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PRCTICA 13
COLORACIN DE LOS TEJIDOS
OBJETIVO.
Obtener las preparaciones de tejidos coloreadas para ser observadas al M/O.
MATERIAL:
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar y rehidratar las preparaciones:
a. 3 baos de Isoparafina .5 min
b. Alcohol de 1003 min
c. Alcohol de 96 3 min
d. Alcohol de 80 3 min
e. Alcohol de 70 3 min
f. Agua destilada 3- 5 min
2. Coloracin.
Seguir los protocolos de cada tincin
3. Deshidratar.
o Alcohol 70 ................................................. 3 min.
o Alcohol 80 ................................................. 3 min.
o Alcohol 96 ................................................. 3 min.
o Alcohol 100 ............................................... 3 min.
Aclarar.
o Isoparafina ................................................... 5 min.
o Isoparafina ................................................... 5 min.
o Isoparafina ................................................... 5 min.
4. Montaje.
Una vez terminado Recoger todo y mantener limpio

Mavi Agudo Escudero

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1 LACAS DE HEMATOXILINA:
La hematoxilina es un colorante natural que se extrae de un rbol hematoxylon
campechianum (palo de Campeche o palo azul de Centroamrica).
Para que la hematoxilina pueda ser empleada como colorante en histotecnologa,
ha de ser oxidada previamente a hematena. Puede ser provocado espontneamente en
contacto con el oxgeno atmosfrico o ser inducido de forma artificial con el uso de
agentes oxidantes qumicos. Lo que se conoce como maduracin de la hematoxilina.
Como regla general para la preparacin de las lacas de hematoxilina, se debe
tener en cuenta que todos los componentes de la frmula han de agregarse en el
orden establecido y deben estar totalmente disueltos antes de aadir el siguiente.

1.1 HEMATOXILINA DE HARRIS:

Es la ms utilizada en la coloracin rutinaria de los ncleos celulares, por su
estabilidad (6 a 12 meses) y facilidad de manejo.
Es una tincin regresiva por lo que requiere diferenciacin cida meticulosa para
obtener la intensidad deseada de la coloracin. La adicin de cierta cantidad de cido
actico glacial a la solucin final de hematoxilina incrementa la especificidad de la
coloracin nuclear y hace necesaria una diferenciacin posterior.
Procedimiento tcnico:
1. Preparacin de la hematoxilina de Harris:
Hematoxilina (cristalizada).1 g
Etanol absoluto..10 ml
Disolver calentando suavemente:
Alumbre potsico o amnico..20 g
Agua destilada.200 ml
Disolver en caliente. Aadir la solucin de hematoxilina y llevar a ebullicin.
Cuando comienza a hervir se aade:
xido de rojo de mercurio..0,5 g
Dejar disolver el xido removiendo lentamente hasta que la solucin adquiera
color prpura. Sumergir inmediatamente en agua fra. Cuando la solucin se haya
enfriado, filtrar y aadir:
cido actico glacial..10 ml
Observaciones:
Filtrar antes de usarla. Almacenar en frasco opaco bien cerrado.
Caducidad 6-12 meses.
Tiempo medio de tincin entre 1 y 2 minutos.

1.2 HEMATOXILINA DE MAYER:

Esta laca es muy selectiva para colorear la cromatina nuclear y, por tratarse de una
tincin progresiva, no requiere diferenciacin posterior. Esto la hace muy apropiada
para el contraste de preparaciones inmunohistoquimicas, ya que el grado de
acidificacin provocado sobre el tejido es mucho menor. Sin embargo, como parte de
una coloracin de conjunto no es del todo satisfactoria, ya que tie dbilmente las
estructuras basfilas extranucleares as como algunos parsitos y microorganismos.

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Procedimiento tcnico:
Preparacin de la solucin de hematoxilina de Mayer:
Hematoxilina..1 g
Agua destilada1000 ml
Disolver la hematoxilina en el agua destilada.
Aadir:
Yodato sdico..0,2 g
Aadir y disolver mediante un agitador magntico (no calentar):
Alumbre potsico o amnico50 g
cido ctrico1 g
Hidrato de cloral50 g
Filtrar.
Observaciones:
El color final de la solucin es rojo violceo.
Almacenar en frasco bien cerrado.
Tiempo medio de tincin alrededor de 10 minutos (coloracin progresiva).

1.3 HEMATOXILINA FRRICA DE WEIGERT:

Estas hematoxilinas frricas son muy tiles para realizar la tincin nuclear cuando
es necesario completar la coloracin con soluciones fuertemente cidas y especficas
para el citoplasma y componentes extracelulares hsticos (fibras conjuntivas, sustancia
ostoide, matriz cartilaginosa, etc.), susceptibles de disolver las lacas convencionales de
hematoxilina que contienen aluminio. Esto ocurre con la mayor parte de las
coloraciones tricrmicas del tejido conjuntivo.
En los que respecta al fundamento bsico de la coloracin, cromgeno y mordiere
se combinan inicialmente entre s y luego se vinculan al tejido.
Procedimiento tcnico:
a) Solucin de stock:
Solucin I:
Hematoxilina cristalizada1 g
Etanol de 95100 ml
Solucin II:
Cloruro frrico anhidro
(FeCl3)...1,5 g
o
Cloruro frrico hexhidratado (FeCl3.6H2O)2,48 g
Agua destilada100 ml
b) Solucin de trabajo: caduca a la semana de preparacin
Mezclar a partes iguales las soluciones I y II. En este momento la
solucin se torna color negroazulado que rpidmante vira a
pardonegruzco.
Preparar en frasco y aadir:
cido clorhdrico concentrado1 ml
Observaciones:
La solucin de trabajo es poco estable, por lo que no debe emplearse ms all de
una semana despus de su reconstitucin.
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El tiempo de tincin con la solucin de trabajo de Weigert es de 10 minutos.
Si la coloracin se prolonga durante ms de 30 minutos siempre ocurre tincin
excesiva que impide visualizar a distribucin de la cromatina. Los ncleos se
colorean con una fuerte tonalidad negroazulada.

2 CARMN.
Colorante natural de color rojo prpura que se extrae de cochinillas hembras
machacadas y secas por calor.
Para la coloracin nuclear el carmn se utiliza en forma da carmalumbre que tie
aproximadamente las mismas estructuras que las lacas de hematena.

2.1 SOLUCIN DE CARMALMBRE.

Procedimiento tcnico.
Alumbre amoniacal.3 g
Agua destilada100 ml
Disolver removiendo lentamente. Aadir:
Carmn (C.I. 75 470).1 g
Llevar a ebullicin durante 15 minutos, enfriar y filtrar.
Aadir 1 ml de formol puro para evitar el enmohecimiento.
Observaciones.
El tiempo medio de coloracin oscila entre 1 y 24 horas, realizndose en agua la
diferenciacin.
Los ncleos se colorean en rojo.

3 FUCSINAS.
Son derivadas del triaminofenilmetano.
Se usan poco como colorantes nucleares, pero son muy empleadas para teir
materiales extracelulares en los mtodos de coloracin tricrmica del tejido conjuntivo
y en algunas tcnicas histoqumicas par glucoprotenas (mtodo del cido peridico de
Schiff) y ADN (mtodo de Feulgen) as como para determinadas cpsulas bacterianas
(tcnica de Ziehl_Neelsen para bacilos cido-alcohol resistentes)
Las bases simples de las que se derivan los distintos tipos de fucsina son incoloras y
reciben el nombre de rosanilinas.

3.1 FUCSINA BSICA.

La fucsina bsica del comercio (rubina o fucsina diamante) es una mezcla de
parafucsina (magenta 0) y fucsina (magenta I).
Procedimiento tcnico.
Fucsina bsica (C.I. 42 510)1 g
Agua destilada.100 ml
Observaciones.
Los ncleos y clulas en mitosis se tien de color rojo prpura.
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4 SAFRANINA.
La safranina es una sustancia de carcter bsico derivada de las azinas que
constituye un excelente colorante de la cromatina a la que tie de color rojo brillante,
por tanto, es de eleccin en la coloracin especfica de los cromosomas. El agente de
eleccin para este caso son los lquidos que contienen cromo o tetrxido de osmio.

4.1 SOLUCIN DE SAFRANINA.

Procedimiento tcnico.
a) Solucin de stock:
Safranina G10 g
Agua destilada..145 ml
Etanol 96%...................................................................155 ml
Mezclar ambos lquidos y a continuacin disolver la safranina.
Almacenar a 4C.
b) Solucin de trabajo:
Solucin de stock da safranina20 ml
Etanol al 50%...............................................................80 ml
Observaciones.
Teir durante 24 horas.
Diferenciar en una mezcla de cido clorhdrico al 1% y etanol absoluto a partes
iguales, controlando al microscopio.

5 EOSINA.
Colorantes citoplasmticos: la eosina Y contiene 4 grupos de bromo y la eosina
B dos tomos de bromo.
Se emplean en solucin acuosa y alcohlica, aunque son ms solubles en agua, pero
la adicin de etanol a las disoluciones de trabajo retarda el proceso de diferenciacin del
colorantes y lo hace, por tanto, menos dificultosos.

5.1 EOSINA ALCOHLICA.

Procedimiento tcnico.
Preparacin de la solucin de eosina alcohlica:
a) Solucin stock:
Eosina Y (C.I. 45 380)1 g
Agua destilada..20 ml
Disolver calentando suavemente y dejar enfriar. Aadir:
Etanol al 95%...............................................................800 ml
b) Solucin de trabajo:
Solucin stock.25 ml
Etanol 80%......................................................................75 ml
Observaciones:
Filtrar antes de su uso.

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La adicin de 0,5 ml de cido actico glacial a cada 100 ml de solucin refuerza
la tonalidad roja del tejido a colorear.

5.2 EOSINA ACUOSA.

Procedimiento tcnico.
a) Solucin stock:
Eosina Y (C.I. 45 380)5 g
Agua destilada..100 ml
b) Solucin de trabajo:
Solucin de stock.1 parte
Agua corriente o destilada...4 partes
Observaciones:
Est comprobado que el empleo de agua corriente provoca una coloracin ms
profunda de las estructuras eosinfilas. En este caso debe aadirse a la solucin
stock algunas gotas de formaldehido puro para garantizar su conservacin.

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Hematoxilina-Eosina.
PROCEDIMIENTO.
1. Isoparafina.............................................................5 min.
2. Isoparafina.............................................................5 min.
3. Isoparafina.............................................................5 min.
4. Alcohol 100 .........................................................3 min.
5. Alcohol 96 ...........................................................3 min.
6. Alcohol 80 ...........................................................3 min.
7. Alcohol 70 ...........................................................3 min.
8. Agua (d) ................................................................3-5 min.
9. Hematoxilina de Harris (comercial o prepararla).. 1 min.
10.Agua corriente .......................................................2 min.
11.Alcohol cido 1%.................................................1 min.
12.Agua corriente .......................................................5min.
13.Eosina alcohlica ..................................................unos segundos
14.Alcohol 70 ...........................................................unos segundos
15.Alcohol 70 ...........................................................3 min.
16.Alcohol 80 ...........................................................3 min.
17.Alcohol 96 ...........................................................3 min.
18.Alcohol 100 .........................................................3 min.
19.Isoparafina.............................................................5 min.
20.Isoparafina.............................................................5 min.
21.Isoparafina.............................................................5 min.
RESULTADOS.
Ncleos teidos de color azul-violceo oscuro.
Citoplasma teido de color rojo-rosceo.

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Tincin de PAS.
PROCEDIMIENTO:
1. Isoparafina.............................................................5 min.
2. Isoparafina.............................................................5 min.
3. Isoparafina.............................................................5 min.
4. Alcohol 100 .........................................................3 min.
5. Alcohol 96 ...........................................................3 min.
6. Alcohol 80 ...........................................................3 min.
7. Agua destilada .......................................................3-5 min.
8. cido Peridico 0,5% ...........................................5-10 min.
9. Lavado en agua destilada ......................................Lavar.
10.Reactivo de Schiff .................................................15-30 min.
11.3x Bao Sulfuroso.................................................2 min.
12.Agua corriente .......................................................5 min.
13.Hematoxilina de Harris .........................................30-60 seg.
14.Agua corriente .......................................................5 min.
15.Alcohol 80 ...........................................................3 min.
16.Alcohol 96 ...........................................................3 min.
17.Alcohol 100 .........................................................3 min.
18.Isoparafina.............................................................5 min.
19.Isoparafina.............................................................5 min.
5.2.1 RESULTADOS.
Ncleos teidos de color azul.
Sustancias PAS+ teidas de color magenta o rojo oscuro (fucsina).
5.2.2 Compuestos PAS+.
Polisacridos simples.
Mucopolisacridos neutros.
Mucoprotenas.
Glucoprotenas de suero, membrana basal y fibras de reticulina.
Glucolpidos como ganglisidos y cerebrsidos.
Algunos pigmentos como el pigmento ceroide y ciertas lipofucsinas

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Tincin de Van Gienson.

Procedimiento.
1. Isoparafina.............................................................5 min.
2. Isoparafina.............................................................5 min.
3. Isoparafina.............................................................5 min.
4. Alcohol 100 .........................................................3 min.
5. Alcohol 96 ...........................................................3 min.
6. Alcohol 80 ...........................................................3 min.
7. Agua destilada .......................................................3-5 min.
8. Hematoxilina frrica de Weigert .10 mins.
9. Lavar en agua corriente 5 min.
10.Aclarar en agua destilada..1 min.
11.Picro-Fucsina 30 60 seg.
12.Secamos con papel de filtro.
13.Lavamos en etanol de 70.
14.Alcohol 80 ...........................................................3 min.
15.Alcohol 96 ...........................................................3 min.
16.Alcohol 100 .........................................................3 min.
17.Isoparafina.............................................................5 min.
18.Isoparafina.............................................................5 min.
RESULTADOS.
Ncleos teidos de color azul o negruzco.
Citoplasmas teidos de color amarillo.
Colgeno de color rojo intenso.
5.2.3 Observaciones.
a. Los lavados con agua tras la solucin de Van Gienson estn
desaconsejados porque la coloracin se disminuye, al menos que los
portas estn colodionados.
b. La sustitucin de la fucsina cida por el rojo sirio no incrementa la
especificidad de la coloracin, pero hace el procedimiento ms
sencillo y reproducible y permite el empleo adicional de luz
polarizada en la interpretacin de resultados.

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Tincin de la Orcena.
Es un mtodo empleado para la coloracin de las fibras elsticas del tejido
conjuntivo. Este mtodo utiliza un colorante natural, la orcena, que se fija, aunque sin
especificidad absoluta sobre las fibras elsticas. La ventaja de este mtodo es su
simplicidad y rapidez.
Colorante especfico: Sol. Alcohlica de Orcena.
Colorante citoplasmtico: Picrocarmn de ndigo.
RESULTADOS.
Fibras y membranas elsticas: color pardo negruzco.
Citoplasma y otras estructuras: verde amarillento.

TINCIN DE CARMN DE BEST.

1. Stock de Carmn de Best.
Carmn ........................................................................................... 2g
Cloruro Potsico ............................................................................ 5g
Hervir 5 min.
Carbonato Potsico ........................................................................ 1g
Agua Destilada .............................................................................. 60ml
Filtrar y aadir NH3 concentrado 20ml (recordar que el amoniaco concentrado es al
20%)

2. Lquido de dilucin.
Amoniaco ...................................................................................... 2vol
Alcohol metlico absoluto.............................................................. 3vol

3. Lquido de diferenciacin.
Alcohol metlico absoluto.............................................................. 20ml
Alcohol etlico absoluto ................................................................. 40ml
Agua destilada
50ml

4. Hematoxilina de Weighert o Harrys.

5. Solucin de trabajo Carmn de Best.
a. Solucin Stock de Carmn ................................................. 2 partes
b. Lquido de dilucin ............................................................ 2 partes
Mezclar en el momento de realizar la tincin.

6. Procedimiento.
1. Desparafinar, colodionar e hidratar.
2. Colorear con hematoxilina de Weighert 15 minutos hemalumbre 3 min.
3. Lavar con agua destilada.
4. Carmn de Best 20 a 30 min.
5. Lavar en solucin 3 hasta que salga todo el rojo.
6. Deshidratar con alcohol absoluto (prolongado).
7. Aclarar y montar.
De esta manera obtendremos un ncleo teido de color azul/negro y el glucgeno de
color rojo.
Mavi Agudo Escudero

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