UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE QUMICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

Caracterizao Qumica, Avaliao Trmica e Atividade Larvicida Frente ao Aedes aegypti do leo Essencial da Espcie Vegetal Aniba duckei Kostermans

TESE DE DOUTORADO

Rogrio de Mesquita Teles Joo Pessoa PB 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE QUMICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

TESE DE DOUTORADO

CARACTERIZAO QUMICA, AVALIAO TRMICA E ATIVIDADE LARVICIDA FRENTE AO Aedes aegypti DO LEO ESSENCIAL DA Aniba duckei Kostermans
ROGRIO DE MESQUITA TELES

Tese de doutorado apresentada ao Centro de Cincias Exatas e da Natureza da Universidade Federal da Paraba como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Doutor em Qumica Orgnica. Orientadores: Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho Prof. Dr. Antnio Gouveia de Souza

Joo Pessoa PB 2009

T269c

Teles, Rogrio de Mesquita. Caracterizao qumica, avaliao trmica e atividade larvicida frente ao aedes aegypti do leo essencial da aniba duckei Kostermans/ Rogrio de Mesquita Teles. Joo Pessoa, 2009. 97p.:il Orientadores: Victor Elias Mouchrek Filho e Antonio Gouveia de Souza. Tese (doutorado) UFPb / CCEN. 1. Qumica Orgnica Farmacologia. 2. leo essencial Pau rosa Linalol 3. Aedes aegypti. CDU: 547: 615(043)

UFPb/BC

DEDICO ESTE TRABALHO

Ao meu pai, Raimundo Teles Sobrinho, pelo seu exemplo de vida que sempre me serve de estimulo em tudo que fao (in memorian).

minha me, Cassiopa, minha primeira e eterna professora, orientadora e, sobretudo incentivadora.

minha tia, Caciuda Mesquita, que sempre me apoiou e estar eternamente presente em minha vida, sobretudo nos momentos de sucesso (in memorian).

Aos meus irmos, em especial Aupicio Teles e sua esposa Terezinha, pelos ensinamentos de pais, ajuda e estmulo que sempre me dedicaram.

 minha querida Lara Rubia, pelo amor e pelos lindos filhos Felipe Rogrio, Tiago Rogrio e Melissa Lara. Vocs so a verdadeira justificativa deste trabalho.

Aos Profs. Drs. Victor Elias Mouchrek Filho e Antonio Gouveia de Souza, pela segura orientao deste trabalho, pela sincera amizade, pela compreenso e pelos ensinamentos transmitidos, que certamente sero para sempre.

A procura da verdade difcil e fcil, j que ningum poder desvend-la por completo ou ignor-la inteiramente. Contudo, cada um de ns poder acrescentar um pouco de nosso conhecimento sobre a natureza e, disto, uma certa grandeza emergir. Aristteles, 350 a.C.

AGRADECIMENTOS
Deus,
Por direcionar meu caminho e est sempre me amparando.

Natureza,
Por permitir o meu crescimento pessoal e profissional atravs do contato direto com plantas medicinais.

Profs. Drs. Victor e Gouveia, pais cientficos,

Pela orientao em todos os momentos, pela oportunidade de aprendizado e desenvolvimento, e pela compreenso.

So Benedito do Rio Preto MA,

Bero querido, Terra que Deus escolheu para derramar as bnos.

Profs. Drs. Joo Mouchrek e Adenilde,

Pela amizade e incentivo.

A todos os colegas de doutorado, em especial aos Amigos Odair, Vasco, Joelkson, Manasss, Antnio e Silvio,
Pelo constante incentivo, por compartilhar dificuldades e comemorar conquistas.

CEFET-MA, em especial aos amigos do DAQ,

Pela compreenso ao longo deste doutoramento e pela amizade.

UFPB
Pela oportunidade do doutorado nesta Universidade.

Prof. Dr. Jamal Chaar,

Pela amizade, pelo apoio e pela receptividade em seu LAPEC.

Amigos do GEOALPHA,
Pela presena constante na minha vida, sempre torcendo, vibrando e me ajudando a caminhar, dividindo e somando crescimento.

Marlcia,
Pela colaborao indispensvel.

Amigos da UFPB, Manoel, Raul, Lcia, Marta, Geuza e Marcos Pequeno,

Importantes desenvolvimento doutoramento. colaboradores. deste trabalho, No mas apenas do no

prprio

SUMRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................ i LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................iii LISTA DE TABELAS .....................................................................................................vi RESUMO .......................................................................................................................vii ABSTRACT ..................................................................................................................viii

Captulo 1 ...................................................................................................................... 1 INTRODUO ............................................................................................................... 1 Captulo 2 ...................................................................................................................... 2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 2 Captulo 3 ...................................................................................................................... 3 FUNDAMENTAO TERICA .................................................................................... 3 3.1 A Dengue ................................................................................................................. 3 3.2 Consideraes sobre o Mosquito Aedes aegypti .............................................. 5 3.2.1 O ciclo de vida....................................................................................................... 7 3.2.1.1 O Ovo ................................................................................................................. 7 3.2.1.2 A larva ............................................................................................................... 8 3.2.1.3 A Pupa................................................................................................................ 9 3.2.1.4 O adulto .............................................................................................................. 9 3.3 O uso de Plantas Medicinais ............................................................................. 10 3.4 Plantas e Suas Atividades Larvicidas .............................................................. 12 3.5 Metabolismo Vegetal Secundrio ..................................................................... 14 3.6 leos Essenciais ................................................................................................. 15 3.6.1 3.6.2 Definies e Caractersticas ............................................................................ 15 Processos de extrao .................................................................................... 16

3.6.2.1 Arraste por vapor dgua ................................................................................. 16 3.6.3 3.7 3.8 Funes Biolgicas e Dados Farmacolgicos ................................................ 16 A Reserva Ducke ............................................................................................. 17 A Espcie Aniba duckei Kostermans ........................................................... 18

3.9 3.10 3.11

leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans .............................. 21 Tcnicas Analticas....................................................................................... 23 Anlise Trmica............................................................................................. 24

3.11.1 Conceito .......................................................................................................... 24 3.11.2 Tcnicas Termoanalticas............................................................................... 25 3.11.2.1Termogravimetria (TG) ................................................................................... 25 3.11.2.2 Termogravimetria Derivada (DTG) ................................................................ 26 3.11.2.3. Anlise Trmica Diferencial (DTA) ............................................................... 27 3.11.2.4 Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) ................................................. 27 Captulo 4 .................................................................................................................... 29 METODOLOGIA EXPERIMENTAL ............................................................................ 29 4.1 Materiais e Equipamentos................................................................................... 29 4.1.1 Moinho eltrico .................................................................................................... 29 4.1.2 Refratmetro ....................................................................................................... 29 4.1.3 Extrator de Clevenger ......................................................................................... 30 4.1.4 Espectrmetro Ultravioleta ................................................................................. 30 4.1.5 Espectrmetro Infravermelho com Transformada de Fourier (Interfermetro) ............................................................................................................ 31 4.1.6 Cromatgrafo a gs acoplado a Espectrmetro de Massas ............................. 31 4.1.7 Estudo trmico ................................................................................................... 31 4.2 Metodologia experimental................................................................................... 32 4.2.1 Origem, Coleta Preparao e Armazenamento da Amostral Vegetal............... 32 4.2.2 Extrao do leo essencial................................................................................. 32 4.2.2.1 Determinao do tempo de extrao .............................................................. 33 4.2.3 Padres ............................................................................................................... 33 4.2.4 Caractersticas Fsicas do leo Essencial......................................................... 33 4.2.4.1 Densidade ........................................................................................................ 33 4.2.4.2 Solubilidade em Etanol (70%) ......................................................................... 34 4.2.4.3 ndice de Refrao........................................................................................... 34 4.2.4.4 Rendimento do leo Essencial ....................................................................... 34 4.2.4.5 Cor .................................................................................................................... 34 4.2.4.5 Aparncia ......................................................................................................... 35 4.2.5 Anlises Espectroscpicas ................................................................................. 35

4.2.5.1 Anlise Espectroscpicas na Regio do Ultravioleta-Visvel ......................... 35 4.2.5.2 Anlise Espectroscpicas na Regio do Infravermelho ................................. 35 4.2.5.3 Anlise por Cromatografia Gasosa acoplada Espectroscopia de Massas.......................................................................................................................... 35 4.2.6 Quantificao de Linalol por Cromatografia Gasosa ......................................... 36 4.2.7 Estudo Trmico ................................................................................................... 36 4.2.8 Obteno e Cultivo das Larvas........................................................................... 36 4.2.9 Teste de Toxidade .............................................................................................. 37 4.2.10 Anlise Estatstica............................................................................................. 38 Captulo 5 .................................................................................................................... 40 RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................. 40 5.1 Estudo do tempo de extrao do leo essencial............................................. 40 5.2 Caractersticas fsicas do leo essencial ......................................................... 41 5.3 Anlises espectroscpicas e cromatogrficas do leo essencial dos frutos da espcie Aniba duckei K. ........................................................................... 43 5.3.1 Anlise espectroscpica na regio do Ultravioleta ............................................ 43 5.3.2 Anlise espectroscpica na regio do Infravermelho ........................................ 44 5.3.3 Cromatografia Gasosa acoplada Espectroscopia de Massas........................ 47 5.3.4 Quantificao por Cromatografia Gasosa.......................................................... 56 5.4 Anlise trmica do leo essencial ..................................................................... 58 5.4.1 Calorimetria exploratria diferencial ................................................................... 58 5.4.2 Anlise Termogravimtrica ................................................................................. 64 5.5 Atividade Larvicida do leo Essencial .............................................................. 69 Captulo 6 .................................................................................................................... 81 CONCLUSO .............................................................................................................. 81 Captulo 7 .................................................................................................................... 83 PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................... 83 Captulo 8 .................................................................................................................... 84 REFERNCIAS ............................................................................................................ 84

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

GL g CG CL50 CLAE d.C. DSC DTA DTG EM eV F.M. FHD FNS FT FUNASA ICTA IE INPA ISO IV LACOM LAPEC LPQA m/z MS OMS PIB

Grau Gay-Lussac Micrograma Cromatografia Gasosa Concentrao letal 50% Cromatografia Lquida de Alta Eficincia Depois de Cristo Calorimetria Exploratria Diferencial Anlise Trmica Diferencial Termogravimetria Derivada Espectrometria de Massas Eltron-Volt Frmula Molecular Febre de Dengue Hemorrgica Fundao Nacional de Sade Transformada de Fourier Fundao Nacional da Sade International Confederation of Thermal Analysis and Calorimetry Impacto de eltrons Instituto Nacional para o Progresso da Amaznia International Standard Organization Infra-Vermelho Laboratrio de Combustveis e Materiais Laboratrio de Pesquisas e Ensaios de Combustveis Laboratrio de Pesquisa em Qumica Analtica Relao carga-massa Ministrio da Sade Organizao Mundial de Sade Produto Interno Bruto

ii ppm SUDAM SVS TG UFAM UFMA UFPB UV Partes por Milho Superintendncia de Desenvolvimento da Amaznia Secretaria de Vigilncia Termogravimetria Universidade Federal do Amazonas Universidade Federal do Maranho Universidade Federal da Paraba Ultra-Violeta

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 . Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti. ............................................ 7 Figura 3.2 . Ovos do Aedes aegypti. ....................................................................... 8 Figura 3.3 . Larvas do Aedes aegypti em terceiro estgio. ...................................... 9 Figura 3.4 . Mosquito Aedes aegypti na fase adulta. ............................................. 10 Figura 3.5 .Reserva Florestal Adolfo Ducke (Reserva Ducke)............................... 18 Figura 3 . 6 . rvores plantadas em rea de cultivo do Pau Rosa na Reserva Florestal Ducke Manaus / AM. ................................................................. 20 Figura 3 . 7 . Fr mulas do linalol: estrutural e Molecular. ........................... 22 Figura 3 . 8 . Estruturas enantiomricas do linalol. .................................................. 23 Figura 5.1 . Sistema Extrator de Clevenger Adaptado........................................... 30 Figura 4.2 . Armadilha para obteno dos ovos do Aedes aegypti ........................ 37 Figura 4.1 . Variao do rendimento de leo essencial em funo do tempo de extrao. ................................................................................................... 41 Figura 5.2 . Espectros de absoro no UV: (A) mistura de etanol/gua a 60 %. (B) padro de linalol e (C) leo essencial extrado de galhos. ........................ 43 Figura 5.3. Espectro na regio do Infravermelho: (A) padro de linalol e (B) leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans. .............................................................................................................. 45 Figura 5.4 cromatograma do leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans. ......................................................................................... 47 Figura 5.5 . Espectros de massas: (A) Compo sto do pico 5 do cro matogra ma da Figura 11; (B) Padr o de linalol. .................................... 49 Figura 5.6. Espectro de massas correspondente ao pico 1 do cromatograma da Figura 5.4., limoneno. .................................................................. 50

iv Figura 5.7 . Espectro de massas correspondente ao pico 2 do

cromatograma da Figura 5.4., Cineol........................................................................ 51 Figura 5.8. Espectro de massas correspondente ao pico 3 do cromatograma da Figura 5.4, cis-xido de linalol...................................................... 52 Figura 5.9. Espectro de massas correspondente ao pico 4 do cromatograma da Figura 5.4, trans-xido de linalol. ................................................. 53 Figura 5.10 . Espectro de massas correspondente ao pico 6 do cro matogra ma da Figura 5.4, -terpineol. ..................................................... 53 Figura 5.11 . Espectro de massas correspondente ao pico 7 do cro matogra ma da Figura 5.4, Copaeno. ......................................................... 54 Figura 5.12 . Espectro de massas correspondente ao pico 8 do cro matogra ma da Figura 5.4, octehidro-tetrametilmetanoazuleno. .................................................................................................... 55 Figura 5.13 . Espectro de massas correspondente ao pico 9 do cro matogra ma da Figura 5.4, cariofileno. ...................................................... 56 Figura 5.14 .Curva analtica obtida pelo mtodo do Padro Externo para determinao do Linalol no leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans . ............................................................................................................ 57 Figura 5.15 . Curva analtica obtida pelo mtodo do Padro Externo, com cromatogramas, para determinao do Linalol no leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans . .......................................................................... 58 Figura 5.16 . Curva DSC para padro de linalol em atmosfera de ar e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min - 1 ......................................................................................................................... 59 Figura 5.17 . Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei K em atmosfera de ar e panela de alumnio sem furo, co m razo d e aquecimento de 10 C min - 1 .. ............................................................................ 60 Figura 5.18 . Curva DSC para padro de linalol em atmosfera de N2 e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min - 1 ......................................................................................................................... 61

v Figura 5.19 . Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei K em atmosfera de N2 e panela de alumnio sem furo, co m razo de aquecimento de 10 C min - 1 .............................................................................. 62 Figura 5.20 . Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei K em atmosfera de N2 e panela de alumnio com furo, co m razo de aquecimento de 10 C min - 1 .............................................................................. 63 Figura 5.21 . Curvas TG-DTG para o padro de linalol em atmosfera de atmosfera de ar ........................................................................................................ 65 Figura 5.22 .Curvas TG-DTG para o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei K. em atmosfera de ar ....................................................................... 65 Figura 5.23 . Curvas TG-DTG para o padro de linalol em atmosfera de N2. ............................................................................................................................. 66 Figura 5.24 . Curvas TG-DTG para o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei K. em atmosfera de N2......................................................................... 67 Figura 5.25 . Curvas TG do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei K. e do padro de linalol, em diferentes atmosferas. .................................... 68 Figura 5.26 . Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti expostas a sete concentraes diferentes do leo essencial de Aniba duckei Kostermans, aps 24 horas. ..................................................................................... 70 Figura 5.27 . Estimativa da LC50 do leo essencial de Aniba duckei K pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas. ........... 71 Figura 5.28 . Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti expostas a sete concentraes diferentes do padro de dl-linalol, aps 24 horas. ................. 73 Figura 5.29 . Estimativa da LC50 do padro de dl-linalol pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas................................. 74 Figura 5.30 . Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti expostas a sete concentraes diferentes do padro de l-linalol, aps 24 horas..................... 76 Figura 5.31 . Estimativa da LC50 do padro de l-linalol pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas................................. 77

vi

LISTA DE TABELAS

T abela 3.1 . Anlises trmicas. ............................................................ 25 T abela 5.1 . Propriedades fsicas do leo essencial extrado de galhos da
espcie Aniba duckei Kostermans. ............................................................. 42

T abela 5.2 . Principais bandas de absoro e modos vibracionais do padro de linalol e do leo essencial na regio do infravermelho. ..................... 46 T abela 5.3 . Compostos identificados na amostra de leo essencial de galhos da espcie Aniba duckei Kostermans .............................................. 48 T abela 5.4 . Mortalidade das larvas do Aedes aegypti aps 24 horas de exposio a vrias concentraes do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans ..................................................................... 69 T abela 5.5 . Mortalidade das larvas do Aedes aegypti aps 24 horas de exposio a vrias concentraes padro de dl-linalol .................................. 72 T abela 5.6 . Mortalidade das larvas do Aedes aegypti aps 24 horas de exposio a vrias concentraes do padro de l-linalol ................................ 75

vii

Ttulo: Caracterizao Qumica, Avaliao Trmica e Atividade Larvicida Frente ao Aedes aegypti do leo Essencial da Espcie Vegetal Aniba duckei Kostermans Autor: Rogrio de Mesquita Teles Orientadores : Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho Prof. Dr. Antnio Gouveia de Souza

RESUMO O Aedes aegypti o vetor de quatro sorotipos do flavivrus causador da dengue clssica e da febre hemorrgica da dengue. At o momento no existe vacina para a dengue, e a melhor forma de combater a doena atacar o vetor, principalmente eliminando os locais onde ocorre a oviposio e o desenvolvimento de suas larvas. Atualmente esse controle feito atravs aplicaes de inseticidas organafosforados em doses cada vez maiores, o que tem selecionado populaes resistentes do mosquito. Em todo o mundo diversas pesquisas so desenvolvidas no sentido de encontrar substncia de origem vegetal, como alternativa para o controle da dengue. Este trabalho teve como objetivo identificar os componentes do leo essencial da Aniba duckei Kostermans, pau-rosa amaznico, uma espcie nativa da regio amaznica, da famlia das Laurceas, com rvores de at 30 metros de altura e um metro de dimetro. Seu leo essencial utilizado em perfumaria, devido ao seu alto teor de linalol. Nesta pesquisa, extraiu-se o leo essencial dos galhos finos da Aniba duckei Kostermans por hidrodestilao. Foram determinadas propriedades fsicas e qumicas, alm do rendimento, incluindo o estudo do tempo de extrao. As tcnicas de espectrometria no ultraviolet e visvel (UVVis), infravermelho e de massas foram empregadas para a identificao de seus componentes. Usou-se a cromatografia gasosa para a quantificao, pelo mtodo do padro externo, do principal componente. Fez-se o estudo trmico do leo. O rendimento mdio foi de 1,93%. Os espectros no na regio do infravermelho e espectro de massas confirmaram a presena majoritria do linalol. A concentrao deste foi de 89,34 % no leo essencial. Tambm foi determinado o ponto de ebulio e a entalpia para o leo essencial e o padro de linalol por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC). Fez-se a aplicao do leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans e dos padres de l-linalol e dl-linalol como agente larvicida do mosquito Aedes aegypti. As Concentraes letais 50%, concentrao na qual metade das larvas morre, para o leo essencial, para o l-linalol e para o dl-linalol foi de 250,61 (2,20) g mL-1, 279,89 (2,12) g mL-1 e 346,73 (2,14) g mL-1, respectivamente. Palavras-chave: leo essencial; Aniba duckei Kostermans; Linalol; Aedes aegypti; larvicida.

viii

Author: Rogrio de Mesquita Teles Advisers: Prof. Dr. Victor Elias Mouchrek Filho Prof. Dr. Antnio Gouveia de Souza

ABSTRACT Aedes aegypti is the vector of four flavivirus serotypes causing the classical dengue and the dengue haemorrhagic fever. Up to now, there is no vaccine against dengue, and the best way to fight the disease is to attack the vector, mainly eliminating the places where occurs the oviposition and the development of its larvae. Nowadays this control is done through the application of organophosphorus insecticides at higher and higher doses, what has selected resistant populations of the insect. All over the world, several research activities are being developed aiming at finding out a substance of vegetable origin, as an alternative for the dengue control. The present work had as objective to identify the components of the essential oil from Aniba duckei Kostermans, a species native from the Amazonian region, from the Lauraceae family, with trees of up to 30m high and one meter diameter. Its essential oil is used in the perfume industry, due to its high linalol content. In the present work, the essential oil was extracted from fine branches of Aniba duckei Kostermans por hydrodistillation. The physical and chemical properties were determined, besides the yield, including the study of the extraction time. The techniques of UV/Vis spectrometry, infrared spectrometry and mass spectrometry were utilized for the identification of its components. The main component was quantified by gas chromatography, by the external standard method. A thermal study of the oil was carried out. The average yield was determined as 1.93%. The infrared and mass spectra confirmed the presence of linalol as the main component, reaching a content of 89.34 % in the essential oil. The boiling point and the enthalpy of the essential oil and the linalol standard were determined using the technique of Differential Scanning Calorimetry (DSC). The essential oil from the species Aniba duckei Kostermans and standards of l-linalol and dl-linalol were applied as larvicide agents for the Aedes aegypti mosquito. The 50% letal concentration, a concentration at which 50% of the larvae die, for the essential oil, for the l-linalol and for the dl-linalol were of 250. 61 (2.20) g mL-1, 279.89 (2.12) g mL-1 and 346.73 (2.14) g mL-1, respectively. Keywords: Essential oil; Aniba duckei Kostermans; Linalol; Aedes aegypti; larvicide.

1 - Introduo

1 Captulo 1 Introduo 1 INTRODUO

Em termos de morbidade e mortalidade, a dengue considerada atualmente a mais importante doena viral humana transmitida por mosquitos, sendo um srio problema de sade pblica dos centros urbanos das reas tropicais da Amrica do Sul, Amrica Central, Sudeste Asitico e Pacfico Ocidental (MS-FNS, 2002). Trata-se da arbovirose mais importante no mundo, com estimativa de 50 milhes de infeces por ano (COLHO, 2006). Como no existem vacinas validadas para o uso contra a dengue, o melhor mtodo de controle da doena a preveno, ou seja, atacando o vetor, o Aedes aegypti. O controle vetorial feito eliminando os locais propcios oviposio ou combatendo as larvas desse mosquito. Atualmente, esse combate feito por meio de aplicaes de inseticidas organafosforados. Porm, o uso frequente e em doses cada vez maiores desses produtos, tem desenvolvido resistncia pelo mosquito aos pesticidas comumente utilizados, dificultando o trabalho. Verificou-se a existncia de populaes resistentes a inseticidas organofosforados (LIMA, et al., 2003; BRAGA, et al., 2004), requerendo, dessa forma, a necessidade de novas pesquisas em busca de compostos com essa atividade. Uma alternativa tem sido as plantas, fontes de molculas com aes fagoinibidora, repelente, inseticida, alm de substncias capazes de alterar a regulao do crescimento. Os leos essenciais, produzidos no metabolismo secundrio das plantas, tambm tm se apresentado como fontes de materiais com atividade inseticida, larvicida e repelente (COSTA, 2005; MURUGAN et al., 2007). No sentido de contribuir com o combate a larvas do Aedes agypti, no presente estudo extraiu-se o leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans, realizou-se o estudo de suas caractersticas fsicas, de sua composio qumica e sua anlise trmica, alm de test-lo como larvicida junto a larvas do mosquito Aedes aegypti em terceiro ou quarto estgio.

2 - Objetivos

2 Captulo 2 Objetivos 2 OBJETIVOS

O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar qumica termicamente o leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans e avaliar sua atividade como agente larvicida frente a larvas do Aedes aegypti no terceiro estgio. Para tanto tornou-se necessrio o cumprimento dos seguintes objetivos especficos: Extrair o leo essencial da Aniba duckei Kostermans coletado da

i.

Reserva Vegetal Adolfo Ducke (Reserva Ducke) em Manaus AM; ii. iii. Caracterizar fisicamente o leo essencial; Identificar analiticamente os componentes do leo, usando

cromatografia gasosa acoplada espectroscopia de massas, espectroscopia no ultravioleta e infravermelho; iv. Analisar termicamente o leo essencial da Aniba duckei

Kostermans pelas tcnicas Termogravimetria (TG), Termogravimetria Derivada (DTG) e Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC); v. Testar a atividade larvicida leo essencial da Aniba duckei

Kostermans, e dos padres de linalol, l-linalol e dl-linalol frente a larvas do Aedes aegypti entre os terceiro e quarto estgios.

3 - Fundamentao Terica

3 Captulo 3 Fundamentao Terica 3 FUNDAMENTAO TERICA 3.1 A Dengue

A dengue uma doena infecciosa de origem viral, transmitida para o homem por meio de fmeas de mosquito Aedes. O principal vetor o inseto Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera:Culidae), tambm vetor da febre amarela urbana, embora outras espcies de Aedes possam est envolvidas nessa transmisso (HALSTEAD, 1997; COLHO, 2006). A dengue apresenta evoluo benigna na forma clssica, a Dengue Clssica, e grave, na forma hemorrgica, a Febre Hemorrgica da Dengue, FHD (KUNO, 1995). Trata-se de uma arbovirose, cujo vrus da famlia Flaviviridae e do gnero Flavivirus se apresenta em quatro sorotipos: Dengue vrus 1, Dengue vrus 2, Dengue vrus 3 e Dengue vrus 4. Em termos de morbidade e mortalidade, a dengue a mais importante doena viral humana transmitida por mosquitos e constitui srio problema de sade pblica dos centros urbanos das reas tropicais da Amrica do Sul, Amrica Central, Sudeste Asitico e Pacfico Ocidental (MS-FNS, 2002). A doena conhecida clinicamente nas Amricas desde o final do sculo 18, surto ocorrido na Filadlfia, Estados Unidos, em 1780, sendo que o isolamento do vrus nas Amricas aconteceu pela primeira vez apenas em 1953 na Ilha de Trinidad (Caribe), com a identificao do Dengue vrus 2. Em 1963, o Dengue vrus 3 foi identificado em epidemia de Dengue Clssica que afetou o Caribe e a Venezuela (OPAS, 1997). No Brasil, vrias epidemias de Dengue foram registradas em 18461848 no Rio de Janeiro, So Paulo, Salvador e outras cidades. Em 1851 e 1853, novas epidemias aconteceram na cidade de So Paulo, com reemergncia em 1916. Em 1923 foi relatada uma epidemia de Dengue em Niteri/RJ (MS-FNS, 1996).

4 Captulo 3 Fundamentao Terica O vetor foi declarado erradicado no territrio brasileiro por duas vezes. A primeira, em 1958, voltando em menos de uma dcada, em 1967, em Belm PA, e em outros 23 municpios do Estado. Dois anos depois foi detectada a presena do Aedes aegypti em So Lus e So Jos do Ribamar, no Maranho. Em 1973, com a eliminao do ltimo foco de Aedes aegypti em Belm/PA, o vetor foi considerado erradicado do Brasil pela segunda vez. A reintroduo foi registrada em 1976 na cidade de Salvador BA (MS-FNS, 2001). Durante a dcada de 1980, a magnitude do problema da dengue nas Amricas, caracterizada por uma importante disperso geogrfica da doena, aumentou consideravelmente. Em 1982, em Boa Vista/RR, ocorreu uma epidemia causada pelos sorotipos Dengue vrus-1 e Dengue vrus-4, rapidamente controlada. Em 1986, o Dengue vrus-1, introduzido no Rio de Janeiro/RJ, Niteri/RJ e Macei/AL causou surtos epidmicos importantes e desde ento propaga-se pela maioria dos estados brasileiros. Em 1990, novas ocorrncias da doena no pas apresentaram-se em ondas epidmicas com aumento de circulao do Dengue vrus-1 e introduo do Dengue vrus-2 no Rio de Janeiro/RJ, momento em que se registram os primeiros casos de FHD no Brasil, com 462 casos confirmados e oito bitos (FIGUEIREDO et al., 1990). A situao epidemiolgica torna-se grave em todo o pas a partir de 1994. Nesse ano, 18 estados brasileiros reportam a ocorrncia do Aedes aegypti. Em 1995, o vetor foi encontrado em 24 estados e no Distrito Federal, as excees foram o Amazonas e o Amap. A presena do vetor j detectada em todos os estados em 1998 (MESSER et al., 2003). Em 1999, h notificaes de Dengue em 1.946 municpios distribudos por 23 estados (MS, 2001). No ano seguinte ocorre uma epidemia no Estado do Rio de Janeiro, com a notificao de 4.281 casos de Dengue. Em 2001, registra-se o isolamento do Dengue vrus-3 em paciente da regio metropolitana do Rio de Janeiro. Esse novo vrus provocou uma epidemia sem precedentes, em 2002, no Estado do Rio de Janeiro, com a notificao de 254.862 casos. As vinte e sete unidades da federao notificaram 783.143 casos da doena. As notificaes do Rio Grande do Sul e Santa Catarina so referentes a casos importados (MS/SVS, 2003).

5 Captulo 3 Fundamentao Terica No ano de 2006, foram registrados 345.922 casos, sendo as regies mais acometidas, o Sudeste (141.864) e o Nordeste (105.017 casos). Foram notificados 682 casos de Febre Hemorrgica da Dengue e 76 bitos. A Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade registrou no perodo de janeiro a julho de 2007, 438.949 casos de dengue clssica, 926 casos de Febre Hemorrgica da Dengue e a ocorrncia de 98 bitos, sendo que no Maranho ocorreram 10.442 casos dos quais 81 foram de dengue hemorrgica, havendo 5 mortes (MS/SVS, 2007). De acordo com o Levantamento Rpido de ndice de Infestao por Aedes aegypti (LIRAa), em 2008, dos 2.324 extratos avaliados (reas de 9 mil a 12 mil imveis com caractersticas semelhantes) 1.344 apresentaram ndice de infestao abaixo de 1,0%, considerada uma faixa satisfatria de acordo com a Organizao Mundial de Sade (OMS). A quantidade de locais com este perfil em 2008 correspondeu a 57,8% do total de extratos avaliados. Em 2007, o percentual foi de 53,8% de um grupo de 2.130. Quando os locais avaliados (estratos) apresentam menos de 1,0%, significa que h menos de uma casa com larvas do mosquito da dengue para cada grupo de 100, no momento da realizao desse trabalho (MS/SVS, 2008). Porm, de acordo com esses mesmos dados do Ministrio da Sade, pode-se perceber que na avaliao das capitais, 14 esto em estado de alerta, ou seja, os estratos apresentaram infestao entre 1 e 3,9%, dentre elas So Lus MA. O principal vetor da Dengue no Brasil o Aedes aegypti, pertencente ao FILO Arthropoda, SUBFILO Mandibulata, CLASSE Insecta, SUBCLASSE Pterygota, ORDEM Diptera, SUBORDEM Nematocera,

FAMLIA Culicidae, SUBFAMILIA Culicinae, GNERO Aedes (REY, 1992).

3.2 Consideraes Sobre o Mosquito Aedes Aegypti Lineau, 1762 A distribuio do vetor da dengue, o Aedes aegypti, cada vez mais abrangente. O rpido crescimento e urbanizao das populaes nas reas tropicais, sem infra-estrutura bsica de saneamento, ampliaram a faixa de ocorrncia desta arbovirose, em razo da difuso do mosquito em reas antes livres da doena. Esse mosquito tambm vetor urbano da

6 Captulo 3 Fundamentao Terica febre amarela, aumentando o risco de urbanizao dessa doena, mantida primariamente em rea silvestre por mais de meio sculo. Entretanto, ao contrrio da febre amarela, a dengue apresenta um nico ciclo epidemiolgico, o urbano. Os principais elementos desse ciclo so o homem (o hospedeiro) e o Aedes aegypti (o vetor) (GUBLER, 1989; REBLO et al, 1999; SILVA et al., 2008). De acordo com a Organizao Mundial de Sade (OMS) o vrus da dengue o mais importante arbovrus para o homem e, uma vez que o mosquito Aedes aegypti o hospedeiro natural desse vrus, ele tambm tem sido muito estudado. Muitas pessoas morrem no Brasil devido a dengue hemorrgica e muitas outras sofrem ao se contagiar (OMS). O Aedes aegypti um vetor oriundo do continente africano, trazido juntamente com os escravos. Foi erradicado do Brasil pela primeira vez em 1958, mas, em 1967, reapareceu em So Lus e Belm, sendo em seguida eliminado. Em 1976, com origem em um foco em Salvador, iniciase a recolonizao no Brasil. Em 1977, foi encontrado no Rio de Janeiro e Santos; em 1979, em Natal, e em 1981, no Paran (NEVES e SILVA, 1995). Durante esses anos, as medidas de controle eram espordicas e isoladas (REBLO et al, 1999). A Secretaria de Vigilncia em Sade do Ministrio da Sade (SVS/MS) registrou no perodo de janeiro a julho de 2007, 438.949 casos de dengue clssica, 926 casos de Febre Hemorrgica da Dengue e a ocorrncia de 98 bitos, um aumento de 136.488 casos de dengue no pas. Outro aspecto epidemiolgico relevante em 2007 relaciona-se a

concentrao de casos de Febre Hemorrgica da Dengue, sendo 68,0% das notificaes nos estados do Cear, Rio de Janeiro, Maranho, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Amazonas e Piau. A mesma caracterstica observada em relao aos bitos, concentrando-se 50,0% nos estados do Rio de Janeiro, So Paulo, Par e Piuai (MS/FNS, 2007).

7 Captulo 3 Fundamentao Terica 3.2.1 O Ciclo de Vida Para o aprimoramento das formas de combate ao vetor Aedes aegypti, o conhecimento do ciclo de vida do mosquito contribui para melhoria das formas de combate a esse vetor. O Aedes aegypti uma espcie domstica, que se reproduz, preferencialmente, em gua parada e limpa, acumulada em recipientes fabricados pelo homem, como latas, pneus, vasos etc, dentro ou perto das habitaes. Seu ciclo de vida compreende 4 estgios: OVO LARVA PUPA ADULTO, conforme mostrado na Figura 3.1. Os trs primeiros estgios so aquticos e o ltimo terrestre (FORATTINI, 2002).

(Fonte: http://dengue.blogsbr.com/dengue/aedes-aegypti)

Figura 3.1 Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti.

3.2.1.1 O Ovo O ovo do Aedes aegypti (Figura 3.2), mede aproximadamente um milmetro de comprimento, com contorno alongado e fusiforme sendo depositado individualmente, nas paredes dos depsitos que servem como criadouros, prximos lmina da gua; no momento da postura os ovos so

8 Captulo 3 Fundamentao Terica brancos, mas nas primeiras vinte quatro horas adquirem a cor negra; a formao do embrio se completa em 48 horas; so capazes de resistir a longos perodos de dessecao. De acordo com dados da FUNASA, ovos com at 450 dias, sofrem ecloso, quando colocados em contato com a gua. A capacidade de resistncia dos ovos um srio obstculo para sua erradicao. Esta condio permite que os ovos sejam transportados a grandes distncias, em recipientes secos, tornando-se assim, o principal meio de disperso do inseto (FUNASA, 2007).

Figura 3.2. Ovos do Aedes aegypti vistos em dois tamanhos ao microscpio ptico

3.2.1.2 A Larva As larvas, Figura 3.3, alimentam-se de substncias orgnicas, bactrias, fungos e protozorios existentes na gua. A durao da fase larval, em condies favorveis de temperatura (25 a 29 C) e boa alimentao, pode chegar a 10 dias, podendo se prolongar por algumas semanas. Movimenta-se em forma de serpente, como um S. sensvel a movimentos bruscos na gua, movimenta-se com rapidez e se refugia no fundo do recipiente.

9 Captulo 3 Fundamentao Terica

Figura 3.3. Larvas do Aedes aegypti em terceiro estgio.

3.2.1.3 A Pupa A pupa no se alimenta, apenas respira e raramente afetada pela ao de larvicidas. A durao da fase pupal, ltima fase do estgio aqutico, em condies favorveis de temperatura, de aproximadamente dois dias. nesta fase que ocorre a metamorfose do estgio larval para o adulto.

3.2.1.4 O Adulto Na fase adulta, o mosquito, macho fmea (Figura 3.4), j formados, alimentam-se de nctar e sucos vegetais at a fase de acasalamento (uma nica inseminao suficiente para fecundar todos os ovos que a fmea venha a produzir durante sua vida). A partir da, a fmea necessita de sangue para a maturao dos ovos. A busca por esse alimento ocorre, geralmente, durante o dia - nas primeiras horas da manh e ao anoitecer. Em regies tropicais, como o Brasil, o fato de ocorrerem chuvas constantes aumenta significativamente o nmero de mosquitos.

10 Captulo 3 Fundamentao Terica

Fonte: http://dengue.blogsbr.com/dengue/aedesaegypti Figura 3.4. Mosquito Aedes aegypti na fase adulta.

3.3 O uso de plantas medicinais Define-se planta medicinal, segundo a OMS (Organizao Mundial de Sade), como sendo qualquer planta que possua, em um de seus rgos ou em toda planta, substncias com propriedades teraputicas ou que sejam ponto de partida na sntese de produtos qumicos ou farmacuticos (SILVA e CASALI, 2000). Acredita-se que a utilizao de plantas medicinais como terapia preventiva e curativa seja to antiga quanto o prprio ser humano (MARTINS et al., 1994). As primeiras citaes de essncias de cedro e detalhes de uma destilaria vm do Egito e datam de 40 sculos antes de Cristo. O papiro de Ebers (2278 a.C.) e o de Smith (2263 a.C) ensinam o preparo e cultivo de drogas, como a dormideira. Na ndia, China e Prcia, a destilao de plantas conhecida h milnios. A Bblia menciona que os perfumes babilnicos valiam tanto quanto ouro, prata e armas

(BUSTAMANTE, 2000). As plantas medicinais devem ser consideradas no apenas como matria-prima, ponto de partida para a descoberta de novas molculas, mas tambm como um recurso natural potencialmente ativo na forma de fitoterpico padronizado e eficaz. O desenvolvimento desta rea de

11 Captulo 3 Fundamentao Terica pesquisa deve-se a vrios fatores, dos quais se destaca a participao de um nmero cada vez maior de profissionais. No entanto, resultados promissores dependem de uma maior inter-relao entre os diversos profissionais e disciplinas que compem o estudo das plantas medicinais, pois a continuidade de tais estudos de forma isolada perpetuar a falta de recursos, impedindo conseqentemente o desenvolvimento de novos medicamentos (MOUCHREK FILHO, 2000). Nos ltimos vinte anos no Brasil, pas com a maior diversidade vegetal do mundo, o nmero de informaes sobre plantas medicinais tem crescido apenas 8% anualmente (SIANI, 2003). Isso reflete a necessidade de incentivos a pesquisas com plantas medicinais, visto que se trata de um pas to rico em biodiversidade, mas to pobre em pesquisas nesta rea. Afinal, essas pesquisas poderiam levar reorganizao das estruturas de uso dos recursos naturais (em vista da necessidade de sua extrao estar associada aos planos de manejo) e a elevao do PIB, visto que h grande tendncia mundial de aumento na utilizao de fitoterpicos. O mercado mundial de fitoterpicos estimado em mais de US$ 20 bilhes anuais e, somente na Europa, atinge cerca de US$ 7 bilhes ao ano. Segundo estimativa feita pela PhytoPharm Consulting em Berlim, at o ano de 2007 a fitoterapia movimentou cerca de US$ 47 bilhes anualmente. No Brasil, em 1998, os produtos naturais na sade foram responsveis pelo controle de 5,5% do mercado total de medicamentos, o que representa algo em torno de US$ 566 milhes. Em 2000, foram negociados US$ 700 milhes e a previso de um bilho de reais nos prximos 10 anos (SIANI, 2003). Muitas plantas possuem compostos economicamente

importantes, tais como, leos essenciais, alcalides, resinas, taninos, ceras e outros (BALANDRIN et al., 1985). No entanto, muitas espcies de plantas nunca foram observadas quanto a seus constituintes qumicos e biologicamente ativos, e espera-se que novas fontes de materiais com potencial comercial sejam descobertas. Assim, diante da possibilidade da descoberta de novos compostos com atividade teraputica ou da busca de

12 Captulo 3 Fundamentao Terica formulaes mais simples, com menor custo e, portanto, mais acessveis maioria das populaes, a OMS, em 1978, recomendou a seus pases membros que desenvolvessem pesquisas visando o estudo da flora medicinal. Atendendo a esse apelo, o Ministrio da Sade, no Brasil, criou a Portaria n. 212 (11/09/81), sobre Diretrizes e Prioridades em Sade, em que se inclui o estudo multidisciplinar de plantas medicinais (MING, 1994). Os leos essenciais de algumas espcies de plantas aromticas j so largamente usados na indstria para a produo de sabonetes, perfumes e outros produtos de higiene pessoal. Investigaes sobre a avaliao das atividades inseticida (PARE, 1999; LIMA, 2006), bactericida (DORMAN e DEANS, 2000; AGNES, 2005) larvicida (FURTADO, et al., 2005; SILVA et al., 2008; CHENG et al., 2008) e fungicida (LEMOS , 1990) dos leos essenciais de diversas espcies de plantas, nas mais diferentes regies do planeta, tm mostrado resultados interessantes.

3.4 Plantas e suas atividades larvicidas Desde o princpio das civilizaes, os vegetais tm sido utilizados, no apenas como fonte alimentcia, mas tambm medicamentosa. As mais diversas enfermidades tm sido tratadas com chs, sucos, tinturas, banhos, cataplasmas e ungentos, preparados a partir de partes de plantas. Isso remonta, principalmente, aos antigos povos da China, Egito, sia e Roma, em que os eruditos classificavam um grande nmero de plantas com as respectivas indicaes medicinais. Mais tarde os gregos, seguidos pelos clnicos da Europa Ocidental instituram o emprego racional das plantas na prtica mdica (LIMA, 2001). Por outro lado, com o surgimento de formas resistentes de mosquito aos inseticidas convencionais, tem crescido a procura por extratos vegetais e substncias naturais que sejam efetivas no combate ao mosquito adulto e larva de Aedes aegypti e que sejam isentas de toxicidade para o meio ambiente. Resistncia a inseticidas convencionais um dos principais obstculos ao controle de insetos pestes de importncia na agricultura e na

13 Captulo 3 Fundamentao Terica medicina. A resistncia resulta no aumento da freqncia de aplicao de inseticida, dosagens crescentes, rendimentos diminudos, danos ambientais e surgimento de doenas, quando os vetores no podem ser controlados. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS), o custo da resistncia de insetos a inseticidas pode alcanar anualmente US$ 1,4 bilhes nos Estados Unidos (SIMAS, 2004). Plantas, como organismos que co-evoluem com insetos e outros microrganismos, so fontes naturais de substncias inseticidas e

antimicrobianas, j que as mesmas so produzidas pelo vegetal em resposta a um ataque patognico. Inmeras substncias acumulam-se no vegetal para sua defesa contra microorganismos, algumas delas sendo denominadas de fitoalexinas. As plantas sintetizam e emitem inmeros compostos volteis (cidos, aldedos e terpenos) para atrair polinizadores e se defender de herbvoros. No que concerne defesa contra herbvoros, as plantas desenvolveram dois tipos de defesa, a direta e a indireta. Na defesa direta esto envolvidas substncias como slica, metablitos secundrios, enzimas e protenas, alm de rgos como tricomas e espinhos que afetam diretamente a performance do inseto. Na defesa indireta esto envolvidas substncias emitidas pela planta, que atraem parasitas e predadores do inseto fitfago. Terpenos e fenilpropanides volteis sintetizados por espcies vegetais podem ter, dependendo do inseto em anlise, propriedades atrativas (alimentao, polinizao) e/ou deterrentes (inibidores de oviposio) e inseticidas. Nos ltimos anos, leos essenciais obtidos de plantas tm sido considerados fontes em potencial de substncias biologicamente ativas. nfase tem sido dada s propriedades antimicrobiana, antitumoral e inseticida de compostos volteis, alm de sua ao sobre o sistema nervoso central. Os leos essenciais obtidos, por exemplo, de Mentha pulegium e M. spicata so muito eficazes como inseticidas. Pequenas quantidades j so suficientes para causar a morte de inmeros insetos. Os monoterpenos pulegona, mentona e carvona, os principais constituintes do leo de menta, foram considerados txicos para larvas de Drosophila melanogaster (SIMAS, 2004; KELSEY, 1984).

14 Captulo 3 Fundamentao Terica Neste trabalho foi testada ao larvicida do leo essencial da espcie vegetal aniba duckei Kostermans frente a larvas do mosquito aedes aegypti em seu terceiro estgio 3.5 Metabolismo Vegetal Secundrio As plantas produzem um grande nmero de metablitos secundrios que funcionam numa variedade de contextos ecolgicos. Muitos desses compostos so txicos e servem como agentes de defesa contra microorganismos patognicos, insetos e animais herbvoros. Outros so compostos volteis e servem para atrair polinizadores ou insetos que atacam plantas rivais ou ainda repelem organismos nocivos planta (IIJIMA et al., 2004). Compostos secundrios com funo protetora so geralmente armazenados em clulas ou estruturas especializadas para proteger a planta de toxidade (GERSHENZON et al., 1989; PARE e TUMLINSON, 1999; DUKE et al., 2000; DUSSOURD e HOYLE, 2000). Um mecanismo comum de armazenamento tem sido a evulao de estruturas anatmicas, tricomes trmica glandular, na superfcie da parte area das plantas. Tal estrutura contm, comumente, clulas glandes que sintetizam esses compostos e um saco cuticular cobrindo essas clulas nas quais os compostos sintetizados so secretados. Aps a danificao dos tecidos ou mera presso fsica, os sacos rompem-se liberando seu contedo. Como esses compostos secundrios possuem altas presses de vapor, so facilmente evaporados para atmosfera. A famlia dos monoterpenos dos produtos naturais, por

conseguinte, derivada do plastidial, mevalonato rota independe para o metabolismo de isoprenide (McCONKEY et al., 2000), o qual produz isopentil-difosfato (e, por isomerizao, dimetilalil difosfato) como precussor universal dos terpenides (LICHTENTHALER et al., 1997; McCASKILL e CROTEAU, 1999). Os monoterpenos divergem dos metablitos primrios por converso do isopentil difosfato e dimetilalil difosfato, via de ao da

15 Captulo 3 Fundamentao Terica preniltransferase geranil difosfato sintase, para geranil difosfato (BURKE et al., 1999), o qual transforma, aps subseqente ciclizao, por limoneno sintase, em (4S)-(2)-limoneno (ALONSO et al., 1992).

3.6 leos essenciais 3.6.1 Definies e caractersticas SIMES et al. (2007) cita que os leos essenciais so definidos pela International Standard Organization (ISO) como os produtos obtidos de partes de plantas atravs de destilao por arraste de vapor dgua, bem como os produtos obtidos por espresso dos pericarpos de frutos ctricos (Rutaceae). So misturas complexas de substncias volteis, lipoflicas, odorferas e lquidas. Tambm so chamados de leos etreos ou essncias. Estes termos se referem aparncia oleosa a temperatura ambiente, da a designao leo. Entretanto, devido volatilidade, sua caracterstica principal, os leos essenciais diferenciam-se dos leos fixos, misturas lipdicas obtidas geralmente de sementes. Em gua, os leos essenciais apresentam solubilidade limitada, mas o suficiente para aromatizar suas solues aquosas, que nesse caso so denominadas hidrolatos. Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos terpnicos, lcoois simples e terpnicos, aldedos, cetonas, fenis, steres, xidos, perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas, cumarinas, at compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes concentraes; normalmente, um deles um composto majoritrio, existindo outros em menores teores e alguns em baixssimas quantidades (traos) (SIMES et al., 2007). Os leos essenciais diferem-se quimicamente dos leos vegetais e dos minerais. Os primeiros so misturas de terpenos e oxigenados, juntos com outros tipos de compostos orgnicos. J os leos vegetais so steres da glicerina com cidos graxos de longas cadeias, ao passo que os ltimos

16 Captulo 3 Fundamentao Terica leos citados so parafinas lquidas misturados a outros hidrocarbonetos de peso molecular elevado (COSTA, 1994). 3.6.2 Processos de extrao Os mtodos de extrao dos leos essenciais variam de acordo com a regio da planta em que ele se encontra bem como com a proposta de utilizao do mesmo (CRAVEIRO, 1981). Os mais comuns so: enflorao (enfleurage), arraste por vapor dgua, extrao com solventes orgnicos, prensagem (ou espresso) e extrao por CO2 supercrtico (CHAAR, 2000).

3.6.2.1 Arraste por Vapor dgua Na indstria de leos essenciais existem trs tipos de extraes, distinguidas pela forma como se estabelece o contato entre a amostra e a gua, na fase lquida ou de vapor; a primeira chamada de hidrodestilao, onde a amostra fica imersa na gua lquida contida numa caldeira; a segunda maneira de destilao com gua e vapor, onde uma rede colocada na parte inferior de uma caldeira mais alta separa a gua da amostra e o terceiro tipo de destilao pelo vapor de gua, onde a amostra colocada em uma caldeira e o vapor de gua ali injetado provm de um gerador prprio, independente (WILLIANS, 1996; FUH et al., 1996). A indstria utiliza, de preferncia, o vapor dgua por ser reduzido o contato com a gua, relativamente aos mtodos anteriores, menos acentuada a hidrlise dos steres e a polimerizao de outros constituintes, em particular dos aldedos (SIMES et al. 2007).

3.6.3 Funes Biolgicas e Dados Farmacolgicos As substncias odorferas em plantas foram consideradas por muito tempo como desperdcio fisiolgico (SIMES et al., 2007), ou

17 Captulo 3 Fundamentao Terica mesmo produtos de desintoxicao (BELL et al., 1980). Atualmente, considera-se a existncia de funes ecolgicas, especialmente como inibidores da germinao, na produo de predadores, na atrao de polinizadores, na proteo contra a perda de gua e aumento de temperatura, entre outras (HARBONE, 1993). importante no confundir as atividades farmacolgicas do extrato bruto de uma droga vegetal rica em leos essenciais com as atividades farmacolgicas do leo essencial isolado da mesma. Tambm se deve levar em considerao que, se possvel estabelecer a atividade farmacolgica de uma substncia isolada, o mesmo no to fcil para um leo voltil que, alm de ser uma mistura complexa, pode ter sua composio qumica alterada por vrios fatores, tais como: temperatura, umidade relativa, exposio ao sol, ventos, estocagem etc. Entretanto, algumas propriedades farmacolgicas esto relativamente bem estabelecidas, por exemplo: ao carminativa (contra gases intestinais); ao antiespasmdica; ao estimulante; ao cardiovascular; ao sobre o Sistema Nervoso Central; ao anestsica tpica; ao antiinflamatria; alm da ao anti-sptica, uma vez que alguns leos volteis inibem crescimento de vrios tipos de bactrias, fungos e insetos, devido presena de compostos fenlicos, aldedos e alcois (SIMES, 2007). 3.7 Reserva Ducke A Reserva Florestal Adolfo Ducke (Reserva Ducke), Figura 3.5, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), localiza-se no km 26 da rodovia AM-010 (Manaus Itacoatiara) e est compreendida entre as coordenadas geogrficas de 0300''02'' e 030800'''de latitude sul e 5958' 00'' de longitude oeste. O clima da rea do tipo Afi, de acordo com a classificao climatolgica de Koppen. A temperatura mdia para o ms mais frio nunca inferior a 18 C, a precipitao mdia anual de 2000 mm e ocorrem duas estaes distintas: a chuvosa, estendendo-se de novembro a maio e a seca, de junho a outubro (SAMPAIO et al., 2005).

18 Captulo 3 Fundamentao Terica

Figura 3.5. Reserva Florestal Adolfo Ducke (Reserva Ducke) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA): (A) Entrada principal da Reserva. (B) Floresta.

Na reserva Ducke, em latossolo de textura arenosa, existem cerca de 3 a 4 arvores por vinte e cinco hectares. Ocorrem, geralmente, em grupos de 5 a 8 rvores, com espaamento de 50 a 100 metros entre grupos, embora, tambm ocorram rvores isoladas (SAMPAIO, 2000; SAMPAIO et al., 2003; SPIRONELLO et al., 2004). Tradicionalmente, segundo ALENCAR e FERNANDES (1978), o pau-rosa propaga-se de suas sementes, que so, no entanto, severamente predadas na floresta, principalmente por pssaros das famlias Psitacdeos e Ranfastdeos, que atacam os frutos antes da maturao. Na Reserva Ducke, uma rvore adulta chega a produzir mais de 400 frutos, porm poucos chegam a ser coletados.

3.8 A Espcie Aniba duckei Kostermans A espcie botnica Aniba duckei Kostermans, da famlia das Lauraceae, conhecida vulgarmente como pau-rosa, foi descoberta no Brasil em Juriti Velho, no estado do Par em 1925 (CORREA et al., 1975; SIANI et al., 1999).

19 Captulo 3 Fundamentao Terica As Lauraceae apresentam-se amplamente distribudas atravs das regies tropicais e subtropicais do planeta, sendo formadas por 49 gneros com nmero de espcies variando entre 2500 a 3000 (WERFF et al., 1996). Os primeiros registros relativos utilizao das espcies desta famlia datam de 2.800 a.C, sendo originrios da Grcia antiga (BARROSO, 1978; COE-TEIXEIRA, 1980). As espcies do gnero Aniba Aubl. destacam-se pelo alto valor econmico, devido constituio do leo essencial, encontrado em grande quantidade principalmente no lenho e na casca. O primeiro registro de que se tem conhecimento de Aublet, em uma viagem de estudos Guiana Francesa, no perodo de 1762 1764, que registrou a espcie com o nome de Licaria guianensis Aubl., devido mesma ser conhecida pelo nome de Licari, pelos indgenas. Sua importncia econmica teve incio em 1875 quando Samarin, na Frana, obteve o leo essencial por destilao. Em 1881, Morim, tambm na Frana, separou o leo essencial de um lcool e o chamou de linalol. Sua primeira exportao para a Europa aparece registrada na Guiana Francesa em 1883. Anos mais tarde, Koeller sugeriu que a espcie fosse denominada Ocotea caudata Koeller. Posteriormente, Mez sugeriu o nome Aniba parviflora (Meiss.) Mez. Contudo, DUCKE em 1926 passou a cham-la A.rosaeodora DUCKE. O prprio autor, neste mesmo ano, verificou que havia diferenas entre as espcies da Amaznia e das Guianas, da passou a cham-la A.rosaeodora var. amaznica Ducke. A ltima mudana foi feita em 1938, quando Kostermans props a alterao para A. duckei Kostermans (SUDAM, 1971). A espcie A. duckei Kostermans (Figura 3.6), sinonmia de Aniba roseadora Ducke (DUCKE,1938; SAMPAIO, 2000; MAIA, 2000). Recebe vrios nomes comuns, tais como: pau-rosa, pau-rosa-do-amaznas e umbaba (Brasil), rosewood (Ingls), bois de rose femelle (Guiana Francesa), enclit rosenhout (Suriname), cara-cara (Guiana) (MAIA, 2000) e palo de rosa (pases amaznicos de lngua castelhana) (CLAY, 1993). No Brasil, ocorre ao oeste do Amap, ao longo de ambos os lados do Rio Amazonas, tendo grandes concentraes em Curu-Uma

20 Captulo 3 Fundamentao Terica (perto de Santarm PA) para a fronteira peruana, ao sul e do rio Trombetas para a Colmbia, ao norte. Tambm encontrado ao redor de Belm e na Ilha de Maraj, ambos no estado do Par (SUDAM, 1972). Sua rvore, Figura 3.6, pode atingir at 30 metros de altura e seu tronco dimetro de dois metros, tendo casca pardo-avermelhada, folhas semicoriceas, lisas e inflorescncia em panculas multifloras delicadas. As flores so ferrugneas e o fruto uma drupa, de 2 a 3 centmetro de comprimento, com cpula bastante espessa. O tipo de vegetao onde ocorre de floresta tropical mida e terra firme (SAMPAIO, 2000). Seu leo essencial utilizado em perfumaria e um dos trs nicos produtos da flora amaznica regional que foram includos na pauta de exportao nos ltimos oitenta anos.

Figura 3.6. rvores plantadas em rea de cultivo do Pau Rosa (Reserva Florestal Ducke Manaus / AM).

21 Captulo 3 Fundamentao Terica A explorao do Pau Rosa para extrao de seu leo essencial tem sido executada desde 1911 (AZEREDO, 1958), desempenhando uma importante funo econmica da regio amaznica devido alta concentrao de linalol na constituio qumica do leo, tendo sido considerado, naquele tempo, a principal fonte mundial desse componente. A explorao desenvolveu-se, entretanto, de forma rpida e

desordenadamente a partir de 1920, a ponto de em 1927, das 200 toneladas produzidas 80 no encontrarem mercado consumidor. Na dcada de 40 esse produto ocupou o terceiro lugar na pauta de exportaes da Amaznia, segundo a SUDAM, 1972. A explorao diminuiu a partir de 1952. Em 1955 a produo do leo de Pau Rosa brasileiro atingiu quase quinhentas toneladas anuais. Em meados dos anos 60 a produo brasileira ficou em torno de algumas centenas de toneladas anuais. At o ano de 1969 existiam 53 usinas de destilao conhecidas, sendo 3 no estado do Par e 50 no Amazonas. Em 1971 apenas 20 usinas estavam em funcionamento, sendo 7 no Par e 13 no Amazonas. Em 1995 a produo ficou em torno de 130 toneladas por ano, com exportao de um pouco mais de 29 toneladas (CUNHA, 2002). Essa exportao chegou a apenas 22,8 toneladas, em 2002 e, pelo ltimo levantamento do IBGE, em 2004 foram exportadas 29,5 tonelada de leo do pau-rosa (HOMMA, 2005). Atualmente, menos de 15% do leo de Pau Rosa industrializado no Brasil e o restante exportado para os Estados Unidos, Japo, Frana, Holanda, Inglaterra e Sua.

3.9 O leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans O leo essencial de pau-rosa amaznico, como conhecida popularmente a Aniba duckei Kostermans, caracteriza-se por seu forte odor, incolorao e densidade inferior da gua, solubilidade em solventes orgnicos usuais e lcool 70 GL (SUDAM,1972; CHAAR, 2000; TELES, 2003).

22 Captulo 3 Fundamentao Terica O linalol, cujo nome cientfico 3,7-dimetil-oct-1,6-dien-3-ol e suas frmulas, estrutural e molecular, encontram-se na Figura 3.7 (A e B), o constituinte majoritrio do leo da Aniba duckei Kostermans. Outros componentes minoritrios fazem parte da composio do rleo essencial (TELES, 2003).

OH

C 10 H 18 O
(A) (B)

Figura 3.7. Frmulas do linalol: estrutural (A) e molecular (B).

O linalol, um monoterpeno alcolico tercirio de cadeia aberta, uma das substncias mais importantes na indstria de aromas, sendo um dos substitutos para o leo de lavanda francesa ou da bergamota, pois sua forma levorrotatria possui odor similar a estes leos. O linalol ocorre naturalmente em forma de dois estereoismeros, o 3R-(-)-linalol (Figura 3.8, A) e o 3S-(+)-linalol (Figura 3.8, B), que possuem odores distintos. O ismero levorrotatrio (lincareol) possui um aroma de lavanda e flores frescas, com notas de lrio-do-vale, enquanto o dextrorrotatrio (coriandrol) possui um cheiro herbceo, com tom de folhas envelhecidas,

frequentemente descritas como uma nota ctrica (KOPPENHOEFER et al., 1994; SIANI, et al., 2002; SIANI, et al., 2005).

23 Captulo 3 Fundamentao Terica H 3C

H 3C

H2C

OH

H2C

OH

H 3C

(A )

CH 3

H 3C

CH 3 ( B)

Figura 3.8. Estruturas enantiomricas do linalol: (A) 3R-(-)-linalol ou lincareol; (B) 3S-(+)-linalol ou coriandrol.

3.10 Tcnicas Analticas A avaliao quantitativa e qualitativa de leos essenciais envolve a utilizao de diversas tcnicas bsicas, tais como: Cromatografia Gasosa (CG), Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM), Espectrometria Vibracional de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e Espectrometria Eletrnica de Ultravioleta (UV) (MOUCHREK FILHO, 2000). Neste trabalho faz-se apenas uma breve abordagem de cada uma dessas tcnicas. Informaes mais detalhadas podem ser obtidas nas literaturas especializadas (WHITE, 1990; SKOOG, et al., 2002; SILVERSTEIN et al., 2007). Uma separao adequada de mistura natural multicomponente, como o caso dos leos essenciais, por cromatografia gasosa baseia-se na diferena das interaes fsicas entre os componentes da mistura e a fase estacionria da coluna. Assim, a escolha da coluna parte importante do processo de separao. A espectrometria de massas acoplada cromatografia a gs (CG-EM) um importante mtodo na anlise de substncias orgnicas. As molculas eludas na coluna analtica sofrem uma fragmentao num campo de alta energia. A anlise desses fragmentos d informaes sobre a provvel estrutura da substncia.

24 Captulo 3 Fundamentao Terica O espectro infravermelho d informaes sobre grupos funcionais bem como a vizinhana dos mesmos e at a geometria de duplas ligaes, quando estas so presentes. A espectrometria IV baseia-se na vibrao de tomos, contidos numa molcula, excitados por raios eletromagnticos de infravermelho, na faixa de comprimento de ondas entre 2,5 e 25 m ou nmero de ondas 4000 e 400 cm-1. O processo quantizado e assim o espectro vibracional apresenta-se em bandas. Cada mudana de nvel de energia vibracional apresenta uma srie de energia rotacional e, como consequncia, as linhas do espectro rotacional se sobrepem dando as bandas observadas. A absoro molecular na regio do Ultravioleta e do Visvel depende da estrutura eletrnica da molcula. A absoro de energia quantizada e conduz passagem dos eltrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em estado excitado. Para muitas estruturas eletrnicas esta absoro ocorre em uma poro acessvel do UV. Na prtica, a espectrofotometria no ultravioleta limitada, na maior parte, aos sistemas conjugados.

3.11 Anlise Trmica 3.11.1 Conceito De acordo com Mackenzie (1984), a Anlise Trmica um conjunto de tcnicas, nas quais uma propriedade fsica de uma substncia e/ou seus produtos de reao medida, enquanto a amostra submetida a uma programao controlada de temperatura. O desenvolvimento da anlise trmica deu-se progressivamente em funo de trabalhos de pesquisadores isolados e teve no surgimento da International Confederation of Thermal Analysis and Calorimetry (ICTAC) e no grande avano em equipamentos comerciais a tornaram um campo extremamente ativo com aplicaes em diversos ramos da pesquisa cientfica bem como na indstria.

25 Captulo 3 Fundamentao Terica 3.11.2 Tcnicas Termoanalticas Uma tcnica considerada termoanaltica quando ela obedece aos seguintes critrios: mede a variao de uma propriedade fsica quando a amostra aquecida ou resfriada; expressa a medida, direta ou indiretamente, em funo da temperatura; realiza a medida sob controle de temperatura (WENDLANTD, 1986). A Tabela 3.1 mostra algumas dessas tcnicas acompanhadas das respectivas propriedades fsicas

correspondentes: Tabela 3.1. Anlise trmica Propriedade Tcnica Termogravimetria Massa Termogravimetria Derivada Temperatura Anlise Trmica Diferencial Calorimetria Exploratria Entalpia Diferencial DSC DTG DTA TG Sigla

A anlise trmica de leos essenciais pouca explorada, porm Cavalheiro et al. (2004) trabalharam com DSC para determinar pontos de ebulio e suas mudanas de entalpia de alguns leos essenciais, enquanto que Novak et al. (2004) concluram que para anlise de leos essenciais seria mais apropriada a aplicao de tcnicas termoanalticas combinadas (TG-FT-IR, TG-MS). A seguir algumas dessas tcnicas sero apresentadas. 3.11.2.1 Termogravimetria

A Termogravimetria uma tcnica na qual a variao de massa que ocorre na amostra acompanhada em funo do tempo (sob

26 Captulo 3 Fundamentao Terica temperatura constante) ou em funo da temperatura (SANTOS et al., 2000). A medida realizada utilizando-se um equipamento denominado microbalana, que consiste na combinao de uma microbalana eletrnica acoplada a um forno e um programador linear de temperatura, permitindo a pesagem contnua de uma amostra em funo da temperatura, medida que a amostra aquecida ou resfriada (SANTOS, 2004). Existem fornos que podem operar at 2400 C. As temperaturas do forno e da amostra so determinadas com o auxilio de um par termoeltrico e o sensor deve ser localizado a cerca de 1-2 mm da amostra. A escolha do porta-amostras dever ser feita de acordo com a amostra e a temperatura a que ser aquecido o forno (SANTOS, 2001). A atmosfera que circunda a amostra pode ser controlada, podendo ser esttica ou dinmica; presso ambiente ou sob presso ou a vcuo; atmosfera inerte (nitrognio ou argnio) ou oxidante (gs oxignio ou ar sinttico) (GALIM et al., 2002). O registro dos experimentos termogravimtricos so curvas em que se observam variaes de massa em decorrncia da sada de produtos volteis (IONASHIRO e GIOLITO, 1980).

3.11.2.2 Termogravimetria Derivada (DTG) A Termogravimetria Derivada (DTG) a primeira derivada da curva termogravimtrica, ou seja, a derivada da variao de massa em funo do tempo ou da temperatura. A curva DTG apresenta informaes de uma mais clara, sendo a rea ditamente proporcional variao de massa, o que leva determinao da temperatura de pico e indicando as temperaturas inicial e final do processo que est sendo investigado (GONALVES et al., 2003).

27 Captulo 3 Fundamentao Terica A curva DTG torna-se interessante para resolver os seguintes problemas: separao de reaes sobrepostas; identificao de uma determinada substncia; clculo da variao de massa em reaes sobrepostas; anlise quantitativa por medida da altura de pico e distino de eventos trmicos quando comparados com a curva DTA.

3.11.2.3 Anlise Trmica Diferencial (DTA) A Anlise Trmica Diferencial (DTA) uma tcnica na qual a temperatura da amostra, comparada com a temperatura de um material de referncia, termicamente inerte, registrada quando a amostra aquecida ou resfriada a uma razo uniforme, permitindo o reconhecimento de efeitos trmicos (WENDLANDT, 1996). As variaes de temperatura da amostra so causadas por transies entlpicas endotrmicas ou exotrmicas, registrando-se a diferena de temperatura entre a mostra e a referncia em funo da variao de temperatura. Por isso o termo diferencial.

3.11.2.4 Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) Nesta tcnica, Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC), medese a diferena de energia liberada ou absorvida pela amostra, em relao a um material de referncia, termicamente inerte, em funo da temperatura, enquanto a amostra e a referncia so submetidas a uma programao de temperatura (BERNAL et al., 2002). Quando um material sofre algum tipo de mudana de estado fsico ou reao qumica, ocorre uma quantidade de calor envolvido, liberado ou absorvido. A DSC mede as variaes de energia trmica para manter em equilbrio as temperaturas da amostra e do material de referncia, durante o evento trmico. Regra geral considera-se que transio de fase, desidratao, reduo, e algumas reaes de

28 Captulo 3 Fundamentao Terica decomposio produzem efeitos endotrmicos, ao passo que cristalizao, oxidao e algumas reaes de decomposio produzem efeitos

exotrmicos. Isto vlido tanto para DSC quanto para DTA (DANTAS, 2006). Em algumas tcnicas instrumentais, inclusive a anlise trmica, um grande nmero de fatores pode afetar a natureza, preciso e exatido dos resultados experimentais. Os fatores que podem influenciar o aspecto das curvas TG so classificados em duas categorias (GIOLITO, 1988): Fatores Instrumentais, dentre os quais se pode citar: atmosfera do forno; composio do porta-amostra; razo do fluxo do gs de arraste; razo de aquecimento do forno; geometria do porta-amostra e do forno; velocidade do registrador; sensibilidade do mecanismo de deteco; Fatores caractersticos da amostra, dentre os quais se pode citar: natureza da amostra; granulometria da amostra; quantidade da amostra; calor de reao; compactao da amostra; solubilidade dos gases liberados; condutividade trmica da amostra. O conhecimento detalhado da ao destes fatores muito importante, pois permite que o operador obtenha o mximo proveito das curvas termogravimtricas, evitando que os erros mascarem os resultados. Para se ter uma boa reprodutibilidade nas medidas, importante que se tenha amostra e condies experimentais com as mesmas caractersticas. Muitos fatores citados ainda continuam sendo estudados porque, apesar de boa parte deles ser constante para uma dada termobalana (geometria do porta-amostra, velocidade do registrador, sensibilidade do mecanismo de deteco), muitos outros fatores so variveis e difceis de serem controlados (solubilidade dos gases liberados, perturbaes eletrostticas e compactao da amostra).

4 - Metodologia Experimental

29 Captulo 4 Metodologia 4 METODOLOGIA A metodologia adotada envolveu atividades usuais em um tratamento analtico de plantas aromticas, bem como a anlise trmica por DSC, alm do teste da atividade larvicida do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans

4.1 Materiais e Equipamentos Esta pesquisa foi desenvolvida no Laboratrio de Combustveis e Materiais (LACOM) na Universidade Federal da Paraba (UFPB) em parceria com o Laboratrio de Pesquisa em Qumica Analtica (LPQA), Central Analtica e Laboratrio de Fsico-Qumica, Microbiologia do Pavilho Tecnolgico da Universidade Federal do Maranho (UFMA), Laboratrio de Pesquisas e Ensaios de Combustveis LAPEC da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) e Instituto de Qumica de So Carlos da USP.

4.1.1 Moinho Eltrico Utilizou-se o moinho eltrico marca Tecnal, modelo TE 340 para a triturao das amostras.

4.1.2 Refratmetro Utilizou-se um refratmetro marca AABE, modelo 2 WAJ, para as medidas de ndice de refrao.

30 Captulo 4 Metodologia 4.1.3 Extrator de Clevenger Foi utilizado um extrator de Clevenger de vidro, acoplado a um balo de fundo redondo de 1000mL, para extrao do leo essencial (Figura 4.1) e uma manta foi usada como fonte de calor.

Figura 4.1 Sistema Extrator de Clevenger Adaptado

4.1.4 Espectrmetro Ultravioleta Utilizou-se um espectrofotmetro UV Vis. marca HP, modelo 8452A, equipado com monitor e impressora HP.

31 Captulo 4 Metodologia 4.1.5 Espectrmetro Infravermelho com Transformada de Fourier (Interfermetro) Utilizou-se um espectrofotmetro FTIR marca BOMEM, modelo MB 102, usando pastilhas de brometo de potssio (KBr), na faixa de 4000 a 400 cm-1.

4.1.6 Cromatgrafo a Gs acoplado a Espectrmetro de Massas O leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans foi analisada por cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrmetro de massas por impacto de eltrons e analisador on trap (CG-EM-IE-Ion trap), utilizando-se o equipamento da marca Varian, modelo 3900 (equipado com Software Saturno 2100 T GC/MS) acoplado a um Espectrmetro de Massas on Trap 2000, por impacto de eltrons (70 eV). Usou-se uma Coluna VF-5ms LB com 30 m x 25 mm x 0,25 m, fase estacionria 1% fenil-dimetil polisiloxano e a fase mvel usada foi o gs Hlio; Software de busca com bibliotecas NIST e WILEY com aproximadamente 500.000 espectros massas.

4.1.7 Estudo Trmico A anlise trmica de pouco uso na anlise de leos essenciais. Porm, so possveis estudos da perda de massas da amostra pela ao trmica. Alm disso, os pontos de congelamento, fuso e ebulio so propriedades fsicas que tm todas as condies para serem determinadas por anlise trmica, especialmente pela tcnica de calorimetria exploratria diferencial (DSC) e Termogravimetria (TG). As curvas termogravimtricas e calorimtricas foram obtidas em Analisador Trmico da marca TA INSTRUMENTS, modelo SDT 2920 atravs do mtodo no isotrmico de anlise, na razo de aquecimento de 10 C min-1.

32 Captulo 4 Metodologia E intervalo de temperatura de 25-350 C, visando verificar o perfil da decomposio trmica.

4.2 Metodologia Experimental A seguir descrevem-se os procedimentos efetuados

experimentalmente para a realizao dessa pesquisa:

4.2.1 Origem, Coleta, Preparao e Armazenamento da Amostra Vegetal Amostras, folhas e galhos finos, foram coletadas de trs arvores da Aniba duckei Kostermnas cultivadas na Reserva Florestal Ducke, rodovia AM 010, km 26, Manaus, Amaznas, Brasil (0300''02'' e 030800'''de latitude sul e 5958' 00'' de longitude oeste). Essas coletas foram realizadas em maro de 2006. Em seguida, as amostras foram secas por sete dias sob ventilao natural, trituradas e armazenadas em frascos de polipropileno para posterior extrao dos leos essenciais.

4.2.2 Extrao do leo Essencial O leo essencial foi extrado de 30 gramas de galhos finos da espcie Aniba duckei Kostermans com 300 mL de gua destilada, por hidrodestilao, em um sistema de Clevenger (Figura 2.1) mantendo-se a temperatura de 100 C. Posteriormente, o leo foi seco por meio da percolao em Na2SO4 anidro. Essas operaes foram realizadas em triplicatas e as amostras foram armazenadas em frascos de vidro sob refrigerao, para evitar possveis perdas de constituintes volteis. Em seguida, esses leos foram submetidos s anlises.

33 Captulo 4 Metodologia O rendimento foi calculado na relao massa/massa pela medida da densidade, observando o volume obtido no prprio sistema de extrao.

4.2.2.1 Determinao do Tempo de Extrao O melhor tempo de extrao foi determinado em funo do rendimento do leo essencial. Seis extraes foram realizadas nos tempos 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 horas. Exceto o tempo, todos os outros parmetros foram mantidos como descritos anteriormente.

4.2.3 Padres Como padres foram utilizados o linalol racmico, linalol da marca Aldrich (aldrich Chemical Co.) e R-(-)-linalol da marca Fluka (Fluka Chemie GmbH). As solues padro de monoterpenos em etanol e em hexano foram preparadas por diluio em diferentes concentraes.

4.2.4 Caractersticas Fsicas do leo Essencial Na caracterizao das propriedades fsicas do leo essencial de galhos da espcie Aniba duckei K. foram realizadas as anlises de densidade, ndice de refrao, ponto de ebulio, solubilidade em etanol a 70%, cor e aparncia.

4.2.4.1 Densidade Para o clculo da densidade, utilizou-se um balo volumtrico aferido de 1 mL, o qual foi escolhido devido ao pequeno volume de amostra de

34 Captulo 4 Metodologia leo essencial disponvel, previamente seco, tarado e aferido, onde adicionouse a amostra de leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans a 25 C, pesando-se em seguida.

4.2.4.2 Solubilidade em Etanol (70%) Para a determinao da solubilidade, utilizou-se uma mistura de etanol em gua a 70% (volume/volume). A solubilidade foi feita mantendo-se constante o volume de leo e adicionando-se proporcionalmente volumes crescentes da mistura alcolica, at a sua completa solubilizao.

4.2.4.3 ndice de Refrao Para a medida do ndice de refrao foram utilizados tubos capilares de vidro para adicionar as amostras de leos diretamente sobre o prisma de Flint do refratmetro, a uma temperatura de 25 C.

4.2.4.4 Rendimento do leo Essencial Para o clculo do rendimento da extrao de leo, mediu-se o volume do leo obtido na extrao, percolou-se em Sulfato de sdio (Na2SO4) anidro e pesou-se em balo volumtrico seco e tarado 25 C, determinando-se a massa do leo em relao a massa da amostra.

4.2.4.5 Cor A tcnica proposta a visual, feita por comparao das cores das essncias com as cores conhecidas.

35 Captulo 4 Metodologia 4.2.4.6 Aparncia A tcnica proposta tambm a visual, onde se faz uma comparao das essncias no que diz respeito a sua transparncia ou limpidez.

4.2.5 Anlises Espectromtricas 4.2.5.1 Anlise Espectromtrica na Regio do Ultravioleta Visvel A anlise espectromtrica na regio do Ultravioleta-visvel do leo essencial da espcie Aniba duckei Kostermans foi realizada em um espectrofotmetro da marca HP, modelo 8451A. Para tanto, as amostras foram diludas em mistura de 60% de etanol/gua.

4.2.5.2 Anlise Espectromtrica na Regio do Infravermelho com Transformada de Fourier (Interfermetro) As amostras de leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans foram analisadas em um espectrofotmetro FTIR marca BOMEM, modelo MB 102, usando pastilhas de brometo de potssio (KBr), na faixa de 4000 a 400 cm-1.

4.2.5.3 Anlise por Cromatografia Gasosa acoplada Espectrometria de Massas As anlises do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans por cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrmetro de massas por impacto de eltrons e analisador on trap (CG-EM-IE-Ion trap), equipamento marca Varian, modelo 3900, foram realizadas utilizando hlio
-1

como gs de arraste com fluxo na coluna de 1 mL min ; temperatura do Injetor:

36 Captulo 4 Metodologia 270 C, split 1:50; coluna capilar (30 m x 25 mm) com fase estacionria VF-1ms (100 % metilsiloxano 0,25 m) e programao de temperatura do forno de 60 a
-1

220 C com taxa de aquecimento de 4 C min e de 220 a 260 C com razo de aquecimento de 1 oC min , com o tempo de corrida ficando em 100 minutos. No Espectrmetro de Massas as temperaturas do mainfold, ion trap e da linha de transferncia foram de 50, 190 e 200 C, respectivamente. Foram injetadas alquotas de 1,0 L (injetor automtico CP-8410) das amostras diludas na proporo de 20 L em 1,5 mL de hexano.
-1

4.2.6 Quantificao de Linalol por Cromatografia Gasosa O linalol foi quantificado pelo mtodo do padro externo, considerando a sua alta concentrao nas amostras. As amostras foram diludas em etanol absoluto. As curvas analticas foram construdas com padres. Os clculos das concentraes foram feitos pelas respectivas equaes das retas obtidas nas curvas analticas.

4.2.7 Estudo Trmico As curvas calorimtricas foram obtidas em Analisador Trmico, marca TA INSTRUMENTS, modelo SDT 2920 atravs do mtodo no isotrmico de anlise, na razo de aquecimento de 10 C min-1. E intervalo de temperatura de 25-350 C, visando verificar o perfil da decomposio trmica.

4.2.8 Obteno e Cultivo das Larvas Como os ovos do Aedes aegypti no so postos diretamente na gua, mas sim milmetros acima de sua superfcie, principalmente em recipientes artificiais, foi preparada uma armadilha simples para coleta desses ovos. Para tanto, foram utilizados jarros de plstico para planta, de aproximadamente 500 mL, semi-preenchidos com gua e um pedao de

37 Captulo 4 Metodologia madeira de dimenses aproximadamente 20 cm x 5 cm com uma parte imersa e outra no, Figura 4.2. A fmea do Aedes aegypti, deposita seus ovos na parte imediatamente superior lmina dgua, na parte do madeirite ainda mida, mas fora da gua do jarro. Os ovos do Aedes aegypti foram imersos numa bacia plstica, de formato retangular, com cerca de 3 litros de gua mineral para a ecloso. Aps a imerso dos ovos, 0,5 g de rao de rato foi adicionado gua para auxiliar no crescimento das larvas. Todo o material foi mantido no interior de uma gaiola de madeira e coberta com uma tela de tecido, apropriada para insetos, a fim de evitar a contaminao por ovos de outras espcies de mosquito. Aps a ecloso, as larvas foram acompanhadas at que atingissem o 3 ou 4 estgio do desenvolvimento, quando ento foram utilizadas nos ensaios de atividade larvicida. So necessrios de 4 a 5 dias para que as larvas atinjam o tamanho ideal para os ensaios.

Figura 4.2. Armadilhas para coleta dos ovos do Aedes aegypti. As larvas foram identificadas, como sendo do Aedes aegypti, por tcnicos do laboratrio do Ncleo de Patologia Tropical e Medicina Social, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Maranho.

4.2.9 Teste de Toxidade Para realizao do teste de toxidade, as larvas selecionadas, entre o terceiro e o quarto estgios, (10 por teste) foram transferidas para um

38 Captulo 4 Metodologia bquer contendo 20 mL de gua mineral (26 28 C ). As larvas foram capturadas utilizando-se uma pipeta de Pasteur. Cada teste foi feito em quintuplicata para cada concentrao testada. Os controles positivos foram realizados com o organofosforado temefs em larvas do Aedes aegypti, na concentrao utilizada pela vigilncia sanitria que de 100 ppm. Os controles negativos foram realizados com 20 mL de gua mineral (26 28 C) contendo 0,04% de Tween. As larvas foram expostas s solues por 24 horas e ao fim deste perodo registrou-se a mortalidade. Para o preparo da soluo teste, pesou-se 20 mg do leo essencial, em um recipiente do tipo eppendorf, para cada mililitro da soluo teste e, em seguida, foi adicionada uma gota de solvente, do tipo tween 80, sobre o leo, fazendo-se ento a homogeneizao. A seguir, utilizando-se uma pipeta automtica, foi adicionado um mililitro de gua destilada fazendo-se nova homogeneizao. Esta soluo foi ento transferida para o bquer contendo as larvas separadas para o teste, de acordo com as concentraes pr-estabelecidas aps testes iniciais.

4.2.10 Anlise Estatstica Aps os testes, montou-se uma tabela com os valores das sete concentraes, log das mesmas, o nmero de larvas mortas aps 24 horas (mdia dos cinco pontos), nmero de larvas vivas aps 24 horas (mdia dos cinco pontos), o acumulado de vivos (soma das clulas de mortos abaixo) e o acumulado de vivos (soma das clulas de vivos acima). A anlise estatstica dos dados foi realizada de acordo com o mtodo Reed-Muench, o qual parte do princpio de que, um animal que sobreviva a certa dose, tambm ir sobreviver em qualquer outra dose menor que aquela, conseqentemente o animal que morrer com certa dose, tambm ir morrer em doses maiores que aquela. A partir de uma tabela contendo os dados de mortalidade para cada concentrao testada, construdo um grfico onde se observa uma curva para o acmulo de animais mortos em cada concentrao e outra curva para o acmulo de sobreviventes. O ponto de

39 Captulo 4 Metodologia intercesso entre as curvas a Concentrao letal 50% (CL50), pois nesse ponto o nmero de animais sobreviventes igual ao nmero de animais mortos (COLEGATE & MOLYNEUX, 1993).

O intervalo de confiana foi calculado segundo o mtodo de PIZZI (1950). Para tanto, constri-se um grfico do percentual de mortos versus logaritmo (log) da dose. A seguir determina-se o valor de R, que a diferena entre o log da dose que mata 75% das larvas e o log da dose que mata 25% das larvas. Calcula-se tambm a varivel h que consiste na mdia das diferenas dos valores de log das doses. Com esses dados determina-se o log do erro padro (SE), atravs da seguinte frmula: (SE)2 = 0,79 x h x R/20. Finalmente, o valor do intervalo de confiana igual 2 x 10SE.

5 - Resultados e Discusso

40 Captulo 5 Resultados e Discusso 5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1

Estudo do tempo de extrao do leo essencial O tempo de extrao do leo essencial um dos principais

parmetros fsico-qumicos da indstria de essncias, porque, alm de estar diretamente relacionado com a qualidade do leo essencial, se reflete na natureza econmica do processo. Uma destilao rpida pode conduzir a um produto contendo predominantemente constituintes mais volteis mais destitudos das melhores caractersticas; ao contrrio, uma extrao prolongada encarece o produto e tambm pode elevar a quantidade de compostos de aroma menos estimados (CHAAR, 2000; MOUCHREK FILHO, 2000). Neste trabalho, o estudo do tempo de extrao ideal para o leo essencial por hidrodestilao em galhos, de uma massa fixada em 30 g em 300 mL de gua destilada, em funo do rendimento percentual do leo, que resultou na Figura 5.1, na qual pode se observar que o rendimento mximo do leo extrado foi verificado no tempo de extrao de 4,0 horas, obtendo-se um volume de leo essencial igual a 0,65 mL. A este valor foi atribudo o percentual mximo de rendimento. A partir desse tempo a quantidade de leo extravel permaneceu constante. Dessa forma, de acordo com esses resultados, prope-se que o tempo ideal seja de 4,0 horas, que corresponde a um rendimento de 100% de leo essencial.

41 Captulo 5 Resultados e Discusso

100

Rendimento de leo (%)

90

80

70

60

Tempo de extrao (h)

Figura 5.1 - Variao do rendimento de leo essencial em funo do tempo de extrao.

5.2 Caractersticas Fsicas do leo Essencial As essncias alteram-se com maior ou menor facilidade,

dependendo da natureza qumica dos seus constituintes e consoante s circunstncias do meio. Entre os fatores principais que as modificam esto o ar, a luz, o calor, a gua e impurezas diversas de origem natural ou oriunda de falsificaes. As alteraes podem ser reconhecidas tanto por mudanas de suas caractersticas organolpticas (aroma, cor, sabor, transparncia, fluidez), como tambm dos valores dos seus parmetros qumicos e fsicos. Desta maneira, diminuindo as suas qualidades, reduz-se de igual modo o seu aproveitamento nas indstrias de perfumaria, cosmtica, alimentos, qumicas, etc. Prejuzos anlogos sofrem as indstrias farmacuticas, quando se utiliza como corretivo do cheiro; sabor e a teraputica, quer pela diminuio dos constituintes ativos, quer, por se tornarem agressivos quando usados externamente, causando irritaes na pele (TELES, 2003).

42 Captulo 5 Resultados e Discusso Os parmetros fsicos dos leos essenciais dos galhos so mostrados na Tabela 5.1. Tabela 5.1 - Propriedades fsico-qumicas do leo essencial extrado de galhos da espcie Aniba duckei Kostermans.

Propriedaes fsicoqumicas Densidade (g mL-1) Solubilidade em lcool a 70% (v/v) ndice de refrao (ND 25) Cor Aparncia

leo essencial 0,86

(a)

leo essencial (b) 0,87

leo essencial (c) 0,89

1:2

1:2

1:2

1,46

1,47

1,47

Amarelo Lmpido

------

Amarelo Lmpido

(a)Esta pesquisa (coleta em maro de 2008). (b)RAOUL, 1953. (c)CHAAR, 2000.

Comparando-se os valores para o leo essencial dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermas com os da literatura, pode-se observar que h uma similaridade entre eles, no que diz respeito densidade, ao ndice de refrao, solubilidade em etanol a 70%, cor e aparncia.

43 Captulo 5 Resultados e Discusso 5.3 Anlises Espectroscpicas e Cromatogrficas do leo Essencial da Espcie Vegetal Aniba duckei Kostermans A anlise espectroscpica dos leos essenciais de galhos da Aniba duckei Kostermans, comparando com os dados do padro de linalol e da literatura, proporcionou resultados similares. 5.3.1. Anlise Espectroscpica na Regio do Ultravioleta Os espectros de absoro na regio do ultravioleta, para mistura etanol/gua a 60%, em volume (A), para o padro de linalol (B), e para leo essencial da Aniba duckei Kostermans (C) so apresentados na Figura 5.2.

Figura 5.2 - Espectros de absoro no UV: (A) mistura etanol/gua a 60 %. (B) padro de linalol e (C) leo essencial extrado de galhos. Nessa anlise espectroscpica, a mistura de etanol/gua a 60% em volume foi escolhida aps um estudo sobre a solubilidade do leo essencial nesta mistura e sua absorbncia. A Figura 5.2 mostra que a mistura etanol/gua no absorve na regio do UV. Podemos observar tambm que o mx da amostra de leo essencial extrado de galhos da espcie Aniba duckei Kostermans, Figura 5.2C, muito prximo do mx. da soluo de padro de linalol, Figura 5.2B, indicando que se trata do mesmo composto.

44 Captulo 5 Resultados e Discusso Na regio do ultravioleta as absores ocorrem por meio de transies eletrnicas. Uma banda prxima a 200 nm tem sido atribuda elevao simultnea de dois eltrons para orbitais *, estando a intensidade da absoro do alqueno essencialmente independente do solvente devido prpria natureza apolar da ligao carbono-carbono (SILVERSTEIN et al., 2007; BELAICHE, 2005). Para o linalol, considerando que um composto insaturado com duas duplas ligaes (Figura 5.2), espera-se uma transio desse tipo, pois quando duas ou mais ligaes etilnicas ocorrem em uma mesma molcula e esto separadas por pelo menos um grupo metileno, a molcula absorve na mesma posio que um nico cromforo. A intensidade da absoro proporcional ao nmero de grupos cromforos isolados na molcula (SILVERSTEIN et al., 2007).

5.3.2

Anlise

Espectroscpica

na

Regio

do

Infravermelho

com

Transformada de Fourier (Interfermetro) A Figura 3.3 mostra os espectros obtidos na regio do infravermelho para o padro de linalol (A) e para o leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans (B). Pela comparao entre o espectro A e o espectro B, da Figura 5.3, observa-se com facilidade que as bandas de absoro so praticamente coincidentes por suas freqncias. As bandas de absoro fortes na regio de 3650 e 3100 cm-1, quando associado a uma banda forte entre 1300-1000 cm-1 (estiramento da ligao C O) e outra prxima de 1150 cm-1 so atribudas hidroxila de lcoois tercirios. Nos espectros A e B da Figura 3.3 podemos observar essas bandas para o padro de linalol e para o leo essencial, respectivamente.

45 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.3 - Espectro na regio do Infravermelho: (A) padro de linalol e (B) leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans A banda de vibrao verificada prximo de 3090 cm-1 (3086 cm
-1

para o padro de linalol e 3099 cm -1, para o leo essencial) proveniente da deformao axial da ligao Csp2H, referente ligao qumica =CH do grupo vinila, que, de acordo com a literatura, dever ter banda fraca observada entre 3100 e 3000 cm
-1

. As bandas de absoro na regio do infravermelho

verificadas na regio de 3000 a 2840 cm-1 constituem absoro proveniente do estiramento da ligao Csp3H, caracterstica dos compostos alifticos. No espectro da Figura 5.3, verifica-se essas bandas em nmeros de ondas, respectivamente, 2972 e 2970 cm
-1

para o padro de linalol e para o leo

essencial. A banda fraca observada em 1625 cm-1 atribuda ao estiramento da ligao dupla C=C (grupo vinila) que, segundo a literatura deve apresentar bandas de 1680-1630 cm-1. A banda que se verifica prximo a 1070 cm-1 atribuda ao estiramento da ligao CO de lcoois. As ligaes Csp2H sofrem deformaes fora do plano que absorvem em regies entre 1000 e 680 cm-1 e quando se trata de =CH2 essa absoro entre 910 e 905. No espectro da Figura 3.3 essas ligaes so verificadas, para o padro de linalol e para o leo, em 908 e 909 cm-1. Estas observaes esto de acordo com a literatura (SILVERSTEIN et al., 2007; LOPES e FACIO, 2004) e so suficientemente justificveis, visto que o linalol o componente majoritrio do leo essencial da Aniba duckei Kostermans, o Pau Rosa amaznico.

46 Captulo 5 Resultados e Discusso As principais bandas verificadas nos espectros vibracionais de absoro na regio do infravermelho para o padro de linalol e para o leo essencial analisado neste trabalho, bem como os seus modos vibracionais, encontram-se dispostos na Tabela 5.2.

TABELA 5.2. Principais bandas de absoro e modos vibracionais do padro de linalol e do leo essencial na regio do infravermelho. Composto (linalol) Tipo de ligao Grupo Tipo de Absoro Absoro

deformao linalol (cm-1) leo (cm-1)

OH

lcool

Axial

3406,4

3395,7

Vinil CH

Axial

3086,2

3099,2

OH

CH

Metil

Axial

2972,0

2970,7

C=C

Vinil

Axial

1625,0

1625,0

CO

lcool

Axial

1068,2

1072,6

CH

Vinil

Fora do plano

908,1

909,9

47 Captulo 5 Resultados e Discusso 5.3.3 Cromatografia Gasosa acoplada Espectroscopia de Massas O cromatograma do leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans, obtido com o uso de uma coluna Capilar, 30 m x 0,25 mm x 0,25 m. HP-5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (Equivalente DB-5MS ou CP-Sil 8CB LB/MS), apresentado na Figura 5.4. As substncias identificadas a partir do cromatograma da Figura 5.4, esto relacionadas na Tabela 3.3. Nessa tabela, constam o nmero do pico pela ordem de eluio, o tempo de reteno de cada substncia na coluna (em minutos), o nome mais comum para cada substncia identificada, a porcentagem de rea normalizada a qual indica a distribuio relativa dos compostos na amostra e a Qualidade, a qual consiste no ndice de pesquisa na base de dados que reflete a similaridade do espectro de massas obtido com os registros nas bibliotecas utilizadas. Adotam-se ndices de qualidade maior que 70.

Tempo de Reteno, min

Figura 5.4 Cromatograma do leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei Kostermans

48 Captulo 5 Resultados e Discusso Para a identificao dos compostos separados e detectados na amostra do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostrmans, utilizouse as bases de dados de espectros de massas das espectrotecas NIST105, NIST21 e WILEY139, e o programa AMSDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution Mass & Identification System), alm de referncias como o livro do Adams (ADAMS, 2001) e artigos que apresentaram anlises com espectros semelhantes. Para o linalol, a confirmao tambm foi pela adio de padro. Tabela 5.3. Compostos identificados na amostra de leo essencial de galhos da espcie Aniba duckei Kostermans Pico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 tRETa 15,61 15,71 17,43 18,06 18,60 21,88 28,26 31,74 32,02 Nome do Composto Limoneno 1,8-Cineol Cis-xido de linalol trans-xido de linalol Linalol -Terpineol -copaeno -Patchuleno Cariofileno %Ab 0,52 1,07 1,94 1,86 89,34 3,06 0,89 0,77 0,55

Tempo de reteno do pico pela ordem de eluio da coluna.

%A = Porcentagem de area normalizada.

O pico cromatogfico de nmero 5, Figura 5.4, com tempo de reteno 18,60 min, corresponde ao componente majoritrio do leo do pau-

49 Captulo 5 Resultados e Discusso rosa, o linalol, C10H18O, massa molecular igual a 154 u. O espectro de massas referente a este pico, para o leo essencial est representado na Figura 5.5. A identificao do linalol por Espectroscopia de Massas foi confirmada pelo padro de linalol, pelas espectroscotecas NIST105, NIST21 E WILWY139 e com dados constantes da literatura (ADAMS, 2001).
OH

C 10 H 18 O

Figura 5.5 - Espectro de massas do composto do pico 5 do cromatograma da Figura 5.4. Este pico refere-se ao linalol.

Segundo a literatura, o pico do on molecular de muito difcil visualizao no caso de alcois tercirios, o que o caso do linalol. Para o este composto, cuja frmula molecular C10H18O, o pico do on molecular m/z = 154 [M]. Na Figura 5.5, o pico 136 [M 18], corresponde perda de gua, enquanto o pico m/z = 121 [M 18 15] correspondente perda de gua e grupo metila. O linalol um lcool tercirio, e para compostos dessa natureza frequente a quebra de ligao carbonocarbono vizinha ao tomo de oxignio, com eliminao do maior grupo, o que fica evidenciado no pico de m/z=71 (H2C=CH-COH+-CH3) e pelo pico de m/z=83 [(CH3)2C=CH-CH2-CH2]. Sendo este ltimo um alceno, ele pode ser identificado por um aglomerado de picos observados em intervalos de 14 unidades, correspondentes perda de grupos metilenos. Para o pico m/z = 121, os picos derivados dessa forma seriam 107,

50 Captulo 5 Resultados e Discusso 93, 79, 65 e 41, o que pode ser observado no espectro do linalol, Figura 5.5 (SILVERSTEIN et al., 2007). O pico 1 da Figura 5.4, segundo o programa AMSDIS (Automaded Spectral Deconvolution Mass & Identification System) e a literatura (ADAMS, 2001), corresponde ao limoneno, C10H18, de massa molecular igual a 136 e porcentagem relativa de rea correspondente a 0,52%. A Figura 5.6 mostra o espectro de massas para esse composto, acompanhado de sua frmula estrutural. Observando o espectro da Figura 5.6, percebe-se que o on molecular o correspondente relao m/z igual a 136. No valor de m/z = 121 [M 15], tem se uma perda de metila e m/z= 107 [M 15 - 14] uma subseqente perda de metileno, seguida de outra perda de metileno que resulta em m/z= 93 [M 15 14 14], o que caracterstico de hidrocarbonetos. O pico m/z = 68 ([C5H8].+) deve ser em decorrncia de um modo especial de quebra semelhante a uma retro-Diels-Alder (SILVERSTEIN et al., 2007).

Limoneno

Figura 5.6. Espectro de massas correspondente ao pico 1 do cromatograma da Figura 5.4, limoneno.

51 Captulo 5 Resultados e Discusso O pico 2, tempo de reteno 15,71 minutos, mostrado no cromatograma da Figura 5.4, refere-se substncia 1,8cineol, C10H18O, massa molecular igual a 154u, cuja porcentagem de rea normalizada igual a 1,07%. Isso pode ser observado pela anlise do espectro de massa da Figura 5.7 e confirmado pelas espectroscotecas NIST105, NIST21 e WILWY139 e com dados constantes da literatura (ADAMS, 2001).

o
1,8 - Cineol

Figura 5.7. Espectro de massas correspondente ao pico 2 do cromatograma da Figura 5.4, 1,8-Cineol

O pico m/z = 139 refere-se a uma provvel perda de grupo metila. J o pico m/z = 111[M 43] corresponde perda do grupo propila ([C3H7]) ao passo que o pico m/z = 93 [M 43 18] deduzido por posterior perda de gua. Os picos de m/z iguais a 81 e 71 possivelmente referem-se a uma clivagem do ciclo. Os picos 3 e 4 no cromatograma da Figura 5.4 correspondem, respectivamente, aos estereoismeros cis e trans do xido de linalol, C10H18O, massa molecular igual a 154, o que est de acordo com a literatura (ADAMS, 2001; MAIA, 2000; NAMARA et al., 2007). As porcentagens de rea normalizada so iguais a 1,94 e 1,86%, respectivamente. Os espectros de

52 Captulo 5 Resultados e Discusso massas desses picos encontram-se nas Figuras 5.8 e 5.9. De acordo com a literatura (FERREIRA et al., 2001) os espectros de massas dos ismeros cis e trans so, normalmente, muito similares e eluem de acordo com seus pontos de ebulio sendo o ismero cis antes do trans. Isso pode ser percebido no cromatograma da Figura 5.4 e na Tabela 5.3, em que o ismero cis do xido de linalol eluiu no tempo de 17,43 minutos ao passo que o ismero trans eluiu no tempo de 18,06 minutos.

o
H

Cis - xido de linalol

OH

Figura 5.8. Espectro de massas correspondente ao pico 3 do cromatograma da Figura 5.4, cis-xido de linalol.

53 Captulo 5 Resultados e Discusso

o
H

trans - xido de linalol

OH

Figura 5.9. Espectro de massas correspondente ao pico 4 do cromatograma da Figura 5.4., trans-xido de linalol.

- terpineol
OH

Figura 5.10. Espectro de massas correspondente ao pico 6 do cromatograma da Figura 5.4, -terpineol.

No tempo de reteno de 21,88 minutos do cromatograma mostrado na Figura 5.4, aparece o pico 6, que aps anlise do espectro de massas,

54 Captulo 5 Resultados e Discusso pelas espectroscotecas NIST105, NIST21 e WILWY139 e com dados da literatura (ADAMS, 2001; NAMARA et al., 2007) conclui-se que se trata do composto -terpineol, C10H18O, de massa molecular igual a 154 e porcentagem relativa de rea correspondente a, cuja porcentagem de rea foi de 3,06%. Pelo espectro de massas da Figura 5.11, possvel notar que o onmolecular, M, aparece em m/z = 154, muito discretamente e logo em seguida aparece o pico m/z = 136 [M 18], representativo da perda de uma molcula de gua do lcool. Em seguida aparecem os picos m/z = 121 [M 18 - 15],

representativo da perda de um grupo metila e o pico com m/z = 107 [M 18 15 14] e 93 [M 18 15 14 14], caractersticos de duas perdas consecutivas de grupos metilenos (CH2), o que est em conformidade com a literatura (ADAMS, 2001; NAMARA et al., 2007). No cromatograma da Figura 5.4, aparece em 28,26 minutos o pico de nmero 7, com abundncia de 0,89%, o qual aps ser analisado pelas espectroscotecas NIST105, NIST21 e WILWY139 e comparado com dados da literatura (ADAMS, 1995; NAMARA et al., 2007), conclui-se que refere-se substncia -Copaeno, C15H24, de massa molecular igual a 154.
H

- copaeno
H H

Figura 3.11. Espectro de massas correspondente ao pico 7 do cromatograma da Figura 5.4, -copaeno.

55 Captulo 5 Resultados e Discusso Ao analisar o espectro de massas referente ao pico 7 do cromatograma da Figura 5.4, percebe-se que o on-molecular apresenta uma intensidade relativa m/z = 204, seguida do fragmento com m/z = 189 [M 15], que representa perda de grupo metila. Na seqncia, o pico com intensidade m/z = 161 [M - 43] indica a perda do grupo isopropila pela molcula -copaeno. O pico 8 da Figura 5.4, tempo de reteno 31,74 minutos, foi caracterizado como sendo o composto -patchouleno, C15H24, com massa molecular igual a 204 e com porcentagem de rea 0,77% de acordo com as espectroscotecas NIST105, NIST21 e WILWY139 e comparado com dados da literatura (ADAMS, 2001). Seu espectro de massas est representado na

Figura 5.12.

-patchuleno

Figura 5.12. Espectro de massas correspondente ao pico 8 do cromatograma da Figura 5.4, -patculeno.

56 Captulo 5 Resultados e Discusso

cariofileno

Figura 5.13. Espectro de massas correspondente ao pico 9 do cromatograma da Figura 5.4, Cariofileno. No tempo de reteno de 32,02 minutos do cromatograma mostrado na Figura 5.4, aparece o pico de nmero 9, que aps anlise do espectro de massas, pelas espectroscotecas NIST105, NIST21 e WILWY139 e com dados da literatura (ADAMS, 2001; NAMARA et al., 2007) conclui-se que se trata do composto cariofileno de frmula molecular C15H24 e massa molecular igual a 204, cuja porcentagem de rea foi de 0,55%.

5.3.4 Quantificao por Cromatografia Gasosa Construiu-se um grfico para avaliar cromatograficamente a

concentrao proposta, registrando-se a concentrao de linalol pelo valor mdio (n = 5) das respectivas reas e interpolando-se o valor da amostra. As Figuras 5.14 e 5.15 apresentam a determinao quantitativa do linalol por CG, usando o mtodo do padro externo baseado no aumento da rea do pico do cromatograma, em funo do aumento da concentrao de linalol da soluo padro. A curva analtica de padro externo caracterizada pelo coeficiente de correlao (r = 0,998820).

57 Captulo 5 Resultados e Discusso Neste mtodo o linalol pode ser determinado com segurana devido sua elevada concentrao no leo essencial, no sendo afetado pelo efeito matriz das amostras. Pela quantificao cromatogrfica (Figura 5.15) pde-se determinar que o teor de linalol contido no leo essencial extrado dos galhos da espcie Aniba duckei K foi de 89,34%, o que est de acordo com a literatura (CHAAR, 2000; TELES, 2003).

Figura 5.14. Curva analtica obtida pelo mtodo do Padro Externo para determinao do Linalol no leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans.

58 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.15. Curva analtica obtida pelo mtodo do Padro Externo, com cromatogramas, para determinao do Linalol no leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans 5.4. Anlise Trmica do leo Essencial 5.4.1. Calorimetria Exploratria Diferencial

As curvas DSC do leo essencial da Aniba dukei Kostermans e do padro de linalol acondicionadas em porta-amostra de alumnio (Al) fechados, com e sem furos, em atmosferas de ar e de gs nitrognio (N2), so mostradas a seguir. A curva DSC obtida com razo de aquecimento de 10 C min-1 para 6,50 mg de amostra de linalol em atmosfera de ar em recipiente de alumnio, sem furo, apresentou um nico pico endotrmico, com temperatura de pico de 204,11C e entalpia de 213,4 J g-1 atribuda volatilizao do linalol, o que pde ser verificado na Figura 5.16.

59 Captulo 5 Resultados e Discusso

2

199.64C 213.4J/g

Heat Flow (W/g)

-2

-4

-6 -50
Exo Up

204.11C

50

100

150

200

250

300

350

Temperature (C)

Universal V3.0G TA Instruments

Figura 5.16. Curva DSC para padro de linalol em atmosfera de ar e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1.

A Figura 5.17 traz a curva DSC obtida com razo de aquecimento de 10 C min-1 e 10,30 mg de amostra para o leo essencial da Aniba dukei Kostermans em cadinho de Al sem furo com atmosfera de ar apresentou duas transies endotrmicas, a primeira com temperatura de pico de 107,32 C e entalpia de 339,4 j/g, e a segunda com temperatura de pico de 213,90 C e entalpia de 60,19 j/g, atribuda volatilizao e/ou decomposio do leo essencial.

60 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.17. Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei Kostermans em atmosfera de ar atmosfrico e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1.

Pela Figura 5.18, referente anlise calorimtrica exploratria diferencial, DSC, com 5,55 mg do padro de linalol em atmosfera de gs nitrognio (N2) e porta amostra de alumnio sem furo, percebe-se um nico pico com temperatura de 206,24 C e entalpia de 253,6 J g-1 atribuda volatilizao do linalol.

61 Captulo 5 Resultados e Discusso

2

201.92C 253.6J/g

Heat Flow (W/g)

-2

-4

-6
206.24C

-8 -100
Exo Up

100

200

300

400
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.18 Curva DSC para padro de linalol em atmosfera de N2 e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1.

As curvas DSC para as determinaes das temperaturas de ebulio do padro de linalol acondicionadas em porta-amostra de alumnio (Al) fechado sem furos, em atmosfera de ar, Figura 5.16, e de gs nitrognio (N2), Figura 5.18 mostram uma variao pequena nas temperaturas de pico e nas entalpias de vaporizao do linalol. A Figura 5.19, mostra a curva DSC obtida com razo de aquecimento de 10 C min-1 e 10,00 mg de amostra para o leo essencial da Aniba dukei Kostermans em cadinho de Al sem furo com atmosfera de gs nitrognio (N2) apresentou duas transies endotrmicas, a primeira com temperatura de pico de 106,12 C e entalpia de 360,5 J g-1, e a segunda com temperatura de pico de 209,90 C e entalpia de 62,88 J g-1, atribuda volatilizao do leo essencial.

62 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.19. Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei Kostermans em atmosfera de gs nitrognio (N2) e panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1.

Uma comparao entre as Figuras 5.17 e 5.19, referentes s curvas de DSC das amostras de leo essencial da Aniba dukei Kostermans em atmosfera de ar (TE =107,32 C e H = 339,4 J g-1 e TE =213,9 C e H = 60,19 J g-1) e de gs nitrognio (TE =106,12 C e H = 360,5 J g-1 e TE =209,9 C e H = 62,88 J g-1), respectivamente, em panela de alumnio sem furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1, mostrou que a variao nas temperaturas de pico e nas entalpias foi pequena. Certamente essa variao ocorreu por conta da presena dos componentes minoritrios, sendo essa variao pequena pelo alto teor de linalol no leo. Para o padro de linalol, Figuras 5.16 e 5.18, referentes s curvas de DSC, os valores de temperatura de ebulio e entalpias tambm sofreram apenas pequenas variaes em atmosferas de ar (TE =204,11 C e H = 213,4 J g-1) e de gs nitrognio (TE =206,24 C e H = 253,6 J g-1). Essas diferenas so a menor em atmosfera oxidante porque, possivelmente, ocorre reao do lcool formando substncias menos polares. As curvas DSC obtidas a partir do padro de linalol, Figuras 5.16 e 5.18, demonstraram ainda que no h evidncia de decomposio do linalol e

63 Captulo 5 Resultados e Discusso que tambm clara a ausncia de gua de hidratao. Porm, as curvas DSC obtidas com o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans, Figuras 5.17 e 5.19, mostram uma transio endotrmica em torno de 100 C, o que pode evidenciar que o leo essencial apresenta gua de hidratao. A Figura 5.20 apresenta a curva DSC obtida com razo de aquecimento de 10 C min-1 e 5,27 mg de amostra do leo essencial da Aniba dukei Kostermans em cadinho de Al com furo em atmosfera de gs nitrognio (N2). Percebem-se nessa figura, duas transies endotrmicas, a primeira com temperatura de pico de 99,36 C e entalpia de 215,0 J g-1, e a segunda com temperatura de pico de 167,08 C e entalpia de 42,65 J g-1, atribuda volatilizao e/ou decomposio do leo essencial.

0.2

0.0
137.42C 42.65J/g

-0.2
58.26C 215.0J/g

Heat Flow (W/g)

-0.4

167.08C

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2 0
Exo Up

99.36C

50

100

150

200

250

300

350
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.20. Curva DSC para o leo essencial da Aniba dukei Kostermans em atmosfera de gs nitrognio (N2) e panela de alumnio com furo, com razo de aquecimento de 10 C min-1.

De acordo com os resultados mostrados e com a literatura, percebese que os melhores resultados foram aqueles onde as amostras foram acondicionadas em cadinhos de Al sem furos, mesmo levando-se em considerao que o nmero de transies foi o mesmo para o leo essencial

64 Captulo 5 Resultados e Discusso da Aniba duckei K. A melhor definio das curvas de DSC usando-se o porta amostra de Al sem furo pode ser atribuda alta volatilidade dos leos essenciais em geral. Dessa forma, seria interessante que, para futuras anlises, de acordo com os resultados aqui descritos, fosse utilizado esse tipo de porta amostra (MONTEIRO, 2008). A grande semelhana entre os valores da temperatura do leo essencial da Aniba duckei e do padro de linalol pode ser explicada pelo fato de o linalol ser o componente majoritrio no leo, com 89,34%. Alm disso, o valor de temperatura atribuda temperatura de ebulio do linalol semelhante ao encontrado na literatura (MERK, 1996; CAVALHEIROS, 2004). As diferenas entre os pontos de ebulio e nas entalpias do padro de linalol e do leo essencial medidos neste trabalho justificam-se pela presena dos componentes minoritrios bem como as possveis interaes entre eles e suas respectivas concentraes no leo essencial. Deve se considerar que o fato de o leo apresentar outras substncias de diferentes polaridades, massas moleculares e foras intermoleculares deve influenciar nessas temperaturas de ebulio. Por se tratar de uma tcnica nova e eficiente para a determinao de temperaturas de ebulio de leos essenciais, novos estudos devero ser realizados no sentido de ampliar seu espectro de investigao cientfica de leos essenciais. Essa tcnica tambm poder ser usada na certificao e na quantificao de leos essenciais, tendo em vista que muitos leos de alto valor econmico so freqentemente adulterados. 5.4.2. Anlise termogravimtrica A Figura 5.21 mostra as curvas TG-DTG para 20,58 mg do padro de linalol em atmosfera de ar, nas quais percebe-se uma nica etapa de decomposio entre 48,08 e 169,92 C com perda de 99,20% (19,85 mg) da massa, sendo a mesma devido ao processo de volatilizao do linalol.

65 Captulo 5 Resultados e Discusso

4 100
48.08C

135.16C

3 80

60

Weight (%)

99.20% (20.42mg)

40 1 20

0 0
169.92C

-20 0 50 100 150 200 250 300

-1 350
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.21. Curvas TG-DTG para o padro de linalol em atmosfera de ar O grfico a seguir, Figura 5.22, mostra as curvas TG-DTG para 20,46 mg do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans em atmosfera de ar atmosfrico. De acordo com essas curvas torna-se possvel a observao de uma nica transio endotrmica, etapa de decomposio, que ocorre entre 41,02 e 188,91 C com perda de 99,04% (20,27 mg) da massa, sendo a mesma devido ao possvel processo de volatilizao do leo essencial.
3
41.02C 136.29C

100

80

60
99.04% (20.27mg)

40

0 20

0 0 50 100 150

188.91C

200

250

300

-1 350
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.22. Curvas TG-DTG para o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans em atmosfera de ar

Deriv. Weight (%/C)

Weight (%)

Deriv. Weight (%/C)

66 Captulo 5 Resultados e Discusso Percebe-se pela anlise das Figuras 5.21 e 5.22, que h uma ligeira diferena entre a evaporao do padro de linalol para o leo essencial da Aniba duckei Kostermans. O leo comea a perder massa a uma temperatura inferior do padro e termina sua perda de massa a uma temperatura um pouco maior. Isso se deve, provavelmente, presena dos componentes minoritrios no leo, dos quais alguns so mais volteis que o linalol e outros so menos.. Investigando a Figura 5.23, que mostra as curvas TG-DTG para 20,58 mg do padro de linalol em atmosfera de gs nitrognio (N2), percebe-se uma nica etapa de decomposio entre 44,55 e 162,42 C com perda de 98,58% (19,85 mg) da massa, sendo a mesma devido ao processo de volatilizao do linalol.

3
133.78C 44.55C

100

80

60
98.58% (19.85mg)

40

0 20

162.42C

0 0 50 100 150 200 250 300

-1 350
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.23. Curvas TG-DTG para o padro de linalol em atmosfera de N2.

A Figura 5.24, mostra as curvas TG-DTG para 19,07 mg do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans em atmosfera de gs nitrognio. Essas curvas revelam uma etapa de decomposio entre as temperaturas 41,46 e 181,84 C com perda de 99,59% (18,99 mg) da massa, sendo a mesma devido ao processo de volatilizao do leo essencial.

Deriv. Weight (%/C)

Weight (%)

67 Captulo 5 Resultados e Discusso

2.5
41.46C 138.53C

100 2.0 80

1.5 60
99.59% (18.99mg)

1.0 40

0.5 20

181.84C

0.0

-20 0 50 100 150 200 250 300

-0.5 350
Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.24 Curvas TG-DTG para o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans em atmosfera de N2.

A exemplo do que ocorreu em atmosfera de ar, percebe-se pela anlise da Figura 5.23 e da Figura 5.24, que h uma sensvel diferena entre a evaporao do padro de linalol e a do leo essencial da Aniba duckei Kostermans. Do mesmo modo que ocorreu em atmosfera de ar, o leo comea perder massa a uma temperatura inferior do padro e termina sua perda de massa a uma temperatura levemente superior. Isso certamente se deve presena dos diversos componentes minoritrios no leo, dentre os quais alguns devero apresentar menores temperaturas de ebulio e outros maiores, bem como a interao entre esses componentes pode contribuir para essa diferena de temperatura de ebulio do leo em relao ao padro. A Figura 5.25 o resultado da sobreposio das curvas TG do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans e do padro de linalol, em diferentes atmosferas. O significado da legenda encontrada ao lado da curvas o seguinte: Linpar = padro de linalol em atmosfera de ar; Linpn2 = padro de linalol em atmosfera de N2; Olpar = leo essencial em atmosfera de ar; Olpn2 = leo essencial em atmosfera de N2. Pela Figura 5.25 torna-se mais fcil a observao de que a atmosfera, ar sinttico (oxidante) ou gs nitrognio (inerte), praticamente no

Deriv. Weight (%/C)

Weight (%)

68 Captulo 5 Resultados e Discusso exerce influncia no perfil termogravimtrico nem do leo essencial nem do padro de linalol, quando as amostras foram aquecidas em panelas de alumnio fechadas na razo de 10 C min-1.

100

80
Linpar.txt Linpn2.txt Olprar.txt Olprn2.txt

60

Weight (%)

40

20

-20 0 50 100 150 200 250 300 350

Universal V3.0G TA Instruments

Temperature (C)

Figura 5.25. Curvas Termogravimtricas (TG) do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans. e do padro de linalol, em diferentes atmosferas.

Pela Figura 5.25, sobreposio das curvas TG do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans e do padro de linalol, em diferentes atmosferas, torna-se mais fcil a observao de que a atmosfera, ar sinttico (oxidante) ou gs nitrognio (inerte), praticamente no exerce influncia no perfil termogravimtrico nem do leo essencial nem do padro de linalol, quando as amostras foram aquecidas na razo de 10 C min-1. Da mesma forma, percebe-se, pela mesma Figura 5.25, que para as amostras de leo essencial o perfil termogravimtrico desloca-se para temperaturas maiores que as verificadas para o linalol puro, tanto em ar quanto em N2. Entende-se que isso seja possvel em decorrncia da influncia dos

69 Captulo 5 Resultados e Discusso outros componentes do leo essencial, possivelmente pelo motivo de o leo conter substncias menos volteis que o linalol, tais como hidrocarbonetos e teres, bem como pelo fato de essas substncias todas estarem juntas e, por conseguinte, interagindo-se entre elas.

5.5 Atividade Larvicida do leo Essencial A atividade larvicida do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans foi testada em sete concentraes diferentes, a saber: 100, 150, 200, 250, 300, 350 e 400 g mL-1 (Tabela 5.4). O n o nmero de larvas do Aedes aegypti utilizadas no ensaio larvicida para cada concentrao, num total de 10 larvas por ensaio. Os testes foram realizados em quintuplicata para cada concentrao. Os dados sobre o nmero de larvas vivas e de larvas mortas foram encontrados atravs de uma mdia das cinco repeties para cada uma das sete concentraes testadas. Tabela 5.4. Mortalidade das larvas do Aedes aegypti aps 24 horas de exposio a vrias concentraes do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans. Dose, log dose Mortos g mL-1 400 2,60 10 350 2,54 7,6 300 2,48 5,6 250 2,40 4,0 200 2,30 3,4 150 2,18 3,0 100 2,0 1,8 Nmero de larvas (n = 10). Vivos 0,0 2,4 4,6 6,0 6,6 7,0 8,2 Acumul. mortos 35,6 25,6 18,0 12,2 8,2 4,8 1,8 Acumul. Mdia mortalidade, Vivos % 0,0 1,00 100 2,4 0,76 76 6,6 0,56 56 12,6 0,40 40 19,2 0,34 34 26,2 0,30 30 34,4 0,18 18

Os testes foram realizados em quintuplicata e os valores dos nmeros de indivduos mortos e indivduos vivos so resultados de mdias aritmticas das cinco repeties. A CL50 estimada foi de 250,61 ( 2,20) g mL-1

70 Captulo 5 Resultados e Discusso De acordo com a Tabela 5.4, a concentrao de 100 g mL-1 do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans apresentou a menor atividade larvicida, matando, em mdia, 1,80 larvas, o que corresponde a 18,0 % de mortalidade. A concentrao de 400 g mL-1 do leo essencial testado apresentou a maior atividade larvicida, provocando a morte de 100% dos indivduos testados, ou seja, 10 larvas. As concentraes intermedirias, 150, 200, 250, 300 e 350, mataram 3,00; 3,40; 4,00; 5,60 e 7,60 larvas, respectivamente, o que corresponde a uma de mortalidade de 30,0; 34,0; 40,0; 56,0 e 76,0%, respectivamente, conforme mostram a Tabela 5.4 e Figura 5.26.

Figura 5.26. Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti, expostas a sete concentraes diferentes do leo essencial de Aniba duckei Kostermans, aps 24 horas, e o logaritmo de cada dose aplicada. A Figura 5.27 mostra que a concentrao letal 50% (LC50), concentrao na qual cinquenta por cento dos indivduos testados morrem, foi encontrada no intervalo entre as concentraes de 250 e 300 g mL-1. A dose letal 50% para o leo essencial da Aniba duckei Kostermans foi calculada atravs da interseo das curvas de indivduos acumulados mortos e indivduos acumulados vivos da Figura 3.27, tendo como resultado a

71 Captulo 5 Resultados e Discusso concentrao de 250,61 g mL-1 com um intervalo de confiana de 2,20 g mL-1 para mais ou para menos, LC50 = 250,61 ( 2,20) g mL-1.

Figura 5.27. Estimativa da LC50 do leo essencial de Aniba duckei Kostermans pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas em funo do logaritmo decimal da dose aplicada. A LC50 o ponto de interceo das duas curvas.

Para o padro de linalol, componente majoritrio do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans, a atividade larvicida foi testada nas mesmas sete concentraes em que o leo essencial foi testado, a saber: 100, 150, 200, 250, 300, 350 e 400 g mL-1 (Tabela 5.5). O n o nmero de larvas do Aedes aegypti utilizadas no ensaio larvicida para cada concentrao, num total de 10 larvas por ensaio. Os testes foram feitos em quintuplicata para cada concentrao. Os dados sobre o nmero de larvas vivas e de larvas mortas foram encontrados atravs de uma mdia das cinco repeties para cada uma das sete concentraes testadas.

72 Captulo 5 Resultados e Discusso Tabela 5.5. Mortalidade das larvas do Aedes aegypti aps 24 horas de exposio a vrias concentraes padro de dl-linalol.
Dose, g mL-1 400 350 300 250 200 150 100 Acumul. mortos 15,40 8,80 5,0 2,20 0,60 0,0 0,0 Acumul. vivos 3,4 9,6 16,8 25,2 34,6 44,6 54,6 mortalidade, % 66,0 38,7 28,0 16,0 6,0 0,0 0,0

log dose 2,60 2,54 2,48 2,40 2,30 2,18 2,00

mortos 6,6 3,8 2,8 1,6 0,6 0,0 0,0

Vivos 3,40 6,20 7,20 8,40 9,40 10,00 10,00

mdia 0,633 0,367 0,267 0,133 0,067 0,000 0,000

Nmero de larvas (n = 10). Os testes foram realizados em quintuplicata e os valores dos nmeros de indivduos mortos e indivduos vivos so resultados de mdias aritmticas das cinco repeties. A CL50 estimada foi de 346,73 ( 2,14) g mL-1

Para o padro de dl-linalol, as concentraes de 100 e 150 g mL-1 no apresentaram atividade larvicida, ou seja, no mataram nenhuma larva, o que corresponde a 0 % de mortalidade. A concentrao linalol 400 g mL-1 apresentou a maior atividade larvicida, provocando a morte de 66,0 % dos indivduos testados, o que representa 6,60 larvas, em mdia. As concentraes intermedirias, 200, 250, 300 e 350 g mL-1, mataram 0,60; 1,60; 2,80 e 3,80 larvas, respectivamente, o que corresponde a uma de mortalidade de 6,0; 16,0; 28,0; e 38,0%, respectivamente (Figura 5.28). Usando esses valores foi possvel calcular a concentrao letal 50% para o padro de linalol (LC50) e o valor encontrado est no intervalo entre as concentraes de 300 e 350 g mL-1 (Figura 5.29), tendo sido o resultado obtido o valor de concentrao 346,73 g mL-1, com intervalo de confiana de 2,14 g mL-1, para mais ou para menos, LC50 = 346,73 ( 2,14) g mL-1.

73 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.28. Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti expostas a sete concentraes diferentes do padro de dl-linalol, aps 24 horas.

A Figura 5.29 mostra a estimativa da LC50 do dl-linalol pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas em funo do logaritmo decimal da dose aplicada, tendo sido a concentrao letal 50%, LC50, o ponto de interseo das duas curvas.

74 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.29. Estimativa da LC50 do dl-linalol pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas em funo do logaritmo decimal da dose aplicada. A LC50 o ponto de interseo das duas curvas.

A Tabela 5.6 destaca a estimativa do valor da concentrao letal 50%, concentrao na qual metade das larvas do Aedes aegypti morre, LC50, pela ao do padro de l-linalol, calculado atravs do mtodo Reed-Muench a partir das concentraes de linalol e do acumulado de larvas mortas e vivas.

75 Captulo 5 Resultados e Discusso Tabela 5.6. Estimativa da LC50 do padro de l-linalol pelo mtodo ReedMuench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas. Dose, g mL-1 log dose Mortos 400 2,60 10 350 2,54 10 300 2,48 4,4 250 2,40 3,4 200 2,30 1,8 150 2,18 0,4 100 2,00 0,0 Nmero de larvas (n = 10). Acumul. Mortos 30 20,0 10,0 5,60 2,20 0,40 0,0 Acumul. mortalidade vivos mdia ,% 0,0 1,00 100 0,0 1,00 100 5,6 0,44 44 12,2 0,34 34 20,4 0,18 18 30,0 0,04 4 40,0 0,00 0

Vivos 0,0 0,0 5,6 6,6 8,2 9,6 10,0

Os testes foram realizados em quintuplicata e os valores dos nmeros de indivduos mortos e indivduos vivos so resultados de mdias aritmticas das cinco repeties. A CL50 estimada foi de 279,89 ( 2,12) g mL-1

A Tabela 5.6 traz o teste da atividade larvicida do padro de l-linalol, em sete concentraes diferentes, as mesmas das amostras anteriores (Tabela 3.5), 100, 150, 200, 250, 300, 350 e 400 g mL-1, tambm usando nmero de larvas do Aedes aegypti num total de 10 larvas por ensaio. Os testes tambm foram feitos em quintuplicata para cada concentrao e os dados sobre o nmero de larvas vivas e de larvas mortas foram encontrados atravs de uma mdia das cinco repeties para cada uma das sete concentraes testadas. Os resultados de logaritmo da concentrao em funo da porcentagem de larvas mortas para cada concentrao mostrados nessa tabela tambm esto expostos no grfico da Figura 5.30 a seguir.

76 Captulo 5 Resultados e Discusso

Figura 5.30. Taxa de Mortalidade das larvas do aedes aegypti expostas a sete concentraes diferentes do padro de l-linalol, aps 24 horas.

Para o padro de l-linalol, apenas a concentrao de 100 g mL-1 no apresentou atividade larvicida, pois no matou nenhuma das dez larvas testadas, o que corresponde a 0% de mortalidade. As concentraes do l-linalol de 350 e 400 g mL-1 apresentaram-se como as de maiores atividades larvicidas, provocando a mortandade de100% dos indivduos testados, ou seja, as dez larvas. Quanto s concentraes intermedirias, a saber: 150; 200; 250 e 300 g mL-1, estas provocaram a morte de 0,40; 1,80; 3,40 e 4,40 larvas, respectivamente, o que corresponde a uma mortalidade de 4; 18; 34 e 44%, respectivamente (Figura 5.30). A concentrao letal 50% (LC50) foi encontrada no intervalo entre os valores de concentraes para o padro de l-linalol 250 e 300 g mL-1 da Figura 3.31, tendo sido essa concentrao letal 50% para o llinalol 279,89 g mL-1, com intervalo de confiana de 2,12 g mL-1, para mais ou para menos, LC50 = 279,89 ( 2,12) g mL-1.

77 Captulo 5 Resultados e Discusso Acumulados mortos Acumulados vivos

Figura 5.31. Estimativa da LC50 do l-linalol pelo mtodo Reed-Muench a partir do acumulado de larvas mortas e vivas em funo do logaritmo decimal da dose aplicada. A LC50 o ponto de interceo das duas curvas.

O leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans bem com os padres de dl-linalol e l-linalol demonstraram possuir atividade larvicida contra o Aedes aegypti. Para qualificar o grau de atividade larvicida do leo essencial e dos padres de linalol, sero considerados alguns parmetros. No Brasil, os agentes da Fundao Nacional de Sade (FUNASA), rgo do Governo Federal, aplicam o inseticida temefs, numa concentrao de 100 ppm nos locais que servem de criadouros para larvas do mosquito Aedes aegypti. Nessa concentrao, obtm-se taxa de mortalidade de 100%, para o inseticida organofosforado temefs. Partindo do princpio de que o leo essencial um produto natural e, por tanto, menos nocivo sade das pessoas e dos animais domsticos, pode se afirmar que o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans

78 Captulo 5 Resultados e Discusso poder ser futuramente usado como larvicida em possveis locais de crescimento de larvas do Aedes aegypti. Pela anlise dos dados da atividade larvicida do leo essencial e dos padres de linalol, seu componente majoritrio, o que se pode perceber foi que, de um modo geral, o leo apresentou melhor atividade que os padres, sobretudo em concentraes mais baixas. Porm o l-linalol matou 100% das larvas em menor concentrao, a partir de 350 g mL-1, sendo que o leo s atingiu o patamar de 100% em 400 g mL-1 e o dl-linalol no atingiu esse patamar na faixa de concentrao analisada. Por outro lado, ao se investigar a concentrao letal 50% (LC50), concentrao na qual cinquenta por cento dos indivduos testados morrem, percebe-se que quem apresentou melhor atividade larvicida tambm foi o leo essencial da Aniba duckei Kostermans, LC50 = 250, 61 (2,20) g mL-1, contra a LC50 de 279,89 (2,12) g mL-1 do l-linalol e LC50 = 346,73 (2,14) g mL-1 para o dl-linalol. Dessa forma, conclui-se que o linalol responsvel pela atividade larvicida deve ser o ismero levorrotatrio (l-linalol). No foi encontrado na literatura informaes sobre a atividade larvicida contra o Aedes aegypti para o l-linalol, ao passo que para o dl-linalol, os resultados obtidos esto de acordo com a literatura encontrada, que no atribuem ao linalol um valor da atividade larvicida, mas sim o intervalo maior que 100 g L-1 (> 100 g L-1) (SIMAS et al., 2004). Atualmente, muitos trabalhos sobre a atividade larvicida de leos essenciais tm sido publicados, porm quase nenhum discute a relao entre essa atividade e a composio qumica dos leos essenciais. Nesse contexto, se insere o trabalho de SIMAS e colaboradores (2004), no qual ficou evidente a importncia da lipofilicidade de terpenos para a atividade larvicida em Aedes aegypti, quando se comparam monoterpenos e sesquiterpenos de estruturas correlatas. Tambm, foi observada que a inibio da enzima acetilcolinesterase pelos leos essenciais tem a ver com a atividade larvicida desses leos (SILVA, 2006).

79 Captulo 5 Resultados e Discusso A partir do que se exps, verifica-se que a procura por larvicidas naturais para o Aedes aegypti, tem motivado pesquisadores do mundo inteiro a realizar diversos trabalhos e, por tanto, este trabalho uma contribuio nesse sentido. Conclui-se que o leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans poder ser futuramente usado como larvicida do Aedes aegypti. Os produtos naturais com esta finalidade diminuem o impacto que atualmente os inseticidas sintticos causam sade da populao e ao ambiente. Alm disso, a parte da planta para obteno do leo essencial usado nessa pesquisa foram galhos finos, e tambm podem ser usadas folhas, de plantas reflorestadas, o que garante a manuteno da espcie Aniba duckei Kostermans longe do risco de extino. Por outro lado, uso de produtos qumicos, a exemplo do temefs, como base principal do Programa de Erradicao do Aedes aegypti (PEAa), alm de ineficaz, consome enormes recursos e ainda causam danos cujos custos ambientais e sociais no so internalizados nas anlises de custobenefcio desses programas. Segundo o Ministrio da Sade, dentre todos os Programas do Ministrio voltados para a sade pblica, o PEAa o que mais gasta recursos. Desta forma, podemos concluir que o programa, alm de perigoso tambm perdulrio (AUGUSTO et al, 1998). Outra importante observao que o mesmo Programa tem aspectos diferenciados no consumo de Inseticidas, por exemplo, enquanto em Pernambuco so consumidos 87,5 g de inseticida por residncia por aplicao, no sudeste o consumo de 54,0 g e no sul 48,0 g (AUGUSTO e CAMARA NETO, 2007). Atualmente, o custo de um litro de temefs praticamente o mesmo valor de um litro de leo essencial de pau-rosa nas destilarias da Floresta Amaznica, sendo que o temefs comercializado apresenta concentrao apenas de um por cento, ao passo que o leo puro. Por tanto, no aspecto econmico o uso do leo essencial da espcie vegeta Aniba duckei Kostermans considerado vivel e pode se tornar ainda mais em caso de maior demanda.

80 Captulo 5 Resultados e Discusso Por oportuno, ressalta-se que o hidrolato puro do leo essencial, inclusive das destilarias, poder ser usado para fins larvicida contra o Aedes aegypty, o que daria para este produto uma finalidade, evitando, dessa forma, seu desperdcio. Outro fator a ser considerado o aspecto social, pois um aumento na produo traria um nmero maior de empregos para os moradores da Floresta, que poderiam coletar folas e galhos finos de rvores nativas e reflorestadas, poderiam tambm plantar suas prprias rvores e vender o material vegetal, alm de tornarem-se produtores do prprio leo e vend-lo diretamente ao Governo.

6 - Concluso

81 Captulo 6 - Concluses 6 CONCLUSO

Neste trabalho foram empregadas tcnicas que formam um conjunto imprescindvel para o estudo analtico de leos essenciais. Assim, as informaes populares, a qumica de laboratrio e a instrumentao analtica se somaram de maneira tornar possvel a realizao de um trabalho genuno e original. Os resultados obtidos mostraram a eficincia das tcnicas e dos mtodos usados. Com as ferramentas disponveis, foi possvel caracterizar o leo essencial da Aniba duckei Kostermans (Pau-rosa) cultivado na Reserva Florestal Adolfo Ducke, Reserva Ducke, do Instituto Nacional para o Progresso da Amaznia (INPA), localiza-se no km 26 da rodovia AM-010 (Manaus Itacoatiara). Na identificao do componente majoritrio e dos demais componentes, bem como suas quantificaes, as tcnicas foram precisas e os mtodos eficientes, proporcionando um bom desempenho analtico nas determinaes. Ficou evidenciado, tambm, que o leo essencial da Aniba duckei Kostermans apresenta atividade larvicida frente ao aedes aegypti. Diante dos resultados obtidos conclui-se que:

1. As tcnicas espectroscpicas foram eficientes para a confirmao e identificao do linalol como componente majoritrio, com teor de 89,34%, e de componentes minoritrios no leo essencial da Aniba duckei Kostermans. A espectroscopia na regio do infravermelho indicou a presena desses componentes, principalmente pelas vibraes moleculares de seus grupos funcionais contendo oxignio. A

espectrometria de massas mostrou as fragmentaes, intensidades e vizinhanas dos picos caractersticos das molculas de linalol e dos demais compostos;

2. A anlise trmica do leo essencial, pela tcnica de Termogravimetria e calorimetria exploratria diferencial, abriu um novo caminho para anlises de leos essenciais. Os resultados obtidos foram inditos para

82 Captulo 6 - Concluses o leo essencial da Aniba duckei Kostermans, possibilitando sugerir inclusive a determinao quantitativa de linalol por DSC;

3. O estudo dos mtodos de extrao do leo essencial possibilitou verificar os melhores parmetros para o processo extrativo em funo do melhor rendimento e da concentrao de linalol; 4. O presente estudo demonstrou que a espcie Aniba duckei Kostermans, forneceu um leo essencial cujo rendimento foi de 1,93% (m/m), o qual foi considerado de bom valor em relao extrao de outros leos essenciais de plantas aromticas; 5. Os estudos das constantes fsicas do leo essencial apresentaram valores semelhantes aos valores obtidos pela literatura e pelos padres, usados para as suas comparaes; 6. Os resultados sugerem que o leo essencial da Aniba duckei e do padro do l-linalol apresentam atividade larvicida contra o aedes aegypt mais acentuada que o padro do dl-linalol sendo que o leo essencial apresentou melhor LC50, com valor 250,61 ( 2,20) g mL-1 que seus padres de l-linalol e dl-linalol, os quais apresentaram valores de LC50, respectivamente iguais a 279,89 ( 2,20) g mL-1 e 346,73 ( 2,14) g mL-1. Isso certamente se deve presena dos componentes minoritrios do leo; 7. O fato de a atividade larvicida do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans ter sido melhor que seu componente majoritrio, linalol, atribudo presena dos componentes minoritrios, bem como ao sinergismo entre eles.

7 - Perspectivas Para Trabalhos Futuros

83 Perspectivas Futuras 7 PERSPECTIVAS FUTURAS

1. Realizar a extrao do leo essencial da espcie vegetal Aniba duckei Kostermans com fluido supercrtico e verificar possveis alteraes na composio qumica, no rendimento e propriedades fsicas;

2. Relacionar quantitativamente, por DSC, o teor de linalol no leo essencial em funo de sua temperatura de ebulio;

3. Estudar metodologias eletroqumicas para as determinaes qualitativas e quantitativas do outros componentes dos leos essenciais; 4. Testar o leo metilado e acetilado como larvicida do Aedes aegypti e de outros insetos de interesse. 5. Testar o hidrolato do leo essencial da Aniba duckei Kostermans como larvicida do mosquito Aedes aegypti.

8 - Referncias Bibliogrficas

84 Captulo 8 Referncias 8 REFERNCIAS

ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectroscopy. 4. ed. Llinois: Allured Publishing Corporation, 2001, p. 800. AGNES, S. I. A. Isolamento, caracterizao qumica e avaliao da propriedade inseticida do leo essencial de Piper amplum Kunth. Blumenal, Universidade Regional de Blumenal, 2005. Dissertao de Mestrado, 88p. ALENCAR, J. C.; FERNANDES. N. P. Desenvolvimento de rvores nativas em ensaios de espcies. Pau-rosa (Aniba duckei (Kostermans). Acta Amaznica, 8(4): 523-541, 1967. ALONSO, W.R. RAJAONARIVONY,J. I. M.; GERSHENZON. J. CROTEAU,R. Purification of 4S-limonene synthase, a monoterpene cyclase from the glandular trichomes of peppermint (Mentha 3 piperita) and spearmint (M. spicata). J Biol Chem 267: 75827587, 1992. AUGUSTO, L. G da S.; CMARA-NETO, H. F. Dengue: insutentabilidade do PEAa. Anais do XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental, Porto alegre RS, 2007. AUGUSTO, L. G. da S.; FREITAS, C. M. O Princpio da Precauo no uso de indicadores de riscos qumicos ambientais em sade do trabalhador. Revista Cincia & Sade Coletiva, 3 (2): 85-95, 1998. AZEREDO, O. B. Instituto de leos, Centro Nacional de Ensino e Pesquisas Agronmicas, Ministrio da Agricultura, Boletim 15: 137-208, 1958.

85 Captulo 8 Referncias BALANDRININ, M. F.; KLOCKER, J. A.; WURTTELES, E. S. Natural plant chemical-souce of industrial and medicinal materials. Science, 228: 1154-1160, 1985. BARROSO, G. M. Sistemtica das angiospermas do brasil. So Paulo: EDUSP,1978. 255p. v. 1 BELL, E. A. Et al. Secundary plant products. Berlin: Springer, 1980 p. 1-10. BERNAL, C.; COUTO, A. B.; BREVIGLIERI, S. T.; CAVALHEIRO, E. T. G. Influncia de Alguns Parmetros Experimentais nos Resultados de Anlises Calorimtricas Diferenciais DSC. Qumica Nova, 25(5): 849-855, 2002. BRAGA, I. A. et al., Aedes aegypti, resistance to temephos during 2001 in several municipalites in the states of Rio de Jneiro, Sergipe and Alagoas, Brazil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 99: 199-203, 2004. BRASIL. Ministrio da Sade. Fundao Nacional de Sade. Programa Nacional de Controle da Dengue PNCD. Braslia, 2007. BRASIL. Ministrio da Sade. Fundao Nacional de Sade. Programa Nacional de Controle da Dengue PNCD. Braslia, 2008. Disponvel em: http://www.combatadengue.com.br/noticiasDetalhe.php?idnoticia=248 . Acesso em 20/11/2008. BRASIL. MS-FNS (Ministrio da Sade-Fundao Nacional de Sade), 2002. Programa Nacional de Controle do Dengue. Braslia: Fundao Nacional de Sade, Ministrio da Sade. BRASIL. MS-SVS (Ministrio da Sade-Secretaria de Vigilncia em Sade). Dengue-Boletim Eletrnico Epidemiolgico 03/2003. Disponvel na Internet: <dtr2001.saude.gov.br/svs/pub/boletim_eletronico_epi/boletim_eletronico_epi_ 0303.pdf>.

86 Captulo 8 Referncias BRASIL.Ministrio da Sade. Fundao Nacional de Sade. Dengue - Manual de Normas Tcnicas, Instruo para pessoal de combate ao vetor. Braslia, 2001. 83p. BRASIL.MS-FNS (Ministrio da Sade-Fundao Nacional de Sade). Manual de Dengue - Vigilncia Epidemiolgica e Ateno ao Doente. Braslia: Departamento de Operaes - Coordenao de Controle de Doenas Transmitidas por Vetores, Fundao Nacional de Sade, Ministrio da Sade, 1996. BURKE, C. C; WILUNG, M. R.; CROTEAU, R. Geranyl diphosphate synthase: cloning expression and characterization of this prenyltransferase as a heterodimer. Proc Natl Acad Sci USA 96: 13062 13067, 1999. BUSTAMANTE, M. F. L. Plantas medicinales y aromticas: estdio, cultivo y processado. 4. ed. Madri: Mundi-Pensa, 2000. 365 p. CAVALHEIRO, . T. G.; CHAAR, J. S.; MOUCHREK FILHO, V.E.; BREVIGLIERI, S. T.; CHIERICE, G. O. Boiling Temperature and enthalpy changes of essential oil using capillary glass sample holder. Journal of Thermal Analysis, 75: 437-443, 2004. CHAAR, J da S. Estudos analticos e modificao qumica por acetilao do linalol contido no leo essencial da espcie Aniba duckei kostermans. So Carlos, Instituto de Qumica de So Carlos, USP, 2000. Tese de Doutorado. CHENG, S. S.; CHUA, M-T; CHANG, E.H.; HUANG, C-G; CHEN, W-J.; CHANG, S-T. Variations in insecticidal activity and chemical compositions of leaf essential oils from Cryptomeria japonica at different ages.

Bioresour.Technol. (2008),doi:10.1016/j.biortech.2007.11.060. CLAY, J. W.; CLEMENT, C.R. Selected species and estrategies to enhance icome generation from amazonian forest. Roma: FAO, 1993.

87 Captulo 8 Referncias COLHO, A. A. M. Anlise inseticida de extratos de plantas do bioma do cerrado sobre triatomneas e larvas de Aedes aegypti. Braslia-DF, UnB, 2006. Dissertao de Mestrado. 90p. COE-TEIXEIRA, B. Laurceas do gnero Ocotea do estado de So Paulo. Rodrigusia, 32 (52): 55-190, 1980. COLEGATE, S. M.; MOLYNEUX, R. J. Bioactive Natural Products: Detection, Isolation, an Structural Determination. CRC Press. Boca Raton. Ann Arbor London, Tokyo. 1993. 528p. CORREA, D. B; GOTTILIEB, O. R. DUCKEIN, N.A. Alkaloid from Aniba duckei. Phytochemistry, 14: 271-272, 1975. COSTA, A. F. Farmacognosia. 5. ed. Lisboa: Calouste Gulbenkian, 1994. V.1. 1031p. COSTA, J. G. M.; RODRIGUES, F. F. G.; ANGLICO, E. C.; SILVA, M. R.; MOTA, M. L.; SANTOS, N. K. A.; CARDOSO, A. L. H.; LEMOS, T. L. G. Estudo qumico-biolgico dos leos essenciais de Hyptis martiusii, Lippia sidoides e Syzigium aromaticum frente s larvas do Aedes aegypti. Revista Brasileira de Farmacognosia/Brazilian Journal of Pharmacognosy. 15(4): 304-309, 2005. CRAVEIRO, A. A. .; FERNANDES, A.G.;. ANDRADE, C.H.S.; MATOS, F.J. de A.;. ALENCAR, J.W. de e MACHADO, M.I.L.. leos essenciais de plantas do nordeste. Fortaleza: EUFC, 1981. 210p. CUNHA, L. N. influncia sazonal no teor de linalol contido no leo essencial da spcie aniba duckei kostermans plantada em ambiente natural. Manaus, UFAM, 2002. Dissertao de Mestrado. 132p. DANTAS, M. B. Obteno, Caracterizao e Estudo Termoanaltico de Biodiesel de Milho (Zea mays L.). Joo Pessoa, UFPB, 2006. Dissertao de Mestrado. 114 p.

88 Captulo 8 Referncias DORMAN, H. J, D; DEANS, S. G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of pant voatile oils. Jornal of Applied Microbiology, New York, 88: 308316, 2000. DUCKE, A. Laurceas aromticas do Amazonas. Reunio Sul americana de Botnica, 3:55-74, 1938. DUCKE, S. O. ; CANEL, C.; RIMANDO, A.M.; TELLEZ, M.R.; DUCKE, M. V.; PAUL, R.N. Current and Potential Exploitation of Plant Glandular Trichome Productivity. Academic Press, San Diego, 31: 121151, 2000. DUSSOURD, D. E. HOYLE, A. M. Poisoned plusiines: toxicity of milkweed Terpene Biosynthesis in Basil Glandular Trichomes latex and cardenolides to some generalist caterpillars. Chemoecology, 10: 1116, 2000. FERREIRA, J. T. B.; CORRA, A.G.; VIEIRA, P.C. Produtos naturais no controle de insetos. So Carlos, Ed. UFSCar, 2001. V 3. FIGUEIREDO, L. T. M., Cavalcante, S.M.B. & Simes, M.C.. A Dengue serologic survey of school children in Rio de Janeiro, Brazil, 1986 and 1987. Bulletin of the Pan-American Health Organization, 24:217-225, 1990. FORATTINI, O. P. Identificao, biologia, epidemiologia. In: Culicidologia Mdica. So Paulo: Ed. Universidade de So Paulo, 2002. v. 2. FUH, M. R.; PAN, W.H.; HSIEH, I.J.; CHUO, C.-M.. Preparative-scale supercritical-fluid extraction of essential oils from Syzygium aromaticum (Clove bud). Int-Lab., p. 26, 1996. FURTADO, R. F.; LIMA, M. G. A.; ANDRADE NETO, M.; BEZERRA, J. N. S.; SILVA, M. G. V. Atividade Larvicida de leos Essenciais Contra Aedes aegypti L. Neotropical Entomology 34(5):843-847 (2005).

89 Captulo 8 Referncias GANLIM, C.D.; DUTTA, N.K.; ROY CHOUDHURY, N.; KEHOE, D. & MATISONS, J. Evaluation of Kinetic Parameters of Thermal Oxidative Decomposition of Base Oils by Conventional, Isothermal and Modulated TGA, and Pressure DSC. Thermochimica Acta, 392 (2002) 357-369. GERSHENZOM, J.; MAFFEI, M; CROTEAU, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene byosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiol 89: 13511357, 1989; GIOLITO, I. Algumas aplicaes da Anlise Trmica. Revista de Qumica Industrial, 12: 663-671, 1988. GONALVES, M. L. A.; TEIXEIRA, A. M. R.; TEIXEIRA, M. A. G. Aplicabilidade de Tcnicas Termogravimtricas a Estudos de Pirlise de Resduos de Petrleos Nacionais. In: Anais do 2o Congresso Brasileiro de P&D em Petrleo e Gs. Rio de Janeiro: 2003, CD. GUBLER, D. J. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease-control in the 1990s top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: 571-578, 1989. HALSTEAD, S. B. Epidemiology of dengue and dengue hemorrhagic fever. In: GUBLER, D. J. E KUNO, G. (Ed.). Dengue and dengue hemorrhagic fever. New York: CAB International, 1997. HARBONE, J. B. Ecological Biochemistry. 4. ed. Londres: Academic, 1993. HOMMA, A. K. O. O Extrativismo Do leo Essencial De Pau-Rosa Na Amaznia. Anais do XLIII Congresso da SOBER. Ribeiro Preto-So Paulo, 2005. IIJIMA, Y.; DAVIDOVICH-RIKANATI, R.; FRIDMAN, E.; GANG, D.R.

Biochemical and molecular basis for the divergent patterns in the biosynthesis of terpene and phenylpropenes in the peltate glands of three cultivars of basil. Plant Physiology, 136: 3724-3736, 2004.

90 Captulo 8 Referncias IONASHIRO, M.; GIOLITO, I. Nomenclatura, Padres e Apresentao ds Resultados em Anlise Trmica. Cermica, 26(121): 17, 1980. KELSEY, R. G.; REYNOLDS, G. W.; RODRIGUEZ, E. Em biology and chemistry of plant trichomes; Rodriguez, E.; Healey, P. L.; Mehta, I., eds.; Plenum Press: New York, 1984. KNOBLOCK, K. O. LATTE, K.P. KIDERLEN. A. Basic life science, 66:.575, 1999. KOPPENHOEFER, B.; BEHNISH, R.; EPPERLEIN, U.; HOLZSCHUH, H.; BERNREUTHER, A. Enantiomeric odor differences and gas chromatographic properties of flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist, 19: 1-14, 1994. KUNO, G. Review of the Factors Modulating Dengue Transmission. Epidemiology Reviews, 17:321-335, 1995. LEMOS, T. L. G.; CRAVEIRO, A.A.; ALENCAR, J.W.; MATOS, F.J.; CLARCK, A.M.; MACCHESNEY, J.D. Antimicrobial ativity of essential oils of brasilian plants. Phytotherapy Research., 4: 82-84, 1990. LICHTENEHALER,H K.; SCHWENDER, J.; DISCH, A.; ROHMER, M. Biosynthesis of isoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via a mevalonate-independent pathway. FEBS Lett 400: 271274, 1997. LIMA, E. de O. Plantas e suas propriedades antimicrobianas: uma breve anlise histrica. In Plantas Medicinais sob a tica qumica da medicina moderna. Org.: YUNES, R. A.; CALLIXTO, J. B. Ed. Argos, Chapec-SC, 2001. LIMA, J.B. et al., Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalites in states of Rio de Janeiro and Espirito Santo, Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 68: 329-333, 2003.

91 Captulo 8 Referncias LIMA, R. C. Caracterizao Qumica e Bioatividade do leo Essencial de Folhas de Goiabeira Sobre a Lagarta-do-Cartucho do Milho. UFL, Lavras-MG, 2006. Dissertao de Mestrado. 57 p. LOPES, W. A.; FASCIO, M. Esquema para interpretao de espectros de substncias orgnicas na regio do infravermelho. Quim. Nova, 27(4): 670-673, 2004. MACKENZIE, R.C.; Differential Thermal Analysis. Thermochimica Acta, 92:3, 1984 MAIA, J. G. S. Plantas aromticas na amaznia e seus leos essenciais. Belm-PA: Museu Paraense Emlio Goedi, 2000. 180p. MARTINS, G. N. N.; SILVA, F.; SILVA, R. F.; PARK, K. J.; MAGALHES, P. M. Efeito pr-tratamento pr-germinativos em sementes de Chenopodium ambrosides L. In: Simposio de Plantas Medicinais do Brasil, 18, 2004, Manaus. Resumos...Manaus, AM, p.294, 2004. McCASKILL, D.; CROTEAU, R. Prospects for the bioengineering of isoprenoid biosynthesis. Advances Biochem Engin Biotechnol 55: 102146, 1999 McCONKEY, M. E.; GERSHENZON, J.; CROTEAU, R.B. Developmental Regulation of Monoterpene Biosynthesis in the Glandular Trichomes of Peppermint. Plant Physiology, 122: 215223, 2000. MERK, The Merk Index, S. Budavari (Ed.), 12th Ed., Merk and Co., Whitehouse Station, 1996. MESSER, W. B.; Gubler, D. J. Emergence and Global Spread of Dengue Serotype 3 Subtype III. Emerging infectious diseases, 7:800-809, 2003. MING, L.C. Estudo e pesquisa de plantas medicinais na agronomia. Horticultura Brasileira, 12,p.3-9,1994.

92 Captulo 8 Referncias MISTHER, L. A.; DRAKE, S.; GOLLAPUDI, S. K. Journal of Natural Produts, 50: 1025, 1987. MOUCHREK FILHO, V. E. Estudos Analticos e modificaes qumicas por metilao e acetilao do eugenol contido no leo essencial extrado das folhas da espcie Pimenta dioica Lindl. So Carlos, IQSC-USP, 2000. Tese de Doutourado. 124p. MURUGAN, K.; MURUGAN, P.; NOORTHEEN, A. Larvicidal and repellent potential of Albizzia amara Boivin and Ocimum basilicum Linn against dengue vector, Aedes aegypti (Insecta:Diptera:Culicidae). Bioresource Technology, 98: 198201, 2007. NAMARA, K. M.; HOWELL, J.; HUANG, Y.; ROBBAT Jr, A. J. Analysis of gin essential oil mixtures by multidimensional with and one-dimensional gas

chromatography/mass

spectrometry

spectral

deconvolution.

Chromatography A, 1164: 281-290, 2007. NEVES, D. P.; SILVA, J. E. da. Entomologia Mdica: comportamento,

captura, montagem. COOPEMED, 1995. 112p. NOVK, C. FERNANDEZ, L. HEN, Z. MOURA, T.F. e SZTATIZ. J. Caracterization of Lippia sidoides oil extract--ciclodextrin complexes using combined thermoanalytical techniques. Journal of Thermal Analysis, 78: 557573, 2004. OPAS (Organizacin Panamericana de la Salud). Dengue y Dengue hemorrgico en las Amricas: guas para su prevencin y control. Washington: Organizacin Panamericana de la Salud , 1995. OPAS (Organizacin Panamericana de la Salud). Resurgimiento del Dengue en las Amricas, Boletn Epidemiolgico, 2:1-16, 1997 PARE, PW, TUMLINSON J.H. Plant volatiles as a defense against insect herbivores. Plant Physiol 121: 325332, (1999).

93 Captulo 8 Referncias PIZZI, M. Sampling variation of the fifty percent end-point, Determined by the Reed-Muench (Behrens) method. Hum. Biol. 22, 151190, 1950. RAOUL, D. Estude biographique et critique. Genebra: Skira, 1953.120p. REBLO, J.M.M. et al. Distribuio de aedes aegypti e do Dengue no Estado do Maranho, Brasil. Caderno de Sade Pblica, 15(3): 477-486, 1999. REY, L. Bases da parasitologia mdica. Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 1992. 349p. SAMPAIO, P. T.; FERRAZ, I. D. K.; CAMARGO, J. L. C.; Pau-rosa: Aniba roseadora Ducke. In.: Manual de Sementes da Amaznia. Fascculo 3. INPA, Manaus-AM, 2003. SAMPAIO, P. T. B. Pau-rosa (Aniba roseadora Ducke). PP 290-297 In Cay, J. W; SAMPAIO, P. T. B.; CLEMENT, C. R. (Eds.). Biodiversidade Amaznica, exemplos e estratgias de utilizao. INPA-Sebrae. Manaus, 2000. SAMPAIO, P. T. B.; BARBOSA, A; VIEIRA, G. Canopy sprouting biomass of rosewood (Aniba rosaeodora Ducke) in an Amazonian terra firme forest. Acta Amaz., 35(4): 491-494, 2005. SANTOS, J. C. O. Estudo Termoanaltico e Cintico da Degradao Trmica de leos Lubrificantes Automotivos. Joo Pessoa: UFPB, 2004. Tese de Doutorado. 200p. SANTOS, J. C. O. Parmetros Termoanalticos, Cinticos e Reolgicos de leos Comestveis Comercias. Joo Pessoa: UFPB, 2001. Dissertao de Mestrado. 200p. SANTOS, J. C. O.; SOUZA, A. G.; SANTOS, A. V. Thermal Analysis in Quality Control of the Olive Oil. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 75 (13) 23-25, 2000.

94 Captulo 8 Referncias SIANI, A. C. Desenvolvimento Tecnolgico de Fitoterpicos Plataforma metodolgica. Rio de Janeiro: Scriptrio, 2003, 97p. SIANI, A. C. MONTEIRO, S. S. RAMOS, M. C. K. V. AQUINO-NETO, F. R. Variabilidade qumica do linalol no leo essencial de Aeollantus suaveolens (Lamiaceae). Fitos, 1(2): 59-63, 2005. SIANI, A. C. SAMPAIO, A. L. F. SOUZA, M. C. HENRIQUES, M. G. M. O. RAMOS, M. F. S. leos essenciais, biotecnologa ciencia e desenvolvimento, 1999. 38-42. SIANI, A. C; TAPPPIN, M. R. R.; RAMOS, M. F. S; RAMOS, M. C. K. V; AQUINO-NETO, F. R.; FRIGUETO, N. Linalool from Lippia Alba: Study of the reproducibility of the Essential Oil Profile and the Enantiomeric Purity. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 50: 3518-3521, 2003 SILVA, F.; CASALI, V. W. D. Plantas Medicinais e aromticas: Ps colheita e leos essenciais. Viosa: artes e livros, 2000. 135p. SILVA, W. J. Atividade Larvicida de leos Essenciais de Plantas existentes no Estado de Sergipe contra Aedes aegypti. So Cristvo, UFSE, 2006. Dissertao de mestrado 69p. SILVA, W. J.; DORIA, G. A. A.; MAIA, R. T.; NUNES, R. S.; CARVALHO G. A.; BLANK A. F.; ALVES, P. B.; MARAL, R. M.; CAVALCANTI, S. C. H. Effects of Essential Oils on Aedes Aegypti Larvae: Alternatives to Environmentally Safe Insecticides. Bioresource Technology 99: 32513255, 2008. SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER F.X.; KIEMLE D.J. Identificao

Espectromtrica de Compostos Orgnicos. 7. ed. Rio de Janeiro, Livros Tcnicos e Cientficos S.A., 2007. 490p.

95 Captulo 8 Referncias SIMAS, N. K.; LIMA, E. da C.; CONCEIO, S. da R. Produtos naturais para o controle da transmisso da dengue: atividade larvicida de Myroxylon balsamum (leo vermelho) e de terpenides e fenilterpenides. Qumica Nova, 27(1): 4649, 2004. SIMES, C. M. O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P. de; L.A.; PETROVICK. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 2007. 821p. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Principles of instrumental analysis. 5. ed. So Paulo, Freeman, 2002. SPIRONELLO, W. R.; SAMPAIO, P. T.; RONCHI-TELES, B. Produo e predao de frutos em Aniba rosaeodora Ducke var. amazonica Ducke (Lauraceae) em sistema de plantio sob floresta de terra firme na Amaznia Central. Acta bot. bras. 18: 801-807, 2004. SUDAM. O extrativismo do pau-Rosa (Aniba duckei Kosterm. Aniba roseadora Duckei). Aspectos scio-econmicos, a silvicultura da espcie. SUDAM documenta, Belm, v. 3, n. 1/4., p. 5-55, 1971. SUDAM. O extrativismo do Pau-rosa, SUDAM Documentos Amaznicos, 1972, 5-55. TELES, R. M, Estudo Analtico do linalol contido no leo essencial extrado de galhos da espcie Aniba duckei K e sua aplicao como agente bactericida. So Lus, UFMA, 2003. Dissertao de Mestrado. 99p. WENDLANT, W. W. Thermal Analysis. in: Chemical Analysis. 3. ed; Elwin, P.J. and WINIFORDNER, J.D.; Editors, New York: John Willey, 1986. V. 19 WERFF, H.; RICHTER, H. G. Toward and improved classification of Lauraceae. Annals of Missouri Botanical garden. 8: 419 432, 1996.

96 Captulo 8 Referncias WHITE, R. Fourier transform infrared spectroscopy and its applications. New York: Marcel Dkker, 1990. WILLIANS, D. G. The chemistry of essencial oils. England: Micelle Press, 1996, 334p. BELAICHE, J.; MEUWIS, M.A.; DESENY, D.; FILLET,M.; GEURTS, P.; WEHENKEL, L.; LOUIS, L.; MERVILLE, M.P. Proteomics Using Seldi-TOF-MS for the Diagnosis of Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Acta Enterologica Belgica. 8: D38, 2005.