Unidad 3. Caracterizacion Microbiana

Microbiologa y taxonoma microbiana
Unidad 3. Caracterizacin microbiana
Ingeniera en: Biotecnologa
Programa de la asignatura: Microbiologa y taxonoma microbiana
Clave: 200920416 190920416
ESAD
Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 1


Presentacin de la unidad Nos resulta muy sorprendente que, con muchos avances en conocimientos cientficos y tecnolgicos de los que se disponen en la actualidad, an miles de personas se vean afectadas por el ataque de una gama de bacterias. Hasta nuestros das el mundo oculto de los microorganismos no haba sido descubierto, puesto que su diminuto e inapreciable tamao los hace pasar por invisibles, salvo por las grandes consecuencias que estos ocasionan. El llevar a cabo la caracterizacin microbiana es de vital importancia y tiene el fin fundamental de poder conocer sus caractersticas morfolgicas y fisiolgicas y de esta manera diferenciar las principales tcnicas que existen para estudiar en particular a las diferentes especies, pudiendo estas participar dentro de los ciclos biogeoqumicos del agua, oxgeno, carbono, nitrgeno, azufre. Reaccionan muy diferentes ante agentes qumicos, positivamente con los nutrientes para el crecimiento bacteriano o de manera negativa como con los frmacos que atacan a las bacterias. Propsitos El alumno comprender de qu forma influyen en la vida cotidiana las caractersticas de las bacterias, a que se debe su importancia tanto a nivel industrial como ambiental, donde incorporar los conceptos fundamentales de la microbiologa, medios de cultivo, pruebas y tcnicas bioqumicas, as como caracteres genticos para comparar cualitativamente a las bacterias. Competencia especfica Analizar la caracterizacin microbiana mediante el estudio de tcnicas para determinar las caractersticas apropiadas, segn los propsitos del investigador.
3.1. Caracterizacin microbiana Para poder realizar una identificacin microbiana es necesario identificar sus caracteres morfolgicos, fisiolgicos, serolgicos y qumicos que son los que nos van a dar pauta para poder diferenciar entre una especie y otra, o bien identificarlos si es que an no lo han sido. El estudio de tales propiedades conlleva a la realizacin de experimentos, pruebas y tcnicas para identificar a las bacterias. En la actualidad las tcnicas bioqumicas estn tomando auge como una nueva alternativa para resolver problemas que anteriormente se tenan, estas tcnicas permiten la caracterizacin genotpica bacteriana y proporcionan una posible base objetiva para la identificacin de las especies bacterianas. Una herramienta especifica muy til es como el uso del microscopio para poder observar ms a detalle sus estructuras, ya que como sabemos son microorganismos tan diminutos que no pueden ser observados a simple vista. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 2

Cuando alguien se enferma y presenta variada sintomatologa (tos, dolor de cabeza, fiebre, estornudo, cuerpo cortado) se puede asociar a patologas de un catarro, gripe, resfriado, y en casos ms extremos una neumona, bronquitis y la muy conocida influenza, se acude por consiguiente al mdico para que recete un medicamente que solucione el problema, pero antes que nada l realiza una serie de cuestionamientos para poder llegar a un diagnstico y poder suministrar algn antibitico, ya que existen variadas especies de bacterias que causan los mismos sntomas y se tiene que hacer una serie de pruebas de identificacin para poder proporcionar un diagnstico de la enfermedad que se tiene. 3.1.1. Caracteres morfolgicos Vamos a comenzar aclarando algunos conceptos biolgicos importantes, el trmino morfologa hace referencia a la forma de los microorganismos y con ayuda del microscopio electrnico se han podido estudiar y revelar detalles estructurales de las bacterias. Las bacterias son considerados organismos procariotas a nivel macroscpico, las encontramos en forma de colonias o filamentos que contienen clulas especializadas y de manera microscpica es que tienen dos formas comunes, ya sea la esfrica (cocos) o cilndrica (bacilos, espiroquetas) y dentro de cada una hay subvariedades de formas. Una de las caractersticas principales de estas clulas es que no presentan un ncleo verdadero como los eucariotas, ya que van almacenar su ADN (material gentico o informacin gentica) en una estructura denominada nucleoide, el cual solo es perceptible por microscopia de luz y de material teido con ayuda de un colorante conocido como Feulgen que es el que nos va a indicar la presencia de ADN (Brooks, et al. 2011). Editar de la web http://www.humanhealths.com/bacillus-cereus2/bacillus-cereus.php
Nucleoides de Bacillus cereus teidas con Feulgen. Para poder observar la presencia de la membrana nucleoidal es necesario hacerlo a travs de una micrografa electrnica, a excepcin de los plantomicetos, que son un grupo de bacterias acuticas donde su nucleoide est rodeado por una cubierta nucleoidal formada por dos membranas compuestas de lpidos. Primero debes de saber que para poder diferenciar una clula procariota de una eucariota es que la primera no cuenta con un aparato similar al huso mittico, la regin nucleoidal est llena con fibrillas de ADN. El Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 3

nucleoide de la mayor parte de las clulas bacterianas consiste en una molcula circular nica y continua, que vara en tamao de 0.58 a casi 10 millones de pares de bases, aunque como en todo hay sus excepciones ya que algunas bacterias poseen dos, tres o incluso cuatro cromosomas diferentes. Ahora bien el material gentico que es de forma circular (plsmidos que son pequeas molculas circulares de ADN capaces de existir de forma independiente respecto a los cromosomas del husped o sea que son insertados por los virus) hay dos excepciones que han mostrado poseer cromosomas lineales (op cit.). Brooks, et al. 2011
Corte delgado de clula de E. coli fijada con tetrxido de osmio y fijado ms tarde con acetato de uranilo acuoso, que muestra dos regiones nucleares ocupadas con fibrillas de ADN. Para las bacterias el nmero de nucleoides y tambin el nmero de cromosomas, depende de las condiciones de proliferacin. Con esto podemos ver que las bacterias con rpido crecimiento tienen nucleoides ms grandes por clula que los que tienen crecimiento lento, aunque cuando se presentan varias copias, todas son similares (haploides) (op cit.). Otra caracterstica morfolgica importante es la membrana plasmtica que es la que rodea al citoplasma, esta membrana es el punto de contacto de la clula con el ambiente por ello es la responsable de la relacin de la clula con el exterior. La membrana bacteriana difiere de otra debido a que esta carece de esteroles como el colesterol, aunque contienen molculas pentacclicas, similares al esterol, denominadas hopanoides, que los podemos encontrar en nuestro ecosistema. Estos hopanoides se sintetizan (derivan) a partir de los mismos precursores de los esteroides y estos hopanoides son los posibles encargados de la estabilizacin de la membrana (Prescott, et al. 2000).
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Prescott, et al. 2000
Componentes qumicos de la membrana plasmtica El modelo de mosaico fluido (S. Jonathan Singer y Garth Nicholson) es la estructura de membrana ms aceptada donde diferencian dos tipos de protenas de membrana (op cit.): a) Protenas perifricas: estn dbilmente conectadas a la membrana y pueden eliminarse fcilmente, son solubles en soluciones acuosas y constituyen aproximadamente del 20 al 30% del total de las protenas de membrana. b) Protenas integrales: estn no se extraen fcilmente y son insolubles en soluciones acuosas cuando se eliminan los lpidos. El modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana bacteriana mostrado en la figura siguiente muestra a las protenas integrales (azules) flotando en una bicapa lipdica. Las protenas perifricas (morado) estn asociadas de forma poco firme con la superficie de la membrana interna. Las esferas pequeas representan los extremos hidrfilos de los fosfolpidos de membrana, y las colas onduladas son las cadenas de cidos grasos hidrfobos. Puede haber tambin otros lpidos de membrana, como hopanoides (amarillo). Para que quede ms claro, los fosfolpidos se muestran con un tamao proporcionalmente superior al que poseen en las membranas verdaderas.

Prescott , et al. 2000
Estru ctura de la membrana plasmtica. La membrana plasmtica retiene al citoplasma y lo separa del medio exterior, actuando como barrera selectivamente permeable que va a permitir el paso de iones y molculas particulares, tanto hacia dentro como fuera de la clula, mientras que evita el desplazamiento de otras, por ello no hay prdida de componentes es enciales por exudacin (evaporacin), mientras se facilita el movimiento de otras molculas (Brooks, et al. 2011). Podemos encontrar dentro de la clula algunas sustancias que no puedan atravesar la membrana plasmtica por lo que requieren emplear sistemas de transporte para dicha actividad, dentro de estos sistemas tenemos la absorcin de nutrientes, la excrecin de residuos y la secrecin de protenas. La membrana plasmtica es una estructura importante ya que en ella se desarrollan numerosos procesos metablicos como la respiracin, fotosntesis y sntesis de lpidos y de constituyentes de la pared celular. A su vez esta membrana ayuda a las bacterias a detectar y responder a sustancias qumicas del medio exterior (quimiotaxia), por lo que sin esta membrana no sobreviviran los microorganismos (Solomon, et al. 2008). Dentro de la membrana plasmtica encontramos estructuras comunes una de ellas es el mesosoma que son invaginaciones de la membrana plasmtica, para formar vesculas, tbulos o lamelas y los podemos observar tanto en bacterias gram positivas (ms prominentes) como gram negativas, aunque su funcin exacta se desconoce (Prescott, et al. 2000). La mayora de las estructuras de una bacteria gram positiva se muestran en la siguiente figura, solamente una pequea parte de las protenas de superficie se han incluido para simplificar el dibujo, cuando existen, estas protenas cubren la superficie. Las bacterias gram negativas tienen una morfologa similar.

Prescott, et al. 2000
Morfologa de una bacteria gram positiva. Estos mesosomas suelen situarse a continuacin de los septos o tabiques que dividen las bacterias y algunas veces parecieran estar unidas al cromosoma bacteriano, por lo que se cree que estn involucrados en la formacin de la pared celular durante su divisin o desempear un papel en la replicacin del cromosoma y su distribucin a las clulas hijas, o bien pueden participar tambin en procesos secretorios (op cit.). Como en todo, dentro de las bacterias tambin encontramos sistemas internos diferentes a los mesosomas, ya que los plegamientos de la membrana plasmtica pueden ser extensos y complejos en bacterias fotosintticas, como las cianobacterias y las bacterias prpura, o en bacterias con una intensa actividad oxidativa, como las nitrificantes (utilizan nitrgeno para su metabolismo y lo descomponen), ya que pueden construir agregados de vesculas esfricas, vesculas aplanadas, o membranas tubulares (op cit.). Prescott, et al. 2000
Membranas internas bacterianas. Membranas de bacterias nitrificantes y fotosintticas. a) Nitrocystis oceanus con membranas paralelas atravesando toda la clula. Obsrvese el nucleoplasma (n) con estructura fibrilar. b) Ectothiorhodospira mobilis con un sistema extenso de membranas intracitoplasmticas (x60000). Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 7

La pared celular bacteriana debe su resistencia a una capa compuesta de diversas sustancias conocidas como murena, mucopptidos o peptidoglucano (todos son sinnimos). La mayor parte de las bacterias se clasifican como gram positivas o gram negativas con base en su respuesta al procedimiento de tincin de gram (Brooks, et al. 2011). Madigan, et al. 2009
Diagramas esquemticos de pared celular de bacterias gram positivas y gram negativas. Las paredes celulares de bacterias presentan una capa rgida que es la responsable de la resistencia de la pared celular. En especies gram negativas existen capas adicionales que se sitan en el exterior de sta, dentro de estas especies de bacterias presentan puentes que se establecen por lo general mediante enlaces peptdicos directo entre el grupo amino del diaminopimlico de una cadena y el grupo carboxilo de la D-alanina terminal de otra cadena adyacente. En las bacterias gram positivas el entrecruzamiento se establece mediante un puente interpeptdico cuya composicin vara en cuanto a tipo y nmero de aminocidos de un organismo a otro. Por ejemplo, en una de las bacterias gram positivas (S. aureus), el puente interpeptdico est formado por cinco glicinas. La lisozima es una enzima que destruye al peptidoglucano originando la lisis celular. (Madigan, et al. 2009). Madigan, et al. 2009
Peptidoglucano en E. coli y en Staphylococcus aureus. a) en E. coli y Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 8

otras bacterias gram negativas no se forma puente intermedio. b) el puente intermedio de pentaglicina en S. aureus bacteria gram positivo. Las bacterias gram negativas, adems de peptidoglucano, tienen una membrana externa compuesta por lipopolisacridos, protenas (porinas facilitan la permeabilidad a travs de la membrana externa) y lipoprotenas. El espacio entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa se le denomina periplasma y contiene importantes protenas para las funciones celulares este espacio entre estas dos capas es de aproximadamente 15 nm de anchura y tiene un contenido gelatinoso (op cit.). Otra caracterstica morfolgica y de las ms importantes su movilidad mediante la natacin que es debida a una estructura llamada flagelo que funciona por rotacin (como si fuera la hlice de un helicptero), impulsando a las clulas a travs de un medio lquido (Madigan, et al. 2009). Los flagelos bacterianos son apndices largos y finos que se encuentran libres por un extremo y unidos a la clula por el otro. Como son tan finos (15-20 nm de grosor dependiendo de la especie), un flagelo individual solo es visible por microscopa ptica despus de una tincin especial (ayuda a aumentar su dimetro) (op cit.). De acuerdo a la posicin del o los flagelos que presente la clula, estos pueden ser: sin flagelo (atrico), un solo flagelo (monotrico), un flagelo en cada extremo (anfitrico), grupos de flagelos en uno o en los dos extremos (lofotrico) y flagelos distribuidos sobre toda la superficie de la clula (peritricos) como se esquematizan en las figuras siguientes. Figuras para editar
Formas de flagelos de una bacteria Como pudimos observar en la figura anterior los flagelos tienen forma helicoidal y muestran una distancia constante entre cada dos vueltas o curvaturas adyacentes que se denomina longitud de onda y es constante para cada organismo. El filamento de los flagelos bacterianos se compone de subunidades de una protena llamada flagelina. Un flagelo est constituido por varios componentes. En la base del filamento se halla una regin ms ancha llamada gancho que es la que une el filamento a la parte motora, este motor se ancla a la membrana citoplasmtica y en la pared celular est constituido por un eje central que atraviesa una serie de anillos.

Morfologa de anclaje de los flagelos a una bacteria Gram negativa izq y gram positiva der. 3.1.2. Caracteres fisiolgicos La versatilidad metablica de las bacterias les confiere el gran xito evolutivo, ya que todos los mecanismos posibles de obtencin de materia y energa se encuentran en las bacterias, es como si fuese un coche, es decir cmo se lleva a cabo su funcionamiento, es a lo que se llama fisiologa. Comenzaremos con la funcin de la membrana citoplasmtica que es: a. Da permeabilidad selectiva y transporte de solutos: la membrana citoplasmtica forma una barrera hidrfoba impermeable a la mayor parte de las molculas hidroflicas, aunque existen varios sistemas de transporte de nutrientes que trabajan contra un gradiente de concentracin hacia el interior de la misma y productos de desecho hacia el exterior. Este gradiente de concentracin va a permitir el incremento de la concentracin de nutrientes en el interior de la clula. Existen 3 mecanismos de transporte a travs de la membrana y uno especial: Transporte pasivo no utiliza energa y funciona solo cuando el soluto se encuentra en concentraciones ms elevadas fuera de la clula, sus variantes son la osmosis que es el paso del agua a travs de membrana semipermeable desde una regin de mayor concentracin a otra de menor concentracin y la otra es difusin es el movimiento neto de partculas como tomos, molculas e iones desde una regin de mayor concentracin hacia otra de menor concentracin. Transporte activo es el transporte de una sustancia a travs de una membrana que no depende de la energa potencial de un gradiente de concentracin, requiere ATP como fuente de energa. Muchos nutrientes se concentran ms de 1000 veces como consecuencia del transporte activo, lo que depende de la fuente de energa utilizada: transporte acoplado con iones y transporte con casete unido a ATP.
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Editar de la web http://recursos.cnice. mec.es/biologia/bachil lerato/segundo/biologi a/ud03/02_03_04_02_ 031.html
Transporte pasivo y activo Translocacin de grupo: dicho proceso permite que las bacterias utilicen sus fuentes energticas de manera eficiente al acoplar el transporte con el metabolismo. En este proceso, una protena transportadora de membrana sufre fosforilacin (ruta metablica) en el citoplasma a expensas del fosfoenolpiruvato, la protena transportadora fosforilada se une al azcar libre en la cara exterior de la membrana, es transportada hacia el citoplasma y liberada en forma de carbohidrato unida a un fosfato. Imagina que tu estas en una fiesta y quieres salir pero no sabes cmo as que ves a una chica (o) solo cerca de la salida y le haces la pltica y poco a poco la empiezas a rodear hasta que tu estas ya en la puerta y entonces ah te encuentras a un amigo que va a entrar y corres a saludarlo y te sales junto l.
b. Transporte de electrones y fosforilacin oxidativa que es un proceso de la ruta metablica en el cual se utiliza energa liberada por la oxidacin de nutrientes y fin es la produccin de ATP. Los citocromos y otras enzimas y componentes de la cadena respiratoria incluyen ciertas deshidrogenasas que se ubican en la membrana citoplasmtica. La membrana citoplasmtica bacteriano es un anlogo funcional a la membrana mitocondrial de las clulas eucariotas. c. Excrecin de exoenzimas hidrolticas y patogenia de las protenas.- todos los organismos que dependen de polmeros orgnicos macromoleculares como fuente energtica excretan enzimas hidrolticas que desdoblan los polmeros hasta subunidades lo suficientemente pequeas para penetrar la membrana citoplasmtica. Las bacterias secretan las enzimas directamente al medio externo o en el espacio periplasmtico entre la capa de peptidoglucano y la membrana externa de la pared celular en el caso de las bacterias gram negativas. d. Transporte de enzimas y molculas que participan en la biosntesis de ADN, polmeros de la pared celular y lpidos de la membrana, portar receptores y otras protenas quimiotacticas y otros sistemas sensoriales de transduccin.
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e. Funciones de biosntesis: la membrana citoplasmtica es el sitio de los lpidos transportadores sobre los cuales se ensamblan las subunidades de la pared celular as como de la biosntesis de las enzimas de la pared celular. f. Sistemas quimiotcticos: las sustancias con capacidad de atraccin y repulsin se unen a receptores especficos en la membrana bacteriana. Hay al menos 20 quimiorreceptores diferentes en la membrana de E. coli, algunos de los cuales tambin actan como el primer paso en el proceso de transporte (Brooks, et al. 2011).
La pared celular brinda proteccin osmtica y desempea una funcin esencial en la divisin celular, tambin sirve como preparador para su propia biosntesis. Varias capas de la pared son sitios de determinantes antignicos mayores de la superficie celular y uno de sus componentes lipopolisacridos (LPS) de las paredes celulares de bacterias gram negativas) son causantes de la actividad endotxica inespecfica de las bacterias gram negativas. La pared celular no muestra permeabilidad selectiva, sin embargo, una capa de la pared gram negativa que es la membrana externa evita el paso de molculas relativamente grandes (Brooks, et al. 2011). Aunque la principal funcin de la membrana externa es estructural, una importante propiedad biolgica es que resulta txica para los animales. Estas propiedades txicas se asocian con la capa de lipopolisacridos y en particular con el lpido A. Como ya se mencion anteriormente las bacterias cuentan con un flagelo ahora vamos a ver cmo funciona este en una bacteria gram negativa: el anillo L se inserta en la capa de LPS y el anillo P en el peptidoglucano. El anillo MS se ancla en la membrana citoplasmtica y el anillo C en el citoplasma. En el filamento existe un estrecho canal a travs del cual la flagelina alcanza su destino durante la sntesis del flagelo. Las protenas Mot funcionan como motor flagelar y las protenas Fli constituyen el conmutador del motor. El motor flagelar determina el giro del filamento para propulsar a la clula a travs del medio. Para explicar la rotacin del flagelo se ha propuesto un modelo de turbina de protones. El flujo de protones a travs de la protena Mot puede ejercer fuerza sobre las cargas presentes en los anillos C y MS, haciendo girar el rotor (Madigan, et al. 2009). Ahora de manera general el movimiento flagelar se da de la siguiente manera: los motores rotatorios tienen tpicamente dos componentes principales el rotor y el estator. El motor flagelar, el rotor est compuesto por el eje central y los anillos L, P, C y MS. En conjunto, estos elementos componen el cuero basal. El estator est representado por las protenas Mot que rodean al cuerpo basal y que funcionan generando un par de torsin. El movimiento rotatorio del flagelo lo proporciona el cuerpo basal. La energa requerida para la rotacin procede de la fuerza motriz de protones. El flujo de protones a travs de la membrana citoplasmtica se realiza por el complejo Mot que impulsa la rotacin del flagelo se translocan aproximadamente 1000 protones. Se desconoce en realidad como ocurre esto por ello se propuso el modelo de turbina de protones en donde los protones que fluyen por canales a travs del estator ejercen fuerzas electrostticas sobre cargas de las protenas del rotor que estn dispuestas helicoidalmente. Las atracciones entre las cargas positivas y negativas originan que el cuerpo basal rote a medida que los protones pasan por el estator (Madigan, et al. 2009). Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 12

Otro tipo de movimiento es por deslizamiento en superficies slidas y se da en procariotas mviles carentes de flagelos. Este movimiento se da en bacterias como alguna gram negativas (Myxococcus sp) y otras mixobacterias. Se cree que esto lo hace por medio de la excrecin de un polisacrido que se va adhiriendo a la superficie y la clula se desplaza por traccin. 3.2 Caracteres Quimiotxicos El hablar de quimiotaxis que es un fenmeno que experimentan los microorganismos, en especial las bacterias, van a dar una respuesta dirigiendo sus movimientos de acuerdo a la concentracin de agentes qumicos y nutritivos que hay en el ambiente donde se encuentran. Para entender mejor la quimiotaxia recordemos cuando de nio se asista a la primaria, al escuchar los diferentes timbres reaccionbamos dependiendo de cual fuese la situacin, as los timbrados ms importantes eran la hora de entrada, la hora del recreo y la hora de salida, y por consiguiente se experimentaba una respuesta para cada uno. Si era la hora de entrada se apuraba uno para no llegar tarde y que le pusiesen retardo, si era la hora del recreo se saba que era momento de jugar, comer golosinas y por ltimo el timbre que anunciaba la salida indicando el trmino de jornada escolar. Editar de la web http://www.pintodibujos.com/ 2010/11/recreo-paracolorear.html 17 Nov 11 8am
Por fin la hora del recreo es una analoga a la quimiotaxia. 3.2.1 Fundamentos de la caracterizacin quimotxica Las bacterias como sabes las podemos encontrar en casi todas partes desde lugares donde se presentan gradientes de agentes fsicos y qumicos lo cual los ha hecho evolucionar para responder de modo positivo o negativo a estas variables, lo cual har que la molcula realice movimientos dirigidos denominados tactismos. Dentro de estos tactismos tenemos a uno que es la quimiotaxis que es la respuesta a agentes qumicos y otra no menos importante la fototaxis que es la respuesta a la luz. La quimiotaxis se ha estudiado con detalle en bacterias flageladas y se conoce bastante a nivel gentico acerca de cmo se transmite el estado del medio ambiental externo al conjunto flagelar. Por lo que respecta a este tema nos enfocaremos en la quimiotaxia en bacterias flageladas, aunque tambin se presentan en bacterias deslizantes. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 13

Editar de la web http://www.sciencephoto.c om/media/395331/view y http://www.sciencephoto.c om/media/297239/view 17 de Nov 11 8:10 am
Bacteria E. coli La quimiotaxia ha sido estudiada en gran parte en E. coli que tiene flagelacin peritrica (flagelos distribuidos por varios lugares de la pared celular). Para poder comprender como afecta la quimiotaxis a E. coli debemos centrarnos en el comportamiento de una clula enfrentada a un gradiente qumico de una sustancia. En ausencia de un gradiente, las clulas de E. coli se mueven al azar y realizan carreras mediante las cuales se desplazan hacia delante de una forma suave, y tambin tumbos, mediante los cuales la clula se para y cambia de direccin girando al azar. Durante el movimiento hacia delante en una carrera, el motor flagelar rota en el sentido contrario a las agujas del reloj, el movimiento hacia delante cesa y tiene lugar un tumbo (Madigan, et al. 2009). Madigan, et al. 2009
Quimiotaxis en una bacteria con flagelacin peritrica como E. coli. a) En ausencia de una sustancia atrayente, la clula se desplaza al azar mediante carreras y cambia de direccin mediante tumbos. b) En presencia de un atrayente, las carreras se favorecen y la clula se mueve en la direccin del gradiente positivo de la sustancia atrayente. Tras un tumbo, la direccin de la siguiente carrera ocurre al azar. De este modo, mediante sucesivas carreras y tumbos, la clula se desplaza aleatoriamente por su entorno sin ir a una parte concreta. Sin embargo, la presencia de un gradiente de una sustancia atrayente cambia este comportamiento de movimiento sin sentido. A medida que el organismo capta concentraciones ms altas de la sustancia quimiotactica, las carreras son ms frecuentes y los tumbos ms escasos. El resultado neto de este comportamiento es que el organismo se desplaza por el gradiente hacia concentraciones ms elevadas de la sustancia Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 14

atrayente. Si lo que el organismo detecta es una sustancia repelente opera el mismo mecanismo, pero en este caso es la disminucin de la concentracin del repelente lo que estimula la frecuencia de las carreras y favorece su alejamiento. Madigan, et al. 2009
Movimiento flagelar en procariotas con flagelacin peritrica. En la figura anterior se muestra el movimiento hacia delante se debe a la rotacin de los flagelos en sentido contrario a las agujas del reloj. La rotacin inversa, en sentido de las agujas del reloj, origina una voltereta, y luego, cuando vuelve a producirse una nueva rotacin contraria a las agujas del reloj, la clula se desplaza en una nueva direccin. Por lo mismo que las clulas procariotas son muy pequeas ellas se guan solamente por una comparacin del estado fsico o qumico de su entorno que ocuparon segundos atrs utilizando una serie de protenas denominadas quimioreceptores las cuales se ubican en la membrana. Por lo que dice que las bacterias son capaces de responder a gradientes temporales ms que a espaciales, por lo que podra considerarse como un sistema de respuesta sensorial anlogo al de las respuestas del sistema nervioso de los animales. En bacterias con flagelacin polar (los flagelos se localizan en uno o ambos extremos de la clula) pueden invertir la direccin de rotacin de sus flagelos e invertir as el sentido de movimiento, aunque algunas giran solamente en el sentido de las del reloj. Aunque este ltimo tiene la facilidad de reorientarse por medio de un flagelo que es de tipo insercin subpolar detiene peridicamente su rotacin y durante ese breve momento reorienta al azar por movimiento browniano (movimiento aleatorio sin razn aparente).
Madigan, et al. 2009
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Movimiento flagelar procariota con flagelacin polar. Las clulas cambian de sentido invirtiendo la rotacin flagelar o bien, en el caso de los flagelos unidireccionales, mediante paradas peridicas que permiten la reorientacin. La flecha amarilla indica la direccin del desplazamiento de la clula. 3.2.2 Principales tcnicas La demostracin de la quimiotaxis bacteriana puede llevarse a cabo sumergiendo un pequeo capilar de vidrio, que contenga una sustancia quimiotactica, en una suspensin de bacterias mviles que no contengan dicha sustancia. A partir de la punta del capilar se establece un gradiente en el medio, de tal modo que la concentracin disminuye gradualmente a medida que se aumenta la distancia a la punta del capilar. Cuando el capilar contiene una sustancia atrayente, las bacterias se movern hacia el capilar formando un enjambre alrededor del extremo abierto y, posteriormente, muchas de las bacterias mviles se introducirn en el capilar incluso si contuviera una solucin de la misma composicin que el medio, debido a movimientos al azar. Madigan, et al. 2009
Medida de la quimiotaxis mediante ensayo en tubo capilar Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 16

a) Insercin de un capilar en la suspensin bacteriana. Cuando se inserta el capilar comienza la formacin del gradiente. b) Capilar control que contiene una solucin salina que ni atrae ni repele c) Acumulacin de bacterias en el capilar que contiene una sustancia atrayente. d) Repulsin de bacterias por una sustancia repelente. Sin embargo, si se trata de un compuesto atrayente, la concentracin de bacterias dentro del capilar ser varias veces mayor que la de fuera. Cuando se extrae el capilar despus de un cierto perodo de tiempo, se cuentan las clulas y se compara el resultado con el de un control, se pueden identificar fcilmente sustancias atrayentes y repelentes. Madigan, et al. 2009
Cintica de la acumulacin de bacterias en capilares con varias sustancias. Si el capilar que se inserta contiene una sustancia repelente, la concentracin de bacterias en el capilar ser considerablemente menor que la del control. En este caso, las clulas perciben un aumento en la concentracin del repelente y los quimioreceptores correspondientes influyen sobre el motor flagelar para que la rotacin permita el alejamiento del repelente. Utilizando el mtodo del capilar, es posible analizar si las sustancias son atractivas o repelentes para una bacteria determinada. La quimiotaxis tambin puede estudiarse microscpicamente. Utilizando una cmara de video que capte la posicin de las bacterias a distintos tiempos y marque la trayectoria de cada clula, es posible visualizar este fenmeno. Este mtodo ha sido adaptado a estudios de bacterias quimiotcticas en medios naturales. Se piensa que en la naturaleza los principales agentes quimiotacticos para las bacterias son los nutrientes secretados por clulas microbianas de mayor tamao o por otros microorganismos vivos o muertos. La siguiente figura muestra huellas de bacterias mviles en agua marina al desplazarse por las proximidades de una clula de un alga (mancha blanca en el centro) que fueron detectadas mediante un sistema de videocmara acoplado a un microscopio. Advirtase que las clulas responden positivamente al oxgeno (aerotaxis) que el alga produce por fotosntesis. La velocidad media de las clulas fue de 25 m/segundo. El alga tiene unos 60 m de dimetro.
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Madigan, et al. 2009
Huellas de bacterias mviles en agua marina Otros tipos de tcnicas utilizadas es por medio de preparacin de medios de cultivo con diferentes gradientes de concentracin. 3.2.3 Desventajas Entre las desventajas de esta quimiotaxia es que por ejemplo existen algunos derivados como el Eugenol que es utilizado como agente bactericida en enfermedades infecciosas bucales que cuando las bacterias estn en contacto con esta sustancia mueren. Algunos ensayos para la medicin de quimiotaxis no estn disponibles por lo que no es confiable su reproducibilidad. Foro. Actividad 1. Huella gentica En esta actividad leers el artculo La huella gentica de la seleccin natural
http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/10596/1/ECO_18(1)_03.pdf, que puedes

descargar desde el aula; el cual te servir de detonador para entablar una charla en el foro que lleva el nombre de esta actividad. Discute acerca de cmo la caracterizacin bacteriana contribuy al conocimiento de la evolucin de los microorganismos. Una vez que hayas ledo el artculo dirgete al foro y participa a partir de las preguntas que se te plantean. Tema. 3.3. Pruebas Bioqumicas La extrema diversidad que existe entre las bacterias se ve reflejada ms intensamente en sus propiedades fisiolgicas y bioqumicas que en la forma que estas presentan. Aunque parece sencillo explicar la morfologa bacteriana, las caractersticas bioqumicas y fisiolgicas estn basadas en la qumica de los componentes estructurales de la clula Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 18

bacteriana, por lo que se consideran de gran utilidad en la descripcin de los microorganismos. Se necesita conocer detalladamente que cambios sufren las bacterias durante los procesos metablicos, como es que se llevan a cabo las reacciones bioqumicas, que enzimas intervienen y cules son los productos intermedios que se generan. Editar de la web http://aexbe.es.tl/Nuevo-.-Pruebas-bioqu%EDmicas.htm 24 Nov 11
Tubos de ensaye con cultivo microbiano y su reaccin ante las pruebas bioqumicas La figura anterior muestra la forma de expresar una respuesta ante las pruebas bioqumicas o medios de cultivo especiales para obtener alguna especie en particular de bacteria. El cambio o vire de color significa que reaccionan positivamente o favorable a la produccin de una enzima, fermentacin de lactosa, produccin de indol, entre otras. Fundamentos de la caracterizacin por pruebas bioqumicas Los microorganismos se suelen cultivar en medios que generalmente contienen sustancias nutritivas especficas o sustratos los cuales se incuban y despus de cierto tiempo el cultivo se examina para ver los cambios bioqumicos que han ocurrido. Al observar en el microscopio los cultivos microbianos solamente permite visualizar como estn distribuidos en varios grupos los microorganismos basados exclusivamente en su forma, sin embargo cada grupo presenta una extrema diversidad de tipos basndose en su actividad bioqumica, serolgica y su poder patgeno. Para poder estudiar a fondo los microorganismos es fundamental la obtencin de un cultivo puro y despus realizarle una serie de pruebas bioqumicas, ya que las bacterias reaccionan de modo distinto a los diversos mtodos que existen y tales reacciones son tiles para clasificarlas.
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Editar de la web http://estructurayfuncio ncelularbacteriana.wiki spaces.com/Tinciones+ de+microorganismos 24 Nov 11
Ejemplos de bacterias teidas vistas al microscopio electrnico En la unidad anterior se estudi la forma de obtener cultivos puros a partir de una serie de cultivos bacterianos y de materiales que se suponen contaminados por grmenes patgenos, mediante una serie de resiembras con ayuda de un asa bacteriolgica que tiene un alambre de platino, la cual es pasada al fuego para esterilizarla y as evitar la contaminacin de cepas. 3.3.2. Principales tcnicas En la actualidad al convivir con una gran mayora de microorganismos, es de gran utilidad el poder identificar que especies intervienen negativamente en una actividad o de manera benfica, ya que es de gran importancia para entender de qu forma atacarla o explotarla. Para llevar a cabo la identificacin bacteriana es necesario procesarlas a nivel de laboratorio conocer tanto sus caractersticas morfolgicas, la reaccin que presentan a la tincin de Gram, agrupacin y morfologa de las colonias, reacciones metablicas como la produccin de enzimas, entre otras. Uno de los mtodos ms usados es la utilizacin de colorantes para teir a las clulas y facilitar su observacin. Los colorantes son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante tiene afinidad por determinados componentes celulares. Muchos colorantes que se utilizan qumicamente sus molculas estn cargadas positivamente, es decir son bsicos o catinicos, por ejemplo el jugo de limn o la coca-cola son cido y por lo tanto estn cargados negativamente a diferencia del sudor o la sal de mesa que son salados (bsico) y tienen carga positiva. Para llevar a cabo las tinciones de muestras bacterianas se requiere llevar los siguientes procesos: 1. Realizar un frotis y fijarlo 2. Aplicar un colorante 3. Decolorarlo con alcohol puro (96%) 4. Lavarlo con agua. 5. Aplicar otro colorante de contraste. 6. Observarlo al microscopio electrnico. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 20

Me todologa de tincin de bacterias Para la preparacin de los frotis se necesita un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, en donde se va a colocar una gota de la muestra bacteriana que se va a teir en el caso de que sea lquida o toma un hisopo hacindolo pasar sobre el cultivo, el hisopo se parece a un cotonete con los que usualmente se limpian los odos. La muestra se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de una flama hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme, de esta forma se evita contaminacin de la muestra. Posteriormente se realizan los pasos siguientes que corresponden para cada tincin que se va a llevar a cabo. A continuacin se muestra una serie de tinciones y pruebas bioqumicas que se emplean en los test rutinarios para la descripcin e identificacin de las bacterias. Tincin de Gram: este tipo de tincin revela la forma de la clula bacteriana, su agrupacin y grupo taxonmico al que pertenece ya sea Gram positivo o Gram negativo. La tincin de Gram fue introducida en el ao de 1884 por el dans Christian Gram, para teir a las bacterias. En la actualidad es una tcnica comnmente utilizada que consiste en teir la muestra bacteriana (frotis) con el colorante violeta de genciana, someterla a la accin mordiente de lugol, lavar con alcohol puro (96%) hasta eliminar el exceso de colorante y teir luego con un colorante de contraste, como la fucsina bsica o safranina. Las bacterias que retienen la violeta de genciana se llaman Gram positivas (Gram +) y las que se decoloran y se tien en rojo por el colorante de contraste son Gram negativa (Gram -). Edicin propia basndose en el de la web http://pathmicro.med.sc. edu/fox/gram-st.jpg 24 Nov 11
Tincin de Gram en bacterias bacilares Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa
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La figura anterior muestra la reaccin ante la tincin de gram de las bacterias bacilares. Las gram positivas aparecen teidas de color morado mientras que las gram negativas de color rosa. Esta diferencia en respuesta a la tincin de Gram se debe a la estructura de su pared celular como ya se especific anteriormente. Despus de la tincin con el colorante bsico (cristal violeta o violeta de genciana), se le agreg el alcohol el cual decolora a las clulas gram negativas pero no a las gram positivas y por ltimo antes de observarlas al microscopio se tien con un colorante de contraste (safranina) para que se pueda visualizar perfectamente. Algunos ejemplos de bacterias que reaccionan a la tincin de Gram positivo son: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Micrococcus sp, Clostridium perfringens, C. septicum, Listeria sp, Actinomycetes israelii, Nocardia sp. Ejemplos de bacterias que reaccionan a la tincin de Gram negativo son: Neiseria meningitidis, Moraxella sp, Acinetobacter sp, E. Coli, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Fusobacterium sp. Tincin de Ziehl-Neelsen: este tipo de tincin es esencialmente para aquellas bacterias cido-resistentes como el bacilo que causa la tuberculosis. Resulta difcil teirlas, pero una vez que el colorante ha penetrado en la bacteria, las cuales lo conservan despus del tratamiento con cido diluido. La propiedad de resistencia se debe tanto que en la capa de su membrana celular y dentro de la clula (citosol) poseen lpidos. Se lleva a cabo realizando el frotis habitual, salvo que este se fija por calor, se cubre la preparacin con fucsina fenicada, se calienta hasta producir vapores (aprox. 3 minutos), se decolora con alcohol-clorhdrico hasta que las partes ms finas no tengan colorante y las ms gruesas tomen un color rojizo. Despus se le coloca una tincin de contraste con azul de metileno (1minuto), se lava con agua y seca para por ultimo observarlas al microscopio. Las bacterias cido-resistentes se tien en rojo y las clulas y otras bacterias en azul. Editar de la web http://www.auxiliare senfermeria.net/20 11/07/la-tincionparamicobacterias.html Bacilo causante de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Tincin de azul de metileno: para teir a las bacterias se emplea una mezcla de azul de metileno, alcohol etlico e hidrxido de potasio (KOH), la cual se vierte sobre la muestra bacteriana y se deja actuar de 3 a 5 minutos lavndola posteriormente con agua y se observa al microscopio electrnico. Tincin de capsulas: las capsulas de las bacterias son frgiles, por lo que nos se tien Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 22

con los mtodos corrientes, se utiliza una solucin de colorante cristal violeta que se calienta y despus se realiza un lavado con sulfato de cobre. La capsula bacteriana se tie de color azul plido, mientras que la clula y su interior aparecen teidas de color azul obscuro. Tincin de Esporas: algunas especies de bacterias producen intracelularmente estructuras especiales llamadas endosporas, que son clulas diferenciadas resistentes al calor, agentes qumicos y radiacin. Funcionan como estructuras de supervivencia para proporcionar al organismo resistencia a condiciones adversas como temperaturas extremas, desecacin, limitacin de nutrientes. Los gneros ms estudiados con esta tcnica son Bacillus y Clostridium. El mtodo de Schaeffer y Fulton es habitual para teir esporos, se cubre el frotis con verde malaquita en solucin acuosa dejndolo reposar media hora, despus se calienta hasta observar vapores durante medio minuto, eliminar con agua el exceso de colorante y por ltimo aplicar safranina. Los esporos retienen el color verde y las partes vegetativas se tien de rojo. Editar de la web http://bacillus8.blogspot.com/ 25 Nov 11
Bacillus subtilis, observe los esporos teidos de verde Tincin de flagelos: los flagelos de las bacterias son invisibles en las preparaciones corrientes, por lo que solo pueden visualizarse con tinciones especiales. Los flagelos se observan en cultivos bacterianos recientes (12-18 horas), en un tubo con 5 ml de caldo nutritivo, se cultiva la muestra procedente de la placa de agar hasta que se observe una ligera turbidez, se coloca en la estufa a 37C durante 1 hr. Posteriormente se colocan 2 o 3 gotas de la muestra sin mezclarlas ni extenderlas, se flamea en la parte azul de la llama y se deja secar al aire. Para la tincin se ocupa una mezcla homognea en agua destilada de fucsina bsica, alcohol etlico, cido tnico y cloruro de sodio. Se coloca el colorante a la muestra dejndolo actuar de 5 a 15 minutos hasta observar un precipitado y se lava para finalmente observarse al microscopio electrnico. Observndose los flagelos de color rosa o rojo y el resto de la clula es de color rosa tenue o bien sin color. La tincin de Feulgen es una tcnica para teir nucletidos, fue descubierta por Robert Feulgen, se basa en la hidrolizacin del DNA por medio de una solucin diluida de cido clorhdrico (HCl) donde se van a liberar las bases puricas del ADN. Prueba de Catalasa: este tipo de prueba bioqumica es muy til para observar la Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa
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presencia de la enzima catalasa que se encarga de descomponer el perxido (H2O2) en oxgeno y agua, se localiza en las bacterias que son aerobias y anaerobias facultativas. El mtodo usual es realizar un frotis, agregarle una gota de perxido, si se visualiza la formacin de burbujas el resultado es positivo, mientras que si no sucede de lo contrario el resultado es negativo. Una especie que reacciona positivamente a la catalasa es Penicillium simplicissimum. Prueba de Oxidasa: esta prueba comnmente se utiliza para determinar la enzima citocromo-C-oxidasa, entre algunos gneros que resultan positivos a esta prueba destacan Pseudomonas sp, Neisseria sp, Moraxella sp, Vibrio sp, Aeromonas sp. Se lleva a cabo para determinar la oxidacin en presencia del citocromo C. Usualmente se ocupan discos de papel de filtro, una caja petri, reactivo de oxidasa (solucin de NNN'N', tetrametil, 1-4 fenilendiamina). Se coloca un disco inmerso de reactivo oxidasa que se pone sobre la muestra bacteriana, inmediatamente si la reaccin se hace positiva indica un color azul-violeta intenso, de lo contrario la prueba ser negativa. Prueba de Indol: se prepara utilizando usando caldo triptfano y se observa la produccin de indol. Se inocula el medio y se incuba durante 2 das y pasado el tiempo se utiliza el reactivo de Kovac para evidenciar la prueba. Se lleva a cabo cubriendo el medio con 2 ml de cloroformo, seguido de 2 ml del reactivo de kovac, una reaccin positiva denota la aparicin de color rosa o rojo intenso en la capa de cloroformo, de lo contario la prueba es negativa. Editar de la web http://www.joseacortes.com/galeriaimag/ microorganismos/indol.jpg
Forma de observarse la prueba de Indol Voges-Proskauer y Rojo de Metilo: se basan principalmente en la determinacin de acetoina que es un producto final de la sntesis de la glucosa. La acetona es tambin conocida como butanodiol o acetil-metil-carbinol. Estas pruebas se asocian, ya que permiten la identificacin de enterobacterias que son microorganismos anaerobios facultativos. Para llevar a cabo estas pruebas se necesita de un medio de cultivo caldo de Clark y Lubs que tenga 3 das de inoculacin, pasado el tiempo se separa en dos muestras, una para cada ensayo correspondiente. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 24

Rojo de metilo al tubo se le aaden de 4-5 gotas de reactivo indicador Rojo de Metilo, se agita para homogeneizar y se observa la coloracin que se obtuvo, ser positiva si cambia a un color rojo y negativa si permanece amarillo. Voges-Proskauer a la otra muestra del tubo de cultivo se le aade una mezcla del reactivo A Voges-Proskauer que contiene alfa-naftol 5% en etlico absoluto observando que el medio adquiere un aspecto lechoso y reactivo B de Voges-Proskauer hidrxido de potasio (KOH), se observara que desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente. La prueba se torna positiva cuando en menos de cinco minutos aparece un color rosadoviolceo que inicia en la parte superior del tubo y si no hay coloracin alguna la pruebas es negativa. Editar de la web http://www.joseacortes.com/galeriaima g/microorganismos/rojo_metilo.jpg
Visualizacin de la prueba rojo de metilo. Adems de las tinciones y las pruebas antes mencionadas existen medios de cultivo que van a funcionar como evidencia de crecimiento de alguna especie bacteriana muy en particular, entre los que destacan: Citrato de Simmons: este tipo de medio se emplea para la diferenciacin de cepas de E. coli fecal de las del grupo aerogenes las cuales crecen tambin en este medio ya que se utiliza citrato. Tambin existen otras especies como las del gnero Salmonella, en especial S. typhimurium, S. typhosa y S. paratyphi que utilizan citrato como nutriente para crecer. El agar Nitrato: sirve para identificar bacterias que realizan la reduccin de los nitratos a nitrito, se aade una solucin al tubo con cultivo microbiano, esta es una mezcla de cido actico ms cido sulfanlico y cido actico con alfa-amidonaftaleno. Si al observar el tubo de color rojo-rosado indica la presencia de nitritos. Medio SIM: este medio tiene tres finalidades en las muestras bacterianas, sirve para comprobar hidrgeno sulfurado, Indol y motilidad. Se lleva a cabo una siembra por picadura, donde la aparicin de una ligera zona negra a lo largo del trayecto de la siembra, se considera una produccin positiva de hidrgeno sulfurado. La motilidad se nota por el crecimiento en forma de limpia tubos alrededor del trayecto central de la picadura., las bacterias inmviles no penetran en el agar semislido y por ultimo para comprobar la formacin de Indol se utilizan tiras de papel empapadas de solucin saturada de cido oxlico y se corrobora con el reactivo de Kovac. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 25

Tarea. Actividad 2. Pruebas bioqumicas
En esta actividad comparars entre las principales pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de bacterias. Realiza lo siguiente: 1.- En un documento de texto elabora un cuadro comparativo de las principales pruebas y tinciones bioqumicas haciendo nfasis en la importancia de cada prueba. 2.- Apoya tu trabajo con imgenes y s cuidadoso con la ortografa. 3.- Guarda tu documento con la nomenclatura MTM_U3_A2_XXYZ y envalo a tu Facilitador(a) mediante la seccin de tareas.
Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, ya que tu Facilitador(a) puede detectar esta situacin sin dificultad, tu formacin exige que todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad, con el fin de que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional.
Tema. 3.4. Caracteres Genticos Habrs escuchado hablar de la ingeniera gentica, te preguntaras a que se refiere, es una ciencia auxiliar de la gentica que se encarga del uso y aplicacin de tcnicas in vitro para modificar el material gentico de los microorganismos en el laboratorio, dicho material gentico (ADN) puede despus reinsertarse en el microorganismo de donde se extrajo o bien en otra especie de inters. Recientemente han tenido gran auge los anlisis moleculares genticos. Ha pasado por tu mente hacerte la pregunta del por qu no tienes algn rasgo que te identifique con tus progenitores y has encontrado respuesta alguna. He aqu donde acta la gentica que es una ciencia auxiliar de la biologa que se encarga del estudio de la herencia, de cmo es que las caractersticas fenotpicas y genotpicas se van a transmitir de una generacin a otra (herencia gentica). Esta ciencia se inici con el monje austriaco John Gregor Mendel (1822-1884), que es considerado el padre de la Gentica, experiment con guisantes (chicharos) con los cuales llevo a cabo una serie de experimentos respecto a su apariencia fsica cruz organismos con caractersticas fsicas diferentes con los que demostr la transmisin de los caracteres genticos. Aunque sus experimentos no fueron tomados en serio, fue hasta Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 26

1900 que sus trabajos se volvieron a retomar y posteriormente durante las dcadas siguientes sirvieron de base para los genetistas que se dedican a estudiar la transmisin de los caracteres y la expresin de la informacin gentica. En la actualidad son de gran utilidad, por ejemplo sabrs que en criminologa son esenciales para esclarecer crmenes, muy importantes en pleitos de paternidad, para erradicar y combatir enfermedades, mejoramientos de semillas y de especies animales y la ms importante dentro del estudio de los microorganismos para su identificacin. 3.2.1. Fundamentos de la caracterizacin gentica Las estructuras que son esenciales para la gentica microbiana, se encuentran dentro de la clula, especficamente estamos hablando del cromosoma bacteriano, donde se localiza el cido desoxirribonucleico (ADN o DNA). El ADN es el material gentico que se utiliza para guardar la informacin gentica, supongamos que es el disco duro de una computadora, sabes pues que en l puedes guardar toda la informacin que se genera al trabajar. Una secuencia de ADN es simplemente la unin de miles de nucletidos. Un nucletido est formado por una azcar de 5 carbonos (pentosa) llamada desoxirribosa, un grupo fosfatado y una base nitrogenada, que en este caso se dividen en bases puricas como la adenina (A) y guanina (G) y en bases pirimidicas que son timina (T) y citosina (C) (Solomon, et al. 2008). Cada especie microbiana tiene una secuencia gentica diferente, lo cual le confiere caractersticas que las diferencian y son de suma importancia para la identificacin bacteriana. Se tiene conocimiento de la secuencia gentica de algunas bacterias, pero en general la mayora contienen entre 500 a 6000 genes. En 1949 Edwin Chargaff y sus colegas de la Universidad de Colombia llegaron a determinar la composicin de bases de ADN de diversos organismos y tejidos, entre los que destacan el de la bacteria E. coli que contiene 26.1 % de adenina, 23.9 % de timina, 24.9 de guanina y 25.1 % de citosina (Solomon, et al. 2008).
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Editar del Solomon et al. 2008
Estructura de un nucletido que forma parte del DNA
3.2.2. Principales tcnicas En la actualidad se han secuenciado completamente los genomas de muchas bacterias, lo que ha revelado el nmero y la disposicin de los genes que poseen. La clonacin y la secuenciacin han revolucionado el estudio de la estructura y la funcin del genoma en todos los organismos. Los procesos de transformacin, transduccin y conjugacin se han utilizado para mapear la localizacin de los genes en un cromosoma bacteriano (Madigan, et al. 2009). Se han desarrollado y mejorado tcnicas para auxiliar a la ingeniera gentica, dichas tcnicas se basan en la capacidad para cortar el ADN de inters en fragmentos especficos y purificar dichos fragmentos para su posterior manipulacin. Entre las herramientas bsicas destacan: enzimas de restriccin, separacin de cidos nucleicos por electroforesis, hibridacin de cidos nucleicos, las sondas de cido nucleico, clonacin molecular y vectores de clonacin. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 28

Editar de la web http://es.dreamstime.com/f otograf-iacutea-dearchivo-electroforesis-delgel-de-la-dnaimage2223462 y http://betbettybea.blogspot .com/2011/11/electroforesi s.html Electroforesis en gel Las imgenes anteriores muestran cmo es que se lleva a cabo una electroforesis en gel. La figura de la izquierda ejemplifica como el investigador coloca con mucho cuidado y con ayuda de una micropipeta la muestra de ADN en los posos del gel de agarosa, se sumerge en bromuro de etidio y se aplica corriente elctrica y posteriormente la imagen derecha es la observacin final de la tcnica con la ayuda de una cmara de luz ultravioleta, donde las marcas son el ADN. Despus de aislado y purificado el DNA se siembra la muestra en una placa porosa de gel de agarosa o poliacrilamida, la cual es sometida aplicndole corriente elctrica. Al aplicarse la corriente lo que va a provocar es que las molculas se van a mover a travs del gel impulsadas por la corriente. Esta tcnica nos permite separar molculas de acuerdo a su peso molecular y carga (positiva o negativa), debido a esto provoca que las molculas pequeas o las de cierta carga se van a mover con mucha mayor velocidad que las molculas grandes. Los cidos nucleicos por naturaleza estn cargados negativamente, por lo tanto se van a dirigir hacia el polo positivo. Durante el siglo pasado se han llevado a cabo experimentos para encontrar la secuencia completa del genoma de varias especies bacterianas, esto implica una serie de trabajo excesivo llevadas a cabo en laboratorios dotados de nuevas tecnologas de obtencin, procesamiento y visualizacin de los microorganismos. Cada organismo tiene una secuencia nica de DNA genmico, excepto los gemelos idnticos. A diferencia de los organismos superiores cuyo material gentico contiene cadenas repetitivas de ADN, las cuales varan en nmero y disposicin respecto a cada especie. El DNA se puede sintetizar in vitro mediante un mtodo en fase slida, donde se obtienen copias de secuencias especficas de ADN y son necesarias para muchas tcnicas moleculares, un mtodo por el cual se sintetizan estas copias in vitro de ADN es la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) fue inventada por Kary Mullis, el cual recibi el premio nobel por su invento (Madigan, et al. 2009). La PCR puede copiar segmentos de ADN hasta mil millones de veces en un tubo de ensayo, un proceso llamado amplificacin, que genera grandes cantidades de genes especficos u otros segmentos de ADN para toda una serie de aplicaciones en la biologa molecular. Imaginemos pues que es una fotocopiadora a la cual manipulamos y Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 29

programamos para que nos de cmo resultado una cantidad especfica de copias de algn documento, al final tendremos pues copias idnticas a la original y bsicamente eso es lo que hace la tcnica de PCR. Utiliza una DNA-polimerasa que copia molculas de ADN de manera natural, no las copia de manera completa, sino que amplifica fragmentos de hasta algunos miles de pares de bases de una molcula de ADN ms grande. La tcnica bsica para el estudio molecular de las bacterias es: i. Cultivar la muestra bacteriana en un medio general. ii. Llevar a cabo un aislamiento para purificar la bacteria. iii. Si es necesario volver a resembrar el microorganismo en un medio especial para evitar contaminacin de cepas. iv. Aplicar una serie de pruebas y tinciones mencionadas en el tema anterior que sirven para identificar la especie bacteriana. v. Teniendo el cultivo puro, seguir incubando hasta obtener varias generaciones. vi. Tomar una masa de microorganismos y centrifugarlos para obtener por diferencia de peso molecular el ADN. vii. Aplicar tcnicas especficas para lo que se requiere conocer cmo, la secuencia de nucletidos, las protenas, los genes. Una herramienta que auxilia para el estudio del material gentico son los microscopios, que con los grandes avances tecnolgicos han ido especializndose ms respecta a los intereses particulares del investigador, entre los cuales destacan los microscopios pticos de campo brillante, de campo obscuro, de fluorescencia, con focal, de contraste de fases, de interferencia, tambin microscopios electrnicos de transmisin, de barrido. Csmidos: son vectores plasmdicos que contienen el sitio cos del genoma lambda (), que genera extremos cohesivos cuando se cortan, son muy tiles en la tecnologa del DNA recombinante, con estos es posible clonar fragmentos de ADN ms grandes, se utilizan para fabricar genotecas de cDNA y son estudiados cuando el gen se expande de 30 a 40 kilobases (kb), es decir miles de bases que componen el ADN. La ventaja que tienen los csmidos, es que es posible clonar fragmentos de DNA forneo ms grandes que los originales. Editar de la web http://books.google.com.mx/books?i d=33GIdnSf56oC&pg=PA338&lpg=P A338&dq=cosmidos&source=bl&ots =zwkb0bRbLw&sig=Yypszx6eqkyxa LXXUhSuT7LgGZE&hl=es&ei=hhzR TuGJJMyFsgKphfm2Dg&sa=X&oi=b ook_result&ct=result&resnum=6&sqi =2&ved=0CEAQ6AEwBQ#v=onepag e&q=cosmidos&f=false y http://geneticamoderna.blogspot.com/2010/08/man ipulacion-genetica.html Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 30

Esquema de un csmido Plsmidos: son elementos genticos que se replican independientemente del cromosoma, forman parte de otro elemento gentico. Existe una inmensa cantidad de plsmidos de ADN de doble cadena molculas de material gentico que la mayora son circulares, no obstante hay algunos que son lineales. Los plsmidos difieren de los virus ya que no causan dao alguno a la clula husped y no presentan formas extracelulares. Los plsmidos se diferencian de un cromosoma bacteriano, ya que los primeros portan solo genes no esenciales y los cromosomas genes que son muy esenciales. En cepas de E. coli se han asilado ms de 300 plsmidos naturales. El DNA de los plsmidos es bicatenario y contienen de 1 Kbp hasta 1 Mbp. Editar de la web http://caibco.ucv.ve/caibc o/vitae/VitaeDos/Articulo s/BiologiaCelular/carcter. htm
Localizacin de un plsmido bacteriano 3.2.3. Desventajas Pero los investigadores se han topado con un gran problema, el cual es que agentes qumico, condiciones del medio ambiente hacen que los genes sufran mutaciones. Una mutacin es aquella que produce cambios en la secuencia nucletida del DNA, no obstante el ndice de mutacin global es mayor que la frecuencia de daos en el DNA, puesto que todos los organismos tienen complejos enzimticos que reparan algunas lesiones que llegase a sufrir el ADN. Otro problema al que suelen enfrentarse es que al momento de cultivar la cepa, esta no se pueda obtener pura, ya que existen especies bacterianas que comparten genticamente secuencias de nucletidos, las cuales con los mtodos de tincin o pruebas no se puedan diferenciar. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 31

Actividad 3. E. A. Plsmidos y csmidos
Esta actividad es un gran reto ya que implica crear un mapa conceptual (MMCC) en el cual reflejars tu dominio del tema anterior, al construirlo describirs las aplicaciones biotecnolgicas de plsmidos respecto a la forma del ADN. Elaborar un mapa conceptual donde apliques la biotecnologa de plsmidos respecto a la forma de ADN.
En un documento de texto o archivo de imagen plasma un mapa conceptual que contenga las siguientes caractersticas:
1.- concepto o idea original 2.- palabras clave 3.- conectores 4.- conectivos y palabras de conexin 5.- conceptos en diferentes niveles en este caso puedes desarrollarlo mnimo en tres niveles De esta manera a partir del concepto o idea de origen ocurre: 1.- desprendimiento de conceptos secundarios 2.- conectores y proposiciones.- conectores son palabras o preposiciones insertas entre dos conceptos y son tiles para producir nuevas proposiciones o enunciados con sentido 3.- enlaces cruzados.- son puentes entre proposiciones dentro de la arborizacin 4.- Jerarquizacin.- es el orden en ascendente-descendente en funcin de la complejidad de los conceptos o proposiciones tratados en la arborizacin del MMCC.
Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, el facilitador puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que desde esta etapa todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad; para que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional. Nota 2: No olvides revisar/consultar la Escala de evaluacin para que puedas guiarte correctamente en el diseo de estructura de tu ensayo y en el proceso de solucin o respuesta de tu Evidencia de Aprendizaje (EA). Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 32

Cierre de Unidad Como te habrs dado cuenta con los temas vistos en esta unidad, la gran capacidad metablica que tienen los microorganismos para reaccionar a las diferentes pruebas y tinciones, as como est involucrado el material gentico para poder estudiar los caracteres del genoma para determinar especficamente la huella dactilar de cada especie y que tan importante son en la actualidad las diversas tcnicas para llegar a la obtencin de ADN purificado y de esta forma conocer ms acerca de estos microorganismos para poder aplicarla en experimentos de gran utilidad para poder erradicar enfermedades, mejoramiento de cepas para produccin de vinos o lcteos e incluso remediar nuestro medio ambiente haciendo en las bacterias que intervienen en los procesos de fijacin del nitrgeno, el tratamiento de aguas residuales. Para saber ms Para corroborar lo aprendido sobre la tcnica de tincin de Gram observar el siguiente video http://www.gefor.4t.com/bacteriologia/tinciondegram.html. Para entender mejor la tcnica de electroforesis en gel ver los siguientes videos http://www.youtube.com/watch?v=sbCusDyYoi0 y http://www.youtube.com/watch?v=WeRwsr5JUwA Para comprender como se lleva a cabo la PCR observar el siguiente video http://www.youtube.com/watch?v=i1o4jYepdxs. Para comprender que son los plsmidos ver el siguiente video http://www.youtube.com/watch?v=RfMTv1km0RU. Fuentes de consulta Bibliografa bsica Gonzlez, G. M. y C. A. M. (2007) Microbiologa ambiental. Corpus. 120 pp. Pidello, A. (2011). Ecologa microbiana. Corpus Willey, J., Sherwood, L. M. y Woolverton, C. J. (2009). Microbiologa. 7a ed. M Graw Hill-Interamericana. Bibliografa complementaria Brooks, G. F., Butel, J. S. y Morse, S. A. (2011). Microbiologa Mdica. 25 ed. Mc Graw Hill. pp 815. Madigan, M. T., Martinko, J. M. y Parker, J. (2009). Brock. Biologa de los microorganismos. 12 a ed. Pearson Adison-Wesley. 1259 pp. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. (2005). Microbiologa. 5a ed. McGrawHill Interamericana. 1236 pp. Solomon, P. E., Berg, R. L. y Martin, W. D. (2008). Biologa. 8a ed. Mc Graw Hill. 1338 pp. Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa 33

Trtora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. (2007). Introduccin a la microbiologa. 9a ed. Mdica Panamericana. 956 pp.
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Unidad 3. Caracterizacion Microbiana

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Microbiologa y taxonoma microbiana

Unidad 3. Caracterizacin microbiana

Ingeniera en: Biotecnologa

Programa de la asignatura: Microbiologa y taxonoma microbiana

Clave: 200920416 190920416

Microbiologa y taxonoma microbiana

Unidad 3. Caracterizacin microbiana

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Ciencias de la Salud, Biolgicas y Ambientales | Biotecnologa

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Madigan, et al. 2009

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http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/10596/1/ECO_18(1)_03.pdf, que puedes

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