18/9/2012

Prof Dr Eduardo Clmaco 2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Culturas em bateladas
CURVA DE CRESCIMENTO

18/9/2012

M E D I D A S D I R E TA S D O C R E S C I M E N T O

M E D I D A S D I R E TA S D O CRESCIMENTO
O crescimento bacteriano pode ser monitorado pela variao: Nmero de clulas Contagem de clulas totais Contagem de viveis

Peso seco total das clulas Peso de algum constituinte celular (ex. protenas)

Contagem de clulas totais

Contagem direta em microscpio

Amostras secas fixadas em lmina Amostras frescas de origem lquida

18/9/2012

Contagem de clulas totais Cmara de Newbauer

Contagem de clulas totais

Cmara de Newbauer

Volume do Quadrante central: 0,1 mm3 = 0,1 L

Volume de cada dos 25 quadrados menores: 0,004 mm3 = 0,004 L

18/9/2012

C CR oE nS tC a IgM en Es NT dO e c P Ol P uU l aLsA v C iI OvN eA i sL Mtodo de semeadura por espalhamento

Mtodo de semeadura em profundidade (Pour Plate)

C CR oE nS tC a IgM en Es NT dO e c P Ol P uU l aLsA v C iI OvN eA i sL

Contagem de UFC (unidades formadoras de colnias)

Clculo

UFC/mL = no de colnias / inculo em mL

18/9/2012

C CR oE nS tC a IgM en Es NT dO e c P Ol P uU l aLsA v C iI OvN eA i sL

Contagem de UFC (unidades formadoras de colnias)

Erros: Placas com excesso de colnias e Placas com poucas colnias

Limites de contagem: Placas com 30 a 300 colnias

Contagens de clulas viveis

Contagem de UFC (unidades formadoras de colnias)

1 mL
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

9 mL de caldo 1/10 1/102 1/103 1/104 1/105

18/9/2012

Contagens de clulas viveis

Contagem de UFC (unidades formadoras de colnias)

Placa a ser contada

UFC/mL = no de colnias x Fator de diluio / inculo em mL

Contagens de clulas viveis

Contagem de UFC (unidades formadoras de colnias)

-Mtodo Direto: Filtrao

18/9/2012

Contagens de clulas viveis

Contagem Direta ao Microscpio

Contagem Direta de Viveis

A grande anomalia da contagem em placas

Fontes de Erros na microscopia

Presena de microrganismos inviveis;

Fontes de Erros na contagem em placas

Quantidade do inculo; Qualidade do meio de cultura;

Erros do operador.

Condies de incubao;
Tempo de incubao.

M E D I D A S I N D I R E TA S D O C R E S C I M E N T O

M E D I D A S I N D I R E TA S D O CRESCIMENTO Medida da TURBIDIMETRIA

Comprimento de ondas: 540 nm (verde) 600 nm (laranja) 660 nm (vermelho) Unidade de medida - DO

18/9/2012

M E D I D A S I N D I R E TA S D O C R E S C I M E N T O

M E D I D A S I N D I R E TA S D O CRESCIMENTO
Medida da TURBIDIMETRIA Curva-padro

Turbidimetria perde a relao com o nmero de clulas em altas concentraes

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Culturas contnuas
Um volume de meio fresco acrescentado assim como o mesmo volume de meio usado retirado de forma contnua. O Quimiostato

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

O Quimiostato
O fluxo de caldo deve ser calculado em funo: 1. Taxa de diluio 2. Concentrao de um nutriente limitante

Nutrio X Populao microbiana

Taxa de diluio X Populao microbiana

CRESCIMENTO POPULACIONAL

EFEITOS AMBIENTAIS NO CRESCIMENTO MICROBIANO

1. Temperatura 2. pH 3. Disponibilidade de gua 4. Disponibilidade de oxignio

Tempo de duplicao (h)

18/9/2012

EFEITOS AMBIENTAIS NO CRESCIMENTO MICROBIANO

1. Temperatura

CRESCIMENTO POPULACIONAL

1. Psicrfilos 2. Mesfilos 3. Termfilos 4. Hipertermfilos

10

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Microrganismos que crescem em baixas temperaturas

Ambientes glaciais no so estreis! Ambientes permanentemente gelados so mais provveis de encontrar vida microbiana do que aqueles que so gelados sazonalmente. Tem maior ndice de ac. graxo insaturado na membrana citoplasmtica, garantindo a sua fluidez. Microrganismos Psicrfilos Microrganismos Psicrotolerantes Psicrfilos: Psicrotolerantes:

Temperatura mnima - <0oC Temperatura tima - <15oC Temperatura mxima - <20oC

Temperatura mnima - 0oC Temperatura tima 20-40oC Temperatura mxima - >40oC

CRESCIMENTO POPULACIONAL

11

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Congelamento X Crescimento

Embora alguns microrganismos so capazes de crescer em ambientes glidos, o congelamento da gua pode limitar o crescimento. Congelamento no contnuo existem bolses de gua lquida. Lquidos hidrossolveis como glicerol e DMSO (dimetilsulfxido) a 10% em caldos protegem a bactria do congelamento e permite a manuteno de cepas a temperaturas extremas (-70 a -196oC)

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Microrganismos que crescem em altas temperaturas

Termfilos temperatura tima > 45oC. Hipertermfilos temperatura tima > 80oC

Na Natureza:
Solo de algumas regies 60oC Esterco e silagem em fermentao 65-70oC Fontes termais 90-100oC Fendas de vapor 150-500oC Fendas hidrotermais (fundo do mar) 350oC

12

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Populao microbiana constituda por termfilos e hipertermfilos No existem eucariotos capazes de sobreviver nestas condies Termfilos e Hipertermfilos possuem mais ac. graxo saturados. Esses microrganismos so muito teis para indstria.

CRESCIMENTO POPULACIONAL

2. pH e crescimento
pH cido
0 Os microrganismos possuem um pH timo para crescimento que pode variar em 2 ou 3 unidades

Acidfilos

5 7

Alcaliflicos

A maioria dos ambientes tm o pH variando entre 5 e 9, portanto a maioria dos microrganismos preferem crescer nesta faixa de pH. Poucos microrganismos so capazes de crescer em pH extremos (abaixo de 2 e acima de 10), sendo chamados extremfilos.

14 pH alcalino

13

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

2. pH e crescimento
pH cido 0 Em geral os fungos so mais acidfilos do que as bactrias Algumas bactrias so acidfilas obrigatrias: Thiobacillus, Sulfolobus, Thermoplasma e Ferroplasma.

Acidfilos

5 7

Alcaliflicos

Essas bactrias so incapazes de crescer em pH neutro, pois sua membrana citoplasmtica se dissolve facilmente provocando lise celular. Bactrias acidfilas so mais encontrados em ambientes vulcnicos. Ex.: Picrophilus oshimae (pH 0,7)

14 pH alcalino

CRESCIMENTO POPULACIONAL

2. pH e crescimento
pH cido
0 Alguns microrganismos so alcaliflicos extremos (pH >10)

Acidfilos

So encontrados em lagos e solos ricos em carbonatos. 5 7 Alguns so de interesse industrial, pois produzem proteases e lipases resistentes a pH alcalinos que podem ser utilizados como aditivos em detergentes domsticos. Como os alcaliflicos produzem ATP a partir da fora prton motora, em ambientes ricos em OH-? Produz a diferena de gradiente com Na+ ao invs do H+

Alcaliflicos

14 pH alcalino

14

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

3. osmolaridade e crescimento
gua livre gua livre de solutos Atividade de gua (aw) = Presso de vapor da soluo / Presso de vapor da gua pura

Atividade de gua (aw) = 0 ~ 1

Processo Osmtico

H2O H2O

Hipotnico

Hipertnico

CRESCIMENTO POPULACIONAL

3. osmolaridade e crescimento
No solo a atividade de gua varia de 0,90 a 1. Ambientes que tem baixa atividade de gua,normalmente apresentam alta salinidade (NaCl). Ex.: gua marinha Halfilo Necessita de alta salinidade para crescer Hatolerante Suportam ambientes com atividade de gua reduzida

15

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

3. osmolaridade e crescimento
Como bactrias halfilas suportam ambientes hipertnicos? Produzindo ou absorvendo algum soluto compatvel e se tornando mais hipertnico

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento
Vrios hbitat da Terra so pobres ou livres de oxignio:

16

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento
Tipos de bactrias em relao ao oxignio

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento
Condies de cultura em relao oxigenao

Aerbios Anaerbios

Incubao em agitao ou injeo de ar esterilizado Incubao em sistemas fechados, utilizao de agentes redutores ou tioglicolato, incubao em jarras de anaerobiose. Meio fervido, acrescentado H2S, procedimentos feitos sob jato de hidrognio ou nitrognio e em cmaras de anaerobiose.

Anaerbios estritos

17

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento

Shaker Jarra de anaerobiose

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento

Cmara de anaerobiose

18

18/9/2012

CRESCIMENTO POPULACIONAL

4. Oxignio e crescimento

Crescimento de cada tipo de microrganismo em caldo tioglicolato

Aerbio obrigatrio

Aerbio facultativo

Aerotolerante

Anaerbio Microaerfilos obrigatrio

19