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Validao de Mtodos Microbiolgicos

ngela Franco Mattos, Da Aguirra, Denise Sunagawa, Lucielly Borges e Roseli Consoni Introduo H diversos guias e literaturas que descrevem a validao de mtodos analticos (http://www.cmscientifica.com.br) , no entanto, comparativamente, pouco se discute a respeito da validao de mtodos microbiolgicos (Freitas, 2006). Por exemplo, a Farmacopia Brasileira e algumas das principais farmacopias internacionais apresentam pequenos pargrafos sobre a validao dos mtodos microbiolgicos. Atualmente, a Farmacopia Americana fornece guias de validao para testes microbiolgicos (http://www.cmscientifica.com.br) , que compreendem os captulos 1223 Validao de Mtodos Microbiolgicos Alternativos e o 1227 Validao de Recuperao Microbiana a partir de Artigos Farmacopicos. Outros captulos, como 51 Teste de Eficcia de Antimicrobianos -, 61 Teste de Enumerao Microbiana -, 62 Teste para Microrganismos Especficos e 71 Testes de Esterilidade, mencionados nos mtodos gerais da Farmacopia Americana, tambm esto relacionados com a validao, pois esses testes dependem da recuperao microbiana. importante ressaltar que, alm da validao propriamente dita, h fatores que influenciam diretamentenos resultados microbiolgicos, discutidos a seguir, alm da Validao de Recuperao Microbiana. Fatores de influncia Antes de iniciar a validao do mtodo microbiolgico, importante mencionar que as condies do laboratrio (http://www.cmscientifica.com.br) devem seguir as boas prticas laboratoriais, pois a variabilidade conhecida nos dados microbiolgicos, confiabilidade e reprodutibilidade esto diretamente relacionadas aderncia das melhores prticas. Isso compreende as seguintes atividades: Tcnica assptica (http://www.cmscientifica.com.br) ; Preparao e controle de qualidade dos meios de cultura (http://www.cmscientifica.com.br') ; Manuteno e controle das cepas microbianas; Manuteno e controle dos equipamentos do laboratrio (http://www.cmscientifica.com.br) ; Layout do laboratrio e operao; Treinamento do pessoal envolvido; Documentao; Manuteno dos registros do laboratrio; Interpretao e avaliao dos dados laboratoriais. Para a validao, considera-se alguns fatores de influncia nos resultados dos testes, incluindo a natureza dos microrganismos utilizados como organismos desafios, a preparao do inculo, as condies especficas do teste e as condies de recuperao. Portanto, esses pontos precisam ser muito bem definidos no protocolo de validao. Deve-se utilizar microrganismos de testes compendiais (http://www.cmscientifica.com.br) que representem, ao menos, uma categoria de bactrias Gram-negativa e Gram-positiva, leveduras e bolores. A natureza dos microrganismos desafios exerce um grande efeito na resposta do agente antimicrobiano e conseqentemente na neutralizao deste para a recuperao dos inculos. A preparao e estocagem do microrganismo devem estar padronizadas antes de se iniciar os testespara a avaliao da ao neutralizante do produto com propriedade antimicrobiana. As condies especficas do teste, incluindo os buffers ou diluentes utilizados, luz e temperatura tambm so padronizadas e reproduzidas no estudo de validao. As condies de recuperao microbiana esto entre as mais crticas para estimar o nmero de microrganismos presentes na soluo teste. Considera-se o meio de recuperao utilizado para o crescimento dos microrganismos sobreviventes e as condies de incubao, que precisam ser timas para assegurar seu crescimento e resultados reprodutveis. Mtodos de neutralizao das propriedades antimicrobianas Para realizar a validao dos mtodos microbiolgicos (Teste de Eficcia de Conservantes, Testes de Esterilidade, Testes de Contagem Microbiana (http://www.cmscientifica.com.br) e Testes para Microrganismos Especficos), importante que as propriedades antimicrobianas do produto sejam neutralizadas para recuperao dos microrganismos viveis. Essa neutralizao ser alcanada pelo uso de alguns mtodos como inibio qumica, diluio, filtrao e lavagem.

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CINCIA DNA cigano
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Hospital A.C. Camargo e Fiocruz compram novos sequenciadores

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Anticorpo combate vrios tipos de gripe

(http://www.cmscientifica.com.br/index.php/2012/08/20/anticorpocombate-varios-tipos-de-gripe/)

Clulas-tronco obtidas pelo Butantan j so testadas em humanos

(http://www.cmscientifica.com.br/index.php/2012/08/20/celulastronco-obtidas-pelo-butantan-ja-sao-testadas-emhumanos/)

Suplemento de clcio aumenta risco de ataque cardaco, diz estudo

(http://www.cmscientifica.com.br/index.php/2012/05/24/suplementode-calcio-aumenta-risco-de-ataque-cardiaco-dizestudo/)

Brasileiros identificam gene que causa cncer de pnis mais grave

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Usar o computador e fazer caminhada pode evitar demncia, diz estudo

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Frutas vermelhas fazem bem ao crebro de mulheres, diz estudo

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Inibio qumica Alguns neutralizantes qumicos apresentam toxicidade para microrganismos especficos. Apesar disso, so amplamente utilizados por sua conveniente e rpida ao. A inibio qumica de bactericidas o mtodo preferido para o Teste de Eficcia de Conservantes. O potencial de inibidores qumicos ser considerado na filtrao por membrana e teste de esterilidade de transferncia direta. Antibiticos (http://www.cmscientifica.com.br) podem no ser suscetveis neutralizao por meios qumicos, mas sim pelo tratamento enzimtico, por exemplo, penicilinase. Essas enzimas so utilizadas se necessrio. Diluio A diluio outro mtodo amplamente utilizado devido concentrao de um bactericida qumico exercer um largo efeito em sua potncia. A relao entre concentrao e efeito antimicrobiano difere entre os agentes bacteridas, mas uma constante para um agente antimicrobiano particular. Esta relao exponencial in nature, com a frmula geral: Ct=k C a concentrao, t o tempo requerido para matar um inculo padro, k uma constante e o expoente concentrao o slope do plote do log t versus log C. Agentes antimicrobianos com altos valores de so rapidamente neutralizados por diluio, uma vez que aqueles com baixos valores de no so bons candidatos para neutralizao por diluio. Filtrao por membrana A neutralizao por filtrao por membrana freqentemente utilizada, especialmente em testes de esterilidade. Esse mtodo entende-se pela reteno fsica do microrganismo na membrana filtrante e a remoo do agente antimicrobiano por meio do filtrado. A membrana incubada para recuperao dos microrganismos viveis. No entanto, a filtrao sozinha no remove quantidade suficiente de agente bactericida para permitir o crescimento de microrganismos sobreviventes. A aderncia residual de agentes antimicrobianos na membrana filtrante inibe o crescimento. Para eliminar esses agentes, o conservante deve ser diludo ou lavado com um fluido de rinsagem. Neutralizantes qumicos no fluido de rinsagem asseguram que resduos de algum antimicrobiano na membrana no interfiram na recuperao de microrganismos viveis. Validao dos mtodos de neutralizao A finalidade da validao demonstrar que o mtodo capaz de recuperar os microrganismos potencialmente presentes na amostra e que o produto em teste ou a tcnica de anlise no impactam negativamente nessa recuperao. Considera-se recuperao do microrganismo, sob condies timas de crescimento, a produo de turvao do meio de cultura lquido ou desenvolvimento de colnia no meio slido, ambos visveis a olho nu. Entende-se por inculo a carga microbiana do(s) microrganismo(s) empregado(s) como desafio nas validaes, como explicado na Tabela 2, que ser no mximo 100 UFC e no exceder a 1% do volume da amostra diluda. A validao do mtodo de neutralizao das propriedades antimicrobianas do produto deve atender a dois critrios: Eficcia do neutralizante, ou seja, o mtodo de neutralizao empregado efetivo para neutralizao das propriedades antimicrobianas do produto; Toxicidade do neutralizante, ou seja, o neutralizante no deve impactar na recuperao dos microrganismos viveis. Para que se evidencie o atendimento desses dois critrios, o protocolo de validao deve comparar os resultados da recuperao por grupos de tratamento, conforme a seguir. Grupo Teste (1) Produto + mtodo de neutralizao + inculo. O produto submetido ao mtodo de neutralizao, ou seja, um baixo nvel de microrganismo desafio (menos do que 100 UFC) inoculado para recuperao; Grupo Controle (2) Mtodo de neutralizao + inculo. O mtodo de neutralizao utilizado com peptona ou outro diluente como soluo teste; Grupo Viabilidade (3) Inculo. O inculo utilizado sem exposio ao processo de neutralizao. A recuperao similar entre o grupo teste e o grupo controle demonstra adequada eficcia do neutralizante, e a recuperao similar entre o grupo controle e o grupo viabilidade demonstra baixa toxicidade do neutralizante. A validao consiste na realizao de trs ensaios independentes, em que cada microrganismo ser submetido ao teste separadamente, segundo o protocolo de validao. Recuperao em meio Agar Utiliza-se recuperao no meio agar no Teste de Eficcia de Conservantes (http://www.cmscientifica.com.br) , nos Testes de Contagem Microbiana e nos Testes para Organismos Especficos (http://www.cmscientifica.com.br) . O nmero de microrganismos desafio viveis no produto estimado pelo clculo da concentrao de UFC por mL pelo mtodo de contagem em placa. Os resultados do estudo de validao devem atender aos dois critrios de aceitao mencionados anteriormente se forem comparados com os grupos de tratamento (1), (2) e (3).
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Cada ensaio, independente do estudo, demonstraria que a mdia de UFC das contagens em placas do produto testado acima de 70%, se comparado com o controle do inculo. Quando esse critrio no atingido, isso pode indicar que o produto no foi adequadamente neutralizado, existe toxicidade do agente neutralizante ou ambas as condies. Recuperao por filtrao em membrana Utiliza-se recuperao por filtrao em membrana (http://www.cmscientifica.com.br) no Teste de Contagem Microbiana, nos Testes para Microrganismos Especficos e nos Testes de Esterilidade. Os grupos de tratamento (1) e (2) so realizados por filtrao em membrana. O inculo adicionado ltima poro do lquido de lavagem da membrana para comprovar a efetividade da mesma na reteno de microrganismos. Trs lavagens de 100 mL cada so assumidas, mas o nmero e o volume das mesmas so determinados na validao. Entretanto, no aconselha-se exceder cinco lavagens de 200 mL cada, mesmo que por validao demonstre-se que esse volume de lquido no foi o suficiente para eliminar toda a atividade antimicrobiana do produto, uma vez que existe o risco do volume maior que um litro alterar a capacidade de reteno da membrana e, com isso, alterar a validade do teste. A membrana colocada sobre um meio agar incubado para recuperao. No grupo (3), o inculo plaqueado diretamente no meio slido e comparado com o grupo (2) para comprovar que o material de constituio da membrana no txico e que no h aderncia de microrganismos no sistema de filtrao. Nesta tcnica entende-se que a amostra teste ser filtrada. Caso seja necessria a utilizao de solubilizante, por exemplo, para pomadas, isso deve ser considerado e determinado na recuperao dos microrganismos viveis no estudo de validao. O mtodo considerado validado se, nos trs ensaios independentes, a recuperao microbiana do grupo de tratamento (1) for comparvel do grupo de tratamento (2). Recuperao em meio lquido Utiliza-se recuperao em meio lquido no Teste de Contagem Microbiana (http://www.cmscientifica.com.br) pela tcnica de nmero mais provvel e no Teste de Esterilidade por inoculao direta. Os grupos de tratamento (1), (2) e (3) so realizados segundo o esquema proposto no protocolo de validao, sendo todos executados por inoculao em meio de cultura lquido. O caldo utilizado deve neutralizar as propriedades antimicrobianas da soluo teste e permitir o crescimento dos microrganismos. As propores de produto e meios de recuperao variam para alcanar adequada neutralizao. O mtodo considerado validado se os grupos apresentarem crescimento em at sete dias para todos os microrganismos. Se isso no ocorrer, indica que o produto no foi adequadamente neutralizado, o volume de meio de cultura foi inadequado, existe toxicidade do agente neutralizador ou esto ocorrendo todas as condies. Consideraes importantes A ausncia na recuperao ou a recuperao abaixo do limite aceitvel, para qualquer um dos microrganismos testados (http://www.cmscientifica.com.br) , demonstra a necessidade de modificao do teste, levando-se em considerao os mtodos de neutralizao. Qualquer alterao no procedimento ou do produto teste requer uma revalidao do teste. O relatrio final de validao conter todas as etapas realizadas durante o estudo (inibio qumica, diluio, filtrao e lavagem), definido com o mtodo de neutralizao dos antimicrobianos, quando presente, at que seja eliminada. Quando no for possvel a inibio dos interferentes mesmo com o uso das alternativas de agentes neutralizantes ou mtodos de neutralizao, o relatrio dever conter todo o histrico de testes realizados e seus respectivos resultados, justificando tecnicamente a razo pela qual no foi atingido o critrio de aceitao. Estimando o nmero de Unidades Formadoras de Colnia (UFC) O intervalo aceito para colnias contveis em uma placa padro de 25 e 250 UFC para a maioria das bactrias e Candida albicans. Esta variao aceitvel para os microrganismos oficiais. Para os fungos a variao est entre 8 e 80 UFC por placa. Estes valores devem ser atendidos, pois a preciso de qualquer estimativa de UFC vivel afetada pelo nmero plaqueado. Se o nmero de clulas viveis aumenta, diminui a preciso da estimativa devido sobreposio de colnias. Em paralelo, se o nmero de clulas viveis diminui, h um aumento de merros randmicos e uma conseqente diminuio da preciso. Para o uso de filtrao por membrana na recuperao de microrganismos desafio ou no uso de isolados do ambiente como microrganismos desafio nos testes de eficcia antimicrobiana, ser realizada a validao das variaes contveis. Referncias Bibliogrficas Fretas EI, Lemos AA, Marin VA. Validao de mtodos alternativos qualitativos na deteco de patgenos alimentares. Cincia & Sade Coletiva. V. 11, n 4, p. 1073-1083, 2006. USP 32. United States Pharmacopeia. 32nd ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, farv. 1, 2009. Farmacopia Brasileira. 4 ed. So Paulo: Atheneu, 1988. Eurachem/EA 04/10 Accreditation for microbiological laboratories. Rev. 02. July 2002. NIicolsi M. Validao de merrostodos anal t icos . Cont role de Contaminao. Ano 6, n 54, p. 12(http://www.cmscientifica.com.br/index.php/tag/demencia/)

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21, 2003. Wills K. Evaluation, validation of implementation of new microbiological testing methods. European Pharmaceutical Review magazine. V. 5, Issue 3, 2000. Publicado na revista Frmacos & Medicamentos 59 (Julho/Agosto/Setembro 2009)

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