PARTE III Mtodos para generar variabilidad

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

III.-Captulo 1
Variacin somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofa; Echenique, Viviana 1 Introduccin El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genticos que son sensibles a la disrupcin por estreses biticos y abiticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las clulas vegetales e involucra procesos mutagnicos durante el establecimiento del explanto, la induccin de callo, la formacin de embriones y la regeneracin de plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen nuclear y/o citoplasmtica, que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variacin somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no especficas que no generan variacin estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresin gnica. Dichos cambios, denominados epigenticos, son tambin considerados por algunos autores como variacin somaclonal mientras que otros slo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica e intercambio de cromtidas hermanas, rearreglos gnicos somticos, elementos genticos transponibles, amplificacin y/o metilacin del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfolgicos (como por ejemplo el hbito de crecimiento, la morfologa floral, etc.) son fciles de evaluar, muchos aspectos de la variacin suceden sin manifestarse en cambios morfolgicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no alterar su actividad biolgica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variacin debe analizarse a varios niveles. Esta variacin depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composicin del medio de cultivo y de la va de regeneracin, donde la embriognesis somtica generara menores alteraciones que la organognesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico permite utilizar este fenmeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia econmica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontr resistencia a la oruga militar en un cultivar que reuna otras buenas caractersticas, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista prctico no resulta una tcnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresin del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin de plantas. Tambin, en algunos casos, puede representar una fuente rpida y fcilmente accesible de variacin para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados y/o de base gentica estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variacin somaclonal fueron registrados en plantas de reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa, pero el fenmeno ha sido ob-

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servado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal La aparicin de la variacin somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la va de regeneracin, la composicin del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duracin del perodo de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtencin de variedades. El nivel de ploida es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrs (Lolium multiflorum) y en papa se observ que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas durante el cultivo de tejidos. La explicacin ms razonable es que los poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantos que tengan su complemento cromosmico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en hbridos interespecficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los hbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum ,

donde el cultivo in vitro gener entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenan slo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecficos suelen utilizarse como metodologa para la obtencin de haploides. Explanto. La variacin tambin puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen clulas con diferente constitucin gentica, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares podran entonces dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organognicos. La utilizacin de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sera una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. Parecera que el cultivo de meristemas aislados sera la mejor opcin para minimizar el riesgo de variacin somaclonal. Sin embargo, esto no debera tomarse como regla. Utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variacin en plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecera inducir, en ocasiones, inestabilidad gentica, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos tan pequeos. La va de regeneracin tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variacin observada en cultivos embriognicos es relativamente menor que

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la que aparece en cultivos organognicos. Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin de los embriones, mayor que la requerida en la formacin de vstagos. Se postula que el gran nmero de genes requeridos para la iniciacin y maduracin de embriones cigticos y somticos impedira la acumulacin de mutaciones deletreas. Sin embargo, se observaron variantes en plantas de caf, apio y caa de azcar regeneradas a travs de embriognesis somtica. En estos casos se observ que algunos fenotipos anormales de embriones somticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz. La mayor parte de la variacin obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. La iniciacin de un callo puede ser anloga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la induccin de enzimas y productos especficos que se inducen tambin en situaciones de estrs. Cuando comienza la divisin celular a partir de tejidos diferenciados, que dar origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosmica. La variacin que ocurre en los nmeros cromosmicos en la primera fase de la induccin del callo sera el resultado de fragmentacin nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los ncleos intactos (ncleos euploides). La naturaleza del callo tambin puede afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias monocotiledneas, el callo representa, a menudo, una masa de rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales, mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenan los explantos. En ocasiones tambin fue posible

observar variacin en plantas obtenidas por regeneracin directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciacin celular y formacin de callo. Medio de cultivo. El estado fsico del medio de cultivo tambin influye en el nivel de variacin obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica o puede incrementar el nmero de plantas albinas. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) han sido sealados como inductores de inestabilidad. Ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de azcares y en el control de la divisin celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Si bien el modo de accin herbicida del 2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripcin que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo utilizado en gramneas como inductor de aneuploidas. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciacin y este proceso sera el generador de los cambios. La fragmentacin nuclear amittica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas tambin se reconoce como causa de aneuploida. Este fenmeno es causado por una relacin especial auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y el ANA (cido naftalenactico) han sido sealados como los responsables de los incrementos en la metilacin de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la desaminacin de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. Las auxinas naturales y sintticas tienen una elevada correlacin con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.

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Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneracin de plantas a partir de protoplastos, realizados en papa, indicaron que la variacin en el tipo y concentracin de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generara variacin gentica. Sin embargo, si el cambio en la composicin de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciacin de los vstagos, se generan elevados niveles de variacin gentica. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de manera que las hormonas induciran la inestabilidad gentica sin ser, necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxgeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensin de oxgeno de las clulas en la superficie del callo es diferente a la de aquellas clulas que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra comportarse como un mutgeno. Tambin existen especies de plantas que producen compuestos mutagnicos durante el cultivo. Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por las propias clulas durante el proceso. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podran afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variacin, aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos. El nmero ptimo de subcultivos podra estimarse empricamente luego de realizar pruebas de fidelidad gentica en las plantas regeneradas a travs de subcultivos subsecuentes. Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin

de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la regeneracin. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboracin con el IBONE, demostr que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relacin lineal entre el nmero de subcultivos y la cantidad de variacin obtenida en plantas micropropagadas de paraso gigante. La variacin en este caso se detect mediante la tnica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002). La deficiencia o exceso de minerales tambin podra afectar la estabilidad gentica in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre, fsforo, nitrgeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genmicos. En la variedad de lino Stortmont Cyrrus se detectaron cambios genticos estables y heredables inducidos por una alta fertilizacin del suelo con fsforo o con nitrgeno. Varias lneas estables obtenidas, fundamentalmente una llamada L y otra llamada S, denominadas genotrofos, se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. 3 Cambios genmicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algn momento esa capacidad de amortiguacin se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subptimo que podra inducir a mecanismos generadores de cambios genmicos. Las bases metablicas de la interaccin entre el estrs y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrs y del estado de diferenciacin de las clulas en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrs que comprende la prdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciacin que se produce durante la induccin del mis-

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mo provoca en las clulas una serie de procesos metablicos que resultan en reordenamientos genmicos que podran dar lugar a fenotipos alterados. Entre las alteraciones genticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones gnicas, cambios cromosmicos que involucren la estructura o el nmero de los cromosomas y activacin de elementos genticos transponibles. Tambin existen anomalas, como el intercambio entre cromtidas hermanas o el crossing over somtico, que pueden alterar su frecuencia de aparicin en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Varias hiptesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones estructurales y numricas, los cambios en la metilacin y las mutaciones gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos. Tal mecanismo podra afectar la expresin gnica y la estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteracin en los patrones de metilacin. Esta hiptesis establece que el estrs inducido por el proceso de cultivo in vitro, al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucletidos, provoca alteraciones en los patrones de metilacin del ADN. Estas alteraciones podran afectar la expresin de genes especficos, incluyendo elementos transponibles y/ o podran afectar la estructura de la cromatina de una manera ms global, involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. Los cambios en la metilacin del ADN podran estar relacionados con la replicacin tarda de la heterocromatina, que, en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosmica. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilacin no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilacin encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. Esto podra indicar que la variacin en metilacin no es una respuesta general a todos los estreses.

El cultivo de tejidos podra representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrs que podra inducir una respuesta nica y un perfil particular de mutacin. Un posible efector de esta variacin en la metilacin sera la alta concentracin de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las clulas a crecer en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en pices de raz de echalote y tambin en cultivos de clulas humanas. Las auxinas podran ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Se cree, adems, que los cambios en los modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios. En este sentido, en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genmico. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromticas, de manera que parecera que la variacin somaclonal no es al azar y que habra loci especficos que tendran mayor tendencia a la mutacin. Los cambios estructurales que no estn asociados a cambios en el dosaje gnico o a cambios en la regulacin suelen pasar desapercibidos fenotpicamente, pero pueden causar infertilidad. Por otra parte ocurren tambin cambios genmicos que involucran alteraciones en el nmero de cromosomas, como aneuploidas y poliploidas. La poliploida es el ms comn de estos fenmenos y estara relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploida puede surgir por segregacin desigual en la mitosis o por fragmentacin nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el nmero cromosmico pueden afectar el fenotipo a travs de dosajes gnicos alterados. En papa, por ejemplo, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploida o por duplicacin cromosmica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotpico. Los cambios pueden ocurrir tambin en el genoma de los plstidos y las mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauracin parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestriles obteni-

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das in vitro. Tambin puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestriles de maz con citoplasma T (susceptibles a Helminthosporium maydis), que condujo a la reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderan con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variacin debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramneas. El anlisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras revel la presencia de deleciones y rearreglos. Si bien parecera que los tejidos somticos son menos sensibles a la variacin, tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. Como puede apreciarse a travs de los casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variacin somaclonal. Como se mencionara anteriormente existen, adems, variaciones epigenticas, que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilacin del ADN y de amplificaciones gnicas, provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. Caractersticas tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variacin. La comprensin de los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal ayudara a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrs y permitira definir cmo los mismos actan en los procesos de evolucin (Kaeppler et al., 2000). 4 Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y diversos, y probablemente actan simultneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genmicas generadas por cultivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de inters y, desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios

bsicos acerca de la variacin y el posible control de la misma. La ocurrencia de variacin somaclonal puede detectarse con marcadores fenotpicos, bioqumicos y moleculares. La correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmicos es un requisito relevante para su implementacin en los programas de mejoramiento. Se citan a continuacin algunos ejemplos de la utilizacin de marcadores de varios tipos en la evaluacin de la variacin somaclonal.. La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigacin. El examen visual y la utilizacin de un analizador de imgenes posibilitaron la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum Ro. Plantas de (man) presentaron variaciones epigenticas en altura, tamao de hojas, nmero y peso de semillas. El cultivo in vitro de yemas de anan dio como resultado plantas que exhiban cambios estables en el tamao de frutos, tasa de proliferacin de vstagos y color y textura de las hojas; el cultivo de tejidos de violeta africana, variedad Crimson Frost, result en un 67% de variacin en el color de las flores de las plantas regeneradas. A nivel fisiolgico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de clulas y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs variables, entre otros, tanto para cereales como para plantas frutales. La mayora de estos estudios se basaron en la implementacin de una alta presin de seleccin durante la etapa de regeneracin celular mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, tales como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el nmero y estructura de los cromosomas. De esta manera podran detectarse translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones. Los cambios cariotpicos constituyen una fuente importante de variacin que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosmicos. Por esto

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mismo existen otras tcnicas que estiman cambios cariotpicos con mayor eficiencia, como por ejemplo el bandeo cromosmico. Esta tcnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4), donde permiti detectar rearreglos importantes en individuos donde el nmero cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que podra aportar informacin til para detectar cambios genticos estructurales. Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variacin en plantas de Populus tremuloides regeneradas a travs de callos. Esta variacin fue detectada mediante electroforesis en geles de almidn utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones electroforticos permitieron caracterizar a las plantas fenotpicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otros casos el anlisis isoenzimtico no permiti detectar variacin. El estudio de lneas de callos derivadas de embriones cigticos y de embriones somticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimticos no evidenci la presencia de variacin somaclonal en 25 loci analizados. Los patrones isoenzimticos de lneas isognicas de Trifolium pratense L. que diferan en su capacidad de regeneracin, resultaron idnticos para los sistemas de peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas. Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer informacin til acerca de la variacin generada in vitro. Sin embargo, se estn analizando los productos de genes expresados, cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiolgicos. Por otro lado, slo se transcribe y traduce una pequea proporcin del genoma. Por ello, los mtodos de anlisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha informacin, ya que las secuencias de ADN son

esencialmente las mismas en todas las clulas vivas de la planta, independientemente del estado fisiolgico o de desarrollo de las mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad gentica debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenolgicos de las plantas. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callognesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad gentica en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies , Quercus suber L.y Panax notoginseng. En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfolgicas y moleculares, pudindose discriminar plantas normales de variantes morfolgicas mediante la combinacin de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociacin, probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor nmero de cebadores. En Pelargonium x hortorum Ro el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la deteccin de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimrficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotpicamente diferentes obtenidas por micropropagacin. En otro estudio se observ que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrn de bandas. En este mismo gnero, la tcnica permiti detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicara que la variacin molecular no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa. Existen otros ejemplos que corroboraran esta afirmacin, tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que haban presentado fenotipos florales anormales o el de plntulas micropropagadas de Populus deltoides, donde a travs de la utilizacin de microsatlites se detectaron polimorfismos en plantas

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fenotpicamente normales. Otros marcadores moleculares utilizados con xito para la evaluacin de variacin somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas especficas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col., 1994), tena un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero adems era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que produca menores niveles de un estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres agronmicos positivos del cultivar parental, pero tena un cambio en la produccin de un metabolito secundario que confera resistencia a la oruga. 5 La variacin somaclonal y su aplicacin en el mejoramiento gentico de las plantas La base del mejoramiento gentico es la optimizacin de interacciones gnicas. Para lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (fsicas o qumicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridacin somtica y transformacin gentica. La variacin somaclonal proveera una fuente adicional de variabilidad gentica, utilizable en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera:

que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y vegetativa. Las tasas de mutacin son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 10-9 mutaciones por par de nucletidos por generacin. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica durante el cultivo in vitro permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin gentica. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneracin de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:

Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente para cultivos con base gentica estrecha y

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica. La escasa regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino. Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica. La regeneracin est limitada a genotipos especficos que pueden no ser de mucho inters para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (originados por variacin epigentica). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera cumplir los siguientes requerimientos:

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 Involucrar caracteres agronmicamente

tiles. El nivel de expresin del carcter debe superar al de sus progenitores. El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variacin debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia prctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta ms sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la seleccin de variantes tiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin somaclonal comprenden:

etapa de multiplicacin de semillas, que permitir realizar pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresin del carcter. El programa finaliza con la etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. Una modificacin para la produccin de nuevas variedades est basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan clulas haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gametoclones

a) La obtencin de plantas por cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter deseado. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaclonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la produccin comercial de variantes disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. plantas regeneradas, aquellas que expresen el carcter de inters. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generacin R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta progenies sexuales (en el caso de plantas con metodologa tendra la ventaja de permitir este tipo de reproduccin), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes adems se vuelve a realizar la seleccin para el carc- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronmico buscado, tratando de man- tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las caractersticas favora- diante la exposicin al alcaloide colchicina. Las bles de la variedad. En plantas autgamas, evaluaciones a campo se realizan en forma como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluacin de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de carcter hasta la generacin R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales. tos de las plantas R4 selectas con las lneas b) La seleccin a nivel celular, seleccin parentales a fin de determinar, mediante el anlisis de segregacin, la base gentica del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarcter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses biticos o

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abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneracin de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La seleccin efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Seleccin directa en un solo paso, donde el agente de seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas de la MIC (concentracin m- concentraciones de aluminio nima que produce un 100 % racin de callo en el medio de cultivo al que de inhibicin). - Seleccin en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de centracin del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tin. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a frecuentes. El primero es un mtodo simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las clulas sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la toriran, permitindo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les. A continuacin se citan ejemplos donde estrs seran deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combin la seleccin in vitro con la subsinivel de diferenciacin tisular hubiesen sido guiente regeneracin de plantas: capaces de regenerar plantas tolerantes. La - Produccin in vitro de plantas de arroz eleccin de un mtodo u otro depender de un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones txicas de aluuna indicacin acerca de la reaccin del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas observ la aparicin de plantas resistentes a de la seleccin in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles rentes lneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La induccin y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicaran que CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

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el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones tiles en el genoma de arroz. - Obtencin de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. dianthi permiti, luego de dos ciclos de seleccin, la obtencin de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenci considerable resistencia al patgeno en experimentos de campo. La bsqueda de variantes a nivel celular permitira verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de clulas, con una inversin menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenticos, a la naturaleza quimrica del material, al uso de toxinas no especficas (en el caso de resistencia a enfermedades), a la complejidad del carcter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequa) o a la falla de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian. En ambos casos (a y b) la obtencin de resistencia slo ser posible si sta existe en la poblacin original (entonces el cultivo servira slo para recuperar los genotipos tiles) o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variacin somaclonal fue utilizada para la produccin de variedades comerciales con caracteres agronmicos superiores en diferentes especies. A continuacin se enumera, para cada especie, el carcter agronmico seleccionado y el centro de investigacin responsable de dicho logro: en geranio, aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en batata: calidad de races y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service, USA); en caa de azcar: resistencia a estrs y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-

tre, Fiji); en maz: contenido de triptfano (Molecular Genetic, USA); en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento, respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute, Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary); en mostaza: rendimiento (ICAR, India). Las primeras observaciones de variacin en caracteres morfolgicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de 1968. Diez aos ms tarde se inform en detalle la variacin obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. Tambin se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del tallo y otras caractersticas en alfalfa. En arroz, la variacin somaclonal result en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parmetros morfolgicos, caracteres agronmicos y tolerancia a estreses biticos y abiticos. Pueden mencionarse adems otros ejemplos de variacin somaclonal en cultivos agrcolas de inters, como por ejemplo caa de azcar , donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por fidos. Paralelamente, tambin por variacin somaclonal, se seleccion el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por Sclerospora sacchari. En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosmicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar Russet Burbano, que presentaron resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solana y a la colonizacin por fidos que transmitan el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). Se encontr tambin tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. En sorgo se encontr variacin somaclonal estable para altura, nmero de macollos, mayor produccin de granos y mayor nmero de semillas y tolerancia a suelos cidos y a sequa. La incidencia de variacin somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwn se obtu-

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vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares no haban podido ser mejorados por mtodos tradicionales. No obstante, para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagacin adicionales, que permitieron combinar ambas caractersticas en un somaclon. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variacin somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). Se han detectado tambin caracteres interesantes modificados por esta tcnica para

su explotacin comercial en ornamentales, como por ejemplo variacin en el color de las flores en gerbera, clavel y crisantemo. En gramneas forrajeras puede citarse variacin cromosmica en Festuca arundinacea y pasto llorn ( Eragrostis curvula), albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense, cambios en la morfologa de planta, forma y tamao de hoja y espiga, desarrollo floral, vigor, y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea , variacin isoenzimtica en Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). En el laboratorio de Gentica del Dpto.

Figura 3: Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formacin de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfognesis. C) Estudio histolgico de los mismos callos mostrando clulas embriognicas y D) embriones somticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y tambin F) organognesis. G) Plntula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron frtiles (I). J) Cromosomas en el pice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variacin, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.

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de Agronoma de la UNS se llev a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorn (Fig.3). Se trabaj con varios cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dicho material est en proceso de registracin, y est siendo utilizado en estudios de apomixis. - Dos plantas hexaploides apomcticas a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula , muy promisorios por sus caractersticas forrajeras, que estn en proceso de registro. La variacin in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de protenas de la semilla, como las gliadinas. A nivel fenotpico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de protena en grano sin reduccin del rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano, tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al cido abcsico, color de las glumas, entre otros caracteres morfolgicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. El nico antecedente en nuestro pas de bsqueda de variacin somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas, color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfologa de la planta, detectndose slo una translocacin no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta tcnica no es efectiva para inducir variacin que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996).

7 Lecturas recomendadas
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