MICROSCOPA PTICA

Dr. Enrique Ricart Servicio Anlisis Clnicos Hospital Virgen de los Lirios. Alcoi

Sesin clnica
29 de Enero de 2010

MICROSCOPA PTICA
? Principio:

fsica ptica geomtrica.

? Visualizacin

de estructuras biolgicas (clulas) cristalinas mediante un instrumento ptico:

? Clulas sin teir ? Clulas teidas ? Microcristales

MICROSCOPA PTICA Clulas sin teir

? ?

M. O. Luz transmitida a campo claro. M. O. Contraste de fase:

?

Las estructuras biolgicas son sumamente transparentes a la luz visible. La tcnica introduce cambios de fase, que resultan de pequeas diferencias en el ndice de refraccin y en el espesor de las diferentes partes del objeto producidas en la luz que las atraviesa. Si el ndice de refraccin del material es mayor al del medio tiene lugar una demora, que se llama cambio de fase. En un microscopio de contraste de fases: cada objetivo tiene un condensador determinado. En el condensador hay un anillo que deja pasar la luz, su objetivo correspondiente tiene un anillo que no deja pasar la luz. Se hacen coincidir ambos anillos y lo que se ve son clarososcuros dando una sensacin de relieve al objeto.

Tipos del sistema de fases:

1. 2. 3. Contraste fases de campo claro. Fases Campo de Fondo oscuro

MICROSCOPA PTICA Clulas sin teir/microcristales

? M. O. Interferencia: El que permite observar imgenes de interferencia entre rayos que atraviesan la muestra y otros que no lo hacen. ? M. O. Fluorescencia primaria: Permite observar la luz emitida por fluorescencia en la preparacin sometida a luz azul - violeta o ultravioleta. Se emplea especialmente en el estudio de microorganismos y molculas orgnicas. ? M. O. Polarizacin.

MICROSCOPA PTICA Clulas teidas

?

Tipos de sistema de tincin:

1.

Estructurales:
? ? ? ? ? Hematoxilina-eosina Tricrmico May-Grundwald-Giemsa Papanicolau Panptico

2.

Qumicas:
? Cualitativas: PAS, Enzimoqumicas, Inmunofluorescencia ? Cuantitativas: Azul Metileno, Feulgen

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: conceptos-1

?

Instrumento ptico constituido por dos o ms lentes convergentes destinado a observar de cerca objetos extremadamente pequeos. La combinacin de sus lentes produce el efecto que la estructura que se mira aparezca con dimensiones muy aumentadas, hacindose perceptible lo que no es a simple vista. ES UN APARATO DE PRECISIN.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: conceptos-2

?

El microscopio ha de ser binocular como mnimo, con platina desplazable e iluminacin incorporada. Debe de tener condensador, oculares 10X y objetivos seco (40X) y objetivo de inmersin en aceite (100X). Parte del material (elementos formes) que vamos a observar es prcticamente transparente:
El diafragma se debe de cerrar al mnimo. Se debe bajar el condensador.

Debido a que muchos elementos formes son algo refractarios y es difcil distinguirlos, debe cambiarse continuamente el enfoque del microscopio.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: estructura

? ? ? ? ? ? ? ?

OCULAR TUBO OBJETIVOS PLATINA CONDENSADOR PIN DE ENFOQUE DIAFRAGMA DE CAMPO SOPORTE DE FILTROS

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: estructura

?
? ?

OCULAR

Consta de una serie de lentes convergentes. Aampla la imagen. El nmero que lleva grabado indica el aumento del ocular: si se multiplica este nmero por el coeficiente de aumento de un objetivo nos da el aumento total del microscopio. Si dividimos este nmero por el aumento del objetivo, se obtiene el ndice del campo visual (en mm), es decir, el diametro del campo visible en el plano del objeto.
TUBO

? ?

Mono, Bi Triocular
PIE

?
?

Lmpara 6v/15w
PLATINA

? ? ?

En cruz Giratoria
PI N DE ENFOQUE PIN

Tornillos macro y micromtrico

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: estructura

?
?

OBJETIVOS:
Sistema de lentes convergentes que forma una imagen real y aumentada situada entre el ocular y su foco (lmpara y condensador).

Negro Blanco

aceite de cedro agua glicerina yoduro metileno seco Sin cubre

Tipos: Plan, Pol, Ph, Ach. Anillo de color:

Anaranjado Amarillo Azul Magenta

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: estructura

Inscripci Inscripcin en el objetivo

PlanC N 40 0.65 160/8 Ph1

Acromtico plano Coeficiente de aumento 40x Apertura numrica Debe utilizarse con un tubo cuya longitud sea 160 mm Condensador contraste fases 1 Cubreobjetos de un espesor de 0.17 mm. Si no hay cifra, sino un signo (-): insensible a diferencias mayores de espesor; un cero: puede verse la preparacin sin cubrir.

0.17

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico OLYMPUS

modelo BX41 TF-5 serie 9E10715

OCULAR: WHB 10x/20. Gafas ? CONDENSADOR: O, Ph1, Ph2; Ph3, DF ? OBJETIVOS:

PlanC N (magenta) 4x/0.10/8 /-/FN 22 PlanC N (azul) 40x/0.65 Ph2/8 /0.17/FN 22 PlanC N (amarillo) 10x/0.25 Ph1/8 /-/FN 22 PlanC N (blanco/negro) 100x/1.25 Oil Ph3/8 /-/FN 22

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: estructura

?

CONDENSADOR Sistema de lentes convergentes cuya funcin es concentrar sobre la preparacin los rayos luminosos procedentes de una superficie uniformemente iluminada (lmpara halgena) y reflejados por un espejo.
? ? ? ?

Condensa el haz de rayos de luz para obtener la mxima intensidad en la mnima superficie. Diafragma del condensador. Tornillos de centrado. Rueda arriba-abajo.

?
?

DIAFRAGMA DE CAMPO
Reduce el chorro de luz a un tamao suficiente para que pase por el condensador.

?
?

SOPORTE PARA FILTROS

Filtro azul (LBD-IF).

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: manejo-1

ENFOCAR CORRECTAMENTE el microscopio: El principio de iluminacin de Khler, permite iluminar nicamente el campo del objetivo a observar, y con una completa uniformidad. Puede realizarse:
si el microscopio dispone de un condensador desplazable en altura, si el microscopio est provisto de lmpara de microscopa con colector y diafragma iris.

Iniciar siempre la regulacin con el condensador en su posicin ms alta y teniendo intercalada la lente frontal (lente auxiliar). Enfocar el objeto con un objetivo de 10X aumentos sin tener en cuenta la iluminacin. Cerrar el diafragma de la lmpara (diafragma de campo luminoso). El diafragma en el pie del microscopio ejerce la funcin de diafragma de campo luminoso. Reproducir el diafragma de campo luminoso en el objeto, bajando el condensador. Centrar el diafragma de campo luminoso con los tornillos de centrado del condensador. Abrir el diafragma de campo luminoso hasta que todo el campo visual est ntegramente iluminado. Regular el contraste de la imagen con el diafragma (de apertura) del condensador. Regular la claridad de la imagen mediante filtros o tensin de la lmpara.

? ?

? ? ? ? ?

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: manejo-2

? ? ? ?

ENFOQUE DIOPTRIAS. GAFAS CENTRADO DEL MICROSCOPIO: diafragma de campo CENTRADO DEL CONDENSADOR CENTRADO DE LA LENTE AUXILIAR
Parte mec mecnica kleenex humedecido Acetona kleenex humedecido Alcohol Absoluto + Dietil Dietilter (50/50) kleenex humedecido Alcohol Absoluto + Dietil Dietilter (50/50) kleenex seco

LIMPIEZA:

Parte ptica Objetivo seco (4x 20x 40x): Objetivo inmersi inmersin (100x):

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: manejo-2

Para enfocar la preparacin:
? ?

se enciende la lmpara se coloca el objetivo 10x en el eje ptico del ocular.

? ? ?

Se aproxima tanto como sea posible el objetivo a la preparacin y se levanta lentamente la platina. Cuando aparece la imagen bien formada pero borrosa, se termina el enfoque con el tornillo micromtrico. Para una buena observacin es muy importante una correcta iluminacin, que se requiere en mayor intensidad para grandes aumentos. Por lo comn, para las observaciones a pocos aumentos, el objetivo tiene las lentes de gran dimetro y el enfoque se consigue a cierta distancia (algunos centmetros).

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial
?

Principio Luz Polarizada: Comportamiento de las estructuras al ser observadas con luz polarizada: se necesita un polarizador (debajo del condensador), y un analizador por encima de las lentes del objetivo.
?

Si el material es isotrpico: la propagacin de la luz polarizada a su travs ocurre a la misma velocidad, cualquiera que sea la direccin del plano de incidencia. Son sustancias con el mismo ndice de refraccin en todas direcciones. Bajo estas circunstancias, los materiales anistropos (como los cristales), presentan dos ndices de refraccin distintos (birrefringente) que corresponden a las diferentes velocidades de transmisin, ya que la velocidad de propagacin de la luz difiere segn la direccin que se considere.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial
?

Birrefringencia: Capacidad de alterar el plano de vibracin de la luz que atraviesa el cristal en funcin de las diferentes velocidades de paso a su travs. Es propia de los cristales biaxiales, al tener dos ejes pticos implican la existencia de dos direcciones para que pase la luz a su travs sin ser refractada.
? ? Intensidad: FUERTE/DBIL ngulo extincin: PARALELO/OBLICUO

Compensador rojo de primer orden: Es una platina delgada (cristal cuarzo) que enlentece el componente rojo de la luz blanca en un cuarto de longitud de onda. Si se interpone entre el polarizador y el analizador, se consigue que el fondo aparezca rojo en vez de negro, y el cristal problema se tornar azul o amarillo dependiendo del tipo de cristal y de la orientacin que presente respecto al eje de vibracin lenta del compensador.
? Elongacin signo: POSITIVA/NEGATIVA

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial

Luz Polarizada Simple: Las estructuras birrefringentes se observan como objetos luminosos (brillantes) sobre un fondo negro oscuro. Luz Polarizada Compensada: Identificar y diferenciar la positividad o negatividad de las estructuras birrefringentes basndose en los diferentes colores producidos cuando los cristales estn orientados paralelos o perpendiculares al eje del compensador rojo de primer orden.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada Simple

Identificacin microcristales en lquido sinovial

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada Compensada

Identificaci Identificacin microcristales en l lquido sinovial

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: aplicaciones en urgencias

SEDIMENTO URINARIO 10 mL orina reciente 1500 a 2000 rpm/5 min.
M.O luz transmitida a

campo claro M.O contraste fase

Tiras reactivas

DISMORFIAS ERITROCITARIAS en orina

10 mL orina reciente 1500 a 2000 rpm/5 min.

contraste fase Osmmetro XE-5000: VCM y ADE

M.O luz transmitida a

M.O

LQUIDOS BIOLGICOS

y Frmula Leucocitaria ?Microcristales (LIQ SIN)

?Recuento

campo claro M.O polarizacin

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico: preparacin muestras

Cmara Recuento NEUBAUER Profundidad: 0.1 mm Superficie: 0.0025 mm2 Cubrecmaras 22x22 mm Grosor: 0.25 mm TestSimplets (tincin supravital) 76x26 mm Grosor: 1 mm Cubre TestSimplets 24x36 mm Grosor: 0.15 mm

Portaobjetos 76x26 mm Grosor: 1 mm

Cubreobjetos 22x22 mm Grosor: 0.15 mm

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial

1. Preparacin de las muestras

? ? ? ? ? ?

a) Obtencin: sin anticoagulante ( hep Na). b) Observar antes de 4 horas. c) Mejor en el sedimento; 3000 rpm/10 min. d) Limpiar portaobjetos con alcohol absoluto. e) En fresco en TestSimplets. f ) Examinar a 40x. Condensador bajado.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada Identificacin microcristales en lquido sinovial

1A. Preparacin de las muestras

?

a) Los cristales pueden NO verse en M.O. luz campo claro por exceso de luz. Bajar el condensador para dar contraste. b) Con M.O. luz polarizada simple puede ser difcil saber el plano del foco a causa del campo de fondo negro. Introducir ms luz usando un compensador rojo de primer orden. c) Ningn estudio del lquido sinovial est completo si no se realiza una observacin con M.O. luz polarizada.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial

2. Observacin de muestras con Luz Polarizada Simple: a) Instalacin del analizador y polarizador

La marca (lnea blanca) grabada en el polarizador est posicionada cruzada a la direccin de vibracin del polarizador

b) Funcionamiento

Girar el revlver portaobjetivos para colocar el objetivo en uso. Mirando a travs de los oculares, girar el polarizador a la posicin donde el campo de visin sea el ms oscuro (posicin Nicol cruzada). Colocar una muestra en la platina y comenzar la observacin. Ajustar los diafragmas de campo e iris.

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico Luz Polarizada

Identificacin microcristales en lquido sinovial

3. Interpretacin de estructuras con Luz Polarizada Simple

CRISTALES ARTEFACTOS Polvo Talco guantes Rayaduras del cubre o del porta Fibras colgeno Fibras cartlago Fibras artificiales tejidos Fragmentos prtesis Anticoagulantes Grnulos almidn Detritus (purulento)

UMS PPCD HIDROXIAPATITA COLESTEROL OXALATO CLCICO FOSFATOS CLCICOS BSICOS CORTICOIDES

MICROSCOP MICROSCOPA PTICA Lquido Sinovial

Normal NO inflamatorio I Inflamatorio II Purulento III Turbio Amarillento Blanquecino Verde Microcristalino IV Hemorrgico V

Transparencia Color

Claro Amarillo plido

Claro Amarillo plido

Turbio Amarillento

Turbio Amarillento Blanquecino

Hemtico Marrn

Viscosidad

Alta

Alta

Disminuida

Muy disminuida

Disminuida

Disminuida

Leucocitos (Cl/mm3) Polinucleares (%) Glucosa (mg/dL) Protenas (g/dL)

<200

<2000

2000-75000

50000>100000 75-100

500->100000

>5000 leucocitos >10000 hemates

<25

<30

50-80

<90

>25-<50

80-110

80-110

40-80

<40

40-80

Variable Interferencia positiva SI/NO

<3.0

<3.0

>3.0

>4.0

>3.0

Cristales

NO

NO

SI/NO

SI/NO

SI

MICROSCOPA PTICA Lquido Sinovial

NO inflamatorio Inflamatorio Purulento Hemorrgico

Artrosis

Artritis Reumatoide

Artritis Sptica (gonoccica) Gota Pseudogota (Condrocalcinosis) Sd. Reiter

Traumatismo

Artritis traumtica

Sndrome Reiter

Neuroartropata

Mixedema Osteocondromatosis sinovial Necrosis asptica Osteocondritis disecante

Artropata Psorisica

Hemofilia

Artritis vrica

Sinovitis vellonodular

Conectivopatas

Tto anticoagulante Sds. Proliferativos Trombocitosis Prtesis

Sinovitis vellonodular

Neuroartropata

Gota/Pseudogota

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico

Identificacin microcristales en lquido sinovial

? ? ?

a) Morfologa b) Localizacin c) Birrefringencia

? ?

M.O. Campo claro

Intensidad ngulo de extincin Elongacin (signo)

M.O. Polarizacin Simple M.O. Polarizacin Compensada

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico

Identificacin microcristales en lquido sinovial

? ? ?

a) Morfologa b) Localizacin c) Birrefringencia

? ?

M.O. Campo claro

Intensidad ngulo de extincin Elongacin (signo)

M.O. Polarizacin Simple M.O. Polarizacin Compensada

MICROSCOPA PTICA Identificacin cristales Lquido Sinovial

Cristal Morfologa Localizacin Birrefringencia (Intensidad/ngulo extincin) Birrefringencia (Elongacin) Patologa

URATO MONOSDICO
MONOHIDRATO

(UMS)

Acicular con extremos puntiagudos; Bastn-Varilla con bordes paralelos 8-10 Polimorfos: Romboides Cuadrados Ovalados Rectangulares Bastn-Varilla Tabletas Agujas 2-10

Intracelular (crisis aguda) Extracelular

FUERTE Paralelo

NEGATIVA

GOTA Hiperuricemias: Acidosis Rabdomiolisis Sds. Mieloproliferativos Condrocalcinosis: Pseudogota Hiperpatiroidismo 1 Hemocromatosis Mixedema Hemofilia Artrosis Diabetes

PIROFOSFATO CLCICO DIHIDRATO (PPCD)

Intracelular (+++) Extracelular

DBIL Oblicuo

POSITIVA

ngulo extincin Paralelo: brillante si est oblicuo al polarizador o del analizador y deja de serlo cuando es paralelo. ngulo extincin Oblicuo: viceversa

Elongacin Negativa: AMARILLO paralelo al compensador; AZUL perpendicular al compensador. Elongacin Positiva: AZUL paralelo al compensador; AMARILLO perpendicular al compensador.

Pueden verse ambos cristales en un mismo lquido

MICROSCOP MICROSCOPA PTICA Identificaci Identificacin cristales L Lquido Sinovial

Cristal Morfologa Localizacin Birrefringencia (Intensidad/ ngulo extincin) Birrefringencia (Elongacin) Patologa

COLESTEROL

Agregados de Lminas rectangulares (cuadradas) con muescas en ngulo Agujas-Bastones Grandes- >100 (*)

Extracelulares

FUERTE

Lminas: SIN EJE (0) Agujas: NEGATIVA

Conectivopatas: AR; LES; DM Artrosis Gota crnica Espondilitis Quistes seos Xantomas Arteriosclerosis Bursitis calcificante Tendinitis Artrosis Artropatas destructivas Osteocondromatosis sinovial IRC Dilisis Conectivopatas Hiperparatirodismo Sarcoidosis AR (*) Indica sinovitis crnica.

Agujas o Romboides al M. E; < 1 Visibles a M.O si forma agregados de particulars esfricas o discoides con estriaciones concntricas o excntricas monedas brillantes (**) (***)

HIDROXIAPATITA

Intracelulares Extracelulares

DBIL

SIN EJE (0)

(**) Tincin con rojo S-Alizarina: precipitado naranja-rojizo en racimos.

(***) Indica degeneracin, calcificacin articular.

MICROSCOPA PTICA Identificacin cristales Lquido Sinovial

Cristal Morfologa Localizacin Birrefringencia (Intensidad/ngulo extincin) Birrefringencia (Elongacin) Patologa

FOSFATO DICALCIO DIHIDRATADO OXALATO CLCICO

M.E Difraccin de rayos X Parecen cristales de UMS Bipiramidal en sobre de carta Intracelulares Extracelulares

POSITIVA

Artropata Destructiva Dilisis Empleo en la toma muestra Son fragmentos de Amiloide Son steres de colesterol Monoartritis Agudas Producto de la Hb Hemartros Sinovitis eosinfila

FUERTE

SIN EJE (0)

CRIOGLOBULINA IgG ? Glbulos cruces de Malta 2-6

POSITIVA (VERDE) Con tincin rojo Congo Intracelulares Extracelulares

LPIDOS (Grasa)

FUERTE

POSITIVA

HEMATOIDINA Cristal CHARCOTLEYDEN

Intracelulares Extracelulares Intracelulares Extracelulares

MICROSCOPA PTICA Identificacin cristales Lquido Sinovial

Cristal Morfologa Localizacin Birrefringencia (Intensidad/ngulo extincin) Birrefringencia (Elongacin) Patologa

CORTICOIDES

Parecen cristales de UMS o PPCD Extremos romos 1-20 Pleomrficos Parecen cristales de PPCD Parecen cristales de PPCD Parecen cristales de UMS Pequeos Amorfos

Intracelular (+++) Extracelular

FUERTE

NEGATIVA POSITIVA SIN EJE (0)

Inyeccin intraarticular Incluso 6 meses Sin significado clnico Empleo en la toma muestra Empleo en la toma muestra

HEPARINA LITIO

DBIL

POSITIVA

HEPARINA CLCICA

EDTA-K2 polvo

DBIL

SIN EJE (0)

Empleo en la toma muestra

METALES

Intracelulares Extracelulares

En prtesis Metalosinovitis

MICROSCOPA PTICA Identificacin cristales Lquido Sinovial

Cristal Morfologa Localizacin Birrefringencia (Intensidad/ngulo extincin) Birrefringencia (Elongacin) Patologa

DETRITUS

Pequeos Irregulares Bordes no paralelos Variables Redondeados cruz de Malta Irregulares Tipo Bastn 300 Extracelular

VARIABLE

GRNULOS ALMIDN

FUERTE

CARTLAGO COLGENO POLVO RAYADURAS FIBRAS ARTIFICIALES

FUERTE

POSITIVA

Artrosis Postraumatismo

FUERTE

FIBRINA

Parecen cristales de UMS Agujas, irregulares, ramificados o con curvas

DBIL

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico

Identificacin microcristales en lquido sinovial

? ? ?

a) SENSIBILIDAD: 80% b) ESPECIFICIDAD: 96% c) FAMILIARIZARSE CON LA OBSERVACIN EN EL M. O. LUZ POLARIZADA d) PRACTICAR, PRACTICAR, PRACTICAR

MICROSCOPA PTICA Microscopio ptico

Lquidos Biolgicos
?

1) Body Fluid Analysis for Cellular Composition; Aproved Guideline. CLSI document H56-A (ISBN 1-56238-614-X). Clinical and Laboratory Standards Institute. Pennsylvania, USA, 2006. 2) Analysis of Body Fluids in Clinical Chemistry; Aproved Guideline. CLSI document C49-A (ISBN 1-56238-638-7). Clinical and Laboratory Standards Institute. Pennsylvania, USA, 2007.

3) Comisin de Magnitudes Biolgicas relacionadas con la Urgencia Mdica. SEQC. Recomendaciones para el estudio del lquido sinovial. Quim Clin 2004; 23(6): 434-438.