Potencialidades de Linhagens de Leveduras Saccharomyces cerevisiae para a Produo de Aguardente Artesanal

Jordalan Buffet Muniz1, Luciane Maria Colla1, Jorge Alberto Vieira Costa2 e Telma Elita Bertolin1
Universidade de Passo Fundo Curso de Engenharia de Alimentos Centro de Pesquisa em Alimentao - Laboratrio de Fermentaes Campus I Bairro So Jos - 99001-970 Passo Fundo RS E-mail: lmcolla@upf.tche.br 2 Fundao Universidade Federal do Rio Grande Curso de Engenharia de Alimentos Depto. de Qumica - Rua Eng. Alfredo Huch, 475 Centro - 96201-900 Rio Grande-RS E-mail: dqmjorge@furg.br
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RESUMO A melhoria do processo artesanal de produo de aguardente de cana passa pela necessidade do conhecimento da cintica do processo fermentativo. Este trabalho teve como objetivo estudar a cintica de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae com relao ao crescimento, consumo de substrato e produo de etanol. O substrato utilizado foi o caldo de cana-de-acar filtrado e esterilizado, pH entre 4,5 e 5,0. Foram utilizados biorreatores de 5 L, a 30C, concentrao de inculo 5,0 g/L e 2 h de aerao inicial. Durante o processo, foram realizadas determinaes das concentraes de clulas, acares e lcool a cada hora. Os resultados obtidos foram: Levedura A: max 0,1122 h-1, YX/S 0,0346 gclula/gglicose, YP/S 0,299 glcool/gglicose; Levedura B: max=0,1026 h-1, YX/S=0,042 (gclula/gglicose), YP/S=0,385 glcool/gglicose; Levedura C: max=0,1442 h-1, YX/S=0,077 (gclula/gglicose), YP/S=0,382 glcool/gglicose; Levedura D: max=0,0836 h-1, YX/S=0,038 gclula/gglicose, YP/S=0,262 glcool/gglicose. Concluiu-se que a levedura da marca 2 apresentou melhores caractersticas cinticas de converso de substrato em produto (0,385getanol/gART) e taxa volumtrica de formao de produto em etanol (4,684 getanol/L.h) na fermentao alcolica para a produo de aguardente. INTRODUO A obteno de etanol por via fermentativa sempre acompanhou a produo de acar no Brasil, denominando-se as usinas que se dedicam a produo de ambos, usinas ou destilarias anexas e as usinas que no se dedicam a elaborao de acar, mas utilizam o caldo de cana exclusivamente para a produo do etanol de usinas ou destilarias autnomas (Reguly, 1998). A conduo das fermentaes pelo homem visando a obteno de determinado produto apresenta a necessidade do conhecimento da cintica das reaes envolvidas. Alm disso, a seleo de uma microbiota mais eficiente e de maior rendimento, sem perder de vista a qualidade da bebida, deve ser buscada com a adoo de processos adequados e em condies as mais favorveis possveis. Segundo as necessidades da tecnologia envolvida na elaborao de bebidas alcolicas, as linhagens de leveduras foram sendo selecionadas segundo caractersticas desejveis ao processo e ao produto. A taxa volumtrica de formao de produto e a eficincia de fermentao, a tolerncia ao etanol e temperatura, a resistncia a elevadas concentraes de acares so constantes fontes de interesse (Hammond, 1995). Entretanto, o processo de produo de aguardente de cana segue ainda princpios rudimentares de fermentao que impedem no s a escolha, a seleo e o uso de linhagens adequadas de leveduras, como tambm impossibilita um controle de processo e de qualidade

de produto pela existncia de um padro tecnolgico muito incipiente (Ribeiro e Horii, 1999). Considerando estes aspectos o trabalho teve como objetivo verificar a influncia de diferentes cepas comerciais de Saccharomyces cerevisiae sobre o crescimento do microrganismo, converso de substrato em produtos e em clulas e taxa volumtrica de formao de produto. MATERIAL E MTODOS Microrganismo e meio de cultivo Foi utilizado o microrganismo Saccharomyces cerevisiae proveniente de leveduras comerciais liofilizadas e prensadas na concentrao inicial de 5,0 g/L. Foram realizados 4 ensaios, sendo os trs primeiros realizados com leveduras liofilizadas (Marcas A, B e C) e a quarta fermentao com levedura prensada (Marca C). O meio de cultivo utilizado foi o caldo de cana-de-acar, o qual foi extrado com auxlio de moenda e sem banho de imerso. A seguir foi filtrado e esterilizado em autoclave a uma temperatura de 120 C durante 20 minutos. Aps alcanar temperatura ambiente foi diludo com gua estril at 14 Brix, tendo tambm o pH ajustado entre 4,5 e 5. A fermentao foi conduzida em frascos de 5,0 L, com volume inicial de meio de 3,5 L, os quais foram submetidos aerao durante as 2 primeiras horas aps a inoculao do meio. Os experimentos foram realizados em estufa a 28-30C. Determinaes analticas Foram realizadas tomadas de amostra no tempo zero de fermentao e aps a cada hora para a determinao do pH, concentrao de acares redutores totais (ART) e da concentrao de etanol, at que a anlise de ART do cultivo apresentasse resultado prximo a zero, correspondendo a um tempo total de 13-14 h de fermentao. A determinao do pH foi realizada atravs do mtodo potenciomtrico segundo a AOAC (1995). Sempre que o pH situava-se fora da faixa de 4,5 a 5 foi realizada a correo pela adio de solues de NaOH 1M e HCl 1M. A concentrao de clulas foi determinada atravs de leitura da densidade tica em espectrofotmetro a 610 nm utilizando-se uma relao pr-estabelecida entre a concentrao de clulas e a absorbncia. A determinao de acares redutores totais (ART) foi realizada atravs do mtodo espectrofotemtrico do 3-5 cido dinitrossaliclico (DNS). Para isto fez-se uma curva padro obtida a partir de uma soluo de glicose seca e na concentrao de 0,5 g/L (Reguly, 1998) A concentrao de etanol foi determinada atravs do mtodo do dicromato de potssio (Salik e Povoh, 1993) Clculos dos parmetros de fermentao Para obteno dos parmetros cinticos da fermentao, os dados obtidos das condies de cultivo estudadas foram utilizados para os clculos da taxa especfica mxima de crescimento, dos fatores de converso de substrato em clulas e em produto, da eficincia de fermentao e da taxa volumtrica de formao de produto. Taxa especfica mxima de crescimento (max) A taxa especfica de crescimento celular () foi calculada pela Equao 1.
=
1 dX . X dt

Equao 1

A taxa especfica mxima de crescimento foi determinada segundo o coeficiente angular da equao da reta do logaritmo neperiano da concentrao de leveduras em funo do tempo de

fermentao, correspondente fase exponencial de crescimento, determinada por regresso linear (Pirt, 1985), atravs da Equao 2. Equao 2 onde: Ln[X] = logaritmo neperiano da concentrao de leveduras na fase exponencial de crescimento; max = taxa especfica mxima de crescimento (1/h); t = tempo (h) b = coeficiente linear da equao do logaritmo da concentrao de leveduras em funo do tempo de fermentao, na fase exponencial de crescimento. Fator de converso de substrato em produto (YP/S) O fator de converso de substrato em produto foi expresso em g etanol/gART, sendo calculado atravs da Equao 3.
YP / S =

Ln[ X ] = max .t + b

Foram plotados os dados de P (concentrao de produto) versus S (concentrao de substrato), encontrando-se o modelo matemtico (coeficiente de determinao superior a 0,95) correspondente. A partir do modelo foi calculado o fator de converso atravs da derivada de P com relao a S. Fator de converso de substrato em clulas(YX/S) O fator de converso de substrato em clulas foi expresso em gclulas/gART, sendo calculado atravs da Equao 4.
YX / S =

dP dS

Equao 3

Foram plotados os dados de X (concentrao de clulas) versus S (concentrao de substrato), encontrando-se o modelo matemtico (coeficiente de determinao superior a 0,95) correspondente. A partir do modelo foi calculado o fator de converso atravs da derivada de X com relao a S. Eficincia de fermentao (E) Foi calculada com base no rendimento terico proveniente da equao de Gay-Lussac (51,1 getanol/100gglicose) (Ribeiro e Horii, 1999), segundo a Equao 5. E = YP / S .100 / 0,511 Equao 5 Taxa volumtrica de formao de Produto (QP) A taxa volumtrica de formao de produto foi definida pela quantidade de etanol produzida na unidade de tempo, expressa em getanol/L.h) segundo a Equao 6.
QP = Pf Pi tf

dX dS

Equao 4

Equao 6

onde: Pf = Quantidade de etanol no tempo final de fermentao; Pi = quantidade de etanol no tempo inicial de fermentao; Tf = tempo de fermentao. RESULTADOS E DISCUSSO

A Figura 1 apresenta os resultados em clulas (g/L), ART (mg/mL) e etanol (g/L) durante as fermentaes 1, 2, 3 e 4. Pode-se observar que as leveduras 3 e 4 foram os que apresentaram os maiores valores de clulas no tempo final de fermentao, 14,2 e 13,3 g/L, respectivamente; comparados a 12,1 e 11,3 g/L das leveduras 1 e 2, respectivamente. Quanto ao consumo de substrato observa-se que todos as leveduras utilizadas apresentaram um mesmo padro exceto a levedura 1, onde o consumo de substrato ocorreu predominantemente at 7 horas de cultivo, permanecendo praticamente constante aps este perodo. J com respeito a produo de etanol os valores finais obtidos para as leveduras 1, 2, 3 e 4 foram: 58,9; 60,9; 56,8 e 55,6 g/L respectivamente.
180 160 140 Biomassa (g/L) ART (mg/ml) Etanol (g/L) 14 Biomassa (g/L) ART (mg/ml) Etanol (g/L) 14

180 160 140

12

12

Biomassa (g/L)

Art (mg/ml) Etanol (g/L)

10

ART (mg/ml) Etanol (g/L)

120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12

120 100 80 60 40 20

10

4 14

0 0 2 4 6 8 10 12

4 14

Tempo (h)

Tempo (h)

(a)
180 160 140 Biomassa (g/L) ART (mg/ml) Etanol (g/L) 180 160 12 140

(b)
Biomassa (g/L) ART (mg/ml) Etanol (g/L) 14

14

12

Biomassa (g/L)

ART (mg/ml) Etanol (g/L)

ART (mg/ml) Etanol (g/L)

120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 4 14 8 6 10

120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12

10

4 14

Tempo (h)

Tempo (h)

(c) (d) Figura 1: Curvas de crescimento de clulas, consumo de substrato (ART) e produo de etanol para as fermentaes (a) 1, (b) 2, (c) 3 e (d) 4. Na Tabela 1 so apresentados os resultados obtidos de taxa especfica mxima de crescimento e os fatores de converso de substrato em clula (Y X/S) e de substrato em produto (YP/S). Analisando-se as fermentaes quanto aos parmetros cinticos avaliados (Tabela 1), pode-se verificar que as leveduras 2 e 3 foram as que apresentaram os melhores resultados de eficincia de fermentao (73,5 e 74,7%, respectivamente) e fator de converso de substrato em produto (0,385 e 0,382 getanol/gglicose), caractersticas importantes para leveduras na fermentao alcolica. Com respeito taxa volumtrica de formao de produto, a levedura 2 apresentou uma taxa volumtrica de formao de produto mxima de 5,765 g etanol/L.h para um tempo de 6 horas de fermentao. Considerando-se a produo de etanol no tempo total de fermentao (13 horas), a levedura 2 tambm apresentou a melhor resposta de 4,684 g etanol/L.h, comparado 4,532 getanol/L.h, 4,371 getanol/L.h e 4,538 getanol/L.h nas fermentaes 1, 3 e 4, respectivamente. Com relao taxa especfica mxima de crescimento (max) e ao fator de converso de substrato em clulas (YX/S), a levedura 2 apresentou os menores valores para os

Biomassa (g/L)

Biomassa (g/L)

dois parmetros, de 0,1026 h-1 para a max e de 0,042 gclulas/gglicose para o YX/S, sendo estes resultados adequados uma vez que na fermentao alcolica busca-se maiores rendimentos em produto (etanol) do que em clulas. Tabela 1: Taxa especfica mxima de crescimento (max), fator de converso de substrato em clula (YX/S), fator de converso de substrato em produto (Y P/S), eficincia de fermentao (E) e taxa volumtrica de formao de produto mxima (Q Pmax) para as leveduras comerciais utilizadas na fermentao do caldo de cana para obteno de cachaa. Ferm. 1 2 3 4 max (1/h) 0,1122 0,1026 0,1442 0,0836 YX/S (gclula/gglicose) 0,035 0,042 0,077 0,038 YP/S (glcool/gglicose) 0,299 0,385 0,382 0,262 E (%) 58,5 73,5 74,7 51,2 QPmax (getanol/L.h) 5,715 (t=8h) 5,765 (t=6h) 5,050 (t=9h) 4,939 (t=8h)

Observa-se que a levedura da marca 2 apresentou melhores caractersticas cinticas de converso de substrato em produto (0,385getanol/gART) e taxa volumtrica de formao de produto em etanol (5,765 getanol/L.h) na fermentao alcolica para a produo de aguardente. Na Tabela 2 esto apresentados os modelos matemticos obtidos para o clculo dos fatores de converso de substrato em produto e clulas. Tabela 2: Modelos matemticos utilizados no clculo dos fatores de converso de substrato em produto e clulas. Fermentao 1 2 3 4 Modelo Para o clculo de YX/S X=12,2133-0,0333.S X=17,232-0,0773.S X=11,877-0,0421.S X=13,74-0,0383.S Para o clculo de YP/S P=-0,277.S+49,91 P=-0,385.S+60,834 P=-0,382.S+58,929 P=-0,262.S+52,626 Coeficiente de determinao YX/S YP/S 0,99 0,99 0,98 0,99 0,98 0,99 0,98 0,98

CONCLUSO Considerando-se a importncia da melhoria do processo de elaborao da cachaa artesanal, onde na maioria das vezes a produo conduzida de forma emprica e sem maiores preocupaes com o rendimento do processo, concluiu-se que neste trabalho foram obtidas algumas respostas condizentes com respeito a utilizao de leveduras comerciais como inculo na produo artesanal de cachaa. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
A.O.A.C. (1995), Official methods of analysis . 16th edn. Association of Official Analytical Chemists. Arlington, Virginia, USA. Dragone, G., Silva, D. P., Santos, C. L. e Silva, J. B. A. (2002), Estudo de Produo de cerveja em escala piloto utilizando mosto concentrado. Anais do Congresso Brasileiro de Cincia e Tecnologia de Alimentos, SBCTA.

Hammond, J. R. M. (1995), Genetically-modified brewing yeasts for the 21 st century. Progress to date. Yeast, v.11, n.16, p. 1613-1627. Oliveira, E. S.; Rosa, C. A.; Morgano, M. A. e Serra, E. S. (2002), Rendimento de diferentes linhagens de leveduras isoladas de fermentaes de cachaa artesanal. Anais do Congresso Brasileiro de Cincia e Tecnologia de Alimentos, SBCTA. Pirt, S. J. (1985), Principles of microbe and cell cultivation. Oxford: Blackwell, p.274. Reguly, J. C. (1998), Biotecnologia dos Processos Fermentativos , Editora e Grfica Universitria UFPEL, Pelotas, v.2. Ribeiro, C. A. e Horii, J. (1999), Potencialidades de linhagens de levedura Sacharomyces cerevisiae para a fermentao do Caldo de Cana. Sci. Agric. V.56, n.2. Salik, F. L. M. e POVOH, N. P. (1993), Mtodo espectrofotomtrico para a determinao de teores alcolicos em misturas hidroalcolicas. Anais do Congresso Nacional da STAB, guas de So Pedro, Piracicaba, v. 5., p. 262-266. Souto, F. C. (2000), Determinao dos parmetros cinticos de crescimento e produo da fermentao alcolica. Relatrio final de iniciao cientfica. DEQ/UFPB, Campina Grande PB.