2 - Desarrollo de Nuevos Fármacos

Captulo 2: Desarrollo de nuevos frmacos
Captulo 2. Desarrollo de nuevos frmacos.

Mtodos clsicos y modernos. Relaciones Cuantitativas Estructura-Propiedad y EstructuraActividad. Clasificacin de aproximaciones QSAR. Fundamentos de la metodologa elegida para la presente tesis. Etapas generales de un Estudio QSPR/QSAR.
Mtodos clsicos y modernos.
l objetivo central de este captulo es realizar una descripcin
de las metodologas QSAR. Se describirn en primera instancia las distintas metodologas empleadas en el pasado y en el para el desarrollo de nuevos en dos frmacos. grandes Las grupos: distintas mtodos
presente
estrategias
pueden
clasificarse
clsicos y mtodos modernos.
Dentro de los mtodos clsicos pueden incluirse el screening sistemtico y la modificacin estructural de compuestos lderes
(algunos autores mencionan dentro de los mtodos clsicos a la serendipicidad, pero como se vio difcilmente pueda ser considerada como una verdadera estrategia o mtodo).
El populariz
screening luego de
sistemtico, que Fleming
como
ya
se
ha la
mencionado, penicilina.
se El
descubriera
escenario histrico impuesto por la Segunda Guerra Mundial favoreca el inters de los gobiernos de las grandes potencias por encontrar nuevos antibiticos, pero casi no existan conocimientos cientficos vinculados a esta temtica. Sin antibiticos, muchos soldados moran en el frente como consecuencia de infecciones de heridas, incluso
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heridas relativamente leves (hasta entonces la primera causa de muerte de heridos era la mionecrosis clostridiana) por lo que el
descubrimiento de nuevos antibiticos implicaba una clara ventaja estratgica. Fueron Waksman y su grupo de colaboradores quienes, buscando antibiticos capaces de inhibir el crecimiento de bacterias Gram negativas (la penicilina slo se haba demostrado eficaz contra bacterias Gram positivas) encararon la bsqueda de antibiticos de
una manera nueva, sistemtica, buscando zonas de inhibicin alrededor de colonias de una serie de microorganismos del suelo, en un
principio, y de bacterias patognicas luego. Miles de bacterias diferentes fueron aisladas y ensayadas en busca de actividad
antibitica. El xito de esta metodologa de prueba y error (Walksman descubri unos veinte nuevos agentes antimicrobianos naturales, entre ellos la actinomicina y la estreptomicina) hizo que prontamente el screening sistemtico se realizara sobre otras fuentes de productos naturales en busca no slo de antibiticos sino de frmacos
pertenecientes a otras categoras teraputicas [1]. Dado que a travs de la Medicina Tradicional las drogas vegetales haban demostrado ser una cuantiosa fuente de principios activos1, los productos naturales se convirtieron en un nuevo blanco del screening sistemtico. Este screening sistemtico prontamente se asoci al fraccionamiento bioguiado, en el cual la droga vegetal es extrada sucesivamente con solventes de polaridad creciente, y sobre cada extracto se realizan ensayos biolgicos para determinar el extracto activo a partir del cual seguidamente se proceder al aislamiento del o los principios activos. Recientemente el screening sistemtico ha sido aplicado extensiva y xitosamente a productos naturales de origen marino, tales como algas, bacterias o esponjas marinas [2-4].
Como afirma Graham Patrick en su Introduccin a la Qumica Medicinal (Oxford University Press, 2001) la evolucin ya ha llevado a cabo su propio proceso de screening, por el cual las plantas tienen ms chances de sobrevivir si contienen potentes compuestos que evitan que animales e insectos las coman.
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La
modificacin
estructural
constituye
la
otra
estrategia
clsica para el desarrollo de nuevos frmacos, orientada a obtener, a partir de compuestos activos, otros con otras caractersticas tales como mayor potencia, mayor ndice teraputico (LD50/ED50), mayor
biodisponibilidad o, simplemente, encontrar un nuevo compuesto activo no patentado. El origen del prototipo activo sobre el que se realiza la modificacin puede ser muy variado: un ligando natural, una droga patentada por una compaa farmacutica competidora (drogas me too/ semejante a), un compuesto hallado por serendipicidad, screening sistemtico, observacin de un efecto adverso conveniente, etc [5]. tipos de Dentro de esta estrategia encontramos a su vez distintos modificaciones clsicas tales como homologacin,
ramificacin, ciclacin, apertura de anillos, adicin de un escudo estrico, transformaciones que involucran anillos y modificaciones guiadas por el concepto de bioisosterismo.
Por homologacin entendemos la generacin de una serie de derivados de un compuesto por introduccin de unidades constantes (como por ejemplo, grupos metileno). Hasta un valor crtico de unidades adicionadas (que vara segn la actividad considerada) se observa un aumento de la actividad por efectos farmacocinticos y farmacodinmicos. El aumento progresivo de grupos metilo incrementa la lipofilia, lo cual favorece la permeabilidad a travs de membranas biolgicas, no obstante ms all de un valor crtico la actividad comienza a decrecer por ser el compuesto incapaz de disolverse o por quedar retenido el mismo en las barreras biolgicas (sin
distribuirse); el efecto farmacodinmico se relaciona con la presencia de bolsillos hidrofbicos en el receptor biolgico: cuando la parte hidrofbica excede el tamao del bolsillo se desfavorece la
interaccin-droga receptor. Otra explicacin de este efecto es que
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usualmente
el
ligando
debe
perder
el
agua
de
solvatacin
para
interactuar con el sitio activo, proceso que se favorece en molculas con cierta hidrofobicidad.
Screening sistemtico Homologacin Ramificacin Escudo estrico Ciclacin Modificacin biosostrica (clsica no clsica)
Clsicos Modificacin estructural del lder
Mtodos utilizados para el desarrollo de nuevos frmacos
Pro-drogas HTS Modernos - fundados en bases racionales Combinatoria Qumica QSAR Biotecnologa
Fig. 3.1 Distintos mtodos utilizados en el desarrollo de frmacos.
La ramificacin usualmente disminuye o cambia la actividad por desfavorecer la interaccin con un receptor determinado. Un ejemplo clsico son la prometazina y la promazina (fig. 3.2) [6]. La primera tiene, predominantemente, accin atihistamnica y antiespasmdica, mientras que la segunda posee accin antipsictica.
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La adicin de un escudo o impedimento estrico se refiere a la proteccin de funciones qumicas susceptibles de degradacin qumica o enzimtica (por ejemplo, grupos ster o grupos amida) introduciendo grupos voluminosos (por ejemplo, un sustituyente terbutilo) para esconder el grupo lbil del ataque del nuclofilo o de la enzima [5].
S N CH3 N prometazina
S N
N promazina
Fig. 3.2. Ejemplo de modificacin del perfil farmacolgico de un frmaco mediante ramificacin.
Dentro encontramos la
de
las
transformaciones o cierre de
que anillos,
involucran la
anillos o
apertura
contraccin
expansin de anillos (cambio de un anillo por otro con menos o ms tomos, respectivamente) y la reorganizacin de anillos, entre varias otras. Por ejemplo, la ciclacin o cierre de anillos supone la transformacin de un sustituyente alqulico en un anlogo cclico. Aunque puede introducir pequeos cambios en la lipofilia o en el metabolismo de la molcula, en general no produce grandes cambios en la actividad. Por ejemplo, la clorpromazina y el anlogo NSC17471 obtenido mediante ciclacin poseen accin antipsictica similar (Fig. 3.3) mientras que por su parte la trimeprazina y la metdilazina poseen actividades antihistamnicas parecidas.
Una estructural
estrategia de un
ampliamente
utilizada se basa
para en
la el
modificacin concepto de
compuesto
lder
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biososterismo [7]. En 1919 Langmuir, estudiando el comportamiento qumico y la reactividad de un grupo de compuestos con igual nmero de electrones de valencia acu el concepto de isosterismo para definir tomos y/o molculas inorgnicas u orgnicas que poseen el mismo nmero y/o arreglo de electrones (por ejemplo, CO2 y NO2, PO4-3 y SO4-2).
Cl
S N
Cl
S N
N clorpromazina S N
N NSC17471 S N
trimeprazine
metdilazina
Fig. 3.3. La ciclacin suele modificar el perfil farmacocintico de un frmaco sin afectar su perfil farmacolgico. En 1925 Grimm formul la Ley del Desplazamiento, una regla emprica que establece que la adicin de entre uno y cuatro tomos de hidrgeno a un tomo de los cuatro grupos anteriores a los gases inertes en la tabla peridica da como resultado un pseudotomo de propiedades similares a las de los cuatro grupos a su derecha. La Ley del Desplazamiento se ilustra en la tabla 3.1.
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Tabla 3.1. Ley del Desplazamiento de Grimm. Los tomos y pseudotomos de una misma columna se comportan como issteros. C N CHO NHCH2F OHNH2CH3Ne FH H 2O NH3 CH4 Na FH2+ H3O+ NH4+
Ms adelante, Erlenmeyer propuso una definicin ms amplia de isosterismo, definiendo issteros como elementos, molculas o iones que presentan el mismo nmero de electrones en la capa de valencia. Tiempo despus Friedman reconocera la utilidad del concepto de isosterismo para disear molculas bioactivas, definiendo como
bioissteros a aquellas molculas que, cumpliendo con la definicin de isosterismo, actan sobre el mismo receptor ya sea como agonistas o como antagonistas. En 1979 Thornber propuso una definicin ms amplia de bioisosterismo; segn l, los bioissteros son molculas o grupos con propiedades fisicoqumicas similares y una actividad biolgica aproximadamente parecida [8]. En 1991 Burguer propuso una nueva definicin, sugiriendo que son bioissteros aquellas molculas o grupos que poseen un volumen y una distribucin electrnica similar y propiedades fisicoqumicas parecidas [9]. El bioisosterismo clsico incluye tomos o grupos mono, di y trivalentes, tomos
tetrasustituidos y anillos equivalentes; el bioisosterismo no clsico incluye adems sustituciones de ciclos por grupos acclicos y
sustitucin de grupos funcionales (por ejemplo, un grupo ster por un grupo amida). La fig. 3.4 presenta un ejemplo de bioisosterismo, en este caso bioisosterismo clsico entre los grupos OH y NH2.
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COOH OH
COOH NH2
Fig. 3.4. Reemplazo bioisostrico clsico del grupo hidroxi del cido saliclico por el grupo amino del cido antranlico.
Por encontramos
su el
parte, uso de
dentro
de
las la
metodologas combinatoria
ms
modernas el
pro-drogas,
qumica,
screening de alta performance o HTS, las metodologas QSAR y las aplicaciones de la biotecnologa en el rea de la Qumica Medicinal.
Por pro-droga entendemos un tipo de compuesto que debe ser metabolizado en el organismo para poder ejercer su accin biolgica. En general, las pro-drogas consisten de un frmaco unido a un grupo modulador, pudiendo el grupo modulador ser escindido mediante alguno de los sistemas metablicos del organismo y liberndose el frmaco para poder ejercer su accin teraputica (siendo que la asociacin frmaco-grupo modulador es, en el caso del pro-frmaco ideal,
farmacolgicamente inactiva) [10]. Las pro-drogas pueden ser diseadas para resolver problemas farmacocinticos (por ejemplo, baja absorcin) o dificultades debidas a la toxicidad, estabilidad o baja aceptacin por parte del paciente (como ser, caractersticas organolpticas desfavorables). La levodopa constituye un ejemplo de pro-frmaco que permite superar la baja permeabilidad de la dopamina a travs de la BBB. La levodopa es transportada activamente a travs de la barrera y luego es metabolizada a dopamina por una descarboxilasa del SNC, ejerciendo su accin teraputica (fig. 3.5)
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OH O HO OH NH2 HO OH NH2
Fig. 3.5. La levodopa, profrmaco de la dopamina, logra atravesar la BBB mediante transporte activo.
El screening de alta performance (HTS) combina robtica y microensayos para ensayar biolgicamente un gran nmero de compuestos con el fin de verificar su actividad contra un gran nmero de blancos moleculares. Tpicamente, miles de compuestos pueden ser ensayados simultneamente en medio centenar de ensayos a la vez. Se trata de combinar el screening sistemtico clsico de Waksman con la tecnologa moderna ensayando en poco tiempo, y con pequea cantidad de muestra, miles de compuestos en una gran cantidad de blancos moleculares potenciales. La aparicin del HTS y los avances en el mapeo del genoma humano (que trajo aparejado el descubrimiento de un gran nmero de blancos moleculares inexplorados) hicieron necesario desarrollar
nuevas tecnologas de sntesis que permitieran sintetizar una gran diversidad de nuevos compuestos en poco tiempo. Surgi as la sntesis combinatoria, que consiste en llevar a cabo reacciones definidas (tpicamente en fase slida, aunque se estn desarrollando tecnologas de sntesis combinatoria en fase lquida) a partir de reactivos de partida diversos en un solo reactor (sntesis compleja) o en reactores separados (sntesis en paralelo) [11,12].
Las metodologas QSAR se describirn en detalle en los apartados subsiguientes del presente captulo. Las aplicaciones de la
biotecnologa en la Qumica Medicinal incluyen la llamada terapia gnica (introducir un gen funcional en las clulas de un paciente con falta o deficiencia de un gen) y la farmacogenomia (que consiste en
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utilizar informacin gentica para predecir la eficacia y seguridad de una droga en un paciente o grupos de pacientes determinado).
Adicionalmente, la biotecnologa ha aportado a la Qumica Medicinal animales transgnicos que pueden utilizarse como modelos crnicos y ha identificado y elucidado la estructura de nuevos blancos moleculares, estableciendo nuevos objetivos teraputicos. Permite adems aportar informacin sobre los mecanismos moleculares de patologas de origen gentico y facilita el diseo de nuevas estructuras mediante
metodologas basadas en las interacciones especficas frmaco-receptor (docking), generando nuevos frmacos con caractersticas
complementarias a las del sitio activo del receptor.
Relaciones Cuantitativas Estructura-Propiedad y Estructura-Actividad. El proceso en de desarrollo una de un frmaco con consista un perfil
tradicionalmente
identificar
estructura
farmacolgico interesante (prototipo activo), sobre la que se llevaban a cabo una serie de modificaciones estructurales con el objeto de optimizar la actividad2, mientras paralelamente se investigaban rutas y condiciones de sntesis alternativas, con objetivos diversos tales como mejorar y los rendimientos, de disminuir los o costos, utilizar los
reactivos
solventes
menor
toxicidad
facilitar
procedimientos de control de reaccin y aislamiento y purificacin de los productos obtenidos.
Una vez que una serie de estructuras relacionadas (variacin estructural exhaustiva del prototipo activo) haban sido sintetizadas y ensayadas farmacolgicamente, el qumico medicinal estaba en
condiciones de esgrimir hiptesis que relacionaran las caractersticas estructurales y las propiedades fisicoqumicas de los compuestos que
En primer trmino, se proponan una serie de modificaciones sintticamente accesibles segn la estructura del compuesto de partida.
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conformaban la serie con sus correspondientes actividades biolgicas. A partir de estas hiptesis era posible encarar una segunda serie de optimizaciones estructurales con fundamentos racionales. Por lo tanto, las primeras relaciones estructura-actividad (REA) se basaban en la observacin visual de representaciones sencillas de la estructura molecular por parte de un qumico experto. La serie de compuestos inspeccionados estaba constituida generalmente por compuestos
ntimamente relacionados desde el punto de vista estructural (ya que surgan de pequeas modificaciones de la estructura qumica del frmaco que constitua el punto de partida). Se desprende que las primeras REA estaban limitadas por:
a) basarse en representaciones simples de la estructura molecular (estructuras en el plano o modelos moleculares sencillos); no se contaba con representaciones estructurales vlidas; b) establecerse a partir de inspeccin visual de las estructuras comprendidas por la serie, hecho que dificultaba encontrar relaciones no evidentes entre los compuestos estudiados; c) estar la serie conformada por estructuras con pequeas diferencias estructurales. En otras palabras, se trataba de relaciones parciales, que se establecan por inspeccin de un espacio qumico pequeo, limitado; por lo tanto, las conclusiones obtenidas a partir de esa inspeccin podan aplicarse en un espacio qumico o dominio de aplicabilidad pequeo y; d) conocimiento limitado de los procesos bioqumicos que definen la actividad de un frmaco.
El hallazgo fundamental de Hammet (descrito brevemente en la Introduccin) consisti justamente en superar las limitaciones de la inspeccin visual por parte de un experto, recurriendo a mtodos
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estadsticos
para
relacionar
caractersticas
de
la
estructura
molecular con una propiedad fisicoqumica de una serie de compuestos:
log
K K = log Ko Ko
donde como ya se describi, Ko y Korepresentan, respectivamente, las constantes de disociacin del cido fenilactico y el cido benzoico sin sustituir, y K y Klas constantes de disociacin de los mismos cidos, en ese orden, sustituidos por el mismo sustituyente en la misma posicin del anillo aromtico. La expresin anterior puede expresarse como:
log
K = Ko
donde denota la contribucin electrnica del sustituyente respecto al hidrgeno. A partir de la ecuacin anterior, determinando para diversos sustituyentes, puede estimarse el efecto que cada
sustituyente tendr sobre la funcin principal, sin necesidad de la determinacin experimental de la misma.
Por su parte Hansch y Fujita tuvieron la lucidez y la audacia de proponer la aplicacin de la aproximacin de Hammet en la prediccin de actividades biolgicas de compuestos qumicos, introduciendo el trmino relaciones cuantitativas estructura-actividad(Quantitive Structure-Activity Relationship - QSAR). Hansch y Fujita advirtieron prontamente que al considerar la actividad biolgica nos referimos a una propiedad que, aunque dependiente de la estructura qumica como todas las propiedades moleculares, es particularmente compleja, por cuanto la capacidad de un compuesto qumico para manifestar una
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actividad biolgica determinada depende a su vez de una serie de procesos complejos3 adems de la interaccin con su o sus blancos moleculares (receptores, enzimas), entre ellos: la absorcin a travs de las diferentes barreras biolgicas presentes en un organismo, la metabolizacin a especies activas o inactivas, el reparto (no
uniforme) en los distintos tejidos que componen los rganos de un sistema vivo y la velocidad de eliminacin del compuesto administrado
y sus metabolitos, entre otros factores. Hansch y Fujita enfrentaron los desafos particulares que supone el modelado de la actividad biolgica al intentar utilizar el parmetro de Hammet para predecir bioactividades, sin buenos resultados. La descripcin de las
caractersticas electrnicas de una serie de compuestos era, por tanto, insuficiente para explicar consistentemente las diferencias en sus actividades biolgicas observadas; fue necesario la consideracin de otros aspectos estructurales, tales como la lipofilia
(introduciendo el parmetro de Hansch y Fujita4) y los efectos estricos (a travs, por ejemplo, de la refractividad molar) [13,14] para describir propiedades biolgicas de una serie de estructuras. De esta manera, la actividad biolgica poda ser expresada, recurriendo a los mtodos de ajuste ms sencillos (regresin lineal mltiple) como:
log
1 = a1 + a2 + a3 MR + a0 (2.1) C
donde , y MR son los valores del parmetro de Hammet, el parmetro de Hansch y Fujita y la Refractividad Molar para el sustituyente considerado y a0 es el valor predicho por la ecuacin para el compuesto
Hansch y sus colaboradores trabajaron originalmente en la prediccin de la actividad biolgica de auxinas (hormonas involucradas en la regulacin del crecimiento en vegetales), y luego ampliaron el uso de las metodologas desarrolladas a bioactividades diversas. 4 Definido en forma anloga al de Hammet pero caracterizando la influencia de diversos sustituyentes sobre la el logaritmo de la constante de reparto octanol-agua: R = log PR log PH, donde PR y PH son, respectivamente las constantes de reparto octanol-agua del compuesto sustituido por el sustituyente R y sin sustituir
3
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sin sustituir. C es la variable que cuantifica la actividad biolgica. En general, C representa alguna de las formas en las que se suele expresar la actividad biolgica de un compuesto bioactivo: ED50 (dosis del compuesto que genera el 50% del efecto mximo o dosis que genera el efecto deseado en la mitad de la poblacin), IC50 (concentracin requerida para que se produzca un 50% de inhibicin) o LD50 (dosis que provoca muerte en el 50% de la poblacin a la que se le administra el compuesto). La ecuacin puede generalizarse:
log
1 = a1 (descriptor electrnico) + a2 (descriptor hidrofbioco) + a3 (descriptor estrico) + a0 C
(2.2)
Dado que por su definicin el de Hammet y el de Hansch y Fujita son expresiones de cambios de energa libre, y que segn la Teora de Receptores tradicional los valores de ED50 o IC50 corresponden a la constante de disociacin del complejo drogareceptor (Kd) [15], debe expresarse la actividad biolgica como log 1/C o log C para que se corresponda con el cambio energa libre asociada a la unin de la droga al receptor o a la disociacin del complejo frmaco-receptor5
Cabe
mencionar
que,
si
bien
Hansch
sus
colaboradores
inicialmente pensaron a las relaciones QSAR como una metodologa promisoria para guiar optimizaciones de estructuras conocidas, pronto advirtieron que la extrapolacin de las relaciones obtenidas hacia regiones ubicadas fuera del espacio definido por los descriptores y las actividades biolgicas del conjunto de entrenamiento conduca usualmente a predicciones inexactas del valor de actividad. En otras palabras, la actividad biolgica no es en general una funcin
estrictamente lineal de un conjunto de descriptores. Un ejemplo

Originalmente, cuando el trmino QSAR no estaba arraigado, este tipo de relaciones estructuraactividad eran referidas como Relaciones Lineales de Energa Libre.
5
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clsico es un conjunto de estructuras en las que la actividad aumenta sistemticamente con el valor del log P; sera un error interpretar que un compuesto con un log P muy grande tendr una actividad muy grande, por cuanto superado un valor crtico de log P la actividad biolgica en general comenzar a descender por reducirse la
solubilidad y distribucin del compuesto y, consecuentemente, su biodisponibilidad. intrapolaciones Por lo tanto, espacio la metodologa por el QSAR permite de
dentro
del
definido
conjunto
entrenamiento pero no extrapolaciones fuera del mismo. Se desprende que no puede confiarse en las predicciones de valores de actividad fuera del rango de actividades definido por el conjunto de
entrenamiento, por lo que las metodologas QSAR no resultan vlidas para conducir una optimizacin. An as, estas metodologas tuvieron un notable xito en la prediccin de valores de actividad para compuestos incluidos en el espacio qumico definido por el conjunto de entrenamiento (es decir, predicciones basadas en intrapolacin), y pronto se propusieron un gran nmero de nuevos parmetros (o descriptores) que caracterizaran cuantitativamente estos y otros aspectos de la estructura molecular. Dos pasos importantes en el desarrollo de los mtodos QSAR (que como se ver, sern fundamentales para introducir luego la idea de
Screening Virtual) fueron a) la incorporacin de descriptores de naturaleza holstica (que cuantificaban aspectos electrnicos, hidrofbicos y estricos no ya de un sustituyente sino de toda una molcula) y b) la introduccin de descriptores derivados de modelos moleculares tericos en los estudios QSAR. El primero de estos dos adelantos (la cuantificacin de
propiedades moleculares en lugar de utilizar el valor de una propiedad para de un fragmento de la molcula) permiti que el QSAR dejara de ser una metodologa aplicable estrictamente a series de compuestos
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similares, formadas por un mismo compuesto de partida y por derivados obtenidos por incorporacin a la molcula de sustituyentes con valores de , , etc. conocidos. La definicin de descriptores cuyo valor, para cada compuesto, poda ser calculado tericamente (en lugar de requerir una medicin experimental para obtener el valor del descriptor) allan el camino para realizar predicciones de actividad biolgica de compuestos
hipotticos, cuya sntesis no se hubiera logrado o intentado todava. Ms an, hasta la incorporacin de descriptores tericos en los estudios QSAR, la prediccin de la actividad implicaba la
determinacin experimental de descriptores empricos para una serie de sustituyentes o compuestos de actividad conocida (los compuestos que conforman el conjunto de entrenamiento del que se deriva el modelo) y tambin para aquellos compuestos cuya actividad se deseaba predecir, lo que evidentemente La limitaba prediccin disponer varias de las aplicaciones de todos los prcticas de la
metodologa.
actividad compuestos
involucraba, predichos (segn y se
indefectiblemente, realizar una o
determinaciones
experimentales
incluyeran uno o varios parmetros empricamente determinados en el modelo QSAR). El clculo terico de descriptores moleculares pronto puso en evidencia la necesidad de contar con modelos o representaciones cada vez ms exactos de la estructura molecular, bajo la premisa de que cuanto ms exacta fuera dicha representacin mejor se aproximaran los valores tericos de los descriptores a los valores observados. Ms an: los avances en el campo de la biologa establecieron
simultneamente la importancia de la conformacin de la molcula para su interaccin con el receptor biolgico. Pareca lgico inferir que slo una representacin molecular que tuviera en cuenta la geometra ms probable de la molcula en el medio biolgico sera capaz de
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conducir a predicciones de actividad acertadas. No obstante, como se ver ms adelante, se ha demostrado que el conocimiento de la conformacin ms probable es en ocasiones insuficiente para predecir la capacidad de interaccin con un receptor dado. En otras
circunstancias el uso de representaciones ms sencillas (por ejemplo, representaciones en el plano) de la estructura qumica implica
ventajas considerables para algunas aplicaciones especficas. En la Tabla 3.2 presenta un anlisis comparativo de los estudios SAR tradicionales y de las metodologas QSAR. Tabla 3.2. Comparacin de las caractersticas de las metodologas SAR clsicas y las metodologas QSAR. SAR tradicional QSAR Tiene por objetivo establecer relaciones estructura-actividad sencillas para establecer cules descriptores o aspectos estructurales son significativos para la actividad biolgica, es decir, el incremento de qu descriptor o propiedad de la molcula se asocia a un incremento de su actividad, orientando racionalmente la optimizacin de un compuesto lder Parte de representaciones sencillas de la estructura molecular, generalmente representaciones en el plano Se utiliza para analizar series de compuestos estructuralmente similares Las relaciones estructura-actividad que detecta son relativamente simples y suelen ser apreciables a simple vista por un qumico experto El xito de la relacin establecida depende fuertemente de la experticia del investigador Logra plantear algoritmos donde se permite inferir cuali y cuantitativamente qu descriptor/es son responsables de la actividad biolgica. Las aplicaciones ms generales incluyen establecer hiptesis sobre los mecanismos moleculares por los que una droga interacta con un receptor e identificar nuevos compuestos lderes a travs del anlisis de bases de datos de estructuras qumicas Parte de representaciones de complejidad variable de la estructura molecular, desde representaciones muy simples hasta muy complejas Puede utilizarse para analizar series similares o conjuntos de estructuras de gran diversidad Las relaciones estructura actividad que detecta pueden ser muy sutiles, por cuanto los descriptores capturan informacin estructural no evidente Si bien se requiere criterio qumico para analizar/interpretar los resultados obtenidos, el uso de mtodos estadsticos y la capacidad de descripcin de los descriptores permiten lograr aplicaciones exitosas sin necesidad de una gran experticia6.
Subrayaremos de nuevo, sin embargo, que la suerte favorece a las mentes preparadas; a mayor conocimiento del observador mayor la informacin que podr ser extrada de cualquier observacin realizada.
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Clasificacin de las aproximaciones QSAR
Consideraremos dos clasificaciones de las metodologas QSAR: a) segn la dimensionalidad de los descriptores incluidos en el modelo y; b) segn la naturaleza de la variable dependiente considerada.
Pese
que
diferentes
clasificaciones
de
los
descriptores
moleculares segn su dimensionalidad han sido propuestas (algunas veces con diferentes criterios de inclusin de los descriptores en cada categora) [15-17] podemos considerar fundamentalmente dos
categoras de descriptores y de aproximaciones QSAR, cada una de ellas incluyendo subcategoras cuyos lmites son ms difusos, como puede verse en la literatura citada:
Descriptores cuyo valor no depende de la conformacin ni de la orientacin 3D de la molcula. Este grupo engloba varios subgrupos de descriptores 0D y 1D moleculares tales como los y
descriptores
(descriptores
constitucionales
aquellos que indican presencia o frecuencia de un grupo funcional o subestrutura/fragmento determinado en la
molcula) y los descriptores 2D (descriptores topolgicos). Ejemplos de descriptores constitucionales son el peso
molecular, el nmero de tomos que componen la molcula y el nmero de dobles o triples enlaces incluidos en la
estructura. Los descriptores topolgicos se discutirn en detalle en el captulo siguiente. De aqu en ms llamaremos, genricamente, a las metodologas QSAR que utilizan
descriptores de baja dimensionalidad
(0D-2D), independientes
de la conformacin y orientacin de la molcula, metodologas 2D QSAR.
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Descriptores cuyo valor depende de la conformacin y/o de la orientacin 3D de la molcula. La metodologa 3D QSAR es mucho ms compleja que la
aproximacin 2D QSAR, requiriendo varias etapas para la obtencin de los descriptores moleculares asociados. En
primer lugar, debera definirse la conformacin de partida en base a la cual se realiza el clculo de los descriptores. Esta conformacin debe ser, cuando menos, una conformacin energtica probable. Usualmente se definir la conformacin ms probable como la conformacin de mnima energa (esto es, el mnimo global de energa en el espacio conformacional). Esto implica un muestreo sistemtico del espacio
conformacional (o, alternativamente, cuando esto no fuera posible por tratarse de estructuras de elevado peso molecular y gran flexibilidad, mediante otras aproximaciones como
estudios estocsticos). La necesidad de obtener, en general, la conformacin de mnima energa de la molcula introduce algunos interrogantes: qu mtodo debe utilizarse para calcular la energa conformacional? mecnica molecular, mtodos semiempricos o mtodos ab initio? Es una
aproximacin lo suficientemente buena de lo que sucede en un medio biolgico la minimizacin de la energa en el vaco o debe simularse un medio acuoso? Adicionalmente, los mtodos 3D QSAR ms populares, entre los que se puede destacar el CoMFA [18], se basan en disponer cada molcula (optimizada) en una grilla y calcular,
posteriormente, el valor de la fuerza que diferentes campos (electrosttico, estrico) ejercen sobre los vrtices de la misma (a menudo utilizando un tomo o molcula de prueba), estableciendo qu campo, y en qu zona de la grilla, es significativo para la actividad biolgica (fig. 3.6). Otros
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ejemplos de este tipo de metodologas basadas en grilla son SOMFA [19] y GRID [20]. A finales del 2005 ya se haban publicado ms de mil trabajos en revistas cientficas
internacionales utilizando CoMFA, la ms difundida de estas tcnicas [16]. Se desprende que las tcnicas 3D QSAR son, adems de sensibles a la conformacin de la molcula que se ingresa, a la rotacin y traslacin de la molcula dentro de los confines de la grilla. En otras palabras, la orientacin de la molcula es un aspecto crtico, y a la fecha no se han logrado soluciones enteramente automticas y satisfactorias a este problema cuando se trabaja con grandes colecciones de compuestos estructuralmente diversos, requirindose la
introduccin de criterios arbitrarios por parte del operador humano. Si bien un aumento en la resolucin de la grilla (reduciendo la distancia entre los puntos de la misma) conducir en general a una mayor capacidad predictiva
logrando adems cierta independencia a pequeas variaciones traslacionales crecimiento y rotacionales, de la tambin cantidad producir de un
exponencial
variables
consideradas, lo cual, como se ver, introduce dificultades adicionales debidas al incremento del costo computacional y a problemas relacionadas con el anlisis estadstico de una cantidad de variables demasiado grande [21]. Para resolver estas dificultades se han introducido descriptores y tcnicas dependientes de la conformacin pero no de la orientacin (que algunos autores refieren como descriptores 2.5D)[22,23]. Sin embargo, los resultados de estas metodologas son ms difciles de interpretar que los de las metodologas basadas en grillas, y es por este motivo que en la mayora de los casos los descriptores independientes de la alineacin no son
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utilizados fuera del grupo de investigacin que los define [24]. Un anlisis ms profundo de los fundamentos de las
metodologas 3D-QSAR nos enfrenta a una nueva problemtica: cuando se asume que la conformacin de mnima energa
interaccionar con el receptor biolgico se est realizando una simplificacin extrema de la situacin dinmica que acontece en la realidad. Los sistemas biolgicos son sistemas qumicos complejos y dinmicos y no existen garantas de que la conformacin de mnima energa corresponda a la
conformacin bioactiva: ms an, se sabe que tanto el ligando como el receptor inducen cambios conformacionales el uno en el otro, recprocamente, siendo ste el disparador del evento biolgico. Si bien la simplificacin de considerar una
molcula rgida interaccionando con un receptor rgido ha resultado exitosa en muchos estudios, en particular en
aquellos casos en los que el ligando es una molcula rgida con la libre rotacin de los enlaces restringida, los efectos dinmicos son en muchos casos considerables; este hecho ha derivado en la generacin de metodologas 4D-QSAR que
muestrean no una sino varias orientaciones, conformaciones, estados de protonacin y esteroismeros de los ligandos estudiados [25-27]. Recientemente ha sido introducido el paradigma 5D-QSAR, que tiene en cuenta no slo la
flexibilidad conformacional del ligando sino tambin del receptor [28]. Estas metodologas estn en etapa incipiente y resta evaluar si el creciente costo computacional requerido es compensado por un incremento equivalente en la capacidad predictiva de los modelos 4D y 5D-QSAR.
69
Segn la naturaleza de la variable dependiente considerada, los modelos QSAR pueden tambin dividirse en cualitativos o cuantitativos. La primera clase o (que anlisis tambin podemos referir considera propiedad como una modelos variable es
clasificatorios dependiente
discriminante) la
discreta,
categrica;
observada
representada mediante una etiqueta (txico y no txico; activo, moderadamente activo e inactivo; etc.). Los modelos cuantitativos, en cambio, utilizan una variable dependiente continua y se usan para
predecir, por lo tanto, el valor numrico de una propiedad determinada (por ej. ED50). Fig. 3.6. Las metodologas 3DQSAR basadas en grillas (dependientes de la conformacin y orientacin de la molcula en la grilla). Los descriptores surgen de calcular el valor de un campo determinado (por ej. un campo coulmbico para las interacciones electrostticas) sobre un tomo o molcula de prueba ubicado en los vrtices de la grilla. En el ejemplo, una representacin de una grilla en cuyo interior se encuentra una molcula de difenilhidantona.
O HN O NH
Fundamentos de la metodologa elegida para la presente tesis.
En el presente trabajo se ha decidido por la bsqueda de nuevos agentes antiepilpticos mediante 2D-QSAR basado en descriptores y enfocado desde el ligando. Esta decisin supone algunas ventajas y desventajas respecto a otras alternativas posibles. Entre las ventajas podemos mencionar:
a) la independencia del valor de los descriptores 2D respecto de la conformacin y orientacin de las estructuras cuyo valor ha de predecirse, lo cual reduce considerablemente el trabajo de pre-
70
procesamiento de las estructuras de las bases de datos (no se requieren coordenadas optimizadas ni establecer criterios de orientacin para el clculo de los descriptores). Dado que se desea analizar bases de datos de 105 a 106 estructuras con gran diversidad qumica, el solo pre-procesamiento de las estructuras cuya actividad biolgica se busca predecir demandara un tiempo considerable e implicara definir protocolos de optimizacin y criterios de orientacin por parte del operador humano, sobre todo si se tiene en cuenta que se desean identificar estructuras bloqueantes de canales de sodio voltaje operados. Se trata de un tipo de receptor particularmente complejo que consta de una subunidad formada por cuatro dominios (cada uno de ellos consta de seis -hlices transmembrana) y una o ms subunidades de peso molecular relativamente menor (fig. 3.3); los canales de sodio poseen mltiples sitios de unin a inhibidores
competitivos y no competitivos y su estructura terciaria no ha sido an enteramente de canales dilucidada; de sodio del ms SNC an, los diferentes diferente
subtipos
presentan
afinidad por los frmacos [29,30]. Todos estos hechos, asociados a que no se dispone de una estructura de rayos X del canal de sodio, dificultan utilizar el receptor para definir una
orientacin preferencial de molculas estructuralmente diversas en la grilla. b) el bajo costo 2D, computacional lo cual que supone el el clculo de de
descriptores
facilita
anlisis
grandes
colecciones de estructuras virtuales en un tiempo reducido; c) no se requiere informacin sobre la estructura del receptor.
Desde luego, la metodologa elegida tambin tiene sus limitaciones. Las metodologas una 3D-QSAR permiten generar de los modelos grficos que
permiten
fcil
interpretacin
resultados
observados,
71
posibilitando la identificacin de las interacciones frmaco-receptor ms importantes para la actividad biolgica. Sin embargo, nada dicen respecto a otros procesos muy importantes para que un compuesto sea activo, tales como el pasaje a travs de las distintas barreras biolgicas, la metabolizacin, la toxicidad, etc. Los descriptores 2D son en cambio bastante abstractos y codifican/condensan, en un solo nmero, informacin respecto a diversos aspectos estructurales. Si bien son muy eficaces para identificar nuevos lderes, es en general difcil extraer de un modelo 2D QSAR informacin significativa desde el punto de vista fisicoqumico acerca de los mecanismos por los cuales una droga determinada interacciona con su receptor molecular. Los descriptores 2D funcionan, efectivamente, como una caja negra de la que se extrae informacin til pero difcil de interpretar. Por ejemplo, si un modelo 2D-QSAR predice que un compuesto determinado presentar baja actividad biolgica, ser difcil definir si esa baja actividad predicha se debe a su baja biodisponibilidad, su rpida eliminacin o a que no interacciona efectivamente con el blanco molecular (por ms que la prediccin sea acertada).
A modo de sntesis se podra decir que las metodologas 3D describen con mayor claridad la interaccin de la droga y su receptor, evento necesario pero no suficiente para que un frmaco ejerza su actividad (los otros eventos debern ser modelados, se desprende, mediante modelos complementarios); adicionalmente, requieren un preprocesamiento de la estructura que no las hace aptas para el estudio de grandes bases de datos. Las metodologas 2D QSAR, si bien por su carcter abstracto y holstico no arrojan tanta luz sobre el proceso de unin al receptor, capturan otros aspectos necesarios para producir la bioactividad, de y baja por otro lado la y velocidad la de clculo de de la
descriptores
dimensionalidad
independencia
conformacin y orientacin de la molcula las hace ideales para
72
identificar nuevos lderes en grandes bases de datos de diversidad estructural.
En el trabajo de tesis no slo se han generado modelos 2D QSAR para predecir actividad anticonvulsiva por bloqueo de canales de sodio voltaje-operados, sino tambin, en forma complementaria, filtros
particulares para predecir la biodisponibilidad a nivel del SNC y la neurotoxicidad de los compuestos evaluados. Puede subrayarse que, dado al carcter holstico de los descriptores topolgicos, una adecuada seleccin del conjunto de entrenamiento utilizado contribuye a
seleccionar compuestos biodisponibles y seguros durante el proceso de SV. Sin embargo, hemos decidido refinar esta seleccin mediante generacin de filtros especficos de absorcin y neurotoxicidad. En la
Dominio I
Dominio II
Fig. 3.3. Representacin esquemtica de la estructura terciaria de la subunidad de un canal de sodio voltaje operado. Se muestran dos de los cuatro dominios de la misma; cada dominio est formado por seis -hlice transmembrana. En anaranjado, el segmento que reconoce los cambios de voltaje; en amarillo, los segmentos que definen el poro por el que se transporta el sodio. La subunidad puede se asocia a una o ms subunidades . Existen numerosos sitios de unin a frmacos intra y extracelulares.
73
fig.
3.4
se
esquematizan
distintos
procesos
que
condicionan
la
actividad de un frmaco que acta a nivel del sistema nervioso central, y cules de ellos y en qu forma se han considerado en la estrategia QSAR elegida. Hemos elegido para el esquema la va de administracin oral, forma farmacutica slida, que por varias razones es considerada en general como la va de preferencia para medicamentos que se administran en forma crnica (entre ellas: inocuidad,
estabilidad, facilidad de dosificacin y de transporte de las formas slidas orales).
administracin y facilidad
Etapas generales de un estudio QSPR/QSAR
En general, un estudio QSAR pueden dividirse en las siguientes etapas:
1. Generacin del conjunto de entrenamiento. Se denomina conjunto de entrenamiento al conjunto de estructuras qumicas a partir de las cuales se deriva el modelo QSAR. El conjunto QSAR define el espacio qumicodentro del cual la aplicacin del modelo tendr validez. En otras palabras, el valor de la
actividad/propiedad biolgica predicha para un compuesto externo al conjunto de entrenamiento ser vlida si y slo si el mismo posee cierta similitud con alguna o varias de las estructuras incluidas en el conjunto de entrenamiento. El espacio qumico dentro del cual la aplicacin del modelo QSAR es confiable se denomina dominio de aplicabilidad. La forma ms sencilla de estimar el dominio de aplicabilidad cuando los valores de los descriptores incluidos en el modelo estn bien distribuidos para el conjunto de entrenamiento, es definir un espacio N-
dimensional delimitado por los rangos de valores que los N descriptores del modelo asumen para el conjunto de entrenamiento [31,32]. Otra regla til a tener en cuenta cuando se disea un
74
conjunto de entrenamiento es que los valores observados de la propiedad estudiada deberan presentar una buena distribucin (que aproxime una distribucin normal) en un rango de entre tres y cuatro rdenes lgico: logartmicos. supongamos un Este requisito de posee un
fundamento
conjunto
entrenamiento
formado solamente por compuestos de alta y mediana actividad, el modelo QSAR derivado del mismo slo podr predecir con exactitud valores de compuestos muy activos y moderadamente activos, pero no servir para diferenciar compuestos activos de inactivos (no identificar qu caractersticas estructurales son francamente desfavorables a la actividad por no estar los compuestos poco activos e inactivos representados dentro del conjunto de
entrenamiento del que se deriva el modelo). Un ltimo requisito esencial es que los compuestos del conjunto de entrenamiento posean un mecanismo de accin comn, esto es, interaccionen con el mismo receptor o blanco molecular. Supongamos, por ejemplo, que se desea generar un modelo QSAR para la bsqueda de compuestos antihipertensivos. Si se incluyeran en el conjunto de entrenamiento diurticos, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina derivar un y vasodilatadores modelo perifricos, que sera difcil las
nico
QSAR
identificara
caractersticas favorables a la actividad antihipertensiva que no sean simplemente las caractersticas tpicas de los frmacos (caractersticas drug-like, que se discutirn luego), debido a que un frmaco inhibidor de la enzima conversora de angiotensina interacta con un blanco molecular que en principio nada tiene que ver con los varios blancos moleculares de los distintos diurticos, de lo que se deduce que es poco probable encontrar patrones estructurales comunes relacionados con la interaccin frmaco-receptor.
75
2. Clculo del valor de un conjunto de D descriptores para el conjunto de entrenamiento. Lo fundamental en esta etapa es chequear las estructuras del conjunto de entrenamiento y, en los casos en que sea necesario (3D-QSAR en adelante) realizar un pre-procesamiento adecuado de las estructuras de los compuestos. 3. Seleccin de un conjunto d de descriptores de entre los D descriptores disponibles; generacin del modelo. La Regresin Lineal Mltiple (Multiple Linear Regression - MLR ) es el mtodo tradicional para generar modelos QSAR. El mismo se basa en el mtodo de los cuadrados mnimos, esto es, encontrar la
combinacin lineal de variables que minimice la suma de los cuadrados de los residuales (diferencia entre los valores
observados de la variable dependiente y los valores predichos) [33]. Usualmente se utilizan el coeficiente de determinacin r2 y la desviacin estndar en la estimacin SEE (Standard
Deviation on the Estimate) para evaluar la bondad del ajuste de los valores de la variable independiente predichos por el modelo con respecto a los valores observados. El coeficiente de
determinacin indica la fraccin de la varianza total de los datos experimentales que puede ser explicado por el conjunto de descriptores incluidos en el modelo.
r2 = 1
(Yobs, i Ypre, i ) (Yobs, i Ymed )

i =1 i =1 n
(Ypre, i Ymed )
i =1 n i =1
(Yobs, i Ymed )
donde Yobs,i representa el valor observado de la variable dependiente para el caso i; Ypre,i representa el valor predicho para el caso i y; Ymed representa el valor medio observado de la variable dependiente para el conjunto de entrenamiento y n es el
76
nmero
de
casos
(compuestos)
que
integran
el
conjunto
de
entrenamiento. SEE est definido por:
SEE =
(Yobs Ypre)
i =1
n d 1
donde d es el nmero de descriptores incluidos en el modelo. En todo anlisis de MLR debe verificarse que: Los residuales estn normalmente distribuidos alrededor de una media de 0; presenten homoscedasticidad (es decir, varianza constante en todo el rango abarcado por los casos) y; deben ser mutuamente independientes. El nmero de variables independientes sea menor que el nmero de observaciones (hiptesis de rango completo). No existe correlacin lineal significativa entre las variables independientes. En general, se pone una cota al coeficiente de correlacin admitido para cualquiera de los pares de descriptores incluidos en el modelo. La cota puede ser, segn el operador, de 0.5 (acorde al criterio ms conservador), 0.7, 0.9 0.95. Se observa que los criterios menos conservadores violan una de las hiptesis del anlisis de regresin lineal, adems de dificultar seriamente la interpretacin del modelo generado. Otra forma de restringir el ingreso de pares de descriptores altamente correlacionados en el modelo permitida por los programas de estadstica disponibles es fijar una cota a la tolerancia definida como 1 - r2, donde r2 es en este caso el coeficiente de determinacin entre una de las
77
ADMINISTRACIN medicamento
DESINTEGRACIN DISGREGACIN DISOLUCIN (la disolucin se tiene en cuenta mediante filtros generales de biodisponibilidad oral)
frmaco ABSORCIN A TRAVS DE BARRERA GI (se considerar mediante filtros generales de biodisponibilidad oral)
S I S T E M A B I O L G I C O
METABOLIZACIN DISTRIBUCIN Toxicidad heptica por uso crnico Generacin de metabolitos activos e inactivos E L I M I N A C I N (se considera indirectamente: el carcter holstico del descriptor 2D permite capturar caractersticas estructurales que no se relacionan slo con la unin al receptor) Unin a protenas plasmticas Distribucin no uniforme en tejidos ABSORCIN A TRAVS DE BARRERA HEMATOENCEFLICA (se considera directamente a travs de modelado QSAR de biodisponibilidad central e indirectamente debido al carcter holstico del descriptor 2D)
Interaccin del frmaco y sus metabolitos con receptores diferentes del blanco molecular deseado a nivel Interaccin del frmaco y sus perifrico (se considera metabolitos con receptores indirectamente mediante diferentes del blanco diseo del conjunto molecular deseado a nivel de entrenamiento) central (se considera indirectamente mediante diseo del conjunto de entrenamiento y directamente mediante modelo QSAR de neurotoxicidad)
Interaccin del frmaco y sus metabolitos activos con el receptor de inters (se considera directamente a travs de modelado QSAR para identificar accin anticonvulsiva)
Fig. 3.4. Esquema de los diferentes procesos que el medicamento y el frmaco atraviesan en el organismo; en azul, se consigna cmo se consideran los diferentes procesos en el presente trabajo.
78
variables independientes del modelo y todas las dems variables independientes. Sin embargo, cabe mencionar que Randic ha demostrado que la inclusin de pares de
variables altamente correlacionadas con signo opuesto puede ser estadsticamente significativa [34,35].
Las ventajas de la MLR son su simplicidad de clculo y la posibilidad de interpretar los resultados obtenidos con relativa facilidad. El principio de parsimonia indica elegir el modelo ms simple entre aquellos que explican adecuadamente la
problemtica estudiada. Los motivos para preferir modelos ms simples son prcticos adems de filosficos: adicionar
variables intiles implica que, para aplicar el modelo se deber calcular el valor de esos descriptores no significativos , con el consabido desperdicio de tiempo y recursos humanos; incluir predictores innecesarios en un modelo usualmente
conduce a decisiones equivocadas (por ejemplo, si se decide incluir, como descriptor, en un modelo QSAR, el nmero de grupos OH y este predictor es en realidad irrelevante, al aplicar el modelo se descartarn o elegirn compuestos segn su nmero de grupos OH, pudiendo sin perder lderes valiosos variables o reteniendo
compuestos
valor);
adicionar
irrelevantes
introduce variacin azarosa ruido- en el modelo; finalmente, cuanto ms simple el modelo mayor su portabilidad. Sin embargo, las razones filosficas tambin son importantes: los modelos ms simples son ms fciles de interpretar y son considerados ms bellos en el sentido de la esttica matemtica y cientfica en general. Por ejemplo, un modelo de un descriptor ser preferible a uno de diez descriptores que posea un desempeo similar. Las tcnicas de seleccin de variables independientes ms utilizadas en conjunto con la MLR son las conocidas como
79
Stepwise Forward y Stepwise Backward. La metodologa Stepwise Forward consiste en llevar a cabo una regresin por cuadrados mnimos por pasos. En cada paso o etapa la variable
independiente del pool de D variables mejor correlacionada con la independiente es incluida en la ecuacin de regresin; en el segundo paso, se adiciona la variable independiente que de entre todas las remanentes produce un incremento mayor en el r2; este proceso contina hasta que la adicin de una nueva variable no contribuye a un aumento estadsticamente significativo del r2. Un test de F parcial puede ser utilizado para corroborar si la inclusin de una variable en un modelo induce un aumento significativo de r2. El estadstico F se define como:
F=
r2 (1 r )
2
(n k 1)
(n d 1) r 2 1- r2 d
donde
se
observa
que
la
significancia
estadstica
aumenta
lgicamente con el nmero de casos y el valor de r2, pero es inversamente proporcional al nmero de descriptores incluidos en el modelo y tiende a 0 cuando d se aproxima a n (esto es, a medida que aumenta el nmero de variables incluidas en el modelo aumenta la probabilidad de correlacin azarosa, es decir, que fortuitamente la varianza de alguna de las variables
independientes remanentes en el pool refleje la varianza an no explicada por el modelo; el hecho de que al ser d igual a n la significancia estadstica se vuelva nula refleja la hiptesis de rango completo de la que parte el anlisis de regresin). Alternativamente, la metodologa Stepwise Backward comienza
incluyendo todas las variables del pool en el modelo y elimina, una a una, variables independientes hasta que la eliminacin de
80
una variable reduce significativamente el r2. Otros mtodos lineales populares adems de MLR son el anlisis de componentes principales (Principal Component Analysis - PCA) y el mtodo de los cuadrados parciales mnimos (Partial Least Squares - PLS). Ambos mtodos son tiles para reducir la dimensionalidad del pool de descriptores cuando el nmero total de descriptores D es mucho mayor que el nmero de casos n (sin realizar una seleccin explcita), seleccionando como variables independientes ciertas combinaciones lineales y ortogonales de los mismos [33,36]. En el caso de PCA esas variables artificiales se denominan
componentes principales, y se obtienen utilizando la covarianza entre los distintos descriptores como criterio de ponderacin, pero sin tener en cuenta la covarianza entre los valores observados de la variable dependiente y los descriptores. En el caso de PLS, las variables artificiales se denominan variables latentes y en este caso s se tiene en cuenta la covarianza entre la variable dependiente y los descriptores para ponderar las distintas variables. En otras palabras, no hay garanta del valor predictivo que tendrn las componentes principales,
mientras que s la hay en el caso de las variables latentes de PLS. Existen otros mtodos no lineales de seleccin de variables y generacin de modelos, entre los que encontramos los algoritmos genticos (Genetic Algorithms - GA) y las redes neuronales (Neural Networks - NN); ambos mtodos han sido inspirados por la naturaleza: en el primero se toma como modelo la teora de la evolucin y la seleccin natural para seleccionar los modelos ms aptos; el segundo se inspira en la capacidad del cerebro animal para procesar informacin de manera no lineal [37]. En el caso de los GA, un conjunto de representaciones abstractas (llamados cromosomas) de una poblacin de posibles soluciones
81
(llamadas individuos) se aparean o recombinan. Los genes de cada cromosoma representan la presencia o ausencia de un variable independiente determinada en la solucin/individuo. Cada N
generaciones (N definido por el operador humano) se evala el desempeo de los modelos que conforman la descendencia,
seleccionndose los ms aptos para nuevas recombinaciones (en algunos casos se utiliza una seleccin estocstica, generando distintos grupos para de la soluciones siguiente segn serie su de aptitud y
seleccionando
recombinaciones
individuos de todos los grupos, pero en mayor proporcin del grupo ms apto). Cada tantas generaciones se suelen introducir, para imitar a la naturaleza, mutaciones (deleciones de genes, inserciones, etc.) y se pueden incluir operadores que produzcan, al azar, la muerte de algn individuo determinado con la extincin del genotipo correspondiente (ver fig. 3.5). En el caso de las llamadas estrategias evolutivas (ES), al contrario
de lo que ocurre con los GA, la frecuencia de mutaciones predomina sobre la de recombinaciones, un grupo y de en lugar de que
seleccionarse
estocsticamente
soluciones
incluye individuos aptos y poco aptos, se tiende a seleccionar slo al individuo ms apto para dar origen a la siguiente generacin de mutantes [38,39].
En
ocasiones
la
interdependencia
entre
un
proceso
biolgico y alguna propiedad derivada de la estructura molecular es no lineal (un ejemplo clsico es cmo suele variar la actividad biolgica segn el coeficiente de particin octanolagua de las molculas). Las redes neuronales tratan de imitar, de forma simplificada, la estructura de las unidades de
procesamiento del cerebro, las cuales, con una velocidad de clculo ciertamente muy inferior a la de las supercomputadoras
82
actuales logran realizar tareas muy complejas, por ejemplo en lo relativo al procesamiento de estmulos visuales y auditivos. Esquemticamente, el cerebro humano est formado por diez mil millones de neuronas interconectadas masivamente (con un
promedio de varios miles de interconexiones por neurona). Cada neurona es una clula especializada que puede propagar una seal elctrica, con una estructura ramificada por la que ingresa la informacin (las dendritas) y otra estructura ramificada por la que la informacin se propaga a otras neuronas (el axn). Cuando la neurona recibe un estmulo por encima de cierto umbral, se
Poblacin inicial generada al azar

Fig. 3.4. Esquema general de una seleccin de variables basada en GA. La reproduccin selectiva implica una seleccin estocstica sesgada hacia los individuos/modelos ms aptos. Las mutaciones incluyen inserciones, deleciones, y cambios de 0 a 1 y viceversa en la representacin binaria de los genes. El proceso puede terminar por diversas causas: haber alcanzado un nmero de generaciones prefijado, encontrar una solucin que se considere aceptable, etc.
Evaluacin de los individuos
Se detiene?
NO Reproduccin selectiva
S Mejores individuos
Recombinacin
Mutacin
activa y enva una seal neuroqumica a otras neuronas, a travs

del axn. El aprendizaje consiste, fundamentalmente, en alterar la fuerza de ciertas conexiones sinpticas, favorecindolas. En sntesis, a partir de un gran nmero de unidades de
procesamiento relativamente sencillas (cada una realizando una suma ponderada de sus estmulos y disparando una seal binaria
83
si la misma supera cierto umbral) el cerebro logra realizar tareas sumamente complejas. Las redes neuronales imitan este proceso: reciben y ponderan y transforman estmulos (input, el valor de las variables independientes) y generan respuestas (output, la prediccin de la categora a la que pertenece una molcula o el valor de una propiedad fisicoqumica determinada de la misma). En la fig. 3.6 se presenta una arquitectura tpica de una red neuronal, consistente en una capa de neuronas de entrada (que no realiza otra operacin ms que distribuir el vector da datos de entrada vector formado por las variables independientes- a la siguiente capa) una capa de neuronas escondida y una capa de de neuronas de salida. Tpicamente, las neuronas de las capas escondida y de salida transforman los datos que proceden de la capa anterior mediante funciones sigmoideas de la forma:
Sigm (datos de entrada ) =
1 1+ e
( datos de entrada)
Fig. 3.6. Ejemplo de una arquitectura de red neuronal, con cinco neuronas en la capa de entrada correspondientes a cinco variables independientes, tres neuronas en la capa escondida y una neurona en la capa de salida.
84
En la red neuronal del ejemplo, la transformacin final que realizara la nica neurona de la capa de salida sera:
f ( x) = Sigm( j Sigm( i , j x i j ) salida )

j =1 i =1
donde j y salida son los valores umbral de cada una de las neuronas de la capa escondida y de la capa de salida,
respectivamente, xi representa a las variables independientes consideradas, i,j son los coeficientes con los que cada neurona de la capa escondida pondera las variables independientes y j representa a los coeficientes con los que la capa de salida pondera la informacin procedente de cada una de las neuronas de la capa escondida. La ventaja de las redes neuronales es, claramente, la
posibilidad de modelar funciones complejas; su desventaja es que para entrenar una red neuronal se requieren, en general, entre cientos y miles de casos, muchos ms de los necesarios para generar un modelo lineal (en el caso de las aplicaciones en Qumica Medicinal el nmero de compuestos activos conocidos es limitado). La capacidad de generar modelos complejos acenta la tendencia a la sobreparametrizacin, es decir, que el modelo memorice las caractersticas del conjunto de entrenamiento pero no tenga capacidad predictiva sobre casos no utilizados en el entrenamiento. Por lo tanto, se suele reservar, adems de un conjunto de prueba, un conjunto de verificacin utilizado para chequear, durante el entrenamiento, que no se est
sobreparametrizando. La necesidad de contar con tres conjuntos de casos independientes y representativos disminuye
considerablemente el nmero de casos disponibles para entrenar la red. Por otro lado, no se trata de un mtodo de seleccin de variables, sino de generacin de modelos, por lo que se debe
85
tener de antemano cierto conocimiento terico o intuitivo sobre cules de entre el conjunto total de variables son las que contribuyen ms a la propiedad biolgica estudiada, o de lo contrario combinar las redes neuronales con mtodos de seleccin de variables como los GA [33,37]. Las consideraciones que deben tenerse en cuenta en la etapa de seleccin de descriptores y generacin del modelo son varias. En primer lugar, se ha demostrado que el uso de un conjunto total de descriptores de D grande incrementa correlaciones ostensiblemente azarosas entre la un
probabilidad
encontrar
subconjunto de descriptores d y la variable dependiente [40]. Cuando el pool de descriptores es grande en comparacin con el nmero de casos deber, por lo tanto, ponerse nfasis en el proceso de validacin del modelo. En nuestro caso se utilizar un pool de descriptores grande, pero el casi nulo pre-
procesamiento de las estructuras y la facilidad de clculo caractersticos de los descriptores 2D facilitan el proceso de validacin, minimizando la probabilidad de correlacin fortuita. Una problemtica extra a tener en cuenta es la cuestin, ya mencionada fugazmente, de la sobreparametrizacin, esto es, la violacin del principio de parsimonia, conocido tambin como la navaja de Occam1: incluir ms parmetros o utilizar modelos ms flexibles de lo necesario (por ejemplo, una ecuacin polinmica o una red neuronal pueden ajustar los valores de los compuestos del conjunto de entrenamiento mediante una relacin curvilnea, no lineal, no slo sin introducir beneficios sino a expensas del desempeo del modelo sobre un conjunto externo). Hawkins ha publicado
1
un
trabajo
detallado
sobre
los
riesgos
de
la
Entia non sunt multiplicanda praeter necestatem. No ha de presumirse la existencia de ms cosas que las absolutamente necesarias. La explicacin ms simple y suficiente es la ms probable, aunque no siempre la verdadera. Con la enunciacin de este principio, el fraile ingls Guillermo de Occam (u Ockham) expresaba, en el siglo XIV, la ruptura entre el pensamiento cientfico y el pensamiento teolgico o mgico.
86
sobreparametrizacin
la
utilidad
de
las
herramientas
de
validacin para salvaguardarse de la misma [41]. Una regla emprica til para resguardarse de la sobreparametrizacin es vigilar que la relacin n/d sea mayor a cinco. 3. Validacin del modelo. El proceso de validacin es una etapa crtica del modelado QSAR. Tiene por objeto la determinacin de la robustez y capacidad predictiva del modelo [42]. La
validacin puede ser interna y/o externa. En el caso de la validacin interna, para se reutiliza el el mismo conjunto de
entrenamiento
validar
modelo
generado
mediante
validacin cruzada y ensayo de aleatorizacin de Fisher. Los procedimientos de validacin cruzada de modelos QSAR por
excelencia son las tcnicas denominadas Leave-One-Out (LOO Dejar uno afuera) y Leave-Group-Out (LGO Dejar un grupo afuera, tambin llamada por algunos autores Leave-Some-Out o Leave-N-Out). Consisten en, una vez generado el modelo, remover grupos de m compuestos del conjunto de entrenamiento, recalcular el modelo con los compuestos remanentes y utilizar el nuevo modelo para predecir la actividad de las estructuras removidas. El caso extremo en el que m es igual a uno constituye la metodologa LOO (dejar uno afuera). Los parmetros que se utilizan para estimar la capacidad predictiva del modelo
mediante esta tcnica son anlogos a los que se describieron en la etapa de generacin del modelo, SEELOO/LGO y r2CV, o ms comnmente, q2:
q2 = 1
(Yobs, i Ypre, i ) (Yobs, i Ymed )

i =1 i =1 n
87
donde
ahora
Ypre,i
corresponde
al
valor
predicho
para
cada
compuesto i cuando es removido del conjunto de entrenamiento. Aunque en general se considera aceptable un valor de q2 mayor a 0.5, se ha demostrado que un valor adecuado de q2 es condicin necesaria pero no suficiente para afirmar la capacidad
predictiva del modelo [43]. El q2 tiende a ser sobreoptimista, en especial en aquellos casos en los que el conjunto de entrenamiento no es estructuralmente diverso (por ejemplo,
cuando est formado por derivados ms o menos similares de un mismo compuesto lder, lo cual no es del todo inusual en el campo de la Qumica Medicinal) [41]. Adicionalmente, dado que al contrario del r2 el q2 no aumenta indefinidamente a medida que se adicionan parmetros al modelo y por el contrario alcanza un mximo, se utiliza en algunos casos (por ej., en PLS) para determinar el nmero ptimo de variables que se incluirn en el modelo. La aleatorizacin de Fisher, destinada a minimizar la
probabilidad de correlacin fortuita entre los descriptores y la variable dependiente, se lleva a cabo mezclando al azar los n valores observados de la variable dependiente entre los n compuestos, regenerando el modelo con la variable dependiente aleatorizada. Este procedimiento se suele repetir n veces. Idealmente, el modelo original ser estadsticamente muy
superior a los modelos aleatorizados. Por ltimo, la validacin externa consiste en predecir el valor de la variable dependiente para un conjunto de compuestos cuya actividad se conoce y que no han sido utilizados para generar el modelo. El principal problema de este proceso es que deben resignarse casos que podran utilizarse en la generacin del modelo para evaluar su predictividad, lo cual no es viable cuando se conocen pocas estructuras con valor experimental
88
conocido de la propiedad biolgica de inters. Las opiniones, respecto a lo conveniente en este punto, estn divididas. Algunos autores afirman (y han realizado algunas demostraciones al respecto) que el uso de un conjunto de prueba es slo admisible cuando se dispone de un conjunto de entrenamiento muy grande (cientos de compuestos) [41]. Aparentemente, apartar un conjunto de prueba cuando no se dispone de cientos de compuestos atentara contra la predictividad del modelo. Hawkins afirma que el conjunto de prueba como herramienta de estimacin de la predictividad es vlido cuando est formado por ms de 20 estructuras, e, idealmente, cincuenta. Sin embargo, otros
autores sugieren que entre un 10 y 20% del total de estructuras disponible es suficiente reconoce a [42], la y la gran mayora como de los etapa
especialistas
validacin
externa
imprescindible [43]. En nuestro caso hemos considerado una situacin intermedia, validando siempre interna y externamente todos los modelos generados durante la tesis y reservando, para la validacin externa, no un nmero fijo de estructuras sino un porcentaje del nmero de compuestos incluidos en el conjunto de entrenamiento, no menor al 30% del mismo. 5. Interpretacin y aplicacin del modelo. La interpretacin se refiere a calcular la contribucin relativa de los descriptores al modelo (esto de de sobre puede hacerse fcilmente comparando los el del
coeficientes coeficiente predictor
regresin regresin la
normalizados, por la
multiplicando estndar la
desviacin estndar de
desviacin
variable
dependiente o, alternativamente, normalizando los predictores en forma previa al anlisis de regresin, sustrayendo la media del predictor y dividiendo por su desviacin estndar; una forma adicional es multiplicar el coeficiente de regresin por el valor promedio del descriptor para el conjunto de
89
entrenamiento y dividir este valor por la sumatoria de los coeficientes por el valor medio de los descriptores asociados). El estudio de la definicin del descriptor orientar acerca del significado fisicoqumico del modelo; en nuestro caso, ya hemos comentado que el carcter abstracto de los descriptores
topolgicos (ver captulo siguiente para ms detalles) complica la interpretacin, aunque intentaremos de todas maneras abordar los significados de los descriptores incluidos en cada modelo. Sin embargo, esta no es una etapa crtica de este trabajo de tesis por cuanto el objetivo principal es la identificacin de nuevos lderes y no el diseo de nuevas estructuras ni la elucidacin de mecanismos moleculares. En la etapa de
aplicacin del modelo deber tenerse presente, sobre todo, el dominio de aplicabilidad del mismo. Desde luego, la
verificacin experimental (mediante ensayos biolgicos en el caso de predecir bioactividades) constituye la prueba
definitiva de la validez del modelo.
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Captulo 2: Desarrollo de nuevos frmacos

Captulo 2. Desarrollo de nuevos frmacos.

Mtodos clsicos y modernos.

l objetivo central de este captulo es realizar una descripcin

clsicos y mtodos modernos.

sistemtico, que Fleming

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interaccin-droga receptor. Otra explicacin de este efecto es que

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Clsicos Modificacin estructural del lder

Mtodos utilizados para el desarrollo de nuevos frmacos

Fig. 3.1 Distintos mtodos utilizados en el desarrollo de frmacos.

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complementarias a las del sitio activo del receptor.

procedimientos de control de reaccin y aislamiento y purificacin de los productos obtenidos.

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molecular con una propiedad fisicoqumica de una serie de compuestos:

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1 = a1 (descriptor electrnico) + a2 (descriptor hidrofbioco) + a3 (descriptor estrico) + a0 C

estrictamente lineal de un conjunto de descriptores. Un ejemplo

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involucraba, predichos (segn y se

indefectiblemente, realizar una o

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Clasificacin de las aproximaciones QSAR

aquellos que indican presencia o frecuencia de un grupo funcional o subestrutura/fragmento determinado en la

descriptores de baja dimensionalidad

de la conformacin y orientacin de la molcula, metodologas 2D QSAR.

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Fundamentos de la metodologa elegida para la presente tesis.

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conformacin y orientacin de la molcula las hace ideales para

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identificar nuevos lderes en grandes bases de datos de diversidad estructural.

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estabilidad, facilidad de dosificacin y de transporte de las formas slidas orales).

Etapas generales de un estudio QSPR/QSAR

En general, un estudio QSAR pueden dividirse en las siguientes etapas:

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(Yobs, i Ypre, i ) (Yobs, i Ymed )

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entrenamiento. SEE est definido por:

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