ms sensible que los detectores para absorcin de IR constituidos por termoelementos. La posibilidad de usar tubos fotomultiplicadores, junto con que los picos son muy estrechos y con poco fondo, hace que la espectroscopia Raman d mejores resultados que la IR en anlisis cuantitativos.
Ir = k P0 b C = K C

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Tema 6: Comparacin de la Espectroscopa Raman con la Espectroscopa IR.

COMPARACIN CON LA ESPECTROSCOPIA IR Y APLICACIONES

La base de espectrocopa IR es la absorcin de la energa de fotones (hv) para la excitacin de vibraciones moleculares. Los espectros Raman e IR no coinciden en cuanto a las bandas que aparecen, si bien pueden tener algunas bandas en comn. En Raman se obtienen espectros algo ms simples, pues los sobretonos o picos de combinacin suelen ser muy poco intensos. - La espectroscopa Raman puede ser usada para identificar molculas inactivas al IR por tener una total simetra, o en las que abundan grupos simtricos o grupos poco polares. El IR va mejor para investigar molculas poco simtricas y con grupos muy polares. - En Raman se puede usar el agua como disolvente y cubetas de vidrio. -La ventaja fundamental de la espectroscopia Raman respecto al IR es su mejor aptitud para realizar anlisis cuantitativos (mayor linealidad y sensibilidad), no obstante el anlisis de estructura de compuestos orgnicos sigue siendo una aplicacin destacada. -Se hacen anlisis de muestras artsticas tales como pinturas para identificar los pigmentos (tcnica no destructiva)

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra

TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) de radiacin de la zona visible, atraviesa y golpea una suspensin de partculas coloidales (muestra turbia en una cubeta) ocurre lo siguiente: una parte de la luz es reflejada (a) hacia atrs una parte es diseminada en todas direcciones (dispersin Tyndall) (b) parte es absorbida (c) parte es transmitida (d) Generalmente la suma de c y d es la mayor fraccin. Como consecuencia (a) y (b) es una medida indirecta de la turbidez y dicha fraccin de luz dispersada se puede usar para el anlisis cuantitativo de disoluciones o suspensiones coloidales, emulsiones, humos o nieblas (soluciones no homogneas)

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra
Ambas tcnicas sirven para medir la dispersin Tyndall de suspensiones slidas en un lquido (Propiedad no espectroscopica) La turbidez y la luz que ella dispersa se puede medir: 1) directamente por la intensidad de luz desviada a, normalmente, un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente (nefelometra). 2) indirectamente como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin (turbidimetra).

Radiacin incidente Radiacin transmitida Radiacin dispersada

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra

La turbidimetra y la nefelometra son dos tcnicas complementarias para medir turbidez pero que emplean distintos instrumentos (similares respectivamente a un fotmetro y a un flurmetro). En principio cualquier materia en suspensin, analito que d una reaccin de precipitacin (precipitacin inducida), o muestra con microorganismos se puede cuantificar por su turbidez natural u originada. En las reacciones de precipitacin inducida se deben formar partculas muy finas, de tamao reproducible y que permanezcan en suspensin sin coagular. Si no se da este ltimo caso, se aade un coloide protector (como gelatina o glicerina) o un agente tensioactivo.

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra

-La intensidad de luz dispersada depende de: la concentracin o densidad del nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, la longitud de onda de la radiacin incidente y de los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante. -El procedimiento de medida de la dispersin es generalmente emprico haciendo que permanezcan invariables las condiciones experimentales de tamao/forma de las partculas y de intensidad/longitud de onda usada. Las medidas generalmente usan una lmpara cualquiera de luz blanca (policromtica) pero asegurndonos de que su intensidad sea constante durante el proceso. -Slo se obtienen datos fiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan al tamao de partculas, y si se mantiene una distribucin uniforme del tamao de partculas en la muestra, y entre muestras y patrones.

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra
Esquema de un turbidmetro-nefelmetro que permite medir la luz transmitida y dispersada en dos ngulos para tener en cuanta los distintos patrones de dispersin de acuerdo a las caractersticos y tamao de las partculas.

Compartimento

Fuente

P0

de muestra

Detector 1 (Turbidimetra)

Id 90
Detector 2 (Nefelometra 90)

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Tema 6: Turbidimetra y Nefelometra

Turbidimetra
-log T = k b C k = f (forma , y ) Se aplica a muestras de elevada turbidez dentro de ciertos lmites, realizando la medida de una absorbancia aparente (ya que, realmente, no se produce un proceso de absorcin, sino de dispersin). Existe una relacin directa entre la absorbancia aparente y la concentracin de analito o la concentracin celular bacteriana siempre y cuando se trate de suspensiones diluidas ( A< 0.3) ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. En las medidas de turbidez como parmetro no especfico se emplea la reaccin de la formazina (hidrazina + hexametilen tetramina) como estndar.

Nefelometra
ID = kD I0 C kD = f (forma , y ) Es ms sensible que la turbidimetra , por lo que se usa para muestras con bajo nivel de turbidez (lo cual, por otro lado, presenta el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas que suelen involucrar un mayor error de pipeteo) y que el ajuste en general de las condiciones experimentales es ms crtico.

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Tema 4. Otros mtodos pticos
Tcnicas de dispersin

Bioqumica clnica

Proteinas Alcaloides
Turbidez

Desnaturalizar con c. sulfosaliclico o tricloroactico y medir a 420 nm Precipitar con reactivo de Sheibler (Na2WO4, Na3PO4, H+)
Especies inorgnicas