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Introduo
Surfactantes:
- compostos qumicos, utilizados em diversos setores industriais; - maioria sintetizados a partir de derivados de petrleo;
- at 1965, os surfactantes presentes nos detergentes no eram biodegradveis;
- so molculas anfipticas: uma poro hidrofbica e uma poro hidroflica. - os surfactantes diminuem a tenso superficial da gua. - aps a CMC, as molculas de surfactante, na soluo, passam a se agregar sob a forma de micelas.
Molcula anfiptica
Surfactantes
Molcula anfiptica;
Origem;
Biossurfactantes
Compostos de origem microbiana que exibem propriedades surfactantes, e consistem em subprodutos metablicos de bactrias, fungos e leveduras.
Vazamentos de petrleo
Acmulo de resduos
DESAFIO
Produto de Origem Microbiana Biorremediao de Hidrocarbonetos Vantagens Ecolgicas, Sociais e Econmicas Biosurfactantes
Biossurfactantes
Definio: biotensoativos ou biosurfactantes so molculas anfipticas, com uma poro hidroflica e outra hidrofbica, com habilidade de causar emulsificao em uma mistura de gua-leo Estrutura de um biossurfactante (BOGNOLO, 1999; CAMEOTRA e MAKKAR, 1998)
Poro hidroflica: aminocidos [glutamato, aspartato,lisina, ornitina e arginina] ou peptdeos[consistindo de aminocidos hidroflicos], carboidratos, fosfato, cido carboxilico, lcool, etc. Poro hidrofbica: cidos graxos saturados ou insaturados
Classes de Biosurfactantes
cidos graxos hidroxilados e ligados por ligaes cruzadas (cido miclico) Glicolipdeos Complexo Polissacardeo-lipdeo Lipoprotenas-lipopeptideos Fosfolipdeos Superfcie celular completa
Biossurfactantes
Microrganismo
Biossurfactantes
Tipos de biosurfactantes
Glicolipideos
Lipideos-trealose [Dissacarideo trealose ligado ao C6 e C6do cido micolico] associado a estrutura da membrana da parede de muitas espcies dos genros Mycobacterium, Nocardia e Corynebacterium . Reduo da tenso superficial para 25-30mN/m e tenso interfacial por volta de 1 mN/m
Ramnolipideos [uma ou duas molculas de ramnose ligada a uma ou duas molculas de cido -hidroxidecanoico] Produzido por Pseudomonas aeruginosa. Reduo da tenso superficial para 2530mN/m e tenso interfacial por volta de 1 mN/m
Soforolipideos [consiste de um carboidrato dimrico da soforose ligado a uma cadeia longa de cido hidroxicarboxilico]. Produtores: Torulopsis bombicola, T. petrophilum, T. apicola e Candida bogoriensis Tenso interfacial: 40-5mN/m No bom agente emulsificante
com composio de 83% de carboidrato e 17% protena. A poro carboidrato contm: glicose, galactose, galactosamina e cido galacturnico Surfactantes particulados: Acumulo de vesculas de membrana extracelular, contendo proteina, fosfolipdeos e polissacardeos. Produtores : Streptococcus, Staphylococcus aureus, Aeromonas salmonicids, etc
(C H 2 ) 1 2 C H3
CH2OR O OH HO ROH2 C O OH HO OH O O
L-Asp
D-Leu
L-Leu
O HC (CH2)9
CH3 CH CH3 O
CH2 C
surfactina
soforolipdeo
CH3
O HO O CH3 OH O HO O CH CH2 C O CH CH2 COOH ramnolipdeo (CH2)6 CH3 O (CH2)6 CH3
CH3 OH OH
Biossurfactantes
Biossurfactantes
CMC
Ramnolipdeos
Prop. fsicas
Solubilidade
[ ] biossurfactante
Formao de Micela
Formao de Micela
Biossurfactantes x Surfactantes
Aspectos Positivos
so compostos biodegradveis; no so txicos ao ambiente; possuem maior seletividade e atividade especfica; continuam ativos sob condies extremas de pH,temperatura e salinidade; so produzidos renovveis. a partir de fontes
Biossurfactantes x Surfactantes
Entrave ampla utilizao de Biossurfactantes
$
Custos de produo Seleo de linhagens altamente produtoras Uso de engenharia gentica Matria-prima de baixo custo Otimizao do processo (reatores)
Microrg.(rend. g/L)
P. aeruginosa (2,7) Bacillus subtilis P. aeruginosa (11,72) B.Subtilis (2,2 3,0) P. aeruginosa (16,0) C. antartica /C. apicola (10,5/13,4)
Resduo de destilaria
Fonte: Mukherjee et al., (2006)
P. aeruginosa (0,92)
Matria prima utilizada no LMI para produo de Biosurfactante Borra de Petrleo Elementos inorgnicos presentes na Borra
Composition of fatty acids from oil refinery waste used as carbon source by P. aeruginosa LBI % (w/w) FATTY ACID COMPOSITION C16 palmitic C18 stearic C18:1 oleic C18:2 linoleic C18:3 linilenic R. OIL WASTES (SOAPSTOCK) 16.66 3.58 22.9 50.28 4.54
Produo associada ao crescimento; Produo sob condies limitantes de crescimento; Produo por clulas no proliferantes; Produo com adio de precursores.
BIOSSINTESE DE BIOSURFACTANTE Biossurfactante: Duas pores: hidroflica e hidrofbica Diversas vias metablicas esto envolvidas na sntese desse dois compostos, utilizando enzimas especficas. Em muitos casos a primeira enzima na via metablica do precursor nica e sofre regulao 1. De novo sntese das pores hidroflicas e hidrofbicas atravs de duas vias independentes seguida da ligao 2. De novo sntese da poro hidroflica e a sntese da poro hidrofbica dependente do substrato 3. De novo sntese da poro hidrofbica e a sntese da poro hidroflica dependente do substrato
Regulao
1. Por induo: Em geral microrganismos produzem biosurfactantes quando crescem em meios contendo substratos insolveis em gua Utilizao de indutores como longas cadeias de cidos graxos, hidrocarbonetos ou glicerdeos n meio de crescimento de T. magnoliae aumentava a produo de soforolipideos 2. Regulao catablica: Ocorre atravs da glicose ou metablitos primrios. Actinobacter calcoaceticus e A .paraffineus no produzem biosurfactante quando crescidas em cido orgnicos e glicose respectivamente. 3. Efeito da fonte de Nitrognio e ctions multivalentes. Sais de amnia e de uria tem sido citado como fonte preferida no caso de A paraffineus Em Pseudomonas aeruginosa RC-II amnia e glutamina em alta concentrao reprime a sntese de biosurfactante A limitao de ctions multivalentes tambm causa superproduo de biosurfactante em Pseudomonas spp.
Gliconeognese
TDP-glicose
hidroxidecanoil--cido hidroxidecanico
TDP-Ramnose
Produo de Biosurfactante
Produo de biosurfactante via fermentao: Dependendo da natureza do biosurfactante e do microrganismo produtor, a produo pode ocorrer como: 1. Produo associada ao crescimento Parmetros importantes: Tipo de Fonte de carbono, Tipo de adio de Nitrognio, Velocidade de agitao, transferncia de oxignio 2. Produo sob condies de crescimento limitante Quando a concentrao de Nitrognio limitante. A razo C:N no meio tem um efeito importante na produo de biosurfactante. A limitao de ctions bivalentes como Mg++, Fe++ ou Ca++ tambm favorece a formao de biosurfactante 3. Produo por Resting/no growing cells As clulas no se multiplicam, mas continuam a produo 4. Produo associada com aumento de um precursor.
Adio de precursores causa um grande aumento na produo de biosurfactante Obteno do Produto: A escolha de um mtodo para obteno de um biosurfactante depende da carga inica, solubilidade em gua, e se o produto est ligado clula ou extracelular Mtodos: Extrao por solvente: clorofrmio-metanol, diclorometano-metanol, butanol, acetato de etila, pentano e hexano. No caso de Torulopsis bombicola, T. apicola, T. petrophilum carvo adicionado ao meio fermentado livre de clula e aps filtrao o composto desorvido por acetato de etila resfriado, o qual removido sobre presso reduzida e o glicolipdeo dissolvido em etanol aquecido e cristalizado. Cristalizao: possvel colher cristais do sobrenadante de cultivo atravs da adio de cido seguido por incubao a baixa temperatura.
Precipitao : Sulfato de amnia, cido, etanol-cido actico e acetona Sulfato de amnia: Emulsan e biodispersan produzidos por Acinetobacter spp. Precipitao cida: surfactina produzida por Bacillus subtilis Acetona: biosurfactante produzidopoPseudomonas spp. No caso de produo contnua, ocorre acidificao co HCl 2N, onde protenas e lipdeos so precipitados, em seguidas o bisurfactante extrado do sobrenadante com diclorometano[surfactina]. Filtrao com fluxo tangencial tambm pode ser utilizado
Produo de Biossurfactantes Fatores que afetam a produo (Fiechter, 1992; Jo Chu Chang, 2005) Fontes de Carbono
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
5 4 3 2 1 0 0 20 40
2%
4%
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120
60
80
100
120
Produo de Biossurfactantes Fatores que afetam a produo (Fiechter, 1992; Jo Chu Chang, 2005) Propores C/N, C/P e ctions bivalentes
C/N 13
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
1 20 40 60 80 100 120 0
12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
Tempo de Fermentao (horas)
4 3 2 1 0
T e m p o d e F e rm e n ta o (h o r a s )
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0
9 7 6 5 4 3 2
C/N 23
5
14
Produo de Biossurfactantes Fatores que afetam a produo (Fiechter, 1992; Jo Chu Chang, 2005) Temperatura e pH
c/ controle
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
16 14 12 10
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
s/ controle
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
Tempo de Fermentao (horas)
8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
Produo de Biossurfactantes Fatores que afetam a produo (Fiechter, 1992; Jo Chu Chang, 2005) Agitao
500 rpm
9
Concentrao Ramnolipdios (g/L)
8 7 6
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
800 rpm
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120
5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120
Tempo de Fermentao (horas)
Produo de Biossurfactantes Fatores que afetam a produo (Fiechter, 1992; Jo Chu Chang, 2005) Aerao
1,0 vvm
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
16 14 12 10
Concentrao de Ramnolipdios (g/L)
2,0 vvm
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
Tempo de Fermentao (horas)
8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
Produo de Biossurfactantes
Aplicaes(Fiechter, 1992) Agricultura Utilizados em formulaes de herbicidas e pesticidas; Ramnolipdios so potenciais agentes para controle biolgico de fitopatgenos Produtos de higiene e cosmticos Utilizado em hidratantes e umectantes (produtos de maquiagem); Incorporados em produtos de limpeza.
Aplicaes(Fiechter, 1992) Indstrias de Alimentos Agentes emulsificantes no processamento de matriaprima; Auxilia na formao de consistncia textura e na solubilizao de aromas; Outras aplicaes Indstria de papel, textil, tinta (favorece a espalhabilidade e propriedades de mistura), cermica. e
Aplicaes(Mulligan, 2005)
Indstria petrolfera
Recuperao Terciria do Petrleo(MEOR); leos lubrificantes; Remoo de resduos de leo em tanques de estocagem; Processos de biorremediao e disperso nos derramamentos de leo
Remoo de metais
35
30 25 20 15 10 5 0 0 15 30 45 60 75 90
T e m p o d e a q u e c im e n t o ( m in )
tenso superficial do caldo livre de clulas contendo biossurfactante produzido no cultivo da linhagem P. aeruginosa LBI em 2% (w/v) da mistura de leos usado em fritura de alimentos, submetido variao de Temperatura, pH, presso e salinidade.
Nitschke et al. (2005): P. aeruginosa LBI em 2% (w/v) de borra de leo de soja, algodo, milho, palma e babau, observaram a predominncia do mono-ramnolipdio RhaC10C10 (m/z 503) sobre o di-ramnolipdio Rha2C10C10 (m/z 649) Costa et al. (2006): P. aeruginosa LBI em 2% (w/v) de leo de babau ou de leo de cupuau, tambm observaram a predominncia do mono-ramnolipdio RhaC10C10 (m/z 503). P. aeruginosa LBI: cultivada em fontes de carbonos hidrofbicas, houve a predominncia de RhaC10C10 (m/z 503), enquanto que, quando cultivada em fontes de carbono hidroflicas como glicerol e glicose, houve a predominncia de Rha2C10C10 (m/z 649). P. aeruginosa LBI: em 2% (w/v) de n-parafina, uma fonte de carbono hidrofbica, revelou pequena predominncia de Rha2C10C10 (m/z 649) sobre RhaC10C10 (m/z 503). Alm disso, tambm foi detectada a presena dos ons minoritrios: Rha2C10C12:1 (m/z 677), Rha2C10C12:2 (m/z 675), Rha2C10C8 (m/z 621), RhaC10C12:1 (m/z 529), RhaC10C12:2 (m/z 527), e, Rha2C10 (m/z479).
Summary of the experimental results obtained in the investigation of hydrocarbon utilization by P. aeruginosa LBI:
Carbon Source (%) Kerosene (20) Diesel oil (30) Crude oil (10) Oil sludge (10) Surface Tension mN/m 32 33 36 36.3 Biomass (g/L) 2.43 5.4 2.0 4.0 final pH 6.8 8.4 7.0 6.9 Rhamnolipi d (g/L) 1.02 9.9 1.4 1.08
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120
20
40
60
80
100
120
______ 1.0 vvm, 500 rpm; ______ 1.0 vvm, 800 rpm; ______ 2.0 vvm; 500 rpm; ___ + ___ 2.0 vvm, 800 rpm
100
pH2 pH6
pH3 pH7
pH4 pH8
pH5 pH9
pH 2.0 pH 6.0
pH 3.0 pH 7.0
pH 4.0 pH 8.0
pH 5.0 pH 9.0
90 80 70 60 50 0 10 20 30 40 50 60
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
50
60
Tempo (min)
Tempo (min)
Atividade de emulsificao de solues 0,1% de ramnolipdios em diferentes valores de pH (2.0 9.0) utilizando como fonte hidrofbica leo de soja.
Estabilidade da emulso formada pela soluo 0,1% de ramnolipdios em diferentes valores de pH (2.0 9.0) utilizando como fonte hidrofbica o benzeno.
Tabela 1. Parmetros da produo de ramnolipdios pelos isolados LMI 6c, LMI 7a e por P. aeruginosa LBI aps 120 horas de cultivo nos diferentes resduos oleosos testados.
Microrganismos
leo soja usado
Substratos
Borra de soja Gordura de frango Gordura vegetal
Parmetros
LBI
LMI 6c
LMI 7a
1RL
: ramnolipdeos
2TS:
tenso superficial
Borra de soja
100 90
leo usado
LMI 6c LMI 7a
Atividade emulsificante dos biotensoativos produzidos pelos isolados LMI 6c e LMI 7a em borra de soja e leo usado a frente a leo de soja, querosene e benzeno. Cinc. Tecnol. Aliment.,2008
Wettability of aqueous rhamnolipids solutions produced by Pseudomonas aeruginosa LBI. Costa et al, 2008 Journal of surfactants and detergents
Table1- Contact angles () of pure water on the PCL, PVC, PCL-PVC, PET and glass surfaces.
Contact angles () Solution S.T. (mN m-1) Water 72.2 PCL 76.2 0.7 PVC 87.2 0.8 PVC-PCL 68.6 0.5 PET 74.2 1.1 Glass 7.5 1.7
Biosurfactant Production by P. aeruginosa LBI Growing on Different Carbon Sources and Predominant Rhamnolipid as Determined by ESI(-)-MS Analysis
PERSPECTIVAS
Muitas Aplicaes Industriais Especificidade Biodegradabilidade Baixa toxicidade Ao em condies extremas
Biossurfactante Altos Custos METAS Utilizao de substratos mais baratos Mtodos eficientes de purificao Engenharia gentica
Metodologia
Tenso superficial (Tensimetro K6)
Metodologia
ndice de emulsificao
Emulso formada (cm) Altura total (cm)
Sobrenadante + Hidrocarboneto (1:1)
X 100
Estabilidade do biossurfactante
temperatura salinidade
sobrenadante
presso pH
tenso superficial
Recuperao dos Ramnolipdios Para obteno do ramnolipdio utilizou-se o mtodo de recuperao por coluna de adsoro (ABALOS et al., 2001), o caldo de cultivo foi centrifugado a 12.000 rpm durante 20 minutos, o sobrenadante foi acidificado a pH 2,0 com H2SO4 concentrado e mantido sob refrigerao durante 12 horas. Em seguida este caldo foi centrifugado a 10.000 rpm e o precipitado foi ressuspenso em gua destilada e eludo em coluna de adsoro contendo resina de poliestireno Amberlite XAD-2 (Supelco), como descrito por Reiling et al. (1986).
Tenso Interfacial Mediu-se a tenso interfacial entre soluo 0,1% (p/v) de ramnolipdios e hexadecano, utilizando-se o tensimetro Krss K6
Concentrao Micelar Crtica (CMC) A concentrao micelar crtica (CMC) foi determinada medindo-se a tenso superficial de solues de ramnolipdios em diferentes concentraes, variando de 0,0001 mg/L a 1000mg/L. A leitura da tenso superficial de cada soluo foi feita atravs de um tensimetro Krss K6.
Equipe
Prof. Dr. Jonas Contiero Supervisor do LMI Siddhartha Georges V. A O Costa Doutorado Direto Fapesp Roberta Barros Lovaglio - Doutorado Fapesp Tulio de Luca Cappeline Bolsista PIBIC/CNPq Joyce Domingos Ferrari Aluna da Engenharia Ambiental Colaborao: Profa. Dra. Lireny A G. Gonalves Departamento de Tecnologia de Alimentos Unicamp Profa. Dra.Marcia Nitschke Instituto de Qumica de So Carlos - Usp Prof. Dr. Marcos N. Eberlin e Renato Haddad Laboratrio Thomson de Espectrometria de Massa I.Q./Unicamp Dr. Franois Lepine Institute Armand Frappier- Laval/Quebec Dr. Rudolf Hausmann Universidade de Karlsruhe/Alemanha