Manual de Técnicas Básicas para Un Laboratorio de Salud OMS 2º Edición 2003 en Castellano

M A N U A L DE TCNICAS BSICAS
PARA UN LABORATORIO DE SALUD

2 EDICIN
ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD GINEBRA
La Organizacin Mundial de la Salud se fund en 1948 como organismo especializado de las Naciones Unidas que acta como autoridad directiva y coordinadora de los aspectos internacionales de la salud y la salud pblica. Una de las funciones constitucionales de la OMS es la de proporcionar informacin fiable y objetiva y asesoramiento en el campo de la salud humana, la responsabilidad que cumple en parte gracias a su extenso programa de publicaciones. La Organizacin busca a travs de sus publicaciones apoyar las estrategias nacionales de salud y atender los problemas ms acuciantes de salud pblica de las poblaciones de todo el mundo. Para responder a las necesidades de los Estados Miembros en todos los niveles de desarrollo, la OMS publica manuales prcticos guas de referencia y material de capacitacin para determinadas categoras de trabajadores de la salud; las directrices aplicables a escala internacional y las normas, los exmenes y anlisis de polticas, programas e investigaciones sobre salud; y los informes de consenso de vanguardia que ofrecen asesoramiento tcnico y recomendaciones para la toma de decisiones. Estos libros estn estrechamente vinculados a las actividades prioritarias de la Organizacin, que abarca el control y prevencin de enfermedades y el desarrollo de sistemas de salud equitativos basados en la atencin primaria de la salud y la promocin de la salud de los individuos y las comunidades. Avanzar hacia la mejora de la salud para todos exige tambin la difusin mundial y el intercambio de informacin que se basa en el conocimiento y la experiencia de todos los pases miembros de la OMS y la colaboracin de los lderes mundiales en salud pblica y el campo de las ciencias biomdicas. Para asegurar la ms amplia disponibilidad de informacin autorizada y orientacin en materia de salud, que fija la amplia difusin internacional de sus publicaciones y alienta a la traduccin y adaptacin. Al contribuir a la promocin y proteccin de la salud y la prevencin y el control de las enfermedades en todo el mundo, los libros de la OMS favorecen a la consecucin de los objetivos principales de la Organizacin: El logro que todas las personas tengan el mayor nivel posible de salud.
Contents
Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud

Segunda edicin
Organizacin Mundial de la Salud Ginebra 2003
ii
Manual of basic techniques for a health laboratory
OMS Catalogacin por la Biblioteca de Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud. - 2 ed. 1.Tcnicas de laboratorio clnico - Manuales 2.Tecnologa, Mdica - Guas 3.Manuales ISBN 92 4 154530 5 (clasificacin NLM: QY 25)
Organizacin Mundial de la Salud 2003 Todos los derechos reservados. Las publicaciones de la Organizacin Mundial de la Salud pueden obtenerse de Comercializacin y Difusin, Organizacin Mundial de la Salud, 20 Avenue Appia, 1211 Ginebra 27, Suiza (tel.: +41 22 791 2476; fax: +41 22 791 4857; correo electrnico: bookorders@who.int). Las solicitudes de autorizacin para reproducir o traducir las publicaciones de la OMS, ya sea para su venta o distribucin no comercial - deben dirigirse a la Oficina de Publicaciones, a la direccin indicada ms arriba (fax: +41 22 791 4806; e-mail: permissions@who.int ) .Las denominaciones empleadas y la presentacin del material en esta publicacin no implica la expresin de opinin alguna por parte de la Organizacin Mundial de la Salud relativa a la situacin jurdica de ningn pas, territorio, ciudad o zona o de sus autoridades, ni respecto de la delimitacin de sus fronteras o lmites. Las lneas discontinuas representan de manera aproximada fronteras respecto de las cuales puede que no haya pleno acuerdo. La mencin de empresas especficas o de ciertos productos no implica que estn respaldados ni recomendados por la Organizacin Mundial de la Salud con preferencia a otros de naturaleza similar que no se mencionan. Salvo error u omisin, los nombres de los productos patentados se distinguen por una letra inicial mayscula. La Organizacin Mundial de la Salud no garantiza que la informacin contenida en la presente publicacin sea completa y correcta, y no ser responsable de los daos que puedan resultar de su uso.
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PREFACIO. . ........................................................................................................................................................ X 1.INTRODUCCIN. ............................................................................................................................................. 1 1.1 OBJETIVO DE ESTE MANUAL . .............................................................................................................................2 1.2 REACTIVOS Y EQUIPO. ..................................................................................................................................... 2 1.2 .1 Reactivos............................................................................................................................................... 2 1.2.2 Equipo. ................................................................................................................................................... 2 1.3 LA RESPONSABILIDAD DE LOS TRABAJADORES DEL LABORATORIO. .............................................................................2 1.4 UNIDADES DE MEDIDA. ....................................................................................................................................2 1.4.1 Magnitudes y unidades en el laboratorio clnico. .............................................................................. 2 1.4.2 Unidades SI y nombres para las cantidades. ..................................................................................... 2 PARTE 1. ........................................................................................................................................................... 10 2. MONTAJE DE UN LABORATORIO DE SALUD PERIFRICO11 2.1 PLANO DE UN LABORATORIO MDICO PERIFRICO . . ........................................................................................... 11 2.1.1 El laboratorio de una sola habitacin...............................................................................................11 2.1.2 Laboratorio de dos habitaciones. .....................................................................................................12 2.2 ELECTRCIDAD12 2.2.2 Instalacin de un equipamiento elctrico simple................................................................................. 15 2.2.3 Que hacer en caso de falla elctrica. ....................................................................................................17 2.3 Fontanera: procedimientos sencillos. .....................................................................................................20 A. Materiales. ................................................................................................................................................20 B. El grifo de agua. ....................................................................................................................................... 20 C. El sifn del fregadero..21 2.4 Agua para uso del laboratorio. . ............................................................................................................. 23 2.4.1 Agua limpia. . ...................................................................................................................................... 23 2.4.2 Agua destilada. . .................................................................................................................................. 24 2.4.3 Agua desmineralizada. . .......................................................................................................................26 2.4.4 Agua amortiguada. ............................................................................................................................. 28 2.5 Equipamiento. ........................................................................................................................................ 30 2.5.1 Instrumentos de laboratorio esenciales. ............................................................................................. 30 2.5.2 Artculos adicionales. .......................................................................................................................... 30 2.5.3 Equipos y suministros. ......................................................................................................................... 31 2.5.4 Manufactura de utensilios de vidrio. . ..................................................................................................31 2.5.5 Recipientes para muestras. . ............................................................................................................... 40 2.5.6 Almacenamiento, y pedido de suministros. . ....................................................................................... 42 2.6 REGISTRO DE LAS MUESTRAS, REGISTROS DEL LABORATORIO E INFORMES MENSUALES. ............................................ 43 2.6.1 Registro de las muestras. ................................................................................................................ 44 2.6.2 Preparacin del informe mensual.................................................................................................... 44 3 PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO. . ................................................................................... 48 3.1 USO DE UN MICROSCOPIO. ............................................................................................................................ 48 3.1.1 Componentes de un microscopio. .................................................................................................... 48 3.1.2 Configuracin y preparacin del microscopio...................................................................................53 3.1.3 Enfoque del objetivo. . ......................................................................................................................56 3.1.4 Uso de un micrmetro ocular. . ....................................................................................................... 57 3.1.5 Microscopa de campo oscuro. ........................................................................................................ 58 3.1.6 Mantenimiento rutinario. ................................................................................................................58 3.2 PESAJE: EL USO DE BALANZAS DE LABORATORIO. . ............................................................................................. 60 3.2.1 Sensibilidad de la balanza. . ............................................................................................................ 60
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3.2.2 Balanza abierta de dos platillos................................................................................................... 60 3.2.3 Balanza analtica......................................................................................................................... 62 3.2.4 Balanza de dispensario................................................................................................................ 63 3.3 CENTRIFUGACIN................................................................................................................................... 63 3.3.1 Principio...................................................................................................................................... 63 3.3.2 Diferentes tipos de centrfugas.................................................................................................... 64 3.3.3 Instrucciones para usar la centrfuga elctrica............................................................................. 66 3.4 Medicin y dispensacin de lquidos............................................................................................... 67 3.4.1 Pipetas........................................................................................................................................ 68 3.4.2 Matraces volumtricos................................................................................................................ 72 3.4.3 Buretas....................................................................................................................................... 72 3.5 LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN................................................................................................... 74 3.5.1 Limpieza de los utensilios de vidrio y de las jeringas y agujas reutilizables.................................... 74 3.5.2 Limpieza de los recipientes no desechables.................................................................................. 77 3.5.3 Limpieza y mantenimiento de otros equipos de laboratorio......................................................... 78 3.5.4 Desinfectantes............................................................................................................................ 78 3.5.5 Esterilizacin............................................................................................................................... 80 3.6 Eliminacin de residuos de laboratorio........................................................................................... 85 3.6.1 Desecho de muestras y materiales infectados.............................................................................. 85 3.6.2 Incineracin de los materiales de desecho................................................................................... 86 3.6.3 Entierro de los desechos.............................................................................................................. 86 3.7 ENVO DE MUESTRAS A UN LABORATORIO DE REFERENCIA................................................................................ 86 3.7.1 Empaquetado de las muestras para su envo............................................................................... 87 3.7.2 Fijacin y envo de material de biopsias para estudios de histopatologa...................................... 90 3.8 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO................................................................................................................ 92 3.8.1 Precauciones para evitar accidentes............................................................................................ 93 3.8.2 Primeros auxilios en accidentes de laboratorio............................................................................ 93 3.9 GARANTA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO................................................................................................. 95 3.9.1 Recoleccin de la muestra........................................................................................................... 96 PARTE 2...................................................................................................................................................... 93 4. PARASITOLOGA..................................................................................................................................... 98 4.1 INTRODUCCIN...................................................................................................................................... 98 4.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES PARA PARSITOS................................................................................... 99 4.2.1 Coleccin de muestras................................................................................................................. 99 4.2.2 Examen visual............................................................................................................................. 99 4.2.3 El examen microscpico............................................................................................................ 100 4.2.4 Envo de heces para la deteccin de parsitos............................................................................ 102 4.3 PROTOZOOS INTESTINALES...................................................................................................................... 103 4.3.1 Identificacin de formas mviles (trofozotos)............................................................................ 103 4.3.2 Identificacin de los quistes....................................................................................................... 109 4.4 HELMINTOS INTESTINALES...................................................................................................................... 123 4.4.1 Identificacin de los huevos....................................................................................................... 123 4.4.2 Identificacin de los helmintos adultos...................................................................................... 142 4.5 TCNICASPARACONCENTRARLOSPARSITOS.144 4.5.1 Tcnica de flotacin utilizando una solucin de cloruro de sodio (Willis)..................................... 144 4.5.2 Tcnica de sedimentacin formaldehido-ter............................................................................. 147 4.5.3 Tcnica de sedimentacin formaldehido-detergente.................................................................. 152 4.5.4 Tcnica de sedimentacin para las larvas de strongyloides stercoralis (Harada-Mori)................. 154 4.6 PRUEBA QUMICA PARA SANGRE OCULTA EN MATERIA FECAL (SOMF).............................................................. 156 4.6.1 Principio.................................................................................................................................... 156
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4.6.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 156 4.6.3 Mtodo..................................................................................................................................... 156 4.6.4 Resultados................................................................................................................................ 157 4.7 LOS PARSITOS DE LA SANGRE Y DE LA PIEL ................................................................................................. 158 4.7.1 Filariae...................................................................................................................................... 158 4.7.2 Plasmodium spp........................................................................................................................ 171 4.7.3 Trypanosoma spp...................................................................................................................... 189 4.7.4 Leishmania spp......................................................................................................................... 200 5. BACTERIOLOGA.................................................................................................................................... 203 5.1 INTRODUCCIN.................................................................................................................................... 203 5.2 PREPARACIN Y FIJACIN DE LOS FROTIS.................................................................................................... 203 5.2.1 Principio.................................................................................................................................... 203 5.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 203 5.2.3 Preparacin del frotis................................................................................................................ 203 5.2.4 Fijacin de los frotis................................................................................................................... 204 5.3 TCNICAS DE TINCIN............................................................................................................................ 205 5.3.1 Tincin de Gram........................................................................................................................ 205 5.3.2 Tincin con colorante de Albert (para la deteccin de Corynebacterium diphtheriae)................. 208 5.3.3 Tincin con Ziehl-Neelsen (para la deteccin de bacilos cido-alcohol resistentes)...................... 209 5.3.4 Tincin con el colorante de Wayson (para la deteccin de Yersinia pestis).................................. 215 5.3.5 Tincin con azul de metileno de Loeffler (para la deteccin de Bacillus anthracis)....................... 216 5.4 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO Y FROTIS DE GARGANTA................................................................... 217 5.4.1 Materiales y Reactivos.............................................................................................................. 217 5.4.2 Mtodo..................................................................................................................................... 217 5.4.3 Examen microscpico................................................................................................................ 220 5.4.4 Envo de muestras para cultivo.................................................................................................. 220 5.5 EXAMEN DE MUESTRAS UROGENITALES PARA LA GONORREA........................................................................... 221 5.5.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 221 5.5.2 Mtodo..................................................................................................................................... 221 5.5.3 Examen microscpico................................................................................................................ 223 5.5.4 Envo de muestras para cultivo.................................................................................................. 224 5.6 EL EXAMEN DE MUESTRAS GENITALES DE LA SFILIS....................................................................................... 226 5.6.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 226 5.6.2 Mtodo..................................................................................................................................... 226 5.6.3 Examen Microscpico................................................................................................................ 227 5.7 EXAMEN DE MUESTRAS DE SEMEN............................................................................................................ 228 5.7.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 228 5.7.2 Mtodo..................................................................................................................................... 228 5.7.3 El examen macroscpico........................................................................................................... 228 5.7.4 Examen Microscpico............................................................................................................... 228 5.8 EXAMEN DE LA SECRECIN VAGINAL.......................................................................................................... 230 5.8.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 231 5.8.2 Mtodo..................................................................................................................................... 231 5.8.3 Examen microscpico................................................................................................................ 231 5.9 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES ACUOSAS....................................................................................... 231 5.9.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 231 5.9.2 Mtodo..................................................................................................................................... 231 5.9.3 El examen microscpico............................................................................................................ 231 5.9.4 Envo de muestras para cultivo.................................................................................................. 231 5.10 EXAMEN DE ASPIRADOS, EXUDADOS Y DERRAMES....................................................................................... 233
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5.10.1 Materiales y reactivos................................................................................................................. 233 5.10.2 Mtodo...................................................................................................................................... 233 5.10.3 EXAMEN MICROSCPICO................................................................................................................... 233 5.11 EXAMEN DE PUS DE BACILLUS ANTHRACIS................................................................................................ 234 5.11.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 234 5.11.2 Mtodo................................................................................................................................... 234 5.11.3 Examen microscpico.............................................................................................................. 234 5.12 EL EXAMEN DE FROTIS DE PIEL Y RASPADOS NASALES PARA MYCOBACTERIUM LEPRAE......................................... 234 5.12.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 234 5.12.2 Mtodo................................................................................................................................... 234 5.12.3 Examen microscpico.............................................................................................................. 238 6. MICOLOGA...........................................................................................................................................240 6.1 EVALUACIN DE LA PIEL Y EL CABELLO PARA LOS HONGOS.............................................................................. 240 6.1.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 240 6.1.2 Mtodo..................................................................................................................................... 240 6.2 EXAMEN DE PUS PARA MICETOMA............................................................................................................ 241 6.2.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 242 6.2.2 Mtodo..................................................................................................................................... 242 6.3 EXAMEN DE LA PIEL PARA LA PITIRIASIS VERSICOLOR..................................................................................... 243 6.3.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 243 6.3.2 Mtodo..................................................................................................................................... 243 PARTE 3.................................................................................................................................................... 246 7. EXAMEN DE ORINA............................................................................................................................... 247 7.1 RECOGIDA DE MUESTRAS DE ORINA.......................................................................................................... 247 7.1.1 Tipos de muestra de orina......................................................................................................... 247 7.1.2 Preservacin de las muestras de orina....................................................................................... 247 7.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ORINA....................................................................................................... 247 7.2.1 Apariencia................................................................................................................................. 247 7.2.2 Pruebas para la presencia de sangre......................................................................................... 247 7.2.3 Medicin del pH........................................................................................................................ 248 7.2.4 Deteccin de la glucosa............................................................................................................. 249 7.2.5 Deteccin y estimacin de protenas en orina............................................................................ 250 7.2.6 Deteccin de cuerpos cetnicos en orina.................................................................................... 251 7.2.7 Deteccin de elementos anormales........................................................................................... 252 7.2.8 Deteccin de la infeccin producida por Schistosoma haematobium......................................... 263 7.2.9 Deteccin de bacterias en la orina............................................................................................. 265 8. EXAMEN DEL LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)................................................................................. 268 8.1 LAS RAZONES MS COMUNES PARA LA INVESTIGACIN DE LCR....................................................................... 268 8.2 RECOGIDA DE MUESTRAS DE LCR............................................................................................................. 268 8.3 EL EXAMEN DE MUESTRAS DEL LCR.......................................................................................................... 268 8.3.1 Precauciones............................................................................................................................. 268 8.3.2 Examen directo......................................................................................................................... 269 8.3.3 Examen microscpico................................................................................................................ 270 8.3.4 Determinacin de la concentracin de glucosa en el LCR............................................................ 275 8.3.5 Determinacin de la concentracin de protenas en el LCR......................................................... 275 8.3.6 Resumen................................................................................................................................... 277 8.4 ENVO DE LAS MUESTRAS DE LCR PARA CULTIVO ......................................................................................... 277 8.4.1 Materiales y reactivos............................................................................................................... 277
8.4.2 Mtodo del medio de transporte Stuart (para el aislamiento de Neisseria meningitidis)............. 277 9. HEMATOLOGA..................................................................................................................................... 285 9.1 TIPOS DE CLULAS SANGUNEAS ............................................................................................................... 285 9.1.1 Eritrocitos................................................................................................................................. 285 9.1.2 Leucocitos................................................................................................................................. 285 9.1.3 Trombocitos.............................................................................................................................. 285 9.2 RECOGIDA DE MUESTRAS DE SANGRE........................................................................................................ 286 9.2.1 Principio.................................................................................................................................... 286 9.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 286 9.2.3 Mtodo..................................................................................................................................... 288 9.3 ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DE HEMOGLOBINA................................................................................ 293 9.3.1 Mtodo fotomtrico de la Cianmetahemoglobina...................................................................... 293 9.3.2 mtodo de hematina alcalina D................................................................................................. 296 9.4 ESTIMACIN DE LA FRACCIN DE VOLUMEN DE ERITROCITOS.......................................................................... 298 9.4.1 Mtodo de la Microescala......................................................................................................... 299 9.4.2 Mtodo de la Macroescala........................................................................................................ 304 9.5 ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DEL NMERO DE ERITROCITOS................................................................. 305 9.6 ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DEL NMERO DE LEUCOCITOS.................................................................. 310 9.6.1 Principio.................................................................................................................................... 310 9.6.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 310 9.6.3 Mtodo..................................................................................................................................... 310 9.6.4 Resultados................................................................................................................................ 313 9.7 MEDICIN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN DE LOS ERITROCITOS (VSE).................................................... 315 9.7.1 Principio.................................................................................................................................... 315 9.7.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 315 9.7.3 Mtodo..................................................................................................................................... 315 9.7.4 Resultados................................................................................................................................ 316 9.8 MEDICIN DEL TIEMPO DE SANGRADO: MTODO DE DUKE............................................................................ 318 9.8.1 Principio.................................................................................................................................... 318 9.8.2 Materiales y reactivos............................................................................................................... 318 9.8.3 Mtodo..................................................................................................................................... 319 9.8.4 Resultados................................................................................................................................ 319 9.9 OBSERVACIN DE LA RETRACCIN DEL COGULO Y LA MEDICIN DEL TIEMPO DE LISIS.......................................... 320 9.9.1 Principio.................................................................................................................................... 320 9.9.2 Materiales................................................................................................................................ 320 9.9.3 Mtodo..................................................................................................................................... 320 9.9.4 Resultados................................................................................................................................ 320 9.10 PREPARACIN Y TINCIN DE EXTENSIONES SANGUNEAS FINAS....................................................................... 323 9.10.1 Principio.................................................................................................................................. 323 9.10.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 323 9.10.3 Mtodo................................................................................................................................... 326 9.10.4 Examen microscpico.............................................................................................................. 331 9.11 PRUEBA DE LA ANEMIA DE CLULAS FALCIFORMES...................................................................................... 343 9.11.1 Principio.................................................................................................................................. 343 9.11.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 343 9.11.3 Mtodo................................................................................................................................... 343 9.11.4 Examen microscpico.............................................................................................................. 344 9.12 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN / FRACCIN DEL NMERO DE RETICULOCITOS....................................... 345 9.12.1 Principio.................................................................................................................................. 345 9.12.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 345
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9.12.3 Mtodo................................................................................................................................... 345 9.12.4 Examen microscpico.............................................................................................................. 345 9.13 DETERMINACIN DE LA FRACCIN NMERO DE TIPO DE LEUCOCITOS.............................................................. 347 9.13.1 Principio.................................................................................................................................. 347 9.13.2 Materiales............................................................................................................................... 347 9.13.3 Examen microscpico.............................................................................................................. 347 9.14 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DEL NMERO DE TROMBOCITOS....................................................... 349 9.14.1 Materiales............................................................................................................................... 349 9.14.2 Examen Microscpico.............................................................................................................. 349 10. QUMICA SANGUNEA..355 10.1 VALORACIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA EN SANGRE: MTODO DE LA O-TOLUIDINA1............................. 355 10.1.1 Principio.................................................................................................................................. 355 10.1.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 355 10.1.3 Mtodo................................................................................................................................... 356 10.1.4 Resultados.............................................................................................................................. 358 10.2 ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DE UREA EN LA SANGRE: MTODO DE LA DIACETIL MONOXIMA /TIOSEMICARBACIDA ............................................................................................................................................................. 359 10.2.1 Principio.................................................................................................................................. 359 10.2.2 Materiales y reactivos............................................................................................................. 359 10.2.3 Mtodo................................................................................................................................... 359 10.2.4 Resultados.............................................................................................................................. 360 11. TCNICAS INMUNOLGICAS Y SEROLGICAS..................................................................................... 368 11.1 INTRODUCCIN A LA INMUNOLOGA........................................................................................................ 368 11.1.1 Anticuerpos............................................................................................................................. 368 11.1.2 Antgenos................................................................................................................................ 369 11.1.3 Interacciones antgeno-anticuerpo.......................................................................................... 369 11.2 PRINCIPIO DE LAS TCNICAS INMUNOQUMICAS......................................................................................... 369 11.2.1 Ensayos de unin primaria....................................................................................................... 370 11.2.2 Ensayos de unin secundaria................................................................................................... 372 11.3 DETERMINACIN DE LOS FACTORES REUMATOIDES MEDIANTE LA TCNICA DE AGLUTINACIN DE LTEX................... 375 11.3.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 375 11.3.2 Mtodo................................................................................................................................... 375 11.4 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI-ESTREPTOLISINA O.................................................. 375 11.4. 1 Prueba para la Anti-estreptolisina O (ASO, AELO).................................................................... 375 11.4.2 Aglutinacin en ltex............................................................................................................... 377 11.5 DETERMINACIN DE -GONADOTROFINA CORINICA HUMANA (-HCG) EN LA ORINA CON LA TCNICA DE INHIBICIN DE LA AGLUTINACIN...................................................................................................................................... 377 11.5.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 377 11.5.2 Mtodo................................................................................................................................... 377 11.6 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IGA, IGG E IGM POR INMUNODIFUSIN RADIAL........................ 377 11.6.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 377 11.6.2 Mtodo................................................................................................................................... 378 11.7 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIH............................................................ 378 11.7.1 ELISA....................................................................................................................................... 378 11.7.2 Tira reactiva............................................................................................................................ 379 11.8 PRUEBAS PARA LA INFECCIN POR VIRUS DE LA HEPATITIS ............................................................................ 381 11.8.1 ELISA para el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg).................................................. 381 11.8.2 Tira reactiva para el antgeno de superficie de la hepatitis B.................................................... 381 11.9 TIRA REACTIVA PARA P. FALCIPARUM...................................................................................................... 382 11.9.1 Materiales y reactivos............................................................................................................. 382
VII
11.9.2 Mtodo................................................................................................................................... 383 11.10 PRUEBAS PARA LA INFECCIN POR SFILIS............................................................................................... 384 11.10.1 Prueba RPR........................................................................................................................... 385 11.10.2 Prueba TPHA......................................................................................................................... 386 ANEXO: REACTIVOS Y SU PREPARACIN................................................................................................... 425
Manual of basic techniques for a health laboratory
Prefacio
Este libro es una edicin revisada del Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud (OMS, 1980), revisiones importantes que se han llevado a cabo por el Dr. K. Engbaek, el Dr. C. C. Heuck y el Sr. A. H. Moody. La revisin es necesaria debido a nuevos procedimientos y tecnologa que se han desarrollado desde la edicin anterior y que han demostrado ser tiles para los pequeos laboratorios de pases en desarrollo. Los procedimientos han sido incluidos en las secciones correspondientes del manual, y algunos procedimientos obsoletos se han sustituido por tcnicas actualizadas. El objetivo original del manual no ha cambiado. Se destina principalmente a la utilizacin de personal de laboratorio en los pases en desarrollo durante su formacin y, posteriormente, en sus trabajos. En la seleccin de tcnicas, se ha prestado especial atencin al bajo costo, fiabilidad y sencillez de los mtodos y a la disponibilidad de recursos en pequeos laboratorios. La OMS expresa su agradecimiento a todos aquellos que han ayudado en la revisin de este manual.
Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud
OMS
1. Introduccin
1.1 OBJETIVO DE ESTE MANUAL

ste manual est destinado principalmente a los laboratorios mdicos en los pases en desarrollo. Est diseado especialmente para su uso en los laboratorios perifricos en tales pases (es decir, en laboratorios pequeos o de tamao medio adjuntos o conectados a los hospitales regionales) y en los dispensarios y centros de salud rurales donde el tcnico de laboratorio1 a menudo tiene que trabajar solo. Se ha procurado utilizar el lenguaje ms sencillo posible. Sin embargo, cuando ha sido necesario, se han empleado trminos tcnicos de uso comn. El manual describe procedimientos de examen que pueden ser realizados con un microscopio u otro aparato sencillo. Tales procedimientos incluyen los siguientes: - El examen de las heces fecales para la bsqueda de parsitos intestinales (examen microscpico para buscar huevos de helmintos parsitos nematelmintos, platelmintos-, quistes y trofozotos de protozoos parsitos); - El examen de sangre para la bsqueda de parsitos del paludismo; - El examen de esputo para la bsqueda de los bacilos de la tuberculosis; - El examen de pigmentos biliares en la orina; - El examen de sangre para la determinacin de los glbulos blancos (leucocitos) tipo, nmero, fraccin (recuento diferencial leucocitario) (tambin conocido como Frmula Leucocitaria); - El examen de sangre para la determinacin de la concentracin de glucosa. - Envo de heces fecales a laboratorios especializados para detectar vibriones del clera. La intencin es la de proporcionar un determinado nmero de tcnicas bsicas de laboratorio que son tiles para los laboratorios perifricos y que pueden llevarse a cabo con una limitada gama de equipo bsico. Algunos laboratorios pueden no ser capaces de realizar todos los procedimientos descritos. Por ejemplo, un laboratorio de un centro de salud rural no puede ser capaz de llevar a cabo determinadas pruebas de qumica sangunea o pruebas serolgicas.
1.2 REACTIVOS Y EQUIPO 1.2 .1 REACTIVOS A Cada reactivo se le ha asignado un nmero. Los reactivos necesarios y sus nmeros se indican en la descripcin de cada tcnica. Una lista alfabtica de todos los reactivos utilizados, con los nmeros asignados a ellos, su composicin y los mtodos de preparacin y los requisitos de almacenamiento aparece en el anexo al final del manual. Por ejemplo, uno de los reactivos necesarios para la tincin de Gram es el cristal violeta, modificado por Hucker (reactivo no. 18). La composicin del cristal violeta y el mtodo de preparacin de ste aparecen en la lista por orden alfabtico de los reactivos (vase el anexo). 1.2.2 EQUIPO Los elementos necesarios para cada tcnica se enumeran al principio de la seccin correspondiente. Una lista de los aparatos necesarios para equipar un laboratorio capaz de llevar a cabo todos los exmenes descritos en este manual se puede encontrar en la seccin 2.5. Cuando algunos de los artculos no estn disponibles, el tcnico debe encontrar un sustituto adecuado; por ejemplo, los recipientes o frascos vacos que contenan antibiticos para la inyeccin por va parenteral ("frascos de penicilina"), asimismo, pueden ser guardados los recipientes de otras drogas; soportes para tubos de ensayo (gradillas) y los portaobjetos pueden hacerse o construirse en el mismo lugar; tambin las latas vacas se pueden utilizar para hacer baos mara. 1.3 LA RESPONSABILIDAD DE LOS TRABAJADORES DEL LABORATORIO Los trabajadores del laboratorio realizan exmenes de laboratorio para proporcionar informacin al personal clnico con el fin de beneficiar a los pacientes. Por lo tanto, desempean un importante papel ayudando a que los enfermos mejoren. Al mismo tiempo, en el curso de su trabajo, ellos ganan y obtienen mucha informacin sobre los pacientes y sus enfermedades. Los trabajadores del laboratorio, como el personal clnico, deben considerar esta informacin como estrictamente confidencial; y solamente el personal clnico que solicita los exmenes debe recibir los informes sobre ellos. Cuando los pacientes solicitan informacin sobre los resultados de las pruebas se les debe decir que pidan o pregunten acerca de los resultados al personal clnico. En la mayora de los pases del mundo existen rigurosas normas morales y profesionales de conducta entre los mdicos y el personal capacitado de laboratorio. Todos los trabajadores del laboratorio que manipulan materiales clnicos debern ceirse a esas normas. 1.4 UNIDADES DE MEDIDA En el laboratorio usted trabajar frecuentemente con magnitudes y unidades de medicin, y es importante que se comprenda la diferencia que hay entre ambas. Se denomina magnitud toda propiedad fsica mensurable. Tmese nota que la palabra "magnitud posee dos significados: el cientfico que se acaba de indicar y el de uso comn, o sea "cantidad". En el terreno cientfico, altura, longitud, velocidad, temperatura y corriente elctrica son magnitudes y se miden en unidades. 1.4.1 MAGNITUDES Y UNIDADES EN EL LABORATORIO CLNICO Una gran parte de su trabajo en el laboratorio consistir en hacer mediciones de magnitudes y utilizar unidades para comunicar los resultados de tales mediciones. Puesto que la salud y an la vida del paciente pueden depender del cuidado con que usted efecte las mediciones y de la forma en que comunique los resultados, usted deber conocer cabalmente: a) las magnitudes que mida; b) los nombres que se dan a esas magnitudes, y c) las unidades que se emplean para medirlas. 1.4.2 UNIDADES SI Y NOMBRES PARA LAS CANTIDADES Un conjunto simple y estandarizado de unidades de medida ha sido el objetivo de los cientficos durante casi dos siglos. El sistema mtrico decimal fue introducido en 1901. Desde entonces, este sistema se ha ido ampliando, y en 1960 se le dio el nombre de "Systme International d'Units" (Sistema Internacional de Unidades) y la abreviatura internacional "SI".
1
Laboratorista, tambin un Bioqumico Clnico; NDT.
Las unidades de medida que forman parte de este sistema se denominan "Unidades SI". Estas unidades se han utilizado de manera creciente en las ciencias, especialmente la qumica y la fsica, desde 1901 (mucho antes de que ellas fueran llamadas unidades SI), pero la mayora de ellas se introdujeron en la medicina slo despus de 1960. Para acompaar la introduccin de las unidades del SI, los especialistas en ciencias mdicas prepararon una lista sistemtica de los nombres para las magnitudes. Algunos de estos nombres eran los mismos que los tradicionales, en otros casos, sin embargo, los nombres tradicionales eran inexactos, engaosos o ambiguos, y se introdujeron nuevos nombres para reemplazarlos. Este manual utiliza las unidades del SI y los nombres actualmente aceptados para magnitudes. Sin embargo, puesto que las unidades tradicionales y los nombres tradicionales para cantidades todava se utilizan en algunos laboratorios, estos tambin estn incluidos, y la relacin entre los dos es explicada. En la seccin siguiente se describen brevemente las unidades SI y la nueva nomenclatura de las magnitudes segn se usan en este manual. UNIDADES SI USADAS EN ESTE MANUAL Todas las unidades del SI se basan en siete unidades bsicas del SI. Slo cuatro de ellas se utilizan en este manual, que se indican en la Tabla 1.1. Tabla 1.1 Unidades SI bsicas utilizadas en este manual Cantidad Nombre de la Unidad Smbolo Longitud metro m Masa kilogramo kg Tiempo segundo s Cantidad de sustancia mol mol Las primeras tres de estas unidades sern familiares para usted, aunque los nombres de cantidad denominados "masa" y "cantidad de sustancia" y el nombre de la unidad "mol" pueden necesitar una explicacin. Masa es el trmino correcto para lo que comnmente se llama "peso". (Hay un sentido tcnico del trmino "peso": es una medida de la fuerza con la que la gravedad de la Tierra atrae a una dada masa. La Masa, por otra parte, es independiente de la atraccin gravitacional de la Tierra, los dos trminos son confundidos en el uso cotidiano; adems, se habla de la medicin de una masa como "pesar o pesaje". "Cantidad de sustancia" y su unidad, mol, son trminos importantes en medicina y afectarn su trabajo en el laboratorio ms que cualquier otras cantidades o unidades SI. Cuando dos o ms sustancias qumicas reaccionan entre s, no lo hacen en relacin con su masa. Por ejemplo: Bicarbonato de Sodio + cido Clorhdrico Cloruro de Sodio + Dixido de Carbono + Agua En esta reaccin 1 kg (1 kilogramo) de Bicarbonato de Sodio no reacciona con 1 kg de cido Clorhdrico; de hecho, 1 mol de Bicarbonato de Sodio reacciona con 1 mol de cido Clorhdrico. Cuando las sustancias qumicas interactan, lo hacen en relacin a su masa molecular relativa (el nuevo nombre para lo que sola ser llamado "peso molecular"). El uso del mol, que se basa en la masa molecular relativa, por lo tanto, da una medida de cantidades equivalentes de dos o ms sustancias diferentes (el uso de unidades de masa no lo hace). La mayora de las unidades SI son llamadas unidades derivadas del SI o unidades SI derivadas. Estas se obtienen mediante la combinacin de las unidades SI bsicas (por multiplicacin o divisin) segn sea apropiado. Mediante esta denominacin se hace referencia a las unidades utilizadas para expresar magnitudes fsicas que son resultado de combinar magnitudes fsicas bsicas. No se debe confundir este concepto con los de mltiplos y submltiplos, que se utilizan tanto en las unidades bsicas como en las derivadas, sino que siempre se le ha de relacionar con las magnitudes expresadas. Si stas son longitud, masa, tiempo, intensidad de corriente elctrica, temperatura, cantidad de substancia o intensidad luminosa, se trata de una magnitud bsica. Todas las dems son derivadas. Algunas unidades comunes derivadas del SI se muestran en la Tabla 1.2. Tabla 1.2 Unidades SI derivadas utilizadas en este manual Cantidad Nombre de la Unidad Smbolo rea metro cuadrado m2 Volumen metro cbico m3 Velocidad metro por segundo m/s o ms-1 La unidad de rea es metro x metro = metro cuadrado; la unidad de volumen es metro x metro x metro = metro cbico; y la unidad de velocidad es metro dividido en segundo = metro por segundo. Todas las unidades SI derivadas se obtienen de esta manera simple. En algunos casos, sin embargo, es necesario multiplicar y dividir varias veces, y la expresin resultante llega a ser muy engorrosa, por ejemplo, la unidad de presin es kilogramo dividido en (metro x segundo x segundo.) Para evitar esta dificultad, a estas unidades se les da nombres especiales. Por ejemplo, la unidad de presin es llamada Pascal. Si las unidades SI bsicas y las unidades derivadas fueran las nicas disponibles, las mediciones seran difciles de llevar a cabo debido a que estas unidades son demasiado grandes o demasiado pequeas para muchos propsitos. Por ejemplo, el metro es demasiado grande y poco conveniente para la medicin del dimetro de un glbulo rojo (eritrocito). Para superar esta dificultad, el SI incorpora una serie de prefijos, llamado prefijos SI, que cuando se aaden al nombre de una unidad se multiplica o divide esa unidad por un determinado factor, dando mltiplos o submltiplos decimales de la unidad. Los prefijos del SI utilizados en este manual se muestran en la Tabla 1.3. Tabla 1.3 Prefijos SI Factor Prefijo Smbolo mega M Multiplicado por 1000000 o 1 milln ( 106) kilo k Multiplicado por 1000 ( 103) Dividido por 100 (x 0,01 o 10-2) centi c Dividido por 1000 (x 0,001 o 10-3) mili m Dividido por 1000000 (x 0,000001 o 10-6) micro -9 Dividido por 1000 millones (x 0,000 000 001 o 10 ) nano n Por ejemplo, a 1 kilmetro (1 km) = 1000 metros (1000 m); 1 centmetro (1 cm) = 0,01 metros (0,01 m o 10-2m); 1 milmetro (1 mm) = 0,001 metros (0,001 m o 10-3 m), y 1 micrmetro (1 m) = 0,000 001 metros (0,000 001 m o 10-6 m). Estos prefijos tienen el mismo significado cuando se aplican a cualquier otra unidad.
NOMBRES PARA MAGNITUDES UTILIZADOS EN ESTE MANUAL Algunos nombres para las magnitudes fueron introducidas para acompaar el cambio a unidades del SI. La mayora de estos nombres se utilizan para describir concentracin y cantidades afines. AGREGADO: TABLA DE MLTIPLOS Y SUBMLTIPLOS El separador decimal debe estar alineado con los dgitos, mediante una coma (,), salvo en textos en ingls, en los cuales se emplea punto (.). No se ha de usar otro signo entre los nmeros. Para facilitar la lectura, los guarismos pueden agruparse en grupos de tres, de derecha a izquierda, sin utilizar comas, ni puntos, en los espacios entre grupos. Ejemplo: 123 456 789 987 546. Para este efecto, en algunos pases se acostumbra separar los miles con un punto. (Ejemplo: 123.456.789.987.546). Esta notacin es desaconsejable y ajena a la normativa establecida en el Sistema Internacional de Unidades.13 En escritos referentes a fechas se exceptan las cifras relativas a aos: 2012 en vez de 2 012. Artculo principal: Prefijos del Sistema Internacional. Smbol Equivalencia decimal en los Prefijos del Sistema 1000n 10n Prefijo Escala corta Escala larga Asignacin o Internacional 10008 10007 10006 10005 10004 10003 10002 10001 10002/3 10001/3 10000 1024 1021 1018 1015 1012 109 106 103 102 101 100 yotta zetta exa peta tera giga mega kilo hecto deca ninguno deci centi mili micro nano pico femto d c m n p f Y Z E P T G M k h da Septilln Sextilln Quintilln Cuatrilln Trilln Billn Cuatrilln Mil trillones Trilln Mil billones Billn Mil millones / Millardo Milln Mil / Millar Cien / Centena Diez / Decena Uno / Unidad Dcimo Centsimo Milsimo Millonsimo Billonsimo Trillonsimo Cuatrillonsi mo Quintillonsi mo Sextillonsim o Septillonsim o Milmillonsimo Billonsimo Milbillonsimo 1 000 000 000 000 000 000 000 000 1 000 000 000 000 000 000 000 1 000 000 000 000 000 000 1 000 000 000 000 000 1 000 000 000 000 1 000 000 000 1 000 000 1 000 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,000 001 0,000 000 001 0,000 000 000 001 0,000 000 000 000 001 1795 1795 1795 1960 1960 1960 1964 1991 1991 1975 1975 1960 1960 1960 1795 1795 1795
10001/3 101 10002/3 102 10001 10002 10003 103 106 109
10004 1012 10005 1015
10006 1018
atto
Trillonsimo
0,000 000 000 000 000 001
1964
10007 1021
zepto
Miltrillonsimo
0,000 000 000 000 000 000 001
1991
10008 1024
yocto
Cuatrillonsimo
0,000 000 000 000 000 000 000 001
1991
PREFIJOS DEL SISTEMA INTERNACIONAL Los prefijos del SI para nombrar a los mltiplos y submltiplos de cualquier unidad del Sistema Internacional (SI), ya sean unidades bsicas o derivadas. Estos prefijos se anteponen al nombre de la unidad para indicar el mltiplo o submltiplo decimal de la misma; del mismo modo, los smbolos de los prefijos se anteponen a los smbolos de las unidades. Los prefijos pertenecientes al SI los fija oficialmente la Oficina Internacional de Pesos y Medidas (Bureau International des Poids et Mesures), de acuerdo con el cuadro siguiente: Ejemplos: 7 cm = 7 10-2 m = 7 0,01 m = 0,07 m
3 MW = 3 106 W = 3 1 000 000 W = 3 000 000 W Estos prefijos no son exclusivos del SI. Muchos de ellos, as como la propia idea de emplearlos, son anteriores al establecimiento del Sistema Internacional en 1960; por lo tanto, se emplean a menudo en unidades que no pertenecen al SI. REFERENCIAS
13 Bureau International des Poids et Mesures. Resolution 10 of the 22 nd meeting of the CGPM (2003) (en ingls). Consultado el 2 de marzo de 2009. The International System of Units (SI) (8 edicin). International Bureau of Weights and Measures (BIPM). 2006. p. 133. NIST Guide to SI Units Rules and Style Conventions . National Institute of Standards and Technology (July 2008). Consultado el 29 de diciembre de 2009. Centro Espaol de Metrologa. http://www2.cem.es:8081/cem/es_ES/documentacion/generales/SIU8edes.pdf Consultado el 15 de mayo de 2011.
MBITO DE LA QUMICA CLNICA: Consideraciones importantes a tener en cuenta en el rea de la qumica clnica: En el nombre cantidad de sustancia, las palabras de sustancia podran reemplazarse por otras palabras que especificasen la sustancia o materia en cuestin para cada aplicacin particular; as por ejemplo se podra decir cantidad de cido clorhdrico, ClH o cantidad de benceno, C6H6. Es importante precisar la entidad en cuestin (como recomienda el segundo prrafo de la definicin del mol), preferentemente indicando la frmula qumica emprica del material en cuestin. Aunque la palabra cantidad tiene una definicin ms general en el diccionario, dicha abreviatura del nombre completo cantidad de sustancia se usa a veces por brevedad. Ello se aplica tambin a las magnitudes derivadas como la concentracin de cantidad de sustancia, que puede denominarse simplemente concentracin de cantidad. Sin embargo, en el campo de la qumica clnica, el nombre concentracin de cantidad de sustancia se abrevia generalmente como CONCENTRACIN DE SUSTANCIA.
Fuente: Extracto del Centro Espaol de Metrologa. http://www2.cem.es:8081/cem/es_ES/documentacion/generales/SIU8edes.pdf Consultado el 15 de mayo de 2011.
UNIDADES PARA LA MEDICIN DE LA CONCENTRACIN Ya se seal que para acompaar al cambio a unidades SI se introdujeron algunos nuevos nombres de magnitudes. No son muchos; nombres como longitud, altura, rea, volumen y velocidad siguen siendo los mismos. La mayora de la nueva nomenclatura se refiere a la concentracin y otras magnitudes relacionadas con ella. En relacin con la concentracin, existe la dificultad de que se puede expresar de varias maneras distintas. Por lo comn, todas se englobaban en el trmino "concentracin" lo que daba origen a confusiones, En la actualidad, cada manera diferente de decirla posee un nombre particular. Antes de describir los nuevos nombres es muy conveniente explicar acerca de la unidad de volumen llamada "litro", Lo ms probable es que ya la conozca y le haya extraado no encontrarla en la relacin de las unidades SI derivadas. Esto obedece a que el litro, en rigor, no es una unidad SI. La unidad SI (derivada) de volumen es el metro cbico, excesivamente grande para que convenga a la medicin de los lquidos del organismo. Por esta razn se emplea un submltiplo: el decmetro cbico. Puesto que no se emplea en este manual, el prefijo "deci" no se incluy en el cuadro correspondiente; indica una divisin entre 10 (o una multiplicacin por 0,1, 10-1). Por lo tanto, un decmetro es 0,1 m, y un decmetro cbico es 0,1 x 0,1 x 0,1 m3 = 0,001 m3 ( 10-3 m3; es decir, la milsima parte de un metro cbico). Aunque no forma parte del SI, la palabra "litro" se ha aceptado para utilizarla como nombre especial del decmetro cbico. El litro y sus submltiplos, como el mililitro (ml), se emplean para medir volmenes relativamente pequeos de lquidos y, algunas veces, gases; por lo general, los volmenes de cuerpos slidos y los grandes volmenes de gases y lquidos se miden en metros cbicos o en uno de sus mltiplos o submltiplos. El litro es una unidad sumamente importante, ya que se emplea en el laboratorio clnico para notificar todas las concentraciones y magnitudes conexas. Sin embargo, es posible que usted encuentre (por ejemplo, en los artculos de vidrio marcados con escalas de medicin material de vidrio graduado-) volmenes que se indican en submltiplos del metro cbico. Los submltiplos equivalentes del metro cbico y del litro se recogen en la Tabla 1.4. En sta tabla figura un cuadro de equivalencias de los dos sistemas. Tabla 1.4 Unidades SI Derivadas para el Volumen Submltiplos equivalentes del metro cbico y el litro Nombre de Smbolo Equivalente Nombre de Smbolo Equivalente Equivalente la Unidad en metros la Unidad en litros (l) en mililitros cbicos (m3) (ml) 3 Decmetro dm 0,001 litro l 1 1000 cbico -------100 cm3 0,0001 decilitro* dl 0,1 100 ------10 cm3 0,000 01 Centilitro* cl 0,01 10 3 Centmetro cm 0,000 001 mililitro ml 0,001 1 cbico Milmetro mm3 0,000 000 microlitro l 0,000 001 0,001 cbico 001 *Rara vez se utiliza en el laboratorio Despus de estas explicaciones acerca del litro podemos volver a los nombres que se aplican a las distintas maneras de expresar la concentracin. En primer lugar suponga que tenemos una solucin salina. La masa de sal disuelta, dividida entre el volumen de la solucin, recibe el nombre de concentracin de masa. Se suele definir sta como "la masa de un componente dado (por ejemplo, una sustancia disuelta) dividida entre el volumen de la solucin". La unidad con que se
mide es el gramo (o miligramo, microgramo, etc.) por litro. En el sistema SI es raro que se emplee la concentracin de masa; se aplica nicamente a sustancias cuya masa molecular relativa ("peso molecular") es dudosa, como en el caso de las protenas cuya masa molecular relativa es incierta. Suponga ahora que tenemos otra solucin salina, pero esta vez la cantidad de sal disuelta se expresa como "cantidad de sustancia". La cantidad de sustancia salina (o sea el nmero de moles de sal) contenido en la solucin y dividida entre el volumen de esta se denomina concentracin de cantidad de sustancia o, ms brevemente, concentracin de sustancia. Se acostumbra definirla como "la cantidad de sustancia de un componente determinado (por ejemplo, una sustancia disuelta) dividida entre el volumen de la solucin". La unidad con que se mide es el mol (o milimol, micromol, etc.) por litro. Cuando se utilizan unidades SI todas las concentraciones se expresan, siempre que es posible, como concentracin de sustancia. El uso de concentracin de sustancia en lugar de concentracin de masa es la diferencia ms importante entre el empleo de las unidades SI y las unidades tradicionales. En el sistema tradicional, concentracin de masa se usaba de modo casi exclusivo (si bien no se denominaba "concentracin de masa", que es un nombre relativamente nuevo). Sin embargo, en el sistema tradicional no siempre se expresaba la concentracin de masa "por litro". Algunas veces se utilizaba esta expresin, y otras, "por 100 ml" (es decir, por 100 mililitros, 1/10 de litro) o "por mililitro". Pases distintos (y an laboratorios distintos, en el mismo pas) adoptaban prcticas diferentes, creando serias confusiones. Con las partculas o entidades que no se disuelven no es posible usar la concentracin de masa ni la concentracin de sustancia; se debe emplear otra magnitud. Por ejemplo, el torrente sanguneo contiene varias clases de clulas. Todas se encuentran suspendidas en la sangre y es necesario disponer de una manera de expresar el nmero de clulas que hay en cada litro de sangre. En este caso el nombre de la magnitud es concentracin de nmero, y se define como "el nmero de partculas o entidades especificadas en una mezcla, dividido entre el volumen de sta". La unidad con que se mide la concentracin de nmero es el nmero por litro. En el sistema tradicional la concentracin de nmero se denominaba "recuento" y se expresaba mediante la unidad conocida como "nmero por milmetro cbico". Algunas veces la magnitud que interesa no es el nmero real de clulas por litro (concentracin de nmero), sino la proporcin de un tipo determinado de ellas, o sea la fraccin del nmero total formada por las clulas de ese tipo, Esta magnitud se denomina fraccin de nmero y la unidad con que se mide es 1 (unidad, "uno"). A primera vista esto puede parecer relativamente confuso, pero en verdad es muy sencillo. La unidad, que es el nmero "uno", es el todo; 0,5 es la mitad, 0,2 la quinta parte, 0,25 la cuarta parte, 0,1 la dcima parte y as sucesivamente. Por ejemplo, en la sangre hay cinco tipos de leucocitos (glbulos blancos). Sus respectivas fracciones de nmero podran ser 0,45, 0,35, 0,10, 0,08 y 0,02. (Si usted suma estas fracciones observar que el resultado es 1,0, es decir, el todo.) En el sistema tradicional esta magnitud careca de nombre y los resultados se expresaban como porcentajes y no como fracciones. Por ejemplo, una fraccin de nmero de 0,5 era 50% y una de 0,08 era 8%. Usted advertir en esto que el porcentaje dividido entre 100 corresponde a la fraccin de nmero. Otra magnitud que se mide por la unidad "uno" es la fraccin de volumen. Se define como el volumen de un componente especifico en una mezcla, dividido entre el volumen total de sta. En otras palabras, si todo el volumen que ocupan los eritrocitos (glbulos rojos) en 1 litro (1000 ml) de sangre es 450 ml, la fraccin de volumen de los eritrocitos ser 450/1000 = 0,45. La fraccin de volumen de los eritrocitos es importante para el diagnstico de numerosas enfermedades y usted habr de medirla frecuentemente en el laboratorio. Por esta explicacin se deber de percatar que la fraccin de nmero es "nmero por un nmero" y la fraccin de volumen es "volumen por un volumen"; es decir que ambas son proporciones. Por conveniencia se dice que la unidad que expresa una proporcin es "uno". En las pginas siguientes se muestra un cuadro de nombres de magnitudes nuevos y tradicionales, y de unidades SI y tradicionales, con factores de conversin de unas a otras. (Tabla 1.5). Tabla 1.5 nueva Nomenclatura de Magnitudes, Unidades SI, equivalentes tradicionales y Factores de Conversin Nomenclatura Nueva nomenclatura de Unidades Factores de conversin y Unidades SI tradicional de magnitudes tradicionales ejemplos*a magnitudes Sin factor de conversin: Concentracin de nmero de nmero de eritrocitos 12 3 no. x 10 /l Recuento de eritrocitos millones/mm eritrocitos (vase seccin 9.5) 4,5 millones/mm3 = 4,5 x 1012/l; 5,0 x 1012/l = 5,0 millones/mm3 Volumen de sedimentacin globular Volumen de 38% x 0,01 = Fraccin de volumen Fraccin de volumen de 1 sedimentacin globular % de eritrocitos = 0,38; eritrocitos (vase seccin 9.4) o hematocrito Fraccin de volumen de eritrocitos = 0,40 x 100 = 40% Concentracin de nmero de Recuento de leucocitos 8000/mm3 x 0,001 = 8,0 x 109/l; leucocitos (sangre) (vase no. x 109/l no./mm3 (sangre) 7,5 x109/l x 1000 = 7500/mm3 seccin 9.6) Concentracin de nmero de Sin factor de conversin: Recuento de leucocitos leucocitos (LCR) (vase no. x 106/l no./mm3 27/mm3 = 27 x 106/l; (LCR) seccin 8.3.3) 25 x 106/l = 25/mm3 Fraccin de nmero del tipo Linfocitos 33% x 0,01 = fraccin de de leucocitos (sangre y LCR) Recuento diferencial de nmero de linfocitos 0,33 (p. ej., fraccin de nmero de 1 leucocitos (p. ej., % Fraccin de nmero de linfocitos linfocitos) (vanse secciones linfocitos) 0,33 x 100 = linfocitos 33% 9.13 y 8.3.3) Concentracin de nmero de Recuento de 86000/mm3 x 0,001 = 86,0 x 109/l; reticulocitos (vase seccin no. x 109/l no./mm3 reticulocitos 91,5 x 109/l x 1000 = 91500/mm3 9.12) 0,50% x10 = 5 x 10-3; Fraccin de nmero de 12 x 10-3 x 0,1 = 1,2%; Recuento de reticulocitosb (vase seccin no. x 10-3 % reticulocitos 9.12) 5 = 5 x 10-3 12 x 10-3 = 12 9 3 Concentracin de nmero de no. x 10 /l Recuento de no./mm 220000/mm3 x 0,001 = 220 x 109/l;
trombocitos (plaquetas) (vase seccin 9.14) Glucosa, concentracin de sustancia (sangre y LCR) (vase seccin 9.14) Hemoglobina (Fe), concentracin de sustancia (vase seccin 9.3) Hemoglobina, concentracin de masa (vase seccin 9.3) Hemoglobina (Fe) media en eritrocitos, concentracin de sustancia (vase seccin 9.4) Hemoglobina media en eritrocitos, concentracin de masa (vase seccin 9.4) Protenas, concentracin de masa LCR) (vase seccin 8.3.5) Urea, concentracin de sustancia (sangre) (vase seccin 10.2) mmol/l
trombocitos o recuento de plaquetas Glucosa, concentracin de masac (sangre y LCR)
250 x 109/l x 1000 = 250000/mm3 81 mg/100ml x 0,0555 = 4,5 mmol/l; 4,2 mmol/l x 18,02 = 75,7 mg/100ml Hb 13,7 g/100ml x 0,621 = Hb (Fe) 8,5 mmol/l; Hb (Fe) 9mmol/l x 1,61 = Hb 14,5 g/100ml 14,8 g/100 ml x 10 = 148 g/l; 139 g/l x 0,1 = 13,9 g/100ml 35% x 0,621 = 21,7 mmol/l; 22 mmol/l x 1,611 = 35,4% 35% x 10 = 350 g/l 298 g/l x 0,1 = 29,8% 25 mg/100ml x 0,01 =0,25 g/l; 0,31 g/l x 100 =31 mg/100ml Sin cambio 15 mg/100 ml x 0,167 = 2,5 mmol/l; 2.9 mmol/l x 6,01 = 17,4 mg/100ml Nitrgeno de urea, 7 mg/100ml x 0,357 = urea 2,5 mmol/l
mg/100ml
mmol/l
hemoglobina, concentracin de masac hemoglobina, concentracin de masac Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media (v.g., concentracin de masa)d Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media (v.g., concentracin de masa) Protenas, concentracin de masac Urea, concentracin de masac Nitrgeno de ureae, concentracin de masa
g/100ml
g/l
g/100ml
mmol/l
%e
g/l
%e mg/100ml g/l mg/100ml mg/100ml
g/l
mmol/l
LCR: Lquido Cefalorraqudeo *a En estos ejemplos se indica primeramente la conversin de valores numricos reales, en unidades tradicionales, a valores en unidades SI, y seguidamente la conversin de unidades SI a unidades tradicionales. Los factores de conversin se han subrayado. b En este caso la fraccin de nmero no se anota como fraccin de 1, sino de 1000, a fin de evitar valores numricos demasiado pequeos e inconvenientes. c Se acostumbraba medir efectivamente la concentracin de masa, aunque por lo general no se empleaba esta denominacin. d La concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM) se expresaba algunas veces como fraccin decimal en vez de porcentaje; por ejemplo, 0,35 en lugar de 35%. En este caso cada uno de los factores de conversin anotados se debe multiplicar por 100 o dividir entre 100, como se indica en los ejemplos siguientes: 0,35 x 62,1 =21,7 mmol/l 22 mmol/l x 0,01611 = 0,354 0,35 x 1000 =350 g/l 298 g/l x 0,001 =0,298 e En el sistema tradicional unas veces se haca referencia a la urea como tal y otras como nitrgeno de urea (es decir, el contenido de nitrgeno de la urea). En el cuadro se incluye una conversin de ambos sistemas.
-----------------------------------------------------------------------------AGREGADO: LITRO
El litro (smbolo l o L) es una unidad de volumen equivalente a un decmetro cbico (1000 cm). Su uso es aceptado en el Sistema Internacional de Unidades (SI), aunque ya no pertenece estrictamente a l. Fue adoptado por la Oficina Internacional de Pesos y Medidas en 1879. En 1901 fue descrito como el volumen ocupado por una masa de 1 kg de agua pura en su mxima densidad y a presin normal (a 4 C y 1 atm respectivamente). Esta definicin fue derogada en 1964 porque el litro difera del decmetro cbico en aproximadamente 28 partes por milln, induciendo a error en las mediciones que requieren bastante precisin. Actualmente slo es usado como un nombre especial del decmetro cbico. Es la nica unidad que posee doble smbolo reconocido (l o L). El smbolo original es "l", debido a que los smbolos de las unidades se escriben en minscula (excepto aquellas que provienen de nombre propio). No obstante, en el ao 1979 se adopt el smbolo alternativo "L" para disminuir el riesgo de confusin entre la letra l y el nmero 1 en ciertas tipografas. Antes de 1979 se usaba que todava est presente en el uso, aunque no en la norma. PREFIJOS DEL SI APLICADOS AL LITRO El litro puede ser usado con cualquier prefijo del SI. El ms frecuentemente usado es el mililitro, definido como la milsima parte del litro (un centmetro cbico). Otras unidades pueden verse en la tabla, las ms frecuentes en negrilla. Mltiplos del Sistema Internacional para litro (l) Submltiplos Mltiplos Valor Smbolo Nombre Valor Smbolo Nombre 101 l dl decilitro 101 l dal decalitro 2 2 10 l cl centilitro 10 l hl hectolitro mililitro o centmetro 103 l ml 103 l kl kilolitro o metro cbico cbico 106 l l microlitro 106 l Ml megalitro 9 9 10 l nl nanolitro 10 l Gl gigalitro 1012 l pl picolitro 1012 l Tl teralitro 15 15 10 l fl femtolitro 10 l Pl petalitro 18 18 10 l al attolitro 10 l El exalitro 21 21 10 l zl zeptolitro 10 l Zl zettalitro 1024 l yl yoctolitro 1024 l Yl yottalitro Prefijos comunes de unidades estn en negrita.
REFERENCIAS Non-SI units accepted for use with the SI by the CIPM http://physics.nist.gov/Pubs/SP811/sec05.html#table6 ------------------------------------------------------------------------------
OMS
PARTE 1
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2. MONTAJ E DE UN LABORATORIO DE SALU D PERIF RICO 2.1 PLANO DE UN LABORATORIO MDICO PERIFRICO
2.1.1 EL LABORATORIO DE UNA SOLA HABITACIN
a figura 2.1 presenta la posible distribucin del espacio de un laboratorio mdico perifrico anexo a un centro de salud. Se muestra un laboratorio adecuado para llevar a cabo todas o algunas de las tcnicas descritas en el manual. El plano se limita a una habitacin, ya que, con frecuencia, ste es todo el espacio que est disponible para el laboratorio. La habitacin deber medir, por lo menos, 5 m x 6m. La figura 2.2 Indica otra posible distribucin para la instalacin de un laboratorio perifrico. Es obvio que puede ser modificado para adaptarse a las diferentes circunstancias.
Figura 2.1 Plano para un laboratorio de una sola habitacin. En esta imagen aparecen las distintas reas con sus respectivos nombres en ingls provenientes de la versin inglesa del manual de la OMS. Explicacin en castellano de cada una de las reas: A) Sala de espera; 1) Asientos para los pacientes ubicados en la sala de espera; 2) rea de registro de los datos; 3) Autoclave; 4) rea para el lavado de los utensilios de vidrio del laboratorio; 5) Recibo de las muestras; 6) Cubo de basura; 7) Fregaderos; 8) rea para la realizacin de los exmenes de las muestras de orina; 9) rea para la realizacin de los exmenes de las muestras de materia fecal; 10) Microscopio (rea destinada para la observacin microscpica); 11) Ventana; 12) Frigorfico; 13) rea destinada para la extraccin de las muestras de sangre; 14) rea destinada para las tinciones; 15) Armario. (A los fregaderos se los denomina tambin "Bachas en Hispanoamrica, trmino que no aparece en el DRAE); Al frigorfico tambin se lo denomina refrigerador, nevera o heladera en los pases hispanoamericanos. La ventana es esencial para la luz y el aireamiento, la luz cuando en el laboratorio trabajan con un microscopio ptico sin lmpara de luz elctrica incorporada (con espejo). Las flechas sealan el trayecto por donde los pacientes ingresarn y se dirigirn hacia el lugar en donde se practica la flebotoma. DRAE: Diccionario de la Real Academia Espaola.
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Figura 2.2 Plan alternativo para un laboratorio de una sola habitacin. A) Asientos para los pacientes. 1) Mesa para los pacientes externos ambulatorios; 2) Centrfuga manual; 3) Microscopios; 4) rea de hematologa; 5) Colormetro; 6) Bao mara; 7) centrfuga elctrica; 8) rea de serologa de la sfilis y bioqumica; 9) Frigorfico para reactivos; 10) Estante para los reactivos 11) Estante para los utensilios de vidrio; 12) Balanza; 13) Cubeta para tinciones; 14) rea para el examen de las muestras de esputo; 15) Mechero Bunsen; 16) Fregaderos; 17) Vertedero de desechos; 18) Cama para los pacientes; 19) rea de registro de los datos; 20) rea para la preparacin de las muestras de materia fecal para su posterior examen; 21) rea para la preparacin de las muestras de orina para su posterior examen; 22) rea de recepcin de las muestras; 23) Cilindro de gas. (En la figura, el cilindro de gas se muestra conectado al mechero Bunsen). La cama para los pacientes en algunos lugares puede ser usada para eventuales donadores de sangre. Con respecto al cilindro de gas, el recipiente contenedor llamado cilindro tambin es denominado garrafa o bombona (Arg., Bol. y Ur.) la cual designa a una "vasija metlica muy resistente, de forma cilndrica o acampanada y cierre hermtico. Sirve para contener gases a presin y lquidos que, por ser muy voltiles, originan grandes presiones si se impide la salida del vapor (DRAE). Colormetro: En la actualidad, varios lugares ya cuentan con espectrofotmetros capaces de leer en el espectro visible y el ultravioleta, aunque a veces, an persiste el uso de los fotocolormetros. 2.1.2 LABORATORIO DE DOS HABITACIONES En algunos lugares alejados tambin se realizan transfusiones sanguneas en un laboratorio, es decir, el espacio fsico del laboratorio es aprovechado en estos casos cuando no hay otro lugar al cual recurrir. Si se cuenta con dos habitaciones se recomienda que el servicio de transfusin sangunea se organice en la segunda habitacin. En otros lugares, el paciente a ser transfundido es derivado hacia un centro de mayor complejidad para realizarle la transfusin, por ende, no se realiza en el laboratorio perifrico. Si no existe este servicio de transfusin, y si ste laboratorio cuenta con dos habitaciones, y si stas dos habitaciones estn disponibles, se recomienda que la segunda se use para el lavado y la esterilizacin. Los materiales sucios y/o contaminados se debern eliminar del lugar de trabajo del laboratorio con toda la rapidez posible con el fin de proteger la salud de los operadores, esto es, para su seguridad, y asimismo, evitar confusiones (errores) o contaminaciones cruzadas. 2.2 ELECTRICIDAD Un suministro de energa fiable debe estar disponible para asegurar la continuidad de los trabajos en el laboratorio. La energa puede ser proporcionada por las siguientes fuentes: -Red elctrica -Grupos electrgenos -Sistema de suministro de energa solar (energa lumnica). Los laboratorios ubicados en lugares remotos a menudo tienen problemas a la hora de asegurar un suministro continuo
de energa elctrica y pueden generar electricidad mediante el uso de un generador local (grupo electrgeno) o un 13 sistema de suministro de energa solar (vase ilustracin anexa A). 2.2.1 FUENTES DE ELECTRICIDAD GENERADORES La energa elctrica puede ser proporcionada por un generador que funcione con combustible (grupo electrgeno a gasolina, keroseno, gas propano/butano.) Es posible utilizar el motor de combustin del motor de un automvil o un sistema generador de electricidad diseado exclusivamente para ello (construido expresamente para generar energa elctrica, como los grupos electrgenos.) Un generador de electricidad construido exclusivamente para producir electricidad produce una corriente alterna de 110 voltios (V) o 220 V y normalmente puede generar ms energa que el motor de un vehculo. El motor de un vehculo proporciona una corriente continua de 12 V o 24 V, que puede ser introducida o inyectada en las bateras recargables (vase ms adelante). El tipo de corriente disponible limitar la seleccin de equipos de laboratorio, por ejemplo, un instrumento que requiere corriente continua puede ser alimentado con energa a partir de: -Bateras -Una red de corriente continua con un transformador -Una red de corriente alterna con un convertidor. La instalacin de una red de corriente continua es simple, de funcionamiento fiable y seguro de utilizar. Sin embargo, para los instrumentos que requieren una baja tensin (6 V, 12 V o 24 V) de corriente continua, la alta tensin producida por la red de corriente continua debe ser convertida por medio de un transformador. Alternativamente, para los instrumentos que requieren corriente alterna (110 V, 220 V o 240V), la corriente continua debe ser convertida en corriente alterna por medio de un inversor u ondulador. Los inversores u onduladores son pesados y caros y se producen prdidas significativas de energa en el proceso de conversin. Por tanto, es preferible utilizar cualquiera de los aparatos de corriente continua o alterna, dependiendo de su oferta y suministro, y evitar la necesidad de la conversin. Si no hay ningn generador disponible o si una fuente de alimentacin de red elctrica est accesible, pero la corriente elctrica suministrada por esta red flucta o es propensa a las averas frecuentes, puede ser preferible escoger un suministro de energa solar (vase ms adelante). SISTEMAS DE SUMINISTRO DE ENERGA SOLAR (SISTEMAS FOTOVOLTAICOS) Un laboratorio que cuenta con unos pocos instrumentos con bajos requerimientos de energa puede funcionar con un pequeo suministro de energa. Para los laboratorios ubicados en reas remotas, un sistema de abastecimiento de energa solar puede ser ms conveniente que un generador, puesto que no hay problemas de abastecimiento de combustible y puede ser fcil de mantener. Un sistema de suministro de energa solar tiene tres componentes: - Un panel solar (o varios paneles solares) - Un regulador de carga electrnico - Bateras. PANELES SOLARES Dos tipos diferentes de paneles solares estn disponibles comercialmente: -Paneles con clulas de silicio cristalino -Paneles con clulas de silicio amorfo. Los paneles de silicio amorfo son menos costosos, pero producen energa solar con menos eficiencia que los paneles de silicio cristalino. Los paneles solares deben ser instalados de tal manera que estn expuestos a la luz directa, ya que ubicados en un lugar con sombra reducen la eficiencia de la produccin de energa. Deben ser inclinados con un ngulo de 15. La parte inferior del panel debe estar libremente ventilada. La distancia mnima de la parte inferior del panel a partir de la superficie de la construccin de soporte debe ser mayor a 5 cm para evitar el calentamiento del panel, porque este calentamiento reduce la eficacia de la produccin de energa. REGULADORES DE CARGA ELECTRNICOS Un regulador de carga controla la carga y descarga de las bateras de forma automtica. Cuando el voltaje de la batera cae por debajo de un valor umbral durante la descarga, el instrumento de laboratorio se desconecta de la batera. Por otra parte, si el voltaje aumenta por encima de un valor umbral (por ejemplo, cuando la batera se recarga), el panel solar se desconecta de la batera. Un buen regulador de carga adapta la tensin mxima de la batera para el cambio en la temperatura del medio ambiente. Esto evita la prdida de agua de la batera por evaporacin. Es importante tener un regulador de carga de repuesto en stock en caso de avera. El regulador de carga elegido debera ser estable en condiciones tropicales. Es aconsejable elegir un regulador de carga con una pantalla digital integrada que permite que la carga de la batera sea monitorizada fcilmente.
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5 Ilustracin anexa A. Grupos electrgenos porttiles. 1) Grupo electrgeno a gas; 2) Grupo electrgeno a gasolina. Paneles solares. 3) Una instalacin de 24 paneles solares en una zona rural de Mongolia; 4) Un panel solar o mdulo fotovoltaico est compuesto de clulas fotovoltaicas individuales. Este panel de silicio cristalino tiene un marco de aluminio y vidrio en la parte delantera; 5) Diagrama esquemtico que explica el uso de la energa solar la cual es captada por un panel solar que la transforma en energa elctrica; la electricidad generada es usada para diversos fines como se aprecia en la ilustracin. BATERAS BATERAS DE PLOMO Los sistemas de energa solar requieren bateras recargables, que pueden ser o bien de plomo o de nquelcadmio (Ni-Cd). Las bateras de plomo son las preferidas y muchos tipos estn disponibles comercialmente (vase la Tabla 2.1). Las bateras de alta eficiencia tienen ventajas prcticas, aunque son ms caras que las bateras normales. Al adquirir bateras, elija bateras de 12 V con la ms alta capacidad (1000 amperios-hora (Ah)). Existen varios tipos de bateras de plomo libres de mantenimiento que estn disponibles comercialmente, pero son caras y menos eficientes que las que requieren mantenimiento. El desarrollo de este tipo de batera todava est en marcha, pero no ha sido probado a fondo en los climas tropicales. Por lo tanto, las bateras libres de mantenimiento no se recomiendan. TRANSPORTE DE BATERAS DE PLOMO Las bateras de plomo deben ser vaciadas antes de ser transportadas. Es importante recordar que si las bateras de plomo se van a transportar por aire deben estar vacas de solucin de electrolitos, que debe ser reemplazado cuando lleguen al destino. Tabla 2.1 Especificaciones de las bateras usadas para el suministro de energa solar Tipo de batera Especificacin NquelCadmio Lquido 100% 20% Plomo- calcio antimonio (2%) Lquido 80% 20% Plomo-calcio antimonio (6%) Lquido 80% 20% Plomo-calcio Lquido 50% 20%
Tipo de electrolito Mximo de descarga Descarga durante el funcionamiento normal
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Tensin / celda Tasa de Auto-descarga Rellenado requerido Costos de capital Aptitud para el uso fotovoltaico
1,2 V Elevada Mnimo Alto Altamente recomendada
2V Baja Infrecuente De valor medio Altamente recomendada
2V Media Frecuente De valor medio Recomendada
2V Baja Infrecuente Bajo No recomendada
MANTENIMIENTO DE LAS BATERAS DE PLOMO La descarga diaria de las bateras de plomo no debe exceder del 20% de la capacidad de las bateras, de lo contrario la vida til de las bateras (normalmente de unos 1100 ciclos de recarga), se acortar. Si las bateras se descargan repetidamente a 40% de su capacidad, tendrn una duracin de slo alrededor de 600 ciclos. (Hay disponibles algunas bateras especiales de plomo que pueden ser descargadas en un 40%, pero tendrn una duracin de alrededor de 3000 ciclos de recarga.) Para el mantenimiento del nivel de fluido deben ser revisadas peridicamente y cuando sea necesario rellenarlas con agua destilada de la que se utiliza para las bateras de automvil. Las bateras de alta eficiencia no pueden ser reemplazadas por las bateras de automvil normales en caso de una avera. Cuando slo estn disponibles bateras de automvil para reemplazar una batera de alta eficiencia defectuosa, todas las bateras en el sistema de almacenamiento de energa deben ser reemplazadas con bateras de vehculo. BATERAS DE NQUEL - CADMIO (Ni-Cd) Las bateras de Ni-Cd pueden recargarse mediante un panel solar. Algunas bateras de Ni-Cd son del mismo tamao, pero tienen diferentes capacidades. El tamao de batera AA de Ni-Cd est disponible con una capacidad de 0,5 Ah hasta 0,7 Ah. Elija las bateras con mayor capacidad. En cuanto a las bateras pequeas de Ni-Cd, tipo AAA hasta la D, para su uso en instrumentos de laboratorio, se deben recargar con antelacin para permitir la operacin continua en un laboratorio. La vida til de las bateras de Ni-Cd puede ser de 1000 ciclos de recarga, en funcin de su calidad. MANTENIMIENTO DE LAS BATERAS DE Ni-Cd Las bateras de Ni-Cd parecen funcionar de forma poco fiable en los pases tropicales. Esta aparente falta de fiabilidad es causada por un aumento de la frecuencia de descarga en lugar de una recarga ineficiente de la batera a temperaturas ambiente elevadas (ver ms abajo). Tales problemas pueden superarse parcialmente como sigue: La batera de Ni-Cd debe recargarse a una temperatura ambiente baja (por ejemplo, en el frigorfico o en una caja especialmente construida para la recarga) poco antes de ser utilizada. (Por ejemplo, slo el 62% de la energa puede estar disponible a partir de una batera de Ni-Cd que se carg a 40 C) Las bateras de Ni-Cd recargadas se deben almacenar en un lugar fresco y seco para reducir al mnimo la tasa de autodescarga. (Por ejemplo, una batera de Ni-Cd almacenada durante 2 semanas a 40 C tendr una capacidad residual de slo 32%.) La alta humedad tambin acelerar la auto-descarga de la batera. 2.2.2 INSTALACIN DE UN EQUIPAMIENTO ELCTRICO SIMPLE Si el laboratorio tiene un suministro de electricidad, de los siguientes equipos se pueden utilizar: -Una lmpara elctrica para el microscopio (una iluminacin estable hace que el ajuste sea ms fcil); -Centrifuga elctrica (mucho ms rpida que la del tipo de accionamiento manual o centrfuga manual); -Una centrfuga de microhematocrito (para la deteccin de la anemia); -Un espectrofotmetro o colormetro (permite la estimacin exacta de la hemoglobina); -Un bao mara, un frigorfico, un esterilizador elctrico, etc. Puede que tenga que realizar conexiones simples o reparaciones a este equipamiento en el laboratorio. Las explicaciones dadas a continuacin estn destinadas a ayudar al tcnico de laboratorio para hacer esto y se limitan a los pasos a seguir en cada caso. Las personas sin experiencia deben comenzar por la realizacin de los procedimientos en presencia de un instructor. El contador de corriente elctrica (Fig. 2.3) Un medidor mide la electricidad y registra la cantidad de electricidad utilizada. Indica: -La tensin, medida en voltios (220 V, 110 V, etc.); -La fuerza de la corriente, medida en amperios (A); -La frecuencia de la corriente alterna, por ejemplo 50 Hertz (Hz) (ciclos por segundo). Algunos tipos de medidores tienen interruptores o botones: - Un interruptor que gira el cual puede ser girado en un sentido para cortar el suministro de electricidad a todo el edificio (fusible principal de la red elctrica) y girado en el otro sentido para restaurar el suministro; - Un botn rotulado "OFF" (apagado) que se puede presionar para cortar el suministro de electricidad; - Un botn rotulado "ON" (encendido) que se puede presionar para restablecer el suministro elctrico. El interruptor de giro u botn "OFF" tambin acta como un interruptor de circuito, automticamente corta la corriente cuando el circuito est sobrecargado. Cuando esto sucede, en primer lugar se debe encontrar y corregir la falla que caus el corte, y a continuacin, pulse el botn "ON" o active el interruptor para restablecer la corriente.
INSTALACIN DE EQUIPAMIENTO ELCTRICO NUEVO
VOLTAJE Compruebe que la tensin indicada en el instrumento es la misma que la de su suministro de electricidad. El instrumento tiene una etiqueta que indica la tensin con la que debe ser utilizado. El voltaje de la corriente elctrica est marcado en el medidor de electricidad. EQUIPO DE DOBLE VOLTAJE Los instrumentos de doble voltaje se pueden usar con dos fuentes de voltaje diferentes. Hay un dispositivo en el instrumento que le permite seleccionar el voltaje adecuado, es decir, el voltaje marcado en el contador de corriente elctrica. Dependiendo del instrumento, este dispositivo puede ser: -Una palanca o interruptor que puede ser movido a la posicin de 110 V o a la posicin de 220 V (Fig. 2,4 (a)); -Un enchufe sin cables que se puede transferir desde la posicin 110 V a la posicin 220 V (Fig. 2,4 (b)); -Un tornillo que se puede girar a la posicin de 110 V o a la posicin de 220 V (Fig. 2,4 (c)).
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Figura 2.3 Un contador o medidor de corriente elctrica
Figura 2.4 Instrumentos de doble voltaje
LA POTENCIA ELCTRICA DEL INSTRUMENTO La energa elctrica se mide en vatios (W) y est marcado en la placa que indica la tensin correcta para su instrumento. Cada pieza del equipo elctrico en el laboratorio utiliza una cierta cantidad de energa. La potencia total utilizada en un momento dado no debe exceder la potencia de la fuente de electricidad. Usted puede calcular la cantidad de energa disponible a partir de las cifras que aparecen en el medidor: multiplicar el voltaje (V) por la corriente (A). Por ejemplo, si el voltaje es de 220 V y la corriente es 30 A, la energa elctrica suministrada ser 220 x 30 = 6.600 vatios o 6,6 kW. (kW= kilovatios.) USO DE UN TRANSFORMADOR Si un instrumento se ha construido para emplearlo con una tensin diferente a la del circuito del laboratorio, ste instrumento se deber usar con un transformador. Por ejemplo, si una centrfuga adquirida slo funciona a 110 V y la tensin de la corriente elctrica es de 220 V, pida un transformador de 110-220 V, indicando la potencia de la centrfuga. Conecte la centrfuga en la conexin de 110 V del transformador suministrado, a continuacin, conecte el cable de 220 V del transformador a la red elctrica de laboratorio (toma de pared). APAGADO DE LOS EQUIPOS ELCTRICOS Una vez que se ha apagado un instrumento elctrico se debe desenchufar del contacto de pared. Si se deja enchufado puede causar un incendio.
1 2 Imgenes de transformadores. 1) Transformador Elevador De Tensin 100 W Entrada 110 V Salida 220 V con botn; 2) Transformador 110 V- 220 V, otro modelo; 3) Ilustracin de un transformador de 110 V a 220 V, donde por un extremo se enchufa el aparato que funciona con 110 V y por el otro se enchufa el cable del transformador a una toma de pared (220 V). Ambos voltajes estn indicados en la figura. 3
17 2.2.3 QUE HACER EN CASO DE FALLA ELCTRICA Si uno de los instrumentos elctricos deja de funcionar, examnense: Los fusibles El enchufe que se encuentra en el extremo del cable El cable El contacto de pared La tensin del instrumento y la de la fuente de electricidad. ANTES DE HACER ALGO, CORTE LA CORRIENTE: Oprimiendo el botn del interruptor que indica "OFF (apagado) en el medidor de electricidad o jalando la palanquita del interruptor hacia OFF en otros modelos, o bien, Quitando el fusible del suministro de corriente (Figura 2.5) HERRAMIENTAS TILES (Figura 2.6) Destornillador Pinzas para cortar cable o alambre Alicates de picos chatos o piramidales Alambre para fusible Piezas de repuesto: enchufes, interruptores, etc.
Figura 2.5 Figura 2.6 Figura 2.5 Quitar el fusible de red Figura 2.6 Herramientas para el trabajo elctrico CAMBIO DE FUSIBLE Levntese la tapa de la caja del fusible. Si el fusible es de tornillos, el alambre se encontrar extendido entre dos de ellos. Si el alambre se ha roto o fundido la corriente elctrica no podr pasar; el fusible se ha quemado. Afljense los dos tornillos (Fig. 2.7). Qutese el alambre averiado. Sustituya el alambre averiado con alambre nuevo para fusible, del mismo calibre (grosor), o ms delgado si no se consigue alambre del mismo grosor. Monte el alambre dndole forma de "S", con una vuelta en cada extremo. Si el fusible es de tornillos, el alambre deber pasar debajo de las pequeas arandelas protectoras. Si el fusible es de dos clavijas, mntese el alambre en la base de stas y apritense las clavijas con alicates (Fig. 2.8). Despus de arreglar el fusible revsese todo el circuito antes de conectar nuevamente la corriente elctrica. EL ENCHUFE COMPROBACIN DEL ENCHUFE Desmonte el enchufe que se encuentra en el extremo del cable si sospecha que de ah proviene la falla. Existen muchos tipos diferentes de enchufes. Algunos tienen un tornillo externo que se puede aflojar. ENCHUFE DE DOS CLAVIJAS (Figura 2.9) Dentro del enchufe las dos lneas del cable se montan en las terminales (T) de las clavijas (C). Compruebe que los tornillos de las terminales estn suficientemente apretados. A veces esto es todo lo que se necesita hacer para arreglar un enchufe. INSTALACIN DE UN NUEVO ENCHUFE Para montar un nuevo enchufe, seprese 1 - 1,5 cm del material aislante de cada uno de los dos cordones que componen el cable. Para lograrlo raspe con una navaja, aunque con el debido cuidado de no averiar los alambres que se encuentran dentro de las envolturas de material aislante. (Tambin, en lugar de una navaja se puede usar un cter o un pelacables.) Tuerza el extremo de cada alambre desprovisto de su envoltura aislante, formando en cada uno un cabo compacto que entre sin dificultad en la terminal correspondiente con el tornillo aflojado. (Fig. 2.10.) Introduzca cada extremo expuesto de los alambres en la respectiva terminal del enchufe. Apriete los tornillos y coloque las terminales en su sitio (Fig. 2.11). Los tornillos en las terminales debern retener los alambres con firmeza; compruebe si estn bien fijados tirando de los alambres suavemente. ENCHUFE DE TRES CLAVIJAS (Figura 2.12) Dos de las clavijas de estos enchufes se conectan a la corriente elctrica; una es "viva y la otra "neutral. La tercera, que generalmente se encuentra en medio, se conecta a la "tierra. Es sumamente importante que cada uno de los tres alambres del cable se conecte a la clavija apropiada y habitualmente con el enchufe vienen instrucciones que se deben cumplir estrictamente. A la menor duda, consltese un electricista. El alambre de tierra del cable est envuelto en material aislante de color verde o verde y amarillo (T). Proporciona un escape a la corriente elctrica en caso que haya un aislamiento defectuoso, evitando que pase por el cuerpo humano.
VERIFICACIN DEL CABLE Y DEL INTERRUPTOR
EL CABLE (CONDUCTOR ELCTRICO PRINCIPAL) Si el cable se quema o se rompe, ste debe ser reemplazado. En todo caso, pdase al electricista que haga la conexin segn los reglamentos de seguridad vigentes. INTERRUPTORES Existen muchos tipos diferentes de interruptores. Si se desea confirmar que funcionen adecuadamente se deben desatornillar y abrir. Cercirese que los dos alambres del cable de entrada y los dos de salida se encuentren firmemente montados en sus respectivas terminales por medio de los tornillos 1, 2, 3 y 4 (Fig. 2.13). EXTENSIN ELCTRICA Una extensin elctrica es un cable provisto de un enchufe macho (M) en un extremo y una entrada hembra (H) en el
otro. La entrada hembra se conecta al cable principal por medio de dos terminales que posee en su interior, exactamente 18 igual que el enchufe macho normal. La extensin elctrica tambin recibe distintos nombres en varios pases de habla hispana. Ejemplos de esto se tiene alargador elctrico, prolongador elctrico, extensin elctrica o alargue. Cuba, y Mxico Alargador (pieza para alargar) (DRAE). En Argentina, alargador, prolongador, alargue; Espaa, prolongador. En varios de estos pases casi no hay confusin sobre su significado. De todas maneras, Un alargador elctrico, prolongador elctrico, extensin elctrica o alargue es un trozo de cable elctrico flexible, con un enchufe en uno de sus extremos y una o varias tomas de corriente en el otro (normalmente del mismo tipo que el enchufe). El trmino se usa habitualmente para extensiones de cable elctrico para uso domstico, pero tambin es vlido para referirse a otro tipo de extensiones de cable (de red, telefnico, cable USB,...). Si el enchufe o conector de uno de los extremos es de un tipo diferente al del los otros extremos, ms que un alargador debe llamarse un cable adaptador. COMPROBACIN DE LA TOMA DE CORRIENTE CONTACTOS DE PARED Para revisar un contacto de pared enchfese una lmpara que se encuentre en buenas condiciones de funcionamiento. Algunos contactos estn provistos de un pequeo fusible que se puede sustituir. En caso contrario conviene conseguir un electricista para reparar el contacto de pared. PRECAUCIONES ALGUNAS COSAS QUE NUNCA SE DEBEN HACER 1. Nunca desarme los aditamentos elctricos sin cortar antes la corriente. 2. Nunca toque los equipos elctricos con las manos hmedas (el agua es un conductor excelente de la electricidad). 3. Nunca enchufe una pieza nueva de equipo elctrico en los contactos de pared sin haber ledo antes la laminilla correspondiente para tener la seguridad de que el voltaje que se indica en ella es igual al del circuito del laboratorio (110 V, 220 V, etc.). 4. Nunca desconecte un enchufe tirando del cable. 5. Nunca sustituya el alambre para fusible que est fundido con alambre de mayor grosor.
Figura 2.7 Extraccin del alambre de un fusible quemado. Figura 2.8 Cambio de un fusible de dos clavijas.
Ilustracin anexa A Ilustracin anexa A Existen muchos tipos diferentes de enchufes. Algunos tienen un tornillo externo que se puede aflojar con un destornillador. Figura 2.9 Un enchufe de dos clavijas. T: Tornillos, C: Clavijas.
Ilustracin anexa B Remocin del material aislante del cable con un cter o un pelacables dejando al descubierto a los alambres.
Figura 2.10 Tuerza los extremos expuestos de los alambres de ambos cables. Figura 2.11 Despus de insertar los cables en las terminales del enchufe, apriete los tornillos de las terminales y coloque estas terminales en su sitio.
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Figura 2.12 Un enchufe de tres clavijas. Se seala el alambre de tierra del cable (T) con color verde.
Figura 2.12
Figura 2.13 Ilustraciones que representan a un interruptor, en este caso a dos tipos de interruptores. Se sealan los tornillos 1, 2, 3 y 4. Figura 2.14 Extensin elctrica. Macho (M); Hembra (H).
Arreglando un enchufe de tres clavijas. Ntese el cable a tierra cubierto con el material aislante de color verde y amarillo.
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5 Herramientas utilizadas para estos arreglos elctricos. 1) Set de destornilladores. 2) Alicate con bordes cortantes (ideal para trabajar con cables). 3) Cter sencillo de cuchilla segmentada. 4) Pelacables. 5) Navaja comn. 6) Hoja de afeitar. En este caso se puede usar cuando ya no se encuentra a mano ninguna herramienta apropiada, pero debe ser manipulada con cuidado para no daar los cables ni a la persona. La misma advertencia se contempla para con cualquier instrumento cortante.
1 2 Extensiones elctricas. 1) Extensin con una hembra. 2) Extensin mltiple con cuatro hembras.
2.3 FONTANERA: PROCEDIMIENTOS SENCILLOS

Los defectos en la fontanera del laboratorio (un grifo que gotea, un vertedero obstruido, etc.) pueden afectar el trabajo considerablemente. A continuacin se describen algunos procedimientos simples para resolver estos problemas cuando no se pueda conseguir fcilmente un fontanero. A. MATERIALES (Fig. 2.15) * Una llave inglesa * Una llave para tubera * Un juego de destornilladores * Un cepillo para botellas * Arandelas de goma para grifos de agua. Tapones de goma como los que se usan en los frascos de penicilina. Un succionador para destapar caeras obstruidas. Fibra y pegamento, si es posible. Importante: Antes de iniciar todo trabajo de fontanera crtese el suministro de agua. B. EL GRIFO DE AGUA COMPONENTES DEL GRIFO El grifo consta de dos partes (Fig. 2.16): El cuerpo (C) por el que fluye el agua La llave (L) que regula el flujo de agua por medio de una arandela de goma (A). Entre el cuerpo y la llave existe una juntura (J) de goma o fibra. 1. si el grifo contina goteando despus de cerrarlo Se debe cambiar la arandela. (a) Desatornillar la llave del grifo empleando la llave inglesa (grese en sentido contrario a las manecillas del reloj). (Fig. 2.17). (b) Quite la arandela gastada de la base de la llave (B) (Fig. 2.18 (a)). Si la arandela es del tipo que se calza, trese de ella. Si est atornillada, desatornllela (Fig. 2.18 (b)). (c) Sustituya la arandela con otra, nueva, del mismo tipo. (d) Si el grifo sigue goteando despus que se ha cambiado la arandela, es probable que el asiento (A) que la recibe
tenga algn defecto (Fig. 2.19 (a)). En este caso colquese un tapn de goma en el orificio (Fig. 2.19 (b)). Este 21 funcionar temporalmente como sello, hasta que se consigan los servicios de un fontanero. 2. Si el agua escapa por la llave del grifo la juntura se debe cambiar (a) Destornille la llave del resto del grifo empleando la llave inglesa. (b) Sustituya la juntura por otra nueva del mismo tipo. Si la juntura est hecha de fibra: (a) Quite la juntura vieja, raspe la cuerda del tornillo con un instrumento punzante (Fig. 2.20). (b) Enrolle la fibra nueva sobre la cuerda del tornillo comenzando por arriba y siguiendo el sentido de las manecillas del reloj (Fig. 2.21 (a)). (c) Aplique el pegamento sobre la fibra (Fig. 2.22 (b)). (d) Coloque de nuevo en su sitio la llave del grifo y atornllela hasta que no d ms vuelta. 3. Cambio de todo el grifo Destornille el grifo defectuoso utilizando una llave para tubera (dele vuelta en sentido contrario a las manecillas del reloj). Tenga a mano el nuevo grifo; el cuerpo termina en un tornillo amplio (T) (Fig. 2.23 (a)). Enrolle fibra de fontanera sobre la cuerda de este tornillo y aplquese pegamento como se ha indicado anteriormente. Atornille el grifo nuevo en el tubo de suministro de agua que se encuentra en la pared (Fig. 2.23 (b)). Apriete el grifo con la llave inglesa. C. EL SIFN DEL FREGADERO Componentes del sifn (Fig. 2.24) El sifn del fregadero o vertedero consta de: * El cuerpo, que se fija al escape del fregadero mediante la juntura J1 * El cuello del sifn, que tiene forma de "U" y se fija al cuerpo mediante la juntura J2. Todo el sifn se encuentra montado en el tubo de desage mediante la juntura J3. El agua de desecho entra en el sifn, que se halla permanentemente lleno de agua; esto funciona como tapn sellador. As se impide que el aire ftido de los tubos de desage y las caeras entre en el sifn. Cuando los sifones se obstruyen, los vertederos o fregaderos no eliminan el aguade desecho. Empleo del succionador para destupir el sifn Coloque el succionador sobre el orificio de desage del fregadero. Deje que fluya cierta cantidad de agua a su alrededor, de modo que el succionador se adhiera (Fig. 2.25). Presione hacia abajo con el mango de madera para aplanar el succionador. A continuacin tire hacia arriba y presione hacia abajo. Repita estos movimientos varias veces, con toda la rapidez posible. Con la succin que se produce es muy probable que el sifn se destupa. Empleo de agentes qumicos para destupir el sifn Utilice uno de los productos comerciales que se elaboran con ese propsito. Si no hay, emplee 250 g de cristales de hidrxido sdico. Colquelos en el fondo del vertedero o fregadero, sobre el orificio de desage. Vierta dos litros de agua hirviendo sobre los cristales de hidrxido sdico (no eche el agua bruscamente). Deje que los cristales acten durante 5 minutos. (Vase ilustracin anexa A). A continuacin abra el agua fra del grifo y djela correr un rato. Vaciamiento del sifn para destupirlo Coloque un balde bajo el sifn. Destornille la juntura J2 con la llave inglesa. Limpie el sifn con un cepillo para botellas o un trozo de alambre. Saque todos los desechos (Fig. 2.26). Si existe un depsito blanquecino (piedra caliza) en el sifn, desrmelo completamente. Caliente sus componentes en cido actico diluido (20 ml de cido por cada litro de agua). Vuelva a montar el sifn. Si el agua escapa por el sifn Si por el orificio de desage salen olores ftidos, es probable que el depsito permanente de agua del sifn (que hace las veces de tapn) tenga un escape a causa de un defecto de la juntura J2. Atornllela firmemente o cambie la juntura por una nueva (Fig. 2.27). Importante: Nunca derrame cidos fuertes en el fregadero o vertedero porque pueden causar corrosin.
Figura 2.15 Herramientas y materiales para las reparaciones de fontanera.
Figura 2.16 Los componentes de un grifo: C: cuerpo; L: llave; J: juntura; A: arandela. Figura 2.17 Extraccin de la llave de un grifo con una llave inglesa.
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Figura 2.18 Extraccin de la arandela. B: base de la llave.
Figura. 2.19 Reparacin del asiento de la arandela. A: Asiento. b) Colocacin de un tapn de goma en el orificio. Este funcionar temporalmente como sello, hasta que se consigan los servicios de un fontanero.
Figura. 2.20 Extraccin de la juntura alrededor de la rosca de tornillo con un instrumento punzante.
Figura 2.21 (a) Enrollando la fibra nueva sobre la cuerda del tornillo. Figura 2.22 (b) Aplicando el pegamento sobre la fibra.
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Figura 2.23 Sustitucin de un grifo. T: Tornillo. Luego de remover el grifo daado, coloque el nuevo y apritelo con la llave inglesa.
Figura 2.24 Componentes del sifn de un fregadero. J1, J2, J3: Junturas. Figura 2.25 Desobstruccin de un fregadero con un succionador o desatascador de fregaderos colocado sobre el orificio de desage.
Ilustracin anexa A Empleo de agentes qumicos para destupir el sifn.
Ilustracin anexa A
Figura 2.26 Vaciamiento del sifn para destupirlo usando un cepillo para botellas. Figura 2.27 Substitucin de la juntura en la parte inferior de un sumidero.
2.4 AGUA PARA USO DEL LABORATORIO

El laboratorio mdico necesita un suministro de agua adecuado para su labor. Se requiere: * Agua limpia * Agua destilada * Agua desmineralizada (si es posible) * Agua tamponada (si es posible). En algunas reas el agua es escasa y est sumamente contaminada. Cmo se puede obtener agua limpia? 2.4.1 AGUA LIMPIA A. Inspeccin de la calidad 1. Llene una botella con agua. 2. Djela reposar durante 3 horas. 3. Examine el fondo de la botella. Si hay un sedimento ser necesario filtrar el agua. (Vase ilustracin anexa A). B. FILTRADO 1. Filtro de porcelana no vidriada, o de vidrio calizo (vidrio sinterizado) (a) Este filtro se puede ajustar al grifo. (b) De lo contrario, se puede conservar sumergido en el agua que se va a filtrar, en un recipiente amplio. (Vase Fig. 2.28). Importante: Los filtros de este tipo se deben desarmar una vez al mes y lavarlos en agua hirviendo previamente filtrada. 2. Filtro de arena (Vase Fig. 2.29) Este filtro se puede fabricar en el laboratorio. Se necesitan: (a) Un depsito (que puede ser un recipiente amplio como un barril metlico, una olla grande de barro o una cubeta perforada) (b) Arena (c) Grava. Nota: El agua que se ha filtrado a travs de un filtro de arena es casi libre de partculas, pero puede contener compuestos qumicos solubles en el agua y bacterias. C. ALMACENAMIENTO DEL AGUA Si el agua es escasa o proviene de un tanque o pozo, consrvese siempre una reserva abundante, de preferencia, en depsitos de vidrio o material plstico. Antes de filtrarla decante el agua almacenada. D. Suministro de agua
Si en el laboratorio no se dispone de agua corriente prepare un distribuidor de la manera siguiente (Vase Fig. 2.30): 24 1. Coloque el depsito de agua en un anaquel alto. 2. Ponga un tubo de goma al depsito, de manera que el agua descienda por l. 3. Mantenga cerrado el tubo de goma con una grapa de Mohr o una pequea pinza de tornillo.
Ilustracin anexa A
Ilustracin anexa A. Se observa una botella con agua la cual es dejada reposar durante 3 horas, para averiguar si hay sedimento o no, as se procede a realizar la filtracin del agua en caso que haya sedimento en el fondo. Figura 2.28 Filtrado de agua utilizando una porcelana sin esmaltar porosa o un filtro de vidrio sinterizado.
Figura 2.29 Filtrado de agua utilizando un filtro de arena. G: grava, A: Arena Figura 2.30 Un distribuidor de agua 2.4.2 AGUA DESTILADA El agua destilada es libre de compuestos no voltiles (como, por ejemplo, minerales) pero puede contener compuestos orgnicos voltiles. A. Preparacin El agua destilada se prepara por medio de una retorta en que: Se caliente agua normal hasta el punto de ebullicin El vapor que se produce se enfra al pasar por un serpentn (tubo de refrigeracin) y se condensa formando agua destilada. Para este fin existen los aparatos siguientes: 1. Retortas de cobre (alambiques) 2. Retortas de vidrio. 3. Destilador solar. Se calientan con gas, queroseno, electricidad o energa solar dependiendo del tipo de retorta. 1. ALAMBIQUES DE COBRE O ACERO INOXIDABLE (Fig. 2.31) Uno de los modelos ms simples es el alambique que proporciona la UNICEF (ref: 01.680.02). (a) Llene el depsito (D) con el agua que se va a destilar. (b) Conecte el tubo de agua fra (T) a un grifo. (c) Caliente el depsito con: Un mechero de Bunsen (B), o Un calentador de queroseno (tipo Primus). Este alambique puede producir 1 2 litros de agua destilada por hora, dependiendo de la calidad del sistema de calentamiento. 2. RETORTAS DE VIDRIO (Fig. 2.32) Estas retortas son ms frgiles, pero casi siempre producen agua ms pura. El procedimiento de destilacin es el mismo. Cercirese que el agua corriente circule con libertad alrededor del condensador (C). El agua se puede calentar en la retorta por medio de un aditamento elctrico (E). Importante: (a) Almacnese el agua destilada en un recipiente de vidrio o material plstico que se encuentre protegido de la atmsfera. (b) No destile el ltimo % del agua que se ha calentado.
DESTILADORES SOLARES (Fig. 2.33) 25 Para los laboratorios ubicados en reas remotas y con recursos limitados, un destilador simple que utilice energa solar para destilar agua se puede crear fcilmente usando un contenedor plstico limpio con dos compartimientos (uno grande y uno pequeo) y una gran rea de superficie, en el que se coloca una tapa de cristal en una posicin inclinada. El agua se vierte sobre el compartimento grande a partir del cual el agua vertida es evaporada por el sol. Esta se condensa en la cubierta de vidrio y cae en el compartimiento pequeo. El compartimiento pequeo tiene una salida en la parte inferior a travs de la cual el agua destilada puede pasar a un recipiente de cristal colocado debajo del contenedor. En los climas tropicales, alrededor de 2-7 litros de agua destilada puede ser producida diariamente en un alambique solar con una superficie de 1 m2. B. inspeccin de la calidad del agua destilada (Control de Calidad) Normalmente el pH del agua destilada es entre 5,0 y 5,5 (cido). Utilice una solucin acuosa de nitrato de plata (AgN03) (vase seccin de reactivos, para conocer la composicin) en proporcin de 17 g/l (17 g en 1 litro de la solucin) (1,7%). Esto es para evaluar la ausencia de compuestos de cloruro (Por ejemplo, cloruro de calcio). (Ilustracin anexa C). Ponga en un vaso de precipitados: 10 ml de agua destilada 2 gotas de cido ntrico 1 ml de la solucin de nitrato de plata. El agua deber continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidez blanquecina indicar que la calidad del agua destilada es deficiente. C. USOS El agua destilada se utiliza para: 1. Preparar reactivos 2. Enjuagar algunos utensilios de vidrio antes de secarlos. Importante: 1. No use agua destilada comercial (del tipo empleado para llenar las bateras acumuladoras de los automviles) en la preparacin de reactivos para el laboratorio. 2. Es preferible el agua destilada que se ha preparado recientemente; si no es posible disponer de esta, gurdese el agua destilada en recipientes de vidrio o material plstico que se lavarn peridicamente. Es conveniente guardar el agua destilada en estos tipos de recipientes. 3. Utilice siempre agua destilada preparada en la misma semana. 4. No destilar la ltima cuarta parte del agua que se calienta, ya que contiene residuos.
Ilustracin anexa B. Ilustracin que representa un destilador de agua de vidrio con todos sus componentes.
Figura 2.31 Ilustracin anexa C Ilustracin anexa C. Equipo para agua destilada. Retorta de vidrio, mechero calentador, condensador recipiente colector, entrada y salida del agua. Ntese el sentido de ingreso del agua (flechas) de abajo hacia arriba para
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inundar el condensador y refrigerarlo, facilitando de esta forma la condensacin del vapor de agua. Figura 2.31 Componentes de un alambique de cobre o acero inoxidable B: Mechero Bunsen; C: Columna de refrigeracin; R: Reservorio; T: Tubo para el agua.
Figura 2.32 Componentes de un aparato de destilacin de vidrio. C: Condensador; D: Destilado; E: Aditamento elctrico.
Figura 2.32
Figura 2.33. Componentes de un destilador solar. Botella con agua (recolecta el agua destilada); Salida del agua; Dispositivo de recoleccin; Barra del condensador; Contenedor de agua; Cubierta de vidrio; Entrada del agua.
Ilustracin anexa D
Destilador 2/4 elctrico Ilustracin anexa D Inspeccin de la calidad del agua destilada con Nitrato de Plata. Destilador 2/4. Tipo Hongo. Caldera, tapa, condensador y trampa de vapor en acero inoxidable. Para la produccin de agua destilada exenta de Pirgenos. Calefaccin elctrica blindada en vaina de acero inoxidable. Rendimiento de 2 a 4 litros/hora segn modelo. Este tipo de destiladores de agua, exista desde la dcada de los 1970, continuando hasta hoy. Era usado y sigue usndose en algunos laboratorios de hospitales regionales y distritales de ciertos pases, que tengan acceso a la red elctrica. (Fuente: http://www.rolcosrl.com) 2.4.3 AGUA DESMINERALIZADA PRINCIPIO El agua desmineralizada est libre de iones pero no necesariamente libre de compuestos orgnicos. El agua desmineralizada se prepara haciendo pasar el agua ordinaria por una columna de resinas de intercambio inico. El aparato que se utiliza consiste en un tubo largo (cartucho) lleno de grnulos de resinas de intercambio inico. El agua se filtra a travs de la columna de grnulos, que retienen todos los iones minerales (sales minerales disueltas). Esta agua, desprovista de iones, se llama agua desmineralizada. A. PREPARACIN (Fig. 2.34)
1. Compruebe que el tubo est completamente lleno de grnulos de la resina de intercambio inico. Algunos aparatos 27 desmineralizadores tienen dos tubos (cartuchos) por los que pasa el agua sucesivamente. 2. Conecte el tubo de la entrada del aparato al suministro de agua (el grifo o un pequeo tanque colocado en un plano alto, por encima del aparato). En algunos modelos el agua entra por la parte superior de la columna y en otros lo hace por el fondo. 3. Deje que el agua entre despacio. 4. Recoja el agua desmineralizada en un recipiente cerrado. B. Inspeccin de la calidad del agua desmineralizada (Control de Calidad) 1. Aparatos con cuadrante regulador En este cuadrante se mide la conductividad del agua. Mientras ms completa sea la desmineralizacin menor ser la conductividad elctrica del agua. (a) Compruebe que el sistema regulador est provisto de una pila elctrica que funcione adecuadamente. (b) Para comprobar que la pila est cargada apriete el botn "prueba en cero". La aguja del cuadrante deber oscilar hasta el cero. (c) Deje entrar agua en el cartucho (Fig. 2.35 (a)). (d) Cuando el agua desmineralizada comience a salir por el otro extremo, apriete el botn "prueba de agua". La aguja deber marcar una resistencia superior a 2 megaohms/cm (2 M /cm) (Fig. 2.35 (b)). (e) Si la aguja se detiene antes de la lnea 2 o permanece en 0, indicar que el cartucho de resinas de intercambio inico se ha usado demasiado tiempo y se debe reemplazar o reactivar. La graduacin del aparato puede estar hecha en trminos de resistencia (M/cm) o el valor recproco, la conductancia (cm/M o Siemens, S). La mayor parte de los aparatos modernos fabricados en Europa tiene la graduacin marcada en siemens. 2. APARATOS SIN CUADRANTE REGULADOR Con un papel indicador determine: El pH del agua normal que se introduce en el aparato El pH del agua desmineralizada que sale por el otro extremo. Si el pH es el mismo (generalmente inferior a 6,5), la resina ya no est activa. El agua desmineralizada de buena calidad debe tener un pH de 6 ,6 a 7,0. Se puede comprobar de nuevo empleando una solucin de nitrato de plata (AgN03), en proporcin de 17g/l (1,7%). Haga pasar por la resina una solucin dbil de cloruro sdico (sal de mesa) y a continuacin efecte la misma prueba que se ha descrito anteriormente para inspeccionar la calidad del agua destilada (seccin 2.4.2). Si se forma una ligera turbidez blanquecina es necesario sustituir la resina. 3. CAMBIO DE COLOR DE LA RESINA En algunas resinas cambia el color (se suelen ennegrecer) cuando estn gastadas y se deben sustituir. Consulte las instrucciones para el uso de las resinas que proporcione el fabricante. 4. Sustitucin o reactivacin de las resinas de intercambio inico Dependiendo del modelo, se puede hacer de las maneras siguientes: (a) El cartucho se sustituye por otro que se haya llenado con resina y se encuentre listo para usarse. (b) La columna del aparato se llena nuevamente con una resina o una mezcla de 2 resinas. (c) La resina gastada se puede usar otra vez, reactivndola, lo que se consigue haciendo pasar por el aparato una solucin de amonaco. Sganse las instrucciones que proporcione el fabricante para usar el aparato. C. Usos del agua desmineralizada El agua desmineralizada es un poco menos pura que el agua destilada, ya que puede contener vestigios de materias orgnicas. Sin embargo, es lo suficiente pura como para: Enjuagar los utensilios de vidrio antes de secarlos Preparar casi todos los reactivos que se usan en los laboratorios mdicos, incluso las tinciones. Se puede ahorrar agua destilada preparando en el laboratorio agua desmineralizada (especialmente para enjuagar los utensilios de vidrio).
Ilustracin anexa F Ilustracin anexa E Ilustracin anexa E e Ilustracin anexa F. Columnas de resinas de intercambio inico. Como se muestra, el aparato que se utiliza consiste en un tubo (cartucho) lleno de resinas de intercambio inico. El agua es filtrada a travs del pasaje por la columna. Esta agua saliente es llamada agua desmineralizada (libre de iones).
28 Figura 2.34 Diagrama de un desmineralizador. Water inlet: Entrada de agua; Cation Exchange resin: Resina de intercambio catinico; Anion Exchange resin: Resina de intercambio aninico; Deionized water outlet: Salida del agua desmineralizada; Conductivity meter: Medidor de Conductividad.
Ilustracin anexa G
Figura 2.35 Medicin de la resistividad del agua desmineralizada. Ilustracin anexa G En algunas resinas cambia el color (se suelen ennegrecer) (vase la flecha) cuando estn gastadas y se deben sustituir. 2.4.4 AGUA AMORTIGUADA Por lo general el agua destilada es cida y el agua desmineralizada se acidifica cuando se expone al aire. Para algunos procedimientos de laboratorio (preparacin de colorantes, etc.) el pH del agua debe ser de 7,0, aproximadamente (agua neutra) y conservarse en estas condiciones. Esto se logra, cuando es posible, disolviendo sales amortiguadoras en el agua (agua amortiguada). * Materiales * Probetas de 10 ml y 1000 ml * Un matraz volumtrico de 1000 ml * Papeles universales indicadores del pH, (para medicin del pH de 1 hasta 10) * Papeles indicadores del pH de rango limitado: Para un rango de 5.0 a 7.0 y para el rango de 6.0 a 8.0 * Agua destilada (o desmineralizada) * Solucin de cido Actico al 5% (vase seccin de reactivos para el nmero correspondiente), diluido 1/10 con agua destilada * Hidrofosfato disdico (Na2 HP04: 2H2O), hidratado * Fosfato de potasio y dihidrgeno (KH2P04), anhidro * Rojo Fenol, solucin al 1% (vase seccin de reactivos para el nmero correspondiente) * Carbonato de Sodio solucin al 0,2% (vase seccin de reactivos para el nmero correspondiente) B. MTODO 1. Pese con precisin 3,76 g del fosfato disdico. 2. Pselo a un matraz volumtrico de 1000 ml con un embudo (Fig. 2.36). 3. Enjuague con agua varias veces el recipiente donde se pes el hidrofosfato disdico y vierta el agua por el embudo en el matraz volumtrico. 4. Pese con precisin 2,1 g del fosfato de potasio y dihidrgeno y repita la operacin indicada en los puntos 2 y 3. 5. Aada un poco ms de agua y mezcle la solucin hasta que las dos sustancias qumicas se disuelvan (Ilustracin anexa G). 6. Vierta agua en el matraz hasta la marca de 1 litro. 7. Ponga el tapn en el matraz y mezcle completamente la solucin. 8. Pase la solucin a un frasco para reactivos, de vidrio blanco, y gurdela en el frigorfico. 9. Sumerja una tira de papel indicador universal en la solucin tampn y comparar el color obtenido con la que se muestra en la cartilla estndar (Fig. 2.37). Leer la unidad de pH dada por el color obtenido y comprelo buscando que coincida con el color ms cercano de la cartilla de colores.
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10. De acuerdo con el resultado obtenido, seleccione una tira de papel indicador para la gama limitada correspondiente. Por ejemplo, si el pH es 6, use papel indicador para la gama 5,0-7,0. Si el pH es de 7,5, use papel indicador para la gama 6,0-8,0. 11. Repita la prueba, usando el papel para la gama limitada correspondiente. Leer el pH de la solucin tampn en la tabla estndar. 12. Si el pH est entre 7,0 y 7,2, el agua tamponada es satisfactoria. Si es inferior a 7,0, el agua es cida. Si el agua es cida, preparar una solucin fresca, usando agua destilada que haya sido hervida durante 10 minutos en un matraz redondo descubierto, sin tapn, (esto elimina el dixido de carbono) (Vase Ilustracin anexa H). 13. Si el agua es cida an despus de la ebullicin: - Agregar cinco gotas de solucin de rojo fenol por cada litro de agua; - Neutralizar mediante la adicin de una solucin de carbonato de sodio al 0,2%, una gota a la vez, hasta que el agua se vuelve rosa (Fig. 2.38). 14. Si el agua es alcalina (pH superior a 7,2): - Agregar cinco gotas de solucin de rojo fenol por cada litro de agua; - Neutralizar mediante la adicin de una solucin de cido actico 0,5%, una gota a la vez, hasta que el agua se vuelve de color naranja (Fig. 2.39). Si no se dispone de los compuestos fosfatados: Si no hay disponible Hidrofosfato disdico ni Fosfato de potasio y dihidrgeno, neutralizar agua destilada o desmineralizada directamente, como se muestra en los pasos 12-14 anteriores. Nota: El pH tambin puede corregirse mediante la adicin de pequeas cantidades de las sales amortiguadas: * El Hidrofosfato disdico se puede utilizar para aumentar el pH si el agua es cida (pH inferior a 7,0). * El Fosfato de potasio y dihidrgeno puede ser aadido para reducir el pH si el agua es alcalina (pH por encima de 7,2).
Figura 2.36 Transferencia de Hidrofosfato disdico a un matraz volumtrico aforado.
Ilustracin anexa H Ilustracin anexa H Aada un poco ms de agua y mezcle la solucin hasta que las dos sustancias qumicas se disuelvan. Vierta agua en el matraz hasta la marca de 1 litro. Figura 2.37 Controlar el pH usando papel indicador universal.
Ilustracin anexa I Si el agua es cida, preparar una solucin fresca, usando agua destilada que haya sido hervida durante 10 minutos en un matraz redondo descubierto, sin tapn, (esto elimina el dixido de carbono).
Ilustracin anexa I
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Figura 2.38 Correccin del pH cido del agua tamponada con Carbonato de Sodio 0,2% y usando Rojo Fenol como indicador. Figura 2.39 Correccin del pH alcalino del agua tamponada con cido Actico 0,5% y usando Rojo Fenol como indicador.
RELACIN DE APARATOS NECESARIOS PARA EQUIPAR UN LABORATORIO PERIFRICO 2.5 EQUIPAMIENTO

A continuacin se presenta una relacin de los aparatos necesarios para equipar un laboratorio que sea capaz de efectuar todos los ensayos que se describen en este manual. Por lo general este tipo de laboratorio se instalar en un hospital rural pequeo (hospital de distrito) que tenga entre 60 y 100 camas. Las cantidades de los diferentes artculos que se proponen bastan para que un laboratorio que cuente con uno o dos tcnicos realice 20-50 ensayos por da en lapsos de 6 meses. 2.5.1 INSTRUMENTOS DE LABORATORIO ESENCIALES MICROSCOPIOS1 El laboratorio debera estar equipado con dos microscopios. Un microscopio con tubo binocular inclinado, platina mecnica, 3 objetivos (x 10, x 40, x 100), oculares (x 5, x 10), condensador y espejo planocncavo. Si existe suministro de electricidad o una batera, una lmpara elctrica de microscopio, que se usar en los ensayos de hematologa. (Microscopio binocular con luz incorporada). El segundo microscopio es para uso en otros procedimientos del laboratorio (parasitologa, anlisis de orina, bacteriologa, etc.) y debera ser binocular, es decir, con un tubo binocular inclinado y los accesorios que se han indicado anteriormente. Si el laboratorio se encuentra en un centro de salud, un microscopio binocular ser suficiente. CENTRFUGAS2 Es til tener dos centrfugas: Una centrfuga elctrica con aditamento especial para microhematocrito en el cabezal y cuadrante indicador. (Centrfuga para microhematocrito con un lector o baco para la lectura de los capilares de microhematocrito). Una centrfuga manual con cuatro cubetas o una elctrica con cuatro cubetas. BALANZA3 Si los reactivos se han de elaborar en el laboratorio, se necesitar una balanza analtica. Accesorios: un juego de pesas. Si en el laboratorio se necesita preparar una amplia gama de reactivos, es de utilidad tener una balanza analtica de dos platos con su correspondiente juego de pesas (vase seccin 3.2.2). En la actualidad, se puede usar una balanza electrnica de precisin de un solo plato la cual funciona con energa elctrica o con pilas. Este tipo de balanzas ya se encuentran disponibles en los comercios y son de fcil acceso. FRIGORFICOS Siempre que se establezca un laboratorio se deber contar con un frigorfico exclusivo para tal servicio. Existen reactivos que necesitan mantenerse refrigerados (VDRL, pruebas de embarazo, etc.) as como ciertos materiales (algunos medios de transporte, muestras, etc.). Estos se podrn conservar en un compartimiento del frigorfico del hospital o centro de salud. BAO MARA REGULADO POR TERMOSTATO (37 C - 56 C) Un bao mara equipado con un termostato regulador de la temperatura es requerido cuando las muestras o materiales deban ser mantenidos a una cierta temperatura y cuando las mediciones deben ser realizadas a una dada temperatura. En otras palabras, trabajos en que se requieren temperaturas constantes durante un tiempo relativamente prolongado. CONTADOR DIFERENCIAL Si bien se puede utilizar un contador manual para hacer los recuentos (llamado tambin cuenta personas o cuenta ganado) o un sistema de baco manual escribiendo en un papel, con un contador diferencial se ahorra tiempo y se logra mayor eficiencia. FOTMETRO O COLORMETRO Es necesario tener un fotmetro o un colormetro para la medicin de las pruebas de qumica sangunea y para la determinacin precisa de los niveles de hemoglobina. Existen modelos comerciales disponibles que funcionan con pilas. En la actualidad, tambin se usan los espectrofotmetros por su accesibilidad tanto los modelos con cubeta como aquellos semiautomticos. 1 Para obtener ms informacin, consulte la seccin 3.1. 2 Para obtener ms informacin, consulte la seccin 3.3. 3 Para obtener ms informacin, consulte la seccin 3.2.3. 2.5.2 ARTCULOS ADICIONALES AUTOCLAVE Si el laboratorio se encuentra instalado en un hospital, se podr utilizar el servicio de esterilizacin de ste. Si se halla en un centro de salud, se necesitar uno de los esterilizadores siguientes:
una olla de presin 31 un autoclave pequeo (elctrico o calentado en estufa de aceite o gas butano). HORNO DE AIRE CALIENTE Si el laboratorio es relativamente grande ser provechoso que cuente con un pequeo horno de aire caliente que es muy til para secar los utensilios de vidrio y esterilizar materiales conjuntamente con el autoclave. DESIONIZADOR O RETORTA PARA PREPARAR AGUA DESTILADA El desionizador es un aparato para desmineralizar agua por medio de cartuchos de resinas de intercambio inico (vase la seccin 2.4.3). En lugar de un desmineralizador se puede utilizar una retorta. Si todos los reactivos que se obtienen estn listos para usarse o se cuenta con agua destilada, este tipo de artculo se puede excluir de esta relacin. 2.5.3 EQUIPOS Y SUMINISTROS Una lista de equipos y suministros para un laboratorio perifrico de salud est indicada en la Tabla 2.2. Las cantidades propuestas son suficientes como para permitir que un laboratorio con uno o dos tcnicos realicen 20-50 exmenes al da durante un perodo de 6 meses. En la Fig. 2.40, se muestra material de vidrio y pequeos artculos de equipamiento de laboratorio de uso frecuente. 2.5.4 MANUFACTURA DE UTENSILIOS DE VIDRIO El vidrio se produce por la fusin, a temperaturas muy elevadas, de una mezcla de arena y potasio (o sodio). De este modo se forma un silicato (vidrio ordinario, de cal y soda).Cuando se agrega cido brico a estos ingredientes se produce vidrio de borosilicato (Pyrex, etc.), que es menos quebradizo y ms resistente al calor. En el laboratorio se pueden manufacturar ciertas piezas del equipo que se suele usar, calentando vidrio ordinario. MATERIALES 1. Tubos huecos de vidrio: dimetro externo: 4-8 mm espesor de la pared: 0,9-1,0 mm 2. Varillas de vidrio: dimetro: 4-8 mm 3. Cortador de vidrio: lpiz de diamante o sierra. 4. Una pieza de tela 5. Un mechero de Bunsen (o, an mejor, una lmpara de soplete pequea, de gas o petrleo). MANUFACTURA DE UNA PIPETA DE PASTEUR 1. Utilice tubos de vidrio de 4-6 mm de dimetro. Marque con la sierra la longitud de los tubos que necesita: 14 a 15 cm para las pipetas pequeas 18-25 cm para las pipetas largas. Haga las marcas alrededor de cada tubo, formando un crculo (Fig. 2.41).
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34 TABLA 2.2 EQUIPO Y SUMINISTROS PARA UN LABORATORIO DE SALUD PERIFRICO CANTIDAD ARTCULO REQUERIDA EQUIPO PARA LA OBTENCIN DE MUESTRAS EQUIPO ESENCIAL Segn sea Jeringas, graduadas, desechables, 20 ml necesario Segn sea Jeringas, graduadas, desechables, 10 ml necesario Segn sea Jeringas, graduadas, desechables, 5 ml necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 18 (1,2 mm) x 40 mm necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 19 (1.0-1.1 mm) x 40 mm necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 20 (0,9 mm) x 40 mm necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 22 (0,7 mm) x 40 mm necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 23 (0,6 mm) x 32 mm necesario Segn sea Agujas desechables, calibre 23 (0,6 mm) x 90 mm necesario Tubo de goma para aplicar torniquetes, 2-5 mm de dimetro 2 piezas Segn sea Lancetas para extraer sangre capilar necesario Algodn hidrfilo, blanco, absorbente 2x500 g Algodn hidrfilo, no absorbente 2x500 g Para tantos como Frascos vacos de inyecciones, que anteriormente contenan antibiticos, reactivos, etc. sea posible EQUIPO ADICIONAL Bistur con cuchillas desechables para cortar y tomar muestras cutneas para hacer frotis (para 1 la lepra) Pinzas (frceps) de cierre curvo sin dientes para la toma de muestras cutneas para hacer frotis 1 (para la lepra) Cajas, de plstico o de cartn, desechables, para la recoleccin de heces 50 Aplicadores de madera de (12 cm x 1mm) (pueden fabricarse en el mismo laboratorio) 50 Frascos de 2,5 ml y 5 ml, preferiblemente de material plstico 50 Frascos de vidrio blanco, de boca amplia, de 50 ml, con tapa de rosca metlica y arandela de 25 goma, para recoger muestras de esputo Frascos de vidrio blanco, de 25 ml, con tapa de rosca y arandela de goma, para recoger diversas 25 muestras Frascos de boca amplia, de todas variedades, para recoger orina 20-40 Pinzas de sacabocado para biopsias de piel (para oncocercosis) 1 Depresor lingual de madera (abatelenguas) 50 UTENSILIOS DE VIDRIO ARTCULOS ESENCIALES Varillas de vidrio, slidas, 6 mm de dimetro 3 Vasos para anlisis (beackers), de fondo plano, de material plstico, de 50 ml 4 Vasos para anlisis (beackers), de fondo plano, de material plstico, de 100 ml 4 Vasos para anlisis (beackers), de fondo plano, de material plstico, de 250 ml 4 Cubetas para tincin, rectangulares, para 20 portaobjetos 4 Embudo de vidrio, de 60 mm de dimetro 1 Embudos de vidrio, de 90 mm de dimetro 2 Embudo de material plstico, de 200 mm de dimetro 1 Probetas graduadas, de vidrio, con tapn, de 25 ml 3 Probetas graduadas, de vidrio, con tapn, de 100 ml 3 Probetas graduadas, de vidrio, con tapn, de 250 ml 2 Probetas graduadas, de vidrio, con tapn, de 500 ml 1 Probetas graduadas, de vidrio, con tapn, de 1000 ml 1 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 250 ml 3 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 500 ml 3 Matraces de Erlenmeyer, de boca amplia, vidrio Pyrex (resistente al calor), 1000 ml 3 Frascos goteros de material plstico o vidrio, de 100 ml 12 Frascos goteros de vidrio color mbar, 100 ml 3 Frascos para reactivos, de material plstico o vidrio de 100 ml 20 Frascos para reactivos, de material plstico o vidrio de 500 ml 10 Frascos para reactivos, de material plstico o vidrio de 1000 ml 10 Matraces volumtricos de vidrio, con tapn: de 100 ml 4 de 250 ml 2 de 500 ml 2 de 1000 ml 1 Portaobjetos de (25 x 75) mm (1,1 a 1,3 mm de espesor) 2x1000 Cubreobjetos cuadrados de (20 x 20) mm (0,13 a 0,16 mm de espesor) 20x100 Frascos de lavado (pisetas), de material plstico, de 500 ml 2 Frascos de lavado (pisetas), de material plstico, de 1000 ml 2 Cristales cncavos de reloj (vidrios de reloj), de 50 mm de dimetro 2
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Pipetas graduadas desde el extremo superior, pero no hasta el inferior: de 1 ml (divididas en 0,01 ml) de 2 ml (divididas en 0,01 ml) de 5 ml (divididas en 0,1 ml) de 10 ml (divididas en 0,1 ml) Pipetas Pasteur Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 150 x 16 mm Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 85 x 15 mm (tubos de Kahn) Tubos de ensayo de vidrio Pyrex, de 50 x 6 mm (para estudios de compatibilidad) Tubos para centrfuga, cnicos, de 15 ml Tubos para centrfuga, cnicos, de 15 ml, graduados divididos en 0,1 ml Tubos de vidrio; grosor de la pared, 1 a 1,5mm; dimetro, 7 a 8 mm OTROS ARTCULOS Placas de Petri, de vidrio: de 112 mm de dimetro de 156 mm de dimetro Platos para evaporacin, de 75 mm (75 ml) Desecador
UTENSILIOS PARA HEMATOLOGA
12 10 10 6 2 x 144 50 100 20 40 6 1 kg 4 4 2 1 30 20 3 1 12 1 30 2 1 1000 1 juego (10 bandejas) 1 metro 4 1 1 juego 4 4 2 2 1 los necesarios 1 33 6 1 12 12 12 1 12 3 2 2 3 rollos 3 rollos 1000 Las necesarias 5 1 1 1 1 3 Tantos como sea necesario 2 2 1 1 1 1 1 2 1
Pipetas de Sahli, de 0,02 ml, con tubos de goma Pipetas para sangre, de 0,05 ml Cmaras de recuento: de Neubauer mejorada (con lnea brillante si es posible) de Fuchs y Rosenthal Cubreobjetos, pticamente planos, para cmaras de recuento (Cubrecmaras) Contador manual (Cuenta ganado) Tubos (pipetas) de Westergren para medir la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos (Eritrosedimentacin, Velocidad de Sedimentacin Globular: VSG) Soportes para los tubos de Westergren Centrfuga para microhematocrito Tubos capilares para microhematocrito, con heparina Sellador de tubos para microhematocrito (cera, plastilina)
EQUIPO PARA BACTERIOLOGA Y PRUEBAS BIOQUMICAS
Alambre de aleacin de Nquel y Cromo (Nicromo), de 1 mm de dimetro Mangos para asas de alambre Bloque de madera para los mangos Tubos estndar para protenas Gradillas grandes para 12 tubos de ensayo Gradillas pequeas para 12 tubos de ensayo Portatubos de madera Pinzas de acero inoxidable, para portaobjetos Mechero Bunsen para gas butano Depsitos de gas butano (garrafas de gas) Trpode con gasa de amianto Esptulas de diversos tamaos, para pesar reactivos
REGISTROS E INFORMES DEL LABORATORIO
Cuadernos para registro, de cubierta dura, grandes Cuaderno para registro, de cubierta dura, pequeo (para donadores de sangre) Lpices de cera para marcar vidrio, de color rojo Lpices de cera para marcar vidrio, de color azul Marcadores permanentes con tinta al solvente para marcar vidrios (diversos colores, de preferencia, rojo, azul, negro, verde) Marcador de vidrio con punta de diamante Lpices de grafito Estilogrficas, bolgrafo, tinta azul o negra Estilogrficas, bolgrafo, tinta roja (para anotar resultados positivos) Resaltadores fluorescentes (diversos colores, por ej., amarillo, naranja, verde) para resaltar resultados positivos) Cinta de celofn Cinta adhesiva blanca Etiquetas para los frascos de los pacientes Planillas preparadas con solicitudes al laboratorio (de preferencia estandarizada por oficinas centrales) Gomas de borrar Almohadilla para sellos Tinta para sellos Sello Portasello Reglas Sujetapapeles (clips) Pisapapeles EQUIPOS VARIOS Microscopios Colormetro (Espectrofotmetro) Bao mara Frigorfico Horno de aire caliente Centrfuga Balanza Desmineralizador o destilador de agua
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Temporizador (timer), de 0 60 minutos con alarma Lmpara de alcohol Martillo Alicate Alicate de electricista Destornillador pequeo Destornillador mediano Destornillador grande Sierra metlica obtusa, de 5 mm Sierras pequeas, para ampolletas Cacerola de 30 cm, de fondo plano, con tapa Placa caliente Mortero y mano (10 cm de dimetro) Tazones de material plstico, de 50 x 30 cm Cubeta de material plstico de 12 litros Propipeta de goma Micropipeta de 20 l Micropipeta de 50 l Micropipeta de 100 l Micropipeta de 200 l Micropipeta de 500 l Tips (puntas) para micropipeta de 20 l de plstico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 50 l de plstico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 100 l de plstico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 200 l de plstico desechables Tips (puntas) para micropipeta de 500 l de plstico desechables Tijeras (mediana, grande) Bomba de vaco, metlica Termmetro 0 100 C Tapones de goma Tapones de corcho Sacacorchos Cepillos para limpiar tubos de ensayo y frascos (varios tamaos) Papel de filtro de 15 cm de dimetro (tipo Whatman No. 1 o equivalente) Papel para pH, de graduacin estrecha (6,8-7,2) Papel para pH, de graduacin amplia (0 - 12) Papel para lentes Pincel fino, cepillo de pelo de camello suave (para limpiar lentes) Pera de goma pequea sopladora (para la limpieza de lentes) Esta pera de goma puede tener un cepillo de pelo de camello suave incorporado, o puede retirarse el cepillo para usar solo el bulbo de goma para soplar el polvo y la pelusa Papel higinico Toallas y trapos limpios Aceite de inmersin Calorfero porttil de gas Pera de goma (para limpiar las pipetas)
1 1 1 1 par 1 par 1 1 1 1 12 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 Las necesarias Las necesarias Las necesarias Las necesarias Las necesarias 1 de cada una 1 1 1 juego 1 juego 1 6 4 cajas 6 cuadernos 6 cuadernos 2 paquetes 1 1 10 rollos Los necesarios 6 frascos (de 10 ml cada uno) 1 1
Ilustracin anexa A
Ilustracin anexa B
Ilustracin anexa A Tubos huecos de vidrio, varillas de vidrio y sierra. Ilustracin anexa B Colocacin de los tubos de vidrio en un beaker para dejarlos enfriar. Ilustracin anexa C Lavado y enjuague de los tubos de vidrio recin preparados.
Ilustracin anexa C
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Figura 2.41 Marcando la longitud necesaria del tubo de vidrio utilizando una sierra Figura 2.42 Rompiendo el tubo de vidrio a mano Figura 2.43 Redondeo de los extremos del tubo de vidrio por flameado a la llama del mechero 2. Envuelva con una pieza de tela la parte del tubo que va a partir. Sostenga el tubo con ambas manos, colocando las yemas de los pulgares a cada lado de la marca (Fig. 2.42). Rompa el tubo ejerciendo presin con los pulgares. 3. Redondee el extremo de las dos piezas resultantes, de la manera siguiente como se muestra en la Fig. 2.43: caliente el extremo del tubo, sostenindolo en posicin casi vertical inmediatamente arriba de la llama azul del mechero vaya girndolo lentamente detngase cuando el vidrio se ponga al rojo vivo. 4. Coloque los tubos en un vaso de precipitado o en un pote abierto, con los extremos calientes hacia arriba, y djense enfriar. Lave todas las piezas que se han preparado (siga las instrucciones que figuran en la seccin 3.5.1). Enjuguelas y squelas. 5. Estire el tubo para formar la pipeta del modo siguiente: caliente el tubo a la mitad de su longitud en la llama azul (Fig. 2.44); haga girar el tubo hasta que el vidrio enrojezca. En este momento la llama se pondr color amarillo. 6. Retire el tubo de la llama sin dejar de girarlo continuamente y tire con lentitud de ambos extremos conservando las dos manos exactamente en el mismo nivel (Fig. 2.45). El tubo se estirar. Contine tirando de los extremos hasta lograr la longitud requerida (10-20cm). 7. Espere que enfre. Corte por la porcin estirada exactamente a la longitud que se necesite. Redondee los bordes cortantes sostenindolos algunos segundos al calor de la llama (Fig. 2.46). Separe y selle las dos pipetas calentndolas en la parte alta de la llama.
Figura 2.44 Calentamiento del tubo de vidrio antes de estirar la pipeta.
Figura 2.45 Estirando la pipeta. Figura 2.46 Redondeo de los extremos.
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Figura 2.47 Redondeo de los extremos de la varilla de vidrio por flameado.
MANUFACTURA DE UN AGITADOR 1. Procrese una varilla de vidrio slido, de unos 5 mm de dimetro. Con una sierra crtese la varilla en trozos de 15, 20 25 cm, segn sean las necesidades (vase Fig. 2.41). El procedimiento para cortar es el mismo que se usa para los tubos de vidrio. 2. Redondee los extremos hacindolos girar sobre la llama azul del mechero hasta que se pongan al rojo vivo en una porcin de 1 cm, aproximadamente (Fig. 2.47). 3. Con una pesa de 500 g 1 kg aplane los extremos calientes contra el mosaico o azulejo (seco) de la superficie de trabajo (Fig. 2.48). 4. Caliente cada uno de los otros extremos y aplstelos presionndolos suavemente contra un azulejo (Fig. 2.49). Las nuevas varillas se pueden utilizar tambin para decantar lquidos o verterlos con lentitud (vase Fig. 3.52).
Figura 2.48 Aplanar el extremo caliente de la varilla de vidrio con un peso. Figura 2.49 Presionando el extremo caliente de la varilla de vidrio hacia abajo sobre la superficie de un mosaico. Figura 2.50 Calentado el tubo de vidrio antes de doblarlo. Figura 2.51 Curvando el tubo de vidrio para hacer un ngulo recto.
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Ilustracin anexa D Figura 3.52 e Ilustracin anexa D Las nuevas varillas se pueden utilizar tambin para decantar lquidos o verterlos con lentitud.
Figura 2.52 Problemas comunes con el curvado del tubo de vidrio doblado.
DOBLADO DE UN TUBO DE VIDRIO 1. Caliente la parte por donde quiere doblar el tubo hacindolo girar sobre la llama hasta que el vidrio tome un color rojo plido y se haga maleable (Fig. 2.50). 2. Dblelo muy despacio hasta formar un ngulo recto (use como gua el ngulo de un azulejo; Fig. 2.51). Doblados defectuosos (Fig. 2.52) a) El vidrio se calent demasiado. b) El vidrio no se calent suficientemente. PREPARACION DE UN MATRAZ DE LAVADO Materiales Se necesitan: un matraz redondo o un matraz Erlenmeyer de 1000 ml dos trozos de tubo de vidrio un tapn de corcho o goma. Mtodo Perfore el tapn con una broca o perforador de corcho. Humedezca los extremos de los tubos con algunas gotas de agua (cuando se use tapn de corcho) o glicerol (si se usa tapn de goma) antes de insertarlos en las perforaciones (Fig. 2.53). Protjase las manos con una pieza de tela.
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Figura 2.53 Componentes de un frasco de lavado Figura 2.54 Recipientes para muestras de heces
2.5.5 RECIPIENTES PARA MUESTRAS En el laboratorio se emplean distintos recipientes para recolectar muestras de heces fecales, sangre, orina y esputo. RECIPIENTES PARA HECES FECALES Los siguientes tipos de contenedores son adecuados para la recogida de muestras de heces (Fig. 2.54): - Caja de cartn encerado o parafinado - Lata vaca con tapa - Frasco de plstico liviano -Frasco de vidrio especialmente diseado para la recogida de heces, con una cuchara unida al tapn. FRASCOS Y TUBOS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE SANGRE SANGRE SIN ANTICOAGULANTES Use tubos limpios y secos con capacidad para 5-20 ml, segn las necesidades. Separe el suero despus de que la sangre se haya coagulado y centrifugado. Si las muestras de suero se van a enviar a otro laboratorio esterilice los tubos y frascos. El mejor tipo de tubos es el que se puede centrifugar; se evita as la manipulacin excesiva de las muestras. SANGRE CON ANTICOAGULANTES Anticoagulantes para ensayos de hematologa Solucin salina bipotsica EDTA EDTA: cido Etilendiaminotetraactico; tambin conocido como cido Edtico. Coloque 0,5 ml de esta solucin al 10% (reactivo No. 22) en una serie de frascos de 5 ml (Fig. 2.55) (o bien 0,2 ml en frascos de 2 ml). Deje secar los frascos abiertos a la temperatura ambiente o colquelos en una incubadora a 37C, si est disponible. Utilcense para: recuentos de clulas sanguneas clculos de hemoglobina identificacin de grupos sanguneos. Tubos con heparina Este anticoagulante es costoso y poco estable en los climas clidos. Los tubos con heparina se pueden obtener en el comercio o prepararse en laboratorios centrales; tienen marcas indicadoras del nivel hasta donde se deben llenar con sangre. Citrato trisdico al 3,2% (a veces se usa al 3,8%) Preparacin: vase el reactivo No. 60. Se usa para determinar la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos. Emplese 1 ml de solucin de citrato trisdico por cada 4 ml de sangre ( 0,4 ml por cada 1,6 ml de sangre). Importante: Nunca se hagan recuentos de clulas sanguneas con citrato. Anticoagulante para efectuar ensayos bioqumicos Generalmente se emplea fluoruro sdico (NaF). Use 10 mg de polvo de fluoruro por cada 10 ml de sangre, 2 mg por cada 2 ml de sangre. Se utiliza para: calcular la glucosa sangunea calcular la urea sangunea (con ciertas tcnicas). Advertencia: El fluoruro sdico es venenoso. Precauciones que se deben tomar al usar anticoagulantes
o Mzclese inmediatamente despus de recolectar la sangre, invirtiendo el recipiente varias veces con 41 suavidad y uniformidad. No se agite el contenido. o Utilice recipientes limpios. Squense antes de aadir el anticoagulante. Advertencia: Los residuos de detergente disuelven los glbulos rojos. Asegrese que los recipientes se enjuaguen abundantemente antes del secado. o Guarde los frascos que contengan anticoagulantes en un lugar seco. La solucin de sal dipotsica de EDTA y el fluoruro sdico son estables a la temperatura ambiente, pero el citrato trisdico y la heparina se deben conservar en el frigorfico. o Utilice las proporciones correctas. Use recipientes y tubos graduados o coloque etiquetas en ellos de modo que el borde superior de estas quede al nivel de la cantidad de sangre que se requiera (2 ml ,5 ml, etc.) RECIPIENTES PARA RECOLECTAR OTRAS MUESTRAS El procedimiento mejor para los anlisis de orina consiste en que los pacientes las recojan cerca del laboratorio. Use matraces de boca ancha de Erlenmeyer limpios y secos, con capacidad para 250 ml, o frascos limpios de boca amplia para efectuar los exmenes directos y los ensayos bioqumicos habituales. Recoleccin de agua para examen bacteriolgico. Frascos para recolectar lquido cefalorraqudeo (vase seccin 8.2). CAJAS Y TARROS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE ESPUTO Se pueden utilizar tarros de vidrio con tapn de rosca o tarros desechables de material plstico con tapa, o bien se pueden fabricar pequeas cajas en el propio laboratorio con piezas de cartn que se arman con grapas, es decir, usando cartn y una grapadora. Estas cajas solo se pueden usar una vez, y nada ms que para el esputo que se recolecta en el propio laboratorio. 1. Corte las piezas de cartn en cuadros de 18 cm y dblelos como se indica en la ilustracin (Fig. 2.56): primero, de esquina a esquina a continuacin, en nueve cuadros iguales. 2. Dblense hacia adentro los pliegues diagonales del cuadro de cada esquina (Fig. 2.57). 3. Doble dos de las esquinas hacia atrs, sobre un lado de la caja, y las otras dos sobre el otro lado (Fig. 2.58). 4. Fjense con grapas las dos esquinas que se han doblado sobre cada lado de la caja (Fig. 2.59), que de este modo quedar lista para recibir la muestra. 5. Incinere las cajas de cartn y los tarros de plstico despus de usarlos, como se explica en la seccin 3.6.2.
Figura 2.55 Dispensacin de solucin de EDTA en frascos (tubos) para la recogida de muestras de sangre.
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Figura 2.56 Plegando cartn para hacer cajas de cartn para la recogida de esputo Figura 2.57 Doblando las esquinas hacia adentro Figura 2.58 Doblando dos de las esquinas hacia atrs, sobre un lado de la caja, y las otras dos sobre el otro lado Figura 2.59 Asegurando las esquinas dobladas con grapas
Ilustracin anexa A Tarro plstico y caja para la recogida de esputo.
2.5.6 ALMACENAMIENTO, INVENTARIO Y PEDIDO DE SUMINISTROS ALMACENAMIENTO UTENSILIOS DE VIDRIO Gurdense los utensilios de vidrio en los anaqueles de un armario, protegidos del polvo. Los matraces de Erlenmeyer y los de fondo redondo se deban taponar con algodn no absorbente o cubrir con papel de estraza (o, de preferencia, con hojas delgadas de parafina encerada o material plstico adherente, como Parafilm o Saran, si se cuenta con ellos) y ordenarlos por tipos y tamaos. Las pipetas graduadas se guardarn en gavetas (cajones) divididas en secciones.
Ilustracin anexa A Cajn donde se guardan las pipetas graduadas en secciones.
AGENTES QUMICOS Y REACTIVOS Deben colocarse en estricto orden alfabtico. Los cidos y las sustancias qumicas inflamables y peligrosas (que se identificarn por medio de etiquetas de colores apropiados) se deben guardar por separado en una seccin especial. Los frascos que no se han abierto se conservarn en cajas rellenas de aserrn. Los venenos se deben guardar aparte, en un armario con candado, con etiquetas de colores diferentes que los identifiquen. INSTRUMENTOS PESADOS Algunos instrumentos, como los espectrofotmetros, se conservarn en una habitacin provista de un sistema de enfriamiento de aire si el clima es clido y hmedo. Para guardar los microscopios consltense la seccin 3.1.6. ORGANIZACIN DEL ALMACN E INVENTARIO FICHAS DE REGISTRO DE EXISTENCIAS Se deber elaborar una ficha de registro de existencias para cada sustancia qumica, tincin, utensilio de vidrio, etc. Una forma de ficha sencilla se muestra en la tabla 2.3. Cuando se pida un artculo, indquese: En la columna encabezada "Pedido a" dnde se envi el pedido En la columna encabezada "Pedido" la fecha y la cantidad pedida. Cuando se reciba un artculo, indquese:
En la columna encabezada "Recibido" la fecha de recibo y la cantidad recibida 43 En la columna encabezada "Existencia" el total en existencia en el laboratorio despus de que el artculo se haya recibido. Cuando un artculo se haya usado (o roto), indquese: En la columna encabezada "Despachado" -- la fecha y la cantidad salida del almacn En la columna encabezada "Existencia" el total que ha quedado en existencia despus de que el artculo ha salido del almacn. Clasifquense las fichas de existencias en orden alfabtico estricto y consrvense en una caja o un archivero. Se asignar un nmero a cada artculo que se anotar en la ficha de existencias, junto a "Artculo No.". Tabla 2.3 Muestra de una ficha de existencias Artculo Artculo: Tincin de Giemsa (frasco con 250 ml) No. 29 En Pedido a Pedido Recibido Despachado existencia Fecha Cantidad Fecha Cantidad Fecha Cantidad 2 frascos Compaa 01 /08/ 01 2 frascos 20 /08/ 01 2 frascos 4 frascos A 10 /10/ 01 1 frasco 3 frascos 03 /12/ 01 1 frasco 2 frascos Compaa 15/11/01 2 frascos 10/12/01 2 frascos 4 frascos A INVENTARIO Cada 6 meses se har un inventario de todos los suministros del laboratorio. Deber contarse la cantidad o los nmeros de los artculos que se tengan en existencia y se comprobar que la cifra corresponde a la que figura en la columna "Existencia" de la ficha. PEDIDO DE SUMINISTROS Un laboratorio adecuadamente organizado har un pedido de suministros a los expendios centrales cada 3 meses. Para elaborar cada pedido examnense las fichas de existencias, una por una. Es ms fcil calcular las cantidades que se necesitan por mes (vase tabla 2.4) si en la parte inferior de cada ficha de existencias se aade un cuadro como el siguiente: Tabla 2.4 Estimacin de la cantidad de suministros requeridos Ao Cantidad usada por mes
Enero
Febrero
Marzo
Abril
Mayo
Junio
Julio
Agosto
Septiembre
Octubre
Noviembre
Diciembre
2000 2001 2002 2003
En el caso de las sustancias qumicas, las tinciones y los reactivos, pdanse las cantidades que se suelen usar en 3 meses, tomando en cuenta cualesquiera aumentos o disminuciones recientes en tales cantidades. Por ejemplo: En un ao se han usado 8 frascos de tincin de Giemsa Esto equivale a una medida de 2 frascos cada 3 meses Pdanse 2 frascos cada 3 meses ( 4 frascos cada 6 meses si los pedidos se elaboran dos veces al ao). FECHAS DE VENCIMIENTO Algunos reactivos (antisueros para grupos sanguneos, antgenos, etc.) se deben emplear antes que se cumplan sus fechas de vencimiento. Antense las fechas de vencimiento en las fichas de existencias.
Tabla 2.5 Registro de Hematologa a

Fecha Muestra no. Pacien te En Eritrocitos viado Concentracin b Concentracin Fraccin VSG Morfologa de Hb (g/l) por de No. de (mm/h) Volumen Dr M 117 23 ANS ++ POIQ + PMN ++ ANS ++ POIQ ++ HC ++ PMN + Fraccin deosc no. de Reticulocitos 124 10
-3
CHCMd (g/l)
Leucocitos Concentracin Fraccin de nmero de l os tipos de No. N L M E O
Paludismo
Otras Resultados pruebas enviados
en (fecha) 2.1.01
2.1.01
Sr R
4.2 10
0.48 0.35 0.13 0.04 Numerosos . trofozotos de P. falciparum 0.32 0.56 0.04 0.08 Moderado no de
trofozotos de P. falciparum
2.1.01
Sra L
Dr H
58
0.21
52
0.071 10 -3
276
5.7 109
2.1.01
Hb: Hemoglobina; VSG: Velocidad de Sedimentacin Globular; ANS: Anisocitosis; POIQ: Poiquilocitosis; PMN: Eritrocitos polimorfonucleares (?); HC: Hemates hipocrmicos; CHCM: Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media ; N: Neutrfilos; L: Linfocitos; M: Monocitos; E: Eosinfilos; O: Otros. a Para explicacin de los encabezados de columna, consulte las secciones pertinentes del texto. b La hemoglobina tambin puede ser expresada en funcin de la concentracin de la sustancia, el ttulo de la columna sera entonces Hb (Fe), concentracin de la sustancia (mmol / l). En ese caso, los valores citados en los dos ejemplos seran 7,3 y 3,6 mmol / l, respectivamente. c
En este ejemplo los reticulocitos se expresan como fraccin de nmero. Tambin se pueden expresar como concentracin de nmero, o sea su nmero por litro. A s, el encabezado de la columna sera concentracin de nmero de reticulocitos (x 109/l) y las cifras dependeran de las concentraciones de nmero de los eritrocitos (que no se indican en los ejemplos puestos en este cuadro).
d La concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos tambin se puede expresar como concentracin de sustancia; de este modo el encabezado de la columna sera Concentracin de Hemoglobina (Fe) Corpuscular media CHCM (Fe) (mmol/l). En este caso, el ejemplo que se cita (No. 2) tendra un valor de 17.1.
Tabla 2.6 Registro de qumica sangunea

Fecha Muestra no. 2.1.01 2.1.01 1 2 Paciente Sra W Sr G Enviado por Sala 1 Dr 1 W Urea, concentracin de sustancia (mmol/l) 12.8 Concentracin de Glucosa (mmol/l) 5.3 Otras pruebas (especificar) Resultados enviados en (fecha) 2.1.01 2.1.01
Tabla 2.7 Registro de anlisis de orina

Fecha Muestra no. 2.1.01 1 pH Paciente Enviado por Sr C Dr R 7.0 Examen microscpico directo Leucocitos (2030 por campo de alta resolucin), escasos cilindros hialinos Prueba de glucosa Negativo Protenas Pigmentos biliares NR Urobilingeno Cetonas NR Pruebas qumicas para sangre NR Otras pruebas Resultados (especificar) enviados en (fecha) NR 2.1.01
Negativo
NR
2.1.01
Sra E
Dr A
6.8 Leucocitos (510 por campo de alto aumento), escasas clulas epiteliales
+++
Negativo
NR
NR
NR
Prueba de embarazo: positiva
2.1.01
NR: Prueba no realizada; : negativo; +: positivo dbil; ++: moderadamente positivo +++: fuertemente positivo.
Tabla 2.8 Examen del LCR (en el registro de anlisis de orina o por separado)
Fecha Muestra no. 1 Paciente Envia do por Srta W Dr G Apariencia Examen microscpico Concentracin del no. de macroscpica directo leucocitos Turbio Gram: Abundantes leucocitos Escasos diplococos intracelulares Gram negativos NR 30 Concentracin de Glucosa (mmol/l) 1.5 Concentracin de Protenas totales (g/l) 0.45 Prueba de Pandy de las globulinas + Otras pruebas (especificar) Resultados enviados en (fecha) 2.1.01
2.1.01
Leucocitos tipo, no., fraccin: neutrfilos 0.94, linfocitos 0.06
17.1.01
Sr L
Dr C
Claro
3.3
0.25
Negativo
NR
17.1.01
Tabla 2.9 Registro de bacteriologa

Fecha 2.1.01 2.1.01 Muestra no. 1 2 Paciente Sr J Sra A Enviado por Dr R Muestra Esputo Pus de herida Pus uretral Examen solicitado Examen microscpico de frotis para tuberculosis Examen microscpico de frotis teido con Gram Examen microscpico de frotis teido con Gram Examen microscpico de frotis teido con Gram Resultados No se observan BAAR (bacilos cido - alcohol resistentes Abundantes leucocitos; escasos hemates; escasas clulas epiteliales; cantidad moderada de bacilos Gramnegativos Cantidad moderada de diplococos Gramnegativos intracelulares, incluyendo cocos gonoccicos Muy escasos leucocitos y clulas epiteliales; no se observan hemates ni microorganismos Resultados enviados en (fecha) 2.1.01 2.1.01
Sala Mdica 2
3.1.01
Sr L
Dr M
3.1.01
3.1.01
Sra R
Sala Mdica 1
LCR
3.1.01
Tabla 2.10 Registro de parasitologa Fecha Muestra

no. 2.1.01 1 Paciente Sr F Enviado Muestra provista por Dr A Heces Examen solicitado Parsitos intestinales Parsitos intestinales Resultados
Microscopia directa: Se observa cantidad moderada de huevos de Ascaris lumbricoides Microscopia directa: No se observan huevos ni parsitos. Tcnica de concentracin: No se observan huevos ni parsitos.
Resultados enviados en (fecha) 2.1.01
2.1.01
Srta M
Dr C
Heces
2.1.01
2.1.01 3.1.01
3 4
Sra L Sr S
Sala Cortes de Mdica 1 piel Dr R Heces
Oncocercosis Parsitos
No se observan parsitos Sangre oculta: Positivo Microscopia directa: Se observan numerosos trofozotos de Entamoeba histolytica y algunos huevos de Ancylostoma duodenale
3.1.01 3.1.01
Tabla 2.11 Registro de serologa Fecha

Muestra no. 3.1.01 3.1.01 1 2 Paciente Sra P Sra T Clnica prenatal Dr M Sangre Sangre
ELISA para la determinacin de Ac anti-HIV ELISA para la determinacin de Ac anti-HIV
Enviado por
Muestra
Examen solicitado
Resultados No reactivo Reactivo, 1 : 8
Resultados enviados en (Fecha) 3.1.01 3.1.01
ELISA: Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas; HIV: Virus de la Inmunodeficiencia humana; Ac: Anticuerpos
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Tabla 2.12 Muestra del informe mensual para un laboratorio de salud Nombre del laboratorio: Informe de fin de mes: REGISTRO DE LABORATORIO Nmero de exmenes realizados Hematologa (general) 1235 Qumica sangunea 27 Anlisis de orina: Examen directo 287 43 Qumica 17 Pruebas de embarazo Exmenes del LCR: Examen directo 3 3 Qumica Parasitologa: 162 Examen de heces 802 Examen de sangre Otros exmenes (por ej., examen de glndulas linfticas para tripanosomas) 2 Bacteriologa: 63 Tinciones de Gram 41 Tinciones cido-alcohol resistentes 11 Tinciones de Wayson Micologa 3 Serologa 114 Cualitativa 16 Cuantitativa Nmero de muestras enviadas a laboratorios especializados Agua para anlisis bacteriolgico 8 Muestras para cultivo bacteriolgico 32 Suero para serologa 0 Biopsias de tejidos 2 Otras muestras 0 REGISTRO DE ENFERMEDADES TRANSMISIBLES a Nmero de casos informados Exmenes bacteriolgicos Gonorrea 11 Lepra 0 Plaga 0 Tuberculosis 7 Exmenes parasitolgicos Amebiasis 14 Ascaridiasis 22 Filariosis 1 Ancilostomiasis 80 Paludismo 253 Oncocercosis 0 Esquistosomiasis 2 a La lista de enfermedades de notificacin obligatoria, vara de un pas a otro. Las autoridades centrales de salud pblica la formulan teniendo en cuenta: Los reglamentos internacionales para la notificacin de enfermedades transmisibles Las enfermedades prevalecientes en el rea
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3 PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO

Muchas enfermedades prevalecientes en los climas clidos son transmisibles y se propagan por grmenes que a menudo se pueden observar por medio del microscopio en muestras obtenidas de pacientes. Por lo tanto, la microscopia directa es indispensable en los laboratorios de los pases tropicales. Un laboratorio clnico sin microscopio, o con un microscopio que no se conserva de manera adecuada, no se puede considerar equipado con propiedad. 3.1 Uso de un microscopio El microscopio es un instrumento esencial para el diagnstico de una enfermedad. Es un instrumento de precisin que requiere un mantenimiento cuidadoso para evitar daos en las partes mecnicas y oculares y tambin para detener los hongos que producen oscurecimiento de las lentes. 3.1.1 COMPONENTES DE UN MICROSCOPIO Los diversos componentes del microscopio se pueden agrupar en cuatro sistemas: - El sistema de soporte - El sistema de aumento - El sistema de iluminacin - El sistema de ajuste. SISTEMA DE SOPORTE (Fig. 3.1) Este consiste en: - El pie (1) - El bastidor o brazo (2) - Portaobjetivo revlver giratorio (cambiador de objetivos) (3) - La platina (4) - La platina mecnica (5), que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjeto. SISTEMA DE AUMENTO (Fig. 3.2) Consiste en un conjunto de lentes. Las lentes del microscopio se encuentran montadas en dos grupos, uno en cada extremo de un tubo relativamente largo, o tubo del microscopio, el primer grupo de lentes se halla en el extremo inferior del tubo, inmediatamente arriba de la preparacin que se va a examinar (el objeto), y se denomina objetivo el segundo grupo se encuentra en el extremo superior del tubo, por donde mira el microscopista, y se llama ocular. LOS OBJETIVOS (a) Aumento El poder de aumento de cada objetivo se indica por un nmero grabado en la manga de la lente (Fig. 3.3): el objetivo x 10 aumenta 10 veces el objetivo x 40 aumenta 40 veces el objetivo x 100 aumenta 100 veces. (El objetivo x 100 generalmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin.) Algunos microscopios estn equipados con un objetivo x 3 o x 5 en lugar de un objetivo x 10. (b) La abertura numrica (AN) La AN tambin se halla grabada en la manga de la lente, junto a la indicacin del poder de aumento (Fig. 3.4); por ej. 0,30 en el objetivo x 10 --- 0,65 en el objetivo x 40 1,30 en el objetivo x 100 A medida que aumenta la AN es mayor el poder de resolucin (capacidad de hacer perceptibles detalles adyacentes muy cercanos, separndolos y aclarndolos) (vase a continuacin). (Adems, a medida que aumenta la AN disminuyen las dimensiones de la lente frontal montada en la base del objetivo. La lente frontal del objetivo x 100 tiene el tamao de una cabeza de alfiler, por lo que se debe manejar con cuidado.) (c) En la manga del objetivo puede haber varios nmeros: La longitud recomendada en mm para el tubo del microscopio (entre el objetivo y el ocular), es generalmente de 160 mm El grosor recomendado en mm para el cubreobjetos utilizado para tapar el portaobjetos, por ej., 0,16 o 0,17. Las roscas para atornillar todos los objetivos son uniformes, de manera que estos se pueden intercambiar en el revlver. (d) Distancia de operacin del objetivo Esta es la distancia que hay entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos cuando la imagen se encuentra enfocada. A medida que el poder de aumento del objeto es mayor disminuye la distancia de operacin (Fig. 3.5). objetivo x 10: la distancia de operacin es de 5 - 6 mm objetivo x 40: la distancia de operacin es de 0,5 -1,5 mm objetivo x 100: la distancia de operacin es de 0,15 - 0,20 mm (e) Poder de resolucin Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo ser ms clara la imagen y aumentar la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separndolos y aclarndolos.
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El poder de resolucin mximo de un buen microscopio de laboratorio mdico es, aproximadamente, de0,25 m (el poder de resolucin del ojo humano normal es de 0,25 mm). El aceite de inmersin aumenta el poder de resolucin al hacer que se conserven muchos rayos luminosos que se perderan por refraccin al usar un objetivo seco.
Ilustracin anexa A
Ilustracin anexa A Los componentes del microscopio ptico, bsicamente, pueden ser agrupados en 4 sistemas a) El sistema de soporte; b) El sistema de aumento; c) El sistema de iluminacin; d) El sistema de ajuste. Figura 3.1 Componentes del sistema de soporte de un microscopio: El pie o base (1); El bastidor o brazo (2); Portaobjetivo revlver giratorio (cambiador de objetivos) (3); La platina (4); La platina mecnica (5), que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjeto.
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Figura 3.2 Componentes del sistema de aumento de un microscopio.
Figura 3.3 Objetivos. Se muestran uno de x 10, otro de x 40 y uno de x 100. El objetivo de x 100 genralmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin. Figura 3.4 Apertura numrica (AN). La an tambin se halla graba en la manga de la lente, junto a la indicacin del poder de aumento, en este caso, en la figura es 1.30 (AN) en el objetivo x 100.
Figura 3.5 Distancia de operacin o trabajo del objetivo entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos. Esta distancia indica la longitud en la cual la imagen ya est enfocada. Ntese en la figura que a mayor aumento menor es la distancia con el portaobjetos.
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Ilustracin anexa B Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo ser ms clara la imagen y aumentar la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separndolos y aclarndolos. El poder de resolucin mximo de un buen microscopio de laboratorio mdico es, aproximadamente, de 0,25 m (el poder de resolucin del ojo humano normal es de 0,25 mm). El agregado de aceite de inmersin aumenta el poder resolutivo. Obsrvese los puntos dentro de los crculos, la distancia de separacin entre ambos puntos que puede ser percibida a distintos poderes resolutivos. Con uno menor a 0,25 m los puntos aparecen muy cercanos, casi juntos, sin apreciarse separacin entre ellos. EL OCULAR Aumento El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular (Fig. 3.6): Un ocular x 5 aumenta 5 veces la imagen que produce el objetivo Un ocular x 10 aumenta la imagen 10 veces. Si la imagen del objeto se hace aumentar 40 veces mediante el objetivo x 40 y en seguida 5 veces mediante el ocular x 5, el aumento total ser de 5 x 40 = 200. Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, multiplquese el poder de aumento del objetivo por el del ocular. El poder de aumento de los microscopios utilizados en los laboratorios mdicos oscila entre 50 y 1000. Ciertos oculares tienen una retcula calibrada. Estos oculares se utilizan para medir el tamao de un objeto bajo el microscopio (por ejemplo, los quistes de protozoarios). Microscopios binoculares Los microscopios binoculares (que poseen dos oculares, pero solo se usa un objetivo en cada ocasin) fatigan menos los ojos cuando se deben realizar exmenes prolongados. Sin embargo, la iluminacin elctrica es esencial para el objetivo x 100. EL SISTEMA DE ILUMINACIN 1. La fuente luminosa De preferencia se emplear luz elctrica, pues es ms fcil de ajustar. Puede proporcionarla una lmpara contenida en el microscopio por debajo de la platina o mediante una lmpara exterior colocada frente al microscopio. De lo contrario se podr utilizar la luz del da. El microscopio nunca se debe utilizar ni debe permanecer bajo la luz directa del sol. Deber estar bien iluminado, pero se usar una luz amortiguada. Si la luz del sol es excesivamente brillante se colocar frente al microscopio una botella o redoma de vidrio claro, llena de agua, a fin de reducir la intensidad de la luz. 2. El espejo El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Por un lado su superficie es plana y cncava por el otro (Fig. 3.7). El lado cncavo constituye un condensador de escaso poder y no se debe usar si ya se cuenta con un condensador propiamente dicho. 3. El condensador El condensador (Fig. 3.8) lleva los rayos luminosos a un foco comn sobre el objeto que se habr de examinar. Se encuentra colocado entre el espejo y la platina. Se puede elevar (iluminacin mxima) y bajar (iluminacin mnima). Se debe centrar y ajustar adecuadamente. 4. El diafragma El diafragma (Fig. 3.9), que se encuentra dentro del condensador, se utiliza para reducir o ampliar el ngulo, y, por lo tanto, tambin la cantidad de luz que entra en el condensador. Cuanto ms se abre el diafragma ms se ampla el ngulo y en consecuencia aumenta la AN y se pueden observar detalles ms pequeos. Sin embargo, al mismo tiempo se reduce el contraste. Filtros En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (principalmente azules) debajo del condensador. Se pueden dejar en su sitio o quitarlos, segn el tipo de preparacin que se vaya a observar. EL SISTEMA DE AJUSTE (Figs. 3.10 y 3.11) Este sistema comprende:
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La cremallera de avance rpido o tornillo macromtrico El tornillo micromtrico de avance lento El tornillo de ajuste del condensador Los tornillos para centrar el condensador El elevador del diafragma iris Reguladores de la platina mecnica 1. La cremallera de avance rpido Es el tornillo mayor. Se utiliza primero para lograr la aproximacin del enfoque. Tambin, es llamado Macromtrico. 2. El tornillo micromtrico de avance lento Hace que el objetivo se desplace ms lentamente. Se emplea para conseguir un enfoque perfecto del objeto. 3. El tornillo de ajuste del condensador Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminacin o descenderlo y reducir la iluminacin. 4. Los tornillos para centrar el condensador Puede haber tres tornillos colocados alrededor del condensador: uno al frente, uno a la izquierda y uno a la derecha. Se usan para centrar el condensador exactamente en relacin con el objetivo. 5. El elevador del diafragma iris Este es un pequeo elevador que se encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando as el ngulo y la intensidad de la luz. 6. Reguladores de la platina mecnica Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la platina (vase Fig. 3.11): 1 tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia adelante 1 tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.
Figura 3.6 Un ocular.
Figura 3.7 Un espejo de microscopio.
Figura 3.8 Un condensador.
Figura 3.9 Un diafragma.
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Fig. 3.11 Figura 3.10 Sistema de ajuste del microscopio. 1) Tornillo de avance rpido o tornillo macromtrico; 2) Tornillo micromtrico de avance lento; 3) Tornillo de ajuste del condensador; 4) Tornillos para centrar el condensador; 5) Elevador del diafragma iris. Figura 3.11 6) Reguladores de la platina mecnica Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la platina. Un tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia delante, un tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha (vanse las flechas). 3.1.2 CONFIGURACIN Y PREPARACIN DEL MICROSCOPIO Cuando se recibe un nuevo microscopio en el laboratorio es importante saber cmo prepararlo. 1. Posicin del microscopio Coloque el microscopio sobre una mesa firme, de nivel uniforme (compruebe con un nivel de burbuja) y tamao adecuado, pero no demasiado alta. Si se va a usar iluminacin elctrica el microscopio deber estar a la sombra, lejos de las ventanas. Debajo del microscopio coloque una pieza cuadrada de fieltro. Si no se dispone de fieltro utilice una pieza de tela gruesa. MONTAJE DE UNA LMPARA PARA EL MICROSCOPIO Si se dispone de un microscopio con espejo se podr armar una lmpara que le proporcione iluminacin. En una base de madera se montar un soporte de porcelana para bombillas incandescentes y se encerrar este conjunto en una caja de madera u hojalata con una abertura para que salga la luz (Fig. 3.12). branse ranuras en la tapa de la caja a fin de evitar que la bombilla se caliente demasiado, y al mismo tiempo se facilita su enfriamiento. Tambin se puede fijar una hoja plegadiza encima de la abertura de la caja, que sirva de postigo (Fig. 3.13). sese una bombilla opaca del tipo "luz de da" (azul-blanco): de 60 vatios para microscopios monoculares de 100 vatios para microscopios binoculares. 2. Colocacin de los accesorios Atornille los objetivos en el revlver en el sentido de las manecillas del reloj y en el siguiente orden: (objetivo x 3 x 5) -- objetivo x 10 objetivo x 40 objetivo x 100 (para inmersin en aceite). Las roscas para atornillar los objetivos son estndar. Coloque en su sitio el ocular o los oculares. Fije el condensador debajo de la platina. Fije el espejo en el pie del microscopio. 3. Posicin de la lmpara Si se va a usar iluminacin elctrica ponga la lmpara a una distancia de 20 cm al frente del microscopio, por delante del espejo, que se colocar en un ngulo de 45. Cubra el espejo con una pieza de papel. Ajuste la posicin de la lmpara de manera que la luz brille en el centro del espejo (Fig. 3.14). Si la lmpara est provista de una lente, los filamentos del bombillo se proyectan sobre la pieza de papel con que se ha cubierto el espejo. Esto permite centrar el haz luminoso con mayor precisin. En algunos modelos se hace girar el bombillo hasta que se obtiene una imagen clara del filamento 4. Ajuste preliminar del espejo Utilice el lado plano del espejo. Quite, si los hay, los filtros de colores. Abra el diafragma iris hasta el mximo. Eleve el condensador. Coloque una pieza de papel blanco de poco espesor sobre la lente de la cpula del condensador. En esta pieza de papel se deber observar una imagen del bombillo elctrico, rodeada por un crculo de luz (Fig. 3.15).
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Ajuste el espejo de manera que la imagen del bombillo quede exactamente en el centro del crculo luminoso (Fig. 3.16), (o bien, si se utiliza la luz del da, que quede en el centro la porcin ms brillante). 5. Pasos a seguir para centrar el condensador (cuando existe el mecanismo pertinente) Es muy importante centrar correctamente el condensador. Este aspecto se descuida con frecuencia. a) Coloque en la platina una preparacin en su correspondiente portaobjetos, sin cubreobjetos. Haga descender el condensador. Abra el diafragma iris. Examine con el objetivo de menos poder (x 3, x 5 x 10). Observe la preparacin a travs del ocular y enfquese. b) Cierre el diafragma. En el campo microscpico aparecer un crculo borroso de luz rodeado por un anillo oscuro (Fig. 3.17). c) Eleve el condensador lentamente hasta que los bordes del crculo luminoso estn claramente enfocados (Fig. 3.18). d) Ajuste, si es necesario, la posicin del espejo, de manera que el crculo luminoso quede centrado exactamente o sobrepuesto al rea clara que est rodeada por la zona oscura (Fig. 3.19). e) Por medio de los tornillos para centrar el condensador haga los ajustes necesarios hasta que el crculo luminoso se halle exactamente en el centro del campo microscpico (Fig. 3.20). Repita esta operacin con los dems objetivos. 6. Ajuste del diafragma Abra el diafragma completamente. Retire el ocular y observe directamente a travs del tubo del microscopio; la lente superior del objetivo aparecer llena por un crculo luminoso. Cierre el diafragma lentamente hasta que este crculo luminoso ocupe solo 2 /3 de la superficie (Fig. 3.21). Repita esta operacin al usar cada objetivo. 7. Ajuste de los oculares Eleccin del ocular Los oculares x 5 x 10 proporcionan resultados satisfactorios en el laboratorio mdico. Si se utilizan oculares de mayor poder se intensificar el aumento, pero es probable que no se observen mejor los detalles. El ocular que se use depender de la eleccin que se haga. Ajuste binocular En los microscopios binoculares la distancia interpupilar (distancia entre las pupilas de los ojos) se puede ajustar segn la conveniencia del operador. Enfoque de los ojos derecho e izquierdo Uno de los soportes de los oculares (casi siempre el izquierdo) est provisto de un anillo para enfoques (Fig. 3.22). Si este anillo se encuentra en el soporte del ocular izquierdo, cierre el ojo izquierdo y, empleando el objetivo x 40, enfoque la imagen para el ojo derecho por el ocular derecho. A continuacin cierre el ojo derecho y observe con el ojo izquierdo a travs del ocular izquierdo. Si la imagen se encuentra enfocada no se necesitar ajuste alguno. Si la imagen no es clara, haga girar el anillo de enfoque hasta aclararla. En este momento el microscopio habr quedado ajustado de acuerdo con la visin binocular propia del operador.
Figura 3.12 Montando una lmpara para el microscopio. Figura 3.13 Fuente alternativa de luz para el microscopio.
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Figura 3.14 Ajustando la posicin de la fuente de luz
Figura 3.15 Ajuste del espejo. Figura 3.16 Imagen de la fuente de luz, como se ve a travs del condensador.
Figura 3.17 Para centrar el condensador, primero cierre el diafragma. Figura 3.18 Eleve el condensador hasta los bordes del crculo de luz estn en foco. Figura 3.19 Ajuste la posicin del espejo al centro de la fuente de luz. Figura 3.20 Use los tornillos de centrado del condensador al centro de la fuente de luz.
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Figura 3.21 Ajuste del diafragma. Figura 3.22 Enfoque de los oculares. 3.1.3 ENFOQUE DEL OBJETIVO 1. Empleo de un objetivo de bajo poder (x 10) Descienda el condensador completamente. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de la preparacin que se encuentra en el portaobjetos. Utilizando la cremallera de avance rpido eleve el objetivo hasta que observe una imagen clara a travs del ocular. En algunas ocasiones no se puede lograr una imagen clara a pesar de que el objetivo se ha bajado todo lo posible. Esto obedece a que el tornillo micromtrico de avance lento se ha girado completamente hacia la derecha. Gire este tornillo hacia la izquierda hasta donde sea posible y a continuacin busque el enfoque subiendo el objetivo. Si la iluminacin es insuficiente suba el condensador ligeramente. 2. Empleo de un objetivo de gran poder (x 40) Baje el condensador hasta la mitad de la distancia que recorre. Descienda el objetivo hasta colocarlo inmediatamente por arriba de la preparacin que se encuentra en el portaobjetos (la distancia de operacin es muy corta: aproximadamente 0,5 mm). Por medio de la cremallera de avance rpido eleve el objetivo muy lentamente hasta que aparezca una imagen borrosa en el campo microscpico. Busque el enfoque por medio del tornillo micromtrico de avance lento. Eleve el condensador para obtener suficiente iluminacin. Si el microscopio no tiene condensador utilice el lado cncavo del espejo. 3. Empleo del objetivo de inmersin en aceite (x 100) Se deben utilizar preparaciones teidas completamente secas. Ponga una pequea gota de aceite de inmersin sobre la porcin que se va a examinar (de preferencia use aceites sintticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro, que se seca rpidamente). Eleve el condensador hasta donde pueda llegar y abra completamente el diafragma iris. Descienda el objetivo x 100 hasta que se ponga en contacto con el aceite. Acerque el objetivo al portaobjetos hasta donde sea posible, pero evite que presione la preparacin (los objetivos modernos estn provistos de un amortiguador). Observe a travs del ocular y gire hacia arriba, muy despacio, el tornillo micromtrico de avance lento hasta que la imagen se encuentre enfocada. Si la iluminacin es inadecuada utilice el lado cncavo del espejo como se ha recomendado para el objetivo x 40. Importante: En la mayora de los microscopios actuales no se sube o baja el soporte del objetivo, sino la platina que se mueve por medio de la cremallera de avance rpido y el tornillo micromtrico de avance lento. En este caso los tornillos se deben girar en direccin opuesta para enfocar la imagen. Profundidad del campo microscpico Cuando se usa un objetivo de escaso poder se puede observar la profundidad de la imagen. En estas condiciones la profundidad del enfoque es pequea y la impresin que se obtiene de ella aumenta al emplear objetivos de mayor poder (x 40, x 100); se debe usar el tornillo micromtrico de avance lento para examinar todos los detalles del objeto observado, de arriba abajo del enfoque (por ejemplo, los diferentes ncleos de un quiste amebiano esfrico). 4. Imgenes que se observan mediante el microscopio Recuerde que el crculo luminoso que se observa a travs del ocular se denomina "campo microscpico". Cmo determinar la posicin de los objetos observados
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Los objetos que se observan en el campo microscpico se pueden localizar en relacin con las manecillas del reloj. Por ejemplo, en la ilustracin se ha colocado un huevo de esquistosoma "a las 2" (Fig. 3.23). Inversin de las imgenes Las imgenes son invertidas por las lentes: los objetos que aparecen en el fondo del campo microscpico se encuentran realmente en la parte ms alta los objetos que aparecen en el lado izquierdo del campo microscpico se encuentran realmente en el lado derecho. Desplazamiento del objeto Si mueve el portaobjetos hacia la derecha, el objeto examinado se desplazar hacia la izquierda. Si mueve el portaobjetos hacia usted, el objeto examinado se alejar (Fig. 3.24). Cambio de los objetivos Los microscopios modernos estn construidos de tal manera que cuando se cambia de un objetivo de escaso poder a otro de mayor poder para examinar el mismo objeto, ste permanece ms o menos enfocado. Si no ocurre as, suba el revlver antes de hacer el cambio aun objetivo de mayor poder y enfoque nuevamente. Antes de cambiar los objetivos cercirese de que el objeto examinado se encuentra en medio del campo microscpico, a fin de no perderlo despus del cambio.
Figura 3.23 El establecimiento de la posicin de las imgenes vistas bajo el microscopio. Ntese que se dispone el campo microscpico como un reloj de agujas, con las horas para indicar la posicin de un determinado elemento que se quiere ubicar para orientarse. Por ej., en la imagen se observa un huevo de esquistosoma a las 2 horas. En el campo no existen estos nmeros sino que Ud. los tiene que imaginar. Figura 3.24 Al mover el objeto hacia el operador el objeto se aleja, si lo mueve hacia la derecha, ste se mueve a la izquierda. Adems, los objetos que aparecen en el fondo del campo microscpico se encuentran realmente en la parte ms alta. 3.1.4 USO DE UN MICRMETRO OCULAR El tamao de los microorganismos o las subestructuras de los organismos puede ser medido por microscopa utilizando un ocular con un disco micrmetro calibrado. El disco micrmetro tiene una escala que se suele dividir en 0,1 -mm y 0,01 -mm de subdivisiones (Fig. 3.25). Un micrmetro de platina se utiliza para calibrar el micrmetro ocular.
Figura 3.25 Un disco micrmetro ocular Figura 3.26 Calibraciones de un micrmetro ocular con un micrmetro de platina
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Materiales Microscopio Binocular Ocular con un aumento de x 10 Disco micromtrico ocular Micrmetro de platina Papel lente Aceite de inmersin. MTODO 1. Desenroscar la lente del ojo del ocular. 2. Coloque el micrmetro con escala grabada con la cara hacia abajo en el ocular. Utilice papel de lente para manejar el disco. 3. Vuelva a colocar el lente con cuidado. 4. Coloque el ocular con el micrmetro en el tubo ocular del microscopio. 5. Ponga el micrmetro calibrado sobre la platina del microscopio y se centran en la escala. Usted debe ser capaz de distinguir claramente las subdivisiones 0,1-mm y 0,01 mm. 6. Ajustar el micrmetro de platina de manera tal que la lnea 0-mm coincida con la lnea 0-mm del micrmetro ocular. 7. Mire para otro conjunto de lneas, donde la escala del micrmetro de platina coincida con la de la micrmetro ocular. Este conjunto de lneas debe estar lo ms lejos de la lnea 0-mm como sea posible (Fig. 3.26). La distancia entre los dos conjuntos coincidentes de las lneas vara, dependiendo del aumento del objetivo del microscopio. 8. Contar el nmero de subdivisiones en 0,1-mm de la escala del micrmetro de platina entre la lnea 0 y el segundo conjunto de lneas coincidentes. 9. Cuente el nmero de subdivisiones de la escala del micrmetro ocular entre el 0-lnea y el segundo conjunto de lneas coincidentes. 10. Calcular la proporcin de un milmetro que se mide por una unidad ocular sola utilizando la siguiente frmula: lectura de la platina (mm) x 1000 m unidades ocular (m) lectura del ocular x 1 mm Ejemplo Para un microscopio con un objetivo de alta potencia (40 aumentos), el clculo es como sigue: 0,1 mm x 1000 m 2 m 50 unidades x 1 mm Importante: los objetivos correspondientes no deben ser cambiados por un objetivo calibrado, sino que deben ser calibrados por separado. El ocular que contiene el disco micrmetro debe almacenarse hasta que se necesite. Cada microscopio que se va a utilizar para medir el tamao de los organismos debe ser calibrado individualmente. 3.1.5 MICROSCOPA DE CAMPO OSCURO Para obtener un campo oscuro se utiliza un condensador especial con un centro oscuro. Si esto no est disponible, es posible obtener un campo oscuro bajo los objetivos x10 y x40 mediante la insercin de un disco o un tope en el soporte del filtro por debajo del condensador. Los topes deben estar hechos de un material a travs del cual la luz no puede pasar y deben ser del tamao correcto para el objetivo en uso. Si el tope es demasiado pequeo, demasiada luz pasar al objetivo y un campo oscuro no se obtendr. Si el tope es demasiado grande, estar disponible una luz insuficiente para iluminar la muestra. 3.1.6 MANTENIMIENTO RUTINARIO Los Microscopios deben ser instalados en un entorno limpio, alejado de productos qumicos. Los lugares de trabajo deben estar bien ventilados o en lugar con aire acondicionado permanente (el uso intermitente de los acondicionadores de aire produce agua condensada). El microscopio requiere atencin diaria para mantenerlo en buen estado de funcionamiento y de esta manera garantizar resultados confiables de laboratorio. Los instrumentos pticos no deben mantenerse durante largos perodos en compartimentos cerrados ya que estas condiciones tambin favorecen el crecimiento de hongos que pueden corroer las superficies pticas. Se requiere especial cuidado en climas clidos y hmedos. LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO Los microscopios se utilizan para investigar los tejidos y fluidos biolgicos y por lo tanto deben ser descontaminados a intervalos regulares. Materiales 1. Piezas de trapos viejos y un pauelo fino, de lino, que estn limpios 2. Papel de seda especial para lentes o, en su defecto, papel blanco absorbente (papel de tocador) 3. Si es posible, una pieza de piel de gamuza (de lo contrario, un trapo que no desprenda pelusa) 4. Un frasco pequeo de solucin de limpieza (vase despus) 5. Una cubierta de material plstico 6. Una pequea pera de goma y, si es posible, un pincel fino de pelo de camello (o una brocha especial para limpiar lentes o un soplador para limpiar lentes) 7. En los climas clidos y hmedos, En laboratorios que cuentan con electricidad: un armario que est templado, se calienta mediante uno o dos bombillos incandescentes de 40 vatios En los laboratorios que no cuentan con electricidad:
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si es posible, un secador de 15 - 20 cm de dimetro, con no menos de 250 g de gel de slice azul (que indica la existencia de humedad al tomar un color rojizo). Mtodo Limpieza de las superficies pticas Las superficies pticas (condensador, los objetivos y oculares) debe mantenerse libre de polvo con un pincel fino, un pincel suave de pelo de camello (Fig. 3.27) o un soplador. Si el polvo se encuentra dentro del ocular, desenroscar la lente superior y limpie el interior. Los residuos de aceite en las lentes deben eliminarse con papel especial para lentes, papel absorbente o algodn de grado mdico. Las superficies pticas pueden ser finalmente limpiadas con una solucin especial, que consiste en lo siguiente: - 80% de ter de petrleo (punto de ebullicin 60-80 C) - 20% de 2-propanol. Nota: No utilizar 95% de etanol, xileno o tolueno para la limpieza de las lentes, ya que estas sustancias disuelven el cemento. Ellos pueden, sin embargo, utilizarse para la limpieza de espejos. Limpieza del instrumento La contaminacin en exceso puede ser eliminada con soluciones jabonosas suaves. La grasa y el aceite se pueden eliminar con la solucin de limpieza especial descritos anteriormente. El instrumento debe ser limpiado con una mezcla 50:50 de agua destilada y 95% de etanol. Esta mezcla no es adecuada para la limpieza de las superficies pticas. Las partes mecnicas (tornillo de ajuste grueso o macromtrico, tornillo de ajuste fino o micromtrico, enfoque del condensador y la platina mecnica) debern ser peridicamente limpiadas y lubricadas con aceite de mquina para que funcionen libremente. Mantenimiento del microscopio Al llevar a cabo los procedimientos de Figura 3.27 Limpieza de los objetivos usando un reparacin y mantenimiento, tenga cuidado de pincel suave de pelo de camello. no confundir los tornillos del centrado del condensador con los tornillos de sujecin del condensador. Para mantener el microscopio proceder de la siguiente manera: Verifique la platina mecnica. Compruebe el mecanismo de enfoque. Retire el crecimiento de hongos. Revise el diafragma. Limpie todas las piezas mecnicas. Lubricar el microscopio de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Compruebe la carga del resorte de la pinza que sujeta los portaobjetos. Un exceso de tensin puede provocar la rotura de los portaobjetos y daar la pinza. Compruebe la alineacin ptica. Un aspecto oscuro de la muestra es a menudo debido a una mala alineacin de las piezas pticas, ms que la falta de luz. Precauciones Nunca sumergir los objetivos en xileno o etanol, ya que esto puede provocar que las lentes se desprendan. Nunca use papel ordinario para limpiar las lentes. Nunca toque las lentes con los dedos. Nunca limpie el soporte o la platina con xileno o acetona. Nunca limpie las lentes del interior de los oculares y objetivos con tela o papel (esto puede quitar la capa anti-reflectante), el uso de un pincel suave de pelo de camello, un pincel fino o un soplador en su lugar. Nunca deje el microscopio sin los oculares a menos que las aberturas estn tapadas. Nunca mantenga el microscopio en una caja cerrada de madera en los pases hmedos y calientes. No pulse nunca el objetivo al portaobjeto, ya que tanto el portaobjeto y el objetivo se puede romper. Tenga cuidado al enfocar el microscopio. Mantenga limpia la platina mecnica. No desmonte los componentes pticos, ya que esto puede causar desalineacin. Las superficies pticas deben limpiarse con papel para lentes de limpieza o un pauelo de papel suave. Nunca ponga el microscopio alejado con aceite de inmersin sobre el objetivo. Quite todo el aceite todos los das. Una solucin de jabn suave es adecuada para la mayor parte de la limpieza. Utilizar disolventes orgnicos slo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Nunca lleve el microscopio por el brazo con una mano; utilice ambas manos, una en el pie, la otra sosteniendo el brazo o bastidor. Al cambiar una lmpara, evite tocar la lente con los dedos, ya que las huellas dactilares reducen la intensidad de la iluminacin. (A veces, en algunos microscopios modernos con luz
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incorporada, la lmpara viene con dos electrodos que se colocan directamente, pero stos as como la lmpara, si son tocados con los dedos de la mano pueden quemarse directamente debido a que los afecta la grasa de los dedos, entonces, deben ser acarreados envueltos en un papel absorbente y manipulados con guantes de goma). Para maximizar la vida til de las lmparas, ajustar el voltaje con un regulador de intensidad para dar la menor intensidad de luz requerida. Si la tensin de la red vara excesivamente, utilizar un estabilizador de tensin. Precauciones adicionales que deben tomarse en climas clidos Los climas secos En climas clidos y secos, el principal problema es el polvo. Las partculas finas se abren camino en las roscas de los tornillos y en las lentes. Esto se puede evitar del siguiente modo: Siempre mantenga el microscopio bajo una cubierta de plstico hermticamente cerrada cuando no est en uso. Al final de la jornada de trabajo, limpie a fondo el microscopio soplando aire sobre ella con una perilla de goma. Terminar la limpieza de las lentes con un pincel suave de pelo de camello, un pincel fino o un soplador. Si las partculas de polvo permanecen en la superficie del objetivo, se limpia con un papel especial para lentes. Climas hmedos En climas calientes y hmedos y durante la temporada hmeda en climas clidos y secos, los hongos pueden crecer en el microscopio, particularmente en la superficie de las lentes, en las ranuras de los tornillos y debajo de la pintura, y el instrumento pronto ser intil. Esto se puede evitar, como se describe a continuacin. Siempre mantenga el microscopio bajo una cubierta de plstico hermticamente cerrada cuando no est en uso, junto con un plato lleno con slice azul para secar el aire debajo de la tapa. (La slice se vuelve rojo cuando se ha perdido su capacidad de absorber la humedad del aire. Puede ser simplemente regenerado mediante calentamiento en un horno de aire caliente o sobre un fuego.) El microscopio debe ser limpiado diariamente para eliminar el polvo. Estos procedimientos deben llevarse a cabo con regularidad, y son esenciales en relacin con los procedimientos de reparacin y mantenimiento. 3.2 PESAJE: EL USO DE BALANZAS DE LABORATORIO Las balanzas pueden ser elctricas o manuales. Todos los tipos se deben colocar en una mesa firme y nivelada lejos de las vibraciones, corrientes de aire y la luz solar directa. La balanza se utiliza para pesar productos qumicos para la produccin de reactivos, y la limpieza es esencial si se desea obtener resultados precisos: Quite el polvo soplando o con un cepillo suave. Elimine los tintes o los productos qumicos con un cepillo suave. Utilice una cpsula de pesaje de plstico o un papel de filtro para pesar los productos qumicos en la balanza, nunca coloque directamente productos qumicos en el plato. Importante: Si ha utilizado agua para limpiar la balanza, asegrese de que est completamente seco antes de pesar. Siempre poner la balanza a cero antes de pesar. Compruebe la precisin de la balanza regularmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Maneje las pesas sueltas con pinzas. 3.2.1SENSIBILIDAD DE LA BALANZA La sensibilidad de la balanza corresponde a la masa ms pequea que desplace el fiel una divisin en la escala de medicin. Por ejemplo, si la sensibilidad de la balanza es de 1 mg se necesitar por los menos una masa de 1 mg para desplazar el fiel. Para los fines habituales del laboratorio se puede considerar que la sensibilidad de una balanza es la masa ms pequea que esa balanza puede pesar con precisin. 3.2.2 BALANZA ABIERTA DE DOS PLATILLOS (Fig. 3.28) Esta balanza cuenta con dos platillos que reposan en sendas columnas. Puede estar construida para usarse con pesos separados, como la balanza que figura en la ilustracin (Fig. 3.29), o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza (balanza suelta de Harvard). Se emplea para pesar cantidades grandes (hasta varios kg) cuando no se necesita una gran precisin; por ejemplo: 22,5 g, 38 g, 8,5 g, 380 g. Sensibilidad: 0,5 g (500 mg). Si los platillos han sido fabricados con un material que se pueda rayar o corroer fcilmente, protjanse con discos recortados en piezas de material plstico resistente o pelculas para rayos X usadas, que tengan pesos iguales.
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Figura 3.28 Una balanza abierta de dos platillos. Figura 3.29 Juego de pesas (en gramos) para usar con una balanza abierta de dos platillos.
PROCEDIMIENTO PARA PESAR CON LA BALANZA DE DOS PLATILLOS ABIERTA
1. Coloque a la izquierda de la balanza el recipiente que contenga la sustancia que va a pesar. 2. Coloque en el platillo izquierdo el receptculo (papel doblado o plato pequeo) en que se pesar la sustancia. 3. Coloque en el platillo derecho las pesas equivalentes al peso del receptculo ms el de la cantidad de sustancia que se va a pesar. 4. Para medir la sustancia que se va a pesar: con la mano izquierda sostngase el recipiente inclinado hacia abajo (con la etiqueta hacia arriba) con la mano derecha golpese muy suavemente el cuello del recipiente de modo que el polvo o los cristales que se van a pesar caigan poco a poco en el receptculo (Fig. 3.30). utilice una esptula limpia cuando se pesan pequeas cantidades de las sustancias. 5. Inmediatamente despus de que se haya pesado la sustancia coloque el recipiente a la derecha de la balanza (Fig. 3.31). De este modo: las sustancias que se han pesado quedarn a la derecha de la balanza las sustancias que no se han pesado estarn a la izquierda. Esto evita confusiones. 6. Lea la etiqueta tres veces: antes de retirar el recipiente de su anaquel mientras se pesa la sustancia (la etiqueta deber estar hacia arriba) despus de pesar la sustancia, ponga el recipiente a la derecha de la balanza
Ilustracin anexa A Colocar a la izquierda el frasco con la droga a pesar. En el platillo izquierdo poner el pael doblado o receptculo donde se pondr la sustancia a pesar. En el platillo derecho se colocan las pesas.
Ilustracin anexa A
Figura 3.30 Medicin de la sustancia a ser pesada. Colocando la droga en un papel de filtro. Figura 3.31 Mantenga las sustancias pesadas y sin pesar aparte separadas para evitar la confusin.
Ilustracin anexa B Lea la etiqueta tres veces durante todo el proceso: antes, durante y despus de pesar.
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Ilustracin anexa C Imgenes que muestran cpsulas de pesaje plsticas usadas para colocar las drogas a pesar. 3.2.3 BALANZA ANALTICA Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de un astil (viga transversal) dentro de un estuche de vidrio. La balanza analtica se emplea: para pesar cantidades pequeas (hasta 20 200 g, dependiendo del modelo) cuando se requiere gran precisin; por ejemplo, 3,85 g, 0,220 g, 6,740 g. Sensibilidad: 0,5 mg - 0,1 mg, dependiendo del modelo COMPONENTES DE LA BALANZA ANALTICA (Fig. 3.32) A= astil. Esta es la estructura de que se suspenden los platillos. AC = aristas de los cuchillos (AC1, AC2, AC3). Sostienen el astil en el fulcro durante el tiempo que se determina el peso y proporcionan sensibilidad a la balanza. Las aristas que se encuentran en el astil sostienen los platillos suspendidos. E = estribos (El, E2). F= fiel. P = platillos. T = tornillo liberador del astil (o sujetador de los platillos). Detiene el movimiento de los platillos de modo que la adicin sbita de pesas o de sustancias qumicas no dae las delicadas aristas de los cuchillos. TA = tornillos de ajuste (TA1, TA2). Solo se usan para ajustar inicialmente la balanza al cero sin carga.
Fig. 3.32 Figura 3.32 Componentes de la balanza analtica. AC1, AC2, AC3: Aristas de los cuchillos; A: Astil; E1, E2: Estribos; TA1, TA2: Tornillos de ajuste; F: Fiel; P: Platillos; T: Tornillo liberador del astil (o sujetador de los platillos). Figura 3.33 La figura muestra un juego de pesas para usar con la balanza analtica. INSTRUCCIONES PARA USAR LA BALANZA ANALTICA 1. El astil siempre se deber encontrar en descanso (con el tornillo liberador apretado) antes de que se coloquen en los platillos las pesas y la sustancia que se va a pesar. 2. El astil siempre deber quedar nuevamente inmvil antes de retirar de los platillos las pesas y la sustancia que se ha pesado. 3. Coloque siempre la sustancia que va a pesar sobre una pieza de papel doblada cuatro veces, o bien en un cristal cncavo (de reloj) o un platillo de porcelana. 4. Utilice siempre pinzas para recoger las pesas.
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5. Compruebe que los platillos se encuentran equilibrados aflojando el tornillo liberador del astil despus de cerrar el estuche de vidrio. 6. Use los tornillos de ajuste TA1 y TA2 para lograr un equilibrio perfecto compensando el peso del receptculo en que se ha colocado la sustancia que se va a pesar. Cuando estos tornillos se giran hacia afuera del soporte central aumenta el peso. Cuando se giran hacia adentro del soporte central el peso disminuye. 3.2.4 BALANZA DE DISPENSARIO (Fig. 3.34) Esta balanza tambin est provista de dos platillos suspendidos, pero carece de estuche de vidrio y el astil no tiene brazo de soporte. Sensibilidad: 5 -1 0 mg La balanza de dispensario es ms exacta que la balanza abierta de dos platillos, pero solo puede pesar hasta 50 g. (Despus de usarla, guarde la balanza en una alacena cerrada.) Juego de pesas para usarse en la balanza analtica. Pesas sueltas: 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 500 g. Pesas fraccionarias sueltas: 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 y 500 mg
Figura 3.34 Una balanza de dispensario.
AGREGADO:
BALANZAS ELECTRNICAS DE PRECISIN En la actualidad tambin se usan estas balanzas electrnicas de un solo plato abiertas o adicionalmente se les puede colocar un estuche protector de vidrio o plstico transparente para evitar la accin del aire. Funcionan con electricidad, y en algunos modelos a pilas. Han avanzado en el terreno del pesaje ganando lugar por su practicidad, bajo costo, y fcil funcionamiento. Quizs en algunos lugares todava no est al alcance, pero en muchos otros ya lo est, especialmente en centros de salud perifricos de algunos pases hispanoamericanos que disponen de acceso a la red elctrica. Si no hay electricidad se usan las pilas en los modelos que permiten usarlas. Alcanzan sensibilidades bastante buenas, la suficiente como para pesar las cantidades usadas habitualmente en los laboratorios. Si bien, una balanza analtica de precisin electrnica tiene mayor sensibilidad, no est al alcance de todos por el precio abultado. En estas condiciones, estas balanzas como las mostradas en las figuras, cumplen y suplen la funcin de una balanza analtica aunque con limitaciones de sensibilidad, pero prcticas para las necesidades bsicas de un laboratorio de salud perifrico.
3.3 CENTRIFUGACIN 3.3.1 PRINCIPIO Fuerza centrfuga La fuerza centrfuga hace que un cuerpo se ponga en movimiento circular a gran velocidad (Fig. 3.35). De este modo se genera una fuerza que aleja este cuerpo del centro del crculo; se llama fuerza centrfuga (g) o fuerza centrfuga relativa (FCR). Al usar una centrfuga se deben respetar las instrucciones del fabricante.
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Para calcular la fuerza centrfuga relativa (FCR) o (g) de una centrifuga individual, medir el radio (r) del brazo del rotor (en cm) y el nmero de revoluciones por minuto (rpm) y utilizar la frmula siguiente: Para calcular la fuerza centrfuga relativa (FCR) de una centrifuga individual:
2 g FCR 1.118 10 6 r rpm Por ejemplo, si el radio es de 25 cm y las rpm son de 1300 r/min, la FCR o g es aproximadamente de 50 g. Las centrfugas vienen con indicaciones de las rpm a las cuales podemos usar. Generalmente, una perilla para las rpm y otra perilla para el tiempo (temporizador), algunas ms modernas traen una pantalla donde se indica las rpm utilizadas. Componentes de una centrfuga (Fig. 3.36) Las centrfugas constan de: un eje o rbol central (A) que gira a gran velocidad un cabezal (E) fijo al rbol y provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugacin los tubos (T) que contienen el lquido que se va a centrifugar, que se montan en el cabezal. Cuando el rbol gira ejerce sobre los tubos la fuerza centrfuga. Los tubos oscilan hasta colocarse en posicin horizontal y las partculas en suspensin en los lquidos que contienen los tubos se impulsan hacia el fondo de cada uno. Las partculas que hay en los lquidos se comprimen en el fondo de los tubos de centrifugacin y se forman los sedimentos centrifugados. Los sedimentos se pueden separar del lquido flotante y es posible examinarlos. Pueden contener: corpsculos sanguneos huevos de parsitos (cuando se han centrifugado heces fecales diluidas) clulas de los conductos urinarios (en la orina), etc.
Figura 3.35 Principio de centrifugacin
Ilustracin anexa B Ilustracin anexa A Ilustracin anexa A La accin de la fuerza centrfuga sobre los tubos hace que estos oscilen hasta que se coloquen en posicin horizontal y las partculas se van ubicando en el fondo de los tubos. Ilustracin anexa B Luego de un tiempo las partculas se depositan en el fondo de los tubos y se produce el sedimento centrifugado (vase el crculo). 3.3.2 DIFERENTES TIPOS DE CENTRFUGAS Centrfuga manual (Fig. 3.37) Esta centrfuga se hace girar por medio de un manubrio. Contiene de 2 a 4 tubos. Usos 1. Para examinar sedimentos en la orina 2. Para concentrar ciertos parsitos en las heces fecales. Su velocidad no es suficiente para separar en la sangre los glbulos rojos y el plasma. Importante: 1. Con la prensa de sujecin de la centrfuga de mano fije sta firmemente en un punto de apoyo estable (el borde de una mesa). 2. Equilibre completamente los dos tubos que se hallan diametralmente opuestos, como se indica en las instrucciones para el uso de esta clase de centrfuga, en la seccin 3.3.3. 3. Mantngase a cierta distancia mientras efecta la centrifugacin. 4. Para detener la centrfuga no reduzca lentamente la velocidad del manubrio. Separe el manubrio de la mquina con un movimiento brusco. 5. Saque los tubos lenta y cuidadosamente (para no agitar los sedimentos). 6. Lubrique con regularidad el rbol de la centrfuga. Advertencia: La centrfuga manual puede causar serias lesiones fsicas, por tanto, siga estas instrucciones minuciosamente.
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Ilustracin anexa C
Figura 3.36 Componentes de una centrfuga. Un eje o rbol central (A) que gira a gran velocidad; un cabezal (E) fijo al rbol y provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugacin; los tubos (T) que contienen el lquido que se va a centrifugar, que se montan en el cabezal. Figura 3.37 Centrfuga manual. Ilustracin anexa C Algunos modelos de centrfuga cuentan con un cronmetro (C) o temporizador que detiene la centrfuga automticamente cuando se cumple el tiempo (por ejemplo, 5 10 minutos), un contador de revoluciones (CR) que es un cuadrante provisto de una aguja que indica la velocidad de la mquina durante la centrifugacin en rpm. Centrfugas elctricas En algunos sitios se pueden usar centrfugas que funcionan con pilas elctricas. Las centrfugas elctricas se construyen con dos tipos de cabezal. 1. Cabezal oscilante Este cabezal est diseado para que durante la centrifugacin los tubos adopten una posicin horizontal. Este es el tipo de cabezal que se necesita con ms frecuencia (Fig. 3.38). 2. Cabezal oblicuo Sostiene los tubos en un ngulo de 45, aproximadamente, durante la centrifugacin. Es til en la aplicacin de ciertas tcnicas, como en los ensayos de aglutinacin para determinar grupos sanguneos por el mtodo del tubo de ensayo. Sin embargo, no es esencial para las tcnicas que se describen en este manual (Fig. 3.39). Accesorios de las centrfugas elctricas Cubetas (para sostener los tubos) Existen varios tipos, segn sea el modelo de la centrfuga (Fig. 3.40): (a) Cubetas diseadas para sostener un solo tubo de fondo redondo o cnico (b) Cubetas para dos tubos de fondo redondo o cnico (c) Cubetas para nueve tubos pequeos (para precipitinas) etc. Algunos modelos de centrfuga cuentan con: un cronmetro (C) o temporizador que detiene la centrfuga automticamente cuando se cumple el tiempo (por ejemplo, 5 10 minutos) una cmara de enfriamiento que evita el calentamiento de la muestra durante la centrifugacin; un contador de revoluciones (CR) que es un cuadrante provisto de una aguja que indica la velocidad de la mquina durante la centrifugacin (es til para aplicar algunos mtodos de concentracin de parsitos). Centrifuga operada a bateras Centrifugas elctricas pequeas que funcionan con pilas se utilizan a veces para medir el volumen de clulas empaquetadas en hematologa.
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Figura 3.38 Una centrfuga con cabezal oscilante. Figura 3.39 Una centrfuga con cabezal oblicuo. Figura 3.40 Tipos de cubetas porta tubos para una centrfuga. 3.3.3 INSTRUCCIONES PARA USAR LA CENTRFUGA ELCTRICA Equilibrio de las cubetas (Fig. 3.41) Si las cubetas estn numeradas colquense de la manera siguiente: el tubo 1 frente al tubo 2 el tubo 3 frente al tubo 4. Equilibre los tubos que se encuentran frente a frente pesndolos en sus cubetas en la balanza abierta de dos platillos. Para hacerlo puede: agregar al tubo de menor peso cierta cantidad del lquido que va a centrifugar (Fig. 3.42), o verter agua en la cubeta que contenga el tubo de menor peso (utilizando un frasco de lavado, Fig. 3.43). Si solamente se va a centrifugar un tubo que contenga lquido, equilbrelo con un tubo idntico lleno de agua. Para evitar que los tubos se rompan Cubra siempre el fondo de las cubetas con los cojincillos de goma que vienen con la centrfuga, para proteger el fondo de los tubos. Con un frasco de lavado vierta una pequea cantidad de agua entre las paredes de cada tubo y la cubeta Arranque y detencin de la centrfuga (a) Encienda el motor y aumente gradualmente la velocidad girando con lentitud la perilla hasta lograr la velocidad deseada. (b) Detenga la centrfuga gradualmente (algunos modelos tienen freno para este propsito). (c) Retire los tubos lenta y cuidadosamente. (d) Nunca abra la centrfuga hasta que se haya detenido completamente. (e) Nunca trate de reducir la velocidad de la centrfuga con la mano. Limpieza y lubricacin Consrvese la olla de la centrfuga muy limpia. Enjuague las cubetas despus de usarlas. Limpie todos los residuos de sangre, etc. La lubricacin deber hacerla un experto de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Importante: Si se acostumbra a centrifugar sin equilibrar primero los tubos, la centrfuga se romper muy pronto. Para obtener informacin detallada de limpieza y mantenimiento de centrifugas, vase seccin 3.5.3.
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Figura 3.41 Equilibrando las cubetas porta tubos. Figura 3.42 Equilibre los tubos que se encuentran frente a frente pesndolos en sus cubetas en la balanza abierta de dos platillos. Adicionar lquido en la cubeta que contenga el tubo de menor peso (utilizando un frasco de lavado o piseta). Figura 3.43 Equilibrando los tubos aadiendo agua en la cubeta que contiene el tubo de menor peso (usando una piseta).
Centrfuga de mesada. Tapa a bisagra y cierre a presin. Motor flotante, protegido contra derrames, con eje de acero inoxidable. Reloj interruptor automtico de 0 a 30 minutos. Variador Electrnico de Velocidad. Mltiples rotores intercambiables. web: www.rolcosrl.com
3.4 MEDICIN Y DISPENSACIN DE LQUIDOS Muchos de los lquidos manipulados en el laboratorio son bien infecciosos, corrosivos o txicos. Es importante para la prevencin de accidentes que los procedimientos correctos para la medicin y la distribucin de estos lquidos sean claramente comprendidos y sean seguidos concienzudamente. Muchos de los nuevos mtodos para anlisis requieren volmenes muy pequeos de lquido y estn disponibles diversos dispositivos de pipeteado y dispensacin de esos volmenes pequeos para permitir que estos sean medidos con gran precisin. Los volmenes grandes pueden medirse mediante una probeta o un matraz aforado. Una probeta mide diferentes volmenes de lquido pero no es muy precisa. Un matraz aforado mide
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un nico volumen de lquido, por ejemplo, 1 litro, con mucha precisin. Pequeas cantidades de lquido (0,1 - 10ml) puede ser dispensado con rapidez y precisin usando uno de los siguientes mtodos: Un dispensador de volumen fijo o variable conectado a un recipiente de vidrio o polipropileno. Varios volmenes de 0,1 a 1,0 ml y de 2,0 a 10,0 ml pueden ser dispensados. Una pipeta calibrada que usa un bulbo de goma de seguridad. En el laboratorio se emplean los utensilios siguientes para medir volmenes: 1. Cilindros graduados (probetas) 2. Pipetas 3. Matraces volumtricos 4. Buretas 5. Pipetas cuentagotas graduadas 6. Vasos cnicos para anlisis, graduados 1. CILINDROS GRADUADOS (PROBETAS ) Con ellos se pueden medir diversos volmenes, aunque sin gran precisin. sense probetas cuya capacidad se aproxime al volumen requerido. Por ejemplo: para medir 45 ml sese una probeta de 50 ml para medir 180 ml sese una probeta de 200 ml para medir 850 ml sese una probeta de 1000 ml. LECTURA DEL NIVEL En los tubos delgados de vidrio se forma un menisco cncavo (M) en la superficie del agua (y la mayor parte de otros lquidos). La lectura se debe hacer en la lnea de graduacin (G) correspondiente a la parte ms baja del menisco. Para evitar errores en la lectura colquese la probeta en posicin vertical sobre una mesa y ajstese el nivel de la visin a la superficie del lquido.
Ilustracin anexa A Ilustracin anexa B Ilustracin anexa A Utensilios para medir volmenes usados en el laboratorio. 1) Probeta; 2) Pipeta; 3) Matraz volumtrico; 4) Bureta; 5) Pipeta cuentagotas graduada; 6) Vaso cnico para anlisis, graduado. Ilustracin anexa B Probetas de distintos tamaos.
Ilustracin anexa C En los tubos delgados de vidrio se forma un menisco cncavo (M) en la superficie del agua (y la mayor parte de otros lquidos). La lectura se debe hacer en la lnea de graduacin (G) correspondiente a la parte ms baja del menisco.
3.4.1 PIPETAS TIPOS DE PIPETAS PIPETAS GRADUADAS En el extremo de estas pipetas se encuentran las siguientes indicaciones (Fig .344): el volumen total que se puede medir con ellas el volumen que hay entre dos lneas de graduacin Existen varios tipos de pipetas graduadas (en especial 2 tipos) (Fig. 3.45): 1. Pipetas cuyas graduaciones llegan hasta el extremo inferior (A). El volumen total que se puede medir es el que hay entre la lnea 0 y el extremo inferior de la pipeta. 2. Pipetas con graduaciones que no llegan hasta el extremo inferior (B). En estas pipetas el volumen total es el que hay entre la lnea 0 y la ltima lnea antes del extremo inferior (este tipo de pipeta se recomienda para ensayos qumicos cuantitativos). Con las pipetas graduadas se pueden medir varios volmenes. Por ejemplo: se puede usar una pipeta de 10 ml para medir 8,5 ml se puede usar una pipeta de 5 ml para medir 3,2 ml se puede usar una pipeta de 1 ml para medir 0,6 ml. PIPETAS VOLUMTRICAS Sirven para medir un volumen exacto con gran precisin (pipetas A y B). Las pipetas B son mucho
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menos costosas que las pipetas A y, sin embargo, son lo suficientemente precisas para los anlisis clnicos. Existen otros dos tipos de pipetas (Fig. 3.46): 1. Pipetas con una sola lnea de graduacin, que se deben llenar hasta esta lnea. Despus de vaciarlas de su contenido se deja que estas pipetas escurran de 15 a 45 segundos (de acuerdo con su tamao, que se indica en el bulbo) y que la ltima gota se deslice contra la pared del recipiente. No se debe soplar dentro de estas pipetas. 2. Pipetas con 2 lneas de graduacin. En manos expertas estas pipetas pueden ser ms precisas, aunque no lo son tanto para las personas menos expertas, pues es fcil pasar de la lnea inferior de graduacin al vaciarlas. Sujetar la pipeta en posicin vertical para asegurarse que el lquido alcance la marca de la graduacin deseada (G en la Fig. 3.47). Esta marca debe estar al nivel de la parte inferior del menisco formado por el lquido. La punta de la pipeta debe mantenerse en el lateral del receptculo mientras que el lquido se descarga.
Figura 3.44 Pipeta graduada. Figura 3.45 Pipetas cuyas graduaciones llegan hasta el extremo inferior (A). Pipetas con graduaciones que no llegan hasta el extremo inferior (B). Figura 3.46 A: Pipetas con una sola lnea de graduacin, que se deben llenar hasta esta lnea. B: Pipetas con 2 lneas de graduacin.
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Ilustracin anexa E
Fig. 3.47 Figura 3.47 Cmo sostener la pipeta. Sostenga la pipeta en posicin vertical para confirmar que el lquido llegue a la lnea de graduacin deseada (G). Esta lnea deber encontrarse al mismo nivel de la parte ms baja del menisco formado por el lquido. La punta (P) de la pipeta deber sostenerse contra la pared del receptculo. Ilustracin anexa E Para manejar lquidos peligrosos. Utilice una pipeta con bulbo de seguridad (S) cerca de la boquilla. Tapone la pipeta con algodn (no absorbente) (C), o Aspire la solucin con una pipeta provista con pera de goma (propipeta de goma) (ste es, con mucho, el mejor procedimiento).
Ilustracin anexa G Ilustracin anexa F Ilustracin anexa F Propipeta de goma. Ilustracin anexa G Pipetas Pasteur de plstico (pipetas plsticas con bulbo) PIPETAS DE PLSTICO CON BULBO (PIPETAS PASTEUR DE PLSTICO) Las pipetas de plstico con bulbo son baratas y muy tiles para transferir volmenes de lquido tal como suero o desinfectante. Estn disponibles con diferentes puntas y se puede conseguir con calibraciones indicadas en el vstago. Ellas pueden ser reutilizadas despus de la desinfeccin y lavado, pero no pueden ser sometidas al autoclave. Las pipetas de plstico con bulbo tambin son llamadas pipetas Pasteur de plstico. Las pipetas Pasteur de plstico, tambin se hace referencia a estas como pipetas de transferencia, tienen sus tallos y bulbos en forma de una sola pieza de plstico. Existen diferentes tamaos. Los volmenes estn marcados en el tallo, aunque las marcas son bastante groseras y no son especialmente precisas. Las pipetas Pasteur de plstico se utilizan a menudo en biologa, donde la mayora de los medios de comunicacin son acuosos, y la resistencia a los disolventes no es importante. La mayora de disolventes orgnicos, tales como hexano y acetona, no se pueden utilizar en pipetas Pasteur de plstico. Estos disuelven el plstico, hacindolos inadecuados para muchos tipos de aplicaciones. Las pipetas son tambin difciles de lavar, y se desechan con los residuos de riesgo biolgico despus de cada uso. Las pipetas de plstico con bulbo generalmente no son lo suficientemente precisas como para ser utilizadas para las mediciones exactas, mientras que sus homlogas de vidrio pueden ser extremadamente precisas. Generalmente son desechables, pero con mucho cuidado pueden ser lavadas, desinfectadas pero no esterilizadas con autoclave.
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MICROPIPETAS Las micropipetas con puntas desechables se utilizan con frecuencia para medir pequeos volmenes. Estn disponibles en una variedad de volmenes, que van de 5 ml a 1000 ml. Tambin hay volmenes menores partiendo por ejemplo desde 10 l hasta 200 l. Las puntas usadas se desechan directamente en un desinfectante utilizando un mecanismo eyector. Las micropipetas tienen dos posiciones del mbolo operado por el pulgar (Fig. 3.48). La primera posicin se utiliza para recoger la muestra y la segunda para expulsar la muestra de la punta en un tubo o pocillo. Las micropipetas deben ser calibradas y mantenidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PIPETAS GOTEROS CALIBRADAS Las pipetas goteras calibradas del tipo usual suelen dar 20 gotas de agua destilada por cada ml, de manera que una gota = 0,05 ml. Sostenga la pipeta gotera en posicin completamente vertical para contar las gotas (Fig. 3.49). Cercirese que no contengan burbujas de aire. CALIBRACIN DE LAS PIPETAS GOTERAS (Fig. 3.50) Por medio de una pipeta volumtrica (vase antes) mida 1 ml de agua y coloque en un tubo de ensayo pequeo. Aspire el agua con la pipeta gotera que se va a calibrar. Cuente el nmero de gotas que se obtienen del ml de agua. Repita este procedimiento 3 veces para confirmar su precisin. El pipeteo con la boca es peligroso y no se debe hacer. Puede causar lo siguiente: -Infeccin -Quemaduras -Envenenamiento - Cortes. Siempre use una propipeta de goma (vanse ilustracin anexa F y Fig. 3.50) con la pipeta en su lugar.
Figura 3.48 Una micropipeta con punta descartable. Figura 3.49 Usando una pipeta gotero. Sostenga la pipeta gotera en posicin completamente vertical para contar las gotas. Cercirese que no contengan burbujas de aire.
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Figura 3.50 Calibracin de las pipetas goteras. B: Bulbo de goma. (Alternativamente una propipeta de goma).
Fig. 3.50 3.4.2 MATRACES VOLUMTRICOS Estos matraces estn graduados para medir ciertos volmenes cuando se llenan hasta la lnea de graduacin correspondiente. Tienen varias capacidades: - 2000 y 1000 ml 500 ml - 250 y 200 ml 100 ml - 50 y 25 ml Los matraces volumtricos son ms precisos que las probetas. Se deben utilizar en la preparacin de reactivos. Por ejemplo: 1 litro de solucin de cloruro sdico (reactivo No. 53) se prepara colocando 8,5 g de cloruro sdico que se haya disuelto en agua en un vaso, en un matraz de 1000 ml por medio de un embudo, diluyndolo nuevamente (a medida que mezcla) hasta alcanzar la lnea de los 1000 ml (Fig. 3.51). la solucin debe ser sacudida antes de usarla. Tambin las sustancias se pueden disolver en un receptculo y vaciar la solucin en el matraz usando como gua una varilla de vidrio (Fig. 3.52). Enjuguese el recipiente varias veces, vaciando el lquido en el matraz a lo largo de la varilla de vidrio cada vez. Llnese el matraz hasta la lnea de graduacin correspondiente. (Este mtodo se recomienda para preparar reactivos qumicos titulados). TEMPERATURA DE LOS LQUIDOS La temperatura a la que se deben medir los lquidos se ndica en el matraz (junto a la cifra indicadora de la capacidad; Fig. 3.53). Por ejemplo: - 200 ml: 20C. Los lquidos se dilatan con el calor y se contraen con el fro. Nunca se deben medir lquidos calientes ni lquidos fros recin sacados del frigorfico. Tapones Los matraces volumtricos deben acompaarse de tapones de material plstico (de preferencia) o de vidrio esmerilado. Se debe tener cuidado de no extraviarlos, as pues tense al cuello del matraz con un trozo de hilo. Costo Los matraces volumtricos suelen ser sumamente costosos, por lo que se deben usar con mucho cuidado. 3.4.3 BURETAS Las buretas son tubos de vidrio graduado que tienen una espita de vidrio en el extremo inferior. Se llenan por el extremo superior con el lquido que se quiere medir (Fig. 3.54). Su capacidad puede ser de 10 ml, 20 ml, 25 ml y 50 ml. Mantenimiento de las buretas Espita y canilla (A) La espita y la canilla se deben conservar adecuadamente lubricadas. Para lubricar con propiedad una espita limpia, aplique con la yema del dedo una capa de vaselina tan delgada como sea posible, hacia abajo, a ambos lados de la espita, sin llegar al orificio capilar. A continuacin inserte la espita en la bureta y grela hasta lograr que quede untada toda la espita con una capa de vaselina fina y uniforme. Conserve el extremo superior de la bureta (B) taponado o cubierto (Fig. 3.55). Vasos cnicos graduados de vidrio para anlisis Estos vasos no son muy exactos. Se debe evitar usarlos en anlisis de laboratorio. EXACTOS MENOS EXACTOS INEXACTOS Pipetas Probetas Vasos cnicos para anlisis
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Matraces volumtricos Pipetas goteras calibradas ALGUNAS COSAS QUE NO DEBEN HACERSE 1. Nunca mida el volumen de los lquidos cuando estn calientes (se encuentran dilatados). 2. Nunca caliente en una llama los utensilios de vidrio graduados. 3. Nunca deje los utensilios de vidrio graduados en remojo en soluciones alcalinas (hidrxido sdico o potsico, amonaco).
Figura 3.51 Preparando una solucin de Cloruro de Sodio en un matraz volumtrico. Figura 3.52 Mtodos alternativos para preparar reactivos usando un matraz volumtrico (obsrvese el uso de una varilla de vidrio para hacer verter el lquido).
Figura 3.53 La temperatura a la que se deben medir los lquidos se indica en el matraz (junto a la cifra indicadora de la capacidad). Por ejemplo: 200 ml : 20C. Figura 3.54 Llenando una bureta.
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Figura 3.55 Conserve el extremo superior de la bureta taponado o cubierto. Figura 3.56 Vaso cnico de vidrio para anlisis graduado.
3.5 LIMPIEZA, DESINFECCIN Y ESTERILIZACIN

3.5.1 LIMPIEZA DE LOS UTENSILIOS DE VIDRIO Y DE LAS JERINGAS Y AGUJAS REUTILIZABLES
PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR
1. Recipientes de vidrio (matraces de Erlenmeyer, vasos de precipitados, tubos) 2. Pipetas 3. Portaobjetos 4. Cubreobjetos 4. Jeringas y agujas reutilizables RECIPIENTES DE VIDRIO UTENSILIOS DE VIDRIO NUEVOS Los utensilios de vidrio que nunca se utilizaron son ligeramente alcalinos. Con objeto de neutralizarlos deben seguirse los procedimientos siguientes: ponga en una cubeta 3 litros de agua con 60 ml de cido clorhdrico (es decir, una solucin de este cido al 2%) sumerja completamente en esta solucin durante 24 horas los utensilios de vidrio sin usar despus enjuguelos dos veces con agua corriente y una vez con agua desmineralizada. squelos. UTENSILIOS DE VIDRIO SUCIOS Descrtense los recipientes de muestras (vase ms adelante). PRIMER ENJUAGUE Enjuague los utensilios dos veces con agua fra o tibia (los tu b o s con residuos de sangre nunca se deben enjuagar con agua caliente). Jams deje que se sequen los utensilios que se han usado con lquidos que contienen protenas; es imprescindible enjuagarlos primero y lavarlos de inmediato. REMOJO EN SOLUCIN DETERGENTE En una palangana prepare agua con detergente para lavar en polvo o en lquido. Coloque en ella los utensilios de vidrio y lmpielos por dentro con un cepillo para tubos de ensayo (Fig. 3.57). Djelos en remojo durante 2 - 3 horas. ENJUAGUE Saque de la palangana los utensilios, uno a uno. Enjuague cada uno detenidamente con el chorro de agua del g rifo y a continuacin coloque todos en una palangana con agua durante 30 minutos. Enjuague de nuevo cada uno bajo el chorro de agua limpia. (Se debe recordar que las partculas de detergente que queden en los utensilios de vidrio pueden causar resultados falsos en el laboratorio). PARA ESCURRIRLOS Coloque los recipientes (vasos, matraces, probetas) en las clavijas de una gradilla de pared para secado. Ponga los tubos con las bocas hacia abajo en una canastilla de alambre. 6. Secado Ponga los utensilios en canastillas de alambre y squelos en un horno de aire caliente a 60C. De lo contrario coloque las canastillas con los utensilios en un sitio soleado del laboratorio y cbralos con una pieza de tela delgada. TAPONAMIENTO El material de vidrio limpio y seco se deber guardar en una alacena para preservarlo del polvo. Se recomienda que los recipientes se taponen con algodn no absorbente, guata, o se les cubra la boca con pequeas tapas hechas de papel de peridico (Fig. 3.58) o, de preferencia, con hojas delgadas de parafina o material plstico adherente (por ejemplo, Parafilm o Saran), si se encuentran disponibles.
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Figura 3.57 Lavando utensilios de vidrio sucios. Figura 3.58 Tapone o cubra el material de vidrio para protegerlo del polvo. PIPETAS ENJUAGUE INMEDIATO Tan pronto como se haya usado una pipeta se debe enjuagar con un chorro de agua fra para limpiarla desangre, orina, suero, reactivos, etc. REMOJO EN AGUA Despus de enjuagarlas coloque las pipetas en una probeta grande, de material plstico (o una palangana) llena de agua. Si las pipetas se han utilizado para medir material infeccioso djelas en una probeta llena de solucin desinfectante (algn compuesto cuaternario de amonio, o fenol al 2%) durante 24 horas. REMOJO EN DETERGENTE Y ENJUAGUE Siga las instrucciones dadas anteriormente acerca de los utensilios de vidrio del laboratorio. PIPETAS OBSTRUIDAS (a) Ponga en un cilindro lleno con una solucin limpiadora de bicromato (reactivo No. 20), depositndolas con suavidad. Djelas 24 horas en esta solucin. (b) Al da siguiente traslade la solucin de bicromato a otro cilindro (se puede usar 4 veces). (c) Coloque el cilindro que contiene las pipetas bajo el chorro de agua del grifo y enjuguelas minuciosamente. (d) Saque las pipetas, una a una. Verifique que se han eliminado las obstrucciones. A continuacin enjuguense nuevamente. (e) Remoje las pipetas en agua limpia durante 30 minutos, cambie el agua y vulvalas a remojar otros 30 minutos. Advertencia: La solucin de bicromato es sumamente corrosiva y se debe emplear con cuidado extremo. Si se derrama accidentalmente sobre la piel, los ojos o la ropa, lvese inmediatamente con cantidades copiosas de agua. SECADO Seque las pipetas de vidrio Pyrex en el horno de aire caliente a 60C y las de vidrio ordinario en la incubadora a 37C o al aire. USO DE LA BOMBA AL VACO Este es un pequeo aparato de metal o vidrio (frgil) que se anexa al grifo. (a) Abra el grifo bastante de manera que produzca un chorro vigoroso que pase a travs de la bomba y el tubo de goma anexo. (b) Ajuste el tubo de goma al extremo superior de la pipeta. (c) Sumerja el otro extremo de la pipeta en el lquido para enjuagar, que ser succionado a travs de la pipeta y descargado en el vertedero (Fig. 3.59).
Figura 3.59 Usando una bomba de vaco para enjuagar una pipeta.
PORTAOBJETOS PORTAOBJETOS NUEVOS
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REMOJO EN SOLUCIN DETERGENTE En una palangana prepare agua con detergente para lavar en polvo o en lquido, empleando la cantidad que recomienda el fabricante. Coloque en la palangana los portaobjetos uno a uno y djelos en remojo toda la noche. ENJUAGUE EN AGUA Enjuague cada portaobjetos con agua del grifo y luego remojar en agua limpia durante 15 minutos. LIMPIEZA Y SECADO Limpie los portaobjetos, uno a uno, con una tela suave, que no desprenda pelusa. Colquelos separados, en una hoja de papel de filtro, uno a uno. Deje que se sequen. Posteriormente, examine cada portaobjeto. Descarte los portaobjetos que estn teidos o raspados y los que tengan un color amarillento o porciones opacas, y tratar de limpiarlos de nuevo. ENVOLTURA Junte los portaobjetos en montoncitos de 10 20 y envulvalos con hojas pequeas de papel. NUMERACIN En algunos laboratorios se acostumbra numerar los portaobjetos por anticipado en grupos de cinco paquetes, de 1 a 100, con un lpiz de diamante (de esta manera los paquetes contienen portaobjetos del 1 al 20, del 21 al 40, del 41 al 60, del 61 al 80 y del 81 al 100). PORTAOBJETOS SUCIOS PORTAOBJETOS CON RESIDUOS DE ACEITE DE INMERSIN Tome los portaobjetos uno a uno y frtelos con papel de peridico para limpiarlos del aceite hasta donde sea posible. PORTAOBJETOS CON CUBREOBJETOS Separe los cubreobjetos de los portaobjetos con la punta de una aguja o el extremo de una pinza, tambin una varilla de vidrio, y colquense en un vaso para anlisis lleno de agua (Fig. 3.60) (para la limpieza de los cubreobjetos vase ms adelante). REMOJO EN SOLUCIN CONCENTRADA DE DETERGENTE Prepare una palangana con: Agua fra o tibia Detergente (en la cantidad que recomiende el fabricante). Djense en remojo los portaobjetos durante 24 horas. Los detergentes que contienen enzimas son excelentes para limpiar los residuos de sangre. Nota: Si los portaobjetos se han usado con muestras infectadas (orina, heces fecales) se deben colocar en una solucin desinfectante. LIMPIEZA DE LOS PORTAOBJETOS Prepare otra palangana, que contenga una solucin dbil de detergente (15 ml de detergente de uso domstico por cada litro de agua). Saque los portaobjetos, uno a uno, de la solucin detergente fuerte. Frote cada portaobjetos con algodn humedecido en la solucin detergente fuerte y colquense en la palangana que contiene la solucin detergente dbil. Djense en remojo durante 1 a 2 horas en la palangana con solucin detergente dbil. ENJUAGUE DE LOS PORTAOBJETOS Tome los portaobjetos uno a uno usando de preferencia una pinza. Si se utilizan los dedos cjalos por los bordes. Enjuguelos por separado bajo el chorro de agua y a continuacin pnganse en remojo durante 30 minutos en una palangana llena de agua. Este es el mejor procedimiento. MTODO RPIDO Vacese la palangana de solucin detergente dbil y llnese con agua limpia. Cmbiese el agua 3 veces agitando vigorosamente la palangana cada vez. LIMPIEZA, SECADO Y ENVOLTURA Sganse las instrucciones que se han dado para los portaobjetos nuevos. CUBREOBJETOS Despus de usarlos, los cubreobjetos se pueden recobrar, limpiar y usar nuevamente. Para limpiarlos: 1. Remjense en una solucin dbil de detergente a la que se haya agregado un desinfectante preparado en un vaso grande de precipitado como se indica a continuacin: - 200 ml de agua - 3 ml de detergente - 15 ml de leja o 5 ml de un desinfectante cuaternario derivado del amonio (vase ms adelante). Djense en remojo durante 2 - 3 horas, movindolos suavemente de vez en cuando. 2. Enjuague cuatro veces el vaso donde estaban con agua del grifo, agitndolo suavemente. 3. Lvese por ltimo con agua desmineralizada. 4. Escurra los cubreobjetos colocndolos cuidadosamente de punta sobre una pieza de gasa doblada. 5. Si es posible, squense en el horno de aire caliente a 60C. 6. Consrvense en una placa de Petri pequea. Para sacarlos utilice una pinza especial para portaobjetos si se dispone de ella.
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Figura 3.60 Removiendo los cubreobjetos de un portaobjeto para lavarlos usando una pinza o una varilla de vidrio. Figura 3.61 Limpiando una jeringa reutilizable tapada con cido Actico al 50%. JERINGAS Y AGUJAS REUTILIZABLES Inmediatamente despus de tomar una muestra quite el mbolo de la jeringa y enjuague ste y el cilindro. Llene el cilindro con agua y coloque el mbolo en su lugar; impulse con fuerza el agua a travs de la jeringa. Por ltimo, quite la aguja y enjuague la cavidad de su enchufe. JERINGA CON EL MBOLO ADHERIDO Para aflojar el mbolo se puede proceder de varias maneras: Ponga en remojo la jeringa durante 2 horas en agua caliente (a 70 C aproximadamente). O bien, con una pipeta Pasteur delgada introduzca solucin de cido Actico al 50% (reactivo N 3) por la boquilla de la jeringa (Fig. 3.61). Coloque la jeringa sobre su extremo posterior, con el mbolo hacia abajo. Tngala as durante 10 minutos. Ponga la jeringa en remojo durante varias horas en un recipiente con perxido de hidrgeno a 10 vol. ENJUAGUE Y REMOJO DE LAS AGUJAS Inmediatamente despus que se haya usado una aguja enjuguese mientras contina colocada en la jeringa y pngase en remojo de la misma manera que sta. AGUJAS OBSTRUIDAS Utilice un hilo de nylon remojado en cido Actico al 50%(reactivo N 3). De lo contrario, emplee un estilete. 3.5.2 LIMPIEZA DE LOS RECIPIENTES NO DESECHABLES Este procedimiento es ms difcil (por lo tanto, siempre que sea posible sense recipientes desechables). Los frascos (tarros) y matraces pueden contener: materias sumamente infecciosas (heces fecales, esputo, pus, lquido cefalorraqudeo) otras muestras (sangre, orina). RECIPIENTES CON HECES FECALES Llene los tarros que contengan heces fecales con una solucin de fenol al 5% u otro desinfectante similar (como el cresol). Djelos en reposo 24 horas. A continuacin vacelos en el fregadero. Si este se encuentra conectado a un tanque sptico no se deber agregar fenol ni otro antisptico a las heces. Limpie los tarros con detergente y agua (como se indica ms adelante). RECIPIENTES CON ESPUTO Y TUBOS CON PUS O LQUIDO CEFALORRAQUDEO Existen varios procedimientos: USO DEL AUTOCLAVE Este es el procedimiento ms conveniente. 1. Coloque los recipientes en el autoclave tal como se encuentren y esterilcelos durante 30 minutos a 120C para destruir todos los microorganismos. 2. Una vez que se hayan enfriado vacelos en el vertedero o el fregadero. 3. Lmpielos con agua y detergente. Para mejor informacin, vase la seccin 3.55. EBULLICIN EN SOLUCIN DETERGENTE (FIG. 3.62). Disponga de un recipiente amplio, especial para este propsito. Hierva los recipientes de esputo: durante 30 minutos en agua que contenga polvos para lavar en solucin fuerte (o, de preferencia, cristales de carbonato sdico), a razn de 60 ml por cada litro de agua. Empleo de la solucin de formaldehido o fenol Coloqense en cada recipiente de esputo: 10 ml de solucin de formaldehido sin diluir, o 5 ml de fenol al 5%. Djense en reposo durante 24 horas.
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Figura 3.62 Limpiando frascos con esputo hirviendolos en solucin detergente MATRACES CON ORINA Vacense los matraces en el fregadero. A continuacin, llnense con: una solucin de leja comercial al 10%, o una solucin de fenol al 2%. Djense en reposo durante 24 horas. TUBOS CON SANGRE Los tubos con sangre fresca extrada el mismo da debern: enjuagarse con agua fra remojarse en una solucin detergente (vase ms adelante). Los tubos con sangre "vieja que han permanecido varios das a la temperatura ambiente, en que los microorganismos se pueden multiplicar, debern: llenarse con una solucin de leja comercial al 10% dejarse en reposo durante 12 horas y enjuagarse y limpiarse en seguida. 3.5.3 LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DE OTROS EQUIPOS DE LABORATORIO CENTRFUGAS Limpie el tazn de la centrfuga diariamente o despus que ocurra cualquier derrame. Utilice etanol al 70% para recipientes de metal y 1% de lavandina (vase ms adelante) para las de plstico. (No utilice Hipoclorito de sodio para recipientes de metal, ya que puede provocar corrosin.) Enjuagar las cubetas de la centrfuga despus de su uso y eliminar cualquier rastro de sangre, etc. Compruebe a intervalos regulares el cableado por desgaste y conexiones sueltas. Si la centrfuga est encendiendo o corriendo irregularmente, las escobillas (bloques de carbn) deben reemplazarse. La lubricacin de la centrfuga debe ser realizada por un especialista, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (Para mayor informacin vase la seccin 3.3.3) BAOS MARA Si es posible llenar el bao mara con agua destilada o agua de lluvia para evitar la formacin de depsitos en el interior. Un cristal de timol ayudar a prevenir el crecimiento de algas. Cambie el agua y limpie el interior del bao mara por lo menos una vez al mes o cada vez que se ve sucia. Use un termmetro para verificar la temperatura del agua cada vez que se cambia el agua como escala en el elemento de calentamiento, esto puede hacer que el termostato no funcione correctamente. INCUBADORAS (ESTUFAS DE CULTIVO) Las estufas de cultivo o incubadoras son utilizadas para el cultivo de bacterias por los laboratorios que trabajan en microbiologa. La incubadora debe mantener una temperatura promedio constante de 35 C (rango de 33-37 C). La temperatura real debe corresponder a la posicin del termostato cuando se utiliza el instrumento. En las estufas de cultivo de dixido de carbono utilizado para cultivo microbiano, la concentracin de dixido de carbono se debe mantener en un 5-10% y la humedad en el 50-100%. La temperatura en las estufas de cultivo debe ser registrada diariamente. Al igual que todos los instrumentos de laboratorio, las estufas de cultivo deben limpiarse a intervalos regulares (por lo menos cada quince das) y tambin despus del derrame de cualquier material, ya sea infeccioso o no infeccioso. PIPETAS DE WESTERGREN Enjuague con agua y luego dejar en remojo en agua limpia durante 12 horas. Secar completamente (en una estufa de cultivo a 37 C, si es posible). No utilice detergentes, cidos o etanol. (Pipetas de Westergren para eritrosedimentacin). 3.5.4 DESINFECTANTES Hay muchos desinfectantes que tienen diversas acciones qumicas diferentes agentes infecciosos. La Tabla 3.1 enumera los desinfectantes que se usan ms comnmente en los laboratorios de salud.
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CRESOLES Los cresoles pueden ser slidos o lquidos, que son menos solubles en agua que el fenol, pero una solucin acuosa al 5% se puede mantener como una solucin madre. Los cresoles emulsionan bien en soluciones de jabn. LISOL El Lisol es una emulsin al 50% de cresol en una solucin acuosa de jabn. El cresol puede ser sustituido por fenol, pero puesto que el fenol es un desinfectante menos potente el tiempo de exposicin del material a la solucin de fenol debe ser ms largo que para el cresol. Soluciones de fenol y cresol causan irritacin de la piel y los ojos. HIPOCLORITO DE CALCIO Y DE SODIO Las soluciones de hipoclorito de sodio y de calcio (blanqueadores domsticos) son desinfectantes muy fuertes. Se utilizan en muchos laboratorios, tienen aplicaciones domsticas e industriales. Los hipocloritos son inactivados rpidamente por las partculas de polvo y los materiales orgnicos y cada da deben prepararse a partir de soluciones madre. Los hipocloritos causan irritacin de la piel, los ojos y los pulmones. Las soluciones perfectas, sin diluir deben contener un 10% de cloro disponible. Para preparar las diluciones de trabajo, se recomiendan las diluciones siguientes: Para los frascos y envases en que se descartan pipetas, portaobjetos y otros objetos de vidrio usados y para frotar las superficies de las mesadas de trabajo: 10 ml de solucin de hipoclorito concentrado en 990 ml de agua (0,1% de cloro disponible). Colocar el material de vidrio utilizado en los frascos de solucin de hipoclorito y dejar durante al menos 12 horas. No llene los recipientes. Cambiar los recipientes diariamente. Para la descontaminacin de los derrames de sangre y otras muestras con alto contenido de protenas: 40 ml de solucin de hipoclorito concentrada en 360 ml de agua (1% de cloro disponible). Las soluciones fuertes de hipoclorito son corrosivas y pueden causar quemaduras. Maneje las soluciones de leja con cuidado: usar guantes de goma para protegerse las manos y protectores oculares para evitar salpicaduras en los ojos. El hipoclorito de calcio est disponible en su forma slida como polvo o grnulos. Se descompone a un ritmo ms lento que el hipoclorito de sodio. Una solucin de 1% de cloro disponible se obtiene por disolucin de 14 g de hipoclorito de calcio en 1 litro de agua. CLORAMINA La cloramina (tosilcloramida sdica) es un polvo cristalino que, como los hipocloritos, libera cloro como agente desinfectante activo, aunque a un ritmo ms lento. Tambin se utiliza para la desinfeccin de agua: El agua clorada tiene una concentracin de 0,05% de cloramina. Tenga en cuenta que el agua tratada con cloro puede interferir con las pruebas de laboratorio. Por lo tanto, debe ser utilizada el agua destilada. HIDRXIDO DE CALCIO La solucin de hidrxido de calcio se prepara a partir de cal viva (xido de calcio) en polvo o grnulos disueltos en agua (1 parte: 3 partes p / v). La solucin de hidrxido de calcio no es adecuada para la desinfeccin de heces de pacientes con tuberculosis. COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO Los compuestos de amonio cuaternario (CAC) son eficaces contra bacterias vegetativas y algunos hongos. No son eficaces contra las esporas, virus y micobacterias, no son txicos y son inofensivos para la piel. ALCOHOLES Los alcoholes (por ejemplo etanol, isopropanol, n-propanol) son de accin rpida, pero son desinfectantes relativamente caros que se utilizan generalmente para la desinfeccin de la piel. Se matan las bacterias y algunos virus, pero no los hongos. YODO El yodo es un excelente desinfectante de accin rpida con una amplia gama de accin. Mata a las bacterias, muchas esporas, virus y hongos. A bajas temperaturas, el yodo es ms activo que otros desinfectantes. Algunas personas son hipersensibles al yodo y sufren una erupcin en reas de la piel que han sido expuestas a la solucin de yodo. Su sensibilidad es mucho menor cuando se utilizan yodforos (soluciones de polmeros que ligan yodo), tales como polividona yodada o povidona yodada. Tabla 3.1 Desinfectantes de uso comn Dilucin recomendada Duracin mnima Desinfectante para desinfectar del tratamiento (v/v) Solucin de cresol 2:1 6 hs. al 5% Solucin de hipoclorito de 2:1 6 hs. Calcio (1% de cloro disponible) Solucin de cresol 2:1 6 hs. al 5% Solucin de 3:1 6 hs. hipoclorito de
Objetos de desinfeccin
Preparacin de reservas de desinfectante Cristales o lquido Polvo Cristales o lquido Polvo
Sangre
Heces fecales
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Calcio y de Sodio (1% de cloro disponible) Solucin de Hidrxido de 2:1 6 hs. Polvo Calcio al 20% Cloramina (4% de Sin diluir 6 hs. Polvo cloro disponible) Solucin de cresol Orina 1:1 4 hs. Cristales o lquido al 5% Solucin de cresol Esputo 1:1 4 hs. Cristales o lquido al 5% Solucin de cresol 50% de cresol en Sin diluir 2 min. al 50% solucin jabonosa Solucin de etanol Sin diluir 2 min. Solucin al 95% al 80% Solucin de Yodo Sin diluir 2 min. Solucin al 5% al 1% Solucin de Yodo Sin diluir 2 min. Pura povidona al 1% Piel Solucin de Sin diluir 2 min. Pura Isopropanol al 70% Solucin de n Sin diluir 2 min. Pura propanol al 60% Cloramina (1% de Sin diluir 2 min. Polvo cloro disponible) Compuestos de Amonio Sin diluir 2 min. Solucin Cuaternario Agua potable, agua Solucin de Sin diluir 16 min. Polvo de beber Cloramina al 0,25% Solucin de cresol 50% de cresol en Sin diluir 4 hs. al 50% solucin jabonosa Solucin de cresol Sin diluir 4 hs. Cristales o lquido al 5% Mesadas de trabajo Cloramina (5% de Sin diluir 4 hs. Polvo cloro disponible) Hipoclorito de Sodio (1% de cloro Sin diluir 4 hs. Polvo disponible) Hipoclorito de Instrumentos de Solucin: 5%, 10%, Sodio (0,1% de Sin diluir 4 hs. laboratorioa 15% cloro disponible) Hipoclorito de Solucin: 5%, 10%, Utensilios de vidrio Sodio (1% de cloro Sin diluir 12 hs. 15% disponible) aLa desinfeccin qumica para instrumentos invasivos y de corte de la piel deben emplearse slo como ltimo recurso, si no, no es posible la esterilizacin ni la desinfeccin de alto nivel por ebullicin, y slo si la concentracin adecuada de la sustancia qumica est disponible y si los instrumentos se han limpiado a fondo para eliminar la contaminacin excesiva antes de sumergirse en el desinfectante qumico. 3.5.5 ESTERILIZACIN Esterilizar significa eliminar de un objeto o una sustancia todas las formas de vida, cualesquiera que stas sean. En consecuencia, el equipo de laboratorio que se ha esterilizado queda libre de microorganismos vivos. En el laboratorio mdico los materiales se esterilizan con tres propsitos principales: 1. Prepararlos para la recoleccin de muestras (debern estar estriles agujas, jeringas, tubos, etc.). 2. Desinfectar los materiales contaminados. 3. Preparar los utensilios que se emplean en los cultivos bacterianos (cajas de Petri, pipetas Pasteur, tubos, etc.). En el laboratorio mdico la esterilizacin se logra por medio de calor hmedo (autoclave, ebullicin) o calor seco (horno de aire caliente, flameado). ESTERILIZACIN CON VAPOR EL AUTOCLAVE Las muestras clnicas y otros materiales residuales contaminados se colocan en un recipiente para autoclave o en un cubo de plstico o metal para esterilizacin. Utilice los indicadores de esterilizacin del autoclave para controlar el ciclo de esterilizacin. PRINCIPIO En un recipiente cerrado se calienta agua. Esto produce una saturacin de vapor a presin, con temperatura superior a 100 C. Toda clase de grmenes mueren al calentar los utensilios durante 20 minutos a 120C en este vapor a presin. COMPONENTES DEL AUTOCLAVE (FIG. 3.63)
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CALDERA Consiste en un cilindro amplio y profundo en que se colocan los utensilios para esterilizar. CANASTA Es una canasta amplia de alambre donde se ponen los materiales que se esterilizarn. SOPORTE DE LA CANASTA Se encuentra en el fondo del autoclave y sostiene la canasta por encima del nivel del agua. DRENAJE Espita colocada en la base de la caldera, por donde sale el exceso de agua. TAPA La tapa cubre y cierra hermticamente la caldera; se ajusta mediante una arandela de goma. SUJETADORES DE LA TAPA Estos sujetadores, junto con la arandela de goma, cierran hermticamente la tapa e impiden que escape el vapor. VLVULA DE SALIDA DEL AIRE Esta vlvula, que se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa, se emplea para dejar que salga el aire cuando empieza el agua a calentarse. VLVULA DE SEGURIDAD Se halla en la parte superior de la caldera o en la tapa, y deja escapar el vapor cuando la presin se eleva demasiado, evitando as que ocurra una explosin. INSTRUMENTO INDICADOR DE LA TEMPERATURA O DE LA PRESIN Se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa e indica la presin, la temperatura, o ambas. Graduaciones del indicador Todos los indicadores sealan la temperatura en grados Celsius (C); algunos tambin tienen una segunda escala, en que se lee la presin. Calentamiento del autoclave El sistema de calentamiento puede estar construido dentro del autoclave en forma de: dispositivos elctricos, o quemadores de gas. De lo contrario, el autoclave se calentar sobre: un quemador de gas butano, o una estufa de aceite de parafina. INSTALACIN Los autoclaves deben ser instalados fuera de la principal rea de trabajo, ya que son muy ruidosos. Si los gases o un aceite de parafina se utilizan para calentar, deben ser mantenidos lejos de materiales inflamables y de productos qumicos. Cmo usar el autoclave Preparacin de los materiales para la esterilizacin Jeringas reutilizables Los mbolos y los cilindros se colocarn por separado en tubos de vidrio amplios (Fig. 3.64), taponados con algodn no absorbente o guata, o se envolvern con gasa y se colocarn en bandejas metlicas. Agujas reutilizables Es preferible colocar las agujas por separado en tubos de ensayo pequeos que se taponarn inmediatamente despus (vase Fig. 3.64). Colquese por anticipado una pieza de algodn no absorbente o guata en el fondo de cada tubo para proteger las puntas de las agujas. De lo contrario, dispnganse las agujas en bandejas metlicas, hundiendo las puntas en una pieza de gasa doblada (Fig. 3.65). Las bandejas metlicas se colocarn sin tapa en el autoclave. Material de vidrio Los tubos para muestras, las cajas de Petri, etc., se envolvern en papel de estraza y se atarn con cordeles. Pipetas Pasteur de vidrio Se colocarn en tubos amplios y largos, que se taponarn inmediatamente despus. Tambin se pueden envolver con varias hojas de papel de estraza. PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN (a) Llene con agua el fondo del autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese de que el agua no toque la canasta. Si es necesario, elimine el exceso de agua abriendo la espita de drenaje. (b) Introduzca en el autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar. (Se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.) (c) Cierre la tapa del autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretar demasiado. (d) Abra la vlvula de salida del aire. (e) Inicie el calentamiento del autoclave. (f) Vigile la vlvula de salida del aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3 - 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo. Esto indicar que todo el aire se ha expulsado del autoclave. (g) Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del autoclave y redzcase la temperatura ligeramente. (h) Observe el indicador. Cuando se obtenga la temperatura deseada (p. ej. 120C) se deber
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regular el calor para conservarla. Redzcase el calor hasta que la aguja del indicador permanezca en el grado de temperatura escogido. Tiempos de esterilizacin (i) En este momento empiece a medir el tiempo de la manera siguiente: Utensilios para recolectar muestras (jeringas y agujas reutilizables, tubos): 20 minutos a 120C. Recipientes de materias infectadas (vasos que han contenido esputo, tubos que han contenido pus): 30 minutos a 120C. Medios de cultivo bacterianos: Sganse las instrucciones del bacterilogo o el tcnico principal del laboratorio. REDUCCIN TOTAL DEL CALOR (a) Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. (b) Cuando la temperatura descienda a menos de 100C abra la vlvula de salida del aire para igualar las presiones dentro y fuera del autoclave. (c) Cuando cese el silbido afloje los sujetadores de la tapa del autoclave. Quite la tapa. Deje enfriar el autoclave y, a continuacin, retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estriles. Si se han formado gotas de agua y se dispone de una incubadora, squelos en ella, a 37C. LIMPIEZA Limpie el interior del autoclave cada da o cada vez que ocurran derrames. PRECAUCIONES Algunas cosas que no se deben hacer 1. Nunca se deben maniobrar la espita de drenaje ni la vlvula de salida del aire mientras se est efectuando el calentamiento a presin. 2. Nunca se debe maniobrar la vlvula de seguridad mientras se est efectuando el calentamiento a presin. 3. Nunca se debe hacer un calentamiento demasiado rpido para aumentar la presin una vez que la vlvula de salida se ha cerrado. 4. Nunca se debe descuidar el autoclave mientras la presin est aumentando. 5. Nunca se debe permitir que el autoclave se enfre durante demasiado tiempo. Si el aparato se deja varias horas sin abrir la vlvula de salida, se forma un vaco y los utensilios estriles se pueden romper.
Figura 3.63 Componentes de un autoclave 1: Caldera; 2: Canasta; 3: Soporte de la canasta; 4: Drenaje; 5: Tapa; 6: Sujetadores de la tapa; 7: Vlvula de salida del aire; 8: Vlvula de seguridad; 9: Instrumento indicador de la temperatura o de la presin. Figura 3.64 Autoclavando jeringas y agujas reutilizables.
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Figura 3.65 Mtodo alternativo para autoclavar agujas reutilizables. Figura 3.66 Autoclavando pipetas Pasteur de vidrio.
USO DE LA OLLA A PRESIN Las ollas de presin son cacerolas amplias, construidas para cocinar alimentos con gran rapidez empleando vapor a presin. En algunos laboratorios pequeos se utilizan para esterilizar los utensilios con que se recolectan las muestras. Modelo de vlvula giratoria 1. Llene con agua el fondo de la olla. Coloque los materiales que se van a esterilizar en la canastilla que se sostendr arriba del nivel del agua por medio de un soporte. Los utensilios envueltos se debern poner en posicin vertical (nunca en posicin horizontal; Fig. 3.67). 2. Ajuste la tapa de la olla. Atornllese por medio de su perilla. Colquese la vlvula giratoria (V1) en su eje, que se encuentra sobre la tapa (Fig. 3.68). 3. Caliente la olla sobre una estufa. La vlvula comenzar a girar en poco tiempo, dejando escapar un chorro de vapor. 4. Espere hasta que el chorro de vapor sea continuo y a continuacin disminyase el calor de modo que la vlvula gire lentamente. Consrvese la olla con un calor moderado durante 20 minutos. 5. Reduzca completamente el calor. Deje enfriar la olla (o enfrela bajo el chorro de agua del grifo). Quite la vlvula giratoria de manera que pueda entrar el aire. Retire la tapa. Saque los utensilios estriles y djelos secar. 6. Precaucin: Nunca toque la vlvula de seguridad (V2 en la Fig. 3.68) que se encuentra fija a la tapa. Modelo de vlvula fija 1. Coloque en la olla el agua y los utensilios que se van a esterilizar, como se ha indicado anteriormente. 2. Abra la vlvula que se halla en la tapa. Inicie el calentamiento. 3. Tan pronto como comience a escapar un chorro continuo de vapor por la vlvula, cirrela. 4. Espere hasta que la vlvula comience a silbar. Cuando lo haga redzcase el calor. Djese la olla con un calor moderado durante 20 minutos. 5. Reduzca completamente el calor. Deje enfriar la olla (o enfrela bajo el chorro de agua del grifo). 6. Abra la vlvula de modo que pueda entrar el aire. Saque los utensilios estriles, etc. 7. Precaucin: Nunca toque la vlvula de seguridad. ESTERILIZACIN POR EBULLICIN Este procedimiento solo se debe usar cuando no hay alternativa. Utilice un recipiente especial para esterilizar por ebullicin o, si no se dispone de ste, una cacerola. Llene con agua (de preferencia, desmineralizada). Calintese en la estufa. Los utensilios de vidrio (jeringas) se colocarn en el recipiente mientras el agua est an fra. Los artculos metlicos (agujas, pinzas) se colocarn en el recipiente cuando el agua est hirviendo. Hierva durante 30 minutos los utensilios para recolectar muestras (agujas, jeringas). ESTERILIZACIN CON CALOR SECO ESTERILIZACIN POR EL HORNO DE AIRE CALIENTE El procedimiento de esterilizacin por aire caliente solo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal (jeringas, agujas, pipetas, etc.) cuando no se dispone de autoclave. No debe utilizarse para medios de cultivo utilizados en microbiologa, que deben ser autoclavados (vase antes). Prepare el material para esterilizar, del mismo modo que para el mtodo del autoclave. Los tapones de algodn no debern ser demasiado gruesos, de modo que pueda entrar el are. Levntense ligeramente las tapas de los estuches metlicos y dispnganse de modo que miren a la parte posterior del homo. Ponga el termostato a 175C y encienda el horno. Si hay un ventilador, verifique que est funcionando. Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a 175C sgase calentando durante 60 minutos ms. Si los materiales son pesados o voluminosos, o si hay polvos, aceites, vaselina, etc., calintese a
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175C durante dos horas. Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 40C. Abra la puerta del horno. Cierre las tapas de los estuches metlicos. Saque los materiales estriles. El papel empleado para envolverlos deber haber tomado un color marrn oscuro. Si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante; si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado. ESTERILIZACIN POR FLAMEADO Este mtodo solo se deber utilizar con artculos metlicos como pinzas y bistures. No es conveniente para uso general. 1. Coloque los artculos en una bandeja metlica. 2. Aada unas 10 gotas de etanol y encienda fuego. 3. Durante el flameado incline la bandeja de un lado a otro (Fig. 3.69). Las asas para siembras bacterianas, las agujas de vacunacin y las lancetas para extraccin de muestras de sangre capilar se deben calentar en la llama de un quemador de gas o una lmpara de alcohol hasta que se pongan al rojo vivo.
Figura 3.67 Esterilizando equipo usando una olla a presin. Figura 3.68 Componentes de una olla a presin. Ilustracin anexa A Esterilizacin por ebullicin. Ilustracin anexa B Esterilizacin por el horno de aire caliente.
Nota: Desde hace mucho tiempo y en la actualidad se utilizan jeringas y agujas descartables.
Las jeringas estn hechas de plstico as como el mbolo; las agujas estn fabricadas de metal con el estuche de plstico que se pone en el cono de la jeringa. Completa todo el conjunto un capuchn de plstico que recubre toda la aguja para evitar pinchazos accidentales, y de esta manera, lesiones y transmisiones de enfermedades. Estas jeringas con aguja desechables desde hace bastante tiempo estn a disposicin en muchos hospitales tanto los de mayor complejidad como aquellos de menor complejidad dentro de los cuales se encuentran los centros de salud perifricos anexos. Se resalta el hecho porque son prcticas, seguras y su costo es muy barato. Prcticamente han reemplazado a las jeringas y agujas tradicionales de vidrio y metal por lo que no necesitan ser lavadas ni esterilizadas. Si bien este manual de la
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OMS no las incluye, ser quizs porque piensa en un laboratorio con los mnimos recursos, por ende, coloca el proceso de lavado y esterilizacin de las jeringas y agujas tradicionales. Es menester recalcar que solo se usan una vez y luego se descartan en recipientes adecuados, como el descartador de agujas y algn recipiente dispuesto para tal fin para las jeringas desechables. Respetando lo publicado por la OMS en este manual de Tcnicas bsicas para un laboratorio de salud 2 edicin se deja la explicacin sobre el lavado y la esterilizacin de las jeringas de vidrio y de las agujas metlicas.
Imgenes de jeringas y agujas descartables
Imgenes de dos modelos de recipientes descartadores de agujas desechables y elementos cortopunzantes. 3.6 ELIMINACIN DE RESIDUOS DE LABORATORIO 3.6.1 DESECHO DE MUESTRAS Y MATERIALES INFECTADOS Importante: Las muestras examinadas en el laboratorio (heces fecales, pus, esputo, orina, etc.) frecuentemente son infectantes. Despus de examinarlas se deben destruir de manera que se evite todo riesgo de contaminacin (Vase la seccin 3.8). Estas muestras se pueden desechar en: cajas de cartn o recipientes de material plstico que se pueden destruir (heces fecales, esputo) frascos (tarros) de vidrio y matraces que se puedan limpiar, esterilizar y usar nuevamente. Todos los recipientes desechables se usan solo una vez. Cajas desechables para heces fecales o esputo Estas cajas se pueden quemar (incinerar) o enterrar.
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La incineracin es el procedimiento ms fcil y efectivo. 3.6.2 INCINERACIN DE LOS MATERIALES DE DESECHO FABRICACIN DE UN INCINERADOR (FIG. 3.70) 1. Disponga de un barril o latn metlico grande, usado. 2. Fije con firmeza una rejilla de metal resistente (R) aproximadamente a un tercio de la altura del barril. 3. Corte en el metal una abertura amplia o ventanilla (V) abajo del nivel que ocupa la rejilla. 4. Procure una tapa suelta (T) para el barril. Cmo incinerar 1. Al terminar el trabajo de cada maana y cada tarde colquense en la rejilla del incinerador todas las cajas usadas con heces fecales y esputo (Fig. 3.71). 2. El barril metlico deber estar siempre firmemente cerrado (por medio de la tapa y la ventanilla) excepto durante la incineracin. 3. Incinrelo una vez por semana o ms frecuentemente si es necesario. Llene el fondo del barril con papeles, palos, virutas, etc. 4. Quite la tapa. Encienda el fuego y alimntelo hasta que todos los materiales infectados se hayan reducido a cenizas. 5. Estas cenizas no son peligrosas y se pueden arrojar al basurero. 3.6.3 ENTIERRO DE LOS DESECHOS (a) Abra un foso de 4 - 5 m de profundidad y 1- 2 m de anchura en una ubicacin donde ni las aguas subterrneas ni agua de superficie pueden entrar y donde la lixiviacin de los residuos lquidos hasta las aguas subterrneas no puede ocurrir (Fig. 3.72). Un foso nunca debe ser construido cerca de una fuente de agua. (b) Fabrique una tapa que se ajuste con firmeza a la boca del foso. Es conveniente reforzar el borde de la boca del foso con un revestimiento de ladrillos o piedras. (c) Dos veces al da arroje en el foso las cajas usadas con heces fecales, esputo u otras materias infectadas. Coloque inmediatamente la tapa en su lugar. (d) Una vez por semana cubra los desechos con una capa (de 10 cm de espesor, aproximadamente) de hojas secas. (e) Si es posible, en vez de hojas secas deposite una capa de cal viva una vez por semana.
Figura 3.70 Componentes de un incinerador. T: Tapa; R: Rejilla de metal resistente; V: Ventanilla. Figura 3.71 Usando un incinerador.
Figura 3.72 Entierro de los desechos
3.7 ENVO DE MUESTRAS A UN LABORATORIO DE REFERENCIA Los laboratorios perifricos suelen enviar muestras a los laboratorios de referencia o a otros ms especializados con el fin que efecten exmenes que ellos no estn en condiciones de realizar. Por ejemplo: anlisis serolgicos de treponematosis o tifoidea; cultivos de heces fecales para detectar el
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vibrin del clera; exmenes histolgicos de materiales obtenidos en biopsias. La tabla 3.2 siguiente indica, para cada tipo de muestra y cada examen: el recipiente y el preservativo (cuando sea necesario) que se deben usar la cantidad de muestra que se debe enviar el tiempo que se pueden conservar las muestras 3.7.1 EMPAQUETADO DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVO Respete siempre los reglamentos en vigor en el pas. Coloque las muestras en empaques dobles. Las muestras se metern en frascos o tubos cerrados hermticamente (fijando el tapn con cinta adhesiva, vase Fig. 3.73). Compruebe que el recipiente tenga una etiqueta con el nombre del paciente. Ponga el recipiente sellado en un tubo de aluminio con tapa de rosca. Rellene el espacio existente entre la muestra y el tubo con algodn absorbente. Envuelva el tubo con la solicitud de exmenes de laboratorio (Fig. 3.74). En esta solicitud se debern indicar: el NOMBRE del paciente (escrito con letras maysculas), el sexo, la edad y la fecha de nacimiento la naturaleza de la muestra los exmenes que se solicitan (con el diagnstico del mdico, cuando sea pertinente) la fecha de recoleccin de la muestra la direccin del centro de salud donde la muestra fue recogida. Tambin debe ser firmado por el mdico. Coloque el tubo metlico en una caja de cartn grueso o en una de madera para enviarlo. Rellene el espacio vaco con algodn no absorbente. En el exterior de la caja escriba: URGENTE, FRGIL y si es pertinente, MATERIAL INFECCIOSO (Fig. 3.75).
Figura 3.73 Embalaje de las muestras para su transporte.
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Figura 3.74 Envuelva el formulario de solicitud en torno al tubo de metal que contiene la muestra. Figura 3.75 Etiquetar la caja que contiene la muestra con Urgente, Frgil, Material Infeccioso cuando sea pertinente. Urgent: Urgente; Fragile: Frgil; Infectious material: Material Infeccioso. Tabla 3.2 Envo de muestras a un laboratorio de referencia Cantidad de Recipiente y Tipo de examen de laboratorio muestra que se preservativo enva Frasco de 45 ml con 25 ml Cultivo de bacilo tuberculoso de solucin de -------(vase seccin 5.4) bromuro de cetilpiridinio al 0,6% Cultivo de otros microorganismos Sin preservativo ---------Cultivo de bacilos de la difteria (vase seccin 5.4) Exudado farngeo Tubo con suero coagulado Hisopo de algodn Frasco especial con medio de Stuart modificado (reactivo N 56) (vase seccin 8.4.2) LCR en un frasco estril y hermtico que se enva en un matraz al vaco, relleno con agua a 37C ----------
Tipo de muestra
Duracin
Esputo
10 das
2 horas 24 horas
----------
4 horas
Cultivo de meningococos Lquido cefalorraqudeo (LCR) (vase seccin 8)
----------
24-48 horas
2 ml
12 horas
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Cultivo de otros microorganismos Ensayos qumicos (glucosa, protenas, cloruros, etc., vanse secciones 8.3.4 y 8.3.5) Cultivo de gonococos (vase seccin 5.5) Cultivo de bacterias (vase seccin 5) Recuento de clulas leucocitos y hemates (vanse secciones 9.5 y 9.6)
Frasco estril Frasco estril Frasco especial con medio de Stuart modificado (reactivo N 56) 1 tubo estril Solucin de sal dipotsica EDTA, solucin al 10% (reactivo N 22) Tubo estril sin anticoagulante; enviar suero o gotas de sangre secas lo que se considere apropiado Enviar sucesivas muestras de suero: tomadas en el inicio de la enfermedad tomadas despus de 2 a 4 semanas (para detectar aumento de anticuerpos) 5 mg de Fluoruro de Sodio
2 ml 2 - 4 ml
2 horas 2 horas
Pus uretral
1 hisopo con pus
24 horas
Pus de otros sitios
1 ml
2 horas
5 ml
12 horas
Pruebas serolgicas para sfilis (vase seccin 11 -10)
10 ml
3 das
Pruebas serolgicas para virus HIV y hepatitis B (vanse secciones 11.7 y 11.8)
5 ml
24 horas
Sangre (vase seccin 9-11)
Pruebas para glucosa (vase seccin 10.1) Otros ensayos bioqumicos: bilirrubina colesterol hierro srico lpidos sricos protenas funcionamiento heptico uremia Determinaciones de enzimas: amilasa, fosfatasas, transaminasas
5 ml
2 horas
Frasco sin anticoagulante Envese suero
10 ml
48 horas
Frasco sin anticoagulante Frasco estril especial con 50 ml de caldo de cultivo al que se haya elevado la temperatura a 37C tan pronto como sea posible despus de aadirle la muestra Medio de transporte Cary Blair (reactivo N 17) Solucin salina amortiguada de glicerol (reactivo N 14) Frasco de 30 ml con 15 ml
5 ml
2 horas
Cultivo de sangre
5 ml
24 horas
Todos los cultivos bacterianos, incluso el vibrin del clera (vase seccin 5.9) Heces fecales Todos los cultivos bacterianos, excepto el vibrin del clera Huevos, larvas y quistes de parsitos (vase seccin
----------
4 semanas
---------Aproximadamente 5 ml
2 semanas Casi por tiempo
90
4.2.4)
Amebas: Formas vegetativas (vase seccin 4.2.4)
Anlisis bioqumicos: glucosa, protenas, acetona, etc.; vase seccin 7.2.4 y 7.2.6)
de solucin de formaldehido al 10% (reactivo N 28) Tubo de 10 ml con solucin de tiomersal, yodo y formal dehido (TIF) fijador (reactivo No 58), o alcohol polivinlico (APV, reactivo No.44) Frasco seco y limpio (cerrado hermticamente) Frasco seco y limpio o frasco con 8 gotas de solucin de formaldehido al 10% (reactivo No. 28) Para concentracin: 2 ml de leja comercial y 1 ml de cido clorhdrico Frasco estril Frasco estril
indefinido
----------
Casi por tiempo indefinido
20 -50 ml (segn el nmero de anlisis) 30 ml
2 horas 2 horas
Sedimentos (vase seccin 7.2.7)
30 ml
2 das
Orina (vase seccin 7)
Huevos de Esquistosomas
100 ml
Casi por tiempo indefinido
Cultivo de bacterias(vase seccin 5) Prueba de embarazo (vase seccin 11.5)
20 ml 20 ml (la primera miccin del da)
1 hora 12-24 horas (o 4 das en frigorfico)
Se usan los fijadores siguientes: Tejidos de solucin salina rganos Exmenes histolgicos (vase de obtenidos para seccin 3.7.2) formaldehido ------------------biopsias (reactivo No. 27) fijador de Zenker (reactivo No. 66) Sobre de papel o frasco con tapa Bsqueda de hongos de rosca (no se por lo Pelos, uas, (micosis) (vanse secciones 6.1 y usen menos una ---------tejido cutneo 6.3) tubos con tapn semana (a de caucho ni veces, ms) taponados con algodn) 3.7.2 FIJACIN Y ENVO DE MATERIAL DE BIOPSIAS PARA ESTUDIOS DE HISTOPATOLOGA BIOPSIA Para diagnosticar algunas enfermedades de los rganos el mdico extrae un fragmento de tejido con una pinza o un bistur especiales. Esta pieza de tejido se llama muestra de biopsia. Se examina al microscopio despus de cortar una porcin delgada y tratarla con una tincin especial. HISTOPATOLOGA Las clulas de los tejidos y las muestras de biopsias de los rganos se pueden estudiar con el microscopio. El examen microscpico de las clulas se llama histopatologa. La patologa es el estudio de las modificaciones y deformidades de las clulas causadas por diversas enfermedades. Los exmenes de este tipo pueden ser sumamente importantes, especialmente para el diagnstico del cncer. El tcnico de laboratorio deber ser capaz de fijar la muestra de biopsia, y asegurar que se enve
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de la manera apropiada y llegue al laboratorio de patologa en condiciones de conservacin satisfactorias.

FIJACIN DE MUESTRAS DE BIOPSIAS
El fragmento de tejido se sumerge en un lquido fijador. Este procedimiento deber permitir que se conserve hasta donde sea posible en condiciones semejantes a las del tejido vivo, protegindolo de la accin de las bacterias, la autolisis, el encogimiento, etc. El recipiente ms adecuado para esta clase de muestras es un frasco de material plstico, de boca ancha, con tapa (frasco para tabletas). Se puede obtener en tamaos de 60 ml, 45 ml, 30 ml y 15 ml. FIJADORES Los fijadores que se preparan ms fcilmente son: Solucin salina de formaldehido (reactivo No. 27) Fijador de Zenker (reactivo No. 66). Inmediatamente antes de usar este fijador aada 5 ml de cido actico glacial por cada 100 ml de la solucin de Zenker. TCNICA PARA LA FIJACIN Cantidad del fijador El volumen de fijador necesario es aproximadamente 50 veces mayor que el volumen del tejido de la biopsia. Normalmente ste deber tener un espesor de 3-5 mm (cuando es ms grueso, la fijacin se dificulta o se hace imposible). Sin embargo, el rea de la muestra puede variar y esto determinar la cantidad de fijador que se usar (vase Tabla 3.3). Cantidad de fijador: Tabla 3.3 Clculo de la cantidad de fijador para usar en el material de biopsia Dimensiones de la muestra (cm) Cantidad de fijador (ml) muestra de 0,5 x 0 ,5 cm 6-10 ml muestra de 0,5 x 1 cm 10-15 ml muestra de 1 x 1 cm 20-25 ml muestra de 2 x 1 cm 30-40 ml muestra de 2 x 2 cm 90 ml Preparacin Es esencial actuar rpidamente al recibir una muestra de biopsia. Nunca se deje para despus. Primero vierta el fijador en un recipiente. A continuacin coja la muestra de biopsia con un pedazo de papel duro (cartulina) (no use pinzas, pueden daar el tejido). Deposite la muestra en el recipiente. Etiquetado Corte un rectngulo pequeo (aproximadamente de 3 x 1 cm) de papel duro. Con un lpiz de plomo escriba en el papel el nombre del paciente, la fecha en que se ha obtenido la muestra, etc. Pegue la pieza de papel en el recipiente que contiene el fijador. Tiempo de fijacin El tiempo vara segn el fijador que se utilice. Con los dos fijadores que se han mencionado pueden transcurrir de 24 a 48 horas antes de que la muestra se corte y tia, aunque se puede dejar en el lquido por lo menos durante una semana. El material ya fijado se debe enviar al laboratorio de patologa sin tardanza, aunque un transporte prolongado no daar a las muestras. Envo Asegure la tapa o el tapn del recipiente con cinta adhesiva. Coloque el recipiente en un tubo o una caja de metal, junto con el informe correspondiente (nombre, fecha, enfermedad sospechada, tipo de tejido que se enva, investigacin que se solicita) (vase seccin 3.7.1). A continuacin ponga el tubo o la caja con el informe en un estuche pequeo de madera o cartn, rellene el espacio vaco con algodn no absorbente y envelo inmediatamente. TCNICA DEL EXAMEN HISTOLGICO: GENERALIDADES 1. FIJACIN DE LA MUESTRA (vase antes) 2. INCLUSIN DEL TEJIDO Despus de tratarlo con varias sustancias para deshidratarlo y clarificarlo, el tejido se debe incluir en un bloque slido de parafina. 3. CORTE El bloque en que se ha incluido el tejido se corta en secciones suficientemente delgadas para poderlas examinar con el microscopio. El instrumento que se utiliza para hacer estos cortes se llama "micrtomo" y con l se pueden obtener las secciones sumamente delgadas que se necesitan. El espesor promedio de los cortes es de 3-5 m (micrmetros). 4. TINCIN Los cortes se colocan en portaobjetos y se secan la parafina se desprende aplicando un solvente (por ejemplo, xilol). A continuacin los cortes se deshidratan y tien. Existen varios tipos de tincin; el patlogo elige, segn la naturaleza de la muestra y la enfermedad que se sospecha. 5. PROCEDIMIENTO SUSTITUTO: CORTES CONGELADOS Con objeto de efectuar un diagnstico rpido el tejido se trata con un micrtomo congelador utilizando gas lquido, y al mismo tiempo que congela la muestra fresca no fijada hace los cortes. Este procedimiento se emplea durante las operaciones quirrgicas.
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ENVO DE UN RGANO O TUMOR Se utilizan los mismos fijadores. Sumerja completamente el rgano o tumor en un recipiente grande en donde previamente se ha colocado el fijador.
H Ilustraciones anexas A, B, C, D, E, F, G, H, I Tcnica histolgica: A) Cantidad del fijador. B) Preparacin. C) Etiquetado. D) Tiempo de fijacin. E) Envo. F) Inclusin del tejido. G) Corte. H) Tincin. I) Procedimiento sustituto: cortes congelados.
I 3.8 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Cada laboratorio debe disponer de un manual escrito de las prcticas de seguridad en el laboratorio que se deben seguir en todo momento. El laboratorio debe tener un botiqun de primeros auxilios (ver seccin 3.8.2) y al menos un miembro del personal entrenado en primeros auxilios. El laboratorio debe ser un rea de trabajo solamente, los visitantes deben ser restringidos. Ningn alimento o bebida debe ser consumida en el laboratorio. Usar ropa protectora y sacrsela o en ltimos casos eliminarla antes de salir del laboratorio. Siempre se debe considerar cualquier muestra de laboratorio como potencialmente infeccioso y manejarlo con cuidado, usar guantes protectora. Coloque todas las muestras de manera segura en una mesa o en un estante para evitar que se derrame o rompa. Tenga mucho cuidado en la recogida y procesamiento de muestras de sangre, ya que pueden albergar agentes infecciosos (por ejemplo, virus de la hepatitis B, parsitos, etc.) Cubra todos los cortes con un apsito impermeable (tirita, parche). Deseche las agujas y lancetas usadas con seguridad en una "objetos punzantes" contenedor. (Sharps contenedores se pueden hacer a partir de botellas de plstico con tapn de rosca en la que se hace un agujero.) Una vez llenos, los contenedores deben ser esterilizados en autoclave o empapado en desinfectante antes de quemar o enterrar en una fosa profunda (ver secciones 3.6.2 y 3.6.3 ). Cubra cualquier material derramado o tubos rotos de cultivo con un pao empapado en desinfectante (vase la seccin 3.5.4) y dejar actuar durante 30 minutos. A continuacin, utilice un cepillo duro o una hoja de cartn para barrer en un recipiente para muestras desechable. Al final del da, limpie las mesadas con un pao empapado en desinfectante (vase la seccin
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3.5.4) Lvese bien las manos despus de manipular material infeccioso y antes de abandonar el laboratorio. Las muestras pueden ser eliminadas: En cajas de cartn o recipientes de plstico que pueden ser destruidos (heces, esputo); En frascos de vidrio y botellas que se puedan limpiar, esterilizar y volver a usar (ver secciones 3.5.1, 3.5.2 y 3.5.5). Los recipientes desechables no deben reutilizarse. 3.8.1 PRECAUCIONES PARA EVITAR ACCIDENTES MANIPULACIN DE CIDOS Y LCALIS Dilucin del cido sulfrico con agua Aada siempre el cido sulfrico al agua, gota a gota, agitando la mezcla despus de cada gota. Haga esta operacin de preferencia dentro del fregadero. Nunca vierta el agua en el cido sulfrico (para evitar el peligro de salpicaduras debido a la evaporacin explosiva del agua mientras se mezcla). Frascos con cidos y lcalis Consrvense en los anaqueles inferiores de los armarios. Cuando se coja un frasco del armario, sostngalo firmemente en posicin vertical con la mano seca. No se guarden cidos o lcalis en frascos con tapones de vidrio esmerilado (se pueden adherir). Uso de las pipetas Siempre que sea posible utilice probetas pequeas para medir cidos y lcalis. Si se requiere una medicin ms precisa use una pipeta con una propipeta de goma conectada en la punta. Asprese lentamente, observando siempre el nivel del lquido. CALENTAMIENTO DE UTENSILIOS DE VIDRIO Y LQUIDOS Tubos de ensayo Nunca caliente el fondo de un tubo de ensayo. El lquido que contenga puede borbotear. Caliente el tubo por la mitad, agitndolo suavemente. La boca del tubo se deber orientar en sentido opuesto al operador o cualesquiera otras personas, dirigindolo hacia un espacio vaco o un fregadero. Vidrio ordinario y Pyrex Solamente los utensilios de vidrio Pyrex y los receptculos de porcelana se pueden calentar en la llama del mechero Bunsen. El vidrio corriente se rompera. Lquidos inflamables En el laboratorio solo se deben conservar cantidades reducidas de lquidos inflamables, como ter, etanol, acetona, benceno, tolueno y bisulfuro carbnico, ADVERTENCIA: El ter puede incendiarse aunque se encuentre a varios metros de distancia de una llama. Nunca coloque un frasco con ter sobre una mesa de trabajo en que haya una llama descubierta (mechero Bunsen, lmpara de alcohol, etc.). El bisulfuro carbnico es an ms peligroso. Gas butano o propano Para encender un mechero de gas prndase primeramente un fsforo y aplquese al mechero, abriendo a continuacin la llave del gas. Cada noche se cerrarn las vlvulas principales de todos los depsitos de gas butano. Se cambiarn las conexiones de goma una vez al ao. 3.8.2 PRIMEROS AUXILIOS EN ACCIDENTES DE LABORATORIO En el laboratorio mdico los accidentes pueden ser causados por: 1. cidos 2. lcalis que salpican la piel que salpican los ojos que se ingieren involuntariamente. 3. Sustancias txicas 4. Calor llamas descubiertas lquidos calientes lquidos inflamables explosiones. 5. Vidrios rotos Adems de estos accidentes pueden ocurrir heridas debidas a materiales infectados, lesiones en el organismo por choques elctricos, etc. EQUIPO TIL PARA PRIMEROS AUXILIOS Solucin acuosa de carbonato sdico al 5% (reactivo N 52) Solucin acuosa de bicarbonato sdico al 2%(reactivo N 50) (en frasco gotero para uso oftlmico) Acido actico al 5% (reactivo N 1) Solucin saturada de cido brico (reactivo N 12) (en frasco gotero para uso oftlmico) Solucin de polvos de jabn: 5 g porcada litro de agua Algodn y gasa Mercurocromo y tintura de yodo. Estos artculos debern estar en lugares de fcil acceso en el laboratorio. No se deben guardar en alacenas cerradas. Las soluciones se conservarn en frascos de plstico.
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QUEMADURAS POR CIDOS cidos tales como cido ntrico, cido sulfrico, cido crmico, cido clorhdrico, cido actico y el cido tricloroactico pueden causar lesiones corrosivas. Por tanto, es esencial tomar medidas inmediatas en caso de accidente. En todos los casos: Lavar la zona afectada inmediatamente con grandes cantidades de agua. Salpicaduras de cido en la piel (a) Lvese profusa y repetidamente con agua. (b) Lave la porcin de piel afectada con un pedazo de algodn empapado en solucin acuosa de carbonato sdico al 5% Salpicaduras de cido en el ojo (a) Lvese el ojo inmediatamente con agua abundante aplicada con un frasco de lavado (o una pera de goma) por 15 minutos (Fig. 3.76); dirija el agua hacia el ngulo interno del ojo, cerca de la nariz. Tambin puede poner la cabeza Inclinada bajo el grifo, de modo que el chorro de agua le caiga sobre el ojo (Fig. 3.77). Pida al paciente que cierre el ojo que no se ve afectado. (b) Despus de haber lavado el ojo, ponga en l 4 gotas de solucin acuosa de bicarbonato sdico al 2%. (c) Procrese la atencin de un mdico. Siga aplicando la solucin de bicarbonato al ojo mientras se consigue el auxilio mdico. Ingestin de cidos A l usar una pipeta se pueden ingerir cidos accidentalmente: (a) Llmese un mdico. (b) Haga que el paciente beba inmediatamente cierta cantidad de la solucin jabonosa al 5% o leche (o bien haga que ingiera dos claras de huevo mezcladas con 500 ml de agua o leche). Si no se cuenta con estos recursos el paciente deber beber agua corriente. (c) Indquese al paciente que haga grgaras con la solucin jabonosa o con leche. (d) Adminstrense al paciente 3 4 vasos de agua corriente. (e) Si el cido ha quemado los labios y la lengua: enjuguense profusamente con agua humedzcanse con solucin acuosa de bicarbonato sdico al 2%. Nota: Siempre pipetear cidos usando una propipeta de goma, nunca con la boca. Quemaduras por lcalis (Hidrxido de sodio, de potasio o de amonio) En todos los casos: Lvese inmediatamente con abundante cantidad de agua. Importante: Las quemaduras por lcalis son tan peligrosas o ms que las producidas por cidos. Salpicaduras de lcalis en la piel (a) Lvese profusa y repetidamente con agua. (b) Humedzcase la parte afectada de la piel con un pedazo de algodn empapado con cido actico al 5%, (o vinagre sin diluir, o con jugo de limn). Salpicaduras de lcalis en el ojo (a) Lvese inmediatamente con abundante cantidad de agua por medio de un frasco de lavado (o una pera de goma); dirjase el agua hacia el ngulo interno del ojo, cerca de la nariz (vase Fig. 3.76). Alternativamente, lave el ojo con agua corriente del grifo (vase fig. 3.77). (b) A continuacin lvese el ojo con solucin saturada de cido brico, aplicando repetidas veces gotas de esa solucin. (c) Lleve inmediatamente el paciente a un mdico. Continuar aplicando solucin de cido brico en el ojo hasta que el mdico llegue. Ingestin de lcalis Al usar una pipeta se pueden deglutir lcalis accidentalmente: (a) Bsquese un mdico. (b) Hgase que el paciente beba inmediatamente: solucin de cido actico al 5% (o bien, zumo de limn o vinagre diluido, a razn de una parte de vinagre por cada tres partes de agua). (c) Indquese al paciente que haga grgaras con la misma solucin de cido actico. (d) Adminstrense al paciente tres o cuatro vasos de agua corriente. (e) Si el lcali ha quemado los labios y la lengua: enjuguense profusamente con agua humedzcanse con cido actico al 5%. Intoxicaciones Las intoxicaciones pueden ocurrir por: inhalar vapores o gases txicos (por ejemplo, cloroformo) deglutir accidentalmente una solucin txica que se est aspirando con una pipeta. En todos los casos: (a) Solictense los servicios de un mdico o una enfermera experta, especificando la sustancia txica de que se trate. (b) Colquese la vctima al aire libre mientras se espera al mdico. Quemaduras causadas por calor Estas son de dos tipos: 1. Quemaduras graves que afectan porciones extensas de la piel (por ejemplo quemaduras producidas al derramarse sobre la vctima ter en combustin o agua hirviendo). 2. Quemaduras menores, que afectan una porcin reducida de la piel (por ejemplo, quemaduras
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causadas por utensilios de vidrio calientes o la llama de un mechero Bunsen). Quemaduras graves (a) Si la vctima est envuelta en llamas (por ejemplo, cuando se ha salpicado con ter u otro solvente inflamable que se encuentre en combustin), cbrase rpidamente con una frazada (manta, cobertor) o un sobretodo para aminorar el fuego. (b) Infrmese inmediatamente al mdico que se encuentre de guardia en el departamento de urgencias, explicando con claridad que hay un paciente con quemaduras graves que debe ser atendido. (c) Acustese la vctima en el suelo. No se quiten sus ropas. Cbrase la vctima si siente fro. (d) No se aplique tratamiento alguno a las quemaduras; esto deber quedar a cargo del mdico. Quemaduras menores (a) Sumrjase la parte afectada en agua fra o helada para mitigar el dolor. (b) Aplquese mercurocromo (o tintura de yodo) a la quemadura. (c) Colquese un vendaje de gasa seca, sin apretarlo. (d) Si la quemadura se infecta o no cura, envese el paciente a un mdico. Nunca se rompan las ampollas que se forman en las quemaduras. Nota: Nunca arrancar las ampollas que se forman sobre quemaduras! HERIDAS CAUSADAS POR VIDRIOS ROTOS Vidrios limpios (a) Desinfctese la piel de la manera habitual (con mercurocromo, tintura de yodo, etc.). (b) Cbrase la herida con un vendaje adhesivo (del tipo listo para usarse). (c) Si la herida sangra profusamente, detngase la hemorragia presionando con una compresa (estril si es posible). Envese el paciente al departamento de urgencias. (d) Si la herida sangra intensamente y la sangre brota a intervalos, intntese detener la hemorragia con una compresa y solictese un mdico o una enfermera experta. (e) Continese ejerciendo presin sobre la herida mientras se espera al mdico o la enfermera. Ellos decidirn si deben aplicar un torniquete. Vidrios con materiales infectantes Si los trozos de vidrio contienen heces fecales, pus, cultivos bacterianos, etc.: (a) Obsrvese si la herida sangra; si no es as, exprmase la herida con fuerza para hacerla sangrar durante varios minutos. (b) Bese toda el rea (los bordes y el interior de la herida) con tintura de yodo o un antisptico quirrgico (vase Tabla 3.1). (c) Lvese profusamente con agua jabonosa. (d) Bese nuevamente con tintura de yodo. (e) Si se sabe que hay materias sumamente infecciosas (cultivos bacterianos, pus, etc.) envese la vctima a un mdico. Lesiones orgnicas por choque elctrico En el laboratorio se suele usar una corriente elctrica alterna de bajo voltaje (120 220 V) y los choques elctricos son raros. Estos pueden ocurrir cuando se maneja equipo defectuoso, particularmente con las manos hmedas. Los sntomas son prdida del conocimiento y asfixia. (a) Como primera medida, interrumpa la corriente elctrica. (b) Llame al mdico. (c) Aplquese inmediatamente respiracin artificial (de boca a boca) y masaje externo al corazn si es necesario (vase la Ilustracin anexa A).
Figura 3.76 Enjuagar el ojo con un frasco de polietileno Figura 3.77 Enjuague los ojos bajo el grifo
Ilustracin anexa A Aplquese inmediatamente respiracin artificial (de boca a boca) y masaje externo al corazn si es necesario.
3.9 GARANTA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO
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La garanta de calidad en el laboratorio incluye todos los aspectos del trabajo analtico, desde la correcta identificacin y preparacin del paciente para asegurarse que el resultado del laboratorio vuelva al mdico. El objetivo principal de la garanta de calidad es garantizar que el laboratorio proporciona resultados que son correctos y relevantes para la situacin clnica del paciente. Las etapas en las que se debe aplicar la garanta de calidad incluyen: -La preparacin del paciente -Recoleccin de la muestra -La manipulacin y envo de la muestra (ver secciones 2.6.1 y 3.7) -El control de mtodos y reactivos (vase mtodos individuales) -La calibracin de los equipos (ver seccin 2.5) -La presentacin de los resultados (vase la seccin 2.6.2). 3.9.1 RECOLECCIN DE LA MUESTRA La apropiada coleccin de muestras es de suma importancia si los resultados de laboratorio han de ser relevante para la situacin clnica de un paciente. Cuando el material se recoge con fines de vigilancia y control del tratamiento de los pacientes, los siguientes factores deben ser considerados: -El estado fisiolgico del paciente (por ejemplo, los rangos de referencia de determinados indicadores varan con la edad y el sexo); -La preparacin apropiada de los pacientes para la recogida de muestras (por ejemplo, en sangre, para la medicin de la glucosa y los lpidos se debe tomar por la maana de un paciente que se ha mantenido en ayunas durante 12 horas, debido a que sus concentraciones son elevadas despus de una comida); -Las herramientas adecuadas para la recogida de muestras (por ejemplo, en sangre, para el recuento celular se deben recoger en tubos que contienen sales de EDTA dipotsico para evitar la coagulacin del plasma y la agregacin plaquetaria); -El sitio adecuado para la recogida de muestras (por ejemplo, la concentracin de glucosa es diferente en la sangre arterial y en la venosa). Los aspectos especficos de la recogida de muestras, incluyendo aquellas para la deteccin de microorganismos infecciosos (bacterias y parsitos), se describen en las secciones pertinentes de este manual. Para asegurarse que se obtiene la muestra ms til, se recogern siempre en el momento oportuno. La recoleccin aleatoria debe limitarse a las situaciones de emergencia. Por ejemplo, las muestras de esputo para la deteccin de bacilos de la tuberculosis deben ser recogidas por la maana temprano, mientras que la orina para el diagnstico de la esquistosomiasis y otras condiciones se deben recoger como una muestra de orina "terminal" (ver seccin 7.2.8).
OMS
PARTE 2
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4. PARASITOLOGA 4.1 INTRODUCCIN El estudio de los parsitos que causan enfermedades al ser humano se llama parasitologa mdica. Parsito es un organismo que habita en el interior o sobre otro organismo vivo de una especie diferente, y se alimenta de ste producindole dao. El organismo del que se alimenta el parsito se llama husped. Los parsitos que, como las garrapatas, viven sobre un husped se llaman ectoparsitos. Los parsitos que, como los nematodos o las amebas viven en el interior del husped se conocen como endoparsitos. Muchas enfermedades son causadas por la infeccin producida por parsitos. Ellos constituyen una causa importante de diarrea (ver Tabla 4.1), la cual constituye un importante problema de salud en los pases en desarrollo. Si la diarrea aguda es causada por infeccin parasitaria, esto se puede determinar mediante el examen de una muestra de heces. Es til para los tcnicos de laboratorio entender las formas en que las personas pueden infectarse con parsitos intestinales (ver Tabla 4.2). A continuacin, pueden darse consejos sobre higiene a los miembros de la comunidad y cmo ellos pueden evitar la infeccin por s mismos, sobre todo en el laboratorio. Tabla 4.1 Causas ms comunes de enfermedades diarreicas Tipo de causa Causa especfica Infecciosa Protozoo Amebas Giardia spp. Balantidium coli Isospora belli Cryptosporidium spp. Plasmodium spp. Bacteria Salmonella spp. Shigella spp. Escherichia coli Vibrio chloreae Staphylococcus spp. Campylobacter spp. Virus Rotavirus Helmintos Fasciolopsis spp. Strongyloides stercoralis Trichuris trichura Hymenolepis nana Heterophyes heterophyes No infecciosa Sndromes de mala absorcin Esprue tropical Enfermedad de Crohn Enfermedad de Whipple Intoxicaciones Intoxicacin alimenticia Qumicos Drogas Errores innatos del metabolismo Intolerancia a los carbohidratos Enteropata por gluten Enfermedades metablicas Enfermedad adrenal
Nombre Cientfico Helmintos Ancylostoma duodenale
Tabla 4.2 Vas de transmisin de los parsitos intestinales Nombre comn Cmo se contrae la infeccin? Anquilostoma, Uncinaria; Uncinaria del viejo mundo Lombrices intestinales, scaris Duela heptica china Duela heptica lanceolada Tenia de los peces Tenia del perro Caminar descalzo en el suelo contaminado con heces, jugando en suelo contaminado (nios) Comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, jugando en terreno contaminados con heces (nios) Comer carne poco cocida infectada Tragar las hormigas infectadas (en ensalada sin lavar o jugando en la hierba (nios)) Comer pescado de agua dulce crudo o poco cocinado Tragar pulgas del perro (nios) Caminar descalzo en el suelo contaminado por heces fecales; autoinfeccin, el contacto con personas infectadas con las manos sucias; la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio Comer ensaladas sin lavar Comer ensaladas sin lavar
Ascaris lumbricoides Clonorchis sinensis Dicrocoelium dendriticum, D. hospes Diphyllobothrium latum Dipylidium caninum
Enterobius vermicularis
Oxiuro
Fasciola gigantica Fasciola hepatica
Duela heptica gigante Duela del hgado
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Fasciolopsis buski Heterophyes heterophyes Hymenolepis diminuta Hymenolepis nana Metagonimus yokogawai Necator americanus Paragonimus westermani Schistosoma haematobium Schistosoma intercalatum
Duela intestinal gigante Duela enana Tenia de la rata Tenia enana Duela japonesa Uncinaria; Uncinaria americana Duela oriental del pulmn Esquistosoma (vesical) Esquistosoma (rectal)
Schistosoma japonicum Schistosoma mansoni Taenia saginata Taenia solium: Adultos Forma larvales (cisticercos) Trichostrongylus spp. Trichuris trichiura Protozoos Balantidium coli
Esquistosoma (asitico u oriental) Esquistosoma (intestinal) Tenia de la vaca; lombriz solitaria Tenia del cerdo
Comer ensaladas sin lavar Comer carne poco cocida infectada Tragar pulgas de la rata Comer vegetales contaminados; autoinfeccin Comer carne poco cocida infectada Caminar descalzo en el suelo contaminado por heces, jugando en suelo contaminado (nios) Comer cangrejos de agua dulce infectados poco cocidos Baarse en los ros o estanques contaminados con orina o heces infectadas Baarse en los ros o estanques contaminados con orina o heces infectadas Baarse en los ros o estanques contaminados con orina o heces infectadas Baarse en los ros o estanques contaminados con orina o heces infectadas Comer carne poco cocida infectada Comer carne poco cocida infectada Comer verduras crudas sin lavar; autoinfeccin Comer ensaladas sin lavar (Asia) Comer verduras crudas sin lavar y ensaladas Comer verduras sin lavar, ponerse en contacto con cerdos infectados (en las granjas) Beber agua contaminada, comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, ponerse en contacto con personas infectadas con las manos sucias, la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio Beber agua contaminada, comer verduras crudas sin lavar y ensaladas, ponerse en contacto con personas infectadas con las manos sucias; la inobservancia de las normas de seguridad relativas a la limpieza en el laboratorio
------------------Tricocfalo
-------------------
Entamoeba histolytica
-------------------
Giardia intestinalis
-------------------
4.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES PARA PARSITOS 4.2.1 COLECCIN DE MUESTRAS La confiabilidad de los resultados depende considerablemente del cuidado que se ejerza al recolectar las heces fecales. Se deben tomar las precauciones que se exponen a continuacin para los anlisis de heces fecales en busca de parsitos Recoja aproximadamente 100 g de heces en un recipiente limpio, seco y sin conservantes. Un recipiente con tapa de rosca es el ms adecuado (vase la seccin 2.5.5). Asegrese de que los gusanos adultos o los segmentos (progltides) estn incluidos. Para la recogida de muestras de heces para examen bacteriolgico (por ejemplo, para el cultivo del clera y otras bacterias que causa la disentera), ver seccin 5.9.4. Precauciones Nunca deje las muestras de heces expuestas al aire en recipientes sin tapa. Nunca acepte muestras de heces mezcladas con orina (por ejemplo, en un orinal o chata). Nunca examinar las muestras de heces sin antes ponerse los guantes. Siempre examine las muestras de heces dentro de 1-4 horas despus de la recoleccin. Si se reciben varias muestras al mismo tiempo, examinar las heces lquidas y las que contienen moco o sangre primero, ya que pueden contener amebas mviles (que mueren rpidamente). Nunca coloque el recipiente que contiene la muestra de heces sobre la plantilla de solicitud de examen. 4.2.2 EXAMEN VISUAL Las muestras fecales se describen mejor por su color, la consistencia y la presencia o ausencia de sangre macroscpica o exudado. Color El color se puede describir como: - Negro (sangre oculta) - Marrn, amarillo plido (grasa) - Blanco (ictericia obstructiva). Consistencia (Fig. 4.1) La consistencia se puede describir como: - Formada (forma normal) - Formada blanda - uniforme o lquida (acuosa).
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La presencia de sangre o moco externa, que suele presentarse en forma de lneas de color rojo o negro, hay que sealar. La sangre puede estar presente en ciertas condiciones mdicas (por ejemplo, colitis ulcerosa, esquistosomiasis,).
Figura 4.1 Evaluacin de la consistencia de las muestras fecales. F: Formada; B: Blanda; A: (acuosa). 4.2.3 EL EXAMEN MICROSCPICO El examen microscpico de las heces en suspensin salina o de yodo es til por las razones siguientes: - Para detectar trofozotos mviles; - Para detectar huevos y quistes presentes en cantidades moderadas; - Para detectar eritrocitos, restos celulares o exceso de grasa. Seleccione las heces no formadas o lquidas cuando se utiliza la microscopa directa para la deteccin de trofozotos. Las heces formadas rara vez contienen trofozotos mviles. Tambin se realizar un examen directo de cualquier sangre o moco externo. Materiales y reactivos (Fig. 4.2) Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Aplicadores de madera o asas de alambre (0,45 mm, alambre de aleacin de nquel-cromo) Lpices de grasa o cera; alternativamente, marcadores permanentes cloruro de sodio, solucin al 0,85% (no reactivo. 53) Solucin yodada de lugol, solucin al 0,5% (no reactivo. 37) cido actico, solucin al 50% (no reactivo. 3), se diluy 1:1 con agua destilada Solucin de azul de metileno (no reactivo. 39) Eosina, 2% en solucin salina (no reactivo. 24).
Figura 4.2 Materiales y reactivos para el examen microscpico directo de las heces para la bsqueda de parsitos. Figura 4.3 Aadiendo una gota de solucin salina y una gota de la suspensin de yodo al portaobjeto.
Figura 4.4 Muestreo de un espcimen fecal para bsqueda de huevos de parsitos. La ilustracin muestra en este caso que la materia fecal est bien formada, entonces, tmese esta porcin de una parte profunda de la muestra (puede haber huevos de parsitos) y de la superficie.
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B Ilustraciones anexas A, B, C. A) Cuando las heces contienen moco o son lquidas, tmese la porcin indicada del moco sanguinolento de la superficie o del lquido que las rodea (puede haber amebas). B) Mezcle la porcin tomada de la muestra con la gota de solucin de cloruro sdico que se ha depositado en el portaobjetos. C) Con el aplicador o el asa de alambre tmese otra porcin de la muestra y mzclela con la gota de solucin yodada.
C Mtodo 1. Preparar una mezcla 1:1 de solucin de yodo de Lugol y solucin de cido actico (diluido como se expuso anteriormente). Diluir la mezcla con cuatro volmenes de agua destilada y agtela. 2. Tome un portaobjetos seco y la etiqueta con el nombre o nmero del paciente. 3. Ponga: - Una gota de solucin de cloruro sdico calentado a 37 C en el medio de la mitad izquierda del portaobjeto; y - Una gota de la solucin de yodo- cido actico en el medio de la mitad derecha del portaobjeto (Fig. 4.3). 4. Con el aplicador o el asa de alambre tmese una pequea porcin (aproximadamente 2-3mm de dimetro) de las heces. (a) Si las heces estn bien formadas, tmese esta porcin de una parte profunda de la muestra, en especial y si es posible, del centro de la muestra (Fig. 4.4) y de la superficie en busca de huevos de parsitos. (b) Si las heces contienen moco o son lquidas, tmese la porcin indicada del moco sanguinolento de la superficie o del lquido que las rodea (puede haber amebas). 5. Mezclar la muestra con la gota de solucin de cloruro de sodio en el portaobjeto. 6. Usando el aplicador o asa de alambre, tomar una segunda porcin de la muestra de heces como se describi anteriormente y se mezcla con la gota de solucin de yodo-cido actico. Tire el aplicador (o queme el asa de alambre en un mechero de Bunsen) despus de su uso. 7. Colocar un cubreobjetos sobre cada gota (aplicar los cubreobjetos tal como se muestra en la Fig. 4.5 para evitar la formacin de burbujas de aire). 8. Examine la preparacin en el microscopio. Para la preparacin salina utilizar los objetivos x 10 y x 40 y un ocular de x 5. Como los huevos y quistes son incoloros, reducir la cantidad de luz usando la abertura del condensador o bajar el condensador para aumentar el contraste. Para la preparacin con solucin yodada emplee un objetivo x 40 (es decir, primero observar con un objetivo x 10 y luego pasar a uno de x 40). Examinar la primera preparacin con el objetivo x10, comenzando en la esquina superior izquierda, como se indica en la figura. 4.6. Enfoque sobre el borde de un cubreobjetos utilizando el objetivo x 10 y examinar toda el rea bajo cada cubreobjetos para investigar la presencia de huevos y larvas de Strongyloides stercoralis. Con el objeto de asegurar que ninguna parte del campo microscpico se deja de observar, escoja un objeto que se halle en la orilla del campo visual y mueva el portaobjetos a travs de la platina del microscopio, examinando el campo hasta que el objeto escogido se encuentre en la orilla contraria. Repita este procedimiento en todo el campo microscpico. Despus de examinar cada campo use por lo menos una vez el objetivo x 40 para investigar la presencia de protozoarios, que son sumamente pequeos. Esto es, cambiar al objetivo x 40 y de nuevo examinar toda el rea del cubreobjetos de la solucin salina para la bsqueda de los trofozotos mviles y haga lo mismo para el rea del cubreobjetos con solucin yodada para la bsqueda de los quistes. La solucin yodada puede inmovilizar a los trofozotos, es por esto que se aconseja observar los quistes en la preparacin con lugol. Si bien con la solucin salina aparte de poder detectar a los trofozotos mviles tambin se puede llegar a observar las formas qusticas de los protozoos, pero esto precisa mayor experiencia por parte del observador. 9. La solucin de yodo de Lugol - cido actico hace que las formas de trofozoitos se vuelvan inmviles. El ncleo del protozoo aparece claramente teido con el lugol, pero puede ser difcil distinguir entre las formas de trofozoitos y qustica. 10. Usando una pipeta Pasteur delgada, deje una gota de solucin de azul de metileno para que se escurra bajo el cubreobjetos de la preparacin salina (Fig. 4.7). Esto teir los ncleos de cualquier clula presente y permitir distinguir el ncleo lobulado de los polimorfos de los grandes ncleos solitarios de las clulas de la mucosa. 11. Si se aade una gota de solucin de eosina, todo el campo se tie con excepcin de los protozoos (amebas en particular), que siguen sin color y por lo tanto fcilmente reconocibles.
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Figura 4.5 Tcnica para la aplicacin de un cubreobjetos para evitar la formacin de burbujas de aire. Figura 4.6 Examine la primera de las dos preparaciones con el objetivo x 10, comenzando en el ngulo superior izquierdo y siguiendo el camino para la bsqueda de huevos y larvas de parsitos, como se indica en la ilustracin. Figura 4.7 tincin de la preparacin salina con azul de metileno. Ilustraciones anexas D, E, F. D) Con un lpiz de cera o graso o con un marcador permanente marque el nmero de la muestra en el portaobjetos. E) Examine las preparaciones con el microscopio. Preparacin con solucin salina (SS). Preparacin con lugol. F) escoja un objeto que se halle en la orilla del campo visual y mueva el portaobjetos a travs de la platina del microscopio, examinando el campo hasta que el objeto escogido se encuentre en la orilla F contraria. Repita este procedimiento en todo el campo microscpico. 4.2.4 ENVO DE HECES PARA LA DETECCIN DE PARSITOS Las heces pueden ser enviadas a un laboratorio especializado para la identificacin de parsitos raros que son difciles de reconocer. En tales casos, un conservante, debe aadirse a las muestras antes que se enven para su examen. Se utilizan los siguientes conservantes: -Formaldehido, solucin al 10% (reactivo n 28.), para montaje en fresco; - Yodo de Lugol solucin, 0,5% (reactivo no 37.); - Alcohol de polivinilo (PVA) fijador (no reactivo 44.); - Fijador Tiomersal-yodo-formaldehido (TIF) (no reactivo. 58), para montaje en fresco. - Fijador Tiomersal-yodo-formaldehido (TIF) (no reactivo. 58), para montaje en fresco. USO DE SOLUCIN DE FORMALDEHIDO AL 10% 1. Preparar una mezcla que contiene alrededor de una parte de la materia fecal a tres partes de solucin de formaldehido (Fig. 4.8). 2. Machacar las heces a fondo con una varilla de vidrio (Fig. 4.9). El Formaldehido en solucin conserva huevos y quistes de parsitos indefinidamente si el recipiente de la muestra est bien cerrado. No preserva las formas vegetativas de protozoos, que son destruidas despus de unos das. USO DE FIJADOR DE ALCOHOL POLIVINLICO (PVA) En un frasco 1. Verter aproximadamente 30 ml de PVA fijador en un frasco de 40 ml. 2. Aadir heces frescas en cantidad suficiente como para llenar el ltimo cuarto del frasco. 3. Mezclar bien con una varilla de vidrio. El fijador PVA conserva todas las formas de parsitos indefinidamente. En un portaobjetos 1. Para examinar amebas y flagelados, colocar una pequea porcin de la materia fecal en un extremo del portaobjetos. 2. Agregue tres gotas de fijador PVA a las heces. 3. Utilizando una varilla de vidrio, cuidadosamente extienda la muestra sobre aproximadamente la mitad del portaobjetos (Fig. 4.10). Dejar secar durante 12 horas (preferiblemente a 37 C).
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Los especmenes conservados de esta forma se puede mantener durante aproximadamente 3 meses. Estos se pueden teir a su llegada al laboratorio especializado. USO DE FIJADOR TIOMERSAL1-YODO-FORMALDEHDO (TIF) 1 Tambin conocido como timerosal y mercuriotiolato (Merthiolate). 1. Justo antes de su envo, mezclar 4,7 ml de fijador TIF y 0,3 ml de solucin de yodo de Lugol en un tubo o un frasco pequeo. 2. Aadir aproximadamente 2 ml (2 cm3) de las heces y aplastar bien con una varilla de vidrio. La mezcla anteriormente mencionada preserva todas las formas de parsitos indefinidamente, incluyendo las formas vegetativas de amebas (las de los flagelados se deterioran ligeramente).
Figura 4.8 Preservando una muestra fecal en una solucin de formaldehido. Figura 4.9 Trituracin de la muestra fecal con una varilla de vidrio. Figura 4.10 Extensin de una muestra fecal en un portaobjeto. Tabla 4.3 Patogenicidad de los protozoos intestinales Especies Patogenicidad Amebas nica ameba que es comnmente patgena para los seres humanos. Puede causar disentera o abscesos Entamoeba coli No patgena, pero muy comn Entamoeba hartmanni, Endolimax nanus, Iodamoeba No patognicas. La diferenciacin es difcil, pero no es butschlii, realmente necesaria; es suficiente como para ser capaz Dientamoeba fragilis de distinguir estas especies de Entamoeba histolytica Flagelados Giardia intestinalis Patgeno Trichomonas hominis No patognica Chilomastix mesnili No patognica Ciliados Balantidium coli Patgeno 4.3 PROTOZOOS INTESTINALES Los protozoos son microorganismos que consisten en una sola clula (unicelulares). Los protozoos intestinales se pueden encontrar en las heces en su forma mvil (trofozotos) o como quistes. Algunos protozoos intestinales son patgenos (ver Tabla 4.3), mientras que otros son inofensivos. Todos estos protozoos se encuentran en todo el mundo. 4.3.1 IDENTIFICACIN DE FORMAS MVILES (TROFOZOTOS) Los trofozotos de los protozoos son mviles (Fig. 4.11): -Ya sea a causa de movimientos lentos de la clula (amebas); -O porque avanzan rpidamente debido a los flagelos (hilos largos como ltigos) o a los cilios (numerosos pelos cortos). Los trofozotos se encuentran principalmente en: -Heces acuosas -Heces que contienen moco -Heces formadas blandas. Las siguientes caractersticas son tiles para la identificacin de formas mviles de protozoos intestinales (Fig. 4.12): -Tamao -Citoplasma Entamoeba histolytica
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-Pseudpodos -Ncleos -Ectoplasma -Endoplasma -Vacuolas -Cuerpos de inclusin que contienen eritrocitos, bacterias, clulas de levadura, restos (detritus), etc. -Membrana nuclear (cromatina) - Cariosoma nuclear -Flagelos -Membrana ondulante.
Figura 4.11 Formas mviles de protozoos A: ameba, F: flagelado; C: ciliados.
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Identificacin de formas mviles de amebas Entamoeba histolytica (Figs. 4.13 y 4.14) (Ameba de la disentera) Tamao: vara entre 12 y 35 m (generalmente tiene igual longitud que 3 4 glbulos rojos) Forma: cuando est en movimiento se alarga y cambia de forma; de lo contrario es redonda Movilidad: se mueve en una sola direccin; emite un seudpodo que la hace avanzar y el endoplasma entra rpidamente en l, y lo llena Citoplasma: el ectoplasma es transparente y se puede distinguir claramente del endoplasma, que tiene una composicin granulosa fina (gris, con matices verdes amarillentos), en la que puede haber vacuolas Ncleo: no es visible en la forma mvil, pero al teir el parsito con solucin de yodo se observa claramente que posee una membrana uniforme y un cariosoma central, pequeo y denso (punto negro). En las heces fecales lquidas o diarreicas se pueden encontrar dos formas mviles de E. histolytica: Una forma invasiva y una forma no invasiva. (a) la forma invasiva, que mide 20-35 m, con vacuolas que contienen eritrocitos ms o menos digeridos (de 1 a 20, de diferentes tamaos) que ponen de manifiesto su actividad hematfaga (es decir, que se alimenta con sangre) y, por lo tanto, su capacidad patgena (ver Fig. 4.13); (b) la forma no invasiva, no patgena, que prolifera en la cavidad intestinal, donde se alimenta de bacterias u otras materias locales que se pueden observar en el interior de las vacuolas; mide 1220/m (ver Fig. 4.14). Entamoeba coli (Fig. 4.15) Tamao: 20-40 m (generalmente es mayor que E. histolytica) Forma: oval o alargada, y ms bien irregular Movilidad: con frecuencia se encuentra inmvil o se desplaza con suma lentitud, emitiendo seudpodos romos en todas direcciones, a tientas Citoplasma: es difcil diferenciar el ectoplasma del endoplasma granuloso Cuerpos de inclusin: son numerosos y variados (bacterias, levaduras, residuos de diferentes clases), pero nunca glbulos rojos Ncleo: visible en preparaciones frescas, sin tincin. La membrana es irregular y granulosa (semeja un collar de cuentecillas); el cariosoma es grande y excntrico. La Tabla 4.4 resume las caractersticas utilizadas para el diagnstico diferencial de Entamoeba histolytica y E. coli. Si un trofozoto se mueve rpidamente en una direccin y proyecta pseudpodos rpidamente, es probable que sea Entamoeba histolytica. Otras especies de amebas no suelen moverse de esta manera. Si el trofozoto se mueve como se ha descrito y si los eritrocitos estn presentes en el citoplasma, se puede suponer que se trata de E. histolytica. Si es necesario, se puede utilizar azul de metileno tamponado para teir el ncleo para su confirmacin.
Figura 4.13 y figura 4.14 En las heces fecales lquidas o diarreicas se pueden encontrar dos formas mviles de E. histolytica: Una forma invasiva y una forma no invasiva.
Figura 4.15 Trofozoto de Entamoeba coli. Las flechas indican las direcciones de los seudpodos.
Tabla 4.4 Caractersticas para el diagnstico diferencial de Entamoeba histolytica y E. coli E. histolytica (Ameba de la Entamoeba coli (Ameba del Caracterstica disentera) colon) Desplazamiento En direccin definida Al azar Movilidad Medianamente mvil Poco mvil o inmvil Ectoplasma Transparente, muy Diferenciacin escasa o nula
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diferente del endoplasma Cuerpos de inclusin Ncleo (preparaciones frescas) Ncleo (despus de teirlo con la solucin de Yodo) Eritrocitos si es hematfaga Invisible Membrana uniforme Cariosoma central, denso y pequeo
con el endoplasma Bacterias, levaduras y diversos residuos, pero no eritrocitos Visible (membrana nuclear que semeja un collar de cuentecillas) Membrana irregular Cariosoma voluminoso y excntrico
Otras amebas Entamoeba hartmanni (Fig. 4.16) Tamao: pequea; siempre menos de 10 pm (aproximadamente el mismo tamao de un glbulo rojo) Todas sus caractersticas son semejantes a las de E. histolytica, pero nunca contiene glbulos rojos. Puede haber vacuolas claramente visibles. Endolimax nana (Fig. 4.17) Tamao: pequea; 6-10 m Movilidad: numerosos seudpodos pequeos y romos que se mueven lentamente en todas direcciones Citoplasma: sumamente granuloso, con vacuolas pequeas Cuerpos de inclusin: diversos (principalmente bacterias) Ncleo: (Con solucin de yodo) cariosoma que semeja una mancha de tinta. lodamoeba butschlii (Fig. 4.18) Tamao: mediana; 10-15 m Forma: compacta, semejante a una hoja vegetal Movilidad: sumamente lenta; seudpodos claros, romos o semejantes a dedos Cuerpos de inclusin: bacterias, vacuolas grandes Ncleo: (con solucin de yodo) cariosoma oval y voluminoso junto a un grupo de grnulos. I. butschlii raras veces se encuentra en las heces fecales. Dientamoeba fragilis (Fig. 4.19) Tamao: pequea, redonda, de 6-15 m Movilidad: Inmvil (casi siempre) o sumamente mvil (en heces fecales lquidas muy frescas), con seudpodos que semejan las hojas de un ventilador elctrico; se inmoviliza rpidamente bajo el cubreobjetos. Citoplasma: Ectoplasma claro Cuerpos de inclusin: bacterias Ncleo: (con solucin de yodo) 1 2 ncleos; cariosomas divididos en 46 grnulos (membrana difcilmente visible). Identificacin de formas mviles de flagelados Todos estos parsitos, exceptuando Trichomonas hominis, se pueden encontrar en su forma vegetativa, flagelada y activa, o como quistes Inactivos. Los quistes se describen ms adelante. Giardia lamblia intestinalis (el flagelado de mayor longitud) (Fig. 4.20) Tamao: 10-18 m (el tamao de 2 glbulos rojos) Forma: ms bien alargada: Vista frontal: piriforme Vista lateral: forma de cuchara Movilidad: se puede desplazar hacia adelante con pequeos tirones rpidos, en direccin definida, o bien dando giros (cuando se encuentra en heces lquidas) en tanto que otras veces se halla casi inmvil. Contenido: 2 grandes ncleos ovalados, tenuemente visibles. Importante: el movimiento caracterstico de este flagelado solo se observa en heces fecales lquidas y frescas en las heces lquidas los depsitos de moco frecuentemente contienen grupos numerosos de G. lamblia intestinalis en las heces fecales blandas es frecuente encontrar juntas las formas vegetativa y qustica del parsito. Trichomonas hominis (Fig. 4.21) Tamao: 10-15 m (ligeramente menos que G. lamblia intestinalis) Forma: oval, con 2 polos adelgazados Movilidad: gira y se vuelve en todos sentidos, pareciendo vibrar Membrana solo se encuentra en un lado; es sumamente ondulante: mvil (efecta rpidos movimientos ondulatorios) Ncleo: un ncleo, difcil de identificar Flagelos: generalmente 4. Trichomonas es el flagelado ms resistente. Conserva su movilidad an en las heces fecales "viejas". Chilomastix mesnili (Fig. 4.22) Tamao: 10-15 m Forma: triangular y adelgazada en un extremo, pareciendo que tuviera una torsin
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Movilidad: se desplaza en una direccin definida, en espiral Citoplasma: verde grisceo con: una lnea clara, en espiral, alrededor de la cual gira este flagelado (forma de "8"), cerca del extremo adelgazado una hendidura semejante a una boca (el citostoma, que es dbilmente visible), cerca del extremo redondeado Ncleo: un ncleo, que se observa con facilidad en las preparaciones no teidas.
Figura 4.20 Trofozoto de Giardia (lamblia) intestinalis. Se observan claramente los flagelos, as como el movimiento que hace la Giardia.
Figura 4.21 Trofozoto de Trichomonas hominis. Se observan claramente los flagelos, as como el movimiento. Figura 4.22 Trofozoto de Chilomastix mesnili. Se observan claramente los flagelos, as como el movimiento. Identificacin de formas mviles de ciliados Balantidium coli (raro) (Fig. 4.23) Tamao: sumamente voluminoso: 50 m (con frecuencia es tan voluminoso o mayor que un huevo de scaris) Forma: oval, con un polo ms redondeado que el otro; transparente Cilios: cubierto por numerosos cilios pequeos, que se mueven agitadamente Movilidad: se desplaza con suma rapidez en las heces fecales, atravesando el campo microscpico en direccin definida y, otras veces, se mueve en crculos Ncleo: un gran ncleo reniforme junto a otro ncleo pequeo y redondo "Boca": un citostoma, especie de boca que se contrae y relaja dando entrada a diversos materiales como restos celulares. Importante: Si las heces fecales se dejan expuestas al aire en un recipiente sin tapa pueden caer en ellas microorganismos de la atmsfera, como los infusorios. Estos son muy semejantes a Balantidium coli.
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Figura 4.23 Trofozoto de Balantidium coli. Se observa en el crculo, la ilustracin de su movilidad caracterstica. Tambin se logra percibir los cilios que rodean todo el cuerpo del protozoo.
Tincin rpida de campo para trofozotos fecales Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Soporte para portaobjetos Tincin de campo (no reactivo 25): -Tinte de campo A (sin diluir) -Tinte de campo B (diluido una parte de tinte en cuatro partes de agua destilada) Solucin de cloruro de sodio, 0,85% (no reactivo 53) Metanol. Mtodo 1. Preparar un frotis fecal fino en solucin de cloruro de sodio sobre un portaobjetos limpio. 2. Una vez que el frotis est seco, fijar cubriendo el portaobjeto con metanol durante 3 minutos. 3. Incline el metanol. No se olvide de tapar el frasco con metanol puesto que es un reactivo txico. 4. Pipetear 1 ml del tinte de campo diluido B sobre el portaobjetos, seguido de 1 ml del A. 5. Mezclar bien mediante la inclinacin del portaobjetos y deje actuar el tinte durante 1 minuto. 6. Lave el portaobjetos en agua y deje que se seque al aire. 7. Examinar el portaobjetos usando el objetivo x 100 con aceite de inmersin. Busque en el frotis teido, en particular alrededor de los bordes. El citoplasma y los flagelos de los trofozotos de Giardia intestinalis se tien de azul y sus ncleos se tien de rojo. Los quistes de G. intestinalis tambin se tien de azul y sus ncleos se tien de rojo. Nota: Deje las tinciones recin preparadas durante 3 das antes de su uso. Utilizar el agua de lluvia para preparar las tinciones si el suministro de agua de pozo local es demasiado salada. cubrir los frascos que contienen las soluciones de tincin para evitar la evaporacin y la absorcin de polvo. Evite llevar una solucin de tincin a otra. Eosina para trofozotos y quistes fecales Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos soporte para portaobjetos Cubreobjetos Eosina, 1% de solucin (no reactivo. 23). Mtodo 1. Emulsionar una pequea porcin de las heces en solucin de eosina al 1% en un portaobjetos limpio. Esparcir en un rea de aproximadamente 2 cm x 1 cm. 2. Coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y colocarlo en la platina del microscopio. 3. Use el objetivo x10 para examinar el frotis sistemticamente para encontrar trofozotos y quistes no teidos. Examinar con ms detalle con el objetivo x40. La eosina proporciona un fondo de color rosa contra el que los trofozotos y quistes no teidos son claramente visibles. Nota: Si la solucin de eosina al 1% no est disponible, utilizar una gota del tinte de campo B (ver ms arriba). 4.3.2 IDENTIFICACIN DE LOS QUISTES Los quistes son las formas resistentes de ciertas amebas intestinales, los flagelados y ciliados. Son pequeos, redondos y no mviles y pueden tener uno o varios ncleos. El estudio de los quistes es til para la correcta identificacin de las especies. Importancia de los quistes (a) Importancia clnica
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La importancia clnica de los quistes vara de un pas a otro. Lo esencial es encontrar y reconocer quistes de Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y Balantidium coli, aunque su presencia en las heces fecales posee menor significado inmediato que la de las formas vegetativas. Individuos saludables pueden ser portadores de quistes. (b) Importancia para la salud pblica Los quistes son la forma infectante de los parsitos que aqu se tratan. Por lo tanto, los portadores de quistes significan un riesgo para la salud pblica. La deteccin de los quistes tambin puede ser de provecho para la epidemiologa. Algunas de las caractersticas utilizadas en la identificacin de estos quistes y los de otros protozoos intestinales se ilustran en la figura 4.24.
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Tipos de heces fecales con quistes Por lo general, los quistes se encuentran en heces blandas y duras por igual. Examen en portaobjetos 1. Preparacin en solucin de cloruro sdico Los quistes se pueden observar como glbulos transparentes que refractan la luz y se distinguen claramente contra el fondo de color gris. Poseen envolturas bien definidas. 2. Preparacin en solucin de yodo (solucin yodada diluida 5 veces) Al teirse los ncleos, examnense con el objetivo x 40. 3. Recuento de los ncleos Grese el tornillo de ajuste lento del microscopio. 4. Identificacin Nunca es suficiente reconocer un solo quiste; la identificacin depende de que se observen varios quistes sucesivamente. 5. Concentracin Si es necesario, sese el mtodo de concentracin de formaldehido y ter (vase la pgina 165) para observar un nmero mayor de quistes y lograr una identificacin ms firme. En la misma muestra de heces fecales se pueden encontrar quistes de especies diferentes. Identificacin de quistes de amebas Entamoeba histolytica (Fig. 4.25) Esta ameba causa disentera Tamao: 12-15pm (1- 2 glbulos rojos) Forma: redonda Ncleos: 1- 4 ncleos: membrana delgada, uniforme, circular cariosoma pequeo, compacto, central (semejante a una mancha negra) Citoplasma:(con solucin de yodo) gris amarillento y granuloso; parece "sucio" Cuerpos cromatoides: oblongos, redondeados en los extremos (forma de salchicha); no se encuentran en todos los quistes Vacuola: a veces hay una vacuola de glucgeno voluminosa.(teida de pardo rojizo por la solucin yodada) en los quistes jvenes con 1 -2 ncleos. Quistes de otras amebas que no causan enfermedades Su identificacin es difcil. Ante todo se debe distinguir entre estos quistes y los de E. histolytica. Entamoeba coli (Fig. 4.26) Tamao: 12-20 m (2-2% glbulos rojos; un poco mayor que el quiste de E. histolytica) Forma: redonda o ligeramente oval; algunas veces es irregular Ncleos: 1-8 ncleos: membrana irregular, engrosada en algunas partes; no forma un crculo perfecto cariosoma voluminoso, difuso, frecuentemente excntrico Citoplasma:(con solucin de yodo) amarillo plido, brillante (en comparacin con el de E. histolytica) Cuerpos cromatoides: extremos agudos o mellados (en forma de cuchillo o aguja); no se encuentran en todos los quistes Vacuola: algunas veces existe una vacuola sumamente voluminosa (teida de rojo pardo por la solucin de yodo) que comprime dos ncleos, uno en cada polo. Entamoeba hartmanni (Fig. 4.27) Tamao: quiste pequeo, de 4 -8 m (% dimetro de un glbulo rojo) Ncleos: 1- 4, idnticos a los de E. histolytica. Endolimax nana (Fig. 4.28) Tamao: muy pequea; 8-10 m Forma: ms o menos oval Ncleos: 1- 4 membrana: no es visible cariosoma: voluminoso, de contorno irregular Citoplasma: claro, sin grnulos; la solucin de yodo lo tie de amarillo intenso. lodamoeba butschlii (Fig. 4.29) Tamao: quiste pequeo, de 8-10 m Forma: variable (redonda, oval o irregular) Ncleo: casi siempre un solo ncleo: membrana: no es visible cariosoma: sumamente voluminoso, oval, comprimido contra un hacinamiento de grnulos Vacuola: una vacuola de glucgeno sumamente voluminosa (teida de rojo pardo por la solucin yodada, de donde proviene el nombre de lodamoeba), que con frecuencia ocupa la mitad del quiste. Dientamoeba fragilis No se observa en forma qustica.
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Figura 4.25 Quistes de Entamoeba hitolytica. Figura 4.26 Quistes de Entamoeba coli.
Figura 4.27 Quistes de Entamoeba hartmanni. Figura 4.28 Quistes de Endolimax nanus (o Endolimax nana). Figura 4.29 Quistes de Iodamoeba butschlii. Identificacin de quistes de flagelados Giardia lamblia intestinalis (Fig. 4.30) Tamao: 8-12 m Forma: oval, con un polo ms redondeado que otro; con frecuencia se observa una gruesa envoltura de pared doble; en realidad, la pared es la membrana citoplsmica Ncleos: 2-4 ncleos ovales: membrana: sumamente delgada cariosoma: pequeo, central, de color tenue Citoplasma: claro, refracta la luz cuando no se ha teido; verde amarillento o azulado al aplicar la solucin de yodo Fibrilla: refracta la luz; semeja un cabello; es plegada o toma forma de S ; recorre el quiste a lo largo, por el centro (ajstese el microscopio). Chilomastix mesnili (Fig. 4.31) Tamao: quiste pequeo, de 6-8 m Forma: redonda, con un polo adelgazado (piriforme) Ncleo: un solo ncleo voluminoso: membrana: se observa con claridad; engrosada en algunas partes cariosoma: pequeo y central Fibrilla: semeja un bucle. Identificacin de quistes de ciliados Balantidium coli (Fig. 4.32) Tamao: quiste sumamente voluminoso, de 50-70 m (del mismo tamao que un huevo de scaris) Forma: redonda Envoltura: delgada, con pared doble Ncleos: 1 ncleo voluminoso, reniforme; 1 ncleo pequeo que semeja una mancha gruesa, junto al anterior Citoplasma: granulosos, verdoso, lleno de cuerpos de inclusin. Con frecuencia se puede observar en el interior, con lneas tenues, el trofozoto ciliado, organizado y ligeramente mvil de Balantidium (vase antes). Conclusin Es en extremo importante que se logre identificar; - los quistes de Entamoeba histolytica - los quistes de Giardia (lamblia) intestinalis
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- y los quistes de Balantidium coli.
Figura 4.30 Quistes de Giardia (lamblia) intestinalis. Figura 4.31 Quistes de Chilomastix mesnilii. Figura 4.32 Quistes de Balantidium coli. Coccidios (Fig. 4.33) Los coccidios son protozoarios que pueden parasitar al ser humano (sin causar efectos patgenos importantes) o encontrarse de paso en las heces fecales consecutivamente a la ingestin de alimentos contaminados (peces, conejos, etc.). Aparecen en las heces con formas semejantes a quistes (se denominan ooquistes o esporoquistes). Tamao: 15-20 m, dependiendo de la especie Forma: valo alargado que a veces se adelgaza en uno de los polos Color: incoloros y transparentes o, a veces, amarillentos Envoltura: una lnea doble, que refracta ligeramente la luz y se puede distinguir claramente; algunas veces se observa cierto tipo de oprculo en uno de los polos Contenido: es de tres tipos (vase Fig. 4.33): (a) 4 esporozoitos (bastoncillos de extremos redondeados) que contienen pequeos ncleos esfricos; a veces se encuentran algunos grnulos voluminosos en uno de los polos; (b) una clula voluminosa, redonda y granulosa; (c) grnulos que refractan la luz y llenan completamente el interior del protozoario.
Figura 4.33 Tipos de coccidios a: que contiene cuatro esporozoitos y ocasionalmente un nmero reducido de grandes grnulos agrupados en uno de los polos; b: que contiene una gran ronda de clulas granulares; c: que contiene grnulos de refraccin llenando completamente el interior El examen microscpico de los quistes Preparacin en fresco en solucin salina Los quistes pueden ser vistos como glbulos brillantes transparentes que destacan claramente contra un fondo gris. Tienen bien definidas las cpsulas. Usando el objetivo x40, buscar objetos redondos brillantes con un dimetro aproximadamente igual a 1-3 eritrocitos. Cuerpos cromatoides Busque tambin los cuerpos cromatoides (estructuras en forma de bastn). Los cuerpos cromatoides son ms evidentes en las preparaciones salinas que en las preparaciones de yodo. Estos cuerpos son caractersticos en apariencia y aparecen en los quistes de Entamoeba histolytica y E. coli. Los cuerpos cromatoides en forma de bastn de E. histolytica tienen extremos redondeados romos, los de E. coli tienen extremos puntiagudos. Estos cuerpos cromatoides se ven con menor frecuencia en los quistes de E. coli que en los de E. histolytica. Ncleos Los ncleos no son fcilmente visibles en las preparaciones salinas pero se ven claramente en las preparaciones de yodo.
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La apariencia del ncleo es importante para diferenciar entre especies de amebas. Por lo tanto, si los quistes (o cuerpos semejantes a los quistes) se ven en el preparado salino, tambin examinar una preparacin con yodo. Medicin La medicin y evaluacin exacta de los quistes es esencial para su correcta identificacin. Mida cualquier quiste que encuentre, si es posible utilizar una retcula calibrada en el ocular (ver seccin 3.1.1). Preparacin en fresco con solucin yodada Las preparaciones de yodo se utilizan para detectar quistes de amebas y flagelados. Los quistes pueden ser detectados con el objetivo x10. Use el objetivo x40 para ver las caractersticas de los quistes y medir su alcance para lograr una correcta identificacin. El yodo tie el citoplasma de los quistes de color amarillo o marrn claro; los ncleos se tien de marrn oscuro. Cuando los quistes de Entamoeba spp. se tien con yodo, puede ser vista o verificada la disposicin de la cromatina perifrica y la posicin del cariosoma. (Si la cromatina perifrica est ausente, el quiste no es una especie de Entamoeba.) Estos cuerpos cromatoides perifricos se tien de color amarillo claro y pueden no ser muy claros. A veces, los quistes jvenes contienen glucgeno, lo que hace que se tian de color marrn oscuro con yodo. La tincin con yodo de los quistes de los flagelados permite a las fibrillas (filamentos) que sean visibles. Los quistes de varias especies diferentes se pueden encontrar en la misma muestra de heces. Concentracin Si es necesario, utilice la tcnica de sedimentacin con formol-ter (ver seccin 4.5.2) para examinar un mayor nmero de quistes y tener una identificacin ms certera. Eosina para trofozotos y quistes fecales Consulte la seccin 4.3.1. Ziehl-Neelsen Modificado para la tincin de ooquistes de Cryptosporidium spp. Las infecciones por Cryptosporidium spp., causan fiebre, calambres abdominales, diarrea y prdida de peso, con una eosinofilia asociada. En casos severos, se puede desarrollar un sndrome de malabsorcin. La criptosporidiosis causa una diarrea autolimitada en nios. Es una causa reconocida de diarrea crnica en adultos con baja inmunidad, por ejemplo, pacientes con sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La criptosporidiosis se debe sospechar en pacientes con diarrea crnica y prdida de peso, en los cuales no se puede encontrar ninguna otra causa. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Soporte para portaobjetos Placa de Petri Algodn Solucin de cloruro de sodio al 0,85% (no reactivo. 53) Solucin de formaldehdo al 37% (formalina) Carbolfucsina de Ziehl-Neelsen (reactivo no. 16) cido-etanol para Ziehl-Neelsen (reactivo no. 5) Verde de malaquita, solucin al 1% (vase el reactivo no. 31) Metanol. Mtodo 1. Emulsionar una pequea cantidad de heces en solucin salina en un portaobjetos limpio. Esparcir en un rea de aproximadamente 2 cm x 1 cm. 2. Permitir que el frotis se seque antes de la fijacin en metanol absoluto durante 5 minutos. Si el paciente se sabe que es, o se sospecha de ser, positivo para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), fijar el frotis en vapor de formalina durante 15 minutos, colocando el portaobjetos en una placa de Petri con una bola de algodn empapado en formalina. 3. Inundar el portaobjetos con carbolfucsina durante 5 minutos. Lave la tincin con agua. 4. Inundar el portaobjetos con una solucin de cido-etanol para decolorar hasta rosa plido. Lave el portaobjetos en agua. 5. Contrateir el portaobjetos con solucin de verde de malaquita durante 2 minutos. Lavar con agua y colocar en un estante deslizante para drenar y secar. Examinar el portaobjetos bajo el microscopio usando el objetivo x40. Los ooquistes de Cryptosporidium spp. teidos por este mtodo puede mostrar una variedad de reacciones de tincin yendo desde el color rosa plido al rojo oscuro. La medida de los ooquistes est entre 4-6 m. Los esporozoitos en los ooquistes tienen un borde exterior de material muy teido con un centro plido (Fig. 4.34). Esto diferencia ooquistes procedentes de algunas levaduras que podran teirse de rojo, pero tienen una apariencia uniforme y homognea. Nota: Cryptosporidium spp. pertenecen a un grupo de parsitos llamado coccidia. Otros parsitos de este grupo son: -Isospora belli -Toxoplasma gondii -Plasmodium spp. Los ooquistes de Cryptosporidium spp. son altamente resistentes a los agentes desinfectantes.
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Figura 4.34 Ooquistes de Cryptosporidium spp.
AGREGADO
TCNICA ALTERNATIVA PARA TINCIN DE COCCIDIOS COLORACIN DE KINYOUN Tcnica utilizada para: identificacin de ooquistes de coccidios: Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora en muestras fecales (fijadas o frescas), aspirado duodenal, raspados de mucosa intestinal, esputo o lavado broncoalveolar. Representa una modificacin de la tcnica de Ziehl Neelsen realizada en fro muy prctica y til. Materiales: Metanol Carbol-fucsina cido sulfrico al 10% o 1 % (en agua destilada) Azul de metileno Portaobjetos Aceite de inmersin Preparacin de soluciones: Procedimiento: 1. Realizar una impronta con una gota de sedimento 2. Dejar secar a temperatura ambiente durante 24 horas 3. Fijar con metanol y dejar secar al aire 4. Cubrir la impronta con carbol-fucsina durante 5 minutos, (sin calentar) a temperatura ambiente 5. Lavar suavemente con agua destilada 6. Decolorar con cido sulfrico al 10% durante 1 a 2 segundos. Tambin se puede decolorar con cido sulfrico al 1% durante 1 a 2 minutos 7. Contracolorear con azul de metileno durante 1 minuto 8. Lavar y dejar secar 9. Observar con inmersin Comentarios: 1. La coloracin de Ziehl-Neelsen es un procedimiento cido-alcohol resistente (las clulas coloreadas con el colorante fucsina resisten la decoloracin con la solucin acida. 2. Desventajas: Los ooquistes de Cyclospora presentan gran variabilidad tintorial lo cual puede arrojar resultados falso-negativos. Los ooquistes de Cryptosporidium tambin pueden presentar afinidad tintorial variable; en un mismo campo se pueden observar ooquistes bien coloreados y otros que se impregnan levemente con el colorante. 3. Interpretacin: Los ooquistes de Cryptosporidium aparecen como estructuras esfricas u ovoides se ven de color rojo vinoso (fucsia) y su tamao es de 4 a 6 micrones (ms chicos que un glbulo rojo). Alguno de los 4 esporozotos puede ser observado en el ooquiste de Cryptosporidium. Algunos de los ooquistes inmaduros de lsospora (ooquistes enteros) se tien, mientras que otros que estn maduros aparecen generalmente con dos esporoquistes con la pared del ooquiste coloreada de rosado a rojo intenso y un rea clara entre los esporozotos teidos y la pared del ooquiste. El fondo se tie de azulado. Fuente: Henriksen SA, Pohlenz JFL. 1981. Staining of Cryptosporidia by a modified Ziehl- Neelsen technique. Acta Vet. Scand. 22:594-596. Modificacin: Current WL. 1990. Techniques and laboratory maintenance of Cryptosporidium. In: Dubey JP, Speer CA, Fayer R (eds.), Cryptosporidiosis of Man and Animals. CRC Press Boca Raton, Fla, pp 31-49. Objetos que no deben ser confundidos con quistes Objetos: otras cosas, vivas o artificiales, que se encuentran en las heces que no son parsitos y pueden confundir al laboratorista. Blastocystis hominis (levadura) (Fig. 4.36) Tamao: vara entre 5 y 20 m (promedio 10 m). Forma: redonda u oval; algunas veces poseen bordes angulosos e irregulares Contenido: una vacuola voluminosa que ocupa casi toda la clula; el citoplasma, comprimido, forma un anillo granuloso alrededor de ella Color: refractan intensamente la luz cuando no se encuentran teidos; la solucin de yodo no tie la vacuola, pero la periferia adquiere un color amarillo plido Algunos mdicos solicitan que se comunique la presencia de los Blastocystis hominis, particularmente en heces fecales de nios. Hongos (Fig. 4.35) Levaduras Tamao: pequeas (5-8 m)
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Forma: oval, frecuentemente con brotes Contenido: con frecuencia un grupo de 3-6 grnulos en posicin excntrica Color: (con solucin de yodo) rojo pardo. Algunas otras formas de hongos son rectangulares, con un citoplasma oval sumamente claro; se denominan artrosporas. Aparte de las levaduras se contemplan otros elementos fngicos. Leucocitos (Fig. 4.37) Tamao: 10-20 m Forma: redonda o ligeramente alargada, de contorno irregular Contenido: citoplasma que refracta la luz, claro y granuloso, con vacuolas pequeas Ncleo: escasamente notable; algunas veces contiene un "falso cariosoma" con forma de estrella. Pus (Fig. 4.38) El pus se puede observar a simple vista y tiene el aspecto de vetas opacas, de color grisceo (no transparente, como el moco). Con el microscopio se observa como una masa de leucocitos ms o menos degenerados (comunquese su presencia ya que representa un signo de infeccin).
Figura 4.35 Hongos y levaduras. Figura 4.36 Blastocystis hominis. Figura 4.37 Leucocitos. Figura 4.38 Pus.
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Figura 3.
Fig. 4.40
Clava para i d e n t i f i c a r h ue v es d e h e l mi n to s
Longit Jd del huevo < 1 0 0 p m Espicula laleral muy pequea(a m enudo ir.vrsiole). Eri ias heces. (68-100 pm 45-80 firn) Con capsula (30-50 jim 27-50 |im ) D ifiylidm m cjn i u in O 1_ h.crinicapsilci sp Huevos do Schistosoma . Schistosoma apomcum O - Schistosoma mekongi (raras veces) Espolon laleral prom inente.------cubierta transparente (114-180 |<m 45-73 |im) - Schistosoma niansont
Sin capsula Dos lapones polares9
s tapones polares
Sin tapones
Con espicula
Con o sin o p e ic u lo s ? -
Nu op u co la o s---------- .Con o sin espenla?-
Longitud del huevo 110 pm Extremo anterior re d o n d e a d o .- Schistoso.na haemotobium por lo general en la orina o (rararnen e en las heces) en biopsia de vejiga (112-170 jjm 40-70 ym) Extremo anterior puntiagudo, Scgistosoma intfcalalum espoln largo alilado con (espolon mas largo que en S. haem ) punta doblada Slo en heces (140-240 |im 50-85 jim )
Opci colados longitud mxima del huevo9
. Prolongacin anular ue l a _______Cionorc.his sinensis nvoltura ( - resalle pronunciado) (extremo posterior encho y (25-35 |im 1 1 -l2 |n n ) redondeado) Alargado, sin resalle _ (25-35 |tm 8-12 |im) Opisthorchis felineus (extremo posterior cori boort terminal puntiagudo) Heierophyes hetcropriyes {botn pequeo en el extremo posterior)
Espoin terminal Sin espicula cubierta lina o gruesa?
L o fu jiliid del huevo
35 jm Resalte menos p ro n u n c ia d o ----oprculo ancho (28 30 jim 15 17 jun)
Sin re h a lle --------------- _______ Mclagorumus yko<ju.\ a: envoltura lina (26 3 jun 15-20 jirn) -O voide, amarillo d u ra d o ------------ DiphyUcbothrunn taluni Cubierta gruesa. tan embrin (58 76 jirri 4 51 jim) - M a n o n dorado, sin embrin cuOior ta (jiuuSu, uvoidal. con oprculo
c h a t a d o ! * ------------------------ C : ---------------------- P a ra g o n i m u s
- C u b ie rta
! m a _ ---------
y * usa. con o sin blastomeros? jierta gruesa. rugosa o lisa?
i Strongyloidos stercoratis Sin blastomeros, la rv a s ----O parcialmente desarrolladas ! Sirongyloidos tullo born (50-76 |im 35-47 jim) r Ovoidai con 2 - 8 ---------olastmeros (64-80 jun 36-40 jun)
Ncator arnuncanus Ancy/ostorna duodenale Jormdens o^unnutus
Longitud del huevo 3 j 118 jnn
- Con blastom eros. ovoiaal o en elipse alargada?
Si- N o-
Cubieria con una membrana.- Inchostrongytus sp. elipse alargada simtrica (75-115 jim 40-50 jun) - Asears untiiCJvS
w t s ie r m a n i
(68-118 jun 40 51 jnn) _ .Echmostoma sp. {83-120 jim -.58 90 jirn) - Fasciola nepanca (130-145 jirrT x 70 50 jirn)
'C ubierta gruesa y lisa, huevo simtrico o asimtrico?
- Cubierta gruec?. y ru g o s a .----------------------------huavo con c a lila sin segmentar con grnelos gruesos (45-70 jim 35-45 jim)
-L ongitu d dui huuvu . 120 j n n ________ ovoiual.. cubierta lina, (M ido amarillento . t aSClOlOpSIS CilSr.1 (125-140 |im 70 SO jim) -T apones muy prom iutM tios---------(4'J 65 jun - 20 30 jun)
S im trico
A sim trico ----------(un lado convexo, el otro achatado)
Huevo marron (38-45 jun - jim
. D /c r o c o tiiu m a n co a tu m 22-30 jm) (contiene rriiracidio)
L Huevo in c o lo ro .----------cubierta de 4 capas. tjO C0 jirn 20-32 jim) Con em bnoforo-------------amarillo claro o m jrron. envoltura con oos membranas (dimetro: -44-77 jin)
E n te r o b iu s vo rrm c u J a n s
(contiene larva)
T e n la so h u m ,
rtc h u r is tn c h m ra
Hueve redondo c casi redondo, envoltura cor. dos membranas, con o sm em bnoforo? -------
Tao nia s a g i.ia ta
(se distingue examinar.' Jo |5 progions)
-F o im a de limn, sin tajiones prom n enles--------------------(36-45 jim 21 jun) - Torma de limn, con ligero uslruch.iii.iunlu en el Ce ilio
(36 45 |in i r o U O jiu .)
- Capillana hopanca r- Con Mamemos polares?-
H y m o n o lo p s is n a n a
C a p illa ri j p h i l h p p m n s i s
Sin e m b rio fo ro ._____ con o sin filamentos polares?
(40-60 y m 30 0 jim )
L Sin filamentos polare? (70-86 jim - 60-80 jrm)
H ym onoieput diminuta
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Fig. 4
Fig. 4.41
Identificacin de parsitos intestinales: helmintos
T A M A O S R E L A T IV O S DE L O S H U E V O S DE H E L M IN T O S *
M otagoninxjs Halarvphyes C pisthorchls Clononzhis yokogaw ai hoterophyes tohnous sin 6 nsi s
Taenia
Hym snolepis nana
Enterobius verm icdans
Trichuris irichiura
Ascaris kjm bricoidas 'ecunoc
Anquik>s:nA
D'pnyl.'obothnum latum
Hym onotopsis dimiiKita
15 0
l 50
120
120
Paraonimus westermani
Tricfioslrongytus Ascaris kjmricotdes infecundo
Schistosoma Japorucum
Schistosom a
Schistosoma
haematobium
manspju
Fosada ' fi&patica
a s d o lo p s is , bushi
Se han om ilido Schistosom a m ekongi y Sctirslosom n intcrcalalum
WhO 91544
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4.4 HELMINTOS INTESTINALES Las infecciones por helmintos causan una variedad de sntomas clnicos incluyendo calambres abdominales, fiebre, prdida de peso, vmitos, apendicitis, prdida de sangre, anemia y eosinofilia. Hay tres grupos de helmintos de importancia mdica: -Nematodos (gusanos redondos) -Cestodos (tenias) -Trematodos (duelas). Las infecciones por helmintos suelen diagnosticarse mediante la deteccin de huevos y larvas. Con menor frecuencia, las infecciones son diagnosticadas mediante la deteccin de gusanos adultos (por ejemplo, Ascaris lumbricoides y Enterobius vermicularis) o progltides (segmentos) de los gusanos adultos (por ejemplo, Taenia saginata y T. solium). Sin embargo, para la mayora de las infecciones por helmintos, los huevos se utilizan para la identificacin. 4.4.1 IDENTIFICACIN DE LOS HUEVOS Caractersticas de los huevos Los huevos que depositan los helmintos parsitos y se encuentran en las heces fecales se identifican por su: tamao forma envoltura contenido y en algunas ocasiones por su: color y caracteres externos. Tamao La longitud y anchura se miden y generalmente estn dentro de un rango especfico. Forma Cada especie tiene su forma particular. Etapas de desarrollos por el que transcurren los huevos Los huevos de algunas especies consisten de una sola clula, algunos huevos tienen varias clulas, y algunos huevos son embrionados, esto es, contienen una larva. En ocasiones, si las muestras fecales son de 1 a 2 das, los huevos pueden desarrollarse a etapas ms avanzadas en ese tiempo. En el caso de Ascaris lumbricoides, los huevos por lo general tienen una sola clula cuando estn en las heces, sin embargo, la nica clula puede dividirse y en la muestra de ms de 12 horas de obtenida, los huevos con dos o cuatro clulas pueden ser vistos. Los huevos Ancylostoma duodenale o Necator americanus (Uncinarias) presentes en muestras que tienen varias horas de obtenidas pueden contener 16, 32 o ms clulas. Despus de 12-24 horas, los huevos pueden estar embrionados, y an ms tarde las larvas pueden eclosionar. Al observar el grado de desarrollo de los huevos de helmintos, asegrese que la muestra de materia fecal est recin obtenida. Si se trata de varias horas o un da de obtenida, se espera ver cambios en el grado de desarrollo de algunas especies. Lo ideal sera que slo las muestras frescas deban ser aceptadas para el diagnstico. Grosor de la cubierta del huevo Los huevos de algunas especies, como el Ascaris lumbricoides tienen una cubierta gruesa, mientras que otros, tales como Ancylostoma duodenale o Necator americanus tienen cubiertas finas. Color Los huevos de algunas especies, como Ancylostoma duodenale, Necator americanus y Enterobius vermicularis son incoloros, mientras que otros como el Ascaris lumbricoides y Trichuris trichiura son de color amarillo o marrn. Otras caractersticas La presencia de caractersticas como oprculos (tapas), espinas, tapones, ganchitos o capas externas mamelonadas tambin pueden servir de ayuda para la identificacin. Si se encuentra un huevo o un objeto que se parece a un huevo, las caractersticas mencionadas anteriormente deben ser observadas cuidadosamente con el fin de hacer una identificacin especfica. Medicin de los huevos 1 micrmetro (1m) = 0,001 mm. El tamao en m de este manual es del lado largo del huevo. El tamao puede ser estimado por comparacin con el de un eritrocito, que mide 7,5-8 m. El tamao puede ser evaluado en relacin con el campo del microscopio: -Si se utiliza un objetivo x10, el huevo ocupa alrededor de una dcima parte del campo -Si se utiliza un objetivo x40, el huevo ocupa aproximadamente un tercio del campo. El huevo se puede medir mediante la insercin de un portaobjetos de escala del micrmetro en el ocular del microscopio. Una divisin de la escala con el objetivo x10 y el ocular x10 = 1m. Otro mtodo de medicin es comparar el huevo con uno de otras especies comunes en la localidad, cuyo tamao bajo el microscopio se conoce (por ejemplo Ascaris lumbricoides). Como reconocer huevos El mtodo recomendado es: Establecer la identidad probable del huevo desde su aspecto general. Hacer un estudio sistemtico de todas las caractersticas del huevo para confirmar su identidad. Con el fin de ganar experiencia (si es posible, bajo la gua de un instructor): -Estudiar los diferentes huevos que se encuentran en su localidad;
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-Identificar, uno por uno, todas las caractersticas de cada huevo que se describen en este manual. La tabla 4.5 lista las especies de helmintos cuyos huevos se encuentran en las heces. Los trminos utilizados para la identificacin de los huevos de helmintos y una clave para su identificacin se dan en las Figs. 4.39 y 4.40, respectivamente. La figura. 4.41 muestra los tamaos relativos de los huevos de helmintos. Ancylostoma duodenale Tamao: 50-80 m Forma: oval, con polos redondos y ligeramente aplanados (con frecuencia, un polo es ms plano que el otro) Envoltura: sumamente delgada; se observa como una lnea oscura Color: las clulas que hay en su interior son de color gris plido (la solucin de yodo las tie de pardo oscuro) Contenido: vara segn el grado de maduracin. Tipo A (en heces fecales frescas) (Fig. 4.42) 4, 8 16 clulas granulosas de color gris, claras, aunque no refractan la luz (blastmeras). Tipo B (en heces fecales de algunas horas) (Fig. 4.43) Masa uniforme compuesta por numerosas clulas granulosas de color gris. Tipo C (en heces fecales de 12-48 horas) (Fig. 4.44) Todo el huevo se encuentra lleno por una pequea larva (el futuro nematodo), replegada sobre s misma. Este tipo de huevo se llama "embrionado". Ascaris lumbricoides Existen cuatro tipos de huevos de scaris: A. Huevos fecundados, con envoltura doble B. Huevos no fecundados, con envoltura doble C. Huevos semidecorticados, fecundados (menos frecuentes) D. Huevos semidecorticados, no fecundados (sumamente raros). A. Huevos fecundados, con envoltura doble (Fig. 4.45) Tamao: aproximadamente 4570m Forma: oval o, a veces, redonda Envoltura: las dos envolturas se distinguen claramente: la envoltura externa es spera, parda, cubierta por pequeas protuberancias (mamelonada) la envoltura interna es lisa, gruesa e incolora Color: la envoltura externa es parda y el contenido de los huevos es incoloro o amarillo plido Contenido: una sola masa central, redonda y granulosa. B. Huevos no fecundados, con envoltura doble (Fig. 4.46) Tamao: aproximadamente 45-90 m (mayores que los del tipo A) Forma: ms alargados (elpticos o irregulares) Envoltura: las dos envolturas no se pueden distinguir con claridad: la envoltura externa es parda y bollonada, con protuberancias melladas la envoltura interna es sumamente delgada (algunas veces se pueden observar una o dos lneas) Contenido: el huevo se encuentra lleno de grnulos voluminosos y redondos que refractan intensamente la luz (son brillantes). C. Huevos semidecorticados, fecundados (Fig. 4.47) Son similares a los del tipo A, pero carecen de envoltura externa. Envoltura: nica, lisa, gruesa e incolora (o de color amarillo muy plido) Contenido: una sola masa granulosa central, redonda e incolora. D. Huevos semidecorticados, no fecundados (Fig. 4.48) Envoltura: una sola envoltura lisa, delgada e incolora (lnea doble) Contenido: grnulos voluminosos, redondos e incoloros, que refractan la luz. Advertencia: No se confunda el tipo D con los huevos de Ancylostoma, Fasciola spp. o los de Fasciolopsis buski.
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Figura 4.42 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales frescas. (Tipo A). Figura 4.43 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales de algunas horas (Tipo B). Figura 4.44 Huevos de Ancylostoma duodenale en heces fecales de 12-48 horas (Tipo C). Figura 4.45 Huevos de Ascaris lumbricoides fecundados, con envoltura doble (A). Figura 4.46 Huevos de Ascaris lumbricoides no fecundados, con envoltura doble (B). Figura 4.47 Huevos de Ascaris lumbricoides semidecorticados, fecundados (C.) Figura 4.48 Huevos de Ascaris lumbricoides semidecorticados, no fecundados (D).
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Figura 4.49 Huevos de Clonorchis sinensis. Giba: pequeo botn situado en el extremo ancho del huevo (P). Figura 4.50 Huevos de Dicrocoelium spp. (varias especies). Oprculo fcilmente visible (O); Huevos en trnsito* (la forma que se encuentra con mayor frecuencia) (A). Figura 4.51 Huevos de Dicrocoelium spp. de pacientes infectados (sumamente raros) (B). Figura 4.52 Huevos de Diphyllobothrium latum. O: Oprculo; B: Botn o giba sumamente pequea, situada en el extremo opuesto al del oprculo.
Figura 4.53 Huevo de Dipylidium caninum. Figura 4.54 Huevos de Enterobius vermicularis (Oxiuro). Contenido: puede ser una masa granulosa pequea (A) de forma oval irregular, o el embrin del helminto (B), que es una pequea larva enroscada.
Tabla 4.5 Especies de helmintos cuyos huevos se encuentran en las heces Nombre cientfico Distribucin geogrfica Ancylostoma duodenale Mundial Ascaris lumbricoides Mundial Clonorchis sinensis Sureste de Asia Dicrocoelium dendriticum, Dicrocoelium hospes Mundial Diphyllobothrium latum Mundial Dipylidium caninum Mundial Enterobius vermicularis Mundial Fasciola gigantica Mundial Fasciola hepatica Mundial
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Fasciolopsis buski Heterophyes heterophyes Hymenolepis diminuta Hymenolepis nana Metagonimus yokogawai Necator americanus Opisthorchis felineus Paragonimus westermania Schistosoma haematobiumb Schistosoma intercalatum Schistosoma japonicum Schistosoma mansoni
Schistosoma mekongi Strongyloides stercoralisc Taenia saginata Taenia solium Trichostrongylus (varias especies) Trichuris trichiura a Se encuentra principalmente en el esputo. b Se encuentra principalmente en la orina c Se encuentra principalmente en forma de larvas en las heces Clonorchis sinensis (Fig. 4.49) Tamao: 2545m. Forma: caracterstica (vase la ilustracin) Envoltura: lisa y suave, aunque sumamente gruesa (lnea doble) Oprculo: fcilmente visible en el extremo delgado del huevo, ajustado dentro de un engrosamiento anular de la envoltura Giba: pequeo botn situado en el extremo ancho del huevo (P) Contenido: un embrin ciliado, bien organizado Color: la envoltura es parda, ligeramente amarilla, y el contenido es amarillo plido Dicrocoelium spp. (Varias especies) Tamao: 3550m. Forma: oval, ms bien asimtrica Envoltura: gruesa y lisa, de color amarillo, anaranjado o ligeramente pardo Oprculo: fcilmente visible (O). A. Huevos en trnsito*(la forma que se encuentra con mayor frecuencia; Fig. 4.50): El color de la envoltura es variable; puede ser amarillo, anaranjado o ligeramente pardo. El huevo contiene una masa oval poco diferenciada, de color amarillo oscuro, en que frecuentemente se hallan 1 a 4 glbulos que refractan la luz. B. Huevos de pacientes infectados (sumamente raros; Fig. 4.51): La envoltura es de color uniforme, pardo oscuro. El huevo contiene un embrin ciliado. *Huevos en trnsito: El paciente ha ingerido hgado de carnero o res infectado por el parsito. Los huevos no se digieren y, a pesar que se encuentren en las heces fecales, el paciente no se infecta. Repita el examen 8 das despus, e indique al paciente que, mientras tanto, no coma hgado o productos derivados de ste Diphyllobothrium latum (Fig. 4.52) Tamao: 5580 m. Forma: oval, uniforme Envoltura: lisa y delgada Oprculo: difcilmente visible cuando no se encuentra levantado Giba: sumamente pequea, situada en el extremo opuesto al del oprculo Contenido: una masa de clulas pequeas ordenadas alrededor de una clula central voluminosa Color: amarillo plido. Dipylidium caninum (Fig. 4.53) Los huevos se encuentran apiados en racimos de 6-20, envueltos por una membrana delgada. Tamao: del racimo de huevos: 150-300 m de cada huevo: 30-40 m Forma: redonda Envoltura: gruesa, ligeramente granulosa, sin estras Contenido: una sola masa granulosa uniforme con tres pares de garfios que forman una especie de abanico y refractan la luz Color: amarillo o gris plido. Enterobius vermicularis (Fig. 4.54) Tamao: 50-60 m Forma: oval, aunque claramente asimtrica (plana en un lado y redonda en el otro) Envoltura: lisa y delgada, pero se puede observar una lnea doble Contenido: puede ser una masa granulosa pequea (A) de forma oval irregular, o el embrin del helminto (B), que es una pequea larva enroscada Color: incoloro, transparente Este huevo se encuentra ms fcilmente en los pliegues de la piel que rodea el ano que en las heces (vase ms adelante). Tcnica para la recogida y el examen de los huevos Tcnica especial para huevos de oxiuros
Asia oriental y meridional Asia Sudoriental, el Mediterrneo Oriental Mundial Mundial Asia oriental y meridional, Europa central y oriental Mundial Asia oriental y meridional, Europa central y oriental frica Central, Amrica del Sur, Asia oriental y meridional frica, el Mediterrneo Oriental frica Asia oriental y meridional frica (al sur del Sahara), Amrica Central y del Sur, el Caribe Sureste de Asia Mundial Mundial Mundial Asia Mundial
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Principio Los huevos de oxiuros (Enterobius vermicularis) se suelen recoger (en especial en nios) en los pliegues de la piel que rodea el ano. Raras veces se hallan en las materias fecales. Materiales Cinta adhesiva de celofn transparente (cinta Scotch) Una cucharilla de 10cm de longitud o, mejor an, un abatelenguas de madera Un portaobjetos Microscopio Microscopio Tubos de ensayo Pipeta Pasteur Algodn Solucin de cloruro de sodio al 0,85% (no reactivo. 53). Mtodo 1. Coloque una cinta de celofn, con el lado adhesivo hacia abajo, sobre un portaobjetos, como se indica en la figura 4.55. 2. Coloque el lado plano de la cucharilla debajo del portaobjetos (Fig. 4.56). 3. Separe la cinta adhesiva del portaobjetos con suavidad y dblela sobre el extremo del mango de la cucharilla figura 4.57. 4. Sostenga el hisopo formado con la mano derecha, presione firmemente el portaobjetos contra el mango de la cucharilla. 5. Separe con la mano izquierda las posaderas del paciente. Aplique presionando, el extremo de la cucharilla cubierto con la cinta adhesiva en varios sitios de la piel que rodea el ano (Fig. 4.58). 6. Coloque de nuevo la cinta de celofn sobre el portaobjetos, con el lado adhesivo hacia abajo (Fig. 4.59). 7. Para estar seguro de que la cinta se adhiere uniformemente al portaobjetos presione con un trozo de algodn (Fig. 4.60). 8. Observe con el microscopio, con abertura reducida del condensador y utilizando objetivo x 10, en busca de los huevos de E. vermicularis, que tienen las caractersticas siguientes: Forma: oval, aunque asimtrica (aplanada en un lado y redonda en el lado opuesto) Tamao: 50-60 m Envoltura: lisa y delgada, aunque con una lnea doble visible Contenido: puede ser una masa granulosa (1) o un embrin del helminto, plegado sobre s mismo (2) Color: transparente, incoloro Vanse fotografas de estos huevos en las figuras correspondientes (ver fig. 4.54). Mtodo: Segn el mtodo de Melvin, D. y Brooke, M. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites, Atlanta, Secretara de Salud y Servicios Humanos de los EE UU, Centros para el Control de Enfermedades, 1969, pg. 138. Mtodo alternativo Si no se cuenta con cinta de celofn 1. sese un hisopo de algodn 2. Aplquese alrededor del ano (pero no dentro) (Fig. 4.61). 3. Sumerja el hisopo en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 0,5 ml (10 gotas) de solucin de cloruro sdico y enjuguelo bien es esta solucin (Fig. 4.62). 4. Aspire el lquido con una pipeta Pasteur. Pselo a un portaobjetos, ponga un cubreobjetos y examnelo como se indica en el paso 8 del mtodo anterior (Figura 4.63).
AGREGADO:
FROTIS ANALES PARA LA DETECCIN DE OXIUROS Los frotis anales se usan para detectar la presencia de oxiuros (Enterobius vermicularis). Los oxiuros son ms corrientes en los nios que en los adultos, y a menudo el nio parasitado infecta a otros miembros de la familia. As pues, si se observa que un nio est infectado, conviene examinar muestras de todos sus familiares, especialmente de sus hermanos. Los huevos de oxiuro suelen encontrarse en los pliegues cutneos que rodean al ano, raras veces aparecen en las heces. La enterobiosis es considerada enfermedad de las 4 F (del ingls: Food, Fingers, Faeces and Flies) lo que significa en castellano Food: Comida, Fingers: Dedos, Faeces: Heces fecales, Flies: Moscas. Esto hace referencia al tipo de infeccin y transmisin de enfermedades de este tipo, ya que en ellas participan estos cuatro elementos, por ejemplo, un nio infectado contiene huevos en la zona perianal, la hembra del oxiuro cuando los coloca en sta zona y no en las heces, muerde y se produce sensacin de comezn, el nio se rasca para mitigar la molestia del comezn, al hacerlo toca sin querer los huevos depositados en la zona perianal con sus dedos y por debajo de sus uas lo que llevar a que transporte y transmita la enfermedad hacia otros miembros de su especie, por lo general, su familia. Los huevos tambin pueden quedar en la ropa que cubre el trasero. ste nio, toca la comida, supongamos un mendrugo de pan, y otras zonas en la casa. El pan tocado tiene huevos de oxiuro, que si tiene hermanitos, padres y tocan ese pan u otros alimentos contaminados por el nio infectado tambin se infectarn a travs de la comida. Siempre hay que tener en cuenta que el lavado de manos y la higiene son fundamentales para mermar las posibilidades de infeccin. A su vez, el nio lleva ese pan a su boca y se produce auto infeccin. Hasta aqu van la comida y los dedos, Y las heces fecales y las moscas?, Cul es su papel en todo esto? En esta enfermedad parasitaria por Oxiuro, las heces no son determinantes, pero hay que tener en cuenta que el oxiuro es un parsito intestinal y si bien no deposita en las heces directamente los huevos, lo hace en los pliegues que rodean al ano, por esto, junto con otras enfermedades consideradas dentro de esta clasificacin (4 F, contaminacin mano, ano, boca), casi todas ellas por enteroparsitos, las heces fecales si juegan un papel
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fundamental en la transmisin de otras enfermedades por enteroparsitos ya que conjuntamente al oxiuro puede existir coinfeccin con otros parsitos intestinales. Siempre quedan restos pequeos en la zona perianal con materia fecal. Moscas y enfermedades En humanos, la mosca domstica puede ser la causante de la transmisin de cerca de 20 enfermedades como amebiasis, diarreas, disentera biliar, poliomielitis y parsitos intestinales. Adems de contaminar la comida con huevos y gusanos, las moscas pueden diseminar bacterias y parsitos que causan enfermedades intestinales. Pueden viajar de materia fecal a nuestra comida de forma muy sencilla cargando bacterias o quistes y huevos de parsitos en su cuerpo o sus patas. Cuando se alimentan, las moscas excretan saliva y heces que pueden contener bacterias. Algunas veces dejarn sus huevos o gusanos en la piel o heridas de humanos y animales (Miasis). La "mosca domestica", un tpico parsito antihiginico cosmopolita, sigue al ser humano, desde su lugar de origen, hasta todos los rincones del mundo, incluyendo las zonas templadas. Se establece en cualquier lugar en el que haya residuos orgnicos en estado de descomposicin, excrementos de mamferos o similares que le ofrezcan las condiciones de vida necesarias. Tambin los basureros, los cubos de basuras en grandes cocinas y granjas dedicadas a la cra de ganado ofrecen un hbitat ideal para estos insectos. La mosca domstica no daa directamente al ser humano ni a los animales. No obstante, debido a la gran abundancia de alimentos y su rpida reproduccin, la mosca tiende a la multiplicacin desmesurada y se convierte en un insecto muy molesto. Adems, se han encontrado aprox. 100 agentes patgenos en la mosca domstica. Por ello, no se debe subestimar el riesgo de transmisin de enfermedades a travs de las moscas, especialmente por la contaminacin de alimentos. La mosca domstica es un transmisor de enfermedades infecciosas como, por ejemplo, el tifus, el clera, la salmonella, la poliomielitis o la fiebre aftosa entre otras enfermedades incluyendo a las parasitarias por enteroparsitos. Las moscas como transportadoras accidentales de parsitos, tambin tienen su importancia ya que se posan en la comida, o sobrevuelan el trasero del nio y se posan tambin en ste, llevando o acarreando en sus patas a los huevos que se adhieren a ellas, transportando los huevos a la comida y continuando el ciclo. En resumen, es muy probable que la familia entera est infectada. En el manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud 2 Edicin se hace mencin a dos tcnicas orientadas para la bsqueda de oxiuros, la tcnica de la cinta adhesiva transparente de celofn y la tcnica alternativa del hisopado anal. Las descripciones de ambas tcnicas se explican y se dejan como aparece en el manual, haciendo una salvedad aqu de agregar unas tcnicas similares con variacin en el nombre pero esencialmente las mismas. Se adosa una explicacin sobre una variante que emplea gasas en vez de hisopos para frotar en la zona perianal. Fuentes: Mtodos Bsicos de Laboratorio en Parasitologa Mdica, OPS/OMS 1992 versin castellana. IV Curso de metodologa en el diagnstico de enteroparsitos ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn, Argentina, INEI (Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas), ANLIS (Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud). Observacin: Estas tcnicas son especficas para el hallazgo de huevos de Enterobius vermicularis (Oxiuro), pudindose hallar en algunos casos huevos de Ascaris lumbricoides, Tenia spp., H. nana. Los huevos de estos otros parsitos distintos a E. vermicularis se debe a contaminacin fecal de la zona perianal. Siempre quedan pequeos restitos de materia fecal en los pliegues que rodean al ano (falta de higiene) que pueden contener huevos de los helmintos mencionados. RECOLECCIN DE MUESTRAS DE LA ZONA PERIANAL TEST DE GRAHAM GARAGUSO O MTODO DE LA CINTA ADHESIVA TRANSPARENTE (CINTA SCOTCH) (Equivalente al mtodo de la cinta adhesiva de celofn del manual) NOTA: (Este mtodo de recoleccin se realiza en pacientes de edad peditrica. Ocasionalmente en adultos) Materiales: 5 6 portaobjetos con cinta adhesiva transparente (tipo cinta scotch) de 2 cm de ancho colocada a lo ancho de los mismos. Bajalenguas de madera cuchara de plstico de aproximadamente 10 cm de largo Microscopio Portaobjetos Cinta Scotch transparente Procedimiento: 1. Realizar la toma de muestra por la maana al despertar el paciente previo a que defeque o efecte su higiene. 2. Despegar la cinta adhesiva transparente del portaobjetos y enrollarla en el extremo del mango de la cuchara o en el depresor lingual con la parte engomada hacia afuera. 3: Separar las nalgas del paciente y hacer presin con el extremo de la cuchara cubierto con la cinta en la zona perianal. 4. Colocar nuevamente la cinta con la parte adhesiva sobre el portaobjetos. 5. Repetir esta operacin durante 4 o 5 das ms) con los portaobjetos testantes. 6. Una vez efectuada la recoleccin enviar las muestras al laboratorio para su examen. 7. Coloque la cinta con la parte adhesiva hacia adentro. Antes de examinar ste, se puede levantar la cinta adhesiva y dejar caer una gota de aceite de inmersin en el centro del trozo de cinta y vuelva a colocar sta en su sitio. Esto mejorar la transparencia de la cinta. El agregado de aceite de inmersin es opcional, porque si se quiere ver la cinta adherida al portaobjetos se puede hacer directamente sin aceite de inmersin. Para aumentar la probabilidad de recoger huevos, la toma debe hacerse entre las 22 hs y las 24 hs, a primera hora de la maana antes que el paciente orine, defeque o se bae. En algunos casos es necesario tomar varias muestras antes de llegar a un diagnstico positivo. El agente de salud debe lavarse las manos despus de tomar la muestra; de otro modo, los huevos que tal vez hayan contaminado las manos entrarn en la boca y producirn una infeccin. HISOPADO O ESCOBILLADO ANAL NOTA: Se puede escoger para trabajar entre los hisopos y/o las gasas, cualquiera de las dos tcnicas dan buenos resultados.
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Materiales: 5 6 hisopos o gasas (de 10 x 10 cm') frasco de boca ancha con tapa a rosca Solucin salina formolada al 5% Gasas Embudos Varillas de vidrio Tubos de centrfuga Tubos de ensayo Pipetas Pasteur con perilla de goma Portaobjetos Cubreobjetos. Centrfuga Microscopio Procedimiento: 1. Realizar la toma de muestra por la maana al despertar el paciente previo a que defeque o efecte su higiene. 2. Separar las nalgas del paciente y frotar suavemente con el hisopo de algodn o la gasa sobre la superficie y en los pliegues perianales, colocando el hisopo en tubos de ensayo y las gasas en un frasco con solucin salina formolada al 5%. 3. Repetir esta operacin en das consecutivos con los hisopos o gasas restantes. 4. Una vez efectuada la recoleccin enviar la muestra al laboratorio para su examen. Homogeneizar con varilla de vidrio las gasas o los hisopos contenidos en el frasco de recoleccin con (solucin salina formolada al 5%) (esto hace despegar los huevos del hisopo y de las gasas). Filtrar a travs de un embudo con una doble gasa en un tubo de centrfuga Centrifugar durante 5 minutos a 1000-1500 rpm Eliminar el sobrenadante. Observar el sedimento entre portaobjetos y cubreobjetos en microscopio ptico con bajo aumento (10X).
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Figura 4.55 Preparacin del portaobjeto para la recoleccin de huevos de oxiuro Figura 4.56 Coloque el lado plano de la cucharilla debajo del portaobjetos Figura 4.57 Separe la cinta adhesiva del portaobjetos con suavidad y dblela sobre el extremo del mango de la cucharilla. Figura 4.58 Tcnica de recogida de los huevos de oxiuro a un infante. Separe con la mano izquierda las posaderas del paciente. Aplique presionando, el extremo de la cucharilla cubierto con la cinta adhesiva en varios sitios de la piel que rodea el ano. A) Sostenga el hisopo formado con la mano derecha, presione firmemente el portaobjetos contra el mango de la cucharilla.
Figura 4.59 Transferencia de la muestra al portaobjetos. Coloque de nuevo la cinta de celofn sobre el portaobjetos, con el lado adhesivo hacia abajo. Figura 4.60 Asegurarse que la cinta est firmemente pegada al portaobjetos con un trozo de algodn.
B) Observacin al microscopio de los huevos de oxiuro. Contenido: se puede encontrar un material granuloso (1) o un embrin del oxiuro plegado sobre s mismo (2).
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Figura 4.61 Tcnica alternativa para recoger huevos de E. vermicularis. Hisopado anal y escobillado anal con gasas.
Figura 4.62 Transferencia de la muestra a un tubo de ensayo. Sumerja el hisopo en un tubo de ensayo y enjuguelo bien en la solucin que contiene el tubo. Figura 4.63 Transferencia de la muestra a un portaobjetos. Fasciola heptica (Fig. 4.64) Tamao: 130145 m Forma: Oval, con polos redondeados Envoltura: Lisa y suave, con una lnea doble Contenido: Una masa de clulas voluminosas, difciles de distinguir, cuyos ncleos son claros y granulosos (ajstese el tornillo del microscopio para cambiar el enfoque) Color: Vara entre el amarillo y el pardo oscuro Otros Caracteres: Oprculo (O) claramente delineado en uno de los polos; en esta regin la envoltura puede estar visiblemente retrada. En el polo contrario hay un engrosamiento (E) de una pequea porcin de la envoltura. Los huevos se suelen encontrar en cantidad reducida en las heces fecales (en los casos de duda se pueden hacer estudios ulteriores mediante aspiracin duodenal). Los casos transmitidos por los huevos son raros. Fasciolopsis buski (Fig. 4.65) Tamao: 125140 m Forma: oval Oprculo: ligeramente menor (O) que el de Fasciola hepatica. El huevo es muy semejante al de Fasciola hepatica (Fig. 4.64), aunque tiene las diferencias siguientes: a) Envoltura: ms delgada, de una sola lnea, con notable engrosamiento (E) en el polo contrario al que ocupa el oprculo b) Oprculo: ligeramente menor c) Contenido: puede estar formado por clulas que refractan la luz, con una clula clara en el centro del huevo d) Cantidad: con frecuencia hay abundantes huevos en las heces fecales. Heterophyes heterophyes (Fig. 4.66)
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Huevo semejante al de Clonorchis sinensis (Fig. 4.49) Tamao: 2530 m Forma: ms ovalada; el oprculo no se traslapa Color: vara entre amarillo y pardo oscuro Envoltura: ligeramente ms gruesa que la de C. sinensis Giba: pequea, con forma de verruga, situada en el extremo ancho del huevo; no siempre es visible Contenido: una masa de clulas, que a veces contienen grandes grnulos que refractan la luz (en el huevo no fecundado) o un embrin ciliado. Hymenolepis diminuta (Fig. 4.67) Especia rara (se encuentra en heces fecales de nios) Tamao: 7090 m (considerablemente mayor que H. nana) Forma: redonda Color: transparente o amarillo plido Envoltura: sumamente gruesa: la envoltura externa es delgada, con lneas transversales la envoltura interna es muy gruesa, sin filamentos Contenido: un embrin redondo, con 6 garfios dispuestos en forma de abanico. Hymenolepis nana (Fig. 4.68) Tamao: 4560 m Forma: oval, casi redonda Envoltura: doble; membrana externa delgada y membrana interna frecuentemente ms gruesa en los polos, con filamentos que se extienden a partir de stos (redzcase la iluminacin para poderlos observar), mezclados con grnulos que ocupan el espacio que hay entre las dos membranas Color: gris muy plido Contenido: una masa redonda (el embrin) con 6 garfios que refractan la luz, dispuestos en forma de abanico y, con frecuencia, algunos grnulos claramente definidos en el centro. Importante: Antese en el registro si los huevos encontrados son abundantes o escasos. Metagonimus yokogawai (Fig. 4.69) Huevo semejante a los de Clonorchis sinensis y Heterophyes heterophyes (vase las Figs. 4.49 and 4.66). Tamao: 2530 m. Forma: oval, sin salientes notables Envoltura: sumamente gruesa (la ms gruesa de los 3 huevos) Oprculo: Ms redondo que el de H. heterophyes, se traslapa menos que el de C. sinensis Giba: Sumamente pequea o invisible; situada en el polo contrario al del oprculo Contenido: un embrin ciliado. Necator americanus (Fig. 4.70) El huevo es casi idntico al de Ancylostoma duodenale (Fig. 4.42) Tamao: un poco mayor (6080 m) al de A. duodenale Forma: los polos son ms aplanados Contenido: siempre contiene por lo menos 8 clulas (como A. duodenale en heces fecales frescas). Opisthorchis felineus (Fig. 4.71) Similar to the eggs of Clonorchis sinensis Huevo tambin semejante al de Clonorchis sinensis (vase Fig. 4.49). Tamao: idntico (2535 m) Contenido: un embrin ciliado Algunas diferencias: (a) Forma: ligeramente menos amplio y protuberante en la base; algunos huevos son asimtricos (b) Oprculo: se traslapa menos (c) Giba: raras veces es visible. Es sumamente difcil distinguir los huevos de los cuatro parsitos lanceolados orientales: Clonorchis sinensis: redondeado, con oprculo que se traslapa claramente Heterophyes heterophyes: redondeado, de color ms oscuro Metagonimus yokogawai: envoltura ms gruesa Opisthorchis felineus: delgado, frecuentemente asimtrico, sin giba visible. Paragonimus westermani (Fig. 4.72) Los huevos se encuentran principalmente en el esputo (si se degluten tambin se pueden observar en las heces fecales). Tamao: 65120 m (menor que el huevo de F. buski) Forma: oval, frecuentemente aplanado por un lado Oprculo: sumamente caracterstico, con un anillo notable (semeja una tapa plana) Envoltura: engrosamiento acusado en el extremo contrario al del oprculo Color: pardo dorado Contenido: espacio central claro, rodeado de clulas cuadrangulares. Schistosoma bovis (Fig. 4.73) Los huevos se hallan en las heces fecales de pacientes que han comido carne de res infectada. Tamao: muy voluminoso (200 m) Forma: fusiforme, con extremos delgados que se extienden hasta cierta distancia del embrin Espoln: largo espoln terminal Contenido: pequeo embrin redondo que se encuentra en el centro del huevo sin llenarlo completamente.
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Este helminto no causa enfermedades al ser humano. Schistosoma haematobium (Fig. 4.74) Los huevos se encuentran en la orina (vase el procedimiento para detectarlos en la seccin 7.2.8) y ocasionalmente en las heces fecales. Tamao: 110150 m Forma: oval, con un polo notablemente redondeado Espoln: terminal, situado en el polo opuesto Envoltura: lisa, sumamente delgada Color: gris o amarillo plido Contenido: un embrin ciliado, bien formado, envuelto por una membrana (membrana interna). Schistosoma intercalatum (Fig. 4.75) Huevos de aspecto semejante a los de S. haematobium (vase Fig. 4.74), que se encuentran en las heces fecales. Existen algunas diferencias: Tamao: ligeramente mayor (140180 m) al de S. haematobium Espoln: terminal, ms largo y delgado que el de S. haematobium Forma: fusiforme; menos ancho que el de S. haematobium (particularmente aplanado por los lados, hacia el polo redondo) Contenido: un embrin ciliado envuelto por una membrana con dos depresiones (d) o melladuras, una a cada lado, cerca de la parte media. Schistosoma japonicum (Fig. 4.76) Tamao: 70100 m Forma: oval, casi redonda Color: transparente o amarillo plido Espoln: difcil de descubrir, lateral y sumamente pequeo; puede estar oculto por grnulos (P) que frecuentemente se encuentran en la superficie del huevo Contenido: un embrin ciliado muy amplio. Schistosoma mansoni (Fig. 4.77) Tamao: 110180 m (= 3 huevos de Ancylostoma) Forma: oval, con un polo claramente redondeado y el otro casi cnico Espoln: Lateral, cercano al polo redondeado; voluminoso y triangular (si est oculto bajo el huevo ajstese el enfoque del microscopio) Envoltura: lisa, sumamente delgada Color: amarillo plido Contenido: un embrin ciliado voluminoso, envuelto por una membrana (envoltura interna) como en todas las especies de Schistosoma.
Fig. 4.66
Fig. 4.67
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Figura 4.64 Huevo de F. hepatica Figura 4.65 Huevo de F. buski E: Engrosamiento; O: Oprculo Figura 4.66 Huevos de Heterophyes heterophyes Figura 4.67 Huevo de H. diminuta Figura 4.68 Huevos de H. nana Figura 4.69 Huevo de Metagonimus yokogawai
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Figura 4.70 Huevo de Necator americanus Figura 4.71 Huevo de Opisthorchis felineus Figura 4.72 Huevo de Paragonimus westermani Figura 4.73 Huevo de Schistosoma bovis Figura 4.74 Huevo de Schistosoma haematobium. S: Espoln
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Figura 4.75 Huevo de Schistosoma intercalatum D:Depresin; S: Espoln Figura 4.76 Huevo de Schistosoma japonicum G: Grnulos; S: Espoln Figura 4.77 Huevo de Schistosoma mansoni S: Espoln Frotis-fecal en capa gruesa con celofn para el diagnstico de la esquistosomiasis intestinal (tcnica de Kato-Katz) La tcnica de examen de frotis fecales gruesos con celofn ha demostrado su eficacia en el diagnstico de la esquistosomiasis y la helmintiasis intestinales, en especial S. mansoni. Este tipo de frotis puede prepararse sobre el terreno, conservarse en cajas para portaobjetos y enviarse a grandes distancias para que sean examinadas en un laboratorio central en caso necesario. La tcnica no sirve para examinar larvas, quistes o huevos de ciertos parsitos intestinales. La tcnica no es adecuada para el diagnstico de estrongiloidiasis o infecciones con protozoos o Enterobius vermicularis. Material y reactivo Palillos aplicadores de madera Rejilla de acero inoxidable, nailon o plstico (malla 60105) Plantilla de acero inoxidable, plstico o cartn Portaobjetos Celofn, 4050 mm de grosor, tiras de 25 x 30 25 x 35 mm Tarro de fondo plano Pinzas Papel higinico secante Papel de peridico Solucin de glicerolverde de malaquita (reactivo n 31) (o azul de metileno) (reactivo n 39). Microscopio Tcnica La manipulacin de muestras fecales debe hacerse siempre con mucha precaucin. Siempre deben llevarse guantes para evitar la contaminacin de los dedos. 1. Sumrjanse las tiras de celofn en la solucin de glicerol verde de malaquita (o azul de m etileno) al 50 % durante al menos 24 horas antes de usarlas. 2. Transfirase una pequea parte del excremento a un trozo de papel viejo de peridico 3. Colquese la rejilla sobre la muestra fecal y presinese. 4. Con una esptula o un palillo aplicador que tenga un lado plano, raspe la superficie superior de la rejilla para que pase al material fecal (Fig. 4.78). 5. Colquese una plantilla sobre un portaobjetos limpio. 6. Transfirase una pequea cantidad de material fecal tamizado al agujero de la plantilla y llnese cuidadosamente. Alsese la superficie con la esptula (Fig. 4.79). 7. Retrese cuidadosamente la plantilla de modo que todo el material fecal quede sobre el portaobjetos y no haya material adherido a ella. 8. Cbrase la muestra fecal del portaobjetos con una tira de celofn empapada en glicerol (Fig. 4.80). 9. Si hay un exceso de glicerol en la parte superior del celofn retrese con un trozo de papel higinico o secante. 10. Invirtase el portaobjetos y apritese la muestra fecal contra el celofn sobre una superficie lisa (lo ms adecuado es un pedazo de azulejo o una piedra plana) para extender la muestra uniformemente. 11. Levntese cuidadosamente el portaobjetos; de lo contrario el celofn puede desprenderse. Deslcese suavemente el portaobjetos hacia un lado sujetando el celofn. Con esto termina la preparacin del portaobjetos. Tal vez haya que retirar el exceso de glicerol con un trozo de papel higinico para asegurarse que el celofn permanece en su sitio. Con un poco de prctica, las preparaciones sern perfectas. Las diversas etapas de la preparacin de la extensin en capa gruesa se muestran en la figura 2. Muestras fecales espesas o duras El principal problema de la tcnica de extensin en capa gruesa es la imposibilidad de ver los huevos de helmintos en algunos excrementos de consistencia dura. En esos casos: despus de la preparacin por el mtodo normal, esprense 2448 horas antes de contar los huevos en los portaobjetos: la preparacin puede tardar bastante tiempo en aclararse; preprese otro par de muestras en un portaobjetos grande (5 x 7,6 cm) y utilcese un fragmento de celofn ligeramente mayor (35 x 35 mm); a continuacin, presinese con fuerza para aplastar la muestra tanto como sea posible; cuando se utiliza el portaobjetos grande, el excremento puede ablandarse con solucin salina o glicerol antes de tamizarlo. Observacin de las preparaciones La preparacin debe conservarse a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes del examen microscpico (vase ms adelante en la parte relativa a los huevos de anquilostomas). Si se coloca el portaobjetos en una incubadora (40C) o bajo una intensa luz fluorescente o incandescente en el laboratorio, o a la luz del sol sobre el terreno, puede examinarse al cabo de pocos minutos. Para facilitar el examen microscpico, pueden ponerse una o dos gotas de eosina en solucin salina (1:100) sobre la parte superior del celofn, dejarse durante 35 minutos, y a continuacin retirar el exceso con un trozo de papel higinico o secante. Con ello es ms fcil observar los huevos de Schistosoma.
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Fig. 2. Tcnica de examen de extensiones fecales en capa gruesa con celofn (Kato) para el diagnstico de la esquistosomiasis intestinal y las infecciones gastrointestinales por helmintos 1. Se dispone de distintos materiales. En esta fotografa se observa la esptula de plstico, la plantilla de plstico y la rejilla de nailon en un estuche KatoKatz que puede encontrarse en el comercio. Los dos primeros artculos y los portaobjetos pueden volver a utilizarse; la rejilla de nailon es desechable. Pueden encargarse varios estuches para disponer de plantillas normalizadas reutilizables. 2. La rejilla de nailon y el celofn necesarios para la tcnica de frotis en capa gruesa pueden comprarse a granel. El celofn del rollo se corta en tiras de 2530 mm que se colocan en un tarro de boca ancha y fondo plano que contenga una solucin al 50 % (o ms) de glicerina con verde de malaquita o azul de m etileno (100 ml de agua, 100 ml de glicerol, 1 ml de solucin acuosa al 3 % de verde de malaquita o azul de metileno). 3. El procedimiento para esta tcnica es el mismo cualquiera que sea el material utilizado. La muestra fecal se hace pasar por la rejilla utilizando la esptula para separar el material fecal de los residuos ms grandes. 4. El material fecal pasado por la rejilla se transfiere a la plantilla que se coloca en posicin horizontal en el centro de un portaobjetos. El agujero de la plantilla queda completamente lleno de material fecal pasado por la rejilla y al ras de la superficie de la plantilla. La plantilla de KatoKatz que aparece en la imagen puede contener 41,7 mg de heces. El nmero de huevos observado se multiplica por 24 para obtener el nmero de huevos por gramo de excremento. Fig. 2 (Continuacin) 5. El cuadrado de celofn inmerso durante por lo menos 24 horas se coloca sobre la muestra fecal. 6. El portaobjetos se pone boca abajo sobre un cristal u otro portaobjetos y la muestra se reparte uniformemente bajo el celofn como se observa en la fotografa. Una vez preparado el portaobjetos, puede ponerse otra gota de glicerol en el celofn y alisar los bordes de ste para que la preparacin se conserve bien. Si se forman burbujas de aire bajo el celofn mientras se conserva la preparacin, pueden eliminarse poniendo un par de gotas de glicerol en el celofn y dejando reposar la preparacin durante la noche. Los frotis en capa gruesa con celofn pueden prepararse en el terreno, guardarse en cajas para portaobjetos y enviarse a largas distancias, lo que permite su examen en un laboratorio central en caso necesario al cabo de varios das o semanas de su preparacin. 7. Los huevos de Ascaris (izquierda) y Trichuris (derecha) pueden verse en cualquier momento. Los huevos de anquilostomas (no aparecen en la fotografa) son visibles durante los 30 primeros minutos a partir de la preparacin. 8. El momento ideal para observar los huevos de S.mansoni, S. intercalatumo S. japonicum es a las 24 horas de su preparacin. En luz solar directa los portaobjetos se aclaran rpidamente y a veces no es necesario esperar 24 horas.
Figura 4.78 Usando un palillo aplicador, raspar a travs de la superficie superior de la rejilla para tamizar la muestra fecal Figura 4.79 Llenado de la plantilla con la muestra fecal tamizada (vase figura 2 anexa)
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Figura 4.80 Cubrir la muestra fecal con una tira de celofn empapado en glicerol
TOMA, PREPARACION Y ENSAYO DE LAS MUESTRAS
Fig. 2.
Tcnica de examen de extensiones fecales en capa gruesa con celofn (Kato) para el diagnstico de la esquistosomiasis intestinal y las infecciones gastrointestinales por helmintos
1. Se dispone de distintos materiales. En esta fotogra fa se observa la esptula de plstico, la plantilla de pls tico y la rejilla de nailon en un estuche Kato-Katz que puede encontrarse en el comercio. Los dos primeros ar tculos y los portaobjetos pueden volver a utilizarse; la re jilla de nailon es desechable. Pueden encargarse varios estuches para disponer de plantillas normalizadas reutilizables.
2. La rejilla de nailon y el celofn necesarios para la tcnica de frotis en capa gruesa pueden compararse a gra nel. El celofn del rollo se corta en tiras de 25-30 mm que se colocan en un tarro de boca ancha y fondo plano que contenga una solucin al 50 % (o ms) de glicerina con verde de malaquita o azul de metileno (100 mi de agua, 100 mi de glicerol, 1 mi de solucin acuosa al 3 % de verde de malaquita o azul de metileno).
3. El procedimiento para esta tcnica es el mismo cual quiera que sea el m aterial utilizado. La muestra fecal se hace pasar por la rejilla utilizando la esptula para sepa rar el m aterial fecal de los residuos ms grandes.
4. El material fecal pasado por la rejilla se transfiere a la plantilla que se coloca en posicin horizontal en el centro de un portaobjetos. El agujero de la plantilla que da completamente lleno de material fecal pasado por la rejilla y al ras de la superficie de la plantilla. La plantilla de Kato-Karz que aparece en la imagen puede contener 41,7 mg de heces. El nmero de huevos observado se multiplica por 24 para obtener el nmero de huevos por
gramo de excremento.
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MUESTRAS FECALES
Fig. 2 (Continuacin)
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5. El cuadrado de celofn inmerso durante por lo me nos 24 horas se coloca sobre la muestra fecal. 6. El portaobjetos se pone boca abajo sobre un cristal u otro portaobjetos y la muestra se reparte uniformemen te bajo el celofn como se observa en la fotografa. Una vez preparado el portaobjetos, puede ponerse otra gota de glicerol en el celofn y alisar los bordes de ste para que la preparacin se conserve bien. Si se forman bur bujas de aire bajo el celofn mientras se conserva la pre paracin, pueden elim inarse poniendo un par de gotas de glicerol en el celofn y dejando reposar la prepara cin durante la noche. Los frotis en capa gruesa con ce lofn pueden prepararse en el terreno, guardarse en ca jas para portaobjetos y enviarse a largas distancias, lo que permite su examen en un laboratorio central en caso ne cesario al cabo de varios das o semanas de su prepara cin.
7. Los huevos de Ascaris (izquierda) y Trichuris (dere cha) pueden verse en cualquier momento. Los huevos de anquilostomas (no aparecen en la fotografa) son visibles durante los 30 primeros minutos a partir de la prepara cin.
8. El momento ideal para observar los huevos de S. mansoni, S. intercalatum o S. japonicum es a las 24 horas de su preparacin. En luz solar directa los portaobjetos se acla ran rpidamente y a veces no es necesario esperar 24 ho ras.
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Strongyloides stercoralis (Fig. 4.81) Larva Las larvas tienen gran movilidad en las heces fecales. Tamao: 200300 m de longitud y 15 m de grosor Cola: relativamente delgada Boca: pequea Tubo digestivo: fcilmente visible; consta de un esfago (0) con dos ensanchamientos en un extremo y un poro anal en el otro (A) Primordio genital: espacio redondo y claro, prximo a la parte media de la larva (E) Huevos Es raro encontrar huevos de S. stercoralis en heces formadas, ya que maduran antes de la evacuacin y producen las larvas descritas anteriormente. Sin embargo, se pueden hallar en heces lquidas (y ocasionalmente en heces formadas de los portadores de ciertas variedades). Estos huevos son muy semejantes a los de Ancylostoma duodenale (vase Fig. 4.42). Tamao: 50 80 m (ligeramente menores a los de Ancylostoma duodenale) Forma: similar a los huevos de Ancylostoma Envoltura: similar a la de los huevos de Ancylostoma Color: similar al de los huevos de Ancylostoma. Gris plido, de color marrn oscuro despus de la tincin con solucin de yodo. Contenido: una larva gruesa, plegada sobre s misma una o dos veces y provista algunas veces de movilidad. Tenia (Fig. 4.82(a)) Taenia saginata Taenia solium* Los huevos** de estos dos cestodos son casi idnticos. Se pueden encontrar en las heces fecales y los de T. saginata tambin se recogen de la piel que rodea el ano (vase la pgina 136). Tamao: 3080 m Forma: redonda Envoltura: sumamente gruesa y lisa, con lneas transversales (redzcase la iluminacin) Color: de la envoltura: amarillo oscuro o pardo del contenido: amarillo plido o gris Contenido: una masa granulosa redonda con tres pares de ganchos que refractan la luz (ajstese el enfoque) Saco externo: algunas veces el huevo se encuentra encerrado en un saco transparente, en cuyo interior flota (Fig. 4.82 (b)). *Las parasitosis por Taenia solium se restringen principalmente a regiones de escaso desarrollo socioeconmico del centro y el sur de frica, Amrica Latina y el sur de Asia. ** La denominacin adecuada para estos huevos es "embriforos", es decir, huevos embrionados desprovistos del saco externo. Trichostrongylus (varias especies) (Fig. 4.83) Huevos muy semejantes a los de Ancylostoma duodenale (vase Fig. 4.42). Tamao: 75115m m (ligeramente mayores que los huevos de A. duodenale) Forma: oval, asimtrica: uno de los polos es redondo el polo opuesto es ms delgado Envoltura: sumamente delgada, como la de Ancylostoma Contenido: en heces fecales frescas: una masa con no menos de 20 pequeas clulas granulosas y redondas. El huevo se transforma rpidamente en embrin. Trichuris trichiura (Fig. 4.84) Tamao: 5065 m. Forma: elipsoidal Envoltura: ms bien gruesa y lisa, con dos capas Color: envoltura anaranjada; contenido amarillo Otros caracteres: un tapn redondo y transparente en cada polo Contenido: una masa granulosa uniforme (que en las heces "viejas" a veces se halla dividida). Importante: especifique si se observan huevos abundantes o escasos.
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C Figura 4.81 Strongyloides stercoralis A) Larva; B) y C) Huevos.
Figura 4.82 Huevos de Taenia spp. a: huevo normal; b: huevo encerrado en un saco transparente flotante.
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Figura 4.83 Huevos de Trichostrongylus sp. Figura 4.84 Huevos de Trichuris trichiura
NO CONFUNDIR CON HUEVOS DE PARSITOS Grnulos de almidn de origen vegetal (Fig. 4.85) Tamao: 50100 m Forma: redonda u oval y alargada; el contorno siempre es accidentado, con melladuras bruscas Color: blanquecino o amarillo grisceo; la solucin de yodo lo vuelve violceo Contenido: masas apretadas de almidn. Estos grnulos son residuos de alimentos que contienen almidn, como las patatas, las judas, el ame y la yuca. Fibras de carne digerida (Fig. 4.86) Tamao: 100200 m Forma: oval o rectangular, con ngulos redondeados Color: amarillo Contenido: transparente, sin grnulos o lneas (puede haber lneas cuando la carne no se ha digerido adecuadamente). Jabones (Fig. 4.87) Tamao: 20100 m Forma: redonda, ovalada o irregular (semejante al corte de un tronco de rbol) Color: pardo amarillento o incoloro Contenido: lneas que irradian desde el centro, visibles cerca de los bordes; centro vaco. Burbujas y gotas de grasa (Figs. 4.88 y 4.89) Tamao: variable (pueden ser de cualquier tamao) Forma: perfectamente redonda Falsa envoltura: anillo que refracta la luz intensamente (varios anillos en las gotas de grasa) Contenido: ninguno. Obsrvense las grandes diferencias de tamao en la preparacin que se lustra. Pelos vegetales (Fig. 4.90) Tamao: sumamente variable (50300 m) Forma: generalmente rgida y a menudo curva; ancha y trunca en un extremo, delgada en el otro Color: amarillo plido Contenido: un conducto central, estrecho y vaco, entre dos capas transparentes que refractan la luz. Granos de polen y esporas de hongos (Fig. 4.91) Varan mucho segn el lugar del mundo y la alimentacin. Sus formas diferentes y caractersticas y otras particularidades (salientes dentadas o redondas, formas geomtricas distintivas, etc.) ayudan a diferenciarlas de los huevos de parsitos.
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Fig. 4.85
Fig. 4.86 y Fig. 4.87
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Figura 4.85 Grnulos de almidn de origen vegetal. Figura 4.86 Fibras de carne digerida. Figura 4.87 Jabones. Figura 4.88 Burbujas de aire. Figura 4.89 Gotas de grasa. Figura 4.90 Pelos vegetales. Figura 4.91 Granos de polen y esporas de hongos.
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4.4.2 IDENTIFICACIN DE LOS HELMINTOS ADULTOS Los helmintos adultos llevados al laboratorio para su identificacin pueden haber sido encontrados en las heces, en ropa de vestir o de cama, o durante una operacin quirrgica. Lo que hay que examinar: su longitud su forma si son planos y segmentados si son cilndricos (redondos) o no. su estructura interna. HELMINTOS COMUNES Helmintos redondos frecuentes Ascaris lumbricoides: Helmintos redondos grandes (Fig. 4.92) Color: rosceo Grosor: 0,30,5 cm Longitud: macho: aproximadamente 15cm, con cola formando un bucle, Hembra: 20 25 cm, con cola recta. Enterobius vermicularis (Oxiuros): Helmintos redondos pequeos (Fig. 4.93) Color: blanco Longitud: hembra: 1 cm, con cola muy puntiaguda; macho: 0,5 cm (los machos son menos frecuentes). Los oxiuros se suelen encontrar en cantidades abundantes, especialmente en las heces fecales de los nios, y son mviles. Tambin se pueden hallar en los pliegues de la piel que rodea el ano, de donde se obtienen por medio de una cinta adhesiva de celofn (vase seccin 4.4.1). Tenias. Helmintos planos segmentados Color: marfil o azul plido Longitud: todo el helminto: 310 m; sin embargo, por lo general se envan para su examen los segmentos maduros separados (longitud: 13cm) o fragmentos de la cadena, cuya longitud es sumamente variable. Importante Si hay tardanza en realizar el examen las piezas separadas se pueden secar y enrollar, tomando el aspecto de helmintos redondos. Humedzcanse para devolverles su forma. Examen Materiales y reactivos Microscopio o lupa Portaobjetos Placa de Petri Pinzas. 1. Examine una cadena de segmentos para observar el orden de los poros laterales (Fig. 4.94) 2. Examine un solo segmento aplanado suavemente entre dos portaobjetos (Fig. 4.95). Sostenga el portaobjetos contra la luz para observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista. 3. Para examinar la cabeza (esclex): coloque todo el helminto en una caja de Petri o un plato llenos de agua por medio de una pinza traslade el helminto poco a poco a otro plato (Fig. 4.96); desenrllese comenzando por el extremo ms grueso Si al final de una porcin sumamente estrecha (cuello) se encuentra un ensanchamiento del tamao de una cabeza de alfiler pequea, examine con una lupa o con microscopio (con objetivo x 10). La cabeza solo se encuentra raras veces. La Figura 4.97 muestra cmo diferenciar entre T. saginata y T. solium y dos tenias menos comunes, Hymenolepis nana y Dipylidium caninum.
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Figura 4.95 Segmentos de un adulto de Taenia spp. Figura 4.95 Aplanamiento suave de un segmento entre dos portaobjetos de microscopio
A) Sostenga el portaobjetos contra la luz para observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista.
Figura 4.96 Con unas pinzas para transferir una Tenia.
144 B) Observacin del esclex. Examine con una lupa o con microscopio (con objetivo x 10). La cabeza solo se encuentra raras veces.
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OTROS HELMINTOS ENCONTRADOS EN LA MATERIA FECAL Raras veces se observan en las heces fecales. Ocasionalmente se hallan en los rganos del paciente durante una operacin quirrgica. En el hgado y los intestinos puede haber distomas y los quistes hidatdicos se observan en el hgado y los pulmones. Ancylostoma duodenale y Necator americanus (uncinarias) (Fig. 4.98) Pequeo helminto redondo (semejante a un trozo de hilo). Longitud: 11,5cm Color: blanco o rojo si contiene sangre. Se asemeja al oxiuro (vase Fig. 4.93). Examnese la cabeza (esclex) con el microscopio (con objetivo x 10) Trichuris trichiura (tricocfalo) (Fig. 4.99) Pequeo helminto delgado, semeja un pequeo ltigo; le tercera parte de su cuerpo es relativamente gruesa y el resto es filiforme. Este helminto habita en la pared del ciego o bien, ocasionalmente, en el recto Longitud: 35 cm Color: blanco. Distoma (Fig. 4.100) Helminto plano provisto de dos ventosas; semeja una hoja. Distoma grande: de 23 cm de longitud, relativamente ancho, de color rojo pardo o blanco opaco (DG) Distoma pequeo: de 0,51 cm de longitud, menos ancho, transparente, de color rojo sucio (dp). Schistosoma spp. (Trematodos sanguneos) (Fig. 4.101) Pequeo helminto delgado Longitud: 0,51,5 cm Color: blanco. El macho, que es plano, se enrolla en la hembra filiforme, que es ligeramente ms larga. Cada helminto posee dos ventosas cerca de la cabeza. Echinococcus granulosus (quiste hidatdico) Los helmintos de Echinococcus granulosus se encuentran en los perros. Los especmenes adultos tienen de 36 mm de largo. Los humanos y los animales se pueden infectar por la ingestin accidental de los huevos, que luego se convierten en quistes hidatdicos en el hgado o los pulmones (Fig. 4.102). Tamao: alrededor de 150 m. Forma: redonda, ovalada o irregular, con un polo ligeramente aplanada. Contenido: grnulos finos y un anillo distinguible de 1030 ganchitos (corona de ganchos). Color: incoloro y transparente. La hidatidosis se produce preferentemente en las zonas donde se cran ovejas, como frica del Norte y Oriental, Amrica del Sur, la pennsula de Arabia, Australia y Nueva Zelanda. Diphyllobothrium latum (tenia del pescado) Diphyllobothrium latum se encuentra principalmente en los climas fros. La infeccin se produce por ingestin de pescado crudo o insuficientemente cocido y puede resultar en obstruccin intestinal, anemia, dolor y prdida de peso. Duracin: hasta 20 m
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Figura 4.98 Ejemplares adultos de A. doudenale y de N. americanus (uncinarias) Figura 4.99 Ejemplares adultos de Trichuris trichiura mostrando en el crculo los extremos del macho y la hembra.
Figura 4.100 Distoma adulto. Distoma grande (DG), Distoma chico (DC).
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Figura 4.101 Esquistosomas. Se observa en el crculo un macho y una hembra juntos. Figura 4.102 Quiste hidatdico. Se observan los elementos que contiene el quiste, esclex, corona de ganchos, ganchos (arenilla hidatdica)
4.5 TCNICAS PARA CONCENTRAR LOS PARSITOS ELECCIN DEL MTODO DE CONCENTRACIN DE PARSITOS Tcnica de concentracin Si la muestra de heces contiene pocos microorganismos, es posible que no se detecten parsitos en una preparacin hmeda directa. As pues, siempre que sea posible, debe concentrarse la muestra. Los huevos y larvas de gusanos y los quistes de protozoos pueden recuperarse por concentracin, pero los trofozotos de protozoos no se vern ya que este procedimiento suele destruirlos. Por ese motivo es imprescindible el examen de la preparacin hmeda directa como fase inicial del estudio microscpico. El procedimiento de concentracin est indicado cuando el examen preliminar de la preparacin hmeda d resultado negativo a pesar de los sntomas clnicos que indican la infeccin por parsitos del paciente, y para la deteccin de Schistosoma y Tenia. El procedimiento de concentracin que se recomienda es el mtodo formalinater (o formalina acetato etlico)1. Aparte de otros mtodos recomendados de concentracin como el mtodo de Willis de flotacin, por ejemplo. Por este mtodo pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (scaris, tenias, esquistosomas y otros huevos de trematodos), as como quistes de protozoos. 1 Si no se dispone de ter ni acetato etlico, puede usarse gasolina ordinaria en idnticas proporciones que el ter. El acetato etlico no es tan inflamable ni tan explosivo como el ter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratorio. Adems, debe tenerse en cuenta que la recoleccin seriada de la materia fecal durante varios das (6 a 8 das) aumenta ms la probabilidad de encontrar los parsitos a travs de sus formas (quistes, huevos, larvas). BENEFICIOS DE LA CONCENTRACIN DE PARSITOS El empleo de los mtodos de concentracin hace posible que: se examine una cantidad mayor de heces fecales en menor volumen se detecten parsitos que estn presentes en nmero reducido. Importante: Antes de preparar una concentracin de parsitos se debe realizar invariablemente un examen microscpico directo de las heces fecales. (En las preparaciones concentradas no se encuentran formas mviles de protozoarios.) Cuatro tcnicas de concentracin diferentes se describen en este libro: 1. La tcnica de flotacin utilizando una solucin de cloruro de sodio (Willis) 2. La tcnica de sedimentacin formaldehdoter (Allen & Ridley), (tcnica del formaldehido con ter, mtodo formalinater (o formalina acetato etlico), (Telemann modificado)) 3. La tcnica de sedimentacin formaldehdodetergente 4. La tcnica de sedimentacin para las larvas de Strongyloides stercoralis (HaradaMori). 4.5.1 TCNICA DE FLOTACIN UTILIZANDO UNA SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO (WILLIS) Mtodo de concentracin por el uso de solucin de cloruro sdico (Willis) Se recomienda este mtodo para la deteccin de huevos de Ancylostoma duodenale y Necator americanus (es el mejor mtodo para detectar la presencia de Ancylostoma y Necator), Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Taenia spp. y Trichuris trichiura. No es adecuado para la deteccin de huevos de trematodos y Schistosoma spp., larvas de Strongyloides stercoralis, o quistes de protozoarios o trofozotos. PRINCIPIO
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Las heces fecales se mezclan con una solucin saturada de cloruro sdico (aumentando la gravedad especfica). El peso de los huevos es menor y flotan en la superficie, de donde se pueden recoger (Fig. 4.103).
Figura 4.103 Principio de la tcnica de flotacin.
Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Frasco de boca ancha, 10 ml, frascos de 10 ml (de penicilina) Aplicadores de madera Gasa Placas de Petri Etanol al 95% ter Solucin de Willis (reactivo no. 64) Vaselina Cera MTODO Preparacin de cubreobjetos desgrasados (a) Mzclese en una probeta: 10 ml de etanol al 95% y 10 ml de ter (b) Vierta esta mezcla en una placa de Petri y coloque en ella 30 cubreobjetos, uno por uno; agite la placa y a continuacin djela reposar durante 10 minutos (c) Saque los cubreobjetos, uno por uno, y squelos con gasa (d) Guarde los cubreobjetos en una placa de Petri seca. Los pasos anteriores se resumen en la figura 4.104.
Figura 4.104 Preparacin de cubreobjetos desgrasados.
Concentracin de parsitos 1. Coloque aproximadamente 0.5 g de heces en un frasco de boca ancha. Llene la botella hasta la marca de 2,5 ml con solucin de Willis. Otra forma alternativa: Coloque una porcin de la muestra de heces, de 2 ml (2cm3) aproximadamente, en un frasco de penicilina. Llene una cuarta parte del frasco con solucin de Willis. Tambin, se puede cubrir el fondo del frasco con un volumen de muestra fecal previamente homogeneizada en un recipiente aparte. 2. Por medio de un aplicador o una varilla de vidrio disgregue la porcin tomada de la muestra y mzclela minuciosamente con la solucin. Acto seguido llene el frasco completamente con solucin de Willis. La suspensin deber ser completamente uniforme. Adems, la pelcula superficial superior del frasco debe hacer contacto con el cubreobjetos. 3. Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la boca del frasco. Recuerde que el cubreobjetos debe tapar la boca del frasco para poder recibir a los huevos que flotan, por ende, la boca del frasco no debe ser muy ancha como para que el cubreobjetos no logre posarse sobre ella. 4. Compruebe que el cubreobjetos est en contacto con el lquido y no existen burbujas. Djelo reposar durante 10 minutos. Puede dejar tambin de 10 minutos a una hora, tiempo ptimo: 20 minutos (Fuente: Willis HH. 1921. A simple levitation method for the detection of hookworm ova. Med J Australia 29 Oct: 375 376.) 5. Levante el cubreobjetos con cuidado; deber quedar en l una gota del lquido. Levante el cubreobjetos rpida y verticalmente sin invertir sobre el portaobjetos.
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Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos y examnelo con el microscopio inmediatamente (con el objetivo x10), ya que esta preparacin se seca con suma rapidez. De lo contrario, proteja la gota del cubreobjetos bandolo (sellar el cubreobjetos) con vaselina y cera. Utilice el ajuste lento del microscopio para observar todos los objetos visibles que se encuentren en el campo (los huevos suelen adherirse al cubreobjetos y no se pueden distinguir inmediatamente). Nota: Si quiere, en la zona donde colocar el cubreobjetos puede colocar previamente una gota de lugol con una pipeta Pasteur fina, esto es a eleccin del operador y depende de su experiencia; en su defecto, coloque sin esto y observe como se describi antes sin coloracin. Fuente: Willis HH. 1921. A simple levitation method for the detection of hookworm ova. Med J Australia 29 Oct: 375 376.
7 1) Materiales necesarios. 2) Colocacin de la materia fecal en el frasco, tambin se contempla el agregado de un volumen de muestra previamente homogeneizado, y el agregado de la solucin sobresaturada de Cloruro de Sodio (Solucin de Willis) 3) Trituracin de la materia fecal en el frasco con una varilla de vidrio, mezcla de sta con la solucin de Willis y luego llenado del frasco con la solucin sobresaturada de Cloruro de Sodio hasta el borde. Obsrvese la pelcula superficial superior ( menisco de forma convexa) que se forma en la boca del frasco. La suspensin deber ser completamente uniforme. 4) Coloque cuidadosamente un cubreobjetos sobre la boca del frasco. 5) Compruebe que el cubreobjetos est en contacto con el lquido y no existen burbujas de aire. Djelo reposar durante 10 minutos. (Tiempo ptimo. 20 minutos) 6) luego del tiempo de espera, Levante el cubreobjetos con cuidado; deber quedar en l una gota del lquido. Levante el cubreobjetos rpida y verticalmente sin invertir sobre el portaobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre un portaobjetos y examnelo con el microscopio inmediatamente (con el objetivo x10), ya que esta preparacin se seca con suma rapidez. 7) Utilice el ajuste lento del microscopio (micromtrico) para observar todos los objetos visibles que se encuentren en el campo (los huevos suelen adherirse al cubreobjetos y no se pueden distinguir inmediatamente).
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Diagrama esquemtico que ilustra a grandes rasgos la tcnica de Willis. Fuente: Gobierno de Santa Fe (Argentina), Ministerio de Salud, Secretara de salud Pblica Municipalidad de Rosario. Direccin de Servicios de Laboratorio y Anlisis Clnicos, Bioq. Carlos Gmez. 4.5.2 TCNICA DE SEDIMENTACIN FORMALDEHIDO-TER (Allen & Ridley) Principio La muestra de heces se trata con formaldehido, que preserva los parsitos presentes. Los residuos grumosos se eliminan por filtracin. Los elementos grasos de la suspensin fecal se separan por extraccin con ter (o acetato de etilo), seguido por centrifugacin, lo que sedimenta los parsitos presentes. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Centrfuga Tubos de ensayo Gradilla Tubos de centrfuga Aplicadores de madera Filtro de alambre de latn, malla 40 (425 mm), 7,2 cm de dimetro (los coladores de caf de nylon ofrecen una alternativa de bajo costo) Pequeo plato de porcelana o acero inoxidable o vaso de precipitados Pipeta Pasteur Mtodo Preparacin de cubreobjetos libres de grasa 1. Mezclar en un cilindro: 10 ml de etanol al 95% y 10 ml de ter. 2. Vierta la mezcla en una placa de Petri y se colocan 30 portaobjetos, uno por uno, agitar y dejar actuar durante 10 minutos. 3. Tome los cubreobjetos uno a uno y squelos con una gasa. 4. Mantngalos en una placa de Petri seca. Los pasos anteriores se resumen en la figura. 4.104 (vase antes). , solucin de formalina 10% (100 ml de formaldehido, solucin al 37% en 900 ml de agua destilada) ter (o acetato de etilo). Mtodo 1. Mediante el uso de un aplicador de madera, extraer una pequea cantidad (aproximadamente 0,5 g) de heces de la superficie y el interior de la muestra de heces. 2. Colocar la muestra en un tubo de centrfuga que contiene 7 ml de formalina al 10%.
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3. Emulsionar las heces en la formalina y filtrar en el plato. 4. Lave el filtro (con agua y jabn) y deseche los residuos con grumos. 5. Transferir el filtrado a un gran tubo de ensayo. Aadir 3 ml de ter (o acetato de etilo). 6. Tapar el tubo y mezclar bien. Sacudirlo mediante agitacin. 7. Transferir la suspensin resultante de nuevo al tubo de centrfuga y se centrifuga a 2000 g durante 1 minuto. 8. Afloje el tapn graso con un aplicador y vierta el sobrenadante lejos de forma rpida invirtiendo el tubo (Fig. 4.105). 9. Colquese de nuevo el tubo en la gradilla y djese que el lquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. Mzclese bien y transfirase una gota con una pipeta Pasteur a un portaobjetos para examinarlo bajo un cubreobjetos. Hgase tambin una preparacin teida con yodo. 10. Utilcense los objetivos x10 y x40 para examinar la totalidad del cubreobjetos para los huevos y los quistes. Ahora es una prctica comn llevar a cabo todos los pasos anteriores en una cabina de seguridad biolgica. Si el sistema de extraccin de la cabina no es a prueba de fuego, los pasos que involucran ter se deben hacer fuera del armario. El Acetato de etilo proporciona una alternativa menos inflamable al ter. PRECAUCIN El ter es un producto sumamente inflamable que se prende y explota rpidamente si hay una llama o una chispa en sus proximidades. Gurdense las latas o frascos abiertos en un estante abierto en la parte ms fresca del laboratorio. Hay que cerciorarse de que las latas o las botellas estn tapadas. Nunca debe ponerse un recipiente abierto de ter dentro del frigorfico: los vapores se acumulan en el interior de ste, incluso cuando el recipiente est cerrado, y pueden explotar cuando se abre la puerta. No deben colocarse recipientes abiertos en un armario. Es preferible dejar el recipiente en un estante abierto de modo que los vapores puedan dispersarse sin dificultad.
Figura 4.105 Despus de centrifugar la suspensin, afloje el tapn graso y descarte el sobrenadante.
AGREGADO:
Los mtodos de concentracin para parsitos que se agregan a continuacin constituyen una alternativa tambin usada en varios laboratorios de Amrica Latina. MTODO FORMALINA-TER (O FORMALINA ACETATO ETLICO) El procedimiento de concentracin que se recomienda es el mtodo formalinater (o formalina acetato etlico)1. Por este mtodo pueden recuperarse todos los tipos de larvas y huevos de gusanos (scaris, tenias, esquistosomas y otros huevos de trematodos), as como quistes de protozoos. Se recomienda para: No es adecuado para formas mviles de amebas y flagelados, puesto que son lbiles. 1 Si no se dispone de ter ni acetato etlico, puede usarse gasolina ordinaria en idnticas proporciones que el ter. El acetato etlico no es tan inflamable ni tan explosivo como el ter, por lo que resulta menos peligroso en el laboratorio. MATERIAL Y REACTIVOS 1. Varillas aplicadoras de madera. 2. Frascos, distribuidores o de plstico exprimible, de 250 ml o 500 ml. Estos frascos son muy cmodos para aadir formalina a los tubos de la centrifugadora. Puede usarse tambin cualquier tipo de frasco o botella pequea. 3. Centrifugadora, con cabezal y cubetas para alojar tubos cnicos de 15 ml. Deben usarse cubetas hermticamente cerradas. 4. Tubos de centrifugadora, 15 ml, cnicos (hgase una marca a 7 ml y 10 ml con un lpiz graso). 5. Torundas de algodn.
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6. Cubreobjetos. 7. Embudo. 8. Gasa quirrgica. 9. Portaobjetos. 10. Pipetas Pasteur con perilla de goma. 11. Gradilla o soporte para los tubos. 12. Formalina, 10 %. Para el uso cotidiano, virtase parte de la solucin en un frasco exprimible. El frasco debe ir etiquetado. 13. ter o acetato etlico. (Lase antes aclaracin sobre otros lquidos que se pueden usar). 14. Yodo de Lugol, solucin al 1 %, en un frasco distribuido con pipeta. 15. Solucin salina, isotnica. TCNICA 1. Adase 10 ml de formalina al 10 % a aproximadamente 1 g de heces y remuvase utilizando un palillo aplicador hasta obtener una suspensin ligeramente turbia. 2. Ajstese un filtro de gasa al embudo y colquese ste sobre un tubo de centrifugadora. 3. Hgase pasar la suspensin fecal por el filtro dentro del tubo de centrifugadora hasta alcanzar la marca de los 7 ml. 4. Retrese el filtro o y trese junto con el residuo slido. 5. Adanse 3 ml de ter o de acetato etlico y mzclese bien durante un minuto. 6. Vulvase a verter en el tubo de centrifugadora y centrifguese durante un minuto. El tubo debe presentar el mismo aspecto que en la ilustracin. 7. Despguese el tapn graso (residuo) con un palillo aplicador, y trese el sobrenadante invirtiendo rpidamente el tubo. 8. Colquese de nuevo el tubo en la gradilla y djese que el lquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. Mzclese bien y transfirase una gota a un portaobjetos para examinarlo bajo un cubreobjetos. Hgase tambin una preparacin teido con yodo. 9. Utilcense los objetivos X10 y X40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas. EXAMEN DEL SEDIMENTO Las preparaciones de material concentrado deben examinarse del mismo modo que se ha descrito para las preparaciones hmedas directas. La preparacin con solucin salina (o sin teir) debe examinarse de modo sistemtico en busca de huevos, larvas y quistes. Si se observan quistes o estructuras que lo parecen, debe examinarse la preparacin con yodo para hallar ms detalles. Los microorganismos tendrn el mismo aspecto que se ha descrito en el caso de las preparaciones hmedas directas. En las preparaciones con solucin salina concentradas con formalinater (o acetato etlico), los ncleos de los quistes quedan fijados y pueden resultar visibles. No obstante, las preparaciones hmedas con yodo deben examinarse para alcanzar una identificacin ms fiable.
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13 y 14 1) Materiales y reactivos utilizados. 2) Adase 10 ml de formalina al 10 % a aproximadamente 1 g de heces y remuvase utilizando un palillo aplicador hasta obtener una suspensin ligeramente turbia. O agregue en el fondo del frasco un volumen de muestra previamente homogeneizada en otro frasco. 3) Filtre a travs de dos capas de gasa en un tubo para centrifugacin graduado. Retire el filtro de gasas junto con el residuo slido que queda en ella luego de haber filtrado. Los pasos 4), 5) y 6) son alternativos y opcionales. 4) Centrifugue el tubo con el filtrado y luego de centrifugado squelo y descarte el sobrenadante dejando el sedimento en el fondo del tubo 5) Aada de solucin de formaldehido al sedimento. 6) Revuelva bien la mezcla y djela reposar 5 minutos. 7) Adanse 3 ml de ter o de acetato etlico (en ltimos casos, gasolina) y mzclese bien durante un minuto. Importante: Cercirese de que en laboratorio no hay ningn aparato con llama encendido. 8) Tapone el tubo. Vulvalo sobre un lado y agtelo vigorosamente durante 30 segundos. 9) Vulvase a verter en el tubo de centrifugadora y centrifguese durante un minuto. El tubo debe presentar el mismo aspecto que en la ilustracin. Retire el tapn con cuidado. Centrifugue durante 1 minuto a baja velocidad. En el interior del tubo se formarn cuatro capas: 1a capa: ter 2a capa: residuos 3a capa: solucin de formaldehido 4a capa: el sedimento, con huevos y quistes de parsitos. (Vase tambin la figura 10, donde se observan claramente las capas). 11) Fig. 4.105 anterior, siga los mismos procedimientos: Despus de centrifugar la suspensin, afloje el tapn graso y descarte el sobrenadante. Es decir, despguese el tapn graso (residuo) con un palillo aplicador, y trese el sobrenadante invirtiendo rpidamente el tubo. Colquese de nuevo el tubo en la gradilla y djese que el lquido de los lados del tubo escurra hasta el sedimento. 12) Mezcle muy bien el lquido restante con el sedimento golpeando suavemente el tubo (resuspender). 13) Deposite dos gotas del sedimento en un portaobjetos. Aada una pequea gota de solucin yodada nicamente a la segunda gota del sedimento. 14) Coloque cubreobjetos sobre ambas gotas. Examnelas con el microscopio. Preparacin 1 (sin tincin): utilice objetivos x 10 y x 40 (para buscar huevos y larvas). Preparacin 2 (teida): utilice el objetivo x 40 (para buscar quistes). Utilcense los objetivos X10 y X40 para examinar todo el material que queda bajo el cubreobjetos en busca de huevos, quistes y larvas. MTODO DE CONCENTRACIN DE TELEMANN MODIFICADO Es una tcnica de sedimentacin en la cual se utiliza una solucin salina de menor densidad mayor a la de los parsitos para que estos se concentren en el sedimento. La presencia de parsitos hace que este mtodo sea de eleccin, pues es de menor costo, mayor rendimiento y de rpido procedimiento. Este examen parasitolgico de deposiciones puede ser seriado o de solo una muestra. Se utiliza para el diagnostico de urgencia, frente a cuadros diarreicos y disentricos en nios y adultos, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Materiales Solucin salina formolada al 5 % Gasas Embudo Frasco tapa rosca. Tubos de centrifuga Pipetas Pasteur Portaobjetos Cubreobjetos Varillas de vidrio. ter Solucin de lugol. Microscopio. Centrifuga Preparacin de soluciones
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Solucin salina formolada al 5 % Cloruro de sodio 8.5 9.0 g Formol 40 % 50 ml. Agua destilada 1000 ml. Solucin de lugol Ioduro de potasio 10g Iodo metlico bisublimado 5.0 g Agua destilada 100ml. Procedimiento Homogeneizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solucin formolada. Filtrar a travs de un embudo con una doble gasa en tubo de centrifuga. Agregar aprox. 2 ml de ter. Centrifugar a 1000 1500 rpm durante 3 a 5 min. Eliminar con golpe seco el sobrenadante. Tomar con pipeta Pasteur una pequea cantidad del sedimento y colocar en portaobjeto. Agregar una gota de lugol y sellar con un cubreobjeto. Fuente: Telemann W. Eine methode zur erleichterung der auffindung von parasiteneiern in den faeces. Deutsche Medizinische Wochenschrift 35:1510 1511. MTODO DE TELEMAN ORIGINAL FUNDAMENTO En 1908, Telemann describe su mtodo, el cual es modificado por Rivas en 1928, quien cambio el cido clorhdrico por cido actico. En esta seccin se describir el original. La utilidad es para concentracin de huevos, quistes y larvas, sobre todo aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y cidos grasos libres. MATERIAL Reactivos ter etlico cido clorhdrico concentrado Agua destilada Soluciones Solucin de cido clorhdrico al 15% Vidriera Vaso de precipitado Tubos cnicos Pipeta Pasteur Portaobjetos Cubreobjetos Aparatos Microscopio compuesto Centrifuga Otros Aplicadores Tapn de goma o caucho Gasa o algodn Bulbo de goma Gradilla MTODO 1. Se coloca un fragmento de heces del tamao de un frjol (aprox. 1 g) 2. Se le agrega en el vaso de precipitados cido clorhdrico al 15%, y se homogeneiza con el aplicador cuidadosamente 3. Se pasa la suspensin por dos capas de gasa o algodn previamente humedecido. 4. Se aade ter en cantidades iguales y se coloca un tapn de caucho o se tapa con el pulgar. 5. Se agita vigorosamente y se afloja el tapn o el dedo para disminuir la presin y se destapa. 6. Se centrifuga a 1500 rpm durante 1 minuto. 7. Se saca de la centrifuga y se observan cuatro capas: 1) ter; 2) Tapn de restos fecales; 3) Capa de cido; 4) Sedimento inferior que contiene la forma parasitaria. 8. Se mantiene en el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con un movimiento circular, se despega el tapn de restos fecales. 9. Rpidamente, pero con cuidado se vierten el ter, tapn y capa de asido, de manera que quede el sedimento en el tubo. 10. Se mantiene el tubo en posicin horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapn fecal bajen por las paredes al sedimento. 11. Se introduce un aplicador con hisopo de algodn y se limpian las paredes del tubo. 12. Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta. 13. Se coloca en un portaobjetos y se coloca encima el cubreobjetos. 14. Se examina con el microscopio con los objetivos 10X y 40X. 4.5.3 TCNICA DE SEDIMENTACIN FORMALDEHIDO-DETERGENTE Principio La tcnica de sedimentacin formaldehidodetergente es un mtodo de sedimentacin cuantitativo barato, seguro y simple en el que una cantidad medida de heces se mezcla en una solucin de formaldehidodetergente de baja gravedad especfica. La suspensin se tamiza y se deja inalterada
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para permitir que los huevos sedimenten bajo su propio peso. El detergente "borra" los desechos fecales en un corto tiempo. Despus de la sedimentacin y del borrado de los desechos fecales, la pequea cantidad de sedimento fino que se forma se examina bajo el microscopio en busca de huevos, y los huevos se cuentan para dar un resultado cuantitativo. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Kit comercial de ensayo, que consiste en un recipiente de base cnica, un colador de plstico, una Pipeta Pasteur, un vaso de precipitados y un detergente comercial, diluido 1:50 con agua destilada Solucin de formalina al 2% (preparada mediante la dilucin de formaldehido, solucin al 37% 1:50 con agua destilada). Mtodo Los detalles del mtodo que se suministra con el kit son los siguientes: 1. Llene el recipiente de base cnica en la marca de 10 ml con 2% de detergente en el 2% de formalina. 2. Use la cuchara unida a la tapa del recipiente, transfiera aproximadamente 350 mg de heces al recipiente y mezclar bien en la solucin de formaldehidodetergente. 3. Usando el filtro de plstico, colar la suspensin en el vaso de precipitados suministrado con el kit (fig. 4.106). Enjuague el recipiente y luego aadir al filtrado. 4. Coloque el recipiente en posicin vertical en el bastidor provisto y dejar actuar durante 1 hora (no centrifugar). En condiciones de campo, las heces emulsionadas pueden ser transportadas al laboratorio para su anlisis. Los huevos de esquistosomas son fijados y no se distorsionan. 5. Retire cuidadosamente y deseche el fluido sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que se ha formado en la base del recipiente (fig. 4.107). 6. Aadir 10 ml de la solucin de formaldehidodetergente; mezclar y dejar sedimentar durante 1 hora ms. Adems, se lleva a cabo la limpieza de los restos fecales. 7. Retire y deseche el lquido sobrenadante, dejando aproximadamente 0,5 ml de sedimento fino. 8. Usando la pipeta Pasteur, transferir todo el sedimento a un portaobjetos y cubra con un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm (suministrado con el kit) (fig. 4.108). 9. Examine toda la preparacin en el microscopio, utilizando el objetivo x10 con el diafragma del condensador cerrado lo suficiente como para dar un buen contraste. Contar todos los huevos presentes y multiplicar el nmero por 3 para obtener el nmero aproximado por gramo de heces. Nota: Si no se retira el lquido sobrenadante despus de 1 hora, pero en su lugar se aaden 10 ml de reactivo y la suspensin se vuelve a mezclar y se deja sedimentar durante la noche, los huevos, quistes y larvas de otros parsitos se sedimentan. La tcnica es especialmente til en los laboratorios sin las instalaciones para llevar a cabo la tcnica de sedimentacin formaldehido-ter. La formalina conserva los parsitos sin distorsionar su morfologa.
Figura 4.106 Agotar la suspensin. Figura 4.107 Extraccin del sobrenadante.
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Figura 4.108 Transferir el sedimento a un portaobjetos.
4.5.4 TCNICA DE SEDIMENTACIN PARA LAS LARVAS DE STRONGYLOIDES STERCORALIS (HARADA-MORI) PRINCIPIO Las larvas de Strongyloides que se encuentran en las heces fecales se desplazan contra la corriente de agua que, por movimiento capilar, asciende por una tira de papel de filtro que se ha sumergido parcialmente en un tubo de ensayo que contiene agua, y se acumulan en el fondo del tubo. El mtodo de Harada y Mori se basa en la identificacin microscpica de larvas de nematodos que emergen de muestras fecales cultivadas en papel de filtro en tubos de ensayo. El procedimiento es especialmente til en el diagnstico de infecciones humanas por S. stercoralis, Necator americanus, A. duodenale y Trychostrongylus sp., as como para identificacin especfica. Materiales y reactivos Microscopio Cinta adhesiva Tubos de ensayo (de 20 x 200 mm 18 x 180 mm) Gradilla Tiras de papel de filtro (30 mm x 150 mm) Esptula Yodo Lugol, solucin al 0,5% (reactivo. N 37). Agua destilada o hervida Pipeta capilar Mtodo (a) Extienda con la esptula una pequea cantidad de la muestra de heces a lo largo de una tira de papel de filtro (que previamente se habr doblado a lo largo para mantenerla recta), dejando limpios los ltimos 4 5 cm para sumergirlos en agua. (b) Introduzca la tira de filtro de papel, por el extremo limpio, en un tubo de ensayo que contenga 2,53 cm de agua filtrada, destilada o hervida; el extremo de la tira no deber tocar el fondo del tubo (doble la tira en la parte superior para que el fondo no toque el fondo del tubo). (c) Marque en el tubo el nmero o el nombre del paciente en forma indeleble. (d) Conserve el tubo durante 78 das a la temperatura ambiente, protegido con un tapn de algodn o, an mejor, sellado con cinta adhesiva. (e) Busque las larvas que pueda haber en el fondo del tubo y examnelas despus de tratarlas con solucin yodada para poder distinguir las de Strongyloides y las de Ancylostoma. Teir con solucin de yodo durante 1 minuto y luego examinar bajo el microscopio, con el objetivo x10. Nota: Las larvas de Strongyloides pueden llegar a la etapa infectante en estas condiciones, produciendo larvas filariformes, o convertirse en helmintos adultos. Las larvas que generalmente se observan en las muestras de heces frescas son las larvas rabditiformes de S. stercoralis (primera etapa). Sin embargo, si se pasa la materia fecal ms de 12 horas antes, las larvas pueden haber nacido en larvas filariformes (etapa infecciosa). Estos deben estar de diferenciarse de las larvas de Ancylostoma duodenale y Necator americanus (anquilostoma, uncinaria), que tambin puede eclosionar en las heces 1224 horas despus del pasaje. La aparicin de larvas filariformes de S. stercoralis puede indicar una hiperinfeccin sistmica. El primordio genital ser ms visible en las preparaciones teidas con yodo. El yodo mata las larvas y hace que las caractersticas morfolgicas de stas sean ms fciles de ver. Usted tendr que utilizar el objetivo de x40 para ver estas estructuras. Si usted ve una larva con una apertura bucal corta y un primordio genital prominente (claramente visible), es S. stercoralis. Si usted ve una larva con una apertura larga de la boca y no ve un primordio genital, es A. duodenale o N. americanus. Las principales caractersticas distintivas de las larvas de S. stercoralis y A. duodenale o N. americanus se resumen en la Tabla 4.6 y se ilustra en la figura. 4.109. Comentarios: 1. Si las larvas son demasiado activas para observar al microscopio pueden ser matadas por calentamiento, Lugol o formol. 2. Los huevos de Necator americanus en las heces mueren en 24 horas al ser conservados a 0 C. Por este motivo las muestras fecales para ser examinadas por este mtodo deben ser
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mantenidas hasta el momento del examen a 10 25 C en condiciones ptimas de humedad. 3. Un extendido fecal grueso en la cinta de papel puede resultar en una disminucin en la media de eclosin. 4. Si los extendidos quedan inmersos en el agua, aunque sea parcialmente, proliferan bacterias y levaduras, con una consecuente deficiencia de oxgeno disuelto. Las larvas emergentes mueren y la deteccin resulta imposible. 5. Si se usan pequeas cantidades de agua, emergen pocas larvas debido a la desecacin.
AGREGADO
TCNICA ALTERNATIVA Esta tcnica alternativa es la misma que la anterior pero con modificaciones pequeas. 1. Preparar una cinta de papel de filtro. 2. Esparcir 0,5 g de heces frescas en el papel de filtro, formando un extendido fecal fino y uniforme en uno de los lados de la cinta, excepto en las reas de 4 cm distante de ambas extremidades. 3. Introducir la cinta de papel de filtro en un tubo de ensayo de 18 x 180 mm conteniendo 4 a 5 ml de agua destilada, de manera que el agua no entre en contacto con las heces. 4. Cerrar el tubo con un tapn de goma, conservndolo en posicin vertical durante 10 a 14 das a temperatura de 25 30 C. 5. Agregar agua para mantener el nivel original. Chequear diariamente el fluido del fondo del tubo. 6. Al final del perodo de incubacin colectar con una pipeta capilar larga el agua del fondo del tubo con el fin de observar si existen larvas filariformes, o examinar en microscopio invertido. 7. En caso positivo, retirar la tapa y el papel de filtro del tubo y examinar el fluido con objetivo de 10 X. 8. Examinar la movilidad y las caractersticas morfolgicas de las larvas para determinar la especie. Fuentes: Harada U, Mori OA. 1955 A new method for culturing hookworm. Yonago Acta Med 1: 177 179. IV Curso de Metodologa en el Diagnstico de Enteroparsitos Tabla 4.6 Caractersticas de las larvas de Strongyloides stercoralis y Ancylostoma duodenale o Necator americanus Etapa larval S. stercoralis A. duodenale o N. americanus Cavidad bucal corta Cavidad bucal larga (15 m) (4 m) ( eritrocito) Esfago de un tercio de la Esfago de un tercio de la longitud longitud corporal con 2 corporal con 2 ensanchamientos ensanchamientos Rabditiforme o rabditoide Primordio genital grande y notable Primordio genital pequeo (7 m) (22 m) Poro anal a 50 m del extremo Poro anal a 80 m del extremo posterior posterior Tamao 200-500 m x 15-20 m Tamao 200-500 m x 14-20 m Desenvainada Envainada Filariforme Cola bifurcada o roma cola afilada (aguda) Extremo posterior ligeramente agudo Extremo posterior agudo Esfago de un tercio de la Esfago de la mitad de la longitud longitud corporal sin corporal sin ensanchamiento ensanchamiento Cuando existen dos ensanchamientos esofgicos, las larvas se denominan rabditoides
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Figura 4.109 Caractersticas para la identificacin de las larvas de Strongyloides stercoralis y Ancylostoma duodenale o Necator americanus M: boca, O: esfago; GR: rudimento genital; AP: poro anal 4.6 PRUEBA QUMICA PARA SANGRE OCULTA EN MATERIA FECAL (SOMF) Esta prueba se utiliza para el tamizado y la deteccin de infeccin por parsitos, por ejemplo la esquistosomiasis intestinal, o para la deteccin de la hemorragia en el intestino causada por plipos, tumores o inflamacin. Originalmente fue desarrollado utilizando bencidina. Sin embargo, ya no se recomienda el uso de bencidina, ya que se ha demostrado que es cancergena. Nota: Precauciones para el paciente Durante un da entero, antes del examen, el paciente no deber: Comer cualquier tipo de carne; Tomar ningn medicamento que contienen compuestos a base de hierro; Cepillar sus dientes con fuerza. Precauciones de laboratorio Los utensilios de vidrio deben estar limpios (sin residuos de sangre). Se debe observar el resultado antes de que transcurran 5 minutos. Se pueden realizar ensayos testigos: negativos: con agua destilada positivos: con agua que contenga 1% de sangre. 4.6.1 Principio Cuando la hemoglobina de la sangre se pone en contacto con perxido de hidrogeno se libera oxgeno. Este oxgeno liberado reacciona con aminofenazona (aminopirina) y se forma una coloracin azul. 4.6.2 Materiales y reactivos Una centrfuga Tubos cnicos para centrifugacin Aplicadores Una probeta de 20 ml Tubos de ensayo Acido actico al 10% (reactivo No. 2) Perxido de hidrgeno (solucin fresca, de 10 vol.) Etanol al 95% Aminofenazona cristalina. Gradilla Tubo de control positivo (que contiene una solucin al 1% de la sangre en agua) Tubo de control negativo (con agua destilada) Nota: El material de vidrio utilizado para la prueba debe estar limpia, sin rastros de sangre (ver seccin 3.5.1). 4.6.3 Mtodo 1. Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo prepare una solucin de aminofenazona como se indica a continuacin: ponga alrededor de 0,25 g de aminofenazona en el fondo de un tubo de ensayo aada 5 ml de etanol al 95%.
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2. Coloque una porcin de la muestra de heces fecales de 4 ml (4 cm3) aproximadamente en un tubo para centrifugacin. 3. Agregue 7 ml de agua destilada y mzclela completamente (Fig. 4.110). 4. Centrifguese a baja velocidad (1000g) aproximadamente durante 5 minutos, o hasta que se precipiten los slidos (se puede emplear una centrfuga manual). 5. Decante el lquido flotante en otro tubo de ensayo y consrvelo. 6. Aada al tubo de ensayo que contiene el lquido flotante, sin mezclar: 10 gotas de cido actico al 10% 5 ml de la solucin de aminofenazona. Para evitar que se mezclen ponga la solucin de aminofenazona con una pipeta deslizndola por la pared interior del tubo de ensayo. 7. A continuacin agregue: 10 gotas de la solucin de perxido de hidrgeno de 10 vol. No se mezcle. Djela reposar un minuto. Se debe observar el resultado antes de que transcurran 5 minutos luego de la adicin de la solucin de perxido de hidrgeno. 4.6.4 Resultados Reaccin positiva Entre las dos capas de lquido aparece una coloracin azul (Fig. 4.111). Informe los resultados como sigue: azul plido = reaccin positiva + azul oscuro = reaccin positiva intensa ++ azul negruzco = reaccin positiva sumamente intensa +++. Reaccin negativa No ocurre cambio alguno en el color.
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Ilustraciones anexas A, B, C, D, E, F, G. A) Materiales y reactivos. B) Preparacin una solucin de aminofenazona. C) Coloque una porcin de la muestra de heces fecales de 4 m (4 cm3) aproximadamente en un tubo para centrifugacin. Figura 4.110 La mezcla de la muestra de las heces con agua destilada. D) Centrifugar. E) Decante el lquido flotante en otro tubo de ensayo y consrvelo. F) Aada al tubo de ensayo que contiene el lquido flotante, sin mezclar: 10 gotas de cido actico al 10%, 5 ml de la solucin de aminofenazona. Para evitar que se mezclen ponga la solucin de aminofenazona con una pipeta deslizndola por la pared interior del tubo de ensayo. G) Agregue: 10 gotas de la solucin de perxido de hidrgeno de 10 vol. Figura 4.111 Anlisis qumico de la sangre oculta en las heces a: Reaccin positiva; b: reaccin negativa. 4.7 LOS PARSITOS DE LA SANGRE Y DE LA PIEL Los parsitos que pasan toda o parte de su ciclo vital en la sangre o los tejidos se conocen como hemoparsitos. Ellos incluyen: Las especies pertenecientes a los gneros Brugia, Dirofilaria, Loa, Mansonella, Meningonema, Onchocerca y Wuchereria responsable de la filariasis; Trypanosoma spp. responsable de la tripanosomiasis; Plasmodium spp. responsable de la malaria. La infeccin por estos parsitos y Borrelia spp. se puede diagnosticar mediante un examen de las muestras de sangre teidas bajo el microscopio. 4.7.1 FILARIAE Hay muchas especies de filarias, pero la mayora son parsitos de animales y raramente afectan a los seres humanos. Slo ocho especies de filarias se han adaptado a seres humanos, y son transmisibles entre ellos. De stos, el ms importante es subperidica Brugia malayi. Las filarias habitan en el sistema linftico. Las larvas de los gusanos adultos las microfilarias invadir la sangre, y pueden ser identificados en un frotis de sangre. Las microfilarias de Onchocerca volvulus estn normalmente limitadas a la piel (ver ms abajo), pero a veces migran a los ojos (que pueden dar lugar a ceguera), las que tambin se pueden encontrar en la sangre. Las principales manifestaciones clnicas de la filariasis linftica son linfadenopata y linfangitis. Los ataques de linfadenopata que duran varios das se producen a intervalos regulares, con dolor de cabeza, nuseas, tumefaccin de una pierna, abscesos hidrocele y abcesos estriles. En los casos avanzados, la elefantiasis de las extremidades inferiores puede ocurrir debido a la obstruccin de la circulacin linftica. La elefantiasis del escroto, tal como se ve en la filariasis de Bancroft (causada por Wuchereria bancrofti), es poco comn en la filariasis por Brugia (causada por Brugia malayi). Las infecciones en las poblaciones en las regiones donde la filariasis de Bancroft y Brugia son endmicas pueden permanecer asintomticas. Las microfilarias de las siguientes especies se encuentran en la sangre humana: Brugia malayi, Brugia timori, Loa loa, Mansonella perstans1, Mansonella ozzardi y Wuchereria bancrofti. 1Anteriormente conocido como Dipetalonema perstans. Las infecciones por Loa loa entre las poblaciones de las zonas donde es endmica a menudo son asintomticos. Los no residentes que visitan estas reas son susceptibles a la infeccin sintomtica. La infeccin inicial se caracteriza por una tumefaccin transitoria, localizada, subcutnea, conocida como un "tumefaccin de Calabar". Los gusanos adultos pueden migrar a travs de la conjuntiva de los ojos, causando la inflamacin, pero la infeccin no causa ceguera. La infeccin crnica puede llevar a complicaciones como la enfermedad renal, encefalopata y cardiomiopata. Las infecciones con Mansonella perstans generalmente parecen ser asintomticas, pero se han asociado con prurito, dolor abdominal, tumefaccin tipo Calabar y urticaria (vase ms arriba). Las infecciones con Mansonella ozzardi tambin son generalmente asintomticas, pero se han asociado con linfadenopata, prurito, fiebre y dolores en las rodillas y los tobillos. Las microfilarias son transmitidas por mosquitos comunes, moscas y jejenes, que se alimentan de la sangre de los seres humanos infectados. Las microfilarias se desarrollan en larvas que invaden las piezas bucales de los insectos. ONCOCERCOSIS La oncocercosis (ceguera de los ros) es una enfermedad parasitaria causada por el helminto Onchocerca volvulus. Los machos y las hembras de este parsito habitan en los tejidos subcutneos del hombre, apiados en ndulos. Las hembras depositan larvas (microfilarias) que emigran por debajo de la piel. La oncocercosis prevalece en las regiones tropicales de frica y diversas partes de Arabia, Mesoamrica y Sudamrica. La transmite una pequea mosca negra, Simulium. EL EXAMEN DE LA PIEL DE MICROFILARIAS DE ONCHOCERCA VOLVULUS
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Se utiliza una muestra sumamente pequea de la piel del paciente. Para observar las microfilarias, que se encuentran dotadas de gran movilidad, se examinan en una preparacin hmeda, entre un portaobjetos y un cubreobjetos, por medio del microscopio. MATERIALES Y REACTIVOS Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta Pasteur Aguja (para inyeccin intramuscular o subcutnea), de calibre 22 Bistur u hoja de afeitar cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Etanol al 70% Tabla 4.7 Distribucin geogrfica de las filarias Distribucin geogrfica Asia Partes de Indonesia frica occidental y central Amrica del Sur, Central y el Caribe frica Occidental, Amrica del Sur y Central frica tropical, Amrica Central y del Sur, partes de Arabia Endmica en muchos pases tropicales
Especies Brugia malayi Brugia timori Loa loa Mansonella ozzardi Mansonella perstans Onchocerca volvulus Wuchereria bancrofti
MTODO SITIOS DE DONDE SE DEBE OBTENER LA MUESTRA Bsqueda de ndulos (ver Fig. 4.112): a) En pacientes con ndulos Bsquense los ndulos: en el trax (sobre las costillas) (1); en las caderas (2); en las piernas (tibia) (3); en la espalda (sobre los omoplatos) (4). Los ndulos son redondos y duros, de 15 cm de dimetro; cuando se empujan con la yema del dedo se deslizan por debajo de la piel. Tmese la muestra de piel en el centro del ndulo. b) En pacientes que no presenten ndulos: Tmese la muestra de piel de: la parte alta de las posaderas (el rea superior externa, donde se aplican las inyecciones intramusculares, (1 en la Fig. 4.113); Si los resultados del examen son negativos, tmense muestras de: la pantorrilla (rea superior externa), (2 en la Fig. 4.113); la espalda (en el centro de los omoplatos) (3 en la Fig. 4.113); Se recomienda que se examinen 6 muestras (2 de las posaderas, 2 de las pantorrillas y 2 de los omoplatos) antes de notificar un resultado negativo. OBTENCION DE LA MUESTRA a) Preparativos 1. Flamee en etanol el bistur (o la hoja de afeitar) y la aguja. 2. Coloque una gota de solucin de cloruro sdico en un portaobjetos. 3. Desinfecte la piel del rea escogida con un cojincillo de gasa humedecido con etanol. b) Mtodo 1. Con la mano izquierda perfore la piel introduciendo la punta de la aguja hasta una profundidad de 2 3 mm. 2. Estire la piel separndola de los dems tejidos con la punta de la aguja (Fig. 4.114). 3. Con la mano derecha coloque el filo de la hoja del bistur o de la hoja de afeitar sobre la piel estirada, por arriba de la punta de la hoja (vase Fig. 4.115). 4. Corte, con un golpe rpido, la pieza de piel estirada por la punta de la aguja, tan cerca de sta como sea posible (Fig. 4.116). La muestra deber tener aproximadamente este tamao: (2 3 mm) La muestra deber quedar adherida a la punta de la aguja. No deber estar manchada con sangre; en la biopsia no se deber encontrar sangre alguna. 5. Deposite el fragmento de piel en la gota de solucin de cloruro sdico que se encontrar en el portaobjetos (utilizando el bistur o la hoja de afeitar, si es necesario). No aplaste la muestra; si solo hay una microfilaria se puede daar. 6. Proteja la muestra con un cubreobjetos. Si alguna parte de ella no est en contacto con el lquido aada ms solucin introducindola por debajo del cubreobjetos con una pipeta de Pasteur hasta que toda el rea que abarque el cubreobjetos est baada por el lquido. 7. Espere de 23 minutos. Mientras tanto limpie con etanol el rea de donde se ha tomado la muestra. Aplique un apsito adhesivo. Toma de muestras en el campo Si no se dispone de microscopio, o durante los estudios epidemiolgicos masivos: 1. Coloque el trozo de piel en un pequeo frasco que contiene 2 ml de solucin de cloruro de sodio. 2. Espere 15 minutos para que las microfilarias dejen la piel.
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3. Fijar la muestra mediante la adicin de 2 ml de solucin al 10% de formaldehido (Reactivo. N 28). Mezclar y colocar la tapa en el frasco. 4. Cuando regrese al laboratorio, agite bien el envase. Centrifugar el lquido (despus de retirar la pieza de piel) a velocidad media (2000 g) durante 5 minutos. 5. Transferir el depsito del tubo de centrfuga a un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. Examen microscpico Utilice el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador. Examine las orillas de la muestra de piel. Se observarn las microfilarias tratando de salir al lquido de cloruro de sodio (Fig. 4.117). Poseen gran movilidad. Las microfilarias de Onchocerca volvulus tienen las siguientes caractersticas: Longitud: 200315 m Anchura: 5 9 m (la misma de un eritrocito) Curvatura del cuerpo: casi angular Extremo anterior: ligeramente ms ancho Cola: curva y delgada. Cuando la muestra contenga muy escasas microfilarias o si no surgen microfilarias esprese 10 minutos. Si no aparecen las microfilarias vase dentro del fragmento de piel; observando a travs de este se podr ver una microfilaria en movimiento. Si tiene alguna duda, tome una muestra de sangre fresca en el dedo del paciente y preparar un frotis en un portaobjetos. Cubrir con un cubreobjetos y examinarlo bajo el microscopio. Si ve alguna microfilaria, preparar un frotis teido de piel (ver abajo) y un frotis de gota gruesa de sangre teida (vase ms adelante) para identificar la especie. Si las microfilarias estn presentes, sern claramente visibles. La tincin no es necesaria en este caso, ya que las microfilarias se pueden identificar por sus curvas angulares caractersticas. Procedimiento para teir la muestra En un portaobjetos se prepara un frotis macerando la muestra de piel. Se fija por medio de metanol y se tie con colorante de Giemsa (vase ms adelante).Las microfilarias de Onchocerca volvulus poseen las caractersticas siguientes (Fig. 4.118): carecen de envoltura su extremo anterior es ancho las curvas del cuerpo son rgidas la cola se afila gradualmente y termina en una curva sealada contienen grandes ncleos ovales, que se alargan y se tien de negro azulado; se encuentran claramente separados y no llegan hasta la punta de la cola. Otra microfilaria que se puede encontrar en biopsias de piel Mansonella streptocerca causa una dermatitis con picor en la zona infectada. Este helminto, sumamente raro, puede no ser patgeno. Sus microfilarias se encuentran en la piel y difieren de las de Onchocerca volvulus en las siguientes caractersticas (Fig. 4.119): es menos ancha (5 6 m, equivalente a 1/2 eritrocito) es menos larga (180240 m); el extremo anterior no est ensanchado; la cola termina en un gancho romo; los ncleos son ms pequeos y llegan hasta la punta de la cola
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A) Materiales y reactivos. Figura 4.112 Sitios para la recoleccin de muestras de piel mediante hendidura de pacientes con ndulos 1: trax (sobre las costillas); 2: caderas; 3: piernas (tibia); 4: espalda (sobre los omplatos). Figura 4.113 Sitios para la recoleccin de muestras de piel mediante hendidura de los pacientes sin ndulos 1: parte superior de las nalgas; 2: pantorrillas (parte superior externa); 3: espalda (en el centro de los omplatos). B) Flamee en etanol el bistur (o la hoja de afeitar) y la aguja. Coloque una gota de solucin de cloruro sdico en un portaobjetos. C) Con la mano izquierda perfore la piel introduciendo la punta de la aguja hasta una profundidad de 2 3 mm. Figura 4.114 Elevacin de la piel con una aguja. Figura 4.115 Coloque la hoja por encima del punto de la aguja. Figura 4.116 La toma de una muestra de piel mediante hendidura. D) Deposite el fragmento de piel en la gota de solucin de cloruro sdico que se encontrar en el portaobjetos. E) Proteja la muestra con un cubreobjetos. Si alguna parte de ella no est en contacto con el lquido aada ms solucin introducindola por debajo del cubreobjetos con una pipeta de Pasteur hasta que toda el rea que abarque el cubreobjetos est baada por el lquido. F) Espere de 23 minutos. Figura 4.117 Microfilarias de Onchocerca volvulus en preparacin hmeda. Figura 4.118 Microfilarias de Onchocerca volvulus en frotis teido con Giemsa. Figura 4.119 Microfilaria de Mansonella streptocerca en preparacin hmeda. Recoleccin de muestras en el campo
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C D A) Cuando no se disponga de un microscopio o se est llevando a cabo una encuesta epidemiolgica amplia: 1. Coloque la muestra de piel en un pequeo frasco de penicilina que contenga 2 ml de solucin de cloruro sdico. 2. Espere 15 minutos a que las microfilarias salgan de la muestra de piel. B) Cuando hayan transcurrido los 15 minutos fije la preparacin aadiendo 2 ml de solucin de formaldehido al 10%. Mezcle y cambie el tapn del frasco. Esta preparacin se puede conservar durante varios meses. C) Al volver al laboratorio agite bien el frasco. Centrifugue el liquido (despus de haber sacado de ste la muestra de piel) a velocidad media (o utilice una centrfuga manual). D) Examine con el microscopio el sedimento que se haya formado en el tubo para centrifugacin, entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Las microfilarias muertas son claramente visibles sin tincin, con sus curvas angulosas caractersticas. PROCEDIMIENTOS RECOMENDADOS PARA LA DETECCIN E IDENTIFICACIN DE MICROFILARIAS EN LA
SANGRE
Las microfilarias de algunas especies (por ejemplo, Loa loa) y la cepa ms comn de Brugia malayi aparece en la sangre con una periodicidad nocturna o diurna notable (Tabla 4.8). Otras especies y cepas de B. malayi no muestran el mismo grado de periodicidad, son subperidicas nocturnas o subperidicas diurnas (por ejemplo Wuchereria bancrofti). Otras especies no muestran periodicidad (por ejemplo, Mansonella ozzardi). Los tiempos para la recogida de muestras de sangre deben ser seleccionados de acuerdo con los sntomas clnicos del paciente y el historial de viajes. La Tabla 4.9 muestra los tiempos recomendados para la recogida de muestras de sangre para la prueba de las especies peridicas y subperidicas de microfilarias. Nota: A pesar que las microfilarias no son directamente infecciosas para los seres humanos, todos los especmenes patolgicos deben ser tratados como potencialmente peligrosos. Un mnimo de un espcimen de "sangre de da" (tomado alrededor de las 13:00) y una muestra de "sangre de noche" (tomada alrededor de las 24:00) deben ser examinados. Esto suele ser suficiente para detectar infecciones e infecciones mixtas con cepas subperidicas. Una muestra de sangre para microfilarias se examina mejor inmediatamente. Si una muestra de "sangre de noche" no ser examinada hasta la maana siguiente, djela a temperatura ambiente. Para cada muestra, recoger 510 ml de sangre en una solucin de 2% de citrato trisdico en solucin salina (reactivo. 59) o heparina como anticoagulante. Las muestras directas por puncin digital pueden dar resultados adecuados en las zonas donde la filariasis es endmica. EL EXAMEN MICROSCPICO DE LA SANGRE CAPILAR Este examen se debe llevar a cabo a la hora que resulta ms conveniente. Algunas especies de microfilarias solo aparecen en la sangre durante la noche y otras lo hacen en el da. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Lancetas para extraer sangre Hisopos de algodn cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Etanol al 70%. Mtodo 1. Desinfecte con etanol el dedo que se va a puncionar. Escoja el dedo cordial. Squese completamente. Puncione con la lanceta. 2. Recoja la primera gota de sangre (contiene ms microfilarias) directamente en la porcin media del portaobjetos (Fig. 4.120). 3. Aada una gota igual de solucin de cloruro sdico. 4. Mezcle la sangre y la solucin de cloruro sdico con la esquina de un cubreobjetos. Coloque este sobre la preparacin. 5. En otro portaobjetos prepare dos gotas gruesas de sangre empleando otras 2 gotas ms de sangre que servirn para identificar as microfilarias teidas. Examine en el microscopio el frotis fresco, de manera ordenada y minuciosa (usando el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador). El primer indicio de la presencia de microfilarias es un rpido movimiento entre los glbulos rojos.
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6. Para identificar las especies de microfilarias, preparar dos frotis en otro portaobjetos con dos gotas ms de sangre y talos como se indica ms adelante.
Tabla 4.8 Caractersticas de los parsitos de filarias humanas comunes

Caractersticas Distribucin geogrfica Vectores B. malayi Asia sudoriental, India Subcontinente indio Mosquitos (Anopheles y Mansonia spp.) B. timori Islas,Lesser Sunda Timor Mosquitos (Anopheles spp.) L. loa frica Central y Occidental M. ozzardi Amrica del Sur, Centrall y el Caribe M. perstans frica Central y Occidental, Suramrica M. streptocerca frica Central y Occidental O. volvulus frica, Amrica Central y del Sur Moscas negras (Simulium spp.) W. bancrofti Pases Tropicales y Subtropicales Mosquitos (Culex, Aedes, Anopheles y Mansonia spp.) Sistema linftico Sangre Nocturnab
4. Parasitology
Tbanos jejenes penetrantes jejenes penetrantes jejenes penetrantes (Chrysops spp.) (Culicoides spp.) (Culicoides (Culicoides spp.) y moscas negras spp.) (Simulium spp.) Tejidos subcutneos Tejidos subcutneos Mesenterio rbita Sangre Diurna Sangre Aperidica Sangre Aperidica Dermis Piel NA
Hbitat Adultos Microlarias Periodicidad de microfilarias Sistema linftico Sangre Nocturnaa Sistema linftico Sangre Nocturna Tejidos subcutneos Piel NA
Morfologa de las microfilarias

Vaina Longitud (mm) Presente 175230 en frotis; 240300 en 2% formalina 5.06.0 Ahusada; ncleo subterminal y terminal ampliamente separado Espacio de cabeza larga; vaina tie rosada en Giemsa; ncleo terminal y subterminal Presente 265325 en frotis; 330385 en 2% formalina 4.46.8 Presente 230250 en frotis; 270300 en 2% formalina 5.07.0 Ausente 160205 en frotis; 205250 en 2% formalina 3.05.0 Largo, delgado, puntiaguda; anucleada Ausente 190200 en frotis; 180225 en 2% formalina 4.05.0 Ausente 180240 en cortes de piel Ausente 300315 en cortes de piel Presente 240300 en frotis; 275320 en 2% formalina 7.510.0
Ancho (mm) Cola
5.06.0
5.09.0
Ahusada; Ahusada; ncleo ncleo subterminal irregularmente y terminal espaciado ampliamente separado
claramente claramente redondeado, Normalmente flexionada; Cnica; anucleada redondeado doblada en forma de gancho; cnica en punta; ncleo al final ncleo al final anucleada forma delgada; cola doblada; cola de gancho llenada ocurre en la piel y con ncleo; de vez en cuando en ocurre en la piel orina o sangre despus del tratamiento Espacio de cabeza corto; vaina no se tie en Giemsa; cuerpo en curvas suaves; ncleos dispersos
Caractersticas principales
Tamao pequeo, Espacio de cabeza larga; Vaina Tamao pequeo; de cola larga y delgada; cola roma y llena vaina no se tie no se tie en en Giemsa; ncleo Giemsa; una hilera aperiodica con ncleo; terminal y de ncleos al final aperiodica de la cola subterminal
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a b
Subperidica nocturna en Indonesia, Malasia, partes de las Filipinas y Tailandia. Subperidica diurna en Nueva Caledonia y la Polinesia; subperidica nocturna en zonas rurales de Tailandia.
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A) Desinfecte con etanol el dedo que se va a puncionar, use una lanceta. Figura 4.120 La toma de una muestra de sangre capilar (primera gota). B) Aada una gota igual de solucin de cloruro sdico. C) Mezcle la sangre y la solucin de cloruro sdico con la esquina de un cubreobjetos. Coloque este sobre la preparacin. D) En otro portaobjetos prepare dos gotas gruesas de sangre. Examine en el microscopio el frotis fresco, de manera ordenada y minuciosa (usando el objetivo x 10 con escasa abertura del condensador). El primer indicio de la presencia de microfilarias es un rpido movimiento entre los glbulos rojos. Figura 4.121 Una microfilaria patgena. Longitud: 250-300 m; espesor: 6-8 m (dimetro de un eritrocito). Por ejemplo Wuchereria bancrofti, Loa loa, Brugia malayi. Figura 4.122 Una microfilaria de patogenicidad dudosa. Longitud: cerca de 150 m; espesor: aproximadamente 4 m (mitad del dimetro de un eritrocito). Por ejemplo Mansonella ozzardi, M. perstans. Microfilarias en frotis de sangre frescos Las microfilarias se identifican en frotis de sangre teidos. Sin embargo, en los frotis frescos se pueden obtener algunos datos acerca de la especie observada y de su capacidad patgena (figs. 4.121 y 4.122). La tincin se requiere generalmente para identificar microfilarias en frotis de sangre. Es posible, sin embargo, para obtener una indicacin de las especies vistas y su patogenicidad de un frotis en fresco. Tabla 4.9 Tiempos recomendados para la recogida de muestras de sangre para pruebas de microfilarias Especiesa Tiempo de recogida recomendado Peridico (nocturna) 23:00-01:00 (pico 24:00) Peridico (diurna) 12:00-14:00 (pico 13:00) Subperidica (nocturna) 20:00-22:00 (pico 21:00) Subperidica (diurna) 15:00-17:00 (pico 16:00)
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Aperidica cualquier momento (da o noche) Tabla 4.8 Examen microscpico de la sangre venosa concentrada por centrifugacin Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Jeringas (5 ml o 10 ml) Agujas para puncin venosa Centrfuga o centrfuga para microhematocrito Tubos de centrfuga cnicos o tubos capilares microhematocrito Plastilina plstica Cinta adhesiva Anticoagulante: citrato sdico, solucin al 2% en solucin salina (reactivo no. 59) Solucin de formalina al 2% (preparada diluyendo solucin de formaldehdo al 37% 1/50 con agua destilada) o saponina, solucin al 1% (reactivo no. 48) ter Etanol al 70%. Mtodo 1. Recoger 4 ml de sangre venosa. Expulsar en una botella que contiene 1 ml de solucin de citrato trisdico. Mezclar. 2. Medir en un tubo de centrfuga cnico de 10 ml de solucin de 2% de formaldehdo. Aadir 1 ml de sangre con citrato. Mezclar. Espere 5 minutos para que se produzca la lisis de los eritrocitos. 3. Centrifugar durante 5 minutos a 10 000 g. Vierta el lquido sobrenadante. Toque (golpee ligeramente) el tubo para mezclar el depsito. 4. Coloque una gota del depsito en un portaobjetos. Extienda la gota para formar una capa delgada y deje secar al aire. 5. Fijar el frotis utilizando una mezcla 1:1 de etanol y ter. Dejar secar durante 2 minutos, a continuacin, colorear inmediatamente (como se describe ms adelante) para identificar las especies de microfilarias. Mtodo alternativo utilizando una centrfuga de microhematocrito 1. Recoger 4 ml de sangre venosa. Expulsar en una botella que contiene 1 ml de solucin de citrato trisdico. Mezclar. 2. Llenar un tubo capilar de microhematocrito en unas tres cuartas partes con la sangre con citrato. Sellar un extremo del tubo con la arcilla de modelado plstico o por calentamiento. 3. Se centrifuga en una centrfuga de microhematocrito a 10 000 g durante 2 minutos. 4. Colocar el tubo capilar en un portaobjetos y fijar los dos extremos con cinta adhesiva. 5. Examine la lnea divisoria entre las clulas de la sangre y el plasma bajo el microscopio (Fig. 4.123), con el objetivo x10 con la apertura del condensador reducida. Las microfilarias mviles se vern en la parte inferior de la columna de plasma, justo por encima de la capa de leucocitos y eritrocitos (Fig. 4.124). El tubo se puede encajar en la parte inferior de la columna de plasma (vase la fig. 4.124). Utilice la primera gota de cada pieza del tubo roto para preparar una pelcula espesa. Teir la pelcula como se describe ms adelante para identificar la especie. La sangre capilar tambin puede ser examinada por este mtodo. Recoger dos gotas de sangre capilar del dedo sobre un porta y se mezcla con una gota de solucin de citrato trisdico 2%.
aVase
Figura 4.123 Examinando el tubo capilar de microhematocrito bajo el microscopio. Figura 4.124 Movilidad de las microfilarias. Se observarn microfilarias mviles en el fondo de la columna de plasma, inmediatamente arriba de la capa de leucocitos. E: eritrocitos; L: leucocitos; P: plasma. Mtodo alternativo utilizando solucin lisante de saponina
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1. Aadir 10 ml de sangre con citrato (vase ms arriba) a 10 ml de solucin lisante de saponina. 2. Mezclar la sangre con cuidado y dejar actuar durante 15 minutos para permitir la lisis de los eritrocitos. 3. Centrifugar a 2000g por 15 minutos. 4. Eliminar el sobrenadante con una pipeta y desecharlo en un recipiente con desinfectante. 5. Transferir el depsito a un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. 6. Examinar la totalidad del depsito para ver las microfilarias mviles con el objetivo x10. (Las microfilarias seguirn siendo mviles en una muestra examinada de "sangre nocturna" a la maana siguiente.) 7. Cuente el nmero de microfilarias en la preparacin y dividir por 10 para obtener el nmero de microfilarias por ml de sangre. Se requiere una experiencia considerable para identificar microfilarias sin teir. Se recomienda que la identificacin se lleve a cabo en preparaciones teidas (ver ms adelante en tinciones). El examen microscpico de sangre venosa concentrada por filtracin Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos jeringa, 15 ml Soporte del filtro de tipo Swinnex Filtro de membrana de policarbonato (25 mm de dimetro, tamao de poro 5 m)1 Almohadillas de filtros de papel (25 mm de dimetro) Plato llano, 15 ml, con tapa Pinzas romas Cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Metanol absoluto Agua destilada. 1En zonas endmicas de Mansonella perstans, se debe utilizar un filtro de membrana con un tamao de poro de 3 m. Mtodo 1. Extraiga 10 ml de agua destilada en una jeringa. 2. Extraiga 1 ml de sangre fresca o de sangre con citrato en la jeringa (Fig. 4.125). Gire suavemente para mezclar el contenido. Espere 23 minutos, para la lisis de los eritrocitos. 3. Humedezca la almohadilla de papel de filtro con unas gotas de agua destilada y cubrir con el filtro de membrana. Coloque el filtro en el soporte del filtro. 4. Conecte la jeringa al soporte del filtro. Empuje suavemente la sangre a travs del filtro dentro del plato que contiene una solucin desinfectante (Fig. 4.126). 5. Retire la jeringa del soporte del filtro (teniendo cuidado de no perturbar el filtro) y extraiga 10 ml de agua destilada. 6. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje suavemente el agua a travs del filtro dentro del plato que contiene la solucin desinfectante, para eliminar los restos del filtro (Fig. 4.127). 7. Retire la jeringa del soporte del filtro y extraiga aproximadamente 5 ml de aire. 8. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el aire a travs del filtro sobre el plato con desinfectante, para eliminar el exceso de agua del filtro. Deseche la solucin desinfectante en un fregadero. 9. Retire la jeringa del soporte del filtro. Desmonte el soporte del filtro y retire el filtro de membrana con las pinzas. 10. Coloque el filtro, con la parte superior de la membrana hacia arriba, en un portaobjetos. Aadir una gota de solucin de cloruro de sodio y cubrir con un cubreobjetos. 11. Examine toda la membrana para buscar microfilarias mviles, utilizando el objetivo x10. (Las microfilarias seguir siendo mviles en una muestra examinada de "sangre nocturna" a la maana siguiente. 12. Cuente el nmero de microfilarias en la preparacin y se divide por 10 para obtener el nmero aproximado de microfilarias por ml de sangre. Se requiere una experiencia considerable para identificar microfilarias sin teir. Se recomienda que la identificacin se lleve a cabo en preparaciones teidas (ver ms abajo). Para realizar una preparacin teida, siga el mtodo descrito anteriormente, con las siguientes modificaciones: 8. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el aire a travs del filtro sobre el plato con desinfectante, para eliminar el exceso de agua del filtro. 9. Retire la jeringa del soporte del filtro y extraiga aproximadamente 7 ml de aire y 3 ml de metanol. 10. Vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y empuje el metanol y el aire a travs del filtro sobre el plato con desinfectante, para fijar las microfilarias y eliminar el exceso de metanol del filtro, respectivamente. 11. Retire la jeringa del soporte del filtro. Desmonte el soporte del filtro y retire el filtro de membrana con las pinzas. 12. Coloque el filtro, con la parte superior de la membrana hacia arriba, en un portaobjetos. Deje que se seque al aire. 13. Teir con Giemsa como para gota gruesa (ver ms adelante) y examinar toda la membrana del filtro con el objetivo x10.
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Figura 4.125 Extraccin de sangre con citrato en una jeringa Figura 4.126 Filtrado de la muestra de sangre Figura 4.127 Enjuague del filtro Tcnica para tincin de microfilarias Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Giemsa (reactivo. N 29) Colorante hematoxilina de Delafield (reactivo. N 19) Metanol Agua tamponada (reactivo no. 15). Mtodo 1. Preparar un frotis de gota gruesa del depsito como se describe ms adelante. Permitir que el frotis se seque al aire. 2. Fijar en metanol durante 1 minuto. 3. Teir con tincin de Giemsa (diluido 1 en 20 con agua tamponada, pH 6,8) durante 30 minutos.
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4. Examine la preparacin en el microscopio con el objetivo x10. Si es difcil distinguir los ncleos de las microfilarias, devuelva el portaobjetos a la solucin de tincin de Giemsa durante otros 510 segundos. 5. Teir con Colorante hematoxilina de Delafield (diluido 1 en 10 con agua tamponada, pH 6,8) durante 5 minutos. Lave en agua tamponada, pH 6,8. (Se requiere este segundo colorante porque el Giemsa solo no tie la cubierta (o vaina) de Loa loa muy bien.) 6. Examine la preparacin en el microscopio. Utilice el objetivo x10 primero para localizar las microfilarias y luego identificar las especies de filarias utilizando los objetivos x40 y x100. Resultados Bajo el microscopio de luz las microfilarias aparecen (tras la tincin adecuada) como organismos primitivos, en forma de serpentina, a menudo envueltos con una cubierta y llenos de ncleos de muchas clulas (Fig. 4.128). No todas las especies tienen una vaina. En las que lo hacen, la cubierta se puede extender a una distancia corta o larga ms all de cualquier extremidad. En algunas especies, en funcin del colorante que se utiliza, la vaina muestra una calidad de tincin nica que ayuda en la identificacin de las especies. Los ncleos de las clulas que llenan el cuerpo suelen estar oscuramente teidas y pueden estar juntos y muy aglomerados o dispersos (ver Fig. 4.128). La extremidad anterior est caractersticamente desprovista de ncleos y se llama espacio ceflico o cabeza, ya que puede ser corto o largo. Al mirar desde la parte anterior al extremo posterior del cuerpo se vern espacios y las clulas que sirven como puntos de referencia anatmicos adicionales. Estos incluyen el anillo nervioso, poro excretor, clula excretora y poro anal. En algunas especies puede ser vista una masa amorfa llamada cuerpo interior y cuatro clulas pequeas (conocidas como clulas rectales). Algunas de estas estructuras y sus posiciones son tiles en la identificacin de la especie. Otras caractersticas tiles incluyen la forma de la cola y la presencia o ausencia de ncleos dentro de ella. La Tabla 4.8 resume las caractersticas de los parsitos filarias humanos comunes que se utilizan para su identificacin. Nota: A veces las microfilarias de la cepa peridica de Brugia malayi pierden su envoltura. La identificacin de especies puede ser difcil y se cometen errores con frecuencia. Las directrices para la identificacin de microfilarias dada anteriormente y los que aparecen en la mayora de los libros de texto hacen que la identificacin parezca engaosamente simple. A veces es difcil ver la vaina. En otras ocasiones, los ncleos no aparecen en su posicin caracterstica en la punta de la cola. Es una buena prctica para examinar varios microfilarias cuidadosamente, antes de decidir sobre su especie. Si un estudio sistemtico est hecho de todas las caractersticas mencionadas anteriormente, debe ser posible identificar con certeza las especies observadas. La identificacin no se debe basar en una sola caracterstica, pero si en todas las caractersticas tomadas en conjunto.
Fig.Fig. 4.128 14. M icrofilarias que ap arec en en el ser hum ano
E s p a c io c e f lic o
p o r o an al
sin cubierta
PARASITOS SANGUINEOS
CD CO
i
en la sangre en la piel
con cubierta
sin cubierta
sin cubierta
I
los ncleos llegan hasta el extremo caudal
----------- ----------- 1 I ---------- ---------- 1 I----------------------- 1

los ncleos llegan al extremo caudal, cola achatada los ncleos no llegan al extremo caudal, filaras pequeas, finas los ncleos llegan al extremo caudal, filaras pequeas, finas, cola ganchuda los ncleos no llegan al extremo caudal, filara gruesa
I--------- -------------- 1
cola engrosada con dos cola uniforme, ncleos bien diferenciados, espacio ceflico tan espacio ceflico dos veces largo como ancho ms largo que ancho
los ncleos no llegan al extremo caudal, espacio ceflico tan largo como ancho
W uchereria bancrofti
M ansonella perstan s
M ansonella ozzardi
Onchocerca volvulus
WHO 91553
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Posibles causas de error en la identificacin 1. Cola Cola rota o doblada. Si la cola de Wuchereria bancrofti se encuentra rota o enrollada (Fig. 4.129), parecer que los ncleos llegan hasta la punta, como los de Loa loa. 2. La envoltura Envoltura rota o incolora. A veces la envoltura se ha roto o es casi incolora. Por ejemplo, en Loa loa solo se observa como un espacio incoloro entre la cola y las clulas de la sangre. 3. El tamao Microfilarias inusualmente grandes o pequeas. Algunos especmenes de Mansonella perstans son sumamente largos (por ejemplo, 200 m), y algunos de Wuchereria bancrofti y Loa loa son pequeos (por ejemplo, 250 m). 4. Las curvas Frotis mal realizados. Si se daan durante la preparacin del frotis de sangre Wuchereria bancrofti puede aparecer retorcida y Loa loa sufrir una disminucin en el nmero de curvas. 5. La distribucin geogrfica Origen geogrfico del paciente. Tenga en cuenta invariablemente del lugar de donde proviene el paciente o cuales pases visit recientemente. Si el paciente es de: la cuenca del ro Zaire, Nigeria Oriental, Camern o de la Repblica Democrtica del Congo (de la cuenca del ro), es probable que el parsito sea Loa loa; Senegal, Ghana, las Antillas Menores o la India, es probable que sea Wuchereria bancrofti; Tailandia, el parsito puede ser Brugia malayi; Guyana, puede ser Mansonella ozzardi. 6. Extensiones sanguneas El examen de las extensiones delgadas. No se recomienda intentar la identificacin de las microfilarias en extensiones sanguneas teidas; los parsitos se suelen encoger y deformar, de modo que es difcil reconocerlos.
Figura 4.129 Posible causa del error en la identificacin de Wuchereria bancrofti: Cola rota o doblada
PARSITOS DEL PALUDISMO 4.7.2 Plasmodium spp. El paludismo, el cual es causado por la infeccin con protozoos del gnero Plasmodium, es la enfermedad parasitaria ms importante en los pases tropicales. Se transmite a los humanos a travs de la inoculacin de esporozoitos de Plasmodium por la hembra del mosquito Anopheles o por transfusin sangunea. Los esporozoitos viajan a travs de la sangre hacia el hgado, donde se transforman en grandes esquizontes tisulares que contienen un nmero considerable de merozoitos (esquizogonia en el tejido). Estos comienzan a la ruptura despus de 520 das, segn la especie, y los merozoitos liberados invaden los eritrocitos circulantes. El ciclo de replicacin se repite a intervalos regulares. Sntomas clnicos Los primeros sntomas clnicos de la infeccin son fiebre leve, dolor de cabeza, dolores musculares y malestar general. Estos sntomas a menudo son mal interpretados como el resultado de una infeccin viral de la influenza. Los sntomas de parecidos a los de influenza son seguidos por ataques recurrentes y peridicos de fiebre alta y escalofros. Si altas temperaturas se acompaan de trastornos mentales caracterizados por alucinaciones y excitacin cerebral, esto puede indicar el paludismo cerebral, el cual es a menudo fatal. En las zonas donde el paludismo es endmico y donde la poblacin ha desarrollado una inmunidad parcial a la enfermedad, los sntomas clnicos pueden ser ms moderados. Especies de Plasmodium infecciosas para los seres humanos Hay cuatro especies diferentes de Plasmodium infeccioso para los seres humanos. Estos son P. falciparum, P. malariae, P. ovale y P. vivax. La distribucin geogrfica de estas especies se resume en la Tabla 4.10. Tabla 4.10 Distribucin geogrfica de Plasmodium spp. infecciosos para los seres humanos Pas o zona P. falciparum P. malariae P. ovale P. vivax frica Central Predominante Raro Raro Raro frica del Este Predominante Raro Raro Comn frica del Norte Muy raro Muy raro Ausente Predominante frica Occidental Predominante Raro Raro Muy raro Amrica Central Comn Raro Ausente Predominante
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Amrica del Sur Suroeste de Asia y Asia Central Sudeste de Europa Subcontinente indio Indochina Indonesia Madagascar, Ocano ndico Islas del Pacfico
Comn Comn Muy raro Comn Predominante Predominante Predominante Predominante
Comn Comn Muy raro Raro Raro Muy raro Raro Muy raro
Ausente Ausente Ausente Muy raro Raro Muy raro Raro Raro
Predominante Predominante Predominante Predominante Comn Comn Comn Comn
Identificacin de Plasmodium spp. en el frotis de sangre Los parsitos del paludismo suelen detectarse en frotis de sangre teidos con coloracin de Field o de Giemsa. Ellos tambin pueden ser detectados utilizando un procedimiento inmunolgico conocido como una prueba con tira reactiva (vase la seccin 11.9). Es importante para el pronstico y el tratamiento de la enfermedad que las especies implicadas sean identificadas en el laboratorio. Si usted no puede identificar la especie, siempre informe la presencia de parsitos del paludismo que se ven. No confunda a los trombocitos que se superponen sobre los eritrocitos con parsitos del paludismo. Esto puede constituir una causa de error frecuente. PREPARACIN DE LAS EXTENSIONES SANGUNEAS 1. Cuando se debe obtener la muestra Por lo general los parsitos son ms numerosos en la sangre al final de un ataque de fiebre. La recoleccin de sangre se debe hacer invariablemente antes que se administren medicamentos antipaldicos. 2. Para pacientes individuales Prepare: 1 portaobjetos con una extensin sangunea en que se efecte el examen minucioso por especies si se requiere, y 1 portaobjetos con una gota gruesa para la deteccin de los parsitos. 3. Para encuestas Prepare: solo 1 portaobjetos por cada individuo con una gota gruesa y una extensin sangunea en el mismo portaobjetos. 4. Conservacin de los frotis No se recomienda conservar los frotis sin tincin durante ms de 4 das. La coloracin de Field se recomienda para los frotis que se deben teir inmediatamente y la de Giemsa para los que se teirn algunos das despus
B A A) Preparacin de dos portaobjetos para pacientes individuales. En uno de ellos se realiza una extensin fina para luego teirla convenientemente y realizar en esta extensin un examen minucioso por especies. En el otro portaobjeto, se realiza una gota gruesa para la deteccin de los parsitos paldicos. B) Preparacin de un solo portaobjetos para cada paciente, donde en ste portaobjeto se realiza la extensin sangunea y la gota gruesa, como se observa en la figura. Se realiza, por lo general, en estudios de encuestas, por cuestiones de operatividad y practicidad. Preparacin de una gota gruesa y una extensin fina de sangre en el mismo portaobjeto Para la microscopa de rutina del paludismo, una extensin fina y una gruesa se hacen en el mismo portaobjetos. La extensin gruesa (gota gruesa) se utiliza para la deteccin de parsitos, mientras que la extensin fina se utiliza en la identificacin de la especie de parsito. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos de vidrio limpios (vase la seccin 3.5.1) Lancetas estriles Algodn Lpiz graso Metanol Etanol al 70% Mtodo La sangre a ser examinada para los parsitos del paludismo es usualmente recogida en un centro de salud.
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El tiempo ms adecuado para la recogida est en el pico de un episodio de fiebre, cuando los parsitos son ms numerosos en la sangre. Los especmenes de sangre siempre deberan ser recolectados antes que se administren las drogas antipaldicas. 1. Con la palma de la mano izquierda del paciente hacia arriba, seleccionar el tercer o cuarto dedo. (El dedo gordo del pie puede ser usado con bebs. El pulgar nunca debera ser usado con adultos o nios.) Use algodn absorbente ligeramente embebido en etanol para limpiar el dedo apretando y sacudiendo con golpes firmes para remover la suciedad y la grasa de la yema del dedo (Fig. 4.130). Seque el dedo con un pedazo limpio de algodn absorbente. 2. Con una lanceta estril, pinche la yema del dedo (Fig. 4.131), usando una accin de balanceo rpida. Aplicando una presin suave en el dedo, exprima la primera gota de sangre y squela con el algodn seco. Asegrese que ningn hilo del algodn permanezca en el dedo. 3. Trabajando rpidamente y manejando los portaobjetos limpios slo por los bordes, recoja la sangre como sigue: Aplique una presin suave sobre el dedo y recoja una sola y pequea gota de sangre, aproximadamente de este tamao , sobre el medio del portaobjeto. Esto es para la extensin fina. Aplique una presin adicional para sacar ms sangre y recoger dos o tres gotas ms grandes, aproximadamente de este tamao , sobre el portaobjeto cerca de 1 cm de distancia de la gota sacada para la extensin fina (ver Fig. 4.132). Limpie la sangre restante con el algodn. 4. Extensin fina. La utilizacin de otro portaobjeto limpio como una "extensor", y con el portaobjeto con las gotas de sangre apoyado en una superficie firme y plana, toque la pequea gota con el extensor y permita que la sangre se extienda a lo largo de su borde. Firmemente empuje el extensor a lo largo del portaobjeto, lejos de las gotas ms grandes, manteniendo el extensor en un ngulo de 45 (Fig. 4.133). Asegrese que el extensor est en contacto con la superficie del portaobjeto todo el tiempo en que la sangre est siendo extendida. De esta manera saldr bien el extendido. 5. Gota gruesa. Siempre maneje los portaobjetos por los bordes, o por una esquina, para hacer la gota gruesa como sigue: Usando la esquina del extensor, rpidamente junte las gotas ms grandes de sangre y extindalas para hacer una gota gruesa mayor (cada vez ms para hacer una gota mayor) (Fig. 4.134). 6. Permita que la gota gruesa se seque en posicin horizontal en un lugar plano protegida de moscas, polvo y calor extremo. Etiquete el extendido seco con un lpiz graso escribiendo a travs de la parte ms gruesa de la extensin fina el nombre del paciente o nmero y fecha (como se muestra en la Fig. 4.135).
Figura 4.130 Limpiando el dedo antes de recoger una muestra de sangre capilar. Figura 4.131 Usando una lanceta para pinchar la yema del dedo.
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Figura 4.132 Recogiendo la muestra de sangre. Figura 4.133 Preparando una extensin de sangre fina. Figura 4.134 Preparando la gota gruesa. Figura 4.135 Etiquetando el extendido. Tincin de los extendidos sanguneos con el colorante de Giemsa Principio Durante la coloracin de la extensin de sangre, la hemoglobina en los hemates se disuelve (deshemoglobinizacin) y es quitada por el agua en la solucin de tincin. Todo lo que permanece son los parsitos y los leucocitos, que pueden ser vistos bajo el microscopio. Materiales y reactivos Microscopio Probetas de 10, 50 y 100 ml Vasos de precipitados de 50 y 250 ml Cubetas para tincin Varillas de vidrio Pisetas o frascos lavadores Pinzas para portaobjetos Soportes deslizantes para portaobjetos (Bastidores deslizantes) Temporizador Colorante de Giemsa (reactivo nm. 29) Metanol en un gotero Agua tamponada, pH 7.2 (reactivo nm. 15) o agua destilada. Mtodo de rutina para teir extensiones sanguneas finas y gota gruesa de sangre Idealmente, para una tincin ptima, la extensin fina y la gota gruesa deberan ser realizadas en portaobjetos separados. Esto a menudo no es posible y el extendido fino y la gota gruesa son generalmente realizados en el mismo portaobjetos. Cuando se procede as, la coloracin de buena calidad de la gota gruesa tiene la importancia primaria. Los mejores resultados se obtienen si los frotis de sangre se han secado durante la noche. Este mtodo es conveniente para teir 20 o ms portaobjetos. 1. Fijar la extensin fina mediante la adicin de tres gotas de metanol, o por inmersin en un recipiente de metanol durante unos pocos segundos. Con la fijacin prolongada puede ser difcil detectar puntos de Schffner y hendiduras de Maurer. Para permitir la deshemoglobinizacin, la gota gruesa no debe fijarse, por lo tanto evitar la exposicin de la gota gruesa a metanol o a vapor de metanol. 2. Con unas pinzas, coloque los portaobjetos espalda con espalda en una cubeta de tincin (Fig. 4.136). 3. Preparar una solucin de Giemsa al 3% en agua tamponada o destilada, pH 7,2, en cantidad suficiente para llenar el nmero de cubetas de tincin a ser utilizadas. Mezclar bien el colorante. 4. Vierta el colorante suavemente en la cubeta de tincin, hasta que todos los portaobjetos estn totalmente cubiertos. Colorear durante 3045 minutos fuera de la luz solar.
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5. Vierta agua limpia suavemente en la cubeta para eliminar el depsito en la superficie de la solucin de tincin (Fig. 4.137). 6. Verter suavemente el colorante restante (Fig. 4.138), y aclarar de nuevo con agua limpia durante unos segundos. Vierta el agua. En algunos laboratorios con suministros limitados se vuelve a utilizar la tincin de Giemsa diluida; en tales casos, debe ser utilizado en el mismo da. 7. Usando pinzas, remueva los portaobjetos de uno en uno. Colquelos en un soporte para portaobjetos deslizante para drenar y secar, con el lado de la extensin hacia abajo, asegurndose que la extensin no toque la parrilla deslizante para portaobjetos.
Figura 4.136 Colocar los portaobjetos en una cubeta de tincin Figura 4.137 Verter agua limpia en la pila de tincin para eliminar el depsito Figura 4.138 Volcar el colorante restante en un fregadero Mtodo rpido para la tincin de gota gruesa y extendido fino Este mtodo es adecuado para la tincin rpida de gotas gruesas cuando se requieren resultados urgentes. Utiliza mucho ms colorante que el mtodo regular. 1. Permita que la gota gruesa se seque por completo, y si los resultados se necesitan con urgencia, el secado puede ser acelerado por ventilacin (agitar al aire) o exposicin breve del portaobjeto a fuego lento, como tambin al calor proveniente de una lmpara de microscopio. Se debe tener cuidado para evitar el sobrecalentamiento, de lo contrario la gota gruesa se fijar con el calor. 2. Fijar la extensin fina mediante la adicin de tres gotas de metanol, o por inmersin en un recipiente de metanol durante unos pocos segundos. Para permitir la deshemoglobinizacin, la gota gruesa no debe fijarse, por lo tanto evitar la exposicin de la gota gruesa a metanol o vapor de metanol. 3. Preparar una solucin de Giemsa al 10% en agua tamponada o destilada, pH 7,2; si se utiliza una pequea cantidad, tres gotas de colorante por ml de agua tamponada darn la concentracin correcta de solucin de Giemsa. Un frotis requiere de unos 3 ml de colorante fabricado. Mezclar bien la tincin con una varilla de vidrio. 4. Vierta suavemente el colorante en los portaobjetos o usar una pipeta. Teir durante 510 minutos. 5. Enjuague suavemente la tincin de los portaobjetos mediante la adicin de gotas de agua limpia. No incline la tincin; y luego lavar, ya que le dejarn un depsito de basura en los frotis. 6. Colocar los portaobjetos en el soporte deslizante para portaobjetos para drenar y secar, con el lado de la extensin hacia abajo, asegurndose que la extensin no toque el soporte deslizante para portaobjetos.
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En gota gruesa Los glbulos rojos casi han desaparecido. Las manchas rosceas de Schffner an se pueden observar alrededor del parsito. Los leucocitos se conservan sin modificaciones.
GLOBULOS ROJOS INFECTADOS En extensiones sanguneas: Los glbulos rojos infectados pueden no sufrir modificacin alguna, o bien pueden cambiar de color o forma, o contener puntos rosceos (manchas de Schffner). Tincin del frotis de sangre con el colorante de Field La tincin con el colorante de Field permite la rpida deteccin de parsitos del paludismo (pero no siempre tie el moteado de Schffner). Materiales y reactivos Microscopio Frascos de vidrio Soporte deslizante para portaobjetos Metanol Colorante de Field (reactivo no. 25) Agua tamponada, pH 7,2 (reactivo no. 15). Mtodo para la tincin de la gota gruesa 1. Sumergir la extensin no fijada en un frasco que contiene solucin de colorante de Field A durante 3 segundos. 2. Lave suavemente por inmersin (una vez) en una jarra de agua limpia durante 5 segundos. 3. Sumergir el portaobjetos en un frasco que contiene la solucin de tincin de Field B durante 3 segundos. 4. Lavar el portaobjetos suavemente como en el paso 2. 5. Colocar el portaobjetos en posicin vertical en un soporte deslizante para portaobjetos para que se seque al aire. Mtodo para la tincin de extensiones finas 1. Fijar la extensin en metanol durante 1 minuto. 2. Lavar el metanol con agua tamponada. 3. Con una pipeta, cubra la extensin con la solucin de tincin de Field B diluida (un volumen de colorante ms cuatro volmenes de agua tamponada). 4. Inmediatamente despus, aadir un volumen igual de una solucin de de Field A y mezclar bien mediante inclinacin del portaobjetos. 5. Deja actuar 1 minuto. 6. Lavar la tincin con agua limpia. 7. Colocar el portaobjetos en posicin vertical en un soporte deslizante para portaobjetos para secar al aire. El examen microscpico Examinar el portaobjetos bajo el microscopio con el objetivo de x 100. Los parsitos del paludismo que se encuentran en la sangre se encuentran en diferentes etapas de desarrollo (Fig. 4.139). Algunos parsitos del paludismo tienen grnulos de pigmentos en su citoplasma (Fig. 4.140). Frotis de sangre En las pelculas finas de sangre, los eritrocitos infectados pueden permanecer sin cambios o tener un color o una forma diferente, o pueden contener puntos rosados (moteado) ("Schffner") o puntos rojos ("James") (vase el cuadro 4.11). Las extensiones finas se pueden utilizar para identificar las especies de parsitos del paludismo (vase la Tabla 4.12). Nota: En los pacientes que han estado sufriendo de paludismo durante mucho tiempo, los monocitos pueden ser vistos en la extensin fina de sangre, el citoplasma contiene a menudo cuerpos marrones o negro verdosos (siderfilos). En pacientes que han recibido recientemente una
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inyeccin de un medicamento contra el paludismo, los parsitos se tien mal y aparecen distorsionados y confusos. Gota gruesa En el frotis de sangre, el fondo debe estar limpio y libre de restos, ya que los eritrocitos infectados se lisan. Los parsitos del paludismo deben tener la cromatina de color rojo oscuro y el citoplasma azul plido o de color prpuraazul. En las gotas gruesas teidas con Giemsa, los ncleos de los leucocitos deben estar teidos de color prpura oscuro. El moteado de Schffner se puede ver alrededor de los parsitos del paludismo. Las gotas gruesas de sangre se utilizan para la estimacin de la densidad de parsitos, como se describe a continuacin. Densidad de parsitos La densidad de parsitos es el nmero de parsitos contadas en cada campo microscpico. Por lo general, vara de acuerdo con la especie. Dos mtodos se pueden utilizar para contar parsitos del paludismo en gotas gruesas de sangre: determinacin del nmero de parsitos por microlitro (l) de la sangre, y el sistema adicional (el sistema plus o ms donde se usan cruces para simbolizar resultados positivos, de 1 a 4 cruces). 1. La determinacin del nmero de parsitos/l de sangre se lleva a cabo mediante el recuento del nmero de parsitos en relacin con un nmero estndar de leucocitos/l (8000). Inicialmente, la extensin de sangre se examina para la presencia de especies de parsitos y sus etapas de desarrollo. Usando dos contadores manuales (cuenta ganados), uno para contar los leucocitos y el otro para los parsitos, siga uno de estos dos procedimientos: (I) Si, despus de contar 200 leucocitos, se encuentran 10 o ms parsitos, registrar los resultados en el formulario de registro en trminos del nmero de parsitos/200 leucocitos; (Ii) si, despus de contar 200 leucocitos, el nmero de parsitos es de 9 o menos, seguir contando hasta llegar a 500 leucocitos y luego registrar el nmero de parsitos/500 leucocitos. Despus de los procedimientos (i) o (ii), utilizar una simple frmula matemtica, multiplicando el nmero de parsitos por 8000 y luego dividiendo esta cifra por el nmero de leucocitos (200 o 500). El resultado es el nmero de parsitos/l de sangre. Es una prctica normal para contar todas las especies presentes y para contar y registrar por separado los gametocitos de P. falciparum y los parsitos asexuales. Esto es particularmente importante en el seguimiento de la respuesta a los medicamentos antipaldicos que son activos contra la etapa de esquizontes, que no se espera que tengan efectos sobre los gametocitos. nmero de parsitos contados Nmero de parsitos / l de sangre nmero de leucocitos Ejemplo: Si se cuentan 200 leucocitos: (50 parsitos x 8000/200 leucocitos) = 2000 parsitos /l de sangre Si se cuentan 500 leucocitos: (5 parsitos x 8000/500 leucocitos) = 80 parsitos /l de sangre 2. Un mtodo ms sencillo de contar parsitos en frotis de sangre es utilizar el sistema ms usando cruces. Este sistema es menos satisfactorio, sin embargo, se debe usar slo cuando no es posible llevar a cabo el recuento ms aceptable de parsitos /l de sangre. En este sistema, se utiliza un cdigo de entre uno y cuatro signos ms (cruces): + = 110 parsitos por 100 campos de gota gruesa + + = 11 a 100 parsitos por 100 campos de gota gruesa + + + = 1 a 10 parsitos por solo campo gota gruesa + + + + = Ms de 10 parsitos por solo campo de gota gruesa. Recuerde: Para la correcta identificacin y el recuento de parsitos fiable, utilice portaobjetos limpias y gotas gruesas bien hechas y bien teidas. Nota: Los pacientes con muy alta densidad de parsitos (ms de 10 parsitos por campo gota gruesa) requieren tratamiento urgente. Por lo tanto, si usted encuentra una alta densidad de parsitos, indicar el resultado claramente en su informe y lo remitir de inmediato al mdico del paciente.
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Informe de los resultados Si el resultado del examen de los frotis de sangre es positivo, especifique: La especie de parsito que se encuentra; La etapa de desarrollo del parsito; La densidad de parsitos. Los extendidos de sangre que contienen P. ovale y P. vivax pueden contener pocos parsitos y por lo tanto tener ms tiempo para examinarlos bajo el microscopio. Sin embargo, es necesario diferenciar las dos especies, ya que pueden volver a aparecer en la sangre sin la reinfeccin. Los pacientes infectados con P. ovale o P. vivax requieren tratamiento adicional para erradicar las etapas hepticas de estos parsitos. Un paciente puede albergar ms de una especie de parsito del paludismo a la vez (por ejemplo, P. falciparum y P. malariae o P. falciparum y P. vivax). Si el resultado es negativo, informe como "no se encontraron parsitos". A continuacin en las pginas siguientes se colocan ilustraciones que corresponden a las figuras 4.139 y 4.140. En el manual original en ingls no aparecen estas figuras, por lo tanto, se colocarn figuras reemplazantes similares. Figura 4.139 Etapas del desarrollo de los parsitos del paludismo Figura 4.140 Parsitos del paludismo que contienen pigmento
lU tlM IIM U A U U IM U t K A H A iSITO S t L P A LU D IS M O

1 ms ncleos que contienen cromatina roja citoplasma azul granulos ocasionales de pigmento negro o pardo eritrocito infectado (color de rosa)
P A R A SIT O D E L PALU DISM O (teido)
Figura 4.139
ET A P A S DE D E S A R R O L L O Los parsitos que se encuentran en la sangre tienen distintas etapas de desarrollo.
2. Esquizonte
Trofozoito maduro con ncleo dividido en otros 8-24 ncleos. Llena la mayor parte del glbulo rojo.
ncleos frecuentemente ordenados en circulo, formando una roseta
cada ncleo se encuentra envuelto por cierta cantidad de citoplasma formando un merozolto
COMPARACION DE CELULAS INFECTADAS EN EXTENSIONES DE SANGRE
Tabla 4.11
P. faiciparum TAMAO del trofozoito joven en compara cin con el di metro de un gl bulo rojo (en la misma etapa de desarrollo) 1/5 a 1/3 del dimetro P. malariae P. vivax P. ovale
1/4 a 2/3 del di metro, aunque fre cuentemente se observa una forma en banda
1/4 a 2/3 del dimetro
1/4 a 2/3 del dimetro
ASPECTO del glbulo rojo infectado
Sin cambios MANCHAS que se encuen tran en el glbu lo rojo infectado
Sin cambios o empequeecido y algunas veces teido con mayor intensidad
Crecido y fre cuentemente te ido con palidez
Crecido, oval, con bordes rasgados y mellados
Con frecuen cia, ninguna* ETAPAS que se suelen observar Trofozoitos o gametocitos o ambos juntos; en una sola clula se pueden encontrar numerosos tro fozoitos
Ninguna
Manchs~de Schffner, pe queas y rosceas
Siempre existen grandes manchas de James
Se observan todas las formas en el mismo frotis
NOTA: Aspecto de los m onocitos (en casos de paludismo de larga duracin): con frecuencia el citoplasma contiene cuerpos de color castao o negro verduzco (siderfilos) Aspecto de los parsitos del paludismo despus de inyectar un medicamento antipaldico: los parsitos se tien dbilmente, se hallan deformes y son difciles de diferenciar.
* En algunos glbulos rojos Infectados con tro fozoito s adultos de P. faiciparum se puede encontrar cierta cantidad de grnulos rosceos, ms bien voluminosos, denominados "hendiduras de M aurer".
202
Tabla 4.12 Identificacin de Plasmodium spp. infecciosos para el ser humano en extensiones de sangre
IDENTIFICACION DE LAS CUATRO ESPECIES DE PARASITOS PLASMO DIUM M A LA R IA E
PLASMODIUM FALCIPARUM
TROFOZOITO JOVEN
<3 (Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo delgado y pequeo, de color azul plido Cromatina: 1 2 manchas rojas, pequeas ? i (Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo grueso y denso, de color azul, con algunos granulos de pigmento negro Cromatina: 1 gran mancha roja
fe
D
&
TROFOZOITO MADURO
(Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: anillo ms bien delgado azul, tambin con forma de coma o signo de admiracin Cromatina: 1 2 manchas rojas, tamao mediano
fe ? O
? %
(Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasma: puede ser 1) redondo, compacto, azul oscuro, con muchas partculas de pigmento negro, o 2) en forma de banda (slo en ex tensiones sanguneas) Cromatina: 1 mancha redonda o 1 banda roja (Se detecta con bastante frecuencia) M erozoitos: 8-10 Cada uno con una gran mancha roja rodeada de citoplasma plido; las 8 manchas pueden estar distribuidas de forma irregular (formas jvenes) o formar una roseta Pigmento: siempre visible
8 i)
ESQUIZONTE
(Sumamente raro) Muy d ifcil de encontrar en exten siones sanguneas (excepto en casos muy graves) M erozoitos: 18-32 Pigmento: oscuro, negro pardusco
GAMETOCITO
(Se detecta con bastante frecuencia) Forma: parece un pltano o una hoz C olor: azul (macho), azul fuerte (hembra) Ncleo: rojizo Pigmento: grnulos escasos de color negro azulado en el centro del citoplasma o disemi nados en l
1
i
I W 1 i
(Se detecta con bastante frecuencia) Forma: voluminosa, oval o redondeada C olor: azul intenso (hembra) azul plido (macho) Ncleo: una mancha redonda de cromatina roja situada en uno de los bordes Pigmento: grnulos negros grandes repartidos en el cito plasma
GLOBULOS ROJOS
De tamao normal Muchos pueden ser dentados y con tener trofozoitos maduros; a menudo presentan algunas manchas rojas de tamao y forma irregulares
De tamao y forma normales Por lo general no se observan manchas rojas en ellos
Con frecuencia la densidad es muy elevada
Densidad reducida
* En cualquier regin la densidad de los parsitos depende principalmente de que el paludismo ocurra en algunas estaciones del ao o sea endmico. Los individuos adultos en especial suelen desarrollar inmunidad en las regiones endmicas y, en conse cuencia, se reduce la densidad de los parsitos.
200
DENSIDAD PARASITOS
DEL PALUDISMO EN EXTENSIONES SANGUINEAS
Tabla 4.12 (Cont.)

La identidad del 1[ 0%2Ma se debe co n firm a r m ediante examen de una extensin sangunea
PLASMODIUM V IV A X
PLASMODIUM O VALE
TROFOZOITO JOVEN
(Se detecta frecuentemente en esta etapa) Citoplasm a: anillo deforme, muy grueso, de color azul C rom atina: una mancha roja ms bien grande
Citoplasma: anillo uniforme y denso, de color azul Crom atina: una mancha roja, tamao mediano
TROFOZOITO MADURO
(No se detecta con frecuencia) Citoplasma: grande azul, irregular (dividido a veces en 2, 3 4); par tculas de pigmento castao anaranjado C rom atina: 1 mancha roja
Citoplasma: redondo, compacto, azul muy intenso con algunas par tculas de pigmento castao Crom atina: 1 gran mancha roja
ESQUIZONTE
(Se detecta muy frecuentemente) M erozoitos; 12-18 grnulos rojos, voluminosos y compactos, que se observan sobre el fondo del cito plasma, azul plido
M erozoitos: 8-14 grnulos rojos grandes, forman una roseta que rodea un conglomerado central de partculas de pigmento castao
GAMETOCITO
(Se detecta frecuentemente) Hembra: oval o redondeada, azul intenso Un ncleo triangular rojo intenso, con frecuencia situado en un ex tremo; muchas partculas de pig mento anaranjado en el citoplasma Macho: redondeado, azul plido Un ncleo central redondo rojo plido; algunas partculas de pig mento anaranjado en el citoplasma
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voluminosa, oval o redonda, azul intenso Ncleo: 1 mancha redonda y roja Pigmento: algunas partculas de color castao en el citoplasma Se distingue de: P. vivax por su pigmento castao P. malariae por la presencia de manchas de Schffner
Form a:
GLOBULOS ROJOS
Crecidos, a menudo plidos des pus de la tincin. Manchas de Schffner, especial mente alrededor de los trofozoitos maduros
Pueden ser ovales, con extremos mellados Se observan fcilmente grandes manchas rojas de James
0 at e ce
o a0 a 0* o
DENSIDAD PARASITOS
Densidad mediana
Densidad mediana
r
201
Cuadro 7.
Identificacin d e esp ec ies de parsitos paldicos en preparacion es d e sangre de gota gruesa te id as con G iem sa
F a s e d el p arsito en la s a n g re p erifric a
E sp ecie T ro fo z o to E sq u izo n te G a m e to c ito
E
3
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5
E 0 6 Tamao: p e q u e o a m ed ian o ; nmero: p or lo g e n e ra l ab u n d a n te s ; forma: fre c u e n te s , fo rm a s a n u la re s y en co m a; cromatina: a m en u d o d o s m an ch as; citoplasma: u n ifo r m e, d e fino a g rueso; formas maduras: a m en u d o p re s e n te s e n c a s o s g ra v e s d e p a ludism o, c o m p a c ta s co n el p ig m en to en p o c o s g rn u lo s g ru e s o s o e n m a s a nica. N o rm a lm e n te a s o c ia d o s , con m u ch a s fo r m as a n u la re s j v e n e s . Tamao: p eq u e o , c o m p a c to ; nmero: e s c a s o s , p o c o fre c u e n te s , p o r lo g en era l e n c a s o s graves; formas maduras: 1 2 -3 0 o m s m e ro zo ito s en a g lo m e ra d o c o m p a cto ; pigmento: m asa o sc u ra n ic a .. F o r m a s in m a d u r a s p u n tia g u d a s p o c o co rrie n te s . Formas maduras: en fo rm a de b a n a n a o re d o n d e a d a s ; cromatina: nica, b ien d e fin id a ; pigmento: d e s p e rd ig a d o , g ru e s o , riciform e; a v e c e s se o b s e rv a r g a n o d e e x tru si n d e c o lo r ro sa. C o n fre cu e n cia, fo rm a s e ro s io n a d a s s lo con c ro m a tin a y p ig m en to .
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(1 )c o< 1 )
Tamao: de p e q u e o s a g ran d es ; nmero: e s c a s o a m o d erad o ; form a; son c o rrie n te s, el anillo ro to o fo rm a s irreg u lare s; cro matina: nica, en o c a s io n e s dos; citoplas ma: irreg u lar o fra g m e n ta d o ; form as m a duras: c o m p a c ta s , d en s a s ; pigmento: d e s p erd ig ad o , fino.
Tamao: g ra n d e ; nmero: e s c a s o a m o d e rado; formas maduras: 1 2 -2 4 m ero zo ito s , g e n e ra lm e n te 16, en c o n g lo m e ra d o irre gular; pigmento: m a s a su elta.
F o rm a s in m ad u ras difciles d e distingu ir de los tro fo zo to s m a d u ro s . Formas madu ras: re d o n d a s , g ran d es ; cromatina: nica, b ien d e fin id a ; pigm ento: d e s p e rd ig a d o , fino. F o rm a s e ro s io n a d a s con c ito p la s m a e s c a s o o a u s e n te y s lo c ro m a tin a y pig m ento.
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T 3C O(
O c/5 ;
S F C D ir .<
O Tamao: pu e d en se r m e n o re s q u e P. vivax; nmero: en g en era l es c a s o ; forma: an u la r a re d o n d e a d a , fo rm a s co m p a c ta s ; croma tina: nica, p ro m in e n te; citoplasma: b a s ta n te re gular, gru eso ; pigmento: d e s p e rd i g a d o , ru goso. Tamao: p a re c id o a P. m alariae ; nmero: es caso ; formas maduras: 4-12 merozoitos, generalmente 8, conglomerado laxo pig mento: m a s a co n c e n tra d a . F o rm a s in m a d u ra s difciles d e distingu ir d e tro fo z o to s m a d u ro s . Formas maduras: re d o n d a s , p u e d en s e r m e n o re s q u e P. vi vax; cromatina: nica, b ien d efin id a ; p ig mento: d e s p e r d ig a d o , ru g o s o . F o rm a s e ro s io n a d a s co n c ro m a tin a y p ig m e n to s o lam en te.
c
2cE
8 2 3 E
ib = o
2 C -2 ro
6 CL Tamao: peq u e o ; nmero: g e n e ra lm e n te e s c a s o ; forma: a n u la r o re d o n d e a d a , fo r m as c o m p a cta s; cromatina: nica, g ran d e; citoplasma: re g u lar, den so ; pigmento: d e s p e rd ig a d o , ab u n d a n te , con to n o am a rille n to en las fo rm a s m s viejas. Tamao: p e q u e o , c o m p a c to ; nmero: g e n e ra lm e n te es caso ; formas maduras: 6 -1 2 m e ro zo ito s , h ab itu a lm e n te 8, en co n g lo m e ra d o laxo; alg u n o s a p a re n te m e n te sin c ito p lasm a; pigmento: c o n c e n tra d o . F o rm a s in m ad u ras y a lg u n a s m a d u ra s di fciles d e distingu ir d e los tro fo zo to s m a d u ro s . Formas maduras: re d o n d e a d a s , c o m p a c ta s ; cromatina: nica, bien d efin i d a; pigmento: d e s p e rd ig a d o , ru g o so , p u e d e e s ta r d istribuido en la p eriferia . Las fo r m as e ro s io n a d a s s lo tien en c ro m a tin a y p ig m en to .
<D
85
\
IDENTIFICACION DE ESPECIES PARASITAS
Fig. 9.
Plasm odium falciparum
0 C tr Ci ^
r ^ , c
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\
/ *
TR O F O Z O IT O S
E S Q U IZO N TE S
G A M E TO C ITO S Extensin sanguinea fina Preparacin de gota gruesa
86
Fig. 10.
Plasm odium vivax
'S & M
T R O F O Z O IT O S
E S Q U IZO N T E S
**; j . . .* . V .
*
G A M E TO C ITO S Extensin sangunea fina Preparacin de gota gruesa
87
Fig. 11.
Plasm odium m alariae
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O Xs # l
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T R O F O Z O IT O S
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E S Q U IZO N TE S
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88
Fig. 12.
Plasm odium ovale
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i
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~ * * * - a . *** #
T R O FO ZO ITO S
E S Q U IZO N TE S
89
Fig. 13.
A sp ecto de los elem en to s celulares en extensiones sangun eas y preparacion es d e gota gruesa te id as con G iem sa: e fe cto del pH en la tincin d e los parsitos paldicos con G iem sa
LE U C O C ITO S Extensin sangunea fina Preparacin de gota gruesa N = Neutrfilos, e = Eosinfilos, M = M onocitos, L = Linfocitos, P = Plaquetas
Extensin sangunea
E R ITR O C ITO S
Preparacin de gota gruesa
NC = N orm ocitos, M C = Microcitos, PM = M acrocitos policrom ticos, Pe = Poiquilocitos, PB = Basofilia puntuada, CR = Anillo de C abot, HJ = C uerpos de Howeii-Jolly, RC = Nubes reticulares y rganos crom atoides en anem ia aguda
PH
6-4
6-8
72
7-6
T IN C IO N PALU D IC A Y pH
90
189
TRIPANOSOMIASIS
4.7.3 TRYPANOSOMA SPP. 4.7.3 Trypanosoma spp. La tripanosomiasis es causada por la infeccin con protozoos parsitos del gnero Trypanosoma. Se produce en el sur y el oeste de frica, donde se le conoce como enfermedad del sueo o Tripanosomiasis Africana, y en Amrica Central y del Sur, donde se le llama enfermedad de Chagas1 o Tripanosomiasis Sudamericana. 1La enfermedad de Chagas tambin es llamada enfermedad de Chagas Mazza o Tripanosomiasis Americana, porque hasta donde se sabe, la enfermedad de Chagas est confinada al hemisferio occidental y se la encuentra en el continente americano. Fue descubierta en Brasil por el Dr. Carlos Chagas, despus se descubri que su distribucin es mucho ms extensa. Adems de Brasil se informaron casos autctonos en toda Suramrica, Amrica Central y Mxico. Tambin, el agente etiolgico fue encontrado hasta en Corpus Christi, Texas, EE UU. Fuente: Ernest Carroll Faust, Paul Farr Russell, Rodney Clifton Jung Parasitologa Clnica Salvat Editores 1974, reimpresin 1982. Pginas 107 - 122. La Tripanosomiasis Africana La tripanosomiasis africana ocurre en tres fases: -La fase aguda -La fase de parasitemia -La fase neurolgica. Dos o 3 das despus de la picadura de una mosca tse-ts infectada, el chancro aparece en el sitio de la inoculacin, que desaparece a las 2-3 semanas. Desde el sitio del chancro, los tripanosomas invaden el torrente sanguneo, dando lugar a episodios ocasionales de fiebre intermitente. Los sntomas ms comunes de la primera fase o fase aguda son dolor de cabeza, insomnio, dolor en las articulaciones y los ganglios linfticos posterior del cuello, hinchazn de los prpados y articulaciones, prdida de peso y picazn intensa generalizada, especialmente en la regin del esternn. La invasin del sistema nervioso central provoca irritabilidad, parestesia, insomnio y dolores de cabeza severos y finalmente la visin borrosa, as como los ataques epilpticos, los fenmenos psicticos, somnolencia, letargo mental, y coma. La tripanosomiasis causada por Trypanosoma brucei gambiense generalmente tiene un curso lento y crnico. Entre la primera y segunda fases, semanas o meses pueden pasar, y meses o aos pueden transcurrir entre la segunda y tercera fases. La tripanosomiasis causada por T. b. rhodesiense sigue un curso ms agudo y las fases son menos marcadas. Puede causar la muerte en pocos meses. Las complicaciones cardacas son ms frecuentes en la tripanosomiasis causada por T.b. rhodesiense, y algunos pacientes mueren antes de llegar a la fase neurolgica. Las fuentes de infeccin y los modos de transmisin La tripanosomiasis africana es transmitida por moscas tse-ts (Glossina spp.) y los seres humanos son el principal reservorio de la infeccin. Los cerdos, perros y posiblemente otras especies de animales pueden tambin hospedar el parsito, pero su papel en la propagacin de la enfermedad es secundario. La transmisin ocurre cuando las moscas tse-ts ingieren la sangre de personas o animales infectados. Examen del lquido de los ndulos linfticos para Trypanosoma brucei gambiense y T.b. rhodesiense En diversos casos de tripanosomiasis africana del hombre (llamada tambin "enfermedad del sueo") se encuentran tripanosomas en los ganglios linfticos (en infecciones por T. gambiense) durante las primeras etapas de la enfermedad, es decir, 2-3 semanas despus de que la mosca tsets (Glossina spp.) ha inoculado al paciente con los parsitos. Los tripanosomas desaparecen de los ganglios en 2-6 meses. En una etapa posterior los parsitos pueden infectar el sistema nervioso central. El mtodo estndar para el diagnstico de la tripanosomiasis africana en la primera etapa es la bsqueda de tripanosomas en los aspirados de los ganglios linfticos cervicales agrandados por la inflamacin. Principio del examen Por medio de una aguja se extrae una gota de lquido de un ganglio linftico. Esta gota se examina inmediatamente en preparacin hmeda colocada entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Los tripanosomas, que son protozoarios mviles y flagelados, se observan fcilmente con el microscopio. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Una aguja (para inyeccin subcutnea) de calibre 25 (0,5 mm) x 16 mm Jeringa, 5 o 10 ml (tanto jeringa y aguja deben estar perfectamente secas) Tintura de yodo Etanol al 70% Cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). Mtodo Localizacin de un ganglio afectado Entre los ganglios cervicales se suelen encontrar los que se hallan afectados. Plpense ambos lados del cuello, desde la base hasta la oreja.
190
Los ganglios afectados se inflaman y originan protuberancias de 2-4 cm (Fig. 4.141). Son elsticos y se deslizan bajo la piel, ofreciendo escasa resistencia a la presin. No suelen endurecerse (excepto en los casos crnicos). Obtencin de la muestra Preparativos Prepare la jeringa tirando el mbolo hacia atrs, hasta donde sea posible. Prepare asimismo 3 portaobjetos, colocando una gota de la solucin de cloruro sdico en cada uno. Lvese las manos con agua y jabn. Haga que el enfermo se siente. 1. Desinfecte el sitio escogido del cuello con tintura de yodo* o etanol. Tome el ganglio afectado entre el pulgar y el ndice de la mano izquierda. Sostenga el ganglio con firmeza, hacindolo sobresalir al mismo tiempo (Fig. 4.142). Mantenga su mano firme. *La solucin de yodo se debe limpiar despus con etanol para evitar quemaduras. Tambin se pueden emplear otros desinfectantes, como el tiomersal. 2. Sujetando la aguja entre el pulgar y el ndice, Introduzca la aguja en ngulo recto en el centro del ganglio, en dos pasos (Fig. 4.143): primeramente perfore la piel a continuacin haga penetrar la aguja en el ganglio. (Cercirese de evitar la vena yugular y las arterias cercanas) 3. Con La mano izquierda: exprima y suelte el ganglio en movimientos sucesivos, con suavidad. Con la mano derecha: haga girar la aguja en ambas direcciones (Fig. 4.144). El lquido del ganglio saldr por la aguja. La operacin deber durar aproximadamente un minuto y medio (Fig. 4.145). 4. Extraiga la aguja con un movimiento rpido, tapando la entrada con el pulgar. A continuacin aplique un algodn humedecido con tintura de yodo en el sitio perforado. (Nunca se aplique el algodn con tintura de yodo antes de extraer la aguja, ya que cierta cantidad de este antisptico puede llegar a la punta de la aguja, entrar en el lquido que se ha obtenido del ganglio e inmovilizar los tripanosomas.) Si el ganglio se encuentra endurecido, asprese el lquido directamente por medio de una jeringa. Preparacin de los portaobjetos 1. Ponga la aguja en la jeringa (que deber tener el mbolo hacia atrs). Coloque la punta de la aguja en la gota de solucin de cloruro sdico del primer portaobjetos. Empuje el mbolo suavemente hasta la mitad del cilindro de la jeringa para expulsar sobre el portaobjetos el lquido contenido en la aguja. 2. Repita este procedimiento en el segundo portaobjetos, empujando el mbolo hasta el fondo del cilindro para expulsar el resto del lquido. 3. Aspire la gota de solucin de cloruro sdico del tercer portaobjetos al interior de la aguja. Expulse y aspire el lquido sucesivamente varias veces para enjuagar la aguja completamente y recoger los ltimos residuos del lquido extrado del ganglio. El examen microscpico Examine el primer portaobjeto con el objetivo x10, cambie al objetivo x40 para examinar los parsitos con mayor detalle. Cierre el diafragma condensador suficientemente para dar una imagen ntida. Coloque cubreobjetos sobre cada una de las tres preparaciones. Examnense inmediatamente con el microscopio (con objetivo x 40). Espere hasta que se detenga el movimiento del lquido provocado por el calor (corrientes de conveccin). Es imposible ver el movimiento de los tripanosomas entre clulas que se mueven. Empiece examinando la periferia de la primera preparacin, cerca de los bordes del cubreobjetos, hacia donde tienden a dirigirse los tripanosomas (figura 4.146). A continuacin observe minuciosamente el resto de la preparacin. Repita este procedimiento con las otras dos preparaciones. En la preparacin se encontrarn eritrocitos, leucocitos y clulas linfticas. Si se nota algn movimiento entre las diferentes clulas observe con cuidado extremo para determinar si es causado por un tripanosoma. Este parsito mide aproximadamente 20 m de longitud y con frecuencia lo ocultan las diversas clulas, que se agitan ligeramente por los movimientos del flagelo.
191
192
A) Materiales y reactivos. B) Zona del cuello donde se suelen ubicar los ganglios linfticos cervicales. Entre los ganglios cervicales se suelen encontrar los que se hallan afectados. Plpense ambos lados del cuello, desde la base hasta la oreja. Figura 4.141 Encontrar un ganglio linftico infectado con tripanosomas. Los ganglios afectados se inflaman y originan protuberancias de 2-4 cm. C) Prepare la jeringa tirando el mbolo hacia atrs, hasta donde sea posible. Prepare asimismo 3 portaobjetos, colocando una gota de la solucin de cloruro sdico en cada uno. Figura 4.142 Hacer sobresalir el ganglio linftico sostenindolo con firmeza. Figura 4.143 La introduccin de una aguja en el ganglio linftico. Figura 4.144 Haga girar la aguja en ambas direcciones. Figura 4.145 La toma de una muestra de lquido de los ganglios linfticos. D) Extraiga la aguja con un movimiento rpido, tapando la entrada con el pulgar. A continuacin aplique un algodn humedecido con tintura de yodo en el sitio perforado. E) Ponga la aguja en la jeringa que deber tener el mbolo hacia atrs, vea la flecha). Coloque la punta de la aguja en la gota de solucin de cloruro sdico del primer portaobjetos. F) Repita este procedimiento en el segundo portaobjetos, empujando el mbolo hasta el fondo del cilindro para expulsar el resto del lquido (vea la flecha). G) Aspire la gota de solucin de cloruro sdico del tercer portaobjetos al interior de la aguja. Expulse y aspire el lquido sucesivamente varias veces para enjuagar la aguja completamente y recoger los ltimos residuos del lquido extrado del ganglio. Figura 4.146 Examen de una muestra de los ganglios linfticos bajo el microscopio. Empiece examinando la periferia de la primera preparacin, cerca de los bordes del cubreobjetos, hacia donde tienden a dirigirse los tripanosomas. A continuacin observe minuciosamente el resto de la preparacin. Repita este procedimiento con las otras dos preparaciones. Siga el sentido indicado en la figura. Figura 4.147 Aspecto de los tripanosomas en una preparacin de lquido de los ganglios linfticos. Se observan tambin hemates y leucocitos, as como clulas de los ganglios linfticos. El tripanosoma tamao: 15 - 25 m (2-3 veces la longitud de un eritrocito) Forma: semeja un pez ondulante Aspecto:(en preparaciones hmedas) claro; refracta la luz muy intensamente. Flagelo y membrana undulante En preparaciones hmedas se observan principalmente los movimientos del flagelo, que se encuentra situado en el extremo anterior del parsito. El tripanosoma se desplaza entre las clulas con trayectorias serpenteantes. H) En la preparacin se encontrarn eritrocitos, leucocitos y clulas linfticas. Si se nota algn movimiento entre las diferentes clulas observe con cuidado extremo para determinar si es causado por un tripanosoma. Examen de frotis de sangre para Trypanosoma brucei gambiense y Tb rhodesiense
193
Principio Los tripanosomas que pertenecen a la especie de Trypanosoma brucei se detectan en la sangre: -En preparaciones hmedas -En gotas gruesas despus de la tincin -Concentracin por centrifugacin repetida -En las pruebas serolgicas. Importante: En la tripanosomiasis africana los tripanosomas aparecen en la sangre a intervalos durante un perodo de unos pocos das, principalmente durante los primeros 3 meses de la enfermedad y, especialmente, durante los episodios de fiebre. Examen microscpico de la sangre capilar Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Lancetas para puncin capilar Filtro de papel cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Giemsa (reactivo. N 29) o Colorante de Field (reactivo. N 25) Agua tamponada, pH 7,2 (reactivo no. 15) Etanol al 70%. Mtodo 1. Esterilizar la yema del dedo anular y luego pinchar con la lanceta para puncin. Limpie la primera gota de sangre con papel de filtro. Recoja dos gotas de sangre (Fig. 4.148): -Una gota en un portaobjeto -Una gota en un segundo portaobjeto. 2. Recoja dos gotas de sangre en un pedazo de papel de filtro (Fig. 4.149). Dejar secar. 3. En el primer portaobjeto, coloque una gota de solucin de cloruro sdico al lado de la gota de sangre. Mezclar, usando la esquina de un portaobjeto (fig. 4.150). Cubrir con un cubreobjetos. 4. En el otro portaobjeto, extienda la sangre para producir un extendido grueso (gota gruesa) (vase antes). Teir con Giemsa (vase antes) o colorante de Field (ver antes). Nota: Los frotis de sangre deben ser teidos y examinados inmediatamente despus de la recogida de muestras de sangre, ya que los tripanosomas se lisan y desaparecen a las pocas horas.
Figura 4.148 Toma de una muestra de sangre capilar en cada uno de dos portaobjetos. Figura 4.149 Toma de una muestra de sangre capilar en papel de filtro. Figura 4.150 Usando un portaobjetos, con una de sus esquinas mezclar la muestra de sangre con solucin salina. Figura 4.151 Aspecto de los tripanosomas en una preparacin hmeda. El examen microscpico
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Preparacin hmeda. Examinar el primer portaobjeto (con la preparacin hmeda) bajo el microscopio, utilizando el objetivo x40 y la reduccin de la apertura del condensador. Examine primero los bordes del preparado. Busque movimiento entre los eritrocitos; los tripanosomas se desplazarn con su flagelo a medida que avanzan. Asegrese que los organismos son tripanosomas: Longitud: 15-25 m (2-3 eritrocitos). Anchura: 3 m (media de eritrocitos). Forma: como una pez alargado. Motilidad: Los tripanosomas suelen moverse rpidamente, avanzando y contrayndose como una serpiente, y tienen una membrana ondulante que se extiende desde un flagelo mvil en el extremo anterior (Fig. 4.151). No se debe confundir los tripanosomas con las microfilarias, que son mucho ms grandes (100-300 m o 10 a 40 eritrocitos). Gota gruesa. Las gotas gruesas siempre deben ser examinadas, incluso si el examen de la preparacin hmeda parece ser positiva, para asegurarse que los organismos mviles vistos son tripanosomas. Los tripanosomas de T.B. gambiense y T. B. rhodesiense son idnticos en apariencia, en preparaciones teidas (Fig. 4.152): Longitud: 15-25 m. Citoplasma: Azul claro. Ncleo: Ncleo grande central, teido de color rojizo-prpura. Grnulos: Un cuerpo compacto rojo en el extremo posterior: el cinetoplasto. Membrana ondulante: Rojo-rosa, empezando por el cinetoplasto. Flagelo: Rosa, que se extiende 5 m ms all de la membrana ondulante. Si ambos portaobjetos son negativos, repita las pruebas hasta un mximo de 7 das. Enviar las gotas secas de sangre en la tira de papel de filtro a un laboratorio de referencia para la prueba inmunolgica de inmunoglobulina M (IgM) y los anticuerpos especficos.
Figura 4.152 Aspecto de los tripanosomas en una gota gruesa teida. F: flagelo; K: cinetoplasto; M: membrana ondulante
Examen microscpico de sangre venosa concentrada por centrifugacin (Mtodo similar al de Strout) Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Centrfuga o centrfuga para microhematocrito Tubos cnicos de centrfuga con una marca a 10 ml o tubos capilares para microhematocrito Pipeta Pasteur Citrato trisdico, solucin al 3,2% (reactivo no. 60). Mtodo 1. Vierta 1 ml de solucin de citrato trisdico en un tubo cnico de centrfuga. 2. Recoger 9 ml de sangre venosa y aadirlo al citrato trisdico (es decir, llenar el tubo hasta la marca de 10 ml). 3. Mezclar y centrifugar inmediatamente a 3000 g durante 3 minutos. 4. Extraiga todo el plasma sobrenadante y la capa de leucocitos por encima del depsito de los eritrocitos. Expulsar a este lquido sobrenadante en otro tubo (tubo 2). Centrifugar a 3000 g durante 5 minutos. 5. Extraiga todo el lquido sobrenadante (pero mantenga el depsito del tubo de 2). Expulsar el lquido sobrenadante en un tercer tubo (tubo 3). Centrifugar a 3000 g durante 10 minutos. 6. Examinar los depsitos de los tubos 2 y 3 entre un portaobjetos y un cubreobjetos bajo el microscopio.
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Los tripanosomas aparecern en el depsito desde el tubo 3 (existen ocasiones en que aparecen a partir del tubo 2). Nota: Este mtodo es similar al mtodo de la triple centrifugacin de Strout, el cual tambin suele ser utilizado para investigar la presencia de T. cruzi en casos sospechosos de enfermedad de Chagas agudo.
E F A) Tome un tubo cnico para centrifugacin graduado hasta 10 ml. Mida en este tubo: 1 ml de la solucin de citrato. B) Extraiga: 9 ml de sangre venosa y depostelos en el tubo con el citrato (hasta la marca de 10 ml). C) Mzclese y centrifguese inmediatamente a velocidad media durante 3 minutos. D) Extraiga todo el plasma flotante y la capa de leucocitos que se encontrar sobre el sedimento de eritrocitos. Deposite este lquido en otro tubo (tubo 2). Centrifguese a velocidad media durante 5 minutos. E) Extraiga del tubo 2 todo el lquido flotante, dejando el sedimento en su sitio. Deposite este lquido en un tercer tubo (tubo 3). Centrifguelo a alta velocidad durante 10 minutos. F) Examine con el microscopio, entre un portaobjetos y un cubreobjetos, los sedimentos que se han formado en los tubos 2 y 3. Se observarn tripanosomas en el sedimento del tubo 3 (y ocasionalmente tambin en el del tubo 2). Se encontrarn microfilarias en el sedimento del tubo 2. Mtodo alternativo Si una centrfuga de hematocrito est disponible, la sangre venosa (o capilar) con anticoagulante se puede recoger en un tubo capilar de microhematocrito. El mtodo de recogida y el examen es el de microfilarias (ver antes). Los tripanosomas mviles, si estn presentes, se encuentran en el plasma justo por encima de la capa de leucocitos. En primer lugar utilizar el objetivo x10 con menor apertura del condensador para detectar cualquier movimiento, a continuacin, utilizar el objetivo x40 para ver los tripanosomas con mayor claridad. Nota: Este mtodo es similar al mtodo del Strout en capilares de microhematocrito (MicroStrout), el cual tambin suele ser utilizado para investigar la presencia de T. cruzi en casos sospechosos de enfermedad de Chagas agudo. La diferencia con el mtodo de Strout convencional, consiste en el uso de microhematocritos en vez de tubos cnicos de centrfuga y en que no hay una triple centrifugacin. Prueba de la aglutinacin en placa (CATT) para la tripanosomiasis africana La prueba de la aglutinacin en placa (CATT) para la tripanosomiasis africana es una prueba serolgica que se utiliza para el diagnstico de la tripanosomiasis. Materiales y reactivos Frasco Papel de seda (papel de tissue) o tela Cristal varillas agitadoras Frasco gotero dispensador Bulbo o perilla de goma para tubos de microhematocrito Jeringas, 2,5 ml, con agujas Lancetas para puncin capilar de sangre Tubos de microhematocrito heparinizados Placas de prueba Soportes para tubos de microhematocrito con tapa Rotador manual o elctrico (12/220 V) con tapa Antgeno liofilizado Suero control positivo liofilizado Suero control negativo liofilizado Buffer para reconstituir los reactivos. Los materiales y reactivos descritos anteriormente estn disponibles comercialmente como un kit de prueba. Las cantidades aportadas son suficientes para llevar a cabo 250 pruebas. Antes de realizar
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la prueba, preparar sus materiales y reconstituir la cantidad de reactivos necesarios para el trabajo del da. Lea y siga cuidadosamente las instrucciones incluidas en el kit. Mtodo Recogida de muestras 1. Usando una lanceta para puncin capilar, hacer una pequea herida de puncin en el primero, segundo o tercer dedo del paciente. Recoger la sangre en un tubo de microhematocrito heparinizado (Fig. 4.153) hasta que est tres cuartos de su capacidad con sangre. 2. Girar inmediatamente el tubo suavemente de modo que la sangre se extienda desde un extremo del tubo al otro (fig. 4.154). Repetir el movimiento dos veces. Esto asegura que la sangre y la heparina se mezclen entre s, y evita que la muestra se coagule en el tubo. 3. Coloque el tubo de hematocrito en el soporte especial (suministrado con el kit; Fig. 4.155). Mantener el soporte cubierto tanto como sea posible para evitar el polvo y para evitar que la muestra de sangre se seque en el tubo. Los soportes de tubos de microhematocrito tienen 10 ranuras numeradas. Asegrese de colocar el primer tubo en la primera ranura, etc. Una vez que el soporte est lleno, pasarlo a la persona que realiza la prueba. Realizacin de la prueba 1. Preparar dos placas de prueba. Coloque una gota del antgeno reconstituido en los pocillos 1 y 2 de la primera placa y en todos los pocillos de la segunda tarjeta. Mantenga el vial verticalmente para tener gotas calibradas constantes (Fig. 4.156). 2. Usando la primera placa, compruebe la calidad del reactivo. Coloque una gota de control positivo reconstituido en el pocillo 1 y una gota de control negativo reconstituido en el pocillo 2 (Fig. 4.157). Nota: Slo es necesario hacerlo una vez al comienzo de cada da en un estudio de campo. 3. Usando la segunda placa, probar la sangre recogida. Ponga una gota de sangre del primer tubo de hematocrito en el pocillo 1, a partir del segundo tubo en el pocillo 2, etc. (Fig. 4.158). Deseche el tubo de hematocrito en un frasco que contiene agua con detergente. 4. Usando una varilla de agitacin, mezclar los reactivos en cada pocillo de la primera placa y los reactivos y muestras de sangre en cada pocillo de la segunda placa. Extender la mezcla de manera que cubra el pocillo (fig. 4.159). Usar una varilla de agitacin separada para cada pocillo o limpiar la varilla con un trozo de papel de seda o una tela entre cada pocillo para evitar la contaminacin de las muestras. 5. Coloque las dos tarjetas en el rotador, tapar, y ajustar el temporizador a 5 minutos. Si se trata de un aparato rotatorio manual, comprobar el tiempo con su reloj. La velocidad de rotacin debe ser lenta, aproximadamente 100 g. Si la velocidad de rotacin es demasiado rpida, las aglutinaciones se depositan en el borde de los pocillos; si es demasiado lenta, la reaccin ser dbil. 6. Despus de 5 minutos, examinar las placas y registrar las reacciones en cada pocillo. No permita que las muestras se sequen. Si las muestras se han secado, la prueba debe repetirse. Resultados Reacciones fuertemente positivas (Fig. 4.160) Pequeos o grandes aglutinaciones de partculas son visibles sobre todo el pocillo o las aglutinaciones forman un crculo alrededor del borde del pocillo. Reacciones positivas dbiles (Fig. 4.161) Muy pequeas aglutinaciones de partculas se extienden por todo el pocillo o forman un crculo alrededor del borde del pocillo. Repita la prueba usando suero o plasma. Reacciones negativas (Fig. 4.162) No hay aglutinacin visible. La reaccin se mantiene uniforme u ocasionalmente ligeramente ms densa en el centro. Reacciones inespecficas (Fig. 4.163) Un anillo reseco se observa alrededor del borde del pocillo o se ven pequeos puntos o hilos finos. Este tipo de reaccin es por lo general negativo. Si tiene alguna duda al respecto, repita la prueba usando suero o plasma. Nota: Deseche todos los reactivos reconstituidos no utilizados al final del da, a menos que hayan sido refrigerados. Estos no van a mantenerse y pueden dar falsos resultados si se utiliza al da siguiente. Otras pruebas de diagnstico para la tripanosomiasis africana Adems de los ensayos descritos anteriormente, la tripanosomiasis africana tambin se diagnostica en el laboratorio por: El examen del liquido aspirado de los ganglios linfticos para buscar tripanosomas (ver antes); Pruebas de sangre seca recolectada en papel filtro para anticuerpos IgM y anticuerpos especficos (vase antes); Inoculacin de las ratas o ratones con muestras de sangre heparinizada (slo en laboratorios especializados); Examen de las muestras de LCR para buscar tripanosomas (ver seccin 8.3.3, ms adelante).
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Figura 4.153 Toma de una muestra de sangre usando un tubo de hematocrito. Figura 4.154 Girar el tubo para mezclar la muestra. Figura 4.155 Soporte para tubos de hematocrito. Figura 4.156 Aplicacin de antgeno a la tarjeta o placa de prueba. Figura 4.157 Preparacin de los controles para la CATT. Figura 4.158 Aplicacin de las muestras de ensayo a la tarjeta de prueba Figura 4.159 Mezclar las muestras en cada pocillo de la tarjeta de prueba Figura 4.160 Reaccin positiva fuerte en la CATT. Figura 4.161 Reaccin positiva dbil en la CATT. Figura 4.162 Reaccin negativa en la CATT. Figura 4.163 Reaccin no especfica en la CATT.
ENFERMEDAD DE CHAGAS
La enfermedad de Chagas afecta principalmente a los nios y se caracteriza por fiebre alta intermitente o continua. Alrededor del 50% de los nios manifiestan inflamacin unilateral de los prpados (signo de Romaa). En otras reas de la cara o el cuerpo, se producen cerca del punto de inoculacin lesiones cutneas (chagomas) que se asemejan a los fornculos. Puede haber edema generalizado de todo el cuerpo. El agrandamiento del hgado (hepatomegalia) es comn en los nios, pero no se ve a menudo en los adultos. La fiebre puede ir acompaada de miocarditis y meningitis. La infeccin del tracto digestivo provoca vmitos y diarrea. Las infecciones primarias pueden a menudo pasan inadvertidas, pero las infecciones severas pueden causar la muerte.
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Despus de la fase aguda, sigue un perodo latente de la infeccin (fase indeterminada); esta fase se caracteriza por un bajo nivel de parasitemia y la ausencia de sntomas clnicos. O bien puede persistir indefinidamente o puede dar lugar a la forma crnica de la enfermedad. La fase indeterminada se caracteriza por la presencia de anticuerpos especficos que pueden ser detectados por las pruebas serolgicas, pero no por los sntomas clnicos. Los pacientes que padecen la forma crnica de la enfermedad muestran signos de insuficiencia cardaca. Las anormalidades en el electrocardiograma son a menudo evidentes, aunque los sntomas clnicos estn ausentes. Los pacientes con la forma crnica de la enfermedad pueden negar haber experimentado alguna vez la forma aguda, posiblemente debido a que fue asintomtica o porque ocurri en la infancia y se han olvidado. Fuentes de infeccin y modos de transmisin En la enfermedad de Chagas, el parsito (Trypanosoma cruzi) es transmitido por insectos del gnero Triatoma que se infectan por la ingestin de la sangre de personas o animales infectados (animales domsticos infectados o animales reservorios naturales). El parsito se multiplica en el intestino de los insectos triatomneos. Los humanos se infectan cuando la herida en el lugar de la picadura de triatominos est contaminada con las heces infectadas de los insectos vectores. Hay un grave riesgo que la enfermedad de Chagas pueda ser transmitida a travs de la transfusin de sangre si no se toman las precauciones adecuadas. Exmenes de diagnstico para la enfermedad de Chagas El Trypanosoma rangeli infecta a los seres humanos en casi las mismas reas que T. cruzi. Aunque T. rangeli no es patgeno, este debe ser identificado y distinguido de T. cruzi para el diagnstico de la enfermedad de Chagas. Importante: Los tripanosomas mviles se encuentran en la sangre durante la fase aguda de la enfermedad, y rara vez despus de sta (es decir, en la fase indeterminada o de latencia o en la fase crnica). Durante la fase crnica el diagnstico se basa esencialmente en mtodos inmunolgicos. Los tripanosomas que causan la enfermedad de Chagas son difciles de encontrar en la sangre. Las mismas tcnicas se utilizan como para la tripanosomiasis africana: Examen de una preparacin hmeda (vase antes; raramente positivo en la fase crnica de la enfermedad); Examen de gota gruesa (vase antes) repetida varios das seguidos; Examen de frotis de sangre preparados a partir de muestras de sangre centrifugada (ver pginas anteriores); Examen de muestras de sangre seca para anticuerpos IgM y anticuerpos especficos (vase antes). Identificacin de Trypanosoma cruzi en gota gruesa (Fig. 4.164) Descripcin de T. cruzi teido: Forma: ancha, semejante a una "C "; otras veces puede ser ms delgada, generalmente parecida a una "S" Longitud: formas anchas: aproximadamente 15m; formas delgadas: 20 m Citoplasma: azul plido Ncleo: voluminoso, central, de color rojo Cinetoplasto: grnulo voluminoso y redondo, rojo oscuro o morado, situado cerca del extremo posterior Membrana ondulante: delgada, de color rosceo o rojo Flagelo: color de rosa; se extiende hacia atrs de la membrana ondulante Identificacin de Trypanosoma rangeli en gota gruesa (Fig. 4.165) Descripcin de T. rangeli teido: Forma: solo existen formas delgadas con extremos agudos Longitud: 25 - 35 m Ncleo: rojo, situado cerca del centro del cuerpo celular Cinetoplasto: pequeo; semeja una mancha de color rojo oscuro; situado lejos del extremo posterior Membrana ondulante: visible, delgada Flagelo: se extiende hacia atrs de la membrana ondulante.
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Figura 4.164 Aspecto de Trypanosoma cruzi en gota gruesa
Figura 4.165 Aspecto de Trypanosoma rangeli en gota gruesa.
4.7.4 LEISHMANIA SPP. La leishmaniosis es un grupo de enfermedades causadas por la infeccin por protozoos parsitos del gnero Leishmania. Puede afectar la piel (leishmaniosis cutnea), las membranas mucosas (leishmaniosis mucocutnea) y el sistema retculo endotelial (leishmaniosis visceral o kala-azar). El perodo de incubacin es generalmente de 2 a 6 meses, pero puede variar de 10 das a varios aos. En algunos pacientes con una lesin primaria se forma varios meses antes que aparezcan los otros sntomas. Los amastigotes de Leishmania spp. se multiplican lentamente en los macrfagos cerca del sitio de la inoculacin. Algunos macrfagos infectados entran al torrente sanguneo y llegan a las vsceras, donde los amastigotes se multiplican rpidamente. Clnicamente, las primeras fases de la leishmaniosis visceral se caracterizan por la fiebre crnica irregular, tos, diarrea y sangrado de las membranas mucosas y las infecciones secundarias. Ms tarde, en ocasiones, se produce la ampliacin progresiva del bazo, el hgado y los ganglios linfticos, prdida de peso y, en algunos pacientes, hipopigmentacin en parches de la piel. La leishmaniosis cutnea se caracteriza por lceras en la piel, que pueden ser simples o mltiples. En ciertas formas de leishmaniosis cutnea pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo placas, ppulas o ndulos. Los sntomas clnicos de leishmaniosis pueden ser similares a los encontrados en la esquistosomiasis, paludismo crnico y leucemia crnica. Fuentes de infeccin y modos de transmisin La epidemiologa de la enfermedad tiene caractersticas nicas en cada regin y vara de una zona geogrfica a otra. En las Amricas, la infeccin se transmite a los humanos por la picadura del flebtomo Lutzomyia longipalpis (mosca de la arena). El vector se alimenta de perros, animales salvajes y, con menor frecuencia, los seres humanos; este se puede encontrar tanto en el exterior, en el campo, y el interior de las viviendas. La enfermedad se presenta principalmente en las zonas rurales. En la India, los seres humanos son el reservorio principal. En la cuenca del Mediterrneo y la zona del Golfo, los perros son el principal reservorio y los vectores son diversas especies del gnero Phlebotomus. En el Sudn, se han encontrado roedores salvajes y carnvoros como reservorios. La transmisin puede tener lugar en el interior de las viviendas, que constituyen microfocos de infeccin. El examen del frotis de un corte de piel para el diagnstico de la leishmaniosis cutnea Principio La leishmaniosis cutnea se diagnostica mediante la demostracin de la etapa de amastigote tpica del organismo a partir de frotis de cortes de piel de las lceras.
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Las lceras tpicas de la leishmaniosis cutnea son crteres con un borde levantado. Muestras de cortes de piel se recogen desde el borde de la lcera. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Bistur Gasa Soporte deslizante para portaobjetos Lpiz de diamante Etanol al 70% Metanol Giemsa (reactivo. N 29) Agua tamponada con fosfato, pH 6,8 (reactivo. N 43). Para su uso, diluir el colorante de Giemsa en agua tamponada con fosfato (1 volumen del colorante con 19 volmenes de agua tamponada). Mtodo Coleccin de muestras 1. Limpiar el borde de la lcera con un hisopo empapado en etanol. Usando la gasa comprimir el borde de la lcera tan firmemente como sea posible para presentar un rea sin sangre. 2. Utilice el bistur para realizar una incisin superficial a lo largo del borde de la lcera aproximadamente 0,5 cm de largo y 2-3 mm de profundidad. Sin dejar de apretar, gire el bistur en el lado plano y raspar suavemente la base de la incisin con la punta de la hoja. Recoger las clulas del tejido, pero evitar la extraccin de sangre. 3. Extienda el material recogido desde la punta del bistur sobre un portaobjeto con un movimiento circular para cubrir un rea de 5-7 mm de dimetro. Permitir que el frotis se seque al aire y etiquetar el portaobjeto con un lpiz de diamante. Tincin de frotis 1. Fijar los frotis secados al aire inundando el portaobjeto con metanol durante 2 minutos. 2. Volcar el metanol e inunde el portaobjeto con la tincin de Giemsa diluida durante 20 minutos. 3. Enjuague el portaobjetos en agua tamponada con fosfato y colocarlo boca abajo en un soporte deslizante para portaobjetos para drenar y secar. El examen microscpico Examinar el portaobjetos en el microscopio utilizando el objetivo de inmersin en aceite x100. Los amastigotes de Leishmania spp. pueden encontrarse intracelularmente en las clulas de macrfagos o situados por separado entre las clulas. Miden 2-4 m y tienen un ncleo prominente y un cinetoplasto en forma de bastoncillo (Fig. 4.166). Tanto el ncleo y el cinetoplasto se tien de rojo y el citoplasma se tie de azul plido. Reportar el resultado como "amastigotes de Leishmania spp. Presentes "o" no encontrado".
Figura 4.166 Amastigotes de Leishmania spp.
Prueba del formol gel para la leishmaniosis visceral Esta prueba es un indicador no especfico para el aumento de los niveles sricos de gammaglobulina que se observan en la mayora de pacientes con leishmaniosis visceral. Materiales y reactivos Tubos de ensayo Gradilla Centrfuga Tubos de centrfuga Formalina (formaldehido al 37%). Mtodo 1. Recoger 2-5 ml de sangre en un tubo de centrfuga y permitir que se coagule. 2. Separe el suero por centrifugacin del tubo durante 3 minutos a 5000 g, o al dejar el tubo durante la noche en un frigorfico o en la mesada. 3. Pipetear 1 ml de suero transparente en un tubo de ensayo. 4. Aadir dos o tres gotas de formalina al suero. Permita que el tubo permanezca de pie durante 30 minutos. Resultados Un resultado positivo se muestra por gelificacin del suero: Se convierte en slido y se vuelve blanco, por lo general despus de aproximadamente 5 minutos.
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Un resultado negativo se registra cuando no hay gelificacin o blanqueamiento del suero. Nota: El aumento de las concentraciones de gamma globulina en suero tambin se observan despus de la infeccin con hepatitis B (vase la seccin 11.8) y en ciertas enfermedades malignas, tales como mieloma mltiple y macroglobulinemia de Waldenstrm.
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5. BACTERIOLOGA
5.1 INTRODUCCIN El examen directo de frotis bacterianos generalmente no basta para identificar una especie de bacterias; la identificacin precisa solo se puede lograr por medio de cultivos. Esto pone de relieve la importancia de enviar a los laboratorios de referencia las muestras obtenidas. Sin embargo, el examen microscpico directo de frotis teidos constituye una manera eficiente de estudiar la presencia de bacterias en medios biolgicos que normalmente son estriles, como los lquidos cefalorraqudeo (LCR) y pleural, y en muestras de otros orgenes. Este procedimiento puede aportar informacin sumamente til para el diagnstico, el tratamiento inmediato y el control de una enfermedad. Por ejemplo: en muestras de casos de uretritis masculina en etapa inicial se puede diagnosticar con un grado razonable de seguridad una infeccin por gonococos (en la mujer esto es considerablemente ms difcil) se considera que la microscopa directa de esputo es una tcnica prctica y efectiva para detectar casos infecciosos de tuberculosis y, por lo tanto, es de gran importancia para la epidemiologa. el examen microscpico del lquido cefalorraqudeo, de frotis de ste debidamente teidos y de la morfologa de cualesquiera bacterias que se encuentren en ellos puede ayudar a que se reconozca una meningitis (meningoccica, neumoccica o por M. tuberculosis), tambin los casos de hongos que producen meningitis (vase la seccin 8.3.3). El diagnstico de algunas enfermedades tambin es posible por medio de la serologa; un ejemplo es la sfilis (vase el apartado 11.10). Las tcnicas serolgicas tambin son importantes para la vigilancia epidemiolgica y la deteccin temprana de las enfermedades causadas por bacterias que son difciles de cultivar (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis). 5.2 PREPARACIN Y FIJACIN DE LOS FROTIS 5.2.1 Principio La muestra a ser examinada (pus, esputo, centrifugado orina, LCR, etc.) se prepara como sigue: La muestra se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio. Portaobjetos de vidrio: Previamente antes de proceder bense con una mezcla de etanol y ter y lmpiense con gasa. Se deja secar por completo. Se fija con metanol al 70% o por calentamiento antes de ser teido.
A) Portaobjetos de vidrio: Previamente antes de proceder bense con una mezcla de etanol y ter y lmpiense con gasa.
5.2.2 Materiales y reactivos Asa para siembra: consiste en un alambre (generalmente fabricado con una aleacin de nquel y cromo) que por un extremo se fija a un mango que lo sostiene y por el otro se dobla formando un pequeo crculo. Hgase esta asa utilizando una pinza y cuidando que quede centrada (Fig. 5.1). El tamao del dimetro real del asa deber ser de 2 mm. La muestra se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio. Microscopio Portaobjetos de vidrio Cubreobjetos de vidrio Mechero Bunsen o lmpara de alcohol Metanol al 70%.
Figura 5.1 Fabricacin de un asa de siembra en aro, doblar la punta del asa con una pinza; el crculo deber tener 2 mm de dimetro.
5.2.3 PREPARACION DEL FROTIS 1. Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo: sostenga el asa inmediatamente arriba de la porcin azul de la llama ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como sea posible (Fig. 5.2).
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Djela enfriar (cuente hasta 20). 2. Tome una porcin de la muestra que se va a examinar por si hay pus, colocando el asa en posicin plana en la superficie del lquido (Fig. 5.3). 3. Coloque el asa sobre el portaobjetos y aplnese ligeramente en el centro de ste (el portaobjetos deber estar numerado) (Fig. 5.4). 4. Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjetos muvala trazando una espiral del centro a la periferia (Fig. 5.5). Deje cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. Deje secar la muestra completamente al aire. 5. Repita el paso 1. Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella. A veces se reciben en el laboratorio muestras de procedencia externa sin las marcas correspondientes en los portaobjetos. Para saber en cul lado de un portaobjetos sin marcas se encuentra la muestra: coloque el portaobjetos de manera que refleje la luz que entra por la ventana el lado donde no se halla la muestra brillar el lado donde est la muestra no reflejar la luz.
B C B) Repita el paso 1. Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que se encuentren en ella. C) Para saber en cul lado de un portaobjetos sin marcas se encuentra la muestra: coloque el portaobjetos de manera que refleje la luz que entra por la ventana el lado donde no se halla la muestra brillar el lado donde est la muestra no reflejar la luz. 5.2.4 FIJACIN DE LOS FROTIS Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. Cuando el frotis se ha secado completamente, fijarlo al cubrir el portaobjetos con unas pocas gotas de 70% de metanol durante 2 minutos o pase el portaobjetos tres veces a travs de la llama del mechero Bunsen, con la muestra hacia arriba (Fig. 5.6). El frotis fijado puede ser teido como se describe en la seccin 5.3. Djelo enfriar antes de aplicar la tincin. Algunas veces es til dibujar un crculo alrededor del frotis con un lpiz graso, a fin de que se pueda ver ms fcilmente.
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D Figura 5.6 Pase el portaobjetos tres veces a travs de la llama del mechero Bunsen, con la muestra hacia arriba. D) Algunas veces es til dibujar un crculo alrededor del frotis con un lpiz graso, a fin de que se pueda ver ms fcilmente. 5.3 Tcnicas de tincin 5.3.1 Tincin de Gram La Tincin de Gram permitir que el frotis a ser examinado por microscopa para determinar la presencia de bacterias, clulas de pus, bacilos de Vincent y Candida albicans. Las bacterias comensales, que siempre estn presentes, no son importantes. No necesitan ser considerados para un examen ms detenido o notificado. Ventajas Gracias a la tincin de Gram las bacterias se pueden clasificar en dos grupos: grampositivas, que se tien de morado oscuro gramnegativas, que se tien de color de rosa. Esto hace ms fcil su identificacin. Materiales y reactivos Microscopio Soporte deslizante para portaobjetos Cristal violeta, modificacin de Hucker (reactivo no. 18) Yodo de Lugol, solucin al 0,1% (reactivo no. 36) Decolorante acetona-etanol (reactivo no. 4) Solucin de carbol fucsina para la tincin de Ziehl-Neelsen (reactivo. N 16) (diluido 10 veces con etanol al 95%), rojo neutro, solucin de 0,1% (reactivo N 40) o una solucin de safranina (reactivo N 47). Agua corriente. Principio El cristal violeta tie a todas las bacterias de color violeta oscuro (Fig. 5.7). El Solucin de yodo fija el color violeta ms o menos fuertemente en la bacteria (fig. 5.8). Etanol al 95%: -Decolora ciertas bacterias cuando el cristal violeta no est fuertemente fijado por la solucin de yodo (Fig. 5.9 (a)); -No decolorar otras bacterias cuando el cristal violeta est fuertemente fijado por la solucin de yodo (figura 5.9 (b)). La carbolfucsina, rojo neutro o una solucin de safranina (rosa): - Vuelve a teir (rosa) a las bacterias decoloradas por el etanol (Fig. 5.10 (a)) - No tiene ningn efecto sobre las otras bacterias, que permanecen de color violeta oscuro (Fig. 5.10 (b)). TCNICA 1. Fije el frotis (como se describe en la seccin 5.2.4) y djelo enfriar. 2. Cristal de violeta: 1 minuto Vierta el cristal de violeta en el portaobjetos. Extindalo por el portaobjetos completamente. Djelo reposar 1 minuto. Enjuguelo con agua corriente y djelo escurrir. 3. Solucin de yodo de Gram: 1 minuto Bae el portaobjetos con solucin de yodo de Gram y djelo reposar un minuto. Escurra la solucin y enjuague el portaobjetos con agua corriente. 4. Etanol a l 95%: 1 minuto Bae completamente el portaobjetos. Djelo reposar 1 minuto. Enjuague con agua corriente y djelo escurrir. Examine el frotis: si quedan algunas zonas de color violeta aplique nuevamente etanol durante 15 - 30 segundos. Enjuguelo bien con agua y escrralo. Otra opcin es decolorar la solucin de yodo rpidamente con acetona etanol. Slo se necesitan 2 a 3 segundos. 5. Solucin de safranina: 10 segundos. Vierta la solucin de safranina en el portaobjetos y djela reposar 10 segundos. En seguida lvela con agua, brevemente. Pngase a escurrir y djela secar al aire libre.
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Otra opcin es cubrir el frotis con carbolfucsina durante 2 minutos. 6. Lavar el frotis con agua limpia y coloque el portaobjetos en posicin vertical en un soporte para portaobjetos para escurrir y secar al aire. SE DEBERAN BUSCAR: Bacterias = teidas de violeta oscuro, o grampositivas, como estafilococos, estreptococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de la difteria y bacilos del ntrax. Bacterias = teidas de color de rosa, o gramnegativas, como gonococos, meningococos, bacilos coliformes, shigelas, salmonelas o vibriones del clera.
En las figuras siguientes se indican los pasos de la tincin y el aspecto de las bacterias. Las designadas con la letra (a) corresponden a las Gram negativas y las que aparecen con la letra (b) a las Gram positivas. Figura 5.7 Reaccin de tincin Gram: Tincin con violeta cristal a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. Figura 5.8 Reaccin de tincin Gram: Fijacin con yodo a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Grampositivas. Figura 5.9 Reaccin de tincin Gram: Decoloracin con etanol a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. Figura 5.10 Reaccin de tincin Gram: Tincin con carbolfucsina, rojo neutro o una solucin de safranina a: las bacterias Gram-negativas; b: las bacterias Gram-positivas. B
A D
C TCNICA: Primero fije el frotis y djelo enfriar (como se describe en la seccin 5.2.4). A) cristal de violeta: 1 minuto. Vierta el cristal de violeta en el portaobjetos. Extindalo por el portaobjetos completamente. Djelo reposar 1 minuto. Enjuguelo con agua corriente y djelo escurrir. B) Solucin de
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yodo de Gram: 1 minuto. Bae el portaobjetos con solucin de yodo de Gram y djelo reposar un minuto. Escurra la solucin y enjuague el portaobjetos con agua corriente. C) Etanol al 95%: 1 minuto. Bae completamente el portaobjetos. Djelo reposar 1 minuto. Enjuague con agua corriente y djelo escurrir. Otra opcin es usar acetona etanol. Slo se necesitan 2 a 3 segundos. D) Solucin de safranina 10 segundos. Vierta la solucin de safranina en el portaobjetos y djela reposar 10 segundos. Enseguida lvela con agua, brevemente. Pngase a escurrir y djela secar al aire libre. Otra opcin es cubrir el frotis con carbolfucsina durante 2 minutos.
Foto que muestra las bacterias Gram positivas teidas de prpura o violeta a la izquierda y a las Gram negativas a la derecha teidas de rosado rojo. Foto de la derecha: Imagen microscpica de una bacteria Gram Negativa Pseudomonas aeruginosa (los puntos rosas-rojos).
Bacterias Gram-positivas Bacillus anthracis (bastones prpuras) en una muestra de fluido cerebroespinal. Las otras clulas son leucocitos.
CAUSAS DE ERROR Puede ocurrir una reaccin gram positiva falsa porque: el frotis se ha fijado antes de que estuviera seco el frotis ha sido demasiado grueso quedaron sedimentos en el frasco de cristal de violeta (fltrese antes de usarlo) la solucin de yodo de Gram no se escurri completamente no se dej que el etanol actuara suficiente tiempo la solucin de safranina fue demasiado fuerte o se dej demasiado tiempo en el portaobjetos. Puede ocurrir una reaccin gramnegativa falsa porque: no se dej actuar suficiente tiempo la solucin de yodo de Gram el etanol (o acetato etanol) se dej demasiado tiempo en el portaobjetos y no se lav adecuadamente. Examen microscpico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para ver cmo se distribuye el frotis y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100. Microorganismos Gram-positivos Aparecen microorganismos Gram-positivos de color prpura oscuro (fig. 5.11) (por ejemplo, estafilococos, estreptococos, micrococos, neumococos, enterococos, bacilos de la difteria, bacilos del ntrax). Microorganismos Gram-negativos Aparecen microorganismos Gram-negativos de color rojo o fucsia (Fig. 5.12) (por ejemplo, gonococos, meningococos, bacilos coliformes, Shigella, Salmonella, Vibrio clera). Identificacin de microorganismos especficos Candida albicans aparece tan grande (2-4 m de dimetro) en formas ovales o como esporos Gram positivos redondos (clulas brotadas o con blastosporos) (Fig. 5.13 (a)) con filamentos semejantes a un micelio de longitud variable con extremos redondeados (seudomicelios o seudohifas) (Fig. 5.13 (b)). Los "Actinomicetos" son vistos como grnulos grandes, a veces visibles a simple vista (color de blanco a amarillo). El centro es Gram-negativo, con una periferia grampositiva (Fig. 5.14). Se encuentran en la piel de pus, esputo, etc. Los bacilos de Vincent son vistos como espiroquetas Gram-negativas y bastoncillos fusiformes (Fig. 5.15). Ninguna otra bacteria debera ser informada, debido a que hay muchas bacterias comensales que pueden ser confundidas con agentes patgenos.
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Figura 5.12 Microorganismos Gram-negativos Figura 5.11 Microorganismos Gram-positivos
5.3.2 TINCIN CON COLORANTE DE ALBERT (para la deteccin de Corynebacterium diphtheriae) Si se sospecha de difteria un frotis de esputo debe ser teido con el colorante de Albert. Este colorante se utiliza para mostrar los grnulos volutin teidos de oscuro que aparecen en los bacilos de Corynebacterium diphtheriae (ver Fig. 5.16). Materiales y reactivos Microscopio Soporte para portaobjetos Colorante de Albert (reactivo. N 7). Mtodo 1. Fije el frotis como se describe en la seccin 5.2.4. 2. Cubrir el frotis con tincin de Albert durante 3-5 minutos. 3. Lavar la tincin con agua limpia y coloque el portaobjetos en posicin vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. El examen microscpico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para ver cmo se distribuye el frotis y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100. Corynebacterium diphtheriae aparece como bastoncillos verdes (fig. 5.16) que contienen grnulos volutin verde-negro. Los bastoncillos pueden estar dispuestos en filas (a) o en formacin en V (b), o unidas en ngulos, dando la apariencia de los caracteres chinos (c). La presencia de bastoncillos delgados que contienen grnulos volutin es prueba suficiente para iniciar el tratamiento de la difteria. Si se sospecha de difteria, una muestra debe ser enviada al laboratorio de bacteriologa para la el cultivo (vase la seccin 5.4.4).
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Figura 5.16 Corynebacterium diphtheriae Los bastoncillos de C. diphtheriae pueden estar dispuestos en filas (a) o en formacin en V (b) o unidas en ngulo, dando la apariencia de los caracteres chinos (c).
Corynebacterium diphtheriae teidos con coloracin de Albert. 5.3.3 TINCIN CON ZIEHL-NEELSEN (PARA LA DETECCIN DE BACILOS CIDOALCOHOL RESISTENTES) El Ziehl-Neelsen se utiliza para identificar micobacterias y ooquistes de Cryptosporidium spp. (Ver seccin 4.3.2). Principio Cuando las micobacterias y los ooquistes de Cryptosporidium spp. se tien con una solucin fuerte caliente de carbolfucsina, se resisten a la decoloracin con una solucin de cido o cido-etanol y se tien de rojo. Otros microorganismos y los tejidos se decoloran por la solucin de cido-etanol y se ponen de manifiesto por una tincin de contraste como el azul de metileno, que se tie de azul. Mycobacterium leprae and ooquistes de Cryptosporidium spp. slo resistir la decoloracin con soluciones dbiles de cido o cido-etanol. Ellos se ponen de manifiesto mediante la tcnica de Ziehl-Neelsen modificada (Tabla 5.1). Mycobacterium spp. y ooquistes de Cryptosporidium spp. se conocen como "ACIDFast" debido a su resistencia a la decoloracin con solucin de cido. Ellos no se tien bien con manchas de tincin de Gram o simples como el azul de metileno. Mycobacterium leprae y los ooquistes de Cryptosporidium spp. slo resisten la decoloracin con soluciones dbiles de cido o cido-etanol. Ellos se ponen de manifiesto mediante la tcnica de Ziehl-Neelsen modificada (Tabla 5.1). Mycobacterium spp. y los ooquistes de Cryptosporidium spp. se conocen como cido Alcohol Resistentes debido a su resistencia a la decoloracin con solucin de cido. Ellos no se tien bien con los colorantes de la tincin de Gram o colorantes simples como el azul de metileno. Materiales y reactivos Microscopio Lmpara de alcohol o mechero Bunsen Soporte para portaobjetos Pinzas Solucin de carbolfucsina para la tincin Ziehl-Neelsen (reactivo. N 16) (filtrada antes de su uso) cido-etanol de Ziehl-Neelsen (reactivo. N 5) El verde de malaquita, solucin al 1% (vase el reactivo no. 31), se diluy 1:1 con agua destilada, o con solucin de azul de metileno (reactivo no. 39). Portaobjetos de vidrio (si es posible, nuevos, que no estn rayados) Asa para siembra Taco de algodn colocado en un alambre para flamear Temporizador Mtodo 1. Fije el frotis como se describe en la seccin 5.2.4.
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2. Cubrir el frotis con el colorante filtrado carbolfucsina. Usando pinzas, calentar suavemente el portaobjetos sobre una lmpara de alcohol o mechero Bunsen hasta que el colorante comience a evaporarse (a aproximadamente 60 C-no recalentar). 3. Dejar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos. 4. Lavar el colorante con agua limpia y cubra el frotis con cido-etanol durante 5 minutos o hasta que el frotis sea de color rosa plido. 5. Lavar bien el portaobjetos en agua limpia y cubrir el frotis de verde malaquita o azul de metileno durante 1-2 minutos. 6. Lavar la tincin con agua limpia y coloque el portaobjetos en posicin vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. No seque el frotis (con papel secante u otro material). El examen microscpico Examinar el portaobjetos bajo el microscopio, primero use el objetivo de x40 para ver cmo se distribuye el frotis. A continuacin, examinar sistemticamente el frotis con el objetivo de inmersin en aceite x100 para buscar bacilos cido-alcohol resistentes (bacilos rojos). Examinar el portaobjetos de extremo a extremo en pasos hasta que todo el frotis est cubierto. Cuente el nmero de bacilos cido-alcohol resistentes presentes por campo microscpico (o por 100 campos microscpicos, si muy pocos bacilos cido-alcohol resistentes estn presentes). Antes de pasar a otro portaobjeto, limpie el objetivo con papel para lentes para evitar la transferencia de bacilos cido-alcohol resistentes a otro portaobjeto. Si se pueden ver bacilos rojos, informar como "bacilos cido-alcohol resistentes presentes". Informe el nmero de bacilos cido-alcohol resistentes presentes como se describe en la Tabla 5.2. Si no se ven bacilos cido-alcohol resistentes, informar como "no se encontraron bacilos cidoalcohol resistentes". Tabla 5.1 Microorganismos teidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen Muestra Microorganismo Esputo M. tuberculosis M. bovis Piel M. leprae M. ulcerans Orina M. tuberculosis M. bovis Materia fecal Cryptosporidium spp. Lavado gstrico M. tuberculosis M. bovis Tabla 5.2 Informar sobre el nmero de bacilos cido-alcohol resistentes presentes Nmero de bacilos cido-alcohol resistentes Resultado presentes por campo de microscopio Especifique el nmero presente por cada 100 < 0,1 (< 10 por 100 campos) campos 0,1-1 (10-100 por 100 campos) + 1-10 ++ > 10 +++
AGREGADO:
Se muestra una variante de la tcnica de Ziehl Neelsen, es decir una variante significara no una modificacin establecida pero si una forma para realizar la misma tcnica de tincin. La tcnica que se describe ms adelante se basa en: Smithwick, R.W. Laboratory manual for acid -fast microscopy, 2a. ed., Atlanta, Secretara de Salud y Servicios Humanos de los EUA, Centros para el Control de Enfermedades, 1976. Vase tambin: Unin Internacional contra la Tuberculosis, Technical guide for collection, storage and transport of sputum specimens and examination for tuberculosis by direct microscopy, Pars IUAT, 1976. El bacilo de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los cidos y se tie de rojo con la coloracin de Ziehl y Neelsen, en tanto que casi todos los dems microorganismos se tien de azul. Recoleccin del esputo La calidad de la muestra es sumamente importante; vase antes, donde figura el mtodo de recoleccin para exmenes directos, y si la muestra se debe enviar a otro laboratorio para realizar un cultivo. MATERIALES Portaobjetos de vidrio (si es posible, nuevos, que no estn rayados) Asa para siembra Taco de algodn colocado en un alambre para flamear Temporizador con alarma Microscopio Lmpara de alcohol o mechero Bunsen Soporte para portaobjetos Pinzas REACTIVOS Fucsina fenicada para tincin de Ziehl y Neelsen Mezcla de cido y etanol Azul de metileno acuoso Alcohol metlico (para quemar) Frasco de lavado con agua destilada
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PREPARACION DEL FROTIS DE ESPUTO 1. Prepare dos portaobjetos. Tome una porcin purulenta del esputo para cada portaobjetos, usando un asa estril para siembra o dos asas, para hacer una tenaza. 2. Haga los frotis: tan delgados como sea posible de manera que abarquen el rea ms extensa que se pueda, trazando con el asa crculos concntricos bien separados, aunque sin llegar a las orillas del portaobjetos. Importante: Cuando haya terminado de preparar los frotis sumerja las asas para siembra en un antisptico lquido y sacdalas dentro para quitar los residuos de esputo. A continuacin coloque las asas junto a la llama, espere a que se sequen y, acto seguido, las pasa a travs de sta. As se evitar que el esputo infectado se disemine en el aire al exponerlo a la llama. 3. Fijacin Deje secar los frotis al aire y enseguida los fija pasando los portaobjetos tres veces a travs de la llama. 4. Numere los portaobjetos y colquelos a travs de dos varillas de vidrio sobre el fregadero. 5. Tincin con fucsina fenicada: 5 minutos al calor Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada, que deber filtrarse antes de usarla. Moje el taco de algodn con alcohol metlico, encindalo y psese lentamente por debajo de los portaobjetos para calentarlos. 6. Tan pronto como los portaobjetos comiencen a emanar vapor ponga el cronmetro a marcar 5 minutos. Siga calentando durante 5 minutos de modo que se vea el vapor, aunque sin llegar al punto de ebullicin. Si la fucsina filtrada comienza a secarse durante este calentamiento aada cierta cantidad inmediatamente para evitar que se seque por completo. 7. Lavado con agua destilada Deje enfriar los portaobjetos. A continuacin lvelos suavemente con agua hasta que ste no arrastre color alguno. 8. Decoloracin con la mezcla de cido y etanol Cbranse los portaobjetos con la mezcla de cido y etanol. Djense reposar 3 minutos. Lvense con agua corriente y escrranse. Examnense; si se han decolorado completamente tanse con azul de metileno como se indica ms adelante, en el punto 10. Si an se pueden apreciar residuos de fucsina (en frotis gruesos) aplique nuevamente cido con etanol y djelo reposar 1 minuto. 9. Lavado con agua Compruebe que los portaobjetos se decoloran completamente. 10. Tincin con azul de metileno: 30 segundos Cubra los portaobjetos con este colorante. Djelos reposar 30 segundos. Lvelos con agua corriente durante 1 minuto. Escrralos y djelos secar en una gradilla para portaobjetos. EXAMEN DE LAS PREPARACIONES Utilice el objetivo de inmersin en aceite. Los bacilos de la tuberculosis: son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul tienen forma recta o ligeramente curva son muy pequeos (1 - 4 m) son frecuentemente granulosos se disponen en grupos de 3 - 10 bacilos que semejan trozos de hilo o parecen formar letras torcidas (con frecuencia se encuentran cerca de los hilos de fibrina). En lugar de la solucin de azul de metileno se puede emplear una solucin de verde de malaquita al 0,2% en agua destilada. El procedimiento es Igual. El verde de malaquita tie de este color el fondo del campo; los bacilos se tien de rojo. No se confundan con bacilos de la tuberculosis: 1. Las levaduras, que se tien ms o menos de rojo. Al calentarlas frecuentemente se rompen y forman conglomerados de grnulos voluminosos de color rojo. 2. Manchas de colorante (cuando el portaobjetos no se ha decolorado adecuadamente). Importante: Otro bacilo patgeno resistente a los cidos es el causante de la lepra (vase la pgina 262). En la naturaleza, Incluso el agua corriente, se suelen encontrar diversos bacilos que son ms o menos resistentes a los cidos. Algunas veces provocan resultados Incorrectos en el laboratorio.
A A) Bacilos tuberculosos. B) 1) Levaduras; 2) Manchas de colorante. CMO EXAMINAR LAS PREPARACIONES
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Haga un examen completo del primer portaobjetos empleando el objetivo de inmersin en aceite (con iluminacin mxima y sin filtro de color), procediendo como se indica en la figura. Portaobjetos positivo Una vez que se hayan examinado aproximadamente 10 bacilos resistentes a los cidos en el primer portaobjetos, examine el segundo para confirmar este resultado. Portaobjetos negativo Examine el primer portaobjetos minuciosamente (10 minutos) y a continuacin haga lo mismo con el segundo portaobjetos (10 minutos).
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K J TCNICA: A) Materiales y reactivos. B) Preparacin del frotis de esputo. C) Haga los frotis lo ms delgados posibles trazando con el asa crculos concntricos bien separados, aunque sin llegar a las orillas del portaobjetos. Figura 5.6 Fijacin del frotis a la llama con el lado de la muestra hacia arriba. D) Numere los portaobjetos y colquelos a travs de dos varillas de vidrio sobre el fregadero. E) Tincin con fucsina fenicada: 5 minutos al calor. Cubra los portaobjetos con fucsina fenicada. F) Moje el taco de algodn con alcohol metlico, encindalo y psese lentamente por debajo de los portaobjetos para calentarlos. Tan pronto como los portaobjetos comiencen a emanar vapor ponga el cronmetro a marcar 5 minutos. Siga calentando durante 5 minutos de modo que se vea el vapor, aunque sin llegar al punto de ebullicin. G) Lavado con agua destilada hasta que no quede color alguno. H) Decoloracin con la mezcla de cido y etanol. Cbranse los portaobjetos con la mezcla de cido y etanol. Djense reposar 3 minutos. Lvense con agua corriente y escrranse. I) Lavado con agua corriente. Compruebe decoloracin completa. J) Tincin con azul de m etileno: 30 segundos. Luego de esto Lvelos con agua corriente durante 1 minuto. Escrralos y djelos secar en una gradilla para portaobjetos. K) Cmo examinar las preparaciones: con objetivo x100 en aceite de inmersin, proceda como se indica en la figura. Mtodo de los Centros para el Control de Enfermedades y la OMS, en: Smithwick, R.W. Laboratory manual for acid-fast microscopy, 2a. ed., Atlanta, Secretara de Salud y Servicios Humanos de los EUA, Centros para el Control de Enfermedades, 1976 Resumen Principio del mtodo de tincin de ziehl y neelsen El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano es Mycobacterium tuberculosis: tipo humano tipo bovino y aviario (raro). Estos bacilos son resistentes a los cidos; es decir, una vez que se han teido de rojo con fucsina fenicada no se pueden decolorar por medio de cidos o etanol.
Fucsina fenicada: tie de rojo todos los microorganismos que se encuentran en el esputo.
Mezcla de cido y etanol: decolora todos los microorganismos y elementos celulares, exceptuando los bacilos resistentes a los cidos (bacilos de la tuberculosis). NO BAAR BAAR Azul de metileno: tie de azul todos los microorganismos y elementos decolorados por la mezcla de cido y etanol, pero los bacilos acidorresistentes se conservan teidos de rojo. NO BAAR BAAR BAAR: Bacilos cido Alcohol Resistentes. Otros microorganismos patgenos que se encuentran en el esputo Invariablemente se necesitan cultivos para identificar estos microorganismos. Sin embargo, la presencia de algunas especies se puede sospechar en los exmenes directos (con tincin de Gram). (a) Neumococos: Son diplococos grampositivos. Cada par se encuentra rodeado por una cpsula que se conserva incolora. (b) Hongos: Son levaduras o filamentos de micelio provistos de esporas o sin ellas. Pueden ser patgenos (es necesario que se haga su identificacin en un laboratorio especializado) o saprofitas que se han multiplicado en la muestra despus de obtenerla. (c) Actinomicetos (grnulos)
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Asimismo es posible encontrar parsitos en las preparaciones sin tincin; por ejemplo, huevos del distoma pulmonar y, muy raras veces, huevos de esquistosomas y Syngamus.
a) Neumococos; b) Hongos.
Visualizacin de Mycobacterium tuberculosis usando la tincin de Ziehl-Neelsen.
Fuente: www.telmeds.org Panam PESTE: BSQUEDA DE BACILOS Principio Para confirmar que existe un caso de peste infecciosa se requiere que se aisl e identifique el bacilo causante, Yersinia pestis. Con frecuencia, durante las epidemias o epizootias es posible elaborar un diagnstico por presuncin basado en la presencia de bacilos de la peste, que se colorean caractersticamente por su forma bipolar con la tincin de Wayson (reactivo No 63) en muestras obtenidas de bubas por aspiracin. Obtencin de las muestras Materiales Una jeringa de 10 ml 20 ml con aguja de calibre 18 (1,2 mm) o calibre 19 (1,0 - 1,1 mm) Tintura de yodo Etanol al 70% Solucin de cloruro sdico Portaobjetos de vidrio. Mtodo Esto slo puede ser realizado por un mdico con experiencia ya que hay riesgo de infeccin. En todo caso siempre es bueno conocer como se realiza la obtencin de la muestra y la manipulacin y descarte de sta. 1. Desinfecte la piel de la buba con tintura de yodo. 2. Aspire con la aguja y la jeringa algunos ml (metros de solucin de cloruro sdico. 3. Sosteniendo la jeringa entre el ndice y el pulgar de la
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mano derecha introduzca la aguja en la buba. 4. Con la mano izquierda tire lentamente del mbolo de la jeringa. Deber entrar en sta un lquido que puede ser sanguinolento. En el caso de que no entre lquido alguno en la jeringa inyecte la solucin de cloruro sdico en la buba, empuje suavemente el mbolo con el pulgar. Imprmase a la aguja introducida en la buba un movimiento circular. A continuacin tire nuevamente del mbolo hasta que se llene, si es posible, la mitad de la jeringa. 5. Retire la jeringa y limpie con una pieza de algodn impregnada de etanol el sitio donde se hizo la puncin. 6. Sostenga la jeringa en posicin vertical, con la aguja hacia abajo, y deje que escurran por sta una o dos gotas sobre un portaobjetos para preparar un frotis como se indica en la pgina 232. 7. Si el lquido de la buba se va a enviar a un laboratorio especializado para realizar cultivos se debern depositar algunos mililitros en medio de transporte de Cary y Blair y despachar el frasco, con la tapa enroscada hermticamente, en un empaque doble. 8. Sumerja la jeringa y la aguja en fenol al 5%, extrayendo suavemente el mbolo (vase la pgina en cuanto al desecho de los materiales infectados). Importante: Al manejar el material extrado de las bubas se debe tener sumo cuidado para evitar que se dispersen en el aire gotas minsculas que pueden causar accidentalmente la infeccin de otras personas y la propagacin de la peste neumnica. 5.3.4 TINCIN CON EL COLORANTE DE WAYSON (PARA LA DETECCIN DE YERSINIA PESTIS) La tincin con el colorante de Wayson se utiliza para identificar Yersinia pestis en aspirados de bubas (ver seccin 5.10). Materiales y reactivos Microscopio Soporte deslizante para portaobjetos 70% metanol Colorante de Wayson (reactivo. N 63). Mtodo Fijacin 1. Fije el frotis con metanol durante 2 minutos. Tambin, puede proceder de esta forma: Coloque durante 5 minutos los frotis, que se habrn dejado secar previamente al aire, en una cubeta para tincin llena con metanol qumicamente puro. Luego saque los portaobjetos de la cubeta y djelos secar al aire antes de proceder a teirlos. Tincin 2. Despus de haberlos fijado de la manera descrita, cubra los frotis con colorante de Wayson durante 10 -20 segundos (promedio 15 segundos). 3. Lavar el portaobjetos en agua limpia y colocarlo en posicin vertical en un soporte deslizante para portaobjetos y secado al aire. El examen microscpico En primer lugar examinar el portaobjeto con el objetivo x40 para comprobar la distribucin del material y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100 observando las porciones delgadas de los frotis teidos en busca de los bacilos caractersticos de la peste. Yersinia pestis aparece como organismos bipolares que se tien de azul con los extremos de color rosa. Es decir, en otras palabras, con el colorante de Wayson los cuerpos polares de Y. pestis se tien de azul y el resto del frotis toma un color rojizo.
C D A) Fijacin con metanol. B) Saque los portaobjetos de la cubeta y djelos secar al aire antes de proceder a teirlos. C) Cubra los frotis con colorante de Wayson durante 15 segundos. D) Lave los portaobjetos cuidadosamente con agua corriente.
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Bacteria bipolar, cuerpos polares teidos
B A) Tincin de Wayson en Yersinia pestis. Note la caracterstica apariencia de alfiler de seguridad de bacteria. B) Las tinciones bipolares obscuras de Yersinia pestis pueden observarse claramente en esta fotomicrografa de sangre de una vctima de plaga (Tincin de Wright). Fuente: http://pathmicro.med.sc.edu/spanish/chapter17.htm CDC 5.3.5 TINCIN CON AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (PARA LA DETECCIN DE BACILLUS ANTHRACIS) Azul de metileno de Loeffler se usa para teir el Bacillus anthracis, que causa ntrax (ver seccin 5.11). Nota: El ntrax es una enfermedad altamente contagiosa. Por lo tanto, deben ser utilizados los guantes y ropa protectora cuando los especmenes sospechosos de estar infectados con ntrax son manejados. El procedimiento de tincin debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad. Materiales y reactivos Microscopio Soporte para portaobjetos Permanganato de potasio, solucin al 4% (reactivo no. 46) Azul de metileno de Loeffler (reactivo. N 35). Mtodo 1. Cubrir el portaobjetos con permanganato de potasio durante 10 minutos. 2. Lavar el portaobjetos en agua limpia y cubra el frotis con azul de metileno de Loeffler durante 1 minuto. 3. Lavar el frotis con agua limpia y coloque el portaobjetos en posicin vertical en un soporte para portaobjetos deslizante para escurrir y secar al aire. Examen microscpico En primer lugar examinar el frotis con el objetivo de x40 y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100. Los bacilos de Bacillus anthracis aparecen como grandes bacilos azules rodeados por una cpsula de color purpreo o prpura plido azulado, los bacilos aparecen en cadenas (Fig. 5.17).
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A Figura 5.7 Bacillus anthracis. A) Bacillus anthracis, tincin con azul de metileno de un frotis de tejido, observado con gran aumento. Ntese la intensa coloracin roja o prpura de la gran cpsula de este microorganismo y el gran nmero de bacterias. La demostracin de la cpsula distingue al B. anthracis de la contaminacin postmortem por un Clostridium. Fuente: http://www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/anthrax/overview_of_anthrax.html 5.4 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ESPUTO Y FROTIS DE GARGANTA La presencia de microorganismos patgenos se pone de manifiesto mediante el examen microscpico de muestras de esputo e hisopados de garganta. Los microorganismos incluyen: Las bacterias: Bacilos cido-alcohol resistentes Gram-positivas y Gram-negativas. Los hongos o levaduras: Filamentos de micelio con o sin poros. Ellos pueden ser patgenos o saprfitos que se han multiplicado en la muestra despus de la recogida (Es necesaria la identificacin correcta por parte de un laboratorio especializado). Actinomicetos: Grnulos (vase antes). Los parsitos: Huevos de trematodos pulmonares y, muy raramente, huevos de esquistosomas y los gusanos adultos de Mammomonogamus laryngeus. El cultivo es a menudo necesario para la identificacin de los agentes infecciosos. 5.4.1 Materiales y Reactivos Microscopio Portaobjetos Contenedores a prueba de fugas para las muestras de esputo, de cuello ancho, como frascos o cajas de papel rgido (vase la seccin 2.5.5) Hisopos estriles de algodn Depresor lingual (abatelenguas) o esptula Tubos de ensayo Cristales de cloruro de sodio N-cloruro de cetilpiridinio Agua destilada. Reactivos para elaborar la tincin de Gram Si es posible, los hisopos de algodn estriles deben ser preparados en un laboratorio de nivel central, de lo contrario, la siguiente tcnica se puede utilizar. 1. Preparar unos palos delgados de madera (o alambre de aluminio), de 18 cm de largo y 2 mm de dimetro. Prepare tiras de lana de algodn, de 6 cm de largo por 3 cm de ancho y tan delgado como sea posible. 2. Enrolle la ronda de algodn en un extremo de la barra (o cable). 3. Moldee el hisopo en una forma cnica. 4. Colocar en un tubo de ensayo de vidrio. Taponar los tubos con tapones de algodn no absorbente. Esterilizar (ver seccin 3.5.5). 5.4.2 Mtodo Coleccin de muestras Muestras de esputo Obtencin de la muestra Las muestras de esputo deben recogerse temprano en la maana. La enfermera o el tcnico de laboratorio debern estar presentes y se emplear el procedimiento siguiente: 1. Si es posible, el paciente deber estar de pie. 2. Har un movimiento inspiratorio sumamente profundo, llenando de aire los pulmones. 3. Vaciar los pulmones con una sola aspiracin, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda (Fig. 5.18). 4. Escupir en el interior del tarro para muestras el material que haya expectorado. 5. Asegure la parte superior del tarro y coloque una etiqueta en el tarro, en que se lean claramente el nombre o nmero del paciente y la fecha (ver seccin 3.7.1). Verifique que se haya producido una cantidad suficiente de esputo. Tarros y cajas para recolectar esputo Para recolectar muestras en el sitio donde se encuentre el paciente emplense tarros que se puedan usar nuevamente o cajas de papel rgido fabricadas en el propio laboratorio (vase antes). Para la limpieza y desinfeccin de los receptculos vase antes.
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En la actualidad, se pueden conseguir en los comercios o bien proveer a los laboratorios perifricos por parte del Ministerio de Salud Pblica de cada pas, frascos estriles de plstico, seguros, bien protegidos con envoltorios que son fabricados para este tipo de recoleccin de esputo, o bien, frascos estriles de plstico adaptados para la recogida de este material y tambin que sirven para recoger otros materiales biolgicos. Estos frascos estriles de plstico son desechables y de un solo uso, lo que facilita su descarte y evita manipular el frasco para su reutilizacin ahorrando tiempo y prescindiendo cualquier posible contacto con material infeccioso. Despus de obtener la muestra Compruebe que se ha recogido una cantidad suficiente de esputo. El esputo de un individuo infectado suele contener: moco denso con burbujas hilos de fibrina porciones de pus algunas vetas de sangre. Importante: La saliva espumosa lquida y las secreciones nasales y farngeas no son expectoraciones aceptables para el examen bacteriolgico. Debe obtenerse otra muestra del esputo del paciente.
C D
E A) El tcnico o enfermera, si es posible, deben pedirle al paciente que se ponga de pie (vase flecha). Esto facilitar la recoleccin del esputo. B) El paciente debe hacer un movimiento inspiratorio sumamente profundo, llenando de aire los pulmones (flecha). C) El paciente debe vaciar los pulmones con una sola aspiracin, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda (vea los movimientos de la cabeza en la ilustracin). D) El paciente debe escupir en el interior del tarro para muestras el material que haya expectorado. E) Tape el frasco y coloque una etiqueta en el tarro, en que se lean claramente el nombre o nmero del paciente y la fecha. Remisin del esputo Si la muestra se va a enviar a un laboratorio para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis (vase la seccin 5.4.4), pida al paciente que expectore directamente en un frasco de boca ancha, con tapa de rosca que contiene 25 ml de la siguiente solucin (medio de transporte lquido): Cloruro de N-cetilpiridinio 5 g Cloruro de sodio 10 g Agua destilada hasta 1000 ml. En este caso, el paciente deber expectorar directamente en el lquido contenido en el frasco (es decir, el medio de transporte lquido). Atornille la tapa y efecte la remisin de la muestra. Esta preparacin se conserva por lo menos durante 10 das.
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B A A) Medio de transporte lquido en un frasco de boca ancha y tapa a rosca. B) El paciente deber expectorar directamente en el lquido contenido en el frasco. Atornille la tapa y efecte la remisin de la muestra. El diagnstico de tuberculosis pulmonar tambin se puede hacer por: 1. Examen directo (y cultivo) de lquidos obtenidos por lavado del estmago (especialmente en nios): Centrifguense estos lquidos a alta velocidad durante 20 minutos, hgase un frotis con el sedimento y tase del mismo modo que el esputo. 2. Cultivo de exudados larngeos. Para investigar otros sitios de infeccin se intenta detectar los bacilos en: 1. La orina (tuberculosis renal); 2. El pus de abscesos cerrados (tuberculosis sea). 3. El lquido cefalorraqudeo (meningitis tuberculosa, especialmente en nios); 4. Lquidos aspirados de glndulas. No se recomienda examinar heces fecales en busca de bacilos de la tuberculosis. MUESTRAS OBTENIDAS EN LA GARGANTA Ventajas Los exmenes microscpicos de frotis teidos que se han preparado con muestras obtenidas en la garganta proporcionan a veces indicios de los microorganismos que causan una infeccin. Para determinar con certeza la identidad de estos microorganismos se necesita efectuar cultivos bacterianos. OBTENCIN DE LA MUESTRA Idealmente la obtencin de la muestra la debera efectuar un mdico o una enfermera capacitada, aunque es posible que se solicite al tcnico del laboratorio que lo haga. 1. El paciente debe permanecer sentado frente a la luz (se puede usar tambin una linterna elctrica). 2. Indique al paciente que abra la boca sin sacar la lengua y diga "Ahhhh...". Mire cuidadosamente en busca de signos de inflamacin y cualquier exudado, pus, depsitos membranosos o lceras. 3. Mientras el paciente dice "Ahhhh", deprima los 2/3 anteriores de la lengua con el abatelenguas, empleando la mano izquierda (Fig. 5.19). De este modo se deber poder observar las amgdalas (A) y el fondo de la faringe enmarcado por los pilares (P). 4. Introduzca el hisopo estril con la mano derecha. Evite tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismos. Tenga cuidado de no contaminar el hisopo con la saliva. Devolver el hisopo para el tubo de ensayo estril. 5. Localice la porcin infectada (inflamada) de la garganta. Estar sumamente enrojecida o blanca, dependiendo del caso. Por lo general la infeccin se descubrir en las amgdalas o las fauces. 6. Frote el hisopo con firmeza en la parte inflamada, hacindolo girar y, si existen membranas, recjalas con el hisopo. 7. Si no se encuentran anormalidades pase el hisopo por las amgdalas, las fauces y la parte posterior del paladar blando. Preparacin de los frotis Frote el hisopo sobre 2 3 portaobjetos hacindolo girar al mismo tiempo para formar frotis amplios y suficientemente gruesos. Prepare dos frotis de cada una de las muestras (vase la seccin 5.2.3). Teir un frotis con tincin de Albert (ver seccin 5.3.2) y el otro con Ziehl-Neelsen (ver seccin 5.3.3). Si el material obtenido se va a sembrar en un medio de cultivo o se va a enviar sembrado en un medio de transporte, tome dos muestras: la primera, para los medios de cultivo o transporte la segunda, para preparar frotis que se examinarn directamente.
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A) Materiales necesarios. Figura 5.19 Examinar la parte posterior de la garganta. A: Amgdalas; P: Pilares. B) Frote el hisopo sobre 2 3 portaobjetos hacindolo girar al mismo tiempo para formar frotis amplios y suficientemente gruesos. B
5.4.3 EXAMEN MICROSCPICO Examine el esputo con el ojo desnudo y luego por microscopa. El esputo de una persona que sufre de una infeccin bacteriana generalmente contiene: Mucosidad espesa con burbujas de aire -Hilos de fibrina -Placas de pus -Rayas de color marrn ocasionales de sangre. Despus de la inspeccin visual de informar la apariencia del esputo como: -Purulento verdoso, que contienen pus; -Mucopurulento: verdoso, que contiene tanto pus y moco; -Mucoide: contiene principalmente mucus; -Mucosalival: moco que contiene una pequea cantidad de saliva. Si hay sangre, esto tambin debe ser informado. Una muestra de esputo compuesto en su mayora de la saliva no ser til ya sea para el cultivo o para el examen directo. Examinar la tincin con la tincin de Albert como se describe en la seccin 5.3.2. Si se ven las barras verdes que contienen grnulos volutin negro - verduzcos (ver fig. 5.16), informar como "Corynebacterium diphtheriae presente". Examinar el frotis teido con Ziehl-Neelsen como se describe en la seccin 5.3.3. Si se pueden ver bacilos rojos, informar como "bacilos cido-alcohol resistentes presentes". Informe el nmero de bacilos cido-alcohol resistentes presentes como se describe en la Tabla 5.2. Si no se ven bacilos cido-alcohol resistentes, informar como "sin bacilos cido-alcohol resistentes encontrados". 5.4.4 ENVO DE MUESTRAS PARA CULTIVO1 Muestras de esputo 1Vase tambin la seccin 3.7.1. Los Especmenes de esputo se envan a un laboratorio de bacteriologa para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis, para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana y la inoculacin en cobayos. La muestra debe ser recogida en un medio de transporte, tal como se describe en la seccin 5.4.2 y enviado de inmediato al laboratorio. Tiempo de conservacin mximo: 10 das. Muestras de garganta Para la investigacin de rutina Tan pronto como se haya recogido la muestra, reemplace el hisopo en el tubo de ensayo estril (vase la seccin 5.4.2) y envelo inmediatamente al laboratorio de bacteriologa. Para la confirmacin de la infeccin por Corynebacterium diphtheriae Si se sospecha de difteria, la muestra debe ser enviada en un tubo estril con suero coagulado (que se deben almacenar en un refrigerador). Frote el hisopo sobre la superficie inclinada del suero, comenzando a partir de la parte inferior del tubo y no aplicar presin (fig. 5.20). Enve el mismo da. Tiempo de conservacin mximo: 24 horas. Para la deteccin de meningococos
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Esto rara vez es necesario, excepto para los estudios epidemiolgicos dirigidos a identificar a los portadores de meningococos. Si es posible, utilice un medio de transporte como el medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N 56). Frote el hisopo sobre la superficie del medio de un lado del tubo al otro, comenzando a partir de la parte inferior del tubo (fig. 5.21). Enva el mismo da. Tiempo de conservacin mximo: 3 das.
Figura 5.20 Despacho muestras farngeas en suero coagulado Figura 5.21 Envo de muestras de garganta en medio de transporte de Stuart GONORREA El gonococo, Neisseria gonorrhoeae, es el causante de la gonorrea, una enfermedad de transmisin sexual sumamente frecuente. Su trmino de Incubacin es de 4 - 8 das. Exudado genitourinario Pus amarillo y denso: gonococos? Lquido claro, blanquecino: Trichomonas* Exudado blanco y denso: hongos?* Otros tipos de exudado: uretritis inespecfica (no identificable por examen directo). * Vase lo relativo a Trichomonas y los hongos en la pgina correspondiente. Principio Los frotis de pus uretral toman la tincin de Gram. Los gonococos se pueden reconocer por tres caractersticas: 1. Son diplococos (se agrupan en pares) 2. Son gramnegativos 3. Son intracelulares (se hallan dentro de los leucocitos).
Leucocito con diplococos gramnegativos intracelulares.
5.5 EXAMEN DE MUESTRAS UROGENITALES PARA LA GONORREA 5.5.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Frasco, 100 ml Pipeta Pasteur Algodn Medio de transporte Amies (reactivo. N 9). Asa de siembra 5.5.2 Mtodo Coleccin de muestras Obtencin de muestras de los pacientes varones 1. Si es posible, tmese la muestra a primera hora de la maana, antes de que el paciente haya orinado. Cuando sea necesario lmpiese el meato con un hisopo de algodn humedecido con solucin de cloruro sdico estril. 2. Aplquese al pene una ligera presin, de manera que salga una gota de pus por el meato, si no aparece pus, masajear suavemente la uretra desde arriba hacia abajo. 3. Tmese el pus con asa estril para siembra o directamente en un portaobjetos limpio. 4. Si la gota de pus no aparece, introdzcase el asa estril en el conducto uretral, hasta una profundidad de 2,5 cm aproximadamente para obtener la muestra. 5. Se recoge una muestra del pus con un hisopo de algodn estril con palo largo (ver seccin 5.4.1). Inserte el hisopo en un pequeo frasco con medio de transporte Amies. Corte la porcin excedente de la varilla del hisopo con tijeras estriles (flameadas) esto es para que la parte
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superior pueda ser descartada y permita cerrar hermticamente el frasco (Fig. 5.22). Luego enrosque la tapa en el frasco inmediatamente. 5. Utilice otro hisopo para recoger una gota de pus para la tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1). Nota: Se puede utilizar el asa estril para siembra para recoger el pus o usar un hisopo de algodn estril de palo largo. El asa de siembra debe estar estril pero No al rojo vivo!, es decir, previamente esterilizada con calor y luego dejada enfriar para que est apta para recoger la muestra de pus o cuando se quiera introducir en el conducto uretral. Muchas veces no se tiene un hisopo estril comercial, entonces se usa el asa de siembra. En la actualidad ya se dispone de asas de siembra en punta y en aro desechables de plstico de poliestireno estriles muy tiles como para estos casos. La disponibilidad en varios pases es todava incierta, dado que no se sabe su difusin para uso en centros de salud complejos y en los laboratorios perifricos de los pases latinoamericanos, asiticos y africanos. Estas asas descartables de plstico son seguras como para recoger las muestras de pus del meato urinario o para introducirlas en el conducto uretral ya que no deben ser previamente flameadas en mechero y son descartables, de un solo uso, seguras y prcticas. Usadas tambin para la inoculacin de medios de cultivo. El material muy flexible permite una aplicacin suave sin daar la superficie del medio de cultivo. fabricados de poliestireno con lazo en una extremidad y aguja (punta) en la otra o con aro solo y asa en punta sola esterilizadas por radiacin gamma desechables en bolsitas de 20 piezas, 50 bolsitas por cartn
Fuente: http://www.ictsl.net/productos/plastico/asasdesiembraplasticoesterilessterilin.html www.marienfeld-superior.com El uso del hisopo estril facilita la recogida y es a menudo ms prctico para colocar el hisopo en un medio de transporte como el de Amies as el contenido extrado con este hisopo luego es cultivado en medios de cultivo especiales. Se usa otro hisopo para sacar material y colocarlo en un portaobjetos limpio en el cual se efectuar la tincin de Gram. 6. Prepare dos frotis: tan finos como sea posible que abarquen la mayor extensin que se pueda en el portaobjetos.
B A A) Obtencin de muestras del varn. Aplquese al pene una ligera presin, de manera que salga una gota de pus
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por el meato. Tmese el pus con asa estril para siembra o directamente en un portaobjetos limpio. Tambin se puede usar un hisopo de algodn estril para recoger la gota de pus del meato. B) Prepare dos frotis: tan finos como sea posible y que abarquen la mayor extensin que se pueda en el portaobjetos.
Figura 5.22 Transferencia de una muestra urogenital a un medio de transporte Amies. Se observa adems, el corte con una tijera del palo sobrante as queda en el frasco del medio de transporte el hisopo con un pedazo pequeo del palo, este frasco debe ser tapado de inmediato.
Obtencin de muestras en la mujer La muestra debe ser tomada del conducto cervical por un mdico o una enfermera especialista. En los casos de gonorrea crnica se deber tomar inmediatamente antes o inmediatamente despus del periodo menstrual. GONOCOCOS: EXAMEN DIRECTO DEL PUS URETRAL Preparacin de los frotis Preparar un frotis de cada uno de los especmenes. Deje que los frotis se sequen al aire y luego se tien con la tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1). Prepare dos frotis: tan finos como sea posible que abarquen la mayor extensin que se pueda en el portaobjetos. 5.5.3 Examen microscpico El examen directo es de gran valor para el diagnstico de la gonorrea en el hombre; en la mujer su utilidad es considerablemente menor. Por lo tanto, el cultivo es necesario para aislar e identificar los gonococos en muestras obtenidas de mujeres. Examine los portaobjetos utilizando el objetivo de inmersin en aceite x100. Preste atencin especial a las orillas del frotis, donde los elementos se extienden en una capa ms delgada, son ms fciles de reconocer y la tincin se concentra menos. Pus: (Observe si hay numerosas acumulaciones de leucocitos degenerados. Los ncleos son de color rosa fuerte y el citoplasma es incoloro.) Gonococos: Ovales, con formas que semejan riones, gramnegativos (color rosa plido) agrupados en pares. Gonococos intracelulares: Aglomerados dentro del citoplasma de los leucocitos (1). (Fig. 5.23, 1) Gonococos extracelulares: Agrupados en racimos entre leucocitos o cerca de leucocitos rotos (2). (Fig. 5.23, 2) Informar como: - Diplococos Gram-negativos intracelulares presentes; - Diplococos Gram-negativos extracelulares presente; -No se encontraron diplococos Gram-negativos.
Figura 5.23 Clulas de pus y gonococos 1: Gonococos intracelulares, 2: Gonococos extracelulares. Tambin se seala el citoplasma y el ncleo de un leucocito.
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Frotis 1. Neisseria gonorrhoeae Esta tincin de Gram del exudado uretral revela varios diplococos gramnegativos en numerosos neutrfilos. Cuando los diplococos gram-negativos estn slo fuera de los neutrfilos, los cultivos de muestras de varones, usualmente son positivos para Neisseria gonorrhoeae; en las muestras de secreciones cervicales, sin embargo, un predominio de los organismos extracelulares indica que muchos de ellos son especies de Neisseria no patgenas en lugar de N. gonorrhoeae. Observar los crculos. Fuente. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/3089-examination-of-gram-stains-of-cervical-andurethral-discharges
En la fotomicrografa se muestran diplococos intracelulares de N. gonorrhoeae en leucocitos y extracelulares (crculos). Fuente: www.seimc.org
Evaluacin de resultados del examen bacteriolgico directo del pus uretral Posibles casos encontrados en un frotis teido: Abundantes leucocitos. Abundantes leucocitos. Abundantes leucocitos. Escasos eritrocitos. Escasos eritrocitos. Escasos eritrocitos. Escasas clulas epiteliales. Escasas clulas epiteliales. Escasas clulas epiteliales. Cantidad moderada de No se observan diplococos No se observan diplococos diplococos intracelulares intracelulares gramnegativos. intracelulares gramnegativos. gramnegativos. Escasos diplococos No se observan diplococos extracelulares gramnegativos. extracelulares gramnegativos. CONCLUSIN Gonococos: positivo. Gonococos: sospechoso. Gonococos: negativo. Otras bacterias que causan infecciones uretrales En el hombre Ocasionalmente se observan en frotis de pus uretral diversas cantidades de: Cocos grampositivos (por Ej.: estafilococos) Bacilos grampositivos (por Ej.: difteroides) Bacilos gramnegativos (por Ej.: bacilos coliformes). Estos microorganismos se describen en la seccin 5.3.1. Nunca se haga un examen directo en busca de gonococos en un frotis de sedimento urinario. En la mujer Se suele encontrar toda clase de microorganismos en los frotis de la mujer, particularmente: Bacilos grampositivos Cocos gramnegativos (saprfitos). Por esta razn el cultivo es esencial. 5.5.4 Envo de muestras para cultivo1 Uso de medio de transporte de Stuart
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El envo de la muestra en medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N 56) es el mejor mtodo, si el medio se puede obtener en un laboratorio especializado. Por lo general se suministra en frascos planos (semejantes a tubos largos) de 30 ml que contienen 8 ml de medio slido (ubicado a lo largo de un lado del frasco, es decir, inclinado) y esta rellenados con una mezcla de aire (90%) y dixido de carbono (10%). Tambin se pueden usar alternativamente frascos redondos. El frasco debe permanecer abierto durante el menor tiempo posible para evitar el escape de gas. Nota: Por conveniencia, este medio se suele suministrar en frascos planos, aunque tambin se pueden emplear frascos redondos como el que figura en la ilustracin. 1Vase tambin la seccin 3.7.1. Mtodo 1. Coloque el frasco del medio de transporte en posicin vertical. Recoger la muestra de pus con un hisopo de algodn sostenido con una pinza estril (flameada), como se describe en la seccin 5.5.2. Desenrosque la tapa del frasco. 2. Sosteniendo el frasco lo ms vertical posible (para evitar que el gas se escape), frotar el hisopo de pus sobre toda la superficie del medio slido, de un lado del frasco al otro, a partir de la parte inferior (vase la fig. 5.22). Es decir, hisope desde el fondo siguiendo un camino en zigzag haciendo estras. 3. Vuelva a colocar el tapn del frasco de inmediato. Enve el frasco (a temperatura ambiente) inmediatamente. Tiempo mximo de conservacin: 3 das. Sin embargo, es conveniente que se enve cuanto antes. Es decir, es mejor cuanto ms corta sea la demora. Este medio de transporte tambin es adecuado para los meningococos.
E A) Frasco con el medio de transporte de Stuart. Por conveniencia, este medio se suele suministrar en frascos planos, aunque tambin se pueden emplear frascos redondos como el que figura en la ilustracin A. B) Recoger la muestra de pus con un hisopo de algodn sostenido con una pinza estril (flameada). C) Coloque el frasco en posicin vertical. Recoja la muestra de pus con un hisopo de algodn. Desenrosque la tapa del frasco. D) Sosteniendo el frasco tan verticalmente como sea posible (para evitar que escape el gas) frote el hisopo con pus en toda la superficie del medio slido, de un extremo del frasco al otro, comenzando por el fondo (estriado). Figura 5.22 Transferencia de una muestra urogenital a un medio de transporte de Stuart. Se observa adems, el corte con una tijera del palo sobrante as queda en el frasco del medio de transporte el hisopo con un pedazo pequeo del palo, este frasco debe ser tapado de inmediato. E) Coloque la tapa en el frasco Inmediatamente. Enve el frasco, a la temperatura ambiente.
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Figura 5.24 Remisin de muestras urogenitales en una pipeta

Pasteur.
5.6 EL EXAMEN DE MUESTRAS GENITALES DE LA SFILIS La sfilis es una infeccin de transmisin sexual causada por el Treponema pallidum y se produce en tres etapas clnicas. El periodo de incubacin es, aproximadamente, un mes. Al cumplirse el periodo de incubacin suele aparecer el primer signo de la enfermedad, generalmente en los rganos genitales: un chancro redondo u ovalado, de 1 - 2 cm de dimetro, rojo, con bordes endurecidos La etapa primaria se caracteriza por una lcera genital indolora (chancro sifiltico), a veces con inflamacin de los ganglios linfticos en ciertas regiones del cuerpo. El chancro cura espontneamente, incluso sin tratamiento. En algunos pacientes, la enfermedad progresa a la etapa secundaria. La etapa secundaria resulta en: -Erupciones en la piel -lceras de la boca -Verrugas genitales -Agrandamiento generalizado de los ganglios linfticos. La etapa terciaria es muy rara y se caracteriza por la afectacin del sistema nervioso central y las enfermedades cardacas. La sfilis secundaria o terciaria puede ser transmitida a un feto en el tero (sfilis congnita). Pian El pian o frambesia es causado por un treponema no venreo (Treponema pertenue) y ocurre en los climas tropicales hmedos. Se caracteriza por papilomas granulares en la piel. T. pallidum y T. pertenue son espiroquetas delicadas, fuertemente enrolladas miden 6-12 m x 0,2 m. Ambos son indistinguibles bajo el microscopio. Es necesario inspeccionar las muestras sospechosas de estar infectadas con espiroquetas por microscopa de campo oscuro, ya que no se tien fcilmente para su visualizacin con luz transmitida. 5.6.1 Materiales y reactivos Microscopio con accesorio de campo oscuro Portaobjetos Cubreobjetos Guantes Gasa Lanceta estril o un bistur cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). 5.6.2 Mtodo Coleccin de muestras Este examen se puede llevar a cabo solo por personal experto, en un laboratorio provisto de un microscopio con condensador para campo oscuro. El examen carece de valor si el paciente ha tratado la lesin con algn ungento. En este caso se deben esperar tres das para efectuar el examen. Importante: Use guantes protectores para este procedimiento. El rea del chancro debe estar libre de cualquier pomada antes de tratar de recoger las muestras. 1. Recoger la muestra del chancro con una gasa humedecida con solucin de cloruro de sodio. 2. Si no hay lquido seroso obvio, raspar suavemente el borde de la lcera con una lanceta estril o el borde plano de una hoja de bistur (fig. 5.25). No extraer la sangre. 3. Comprimir la lcera suavemente con una gasa. 4. Usando un cubreobjetos, se recoge una gota del exudado seroso y se invierte inmediatamente en un portaobjeto. Tambin se puede hacer lo siguiente: Retire la gasa y espere durante unos
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minutos a que aparezca un lquido seroso de color rosceo. Asprese ese lquido con una pipeta de Pasteur provista de una perilla de goma. 5. Deposite una gota del lquido en un portaobjetos de vidrio delgado (del tipo fabricado especialmente para microscopa en campo oscuro).
A) Limpie el chancro con gasa humedecida en solucin estril de cloruro sdico; squelo bien. Figura 5.25 La toma de una muestra de chancro. Raspe los bordes del chancro varias veces con la hojilla de una lanceta estril colocada en posicin plana. Evite provocar la salida de sangre. B) Presione con gasa estril seca. Comprimir la lcera suavemente con una gasa. C) Retire la gasa y espere durante unos minutos a que aparezca un lquido seroso de color rosceo. Asprese ese lquido con una pipeta de Pasteur provista de una perilla de goma. D) Deposite una gota de lquido en un portaobjetos de vidrio delgado (del tipo fabricado especialmente para microscopa en campo oscuro). Figura 5.26 Observacin de los treponemas en microscopio de campo oscuro. Examnese con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas de la sfilis y la frambesia (Pian) se podrn distinguir de los treponemas saprfitos de la piel por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos caractersticos. 5.6.3 Examen Microscpico Examnese el portaobjetos con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas de la sfilis y la frambesia se podrn distinguir de los treponemas saprofitas de la piel por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos caractersticos y el nmero tpico de espirales (fig. 5.26). El tcnico de laboratorio necesitar capacitacin especial para reconocerlos. Examen de frotis secos y teidos
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No se recomienda este procedimiento, ya que en la piel y las membranas mucosas suelen existir treponemas saprofitas. 5.7 EXAMEN DE MUESTRAS DE SEMEN El Semen es investigado en pacientes para excluir la infertilidad. Esto se realiza mediante la evaluacin de las caractersticas funcionales de los espermatozoides en el lquido seminal. 5.7.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta de Sahli para Sangre Probeta graduada, 10 ml Papel indicador de pH Cmara de recuento Neubauer mejorada Bicarbonato de sodio Fenol o formalina (formaldehdo al 37%) Agua destilada Vaselina. Antes de la recogida de la muestra de semen, preparar el lquido diluyente para semen de la siguiente manera: -Bicarbonato de sodio 5 g -Fenol o formalina 1 ml Agua destilada hasta 100 ml. 5.7.2 Mtodo Coleccin de muestras El semen es recogido por el paciente en un frasco limpio y seco y se lleva al laboratorio tan pronto como sea posible despus de la recoleccin, de preferencia dentro de los 30 minutos. No puede ser examinado inmediatamente como semen es un fluido muy viscoso y debe "licuar o hacer licuefaccin". Esta labor se realiza en 15 a 30 minutos y se debe examinar a la mayor brevedad posible, una vez haya tenido lugar licuefaccin. La muestra de semen debe ser colectada mediante masturbacin y nunca recoger en un profilctico o practicar sexo antes de recolectar la muestra. Preparacin de los portaobjetos Despus que la licuefaccin ha tenido lugar, hacer un frotis del semen en un portaobjetos (similar a un frotis de sangre), deje que se seque al aire y luego se calienta muy suavemente para fijar. Retire el moco (lo que puede interferir con la tincin) mediante lavado del portaobjeto con lquido diluyente para semen (vase ms arriba). A continuacin, lavar el portaobjetos suavemente con agua destilada tamponada. Teir el esperma con tincin de Leishman o tincin de Giemsa (ver seccin 9.10.3, ms adelante). 5.7.3 El examen macroscpico Volumen Medir el volumen en una pequea probeta graduada, la cantidad vara de slo unas pocas gotas hasta 10 ml. El volumen normal es de 4-5 ml. Menos de 1,5 ml se considera anormal. Viscosidad El Semen recin eyaculado debe estar completamente licuado dentro de los 30 minutos. La Ausencia de licuefaccin puede interferir con la motilidad del esperma y la fertilizacin. Color El semen es normalmente de un color gris opaco. Despus de un largo periodo de abstinencia de la actividad sexual puede parecer ligeramente amarillo. pH El pH se observa por lo general, aunque es de poca importancia. El semen es siempre alcalino; con un pH medio de aproximadamente 7,6 (rango de 7,02 a 8,09). 5.7.4 Examen Microscpico Los espermatozoides normales tienen de 50-70 m de longitud, con una gran cabeza ovalada, un pequeo cuello y una cola larga y delgada; la cola representa aproximadamente el 90% de la longitud total (fig. 5.27). La cabeza es de 3 a 6 m x 2-3 m Las alteraciones de la morfologa que se buscan incluyen: -Cabezas de forma anormal (Fig. 5.28); - cabezas de tamao Anormalmente gigantes o diminutas (Fig. 5.29); -Dobles cabezas (Fig. 5.30); - Colas en espiral o enrolladas (Fig. 5.31); - Cuellos ausentes, bifurcados o aumentados (hinchados) (seccin central) (Fig. 5.32); - Colas dobles, rudimentarias o ausentes (Fig. 5.33). En una prueba normal, no debe haber ms de 20% de formas anormales. Durante el examen de semen se toma en cuenta la presencia de otras clulas, tales como: -Eritrocitos; -Leucocitos polimorfonucleares; -Clulas epiteliales; -Clulas inmaduras de los testculos, etc. Varios cristales tambin pueden ser vistos; su presencia tambin debe tenerse en cuenta. Motilidad
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Para comprobar la motilidad, coloque una gota de semen en un portaobjetos, cubra la gota con un cubreobjetos y el borde de la punta con vaselina para evitar la evaporacin. Examinar bajo el objetivo del microscopio x40. Calcule aproximadamente la proporcin de espermatozoides mviles a formas no mviles en varios campos microscpicos diferentes. Normalmente alrededor del 80% de los espermatozoides son activamente mviles y aproximadamente 20% son lentos o no se mueven en absoluto. Observe el portaobjeto despus de 3 y 6 horas, y si lo estima conveniente, tambin despus de 12 y 24 horas. Para un mximo de 3 horas no debe haber poca o ninguna reduccin en la motilidad, y despus de esto hay una creciente prdida de la movilidad, que a temperatura ambiente se completa a menudo por 12 horas. La disminucin de la motilidad de los espermatozoides puede ser un factor en la infertilidad. El conteo de espermatozoides 1. Despus que la licuefaccin ha ocurrido, agite suavemente la muestra para mezclar. 2. Usando una pipeta de Sahli, extraer el semen hasta la marca de 0,5 l y, a continuacin aspirar en el lquido diluyente para semen hasta la marca de 11 l y colocar la pipeta en un rotador para mezclar el contenido. 3. Cargar en una cmara de recuento de Neubauer mejorada (ver fig. 9.40), permitir que el esperma se asiente y luego contar en las cuatro esquinas, como un recuento de leucocitos (vase la seccin 9.6.3). La frmula para el clculo es similar a la utilizada para los leucocitos, excepto que el recuento de esperma es por ml en lugar de por mm3, por lo que es necesario un factor de multiplicacin adicional de 1000. n 10 20 1000 Nmero de espermatoz oides / ml 4 Donde n = nmero de espermatozoides contados. El recuento normal de esperma est entre 60 millones y 150 millones por ml (100-500 millones/ml, segn algunas fuentes). Los pacientes con recuentos de espermatozoides inferiores a 60 millones por ml definitivamente tienen recuentos bajos, a pesar que todava pueden ser frtiles.
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Figura 5.27 Espermatozoide normal. Figura 5.28 Espermatozoide con una cabeza de forma anormal. Figura 5.29 Espermatozoide con una cabeza anormalmente pequea. Figura 5.30 Espermatozoide con doble cabeza. Figura 5.31 Espermatozoide con la cola enrollada. Figura 5.32 Espermatozoide con el cuello hinchado. Figura 5.33 Espermatozoide con colas dobles o rudimentarias. Fuente: Image House Medical, Sperm MORPH system. Usado con permiso.
5.8 EXAMEN DE LA SECRECIN VAGINAL
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El flujo vaginal es examinado por microscopa para excluir infecciones por gonococos, Candida albicans y Trichomonas vaginalis, que causan la vaginosis bacteriana, la candidiasis vulvovaginal y la tricomoniasis, respectivamente. 5.8.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). 5.8.2 Mtodo Coleccin de muestras La muestra debe ser recogida por un mdico o enfermera especialista. Preparacin de los portaobjetos 1. Hacer un frotis del flujo vaginal en un portaobjetos y dejar que se seque al aire. Teir el frotis con tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1) y examinar para Candida albicans. 2. Transferir una pequea muestra de la secrecin vaginal a un segundo portaobjetos, aadir una gota de solucin salina y cubra con un cubreobjetos. Busque gonococos y trofozotos de Trichomonas vaginalis en esta preparacin. 5.8.3 Examen microscpico Examinar el portaobjetos con tincin de Gram con el objetivo x40 y el objetivo de inmersin en aceite x100. Candida albicans aparece como grandes levaduras Gram-positivas, a menudo con brotacin o con filamentos cortos de micelio (ver fig. 5.13). Examine la preparacin salina tan pronto como sea posible con los objetivos x10 y x40. Utilice un microscopio con el diafragma cerrado para dar un buen contraste. No permita que la muestra se seque. Los gonococos son Gram-negativos y aparecen como pequeos puntos (ver fig. 5.12). Los trofozotos de Trichomonas vaginalis aparecen como flagelados muy mviles, miden de 8-20 m, con una membrana ondulante y un ncleo prominente.
5.9 EL EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE HECES ACUOSAS Microscopa de campo oscuro se utiliza para identificar a Vibrio cholerae y Campylobacter spp. en las muestras de heces acuosas. 5.9.1 Materiales y reactivos Microscopio con accesorio de campo oscuro Portaobjetos Cubreobjetos Asa de siembra cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). 5.9.2 Mtodo 1. Suspender 0,2 g de heces en 5 ml de solucin de cloruro de sodio. Permitir que las partculas grandes sedimenten. 2. Mediante el uso de un asa de inoculacin (esterilizada por flameado), preparar un frotis muy delgado sobre un portaobjetos. Retire con cuidado cualquier partcula grande. 3. Cubrir con un cubreobjetos. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. 4. Abra el diafragma iris totalmente y coloque el accesorio de campo oscuro en su posicin. 5.9.3 El examen microscpico Utilice el objetivo x10 para el enfoque. El fondo aparece en negro, y todos los objetos en suspensin en la solucin salina aparecen ms brillantes. Usa el objetivo x40 para buscar bacterias con formas caractersticas y motilidad (ver ms abajo). El Vibrio cholerae aparece como bastoncillos mviles, que pueden ser cortos, curvos, rectos o involutivos (fig. 5.34). Campylobacter spp. son bastoncillos espirales Gram-negativos que giran rpidamente sobre un eje central. 5.9.4 Envo de muestras para cultivo1 A menudo es necesario el envo de muestras de heces a un laboratorio de bacteriologa para su cultivo: -Para la deteccin de vibriones del clera -Para la deteccin de otras bacterias que causan disentera (especies de Salmonella, Shigella, etc.) Se puede utilizar para ambos propsitos la misma forma de transporte, en el medio de Cary y Blair 1 Vase tambin la seccin 3.7.1.
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Uso del medio de transporte de Cary-Blair El medio de transporte de Cary-Blair (reactivo N 17) conservar muchos tipos de bacterias entricas (vibriones del clera, otros vibriones, salmonella, shigella, etc.) hasta un mximo de 4 semanas. El medio inoculado se puede almacenar en un frasco sellado a temperatura ambiente durante 8-12 semanas. 1. Sumerja un hisopo de algodn estril en la muestra de heces fecales (Fig. 5.35). 2. Para los bebs, nios u otros pacientes que no pueden producir una muestra de heces, tome un hisopo rectal. Humedecer el hisopo con una solucin de cloruro de sodio e introducir el hisopo en el recto. Gire el hisopo dentro del recto varias veces con un movimiento circular (Fig. 5.36). 3. Coloque el hisopo en un frasco con medio de Cary-Blair (tres cuartos de su capacidad) y enviarlo al laboratorio de bacteriologa. Si usted no puede enviar el hisopo inmediatamente, gurdelo a temperatura ambiente. Importante: No guarde nunca el hisopo en la incubadora. No guarde nunca el hisopo en el refrigerador. Uso de solucin salina tamponada de glicerol. Cuando se deben enviar a otros laboratorios muestras para efectuar cultivos de microorganismos entricos, aparte de vibriones del clera, y no se dispone del medio de transporte de Cary y Blair, se puede emplear solucin salina amortiguada de glicerol (reactivo No. 14). Nota: Si en su pequeo frasco la solucin salina amortiguada de glicerol cambia de color de rosa al amarillo, deschese y preprese una solucin fresca. 1. Se recomienda utilizar un frasco pequeo, con capacidad para 7,5 ml. Llnese hasta 2 cm de distancia de la boca con solucin salina tamponada de glicerol. 2. Deposite en este medio de transporte el hisopo que se ha introducido en las heces fecales o en el recto y envese directamente al laboratorio bacteriolgico.
A B Figura 5.34 Aspecto de Vibrio cholerae al microscopio. Figura 5.35 Toma de una muestra de heces acuosas. Sumerja un hisopo de algodn estril en la muestra de heces fecales. Figura 5.36 Toma de una muestra de heces de un beb. En el caso de nios u otros pacientes que no hayan presentado esta muestra, obtngala directamente introduciendo en el recto un hisopo, previamente embebido en solucin de cloruro sdico, y una vez que el hisopo est dentro del recto hgalo girar varias veces. A) Deposite el hisopo en un frasco que contenga medio de
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Cary y Blair (hasta 3/4 de su capacidad). B) Nunca guarde la preparacin en la incubadora o en el frigorfico.
C) Tincin de Gram. Microscopa ptica. 1000 aumentos. V. cholerae se presenta como tpicos bacilos pequeos, curvados o no, Gram negativos. Fuente: www.microbe-edu.org
C 5.10 EXAMEN DE ASPIRADOS, EXUDADOS Y DERRAMES Los aspirados, los exudados y los derrames son recogidos mediante la insercin de una aguja estril en la cavidad apropiada. Esto slo puede ser realizado por un mdico con experiencia ya que hay un riesgo de introducir infeccin. Las cavidades de la cual se pueden recoger los derrames son las siguientes: -Pleural (pecho) -Peritoneal (abdominal) -Pericrdica -Sinovial -Bolsa (Bursa). Los aspirados de los bubas se examinan para Yersinia pestis, que causa la peste bubnica. El microorganismo es transportado desde los sitios de inoculacin a los ganglios linfticos en las axilas, la ingle y el cuello, lo que provoca inflamaciones localizadas o bubas. 5.10.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Centrfuga Tubos de centrfuga Recipientes de muestras (ver seccin 3.7) Asa de siembra Metanol al 70% Reactivos para: -Giemsa (ver seccin 9.10.3) -Tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1) -Tincin de Wayson (vase la seccin 5.3.4) -Ziehl-Neelsen (ver seccin 5.3.3). 5.10.2 Mtodo Coleccin de muestras Fluido aspirado de una cavidad El fluido aspirado de una cavidad se recoge en recipientes estriles, limpios y secos. Informe la aparicin del fluido. El fluido de una cavidad es normalmente de color pajizo (amarillo), pero puede aparecer turbio o manchado con sangre. Preparacin de los portaobjetos Fluido aspirado de una cavidad 1. Usando una tcnica asptica (estril), transferir 10 ml del fluido a un tubo de centrfuga y se centrifuga a una velocidad moderada (2000g) por varios minutos. 2. Eliminar el sobrenadante, resuspender el depsito y use un asa de inoculacin (esterilizada con un mechero) para preparar tres frotis. Extienda el lquido finamente sobre cada portaobjetos (ver seccin 5.2.3). 3. Permitir que los frotis se sequen al aire y fijar con metanol. 4. Teir los frotis con: -Tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1) -Ziehl-Neelsen (vase la seccin 5.3.3) -Tincin de Giemsa (ver seccin 9.10.3). Aspirados de bubas 1. Preparar un frotis del aspirado de lquido como se describe en la seccin 5.2.3. 2. Fije el frotis con metanol durante 2 minutos y se tie con la coloracin de Wayson (ver seccin 5.3.4). 5.10.3 Examen microscpico Fluido aspirado de una cavidad Examine cada frotis con el objetivo de x40 y el objetivo de inmersin en aceite x100. Busque cualquier bacteria presente en los portaobjetos teidos con la tincin de Gram.
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Busque bacilos cido-alcohol resistentes (micobacterias) en el portaobjetos teido con ZiehlNeelsen. Al examinar el portaobjetos teido con tincin de Giemsa, identificar el tipo predominante de clula de la sangre presentes: leucocitos, linfocitos o clulas mesoteliales (provenientes del revestimiento de la cavidad) y la presencia de clulas atpicas, que pueden sugerir clulas cancerosas. Si hay ms de unas pocas clulas presentes o si el lquido est manchado con sangre, enviar el portaobjetos a un laboratorio de bacteriologa para su cultivo. Aspirados de bubas En primer lugar examinar el portaobjetos con el objetivo x40 para comprobar la distribucin del material y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100 para buscar Yersinia pestis. Yersinia pestis es observado como microorganismos bipolares que se tien de azul con los extremos de color rosa. 5.11 EXAMEN DE PUS DE BACILLUS ANTHRACIS El Bacillus anthracis es un patgeno de varios tipos de animales. Es responsable del ntrax cutneo donde se muestra en su forma temprana como una ampolla en la piel que a menudo es llamado pstula maligna. 5.11.1 Materiales y reactivos Ropa de proteccin Guantes Microscopio Portaobjetos Asa de siembra o hisopos de algodn estriles (vase la seccin 5.4.1) Azul de metileno de Loeffler (reactivo no. 35) Permanganato de potasio, solucin al 4% (reactivo. N 46). 5.11.2 Mtodo Coleccin de muestras Advertencia: El ntrax es altamente contagioso. Por lo tanto, los guantes y ropa de proteccin deben ser usados cuando se recogen muestras. Mediante el uso de un asa de inoculacin o un hisopo de algodn, recoger unas pocas gotas de pus o lquido de las pstulas malignas. Deje que el frotis se seque al aire en una cabina de seguridad. Preparacin de los portaobjetos 1. Preparar un frotis de pus o lquido como se describe en el apartado 5.2.3. 2. Fije el frotis con permanganato de potasio durante 10 minutos, y luego se tie con azul de metileno de Loeffler (ver seccin 5.3.5). 5.11.3 Examen microscpico En primer lugar examinar el frotis con el objetivo x40 para comprobar la distribucin del material y luego usar el objetivo de inmersin en aceite x100 para buscar Bacillus anthracis. Bacillus anthracis es visto como grandes bacilos azules rodeados por una cpsula de color purpreo; los bacilos se disponen en cadenas (vase la figura 5.17.). LEPRA 5.12 EL EXAMEN DE FROTIS DE PIEL Y RASPADOS NASALES PARA MYCOBACTERIUM LEPRAE La lepra o enfermedad de Hansen es una infeccin de los tejidos nerviosos perifricos producida por la bacteria Mycobacterium leprae tambin llamada bacilo de Hansen. Los bacilos pueden estar presentes en un gran nmero en las lesiones lepromatosas (multibacilar), pero generalmente es muy escaso o no se observa en las lesiones tuberculoides (lepra paucibacilar). Desde el punto de vista teraputico la lepra se clasifica en paucibacilar y multibacilar. Paucibacilar: Se define en pacientes sin bacilos demostrados desde un punto de vista histopatolgico. El diagnstico se realiza mediante el examen de los frotis de la piel de cortes tomados de diferentes sitios en el cuerpo, o a partir de raspados nasales tomados desde el tabique de la nariz. Despus de la fijacin, los frotis se tien con el mtodo de Ziehl-Neelsen modificado. Los frotis de piel de los cortes se recogen normalmente de seis sitios, que se eligen de las reas donde los nervios se encuentran cerca de la superficie de la piel. Estos sitios deben incluir ndulos o manchas en la cara o el cuerpo. 5.12.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Bistur Si es posible, una pinza de puntas romas, sin dientes, o una pinza curva sin dientes, o una pinza para tejidos Lpiz de diamante Gasa Pequeas hojas de plstico o guantes Hisopos estriles de algodn (vase la seccin 5.4.1) Lmpara de alcohol o mechero de Bunsen Reactivos para la tincin de Ziehl-Neelsen (vase la seccin 5.3.3) Etanol al 95% Cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). Una placa de Petri grande
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Formaldehido al 37% 5.12.2 Mtodo Coleccin de muestras Muestras de las lesiones de la oreja y de la piel 1. Examinar cada oreja y la piel con una buena iluminacin, colocada en forma conveniente y busque las lesiones, que son pequeos engrosamientos (infiltracin) de superficie lustrosa y tamaos variados. (Fig. 5.37). De cada oreja seleccione la lesin ms congestionada o ndulo. Si no hay ninguna lesin visible, use los bordes del lbulo de la oreja. A partir de la lesin de la piel elegir un rea justo dentro del borde de un parche de rea despigmentada. 2. Limpie y desinfecte el rea con una pieza de gasa humedecida con etanol. Flamee la pinza y el bistur. Los bistures se pueden esterilizar por anticipado en tubos de vidrio taponados con algodn no absorbente. No se use yodo. 3. Apriete firmemente con la pinza el lbulo de la oreja para detener la irrigacin sangunea del rea (Fig. 5.38), esto cuando estn disponibles las pinzas, si no hay, utilizar el dedo ndice y el pulgar para detener el flujo de sangre. 4. Sosteniendo con firmeza las pinzas haga una incisin superficial de arriba abajo con el bistur, aproximadamente de 0,5 cm de largo y 2-3 mm de profundidad a lo largo en el centro de la lesin. 5. Sin dejar de apretar con la pinza, raspe suavemente el fondo y los bordes de la incisin con la punta y la hoja del bistur (fig. 5.39). Recoja con el bistur el material seroso, incoloro o rosceo, de la lesin. No provoque la salida de sangre y evitar la extraccin de sangre.
A) Materiales. Figura 5.37 Lesiones de lepra en la oreja. Al examinar las orejas busque las lesiones, que son pequeos engrosamientos (infiltracin) de superficie lustrosa y tamaos variados. Escoja la lesin o ndulo ms congestionado. B) Limpie el rea con una pieza de gasa humedecida con etanol. Figura 5.38 Exprimir el lbulo
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de la oreja para detener el flujo de sangre. Figura 5.39 Toma de una muestra de una lesin del odo. Sosteniendo con firmeza las pinzas haga una incisin superficial de arriba abajo, a la mitad de la lesin. Muestras de la cara y el cuerpo Examine la cara y el cuerpo en busca de: A) Lesiones semejantes a las que se han encontrado en la oreja, aunque frecuentemente mayores (fig. 5.40); B) Ppulas, manchas planas (mculas), placas de color plido o zonas infiltradas de la piel (fig. 5.41), que son similares en apariencia a la piel de naranja. Tambin se pueden obtener muestras de zonas de la piel en que se comiencen a observar signos de infiltracin leprosa. Escoja una lesin en que se observe la infiltracin ms acusada y seleccione el lugar de donde se obtendr la muestra. Este sitio deber estar situado: inmediatamente dentro del borde de la placa, donde sea evidente que la piel se est alterando con mayor rapidez. (Esto es importante para estar seguros de que se detecten los bacilos.) Una muestra puede ser extrada de una zona de la piel que muestra los primeros signos de infiltracin leprosa. 1. Desinfecte el rea con una pieza de gasa embebida en etanol. Flamee la pinza sin dientes y el bistur. Pellizque vigorosamente con una pinza sin dientes el sitio de donde se obtendr la muestra. 2. Contine sosteniendo firmemente. Con la punta del bistur haga una incisin (fig. 5.42): de 0,5 cm de longitud de 2 - 3 mm de profundidad 3. Con la misma punta del bistur raspe el fondo y los bordes de la incisin. Recoja cierta cantidad de pulpa y material seroso. (Siga apretando para evitar que sangre.)
Figura 5.40 Lesiones de lepra en el brazo. Figura 5.41 Lesiones de lepra en la cara. A) Escoja una lesin en que se observe la infiltracin ms acusada y seleccione el lugar de donde se obtendr la muestra. B) Desinfecte el rea
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con una pieza de gasa embebida en etanol. Pellizque vigorosamente con una pinza sin dientes el sitio de donde se obtendr la muestra. Figura 5.42 Toma de una muestra de una lesin cutnea. Muestras de la nariz (exudado nasal) Las muestras se preparan mejor con el contenido de la cavidad nasal que se expulse por primera vez en el da, a hora temprana de la maana. El paciente deber proporcionar este material "sonndose la nariz" completamente en una hoja limpia y seca de celofn o material plstico. Preparacin de los frotis Preparacin de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel 1. Con el lado plano de la hoja del bistur extienda, con un movimiento circular, el material seroso sobre un rea de 5-7 mm de dimetro en un portaobjetos que est numerado con lpiz de diamante. Se pueden colocar 2-4 muestras del mismo paciente en un solo portaobjetos (Fig. 5.43). 2. Deje secar el portaobjetos en un lugar donde no haya polvo. Cuando los frotis se encuentren completamente secos fjense con vapores de formaldehido en una caja de Petri atravesada por dos varillas de vidrio. Utilice la cantidad suficiente de solucin de formaldehido de manera que cubra solamente el fondo de la caja. Coloque el portaobjetos sobre las varillas de vidrio. Tape la caja y djela reposar 3 minutos. Tambin se puede fijar los frotis pasando la parte de atrs del portaobjetos (no del lado de la muestra) a travs de la llama de una lmpara de alcohol o mechero Bunsen varias veces (vase la Fig. 5.6). 3. Teir los frotis mediante la tcnica de Ziehl-Neelsen modificada (vase la seccin 5.3.3). Tincin de los frotis: Bae cada portaobjetos con fucsina fenicada recientemente filtrada y djese reposar 20 minutos. Lvense los portaobjetos suavemente con agua del grifo (depostense en un vaso para anlisis con el frotis vuelto hacia el lado contrario del chorro); se pueden dejar en el vaso hasta que se proceda a decolorarlos. Decolore los portaobjetos, uno por uno, haciendo correr suavemente sobre ellos la mezcla de cido y etanol hasta que sta sea clara e incolora. Lvense nuevamente los portaobjetos con agua del grifo y djense secar hasta que se aplique el siguiente colorante. Tanse con solucin de azul de metileno durante 1 minuto. Nota: Para la descripcin de Mycobacterium leprae vase ms adelante.
Figura 5.43 Transferencia de la muestra a un portaobjetos. Con el lado plano de la hoja del bistur extienda la muestra sobre un portaobjetos de vidrio numerado con lpiz de diamante en un rea de 5 - 7 mm de dimetro por
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medio de movimientos circulares. A) Deje secar el portaobjetos en un lugar donde no haya polvo. Cuando los frotis se encuentren completamente secos fjense con vapores de formaldehido en una caja de Petri atravesada por dos varillas de vidrio. Tambin, se puede hacer como en la figura 5.6 secar el portaobjetos a la llama de un mechero del lado opuesto al lado del frotis. B) En la tincin lvense nuevamente los portaobjetos con agua del grifo y djense secar hasta que se aplique el siguiente colorante. Preparacin de los frotis de las muestras de la cara y el cuerpo 1. Con el lado plano de la hoja del bistur extienda la muestra sobre un portaobjetos de vidrio numerado con lpiz de diamante en un rea de 5-7 mm de dimetro por medio de movimientos circulares. En el mismo portaobjetos se podrn colocar 3 - 6 muestras de diferentes lesiones. 2. Seque los frotis y fjense como se indica en la preparacin de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel (vase antes). 3. Teir los frotis mediante la tcnica de Ziehl-Neelsen modificada (vase la seccin 5.3.3). Aplique la tincin de acuerdo a lo explicado antes en la preparacin de los frotis de muestras de las lesiones de la oreja y de la piel. Limpie la incisin con ter y etanol y, si sangra, aplique una compresa. Preparacin de los frotis de las muestras de la nariz 1. Con un pequeo hisopo de algodn ligeramente humedecido con solucin de cloruro sdico traslade cierta cantidad de la sustancia opaca que ha expulsado el paciente, de la hoja de material plstico a un portaobjetos marcado anticipadamente. 2. Extienda la muestra en el portaobjeto con toda la uniformidad que sea posible. En un solo portaobjetos se pueden preparar dos o tres frotis del mismo material. 3. Deje secar los frotis. 4. Cuando se encuentren completamente secos, fije los frotis con vapores de formaldehido. Otra alternativa es fijar los frotis a la llama de una lmpara de alcohol o mechero Bunsen varias veces pasando la parte de atrs del portaobjetos (la que no tiene el frotis) rpidamente por la llama. 5. Tia el portaobjetos por la tcnica de Ziehl-Neelsen modificada (vase la seccin 5.3.3). 6. Examnelos con el microscopio y registre los resultados como se indica en lo relativo al examen de los bacilos en ndulos y lesiones de la piel (Tabla 5.3). 5.12.3 Examen microscpico Descripcin del bacilo de la lepra Examinar el portaobjetos con el objetivo de inmersin en aceite x100. Mycobacterium leprae es un bacilo cido-alcohol resistente, por lo tanto, se asemeja al bacilo de la tuberculosis. As pues, tambin es resistente a los cidos y se tie de rojo sobre un fondo azul con la tcnica modificada de Ziehl y Neelsen. Tamao: 1 - 8 m Forma: bastoncillo alargado, recto o ligeramente curvo, con extremos romos. Granulacin: frecuentemente granuloso; los grnulos, voluminosos y de color rojo fuerte, se hallan separados por espacios incoloros Disposicin: (a) Se puede encontrar en grupos de 2-5 bacilos dispuestos paralelamente (fig. 5.44 (a). o (b) En grupos, o racimos mayores (Fig. 5.44 (b)), o (c) En gran nmero, formando conglomerados circulares llamados "globi" (fig. 5.44 (c)). Nota: Los frotis nasales contienen a veces bacilos cido-alcohol resistentes no patgenos que no son M. leprae.
Figura 5.44 Mycobacterium leprae. a) Se puede encontrar en grupos de 2-5 bacilos dispuestos paralelamente, b) En grupos, o racimos mayores, c) En gran nmero, formando conglomerados circulares llamados "globi".
Registro de los resultados Registre los resultados de la siguiente manera: Muestra obtenida de: placas o ndulos de la oreja, etc. -Bacilos cido-alcohol resistentes presentes o -No se observaron bacilos cido-alcohol resistentes.
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Tambin se le puede agregar o informar por ej.: se observaron bacilos cido-alcohol resistentes (Especifquese si se encontraron en globos, ("globi")). O bien, se examin con el objetivo x 100 y el ocular x 6; no se observaron bacilos cido-alcohol resistentes. Los resultados del examen pueden ser clasificados como se muestra en la Tabla 5.3. Importancia del examen de placas o ndulos Empiece invariablemente examinando muestras de placas o ndulos, si es que existen. ndices bacteriolgico y morfolgico Estos ndices se pueden calcular si el mdico lo solicita. (a) ndice bacteriolgico. El ndice bacteriolgico (IB) es una gua de la carga bacteriana. Smense todos los resultados positivos de todos los sitios del cuerpo de donde se han obtenido muestras y divdase el total entre el nmero de estos sitios. Por ejemplo: sitio 1 = oreja derecha +++ sitio 2 = oreja izquierda ++ sitio 3 = brazo izquierdo ++ Sitio 4 = espalda + Total 8+ (El nmero total de muestras positivas es 8 +) ndice bacteriolgico 8 /4 = 2 (o 2+) (b) ndice morfolgico. El ndice morfolgico proporciona un indicador de la viabilidad de los bacilos. Se determina de la siguiente manera: Examnense 100 bacilos de las preparaciones hechas en los portaobjetos. Cuntese el nmero de bacilos que se ha teido uniformemente de rojo en toda su longitud ("bacilos viables"). Si el nmero de bacilos viables es, por ejemplo, 8, el ndice morfolgico ser 8%. Este ndice se emplea para elaborar el diagnstico inicial, la historia clnica y la observacin y el seguimiento ulterior de pacientes con bacilos abundantes (lepra multibacilar). Cultivo No hay ningn mtodo disponible para el cultivo in vitro de Mycobacterium leprae. Sin embargo, el microorganismo puede cultivarse in vivo en las almohadillas de las patas de ratones o en el armadillo. Tabla 5.3 Informe de los resultados de los exmenes de Mycobacterium leprae Nmero de bacilos por campo microscpico Resultado Ninguno (<1 por cada 100 campos) 0 0,01-0,1 (1-10 por 100 campos) 1+ 0,1-1 (1-10 por cada 10 campos) 2+ 1 - 10 3+ 10-100 4+ 100-1000 5+ > 1000 6+
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6. MICOLOGA1
6.1 EVALUACIN DE LA PIEL Y EL CABELLO PARA LOS HONGOS La tia es una infeccin fngica de la piel. Se puede encontrar en la superficie del cuerpo, el cuero cabelludo y las uas y entre los dedos de los pies. Con frecuencia se produce la infeccin cruzada entre los seres humanos y la infeccin tambin puede ser adquirida a partir de animales infectados o en el suelo. Las lesiones circulares en la piel consisten en una masa de hifas ramificadas, el pelo y las uas infectadas tambin pueden contener esporas de hongos. 1Una descripcin del mtodo utilizado para la identificacin de Candida albicans en la secrecin vaginal se proporciona en la seccin 5.8. 6.1.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos (o papel oscuro) Cubreobjetos Bistur Pinzas Placa de Petri Mechero de Bunsen o lmpara de alcohol hisopo de algodn Algodn Etanol al 70% Solucin de montaje de azul de lactofenol (reactivo no. 33) Hidrxido de potasio, solucin al 20% (reactivo no. 45). 6.1.2 Mtodo2 Coleccin de muestras 1. Limpie la zona afectada con un hisopo de algodn empapado en etanol. 2. Utilice un bistur estril para raspar suavemente el borde de una lesin y recoger algunas escamas de piel a un portaobjetos de vidrio o sobre un trozo de papel oscuro en el que las escamas pueden ser vistas ms fcilmente. Tambin recoja algunos pelos rotos o daados de las reas infectadas del cuero cabelludo utilizando unas grandes y amplias pinzas y colocarlos en el portaobjetos. 3. Coloque una gota de solucin de montaje de azul de lactofenol y una gota de hidrxido de potasio al 20% a las escamas y el pelo (Fig. 6.1). Cubrir con un cubreobjetos. El lcali fuerte disolver la queratina en el tejido, lo que permite que se puedan ver hifas y esporas. Nota: El hidrxido de potasio es un fluido corrosivo y no se debe permitir que toque la piel. 4. Colocar el portaobjetos en una placa de Petri cubierta con un poco de algodn hmedo para evitar que la muestra se seque. Dejar la muestra para aclarar durante 5-30 minutos, dependiendo del grosor. Como alternativa, aclarar la muestra mediante la sujecin del portaobjeto por encima de la llama de un mechero de Bunsen o una lmpara de alcohol durante 1 minuto (Fig. 6.2). Advertencia: El colorante y especialmente el hidrxido potsico pueden hervir sbitamente y borbotear. Tenga el rostro convenientemente alejado del portaobjetos durante el calentamiento. 2 La infeccin por tia tambin se puede identificar examinando al paciente en una habitacin oscura iluminada con luz ultravioleta. Los pelos infectados con tia aparecern fluorescentes. Generalmente, se usa la lmpara de Wood la cual se puede definir como un tipo de iluminacin que utiliza luz ultravioleta de onda larga. Cuando se ve un rea del cuero cabelludo infectada con tia bajo la lmpara de Wood, el hongo puede brillar (fluorescente). Esta prueba se puede hacer para detectar la presencia de una infeccin mictica en el cuero cabelludo o en la piel. Examen microscpico Examine la muestra limpiado utilizando los objetivos x10 y x40. Ajuste el diafragma del condensador para dar un buen contraste. Pueden observarse hifas ramificadas y cadenas de artrosporas redondeadas angulares. Las hifas fngicas pueden ser diferenciadas de otras estructuras tisulares por su ramificacin y los tabiques o septos que presentan. Se tien de azul con el azul de lactofenol. Las esporas (grnulos grandes redondos con membranas transparentes) pueden ser vistas alrededor del exterior de los pelos (fig. 6.3). Estas esporas se conocen como ectothrix. Las esporas que se encuentran dentro de los pelos se llaman endothrix (Fig. 6.4). Informar como "hifas o esporas de hongos presentes" o "no encontrado". Importante: Estos exmenes pueden ser difciles, especialmente en las primeras etapas de la enfermedad. En caso de duda tome un pelo aparentemente normal, de la misma longitud que el pelo enfermo, y colquelo sobre el portaobjetos al lado del pelo infectado, para compararlos. Solamente por medio de cultivos se puede determinar con exactitud la especie de hongo que causa la infeccin.
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D C A) Lesiones de tia en el cuero cabelludo. La tia es una infeccin del cuero cabelludo, causada por diferentes hongos, que afecta principalmente a los nios. Los pacientes pierden el pelo en placas redondas de tamao variable. En el laboratorio se pueden detectar los hongos por el examen directo del pelo con el microscopio. Tambin es posible cultivar e identificar los hongos en laboratorios especializados (cultivos micolgicos). B) Materiales y reactivos. C) Obtencin de la muestra: Escoja un pelo conveniente, que se encuentre dentro de las placas de calvicie, pero cerca de! borde. El pelo infectado es corto, quebradizo, se halla retorcido y es ms opaco que los dems; a veces existe cierto tipo de pus seco en la raz. Ponga las pinzas precisamente en la base del pelo. Tire con firmeza, pero gradualmente. El pelo afectado generalmente se fija con escasa firmeza en su folculo y es fcil extraerlo. D) Coloque el pelo en el centro del portaobjetos. Conviene tomar pelos de varias placas (aproximadamente 10 pelos en total). En el mismo portaobjetos se pueden colocar 3 4 pelos.
Figura 6.1 Preparacin de los portaobjetos para el examen microscpico de la piel y el cabello para la observacin de los hongos. Figura 6.2 Aclaracin de la muestra sobre una llama calentndola. Pase el portaobjetos rpidamente 4 veces a travs de la llama del mechero Bunsen para calentarlo (o sostngalo sobre la llama de una lmpara de alcohol durante un minuto). Figura 6.3 Ectothrix a: esporas inmaduras; b: esporas maduras. Figura 6.4 Endothrix a: esporas inmaduras; b: esporas maduras. 6.2 EXAMEN DE PUS PARA MICETOMA El Micetoma es una enfermedad granulomatosa crnica del tejido subcutneo y profundo. El sitio ms comnmente infectado es el pie, donde se le llama " Pie de Madura. Otros sitios posibles de infeccin incluyen las manos, la cabeza y la pared torcica. El Micetoma produce pequeos grnulos que son descargados a travs de los senos a la superficie. Estos grnulos se utilizan en el diagnstico de la enfermedad.
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6.2.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos agujas estriles Agua destilada Metanol al 70% Cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Hidrxido de potasio, solucin al 20% (reactivo no. 45) Reactivos para la tincin de Gram (ver seccin 5.3.1). 6.2.2 Mtodo Coleccin de muestras 1. Use una aguja estril para levantar la costra superficial sobre un seno. 2. Retire con cuidado algunos de los puses que supuran sobre un portaobjeto. 3. Aadir una gota de solucin salina o agua, extender el pus con cuidado y buscar grnulos. Los grnulos varan en color, tamao, forma y grado de dureza. 4. Machacar unos grnulos en un poco de agua destilada y colocar en dos portaobjetos. 5. Permitir que un portaobjetos se seque al aire, fijar con metanol durante 2-3 minutos y teirlo con la tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1). 6. Ponga unas gotas de hidrxido de potasio al 20% en el segundo portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Dejar la muestra para aclarar durante 10 minutos. Examen microscpico Examine la muestra limpiado utilizando los objetivos x10 y x40. Ajuste el diafragma del condensador para dar un buen contraste. Busque las ramificaciones e hifas retorcidas o filamentos fragmentados. Los Grnulos teidos con Gram pueden mostrar filamentos Gram-positivos finos o fragmentados. Informar como: "pus del seno que contiene grnulos de [Especificar el color y el tamao del grnulo] presente"; "La tincin de Gram muestra hifas delgadas Gram-positivas" o "La tincin de Gram no muestra hifas delgadas Gram-positivas".
B A A) Formacin de abcesos en la dermis profunda mostrando bacterias filamentosas gram +. La flecha seala unos de los filamentos. Tincin de Gram magnificacin original 400 (Ziehl Neelsen y PAS negativos). Se observan bacterias filamentosas pero no hongos. B) Examen directo con KOH 20% (400x).
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E F C) Lesiones en trax posterior. D) Ndulo drenando material purulento. E) y F) Tumefacciones en los miembros inferiores. En F) Paciente con Pie de Madura en el Complejo King Saud Medical Complex. Riyadh. Saudia Arabia.
d .c) Grano de Madurella. grisea (200X), de color oscuro y gran tamao comparado con el grano de Nocardia (no mostrado); d) Grano de M. grisea (400 X) en el que se aprecian los filamentos micticos que lo constituyen. Imgenes: Dr. Luis J. Mndez Tovar. Fuente: Micetoma, Dr. Luis J. Mndez Tovar, Unidad de investigacin mdica, hospital de especialidades C.M.N. siglo XXI. 6.3 EXAMEN DE LA PIEL PARA LA PITIRIASIS VERSICOLOR La pitiriasis versicolor es una enfermedad comn de la piel en climas clidos, sino que es causada comnmente causada por especies de hongos del gnero Malassezia, aunque antiguamente a los agentes causales se les conoca con los nombres de Pityrosporum orbiculare y Pityrosporum ovale. La pitiriasis versicolor es producida por las siguientes especies del gnero Malassezia: Malassesia globosa Malassesia sympodialis Malassesia restricta Malassesia furfur (el hongo Pityrosporum furfur hoy es llamado Malassesia furfur) Malassesia ovalis Malassesia pachydermatis Malassesia obtusa Malassesia sloffiae La investigacin reciente ha demostrado que la mayora de pitiriasis versicolor es causada por el hongo Malassezia globosa, aunque Malassezia furfur es responsable de un pequeo nmero de casos. Esta infeccin es cutnea, superficial, se caracteriza por manchas en la piel (mculas hipo o hiperpigmentadas) y suele ser por dems asintomtica. La cara y el cuerpo estn cubiertos de manchas, que aparecen: -Plidas y descoloridas en pacientes de piel oscura; -Color marrn amarillento en los pacientes de piel blanca. 6.3.1 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos cinta de celofn adhesiva Abatelenguas o varilla de vidrio Pinzas Gasa Eosina, solucin al 1% (sin reactivo. 23), si es posible (de lo contrario, examinar sin tincin). 6.3.2 Mtodo Coleccin de muestras 1. Escoja una placa de piel Infectada que se est extendiendo rpidamente. Humedezca la parte que va a examinar con la gasa empapada en la solucin de eosina (Fig. 6.5). Djese secar durante 1 minuto. (Si se ha espolvoreado talco en la piel, no tome la muestra sin lavarla primero.) 2. Corte una tira de la cinta adhesiva de celofn, aproximadamente de 5 cm de longitud. Colquela sobre la placa cutnea de manera que sobrepase uno de los bordes (Fig. 6.6). 3. Pegue la cinta de celofn a la piel y presione con firmeza de un extremo al otro haciendo pasar varias veces sobre la cinta un abatelenguas o una varilla de vidrio (Fig. 6.7). Quite de la piel la cinta adhesiva con una pinza. Colquela inmediatamente sobre un portaobjetos con el lado adherente hacia abajo (Fig. 6.8). Examen microscpico
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Examine con el microscopio todo el portaobjetos (empleando el objetivo x 40) hasta que vea un racimo de grnulos voluminosos (esporas) (fig. 6.9). Si la piel se ha tratado con eosina estos grnulos sern blancos sobre un fondo rosceo; tambin son visibles en preparaciones no teidas. Coloque el objetivo de inmersin en aceite para examinar los detalles (Fig. 6.10): (a) Esporas: se encontrarn en conglomerados o racimos son redondas o ligeramente rectangulares miden 3 8 m de dimetro sus paredes son ms bien gruesas algunas veces se hallan en proceso de producir brotes visibles. (b) Filamentos de micelio (ms difciles de observar): son bastoncillos largos, doblados y torcidos miden 20 40 m de longitud miden 5 m de anchura semejan dedos y poseen ramificaciones. COMUNICACION DE LOS RESULTADOS Examen directo de pitiriasis versicolor: Se observaron racimos de esporas (y, cuando as sea, filamentos de micelio).
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Figura 6.5 Tiendo las placas cutneas de pitiriasis versicolor infectadas con eosina. Escoja una placa de piel Infectada que se est extendiendo rpidamente. Humedezca la parte que va a examinar con la gasa empapada en la solucin de eosina. Figura 6.6 Aplicacin de una cinta adhesiva a una placa de piel infectada. Figura 6.7 Toma de una muestra de piel. Figura 6.8 Transferencia de una muestra de piel a un portaobjetos. Figuras 6.9 y 6.10 Malassesia spp. Vistas con los objetivos x 40 y x 100 (con aceite de inmersin). (No se puede afirmar la especie, entonces se expresa como spp.: Varias especies).
OMS
PARTE 3
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7. EXAMEN DE ORINA
El examen de la orina constituye una investigacin fundamental en los pacientes en quienes se sospecha trastornos renales o infecciones del tracto urinario. Tambin hay muchos pacientes que no presentan sntomas clnicos, pero en los que las infecciones del tracto urinario no reconocidas anteriormente se pueden diagnosticar por el examen de la orina. 7.1 Recogida de muestras de orina Los contenedores (recipientes) para la recogida de la orina deben ser de boca ancha, limpios y secos. Si la muestra de orina tiene que ser transportada y debe almacenarse por un cierto tiempo para su transporte debe contener un conservante adecuado para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano o la eclosin de los huevos viables. 7.1.1 Tipos de muestra de orina Primera muestra de orina de la maana La primera muestra de orina de la maana bien temprano proporciona la muestra ms concentrada. Muestra de orina aleatoria Una muestra de orina al azar, tomada en cualquier momento del da, permitir al laboratorio la deteccin de sustancias que son indicadores de infeccin de los riones. Muestra de orina de 24 horas (solicitadas ocasionalmente) La orina se rene en un frasco de vidrio claro, de 2 litros, con tapa. El paciente deber orinar en la maana, al levantarse; esta orina no se recoge. Posteriormente toda la orina que se produzca durante el resto del da se reunir en el frasco, as como toda la que se produzca en el curso de la noche. Al da siguiente, cuando el paciente se levante, deber depositar en el frasco la primera orina de la maana. El frasco se llevar inmediatamente al laboratorio. Ah se determinar el volumen de la orina con una probeta y se har el registro correspondiente. Muestra de orina (chorro medio) Mientras est orinando, el paciente coloca en un recipiente abierto el chorro medio de orina, es decir, recoger la muestra a la mitad de la miccin en un recipiente abierto y luego el recipiente debe ser cubierto inmediatamente. Se recoge alrededor de 20 ml de orina. Los rganos genitales se debern limpiar anticipadamente. Muestra de orina terminal El paciente orina la ltima porcin de la orina en un recipiente abierto. Muestras de orina recolectados a travs de un catter La obtencin de orina mediante un catter debe ser llevada a cabo por un mdico o enfermera calificados. El procedimiento se utiliza para ciertas pruebas bacteriolgicas, principalmente en las mujeres. Por lo general, sin embargo, un espcimen recogido en la forma normal despus de una limpieza completa del rea genital es aceptable para este propsito. Las muestras de orina de los bebs y nios Las muestras de orina de los bebs y nios que no avisan (no controlan esfnteres): La orina puede ser recolectada en una bolsa de plstico con una boca adhesiva. La bolsa se fija alrededor de los genitales del nio y deja en su lugar durante 1-3 horas, dependiendo del examen solicitado. Se pueden utilizar las bolsas de colostoma. 7.1.2 PRESERVACIN DE LAS MUESTRAS DE ORINA La orina producida recientemente que se procesar en el da y se examina inmediatamente no requiere preservacin. Si la orina que ha sido recogida para comprobar la presencia de huevos de Schistosoma haematobium pero no puede ser examinada por varias horas, debe ser acidificada con unas pocas gotas de cido actico al 10% (reactivo no. 2). 7.2 EXAMEN DE LAS MUESTRAS DE ORINA 7.2.1 Apariencia La orina normalmente es transparente de color amarillo pajizo. La orina ms concentrada puede aparecer de color amarillo oscuro. La presencia de clulas de la sangre o el exceso de sales puede hacer que la orina aparezca turbia. Los pigmentos de sustancias biliares pueden hacer que la orina aparezca de color amarillo oscuro o marrn. La orina puede aparecer ocasionalmente incolora. Informe la apariencia como: -Lmpida o turbia; -Incolora, amarillo claro, amarillo oscuro o marrn. 7.2.2 Pruebas para la presencia de sangre Recuento de eritrocitos elevados y niveles de hemoglobina aumentados pueden aparecer en la orina: -Despus de un ejercicio fsico intenso; -En las infecciones del tracto vaginal; -En las infecciones parasitarias (por ejemplo, esquistosomiasis); -En la glomerulonefritis aguda; -En la cistitis aguda o uretritis; -En los pacientes que sufren de ciertos tumores. Las clulas sanguneas se ven fcilmente por examen microscpico despus de la centrifugacin (vase la seccin 7.2.7).
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Los eritrocitos lisados pueden ser detectados utilizando una tira reactiva de orina que tiene un segmento o almohadilla para la deteccin de sangre. Las tiras reactivas de orina estn disponibles para la deteccin de una sola sustancia (por ejemplo, sangre, glucosa o protena) o para la deteccin de varias sustancias (por ejemplo, nitritos y esterasa leucocitaria). Mtodo Las tiras reactivas se colocan en la orina y se retiran inmediatamente. A continuacin, se comparan con una tabla de comparacin despus de un tiempo adecuado que tambin se especifica en la carta. Generalmente, la tabla de comparacin o carta viene con diferentes colores, de acuerdo con los colores que se podran observar en las orinas. Los cambios de color observados en la tira darn una estimacin semi-cuantitativa de la cantidad de sustancia presente. Este puede ser reportada como negativa, positiva con cruces a diferentes grados (1 a 4 cruces simbolizadas con el signo ms+): +, + +, + + +, + + + + o como un valor aproximado de la concentracin de la sustancia de ensayo. (Dicho valor aparece en la cartilla de colores de comparacin). Las tiras reactivas deben almacenarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 7.2.3 Medicin del pH La orina normal producida recientemente es ligeramente cida, con un pH de 6,0 aproximadamente. En ciertas enfermedades el pH de la orina puede aumentar o disminuir. Principio Se sumergen en la orina piezas de papel indicador de colores(o se coloca en un vidrio de reloj y unas gotas de orina se aade a la misma). El color cambia segn el pH. Los papeles se comparan entonces con un cuadro testigo estandarizado en el que figuran las cifras correspondientes. Materiales (Fig. 7.1) Vidrios de reloj Gotero Pinzas o tenacillas Papeles indicadores de tipo universal (para medir pH de 1 a 10) Papeles indicadores de graduacin limitada: para el intervalo de 5,0 7,0 y el intervalo de 6,0 8,0. La orina en que se haga el ensayo deber ser fresca. La muestra de orina debe ser examinada dentro de 1 hora desde la recogida. Mtodo 1. En un vidrio de reloj ponga una tira de papel indicador de tipo universal (pH 1 10). Deposite en el papel indicador algunas gotas de orina fresca (Fig. 7.2). Alternativamente, sumergir el papel de prueba directamente en la orina contenida en el recipiente. 2. Con la tenacilla tome la tira de papel indicador. Compare el color que se ha producido con los que figuran en el cuadro estandarizado (Fig. 7.3). Vea la cifra del pH en la unidad cuyo color corresponda ms estrechamente al de la tira de papel. 3. Segn el resultado obtenido tmese una tira de papel de graduacin limitada que sea adecuada para el caso. Ejemplo: pH 6: papel indicador con intervalo de 5,0 7,0 pH 8: papel indicador con intervalo de 6,0 8,0. 4. Repita el ensayo en otro vidrio de reloj, utilizando papel indicador de graduacin limitada. Coteje el pH de la orina por medio del cuadro estandarizado (fig. 7.4). Ejemplo: pH = 6,0, o pH = 7,5. El papel indicador tambin se puede sumergir directamente en la orina, dentro del recipiente, para calcular el pH. Resultados pH normal aproximadamente 6,0 (lmite del intervalo normal, de 5,0 a 7,0 durante el da). Se observan valores de pH cidos (4,5 5,5) (si persiste, puede obedecer a algunas formas de diabetes, fatiga muscular, o acidosis). Valores de pH alcalino 7,8 8,0 (son comunes en pacientes con infecciones del aparato urinario; alimentacin vegetariana). pH y depsitos de cristales La determinacin del pH de la orina es til para identificar depsitos de cristales (vase seccin 7.2.7, ms adelante). Algunos cristales se depositan solo en la orina cida; otros lo hacen solamente en la orina alcalina. Por ejemplo: Orina cida: oxalatos, cido rico. Orina alcalina: fosfatos, carbonatos, biurato de amonio. Salvo en enfermedades muy raras, los depsitos cristalinos en la orina no tienen importancia diagnstica. Recordatorio: Los lquidos cidos tienen un pH de 0 7 (0 es el ms cido). Los lquidos alcalinos tienen un pH de 7 14 (14 es el ms alcalino)
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Figura 7.1 Materiales para medir el pH de la orina Figura 7.2 Aplicacin de la muestra de orina al papel indicador universal Figura 7.3 Comprobacin del pH usando papel indicador universal Figura 7.4 Comprobacin del pH usando papel indicador de pH de rango limitado.
7.2.4 Deteccin de la glucosa Principio La glucosa es el azcar (hidrato de carbono, monosacrido) ms comnmente encontrada en la orina, especialmente en pacientes diabticos y pacientes que sufren de insuficiencia renal crnica. La glucosa es una sustancia reductora: Reduce el sulfato cprico, de color azul, de la solucin de Benedict, a xido cprico rojo, que es insoluble. La lactosa es tambin un azcar reductor y se observa ocasionalmente en la orina de mujeres embarazadas. Materiales y reactivos Tubos de ensayo de vidrio Pyrex Un portatubos de madera Gradilla Un vaso para anlisis o un tarro Mechero de Bunsen o lmpara de alcohol Gotero Pipeta graduada de 5 ml Solucin de Benedict (cualitativa) (reactivo no. 10). Frascos para penicilina Mtodo 1. Pipetear 5 ml de solucin de Benedict en un tubo de ensayo. 2. Aadir ocho gotas de orina y mezclar bien. 3. Hierva durante 2 minutos en el mechero Bunsen o en una lmpara de alcohol (fig. 7.5), o sostenga el tubo dentro de un vaso para anlisis o un tarro con agua hirviendo durante 5 minutos. 4. Colocar el tubo de ensayo en la gradilla y se deja enfriar a temperatura ambiente. Examine la mezcla para saber si hay cambios de color o precipitados. El resultado se muestra en la Tabla 7.1. La glucosa en la orina tambin se puede detectar utilizando una tira reactiva de orina (ver seccin 7.2.2). Tabla 7.1 Informe de los resultados del mtodo de Benedict para la deteccin de sustancias reductoras en la orina
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Color Azul Verde Verde con precipitado amarillo Desde amarillo hasta verde oscuro Castao Desde anaranjado hasta rojo ladrillo
Resultado Negativo Trazas (situados al lmite de la normalidad) + ++ +++ ++++
C A) Materiales. B) Con una pipeta deposite 5 ml de solucin de Benedict en un tubo de ensayo. C) Agregue 8 gotas de orina y mzclelas completamente. Figura 7.5 Mtodo de Benedict para la deteccin de sustancias reductoras en la orina. Hierva durante 2 minutos en el mechero Bunsen o en una lmpara de alcohol, o sostenga el tubo dentro de un vaso para anlisis o un tarro con agua hirviendo durante 5 minutos. 7.2.5 Deteccin y estimacin de protenas en orina Los niveles de protena elevados son observados en la orina de pacientes con: -Esquistosomiasis urinaria Enfermedad renal crnica -Pielonefritis -Diabetes mellitus -Trastornos sistmicos (lupus eritematoso) -Mieloma mltiple. Sin embargo, la proteinuria ortosttica, una forma de proteinuria funcional que generalmente se observa en hombres jvenes, que se produce al ponerse de pie y desaparece al acostarse, no tiene ningn significado patolgico. Principio1 Cuando se aade cido tricloroactico a la orina que contiene protena, se forma un precipitado, que se mide por turbidimetra. Esta reaccin se produce con casi todas las protenas, incluyendo albmina y globulinas. 1Otros detalles del mtodo descrito aqu se dan en las siguientes referencias: Shahangian S, Brown PI, Ash KO. Turbidimetric measurement of total urinary proteins: a revised method. American journal of clinical pathology, 1984, 81:651654; Tietz NW, ed. Textbook of clinical chemistry, 2nd ed. Philadelphia, WB Saunders, 1994. Materiales y reactivos Espectrofotmetro Tubos de ensayo Gradilla Centrfuga Rotador mecnico Albmina de suero bovina o humana cido tricloroactico, solucin al 5% (Ver reactivo n 62), diluida 1: 4 con agua destilada Cloruro de sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Controles positivos y negativos Estndar de trabajo de albmina, solucin al 0.005% (preparada a partir de estndar de reserva de albmina, solucin al 5,0%, diluida 1:100 con cloruro de sodio, solucin al 0.85% (reactivo no. 53)). El estndar de trabajo de albmina se puede dividir en alcuotas y almacenado a -20 C durante un mximo de 6 meses. Si el estndar de reserva de albmina no est disponible, los estndares comerciales a base de suero que contienen tanto a la albmina y la globulina se pueden utilizar para preparar una solucin estndar de trabajo de albmina de la concentracin apropiada. Al igual que con el
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estndar de albmina, el estndar de trabajo de albmina tambin se puede dividir en alcuotas y almacenarse a -20 C durante un mximo de 6 meses. Mtodo Coleccin de muestras Se deben utilizar muestras aleatorias, o las muestras de orina de 24 horas (vase la seccin 7.1.1). No deben aadirse conservantes a las muestras. Las muestras de 24 horas que se recogen deben ser almacenadas a 4-8 C durante el perodo de recoleccin, para evitar el crecimiento bacteriano. Las muestras recogidas deben mantenerse a 4 C hasta su anlisis. Si es probable que el anlisis se retrase por ms de 24 horas, las muestras deben ser almacenadas a -20 C. Tcnica 1. Aadir 1,6 ml de la muestra de orina a cada uno de dos tubos de ensayo (al blanco de muestra y al desconocido). Repetir el proceso con el estndar de trabajo y el de control. 2. Aadir 0,4 ml de solucin de cido tricloroactico a todos los tubos de ensayo y mezclar bien. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. 3. Centrifugar los blancos a 2000 g durante 10 minutos. 4. Usando el espectrofotmetro, medir y registrar la densidad ptica de las pruebas y los blancos a 620 nm. El espectrofotmetro debe ajustarse a cero con agua destilada antes de tomar cualquier medida. Tambin debe ser calibrado, como se describe a continuacin. El intervalo analtico de medicin utilizando este mtodo es de 100-1000 mg/l. Clculo Calcular la concentracin de protena en la muestra de orina utilizando la siguiente frmula: (OD T OD TB ) C (OD R OD RB ) Donde: C = concentracin de la solucin de calibracin ODR = Densidad ptica del estndar de trabajo ODRB = Densidad ptica del blanco del estndar de trabajo ODT = Densidad ptica de la muestra de ensayo ODTB = Densidad ptica del blanco de la muestra de ensayo. Nota: Si se utiliza un control basado en suero para fines de calibracin, un material independiente debe ser utilizado para el propsito de control de calidad. Debido a que la cantidad de protena excretada en la orina puede variar en gran medida, los resultados positivos deben confirmarse siempre mediante la repeticin de la prueba en una o ms muestras independientes. Si se utiliza este mtodo para la deteccin de microproteinuria (que se puede correlacionar con microalbuminuria en ausencia de dao tubular, las infecciones urinarias y el tratamiento con ciertos frmacos) en poblaciones de alto riesgo, como los pacientes con diabetes, las siguientes modificaciones deben aplicarse a los pasos 2 y 4: 2. Deje todos los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 35 minutos despus de la mezcla. 4. Usando el espectrofotmetro, medir y registrar la densidad ptica de los problemas y de los blancos a 405 nm. El intervalo analtico de este mtodo modificado es 25-700 mg /l. La protena en la orina tambin se puede detectar utilizando una tira reactiva para protenas (vase la seccin 7.2.2). 7.2.6 Deteccin de cuerpos cetnicos en orina La orina normal no contiene cuerpos cetnicos. La acetona y otros cuerpos cetnicos pueden aparecer en la orina: -En la diabetes severa o no tratada; En otras condiciones (deshidratacin, vmitos, desnutricin, hambre prolongado y despus del ejercicio extenuante). Principio Cuando se aade el nitroprusiato de sodio (nitroferrocianuro sdico o pentacianonitrosilferrato sdico (III)) a la orina que contiene cuerpos cetnicos, se produce un color prpura. Materiales y reactivos Tubos de ensayo Gradilla Probetas, 10 ml Pipeta gotera Cristales de nitroprusiato de sodio cido actico Amonaco. Mtodo 1. Justo antes de la realizacin de la prueba, colocar un nmero suficiente de cristales de nitroprusiato de sodio en un tubo de ensayo para cubrir la parte inferior (fig. 7.6). 2. Aadir 5 ml de agua destilada. Agitar bien hasta que los cristales estn casi disueltos. (No se espera que todos los cristales se disuelvan ya que la solucin est saturada.) 3. Medir 10 ml de orina en otro tubo de ensayo. 4. Aadir cuatro gotas de cido actico a la orina, seguido de 10 gotas de solucin de nitroprusiato de sodio recin preparada. Mezclar bien.
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5. Sujetando la punta de la pipeta contra el lado del tubo, dejar que 20 gotas (1 ml) de solucin de amonaco fluyan sobre la superficie del lquido (fig. 7.7). Esperar durante 5 minutos antes de la lectura-un resultado positivo puede ser evidente antes de este tiempo. Si el resultado es positivo (Fig. 7.8), un anillo de color prpura aparece en la parte superior de la orina. Si el resultado es negativo, no se produce ningn cambio de color. Informar el resultado como se muestra en la Tabla 7.2. Los cuerpos cetnicos en la orina tambin se pueden detectar utilizando una tira reactiva de orina (ver seccin 7.2.2).
Figura 7.6 Preparacin de la solucin de nitroprusiato de sodio Figura 7.7 Adicin de una solucin de amonaco a la superficie de la solucin de nitroprusiato de sodio Figura 7.8 Prueba para sustancias cetnicas en la orina a: Reaccin positiva; b: reaccin negativa
Tabla 7.2 Informe de los resultados de la prueba para la deteccin de cuerpos cetnicos en la orina Cambio de color Resultado Ninguno Negativo Anillo rosado + Anillo rojo ++ Anillo prpura +++ 7.2.7 Deteccin de elementos anormales Principio La orina contiene clulas y cristales en suspensin que pueden ser recogidos por centrifugacin o por accin gravitatoria directa que permite que la orina permanezca estable y quieta y las partculas en suspensin formen un sedimento cuando el tubo es colocado en posicin vertical en una gradilla. Como todos estos elementos en suspensin se sedimentan en la orina, si sta se deja en reposo durante algunas horas, se les llama sedimentos urinarios. El depsito urinario resultante (sedimento urinario) puede ser examinado bajo el microscopio. La centrifugacin es el mtodo ms usual para formar un sedimento por su rapidez. En ciertas enfermedades de las vas urinarias, los depsitos o sedimentos de orina se alteran considerablemente. Los siguientes elementos anormales se pueden encontrar: -Leucocitos -Nmeros anormales de eritrocitos -Cristales anormales (muy raramente) -Trofozotos parasitarios (por ejemplo, Trichomonas vaginalis) o los huevos de parsitos (por ejemplo Schistosoma haematobium1, Enterobius vermicularis2) -Bacterias -Hongos - Cilindros anormales. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Centrfuga Tubo cnico de centrfuga de 15 ml Pipeta Pasteur Cubreobjetos Formaldehido Agua destilada.
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Vase tambin la seccin 7.2.8. Enterobius vermicularis: Se observan los huevos no por ser eliminados por orina sino por contaminacin fecal o mejor dicho ya que son colocados en la zona perianal y algunos huevos pasan o se pueden encontrar, por ejemplo, en la ropa interior, en el perineo, pueden, cuando se produce la miccin para recoger la muestra, pasar al frasco de recoleccin y contaminarlo. Generalmente, se pueden observar en orinas de mujeres, nias, o bebs. Mtodo Coleccin de muestras La orina para examinarla bajo el microscopio debe estar recin obtenida para recogerla en un recipiente limpio y seco. Una muestra de orina de chorro medio (ver seccin 7.1.1) es la ms til. La orina almacenada en un frigorfico puede contener un exceso de sales precipitadas y no ser adecuada para microscopa. La muestra se puede preservar para el examen microscpico del depsito mediante la adicin de 8-10 gotas de solucin de formaldehido al 10% (reactivo no. 28) por cada 300 ml de orina. La orina conservada de esta forma no es adecuada para otras pruebas. Preparacin del sedimento 1. Mezcle la muestra de orina suavemente y vierta aproximadamente 11 ml en un tubo de centrfuga. Tambin puede llenar 3/4 de su capacidad (75%). 2. Centrifugar la muestra a velocidad media (2000 g) durante 5 minutos. 3. Retirar el sobrenadante de forma rpida invirtiendo el tubo sin agitacin. (El sobrenadante puede ser utilizado para las pruebas de bioqumica.) 4. Resuspender el sedimento en agua destilada y mezclar agitando el tubo. Tambin, puede agitar el tubo a fin de que el sedimento forme nuevamente una suspensin sin agregarle agua destilada. 5. Transfiera una gota del depsito sobre un portaobjetos con una pipeta Pasteur y cubrir con un cubreobjetos. 6. Etiquetar el portaobjetos con el nombre del paciente o nmero de identificacin. Examen microscpico Examnela inmediatamente con el microscopio: primero, con el objetivo x 10 a continuacin, con el objetivo x 40 sin filtro de color descendiendo el condensador suficientemente (o reduciendo la abertura de este) a fin de que los elementos transparentes se hagan visibles. Con el objetivo x10 y con el condensador bajo, examine todo el cubreobjetos por todas partes en busca de huevos de Schistosoma haematobium cuando est indicado. Con el objetivo x40 y con el condensador bajo o la abertura reducida, examinar el rea del cubreobjetos otra vez e informe cualquier hallazgo como un valor cuantitativo para cada campo de alto aumento. A continuacin se puede encontrar en la orina: -Eritrocitos -Leucocitos -Clulas epiteliales -Cilindros -Hongos -Cristales -Huevos de parsitos y larvas de parsitos -Trichomonas vaginalis -Espermatozoides. Eritrocitos (Fig. 7.9) Los eritrocitos en la orina pueden estar: (a) intactos: pequeos discos amarillentos, ms oscuros en los bordes (8 m) (b) festoneados o crenados: con bordes espinosos y dimetro reducido (5 6 m); (c) henchidos: crculos de poco espesor y dimetro aumentado (9 10 m). Normalmente hay muy pocos eritrocitos en la a orina. de mujeres si las muestras se obtienen durante Nota: Se pueden encontrar eritrocitos en l el perodo menstrual. La forma de las clulas a menudo cambia durante el almacenamiento de la orina y no tiene ninguna importancia diagnstica.
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Figura 7.9 Eritrocitos a: clulas intactas; b: clulas crenadas, c: clulas henchidas.
Leucocitos (fig. 7.10) Los leucocitos que se encuentran en la orina pueden estar: (a) intactos: discos claros y granulosos de 10 15 m (los ncleos pueden ser visibles) (b) degenerados: deformes, encogidos, menos granulosos (c) como pus: racimos de numerosas clulas degeneradas. La existencia de abundantes leucocitos, especialmente en racimos, denota generalmente una infeccin de los conductos urinarios. Cmo expresar la cantidad de eritrocitos y leucocitos encontrados en los sedimentos urinarios Es importante que se indique la cantidad de los diversos elementos que se observen. Tambin es importante que se use un solo mtodo para expresar las cantidades halladas. Coloque una gota de sedimento urinario en un portaobjetos y colocar un cubreobjetos. Usando el objetivo x40, examinar el sedimento y contar el nmero de eritrocitos y leucocitos por campo microscpico. Informe los resultados como se describe en las Tablas 7.3 y 7.4.
Figura 7.10 Leucocitos a: Las clulas intactas; b: clulas degeneradas, c: pus. Figura 7.11 clulas de la pelvis renal y el urter Tabla 7.3 Informe de los resultados del examen microscpico de la orina para los eritrocitos Nmero de eritrocitos por campo microscpico Resultado 0-10 Escasos eritrocitos (normal) 10-30 Cantidad moderada de eritrocitos > 30 Abundantes eritrocitos Tabla 7.4 Informe de los resultados del examen microscpico de la orina para los leucocitos Nmero de leucocitos por campo microscpico Resultado 0-10 Escasos leucocitos (normal) 10-20 Cantidad moderada de leucocitos 20-30 Abundantes leucocitos 20-30 (degenerados) en grupos o racimos (racimos de Se observan numerosos leucocitos en ms de 20 leucocitos degenerados hasta 30 racimos aproximadamente) > 30 (degenerados) en grupos o racimos (racimos de campo lleno de leucocitos (campo leucocitos y numerosos leucocitos degenerados) cubierto) Clulas del urter y pelvis renal (Fig. 7.11)
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Ovales, de tamao mediano, con ncleos claramente visibles. Si son abundantes y se encuentran junto con leucocitos y filamentos, es probable que provengan del urter. Si son escasas y no se acompaan de leucocitos pueden ser clulas de la pelvis renal. Clulas renales (Fig. 7.12) Las clulas renales son ms pequeas que las clulas renales plvicas. Las clulas renales son pequeas: Su tamao es el de 1 - 2 leucocitos (L) Son sumamente granulosas. Los ncleos refractan la luz y son claramente visibles. Casi siempre se encuentran junto con las protenas urinarias.
Figura 7.12 Clulas renales. Se observan e la figura las clulas renales hacia la izquierda y hacia la derecha dos leucocitos (L), para comparar su tamao.
Levaduras No se deben confundir con eritrocitos. Tamao: 5 12 m Forma: cuerpos redondeados u ovales de varios tamaos, que se hallan juntos. Se pueden observar brotes. No son solubles en cido actico. Las levaduras se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Verifique que la orina sea fresca. Tambin pueden ser encontradas en otros casos. Trichomonas Tamao: 15 m (equivalente a 2 eritrocitos) Forma: redonda, globular Movilidad: mviles en la orina fresca (giran y se vuelven) Membrana ondulante: lateral Flagelos: 4 flagelos ms o menos visibles. Los trofozotos de T. vaginalis muestran contaminacin de la orina, con flujo vaginal en la mujer, cuando sucede en el varn, denota infeccin y mala higiene previa. A pesar que aparecen en la orina y su presencia indica infeccin, y por ende, son consideradas patolgicas, hubo una mala recoleccin de la muestra con la consecuente contaminacin de la orina. Espermatozoides Cabeza: muy pequea (5 m) Flagelo: largo y flexible (50 m) Movilidad: mviles en la orina muy fresca. Se encuentran ocasionalmente en la orina de hombres. Tambin en la orina de mujeres en edad frtil, esto implica que tuvieron coito vaginal con un varn frtil previo a la recoleccin, lo que denota una contaminacin con flujo vaginal y debera pedirse una nueva muestra, previa higiene de la zona, recogida con tapn vaginal. Clulas epiteliales 1. Clulas epiteliales escamosas Grandes y rectangulares; provienen de la descamacin (desprendimiento de clulas del epitelio de los conductos y rganos urinarios). Se originan en: el urter, o la vagina 2. Clulas de la vejiga urinaria Voluminosas, frecuentemente con formas romboidales y un ncleo claramente visible. 3. Clulas de la pelvis renal De tamao mediano (equivalente al de 3 leucocitos), granulosas, con cierta especie de cola. Fueron explicadas antes. 4. Clulas del urter y pelvis renal Fueron explicadas antes. 5. Clulas renales Fueron explicadas antes.
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F E A) Levaduras. B) T. vaginalis, obsrvese el movimiento. C) Espermatozoides. D) Clulas epiteliales escamosas. E) Clulas de la vejiga urinaria. F) Clulas de la pelvis renal. Cilindros Los cilindros son cilndricos y alargados, y cruzan casi todo el campo cuando se examinan con el objetivo x 40. Se forman durante las enfermedades de los tbulos renales, que se pueden llenar de sangre, de otras clulas y de depsitos de sustancias qumicas. Cilindros hialinos Son transparentes y refractan ligeramente la luz; los extremos pueden ser redondeados o delgados (Fig. 7.13). (Se suelen encontrar en individuos sanos despus de esfuerzos musculares intensos.) Cilindros granulosos Estos cilindros son ms bien cortos, llenos de grnulos voluminosos, de color amarillento y extremos redondeados (Fig. 7.14). Los grnulos provienen de clulas epiteliales degeneradas de los tbulos renales. Cilindros de grnulos finos (Fig. 7.15) Los grnulos de estos cilindros son ms pequeos y no llenan el molde o matriz completamente. No se deben confundir con los cilindros hialinos, que se hallan cubiertos parcialmente por cristales de fosfatos amorfos. Cilindros sanguneos (o hemticos) Estos cilindros se encuentran llenos de eritrocitos ms o menos degenerados, de color acastaado (Fig. 7.16). Se encuentran en la enfermedad renal aguda. Cilindros de pus (leucocitarios) (Fig. 7.17) Contienen leucocitos degenerados. Los verdaderos cilindros de pus se llenan completamente de leucocitos (a). Se encuentran en los pacientes que sufren de infeccin renal. Los cilindros hialinos pueden contener algunos leucocitos (b). Cilindros de clulas epiteliales Se encuentran llenos de clulas epiteliales de color amarillo plido (Fig. 7.18). (Para distinguir estas clulas con mayor facilidad agregue una gota de cido actico al 10% (reactivo N 2) al sedimento.) Los cilindros de clulas epiteliales no poseen significancia diagnstica. Cilindros grasos (raros) Refractan intensamente la luz; son de color amarillento, bordes mellados y claramente visibles, y extremos redondeados (Fig. 7.19). Los cilindros grasos son solubles en ter e insolubles en cido actico. (Se encuentran en casos de enfermedades renales graves.) ANEXO Cilindros creos stos poseen un ndice de refraccin muy elevado, son amarillos, grises o incoloros y tienen un aspecto uniforme y homogneo (Figs. 3-48, 3-49). Con frecuencia aparecen como cilindros anchos y cortos de extremos romos o cortados, y a menudo sus bordes son serrados o de aspecto resquebrajado. Se ha postulado que pueden formarse a partir de la degeneracin de cilindros granulosos. Los creos se observan en orinas de pacientes con insuficiencia renal crnica grave, hipertensin
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maligna, amiloidosis renal y nefropata diabtica. Tambin se ven en casos de enfermedad renal aguda, inflamacin y degeneracin tubular y en el rechazo del aloinjerto de rin (vanse figuras anexas). Fuente: Sister Laurine Graff Anlisis de Orina Atlas Color (1987) Cilindros grasos Son aquellos que incorporaron gotitas de grasa libre o bien cuerpos ovales grasos (consltese la seccin correspondiente a cuerpos ovales grasos). Pueden contener slo unas pocas gotitas de grasa o estar formados casi totalmente por gotitas de grasa de diferente tamao. En la figura 3-50 se muestra un tpico cilindro graso con gotitas grasas de gran tamao en una de sus mitades y otras ms pequeas de color amarillo castao en la otra. Si la grasa es colesterol, las gotitas sern anisotrpicas, y bajo luz polarizada presentan la caracterstica formacin en cruz de Malta. Las gotitas isotrpicas son formadas por triglicridos, no polarizan la luz, pero se tien con Sudan III o con Oil Red O. Los cilindros grasos se ven cuando existe degeneracin grasa del epitelio tubular, como en la enfermedad tubular degenerativa. Se observan con frecuencia en el sndrome nefrtico y pueden aparecer en la glomeruloesclerosis diabtica, en la nefrosis lipoidea, en la glomerulonefritis crnica, en el sndrome de Kimmelstiel Wilson, en el lupus y en la intoxicacin renal (vanse figuras anexas). Fuente: Sister Laurine Graff Anlisis de Orina Atlas Color (1987) Falsos cilindros (Fig. 7.20) No se deben confundir con cilindros: las acumulaciones de cristales de fosfatos, que son pequeas y claramente delimitadas (a) las acumulaciones de moco translcido, cuyos extremos se adelgazan hasta tomar forma de hilos (b). Diversas sustancias extraas Si se usan recipientes o portaobjetos sucios, o las muestras de orina se dejan expuestas al aire, se podrn encontrar las siguientes sustancias extraas (vase Fig. 7.21): (a) gotas pequeas de aceite (refractan la luz) (b) grnulos de almidn (se tien de negro azulado con la solucin yodurada de Lugol) (c) granos de polen (d) pelos (e) fibras de algodn (f) burbujas.
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Figura 7.13 Cilindros hialinos. Figura 7.14 Cilindros granulosos. Figura 7.15 Cilindros granulosos finos: a: Los verdaderos cilindros granulosos finos; b: cilindros hialinos parcialmente cubiertos por cristales de fosfato amorfo. Figura 7.16 Cilindros hemticos. Figura 7.17 Cilindros de pus. a: cilindros de pus verdaderos; b: cilindros hialinos que pueden contener algunos Leucocitos. Figura 7.18 Cilindros epiteliales. Figura 7.19 Cilindros grasos. Figura 7.20 Falsos cilindros: a: cristales de fosfato; b: mucus transparente. Figura 7.21 Sustancias extraas: a: gotitas de aceite, b: grnulos de almidn; c: granos de polen, d: pelos, e: fibras de algodn, f: burbujas de aire.
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Figura 3 -50 Cilindro graso (400 x)
Figura 6-49 Cilindro graso que muestra la adherencia de las gotas de grasa a la matriz del cilindro (400).
Figura 3 -48 Cilindros creos y leucocitos (200 x)
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Figura 3 -49 Cilindros creos, leucocitos y bacterias (400 x)
Figura 658 Cilindro creo amplio teido con Figura 6-55 Cilindro granular degenerndose en un KOVA(x 400). cilindro creo (x 400) Fuentes: Susan King Strasinger, D.A., M.T. (A.S.C.P.) Marjorie Schaub Di Lorenzo, M.T. (A.S.C.P.) SH Urinalysis and Body Fluids Fourth Edition (figuras 6 49, 6 58, 6 55). Sister Laurine Graff Anlisis de Orina Atlas Color (1987) (figuras 3 -48, 3 -49, 3 -50). CRISTALES (fig. 7.22) Los cristales tienen formas geomtricas uniformes (a), a diferencia de los residuos amorfos, que consisten en acumulaciones de grnulos pequeos sin forma definida (b). Excepto en las enfermedades raras, los cristales en la orina no tienen importancia diagnstica. SEDIMENTOS NORMALES DE CRISTALES Depsitos cristalinos normales Oxalato clcico (en orina cida) (Fig. 7.23) (a) Forma: semejan sobres de correo (Cristal de Oxalato clcico dihidratado) Tamao: 10 - 20 m (equivalente a 1 2 eritrocitos) O bien: (b) Forma: semejante a cacahuetes enteros (Cristal de Oxalato clcico monohidratado) Tamao: aproximadamente 50 m; refractan intensamente la luz. Color: incoloro, muy brillante. Acido rico (en orina cida) (Fig. 7.24) Forma: variada (cuadros, rombos, cubos o forma de "rosas") Tamao: 30 - 150 m Color: amarillo o rojo parduzco Fosfatos triples (en orina neutra o alcalina) (Fig. 7.25) Forma: rectangulares (forma de tapa de atad) (a), o semejantes a hojas de helecho o estrellas (b) Tamao: 30 - 150 m Color: incoloros; refractan la luz Biurato de amonio (en orina alcalina) (Fig. 7.26) Forma: semejan cactos (a) o haces de agujas (b) Tamao: aproximadamente 20 m (2 - 3 eritrocitos) Color: amarillo; refractan la luz. (Frecuentemente se encuentran junto con los fosfatos.) Depsitos cristalinos normales; Cristales menos frecuentes Fosfato clcico (en orina neutra o alcalina) (fig. 7.27) Forma: estrellada Tamao: 30 - 40 m Color: ninguno. Carbonato clcico (en orina neutra o alcalina) (fig. 7.28) Cristales: sumamente pequeos; agrupados en pares; semejan granos de mijo o maz
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Color: ninguno. (Si se aade cido actico al 10%(reactivo no. 2) se disuelven, produciendo burbujas de gas). Sulfato clcico (en orina cida) (fig. 7.29) Forma: prismas alargados u hojillas, separados o formando haces Tamao: 50 - 100 m. (Se pueden diferenciar de los cristales de fosfato clcico midiendo el pH de la orina.) Residuos amorfos Fosfatos amorfos (en orina alcalina) (Fig. 7.30) Grnulos pequeos, blanquecinos, frecuentemente dispersos. Estos grnulos son solubles en una solucin de cido actico al 10% (reactivo no. 2) (1 gota por cada gota de sedimento). Uratos amorfos (en orina cida) (Fig. 7.31) Grnulos muy pequeos, de color amarillento, agrupados en racimos compactos. No se disuelven en cido actico al 10% (reactivo no. 2), pero lo hacen si la orina se calienta suavemente. (En la orina que se ha conservado en el frigorfico se suelen encontrar gruesos precipitados de uratos.)
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Figura 7.22 Cristales: a) Cristales, b) Residuos amorfos. Figura 7.23 Cristales de oxalato de Calcio: a) Cristales en forma de sobres de correo (Cristal de Oxalato clcico dihidratado), b) Cristales en forma semejante a cacahuetes enteros (Cristal de Oxalato clcico monohidratado). Figura 7.24 Cristales de cido rico. Figura 7.25 Cristales de Fosfato triple (Fosfato Amnico magnsico) rectangulares (forma de tapa de atad) (a), o semejantes a hojas de helecho o estrellas (b) Figura 7.26 Cristales de biurato de amonio: a: cristales en forma de cactus, b: cristales en forma de aguja formando haces. Figura 7.27 Cristales de fosfato de calcio. Figura 7.28 Cristales de carbonato de calcio. Figura 7.29 Cristales de sulfato de calcio. Figura 7.30 Fosfatos amorfos. Figura 7.31 Uratos amorfos. Figura 7.32 Cristales de Cistina. Figura 7.33 Cristales de colesterol. Obsrvese el aspecto de vidrio roto. Figura 7.34 Cristales de bilirrubina. Figura 7.35 Hongos levaduriformes. Figura 7.36 Schistosoma haematobium. OTROS DEPSITOS CRISTALINOS (OTROS SEDIMENTOS DE CRISTALES) Los siguientes se encuentran raras veces en la orina. Sin embargo, cuando existen se suelen observar en grandes cantidades. Cistina (en orina cida) (fig. 7.32) Forma: laminillas hexagonales Tamao: 30 - 60 m Color: incoloras; refractan intensamente la luz. Estos cristales solo se encuentran en orina fresca, ya que son solubles en amonaco. (Se suelen observar en la cistinuria, una enfermedad hereditaria.) Colesterol (en orina cida) (Fig. 7.33) Forma: laminillas cuadradas con escotaduras en un lado (semejan un vidrio roto) Tamao: 50 - 100 m Color: incoloras; refractan la luz. Solubles en ter.
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Bilirrubina (muy rara) (Fig. 7.34) Forma: diversos cristales sumamente pequeos, cuadrados, esfricos o en agujas Tamao: 5m (aproximadamente 1/2 eritrocito) Color: castao. (El ensayo qumico de pigmentos biliares resulta positivo.) Sulfonamidas acetiladas (en orina neutra o cida) Se observan en pacientes que estn siendo tratados con sulfonamidas. Los cristales de sulfonamidas tienen formas variadas, aunque suelen formar ruedecillas o agujas. Si se observan en la orina cantidades importantes de cristales no identificados, avergese si el paciente se est tratando con sulfonamidas. Se debe notificar la existencia de estos cristales, ya que pueden causar lesiones renales. Hongos (fig. 7.35) Tamao: 5-12 m. Forma: cuerpos redondos u ovales de diversos tamaos encontrados juntos. No debe confundirse con los eritrocitos. Se pueden observar brotes. No son solubles en cido actico. Los hongos y las levaduras se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Verifique que la orina sea fresca. Huevos y larvas de parsitos A continuacin se puede encontrar: Huevos de Schistosoma haematobium: se acompaan de eritrocitos(Fig. 7.36); Microfilarias de W. bancrofti (ver Fig. 4.121.): la orina es blanquecina y turbia. 7.2.8 DETECCIN DE LA INFECCIN PRODUCIDA POR SCHISTOSOMA HAEMATOBIUM En los pases en donde la esquistosomiasis es endmica, las muestras de orina se examinan para buscar huevos de Schistosoma haematobium. Los trofozotos de Trichomonas vaginalis tambin pueden ser encontrados. Las microfilarias de Wuchereria bancrofti y Onchocerca volvulus tambin se pueden encontrar en el sedimento urinario centrifugado, proveniente de la orina de pacientes de pases en los que la filariasis es endmica. La primera evidencia indirecta de la infeccin por Schistosoma haematobium es la hematuria y/o proteinuria, que se puede detectar mediante una tira reactiva de orina (ver seccin 7.2.2). La hematuria macroscpica indica una fuerte infeccin. Los dos mtodos usados para la deteccin de huevos de Schistosoma haematobium son los de sedimentacin y filtracin. El mtodo de sedimentacin es menos sensible pero es ms barato y ms simple de realizar. La tcnica de filtracin se utiliza cuando se necesita informacin cuantitativa para fines de vigilancia epidemiolgica. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Centrfuga (mtodo de sedimentacin) Tubos de centrfuga cnicos, 15 ml (mtodo de sedimentacin) Soporte para filtro, 13 o 25 mm de dimetro (mtodo de filtracin) Filtro de membrana, tamao de poro 12-20 m (nylon o policarbonato) o papel de filtro tipo Whatman N 541 (o equivalente) (mtodo de filtracin) Frasco cnico para la recoleccin de orina Pipetas Pasteur (mtodo de sedimentacin) Jeringa de plstico, 10 ml (mtodo de filtracin) Yodo Lugol, solucin al 0,5% (reactivo no. 37) (mtodo de filtracin) Formaldehido, solucin al 37%. Mtodo Recogida de muestras de orina El nmero de huevos en la orina vara a lo largo del da, es ms alto en la orina obtenida entre 10:00-14:00. Por consiguiente, la muestra debe ser recogida entre estos tiempos y debe consistir en una sola muestra de orina terminal (vase la seccin 7.1.1) de al menos 10 ml. Alternativamente, puede hacerse una coleccin de 24 horas de la orina terminal (ver seccin 7.1.1). Toda la muestra debe ser examinada, ya que puede contener slo unos pocos huevos. Pida al paciente que recoja la orina en un recipiente limpio o frasco. Examine la muestra de inmediato. Si la orina no puede ser examinada por una hora o ms, aadir 1 ml de formalina diluida (solucin al 37% de formaldehido) por cada 100 ml de orina. Esto conservar los huevos que pudieran estar presentes. Nota: Si la formalina no est disponible, se puede aadir 2 ml de leja de uso domstico ordinario por cada 100 ml de orina. Advertencia: La formalina y la leja son corrosivas y no deben ser ingeridas. Mtodo de sedimentacin 1. Agite la muestra de orina bien y verter en el frasco cnico. 2. Deje que la orina sedimente durante 1 hora. Eliminar el sobrenadante y transferir el sedimento a un tubo de centrfuga. Centrifugar a 2000 g durante 2 minutos. 3. Examine el sedimento bajo el microscopio para detectar la presencia de huevos. No aumente el tiempo de centrifugacin y no exceda 2000g ya que esto puede alterar los huevos y la liberacin de los miracidios. Importante: -Procesar la muestra tan pronto como sea posible;
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-Agitar el envase antes de verter la muestra de orina en el frasco cnico; -etiquetar los portaobjetos y tubos con cuidado. Mtodo de filtracin 1. Colocar un filtro en el soporte del filtro. 2. Agite la muestra de orina con cuidado y sacar 10 ml en la jeringa (Fig. 7.37). Conecte la jeringa al soporte del filtro. 3. Expulsar la orina desde la jeringa a travs del filtro sobre un cubo o un fregadero (fig. 7.38). 4. Desconecte la jeringa del soporte del filtro. Introduzca aire en la jeringa (Fig. 7.39), vuelva a conectar la jeringa al soporte del filtro y expulsar el aire a travs del filtro (Fig. 7.40). 5. Desconecte la jeringa del soporte del filtro. Con unas pinzas, retire con cuidado el filtro de membrana o el papel de filtro y colocarlo en un portaobjetos. La membrana de nylon y papel de filtro se deben colocar boca arriba, mientras que la membrana de policarbonato debe colocarse boca abajo. 6. Aadir una gota de solucin de Yodo de Lugol para mejorar la visibilidad de los huevos. 7. Examine el filtro entero bajo el microscopio en x10 o x40. Registrar los resultados como el nmero de huevos por 10 ml de orina.
Figura 7.37 Extraer orina en la jeringa. Figura 7.38 Expulsando la orina a travs del filtro. Figura 7.39 Extraer aire en la jeringa.
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Figura 7.40 Expulsin de aire de la jeringa Figura 7.41 Schistosoma haematobium a: miracidio; b: clulas de llama La reutilizacin de los filtros Si ha utilizado un filtro de plstico, retire inmediatamente despus de utilizar y sumergirlo toda la noche en una solucin de hipoclorito al 1% (leja domstica). Despus de remojar el filtro, lavarlo a fondo con una solucin de detergente y luego enjuague varias veces con agua limpia. Revise el filtro bajo el microscopio para asegurarse que est libre de parsitos antes de volver a usarlo. El examen microscpico Los huevos de Schistosoma haematobium son grandes, alrededor de 120 a 150 m de largo, y tienen un espoln terminal en un extremo (fig. 7.41 (a)). Un embrin (el miracidio) se puede ver en el interior del huevo. A veces es necesario determinar si los huevos son viables. Esto se puede hacer si la muestra es fresca y si no se han aadido conservantes. Mire cuidadosamente los huevos para ver si los embriones se estn moviendo. Este es el mejor indicador de la viabilidad. Si no se observa movimiento, busque las "clulas de llama" (Fig. 7.41 (b)). Hay cuatro clulas de llama, uno en cada esquina del embrin. Utilice un objetivo x100 con ligera reduccin de la iluminacin para buscar el rpido movimiento de los cilios (pelos cortos) en las clulas de llama. Informe de los resultados Cuando se utiliza la tcnica de filtracin de jeringa, los resultados pueden ser reportados de acuerdo a las categoras para recuento de huevos: Infeccin liviana: 1- 49 huevos por 10 ml de orina. Infeccin pesada:> 50 huevos por 10 ml de orina. Una tercera categora, tales como > 500 huevos por 10 ml de orina, o > 1.000 huevos por 10 ml de orina, puede ser apropiada en las zonas donde la intensidad de la infeccin con frecuencia alcanza este nivel (es decir, en ms de 10% de los casos). 7.2.9 DETECCIN DE BACTERIAS EN LA ORINA En personas sanas, la orina no contiene prcticamente ningn microorganismo. Las bacterias se pueden encontrar en pacientes que tienen una infeccin de alguna parte del tracto urinario (por ejemplo, uretritis, cistitis o nefritis), o donde las bacterias de una infeccin en otra parte del cuerpo se excretan en la orina. La orina se centrifuga a alta velocidad y el sedimento resultante se examina bajo el microscopio (como se describe en la seccin 7.2.7). Esta es la parte ms importante del anlisis. Sin embargo, el sedimento tambin puede ser usado para hacer frotis que se colorean con la tincin de Gram y con la tincin de Ziehl-Neelsen y se examinan bajo el microscopio. El cultivo es siempre esencial para la determinacin precisa de la identidad de los microorganismos que se encuentran y la cantidad presente. Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Matraz Erlenmeyer estril de 250 ml con tapn Centrfuga Tubos de centrfuga cnicos estriles con tapn Asa de siembra Mechero Bunsen o lmpara de alcohol Etanol al 70% Los reactivos necesarios para la tincin de Gram (vase la seccin 5.3.1) y la tincin de ZiehlNeelsen (ver seccin 5.3.3). Mtodo Coleccin de muestras
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Los genitales se deben limpiar de antemano, utilizando agua y jabn. Se recoge una muestra de chorro medio (ver seccin 7.1.1) en el matraz estril. Examnese lo ms rpido posible. (Otra forma es recoger la orina es en un tubo cnico enjuagado slo con agua hirviendo y examinar de inmediato.) Preparacin de los portaobjetos 1. Verter 10 ml de orina fresca en un tubo de centrfuga estril. Sellar el tubo, ya sea con una tapa a rosca o con un tapn de algodn estril que se fijar en su sitio con gasa y un hilo. 2. Centrifugar la muestra a 1500 g durante 10 minutos. Si se sospecha de la tuberculosis, se centrifuga una muestra adicional de 10 ml a 5000 g durante 20 minutos. 3. Retirar el sobrenadante de los dos tubos (fig. 7.42). Usando un asa de inoculacin (esterilizada por flameado) (Fig. 7.43), mezclar el sedimento con agua destilada hasta obtener una suspensin homognea.
Figura 7.42 Vertiendo el lquido sobrenadante. Figura 7.43 Mezcla del sedimento urinario. Figura 7.44 Preparacin de un frotis del sedimento urinario.
4. Usando un asa de inoculacin (esterilizada por flameado), preparar un frotis de cada una de las dos suspensiones (fig. 7.44). Deje que los portaobjetos se sequen al aire. 5. Fije los frotis anegndolos con etanol y flamendolos, o por calentamiento. 6. Teir el primer portaobjetos con coloracin de Gram (vase la seccin 5.3.1) y el segundo con Ziehl-Neelsen (ver seccin 5.3.3). El examen microscpico Examine los portaobjetos bajo el microscopio con el objetivo x100. Examinar el portaobjetos teido con tincin de Gram para lo siguiente (vase la seccin 5.3.1): Pus (muchos leucocitos teidos de rojo o fucsia por la tincin de Gram) Bacilos Gram-negativos (Fig. 7.45 (a)) Cocos Gram-positivos (Fig. 7.45 (b)) Bacilos difteroides Gram-positivos (Fig. 7.45 (c)) Levaduras Gram-positivas (Fig. 7.45 (d)). Examine el portaobjetos teido con Ziehl-Neelsen para buscar bacilos de Koch, o en este caso, BAAR. Los bacilos aparecen de color rojo oscuro y se disponen en filas (Fig. 7.46).
Figura 7.45 Examen bacteriolgico de la orina a: bacilos Gram-negativos, b: cocos grampositivos, c: bacilos difteroides Gram-positivos, d: levaduras Gram-positivas. Figura 7.46 Bacilo de la tuberculosis (bacilo de Koch). Informe de los resultados
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Indique si se han observado pus o leucocitos presentes. Haga una descripcin precisa de los microorganismos que se encuentran. Ejemplo Organismos que se encuentran: -Abundantes leucocitos -Escasos eritrocitos -Escasas clulas epiteliales -Abundantes cocos grampositivos en racimos. O bien, Organismos que se encuentran: -Escasos leucocitos -Muy pocos eritrocitos -Escasas clulas epiteliales -Escasos bacilos Gram-negativos. Gonococos Nunca diagnosticar una infeccin gonoccica sobre la base de un examen del sedimento urinario. Los gonococos se deben localizar en el pus uretral (ver seccin 5.5). Tiras reactivas para orina Las bacterias en la orina tambin se pueden detectar usando tiras reactivas para orina (ver seccin 7.2.2). Una tira de medicin disponible en el mercado con reactivos para la deteccin de nitrito (que es producido por ciertas bacterias patgenas) y esterasa de leucocitos se ha demostrado que tienen una alta especificidad y una alta sensibilidad para la deteccin de bacterias en la orina. Cultivos de orina Los cultivos de orina se indican cuando muy altos niveles de bacterias se detectan por microscopa o el uso de tiras reactivas de orina. En tales casos, una muestra de orina debe ser enviada al laboratorio de bacteriologa sin demora por un cultivo semi-cuantitativo de los microorganismos patgenos y para la determinacin de su sensibilidad a los antimicrobianos. Este procedimiento es esencial para: identificar la especie de las bacterias determinar el nmero de bacterias presentes (si stas provienen de la contaminacin de la muestra posterior a su recoleccin, sern sumamente escasas) aislar microorganismos que se encuentren en escasa cantidad decidir cul ser el antibitico ms efectivo en el tratamiento de la infeccin (ensayos de susceptibilidad a los antimicrobianos).
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8. EXAMEN DEL LQUIDO CEFALORRAQUDEO (LCR)

El LCR se halla contenido en la cavidad que rodea al encfalo en el crneo y la mdula espinal en la columna vertebral (fig. 8.1). Baa los tejidos del sistema nervioso central y ayuda a proteger el encfalo y la mdula espinal de lesiones. El volumen del LCR en los adultos es de 100-150 ml. El volumen es menor en los nios y vara en funcin de la longitud del cuerpo. 8.1 Las razones ms comunes para la investigacin de LCR Las razones ms comunes para la investigacin de LCR son las de excluir: - Meningitis - Hemorragia en el sistema nervioso central - Ciertos tipos de cncer. La meningitis es una inflamacin de las meninges, las membranas que recubren el crneo y que cubre el cerebro y la columna vertebral. A menudo es causada por una infeccin (vase la Tabla 8.1). La leucemia, los tumores con manifestaciones en el cerebro y el envenenamiento por plomo tambin se han demostrado que producen meningitis. Nota: La investigacin de laboratorio inmediata del LCR puede salvar la vida si se sospecha de meningitis. 8.2 Recogida de muestras de LCR Las muestras de LCR deben ser recogidos nicamente por un mdico o una enfermera especialmente entrenada. 1. La aguja para punciones lumbares se introduce entre la cuarta y la quinta vrtebras lumbares hasta una profundidad de 4 - 5 cm. Se retira el mandril y el lquido fluye por la aguja (Fig. 8.2). 2. Entre 6 y 7 ml de LCR se recogen en cada uno de dos tubos, numerados 1 y 2. El tubo 1 se utiliza para la inspeccin visual, microscpica y anlisis qumico. El tubo 2 se utiliza para cultivo bacteriano. 3. Otra opcin de recoleccin: El LCR se recoge en dos tubos, que se numeran 1 y 2: tubo 1: esterilizado; sirve para recoger algunas gotas tubo 2: en este tubo se recogen 6 - 7 ml. El tubo 1 se desecha si contiene abundantes eritrocitos. El tubo 2 se usa para: observar el aspecto del lquido estudiar la concentracin de leucocitos calcular la cantidad de glucosa efectuar ensayos del total de protenas llevar a cabo el ensayo de globulinas con el mtodo de Pandy examinar con el microscopio: (a) preparaciones hmedas, en busca de tripanosomas (b) preparaciones con tincin de Gram, en busca de otros microorganismos (c) preparaciones con tincin de Ziehl y Neelsen, en busca de bacilos resistentes a los cidos. 8.3 El examen de muestras de LCR 8.3.1 Precauciones No se demore en la prueba del LCR. Las clulas y los tripanosomas se lisan rpidamente en las muestras de LCR. La glucosa tambin se destruye rpidamente, a no ser conservada con oxalato de flor (reactivo n 26, Ver seccin 10.1). Trabajar con cuidado y econmicamente. A menudo, slo una pequea cantidad de lquido cefalorraqudeo est disponible para su examen. El espcimen es difcil de reunir as que no pierda nada de eso. El LCR puede contener microorganismos virulentos. Usar pipetas taponadas con algodn no absorbente, o utilice una propipeta de goma en la pipeta para la aspiracin del lquido. Nunca pipetear LCR por va oral.
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Figura 8.1 Localizacin del LCR Figura 8.2 La toma de una muestra de LCR (puncin lumbar, en este caso). Tabla 8.1 Las causas ms comunes de la meningitis Tipo de infeccin Microorganismo especfico Bacteriana Neisseria meningitidis Streptococcus spp., especialmente S. pneumoniae Staphylococcus spp. Haemophilus influenzae Escherichia coli Listeria monocytogenes Leptospira spp. Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Pseudomonas spp. Por protozoos Plasmodium spp. Viral Virus Coxsackie arbovirus Echoviruses Poliovirus Virus de las paperas Arenavirus Herpesvirus humanos Virus de la hepatitis Fngica Candida albicans Cryptococcus neoformans 8.3.2 Examen directo Aspecto del LCR Describe el aspecto de la muestra de LCR en el informe del laboratorio, y se debe indicar en ste. LCR Claro El LCR normal es transparente e incoloro (Fig. 8.3 (a)). LCR turbio Cuando el LCR es ligeramente turbio o blanco grisceo denota la presencia de pus (Fig. 8.3 (b)). LCR sanguinolento El LCR puede ser turbio y de color rosceo o rojizo (Fig. 8.3 (c)): porque se hayan lesionado vasos sanguneos al efectuar la puncin (en este caso habr ms sangre en el tubo 1 que en el tubo 2) porque exista una hemorragia subaracnoidea (si es as, ambos tubos tendrn el mismo color). Si solo se cuenta con un tubo con LCR, espere a que se asienten los eritrocitos (o centrifguese) y examine el lquido flotante. 1. Si el lquido flotante es claro (Fig. 8.4), la presencia de sangre obedecer a la lesin accidental de un vaso sanguneo. 2. Si este lquido es sanguinolento (Fig. 8.5), la sangre provendr de una hemorragia subaracnoidea. Xantocroma Coloracin amarilla del LCR (Fig. 8.6). La pueden causar: una hemorragia antigua ictericia grave una compresin vertebral.
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Figura 8.3 Examen del aspecto del LCR: LCR claro (normal); b: LCR turbio, c: LCR sanguinolento. Figura 8.4 LCR de un paciente con una lesin de los vasos sanguneos. Figura 8.5 LCR de un paciente con una hemorragia subaracnoidea. Figura 8.6 LCR de un paciente con xantocroma. Formacin de cogulos Indique en el informe si existen cogulos. Examine los tubos que contienen LCR 10 minutos despus de haber obtenido las muestras para determinar si se han formado cogulos: 1. LCR normal: no contiene cogulos. 2. Se producen cogulos en algunas enfermedades: meningitis tuberculosa: un solo cogulo, o bien numerosos cogulos pequeos y delgados cuya presencia fcilmente puede quedar inadvertida meningitis purulenta: un solo cogulo voluminoso compresin vertebral: el LCR se coagula completamente. 8.3.3 El examen microscpico El examen microscpico del LCR incluye: o Examen de una preparacin hmeda para las clulas sanguneas; o Examen de una preparacin hmeda para tripanosomas en las zonas donde se produce la tripanosomiasis africana; o Examen de un frotis con tincin de Gram para los organismos que causan la meningitis, como la Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenza (vase la Tabla 8.1); o Examen de un frotis teido con Ziehl-Neelsen si se sospecha de meningitis tuberculosa; o Examen de hongos como Cryptococcus neoformans y Candida albicans, si sospecha. Los exmenes anteriores se realizan utilizando el sedimento de un LCR centrifugado. Clulas de la sangre en el LCR El LCR puede contener clulas sanguneas en cantidades variables en ciertas enfermedades. El LCR se examina: -Para detectar eritrocitos; -Para determinar el nmero total de leucocitos (concentracin del nmero de leucocitos); -Para determinar los tipos de leucocitos presentes (recuento diferencial de leucocitos).
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Importante: La investigacin de los eritrocitos debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible despus de la recogida de la muestra, ya que se lisan rpidamente. Determinacin de la concentracin del nmero de leucocitos Materiales y reactivos (Fig. 8.7) Microscopio Cmara de recuento de Fuchs-Rosenthal (si no est disponible, se puede usar en su lugar una cmara de recuento Neubauer mejorada) Pipeta Pasteur con perilla de goma Cubreobjetos (suministrado con la cmara de recuento) Frasco, 2-5 ml Solucin de Trk (reactivo no. 61).
Figura 8.7 Materiales para la determinacin de la concentracin del nmero de leucocitos. Figura 8.8 Cubriendo la cmara de recuento con un cubreobjetos. Figura 8.9 Llenado de la cmara de recuento con LCR. Figura 8.10 Uso de la cmara de recuento Fuchs-Rosenthal. Mtodo 1. Tape la cmara para recuento con la laminilla de vidrio que la acompaa (cubrecmara) (Fig. 8.8). 2. Mezcle el LCR con suavidad (Fig. 8.9). Llene la cmara con el lquido: sin diluir, si el LCR es claro diluido, si el LCR es turbio. Prepare una dilucin de 1 x 20 empleando 0,05 ml de LCR y 0,95 ml de solucin de Trk. Aspire con la pipeta, traslade a un frasco pequeo y mzclese. 3. Deje reposar la cmara para recuento en la mesa de trabajo durante 5 minutos, a fin de que las clulas se asienten. A continuacin coloque la cmara en la platina del microscopio.
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4. Cuente las clulas que haya en 1 mm3 de LCR, utilizando el objetivo x 10. Al notificar los resultados en unidades SI informe como "nmero x 106/l el valor no cambia. Ejemplo: 150 clulas por mm3 se notifican como 150 x 106/l. Importante: Si se emplea LCR sin diluir, examine las clulas con el objetivo x 40 para cerciorarse de que se trata efectivamente de leucocitos. Si hay eritrocitos haga el recuento utilizando el objetivo x 40. Uso de la cmara de recuento Fuchs-Rosenthal La cmara cuadriculada de Fuchs y Rosenthal para recuento tiene un rea de 9 mm2 (cmara modificada), o de 16 mm2. Su profundidad es de 0,2 mm. Cuente las clulas en 5 mm2 empleando los cuadros 1, 4, 7, 13 y 16 (Fig. 8.10). Si se usa LCR sin diluir no se necesita hacer clculo alguno; el nmero de clulas que se haya contado dar el nmero correspondiente por milmetro cbico de LCR. Si se emplea LCR diluido, el nmero de clulas contadas multiplicado por 20 dar el nmero de clulas por mm3 de LCR. Es decir, dicho de otro modo, si se utiliza una dilucin de 1 en 20 de LCR, el nmero de clulas contadas se multiplica por 20 para obtener el nmero de clulas por mm3 de LCR. Uso de la cmara de recuento Neubauer mejorada Al emplear la cmara de Neubauer mejorada cuente las clulas que haya en toda el rea cuadriculada, que es de 9 mm2. Si se usa LCR sin diluir multiplique las clulas contadas por 10 y divida entre 9 para obtener el nmero de clulas por mm3 de LCR. Si se emplea LCR diluido multiplique las clulas contadas por 20 y divida entre 9 para obtener el nmero de clulas por mm3 de LCR (si se utiliza una dilucin de 1 en 20 de LCR). Resultados El LCR normal contiene menos de 5 x 106 leucocitos por litro (menos de 5 por mm3). Un aumento del nmero de leucocitos se puede encontrar en: La meningitis bacteriana (meningoccica, Haemophilus influenzae, neumoccica): principalmente neutrfilos. Meningitis tuberculosa y la meningitis viral: en su mayora linfocitos Tripanosomiasis africana: principalmente linfocitos, pero las clulas de Mott se pueden ver, as como tambin tripanosomas. Determinacin de la fraccin del nmero de tipo de leucocitos (Recuento diferencial de leucocitos) Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Centrfuga Tubos de centrfuga Pipetas Tincin de Romanowsky (ver seccin 9.10.1) Metanol. Mtodo Si el LCR no contiene muchas clulas (menos de 200 x 106/l): 1. Se centrifuga el LCR en 3000 g durante 10 minutos. Retirar el lquido sobrenadante a otro tubo (para ser utilizado para otras pruebas). 2. Mezcle el sedimento tocando el extremo del tubo. Extienda la mezcla sobre un portaobjetos limpio y dejar secar. 3. Fijar con metanol y colorear con la tincin de Romanowsky como se describe en la seccin 9.10.3. Se examinan las clulas bajo el microscopio utilizando el objetivo x40. Si hay numerosas clulas en el LCR: 1. Pipetear una gota de LCR sin centrifugar, mezcle el LCR sobre un portaobjetos. 2. Hacer un frotis delgado y dejar secar. 3. Fijar con metanol y colorear con la tincin de Romanowsky como se describe en la seccin 9.10.3. Preparacin hmeda para examen directo en busca de tripanosomas Deposite una gota de sedimento de de LCR en un portaobjetos y ponga un cubreobjetos sobre ella. Examine con el objetivo x 40. Resultados El descubrimiento de tripanosomas mviles en el LCR indica que la enfermedad ha llegado a su etapa tarda en que el sistema nervioso se encuentra infectado (vase la seccin 4.7.3). Por medio de la prueba de Pandy se determina si existe un aumento en las protenas del LCR. La concentracin de protena del LCR se eleva y la prueba de Pandy es positiva (vase la seccin 8.3.5). Asimismo el lquido contiene una cantidad mayor de leucocitos. En una preparacin teida con la coloracin de Romanowsky se puede determinar si los leucocitos observados son linfocitos (L) y con frecuencia tambin se identifican las clulas de Mott (M). Estas clulas son voluminosas, con vacuolas y una cantidad abundante de inmunoglobulina M (Ig M) que toma un color oscuro con la eosina de la tincin de Romanowski (ver seccin 9.10.4).
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Figura 8.11 Tripanosomas en una preparacin hmeda teidas con tincin de Romanowsky L: linfocitos, M: clulas de Mott, T: tripanosomas
Tincin de Gram para reconocer casos de meningitis Preprese un frotis con el sedimento del LCR y djese secar al aire. Tase con el mtodo de Gram, como se indica en la seccin 5.3.1. Resultados La presencia de cualesquiera microorganismos que se observen en el frotis con la tincin de Gram se deber notificar, indicando: su reaccin al mtodo de Gram: positiva o negativa su morfologa: cocos, diplococos, bacilos, etc. la cantidad observada. No es posible identificar con claridad las especies empleando solamente el frotis teido. Se necesita cultivar los microorganismos. Entre los microorganismos que causan meningitis figuran: Neisseria meningitidis (meningococos) (Fig. 8.12) gramnegativos diplococos que se sitan uno al lado de otro intracelulares; se hallan en el interior de los neutrfilos. Nota: Ocasionalmente se observan afuera de los leucocitos en cantidad reducida. Streptococcus pneumoniae (neumococos) (fig. 8.13) - grampositivos - diplococos que se juntan por los extremos - se rodean de una cpsula que no es visible con la tincin de Gram - generalmente son numerosos no son intracelulares. Haemophilus influenzae (especialmente en nios pequeos) (Fig. 8.14) gramnegativos bacilos pequeos (cocobacilos) no son intracelulares suelen ser numerosos. En todas estas formas de meningitis los leucocitos que se observan son neutrfilos. Bacilos grampositivos Se observan raras veces. Pueden pertenecer al grupo de Listeria. Su cultivo es esencial.
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Preparacin de Ziehl y Neelsen para reconocer la meningitis tuberculosa Mtodo Si se sospecha que existe una meningitis tuberculosa, la muestra de LCR se debe dejar en reposo. Generalmente se forma un cogulo frgil. Este cogulo se debe extraer, extenderlo en un portaobjetos y tratarlo con el mtodo de Ziehl y Neelsen, como se indica en la seccin 5.3.3. Resultados Si se observan microorganismos (Fig. 8.15), informe que en el frotis se han encontrado "bacilos resistentes a los cidos (BAAR). HONGOS EN EL LCR En los frotis teidos con el mtodo de Gram se pueden observar hongos (muy raras veces) (Cryptococcus neoformans y Candida albicans). Cryptococcus neoformans puede ser encontrado en un LCR turbio, con linfocitos Mtodo En un portaobjetos agregue y mezcle: una gota de sedimento de LCR centrifugado una gota de tinta china. Examine esta mezcla entre un portaobjetos y un cubreobjetos. Los hongos se reconocern de la manera siguiente: Cryptococcus neoformans aparece de la siguiente manera (Fig. 8.16): esporas redondeadas con gemas que contienen granulaciones grisceas cada grupo de 1 - 3 esporas se rodean de una cpsula incolora Candida albicans se pueden encontrar en una preparacin hmeda no teida del sedimento de LCR. Aparece como sigue (fig. 8.17): Candida (LCR claro, con escasos leucocitos) - Esporas ovales, con gemas - Filamentos micelares cortos
Figura 8.15 BAAR (Bacilos cido Alcohol Resistentes).
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8.3.4 Determinacin de la concentracin de glucosa en el LCR Las concentraciones de glucosa en el LCR son normalmente de aproximadamente el 60% de los de la sangre, es decir, 2.5 a 4.2 mmol / l (45-75 mg/100 ml). En la meningitis (especialmente la meningitis purulenta o bacteriana, y en cierto grado en la meningitis tuberculosa) se reduce considerablemente la cantidad de glucosa en el LCR. Importante: Ya que la glucosa del LCR se descompone rpidamente una vez que se ha recogido el lquido, es importante que esta determinacin se efecte tan pronto como sea posible. Mtodo Para la determinacin de las concentraciones de glucosa en el LCR, todos los mtodos que se utilizan para la determinacin de las concentraciones de glucosa en la sangre se pueden aplicar. Cuando se utiliza el mtodo de la ortotoluidina (vase la seccin 10.1), se necesita cuatro veces ms LCR que en el ensayo en sangre. Nota: Desde hace varios aos y hasta la actualidad, se utiliza el mtodo enzimtico para glucosa, el mtodo colorimtrico de la glucosa oxidasa, el cual est extendido ampliamente y ya resulta de fcil acceso. (Lase pgina anexa sobre la tcnica de la glucosa oxidasa.) Importante: A medida que la glucosa en el LCR se destruye rpidamente una vez que se recoge el lquido, es importante para llevar a cabo la estimacin de la concentracin de glucosa tan pronto como sea posible. Si existe la posibilidad de una tardanza, el LCR se deber preservar con oxalato de flor (vase el reactivo No. 26). 8.3.5 Determinacin de la concentracin de protenas en el LCR Principio La concentracin total de protenas en el LCR se mide mediante la dilucin de la LCR en cido Sulfosaliclico (ASS) y la comparacin de la turbidez producida con la de un conjunto de tubos que contienen estndares de protena. Un nivel de globulina elevada en el LCR se muestra mediante la adicin del LCR a una solucin de fenol en la prueba de Pandy (ver ms abajo). Materiales y reactivos (fig. 8.18) LCR: centrifugar el LCR a 2000 g durante 5 minutos y usar el lquido sobrenadante Pipetas graduadas Pipetas goteras (goteros) Tubos de ensayo Gradilla Cartn Negro cido sulfosaliclico, solucin al 3% (sin reactivo. 57) Reactivo de Pandy (reactivo no. 41) Estndares de protenas (vase la seccin 7.2.5). Mtodo para la determinacin de protenas totales Con una pipeta coloque 3 ml de la solucin al 3% de cido sulfosaliclico en un tubo de ensayo igual que los de las protenas estandarizadas. 2. Aada 1 ml del LCR sobrenadante claro, y mzclelo. Djelo reposar 5 minutos. 3. Compare la turbidez resultante con la del juego de protenas estandarizadas (Fig. 8.19). Anote las protenas del LCR en trminos de g/l. Resultados La concentracin normal de protenas en el LCR es de 100-450 mg/l (0,1 - 0,45 g/l). La concentracin de protena se incrementa en: en la meningitis, las hemorragias subaracnoideas y las compresiones vertebrales; en la tripanosomiasis africana.
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Figura 8.18 Materiales y reactivos para la determinacin de la concentracin de protenas del LCR. Figura 8.19 Comparacin de una muestra de prueba con de los estndares de protenas.
Nota: Las concentraciones de protenas en el LCR son muy bajas en comparacin con otros lquidos orgnicos, por lo que no pueden utilizarse tcnicas convencionales, como el mtodo de Biuret, que es adecuada para la medicin de protenas sricas, pero de baja sensibilidad para el LCR. Las protenas, a diferencia de los elementos formes, son bastante estables en el LCR, por lo que puede enviarse a un laboratorio externo para su determinacin sin necesidad de emplear mtodos de conservacin especiales. Para la determinacin cuantitativa de protenas del LCR no pueden utilizarse las tcnicas convencionales empleadas para las muestras de sangre. Los laboratorios clnicos utilizan tcnicas modificadas de la reaccin de Biuret, u otras como el mtodo turbidimtrico de Meulemans. Como mtodos cuantitativos resaltan el mtodo descrito (ASS), el mtodo de Meulemans (turbidimtrico cuantitativo con ASS ms el agregado de Sulfato de Sodio que ayuda a precipitar y estabilizar a las globulinas (producir turbidez), el ASS lo hace ms con la albmina.) Los mtodos recomendados que estn ganando terreno en la determinacin cuantitativa de protenas totales en el LCR por su sensibilidad y gran reproducibilidad son los mtodos de unin al colorante como el mtodo de Bradford que usa Azul Brillante de Coomasie G-250 descrito por algunos como caro; y el mtodo del Rojo de Pirogalol ms barato y de fcil acceso actual. La gran sensibilidad de estos mtodos los torna adecuados como para la medicin de las cantidades de protenas totales del LCR y de orina que se encuentran en mucha menos cantidad que en el suero. Por esto, el mtodo de Biuret, muy exacto, y reproducible en suero, pero con una sensibilidad pobre para medir las cantidades en LCR u orina no puede ser usado en estos materiales biolgicos, salvo que se haga algn tipo de concentracin para llegar a la magnitud que puede detectar y cuantificar en estos lquidos, por ej., hacer una dilisis para concentrar las protenas lo que resulta muy engorroso y poco prctico para medirlo de manera rutinaria. (Lase anexo de la tcnica del Rojo de Pirogalol para LCR). Prueba de Pandy para las globulinas En un tubo de ensayo pequeo mida: 1 ml de reactivo de Pandy. 2. Coloque el tubo frente a una pieza de cartn negro. 3. Con la pipeta gotera agregue lentamente: 3 gotas de LCR (Fig. 8.20). Examine la solucin despus de agregar cada gota. 4. Analice los resultados inmediatamente. Resultados Resultado positivo Se forma una zona blanca a medida que las gotas de LCR se mezclan con el reactivo (Fig. 8.21 (a)). Resultado negativo No se forma la zona blanca al mezclarse las gotas de LCR con el reactivo, o bien solo se produce una ligera turbidez que se disuelve en seguida (Fig. 8.21 (b)). Notifique los resultados como: "prueba de Pandy positiva", o "prueba de Pandy negativa".
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Figura 8.20 Adicin de LCR al reactivo de Pandy. Figura 8.21 Prueba de Pandy para las globulinas a: Resultado positivo; b: resultado negativo. 8.3.6 Resumen La tabla 8.2 resume los hallazgos tpicos en el examen del LCR. 8.4 ENVO DE LAS MUESTRAS DE LCR PARA CULTIVO Antes de ser enviadas mantener el LCR en la incubadora a 37 C. No las ponga en el refrigerador. 8.4.1 Materiales y reactivos Frascos planos que contienen un medio de transporte adecuado, como el medio de transporte de Stuart, modificado (reactivo. N 56). 8.4.2 Mtodo del medio de transporte Stuart (para el aislamiento de Neisseria meningitidis) Este es el mejor mtodo. El medio se suministra en frascos de 30 ml que contienen 8 ml de medio slido (a lo largo de un lado de la botella plana). Las botellas se llenan con una mezcla de aire (90%) y dixido de carbono (10%). Siga las instrucciones dadas para gonococos en la seccin 5.5.4. Si es posible, siembre en el medio el sedimento del LCR centrifugado (Fig. 8.22); de lo contrario, utilice el LCR sin tratar. Perodo de conservacin: hasta 4 das a temperatura ambiente.
Figura 8.22 Envo de muestras de LCR para cultivo usando medio de transporte Stuart.
Enfermedad o condicin Meningitis purulenta (bacteriana) Meningitis tuberculosa
Meningitis viral
Paludismo Tripanosomiasis africana Hemorragia subaracnoidea Compresin de
Tabla 8.2 Hallazgos tpicos en el examen del LCR Concentracin Concentracin Concentracin Aspecto de clulas de de protenas de glucosa la sangre > 3000 clulas / Turbio, l, Muy elevada, Muy reducida amarillenta principalmente 1-10 g/l granulocitos 30 300 clulas Claro o casi / l, Elevada Muy reducida claro principalmente linfocitos 10 300 clulas Normal o / l, Claro ligeramente Normal principalmente elevada linfocitos Elevada, Ligeramente principalmente Elevada Reducida turbio granulocitos Claro o 5 clulas / l, ligeramente Elevada Reducida principalmente turbio linfocitos Rojo Claro, de color No es interpretable Normal o No es interpretable Muy elevada No es interpretable Normal
Otros hallazgos Bacterias Bacterias, protenas coaguladas ------
-----Tripanosomas, clulas de Mott Despus de la centrifugacin, rojo ------
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la columna vertebral
amarillento
ligeramente elevada
Fuente de las tcnicas: www.wiener-lab.com.ar
C
SIGNIFICACION CLINICA La patologa ms comn relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es la diabetes mellitus. El diagnstico precoz y el control de los pacientes diabticos, tienen por objeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones resultantes de la hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado. Dado que existen mltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en cada caso la condicin fisiolgica y/o la patologa presente en el paciente. FUNDAMENTOS DEL METODO El esquema de reaccin es el siguiente: glucosa + O2 + H2O GOD > cido glucnico + H2O2 POD > quinonimina roja
Glicemia
enzimtica AA
Para la determinacin de glucosa en suero, plasma, orina o lquido cefalorraqudeo ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados. Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10oC) es estable 60 das a partir de la fecha de su preparacin. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Durante el uso, el Reactivo de Trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no afecta su funcionamiento siempre que se procese un Blanco con cada lote de determinaciones y un Standard por lo menos una vez por semana. Desechar cuando las lecturas del Blanco sean superiores a 0,160 D.O. MUESTRA Suero, plasma, orina o lquido cefalorraqudeo (LCR) a) Recoleccin: - Suero o plasma: se debe obtener suero de la manera usual o plasma recolectado con anticoagulantes comunes. - Orina: si se trata de una muestra aislada, utilizar preferentemente orina fresca. En caso de no poder realizar el ensayo de forma inmediata, conservar la muestra en refrigerador (2-10oC). Puede realizarse el ensayo en orina de 24 horas. En este caso, recolectar la muestra en un recipiente oscuro conteniendo 5 ml de cido actico glacial y conservarlo en hielo. - LCR: en caso de utilizar LCR, el ensayo debe realizarse en forma inmediata a la obtencin de la muestra. b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de heparina o Anticoagulante G (EDTA/fluoruro) para su obtencin. c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por: bilirrubina hasta 10 mg/dl, triglicridos hasta 500 mg/dl, ni hemoglobina hasta 350 mg/dl. El cido ascrbico interfiere en la determinacin en orina en cualquier concentracin. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la destruccin enzimtica de la glucosa sangunea (gluclisis) por hemates y leucocitos es proporcional a la temperatura a la que se conserva la sangre, siendo mxima a 37oC. Este proceso no se inhibe an en estado de congelacin, por lo que la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la extraccin. El sobrenadante lmpido se transfiere a otro tubo para su conservacin. De esta forma la gluco870570000 / 01 Pg. 1 de 6
2 H2O2 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato
REACTIVOS PROVISTOS S. Standard: solucin de glucosa 100 mg/dl (1 g/l). A. Reactivo A: viales conteniendo glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD) y 4-aminofenazona (4-AF). B. Reactivo B: buffer fosfatos pH 7,0 conteniendo 4-hidroxibenzoato. Concentraciones finales GOD (microbiana) .................................................. 10 kU/l POD (rbano) .......................................................... 1 kU/l 4-AF ................................................................... 0,5 mmol/l Fosfatos ................................................ 100 mmol/l, pH 7,0 4-Hidroxibenzoato ................................................. 12 mmol/l REACTIVOS NO PROVISTOS Calibrador A plus de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Standard: listo para usar. Reactivo de Trabajo: reconstituir el contenido de un vial de Reactivo A con una parte de Reactivo B. Transferir al frasco de Reactivo B, enjuagando varias veces el vial con el mismo. Mezclar hasta disolucin completa. Homogeneizar y fechar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de qumica clnica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
sa es estable 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. En caso de no poder procesarse la muestra de la forma indicada, deber adicionarse un conservador en el momento de la extraccin. El LCR puede contaminarse con bacterias y otras clulas por lo que la determinacin debe realizarse de inmediato. En caso de no poder procesarse de esta manera, centrifugar el LCR y conservarlo 3 das a 2-10oC o 5 horas a 2025oC. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. - Tubos o cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas. - Bao de agua a 37oC. - Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 505 nm en espectrofotmetro o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm). - Temperatura de reaccin: 37oC - Tiempo de reaccin: 5 minutos - Volumen de muestra: 10 ul - Volumen de Reactivo de Trabajo: 1 ml - Volumen final de reaccin: 1,01 ml Los volmenes de Muestra y de Reactivo pueden variarse proporcionalmente (Ej.: 20 ul Muestra + 2 ml Rvo. de Trabajo). PROCEDIMIENTO En tres tubos marcados B (Blanco) S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Standard Muestra Reactivo de Trabajo 1 ml S 10 ul 1 ml D 10 ul 1 ml
VALORES DE REFERENCIA Se analizaron con Glicemia enzimtica AA, 120 muestras de individuos en ayunas, de ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 aos, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina), sin sntomas de diabetes o cualquier otra enfermedad aparente. Se encontr que el 95% de los resultados cubrieron el siguiente rango: Suero o plasma: 70 a 110 mg/dl En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia: Suero o plasma Adultos: 74 - 106 mg/dl (4,11 - 5,89 mmol/l) Nios: 60 - 100 mg/dl (3,33 - 5,55 mmol/l) Neonatos: 1 da: 40 - 60 mg/dl (2,22 - 3,33 mmol/l) mayor a 1 da: 50 - 80 mg/dl (2,78 - 4,44 mmol/l) Orina aislada fresca 1 - 15 mg/dl (0,06 - 0,83 mmol/l) Orina de 24 horas < 0,5 g/24 hs (< 2,78 mmol/24 hs) LCR Nios: 60 - 80 mg/dl (3,33 - 4,44 mmol/l) Adultos: 40 - 70 mg/dl (2,22 - 3,89 mmol/l) Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia, teniendo en cuenta sexo, edad hbitos alimenticios y otros factores. CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Glucosa (mg/dl) x 0,0555 = Glucosa (mmol/l) Glucosa (g/24 horas) x 55,5 = Glucosa (mmol/24 hs) LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE Los ensayos fueron realizados en analizador automtico Express Plus(*). a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en 5 das diferentes se obtuvo: Precisin intraensayo (n = 20) Nivel 90,7 mg/dl 278 mg/dl Nivel 90,1 mg/dl 299 mg/dl D.S. 1,26 mg/dl 3,08 mg/dl D.S. 1,73 mg/dl 4,86 mg/dl C.V. 1,39 % 1,11 % C.V. 1,92 % 1,62 %
Incubar 5 minutos en bao de agua a 37oC o 25 minutos a 15-25oC. Luego leer en espectrofotmetro a 505 nm o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de reaccin final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de este lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS 100 mg/dl glucosa (mg/dl) = D x f f= S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de glucosa, con cada determinacin.
(*)
Precisin interensayo (n = 20)
b) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de glucosa a distintos sueros, se obtuvo una recuperacin entre 99 y 101%. c) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 500 mg/dl. Para valores superiores, diluir la muestra con solucin salina y repetir el ensayo, multiplicando el resultado final por el factor de dilucin. d) Correlacin: se determin el valor de glucosa en 154 muestras de suero en un rango comprendido entre 23 y
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503 mg/dl, con Glicemia enzimtica AA de Wiener lab. y un kit comercial basado en el mismo principio, obtenindose el siguiente coeficiente de correlacin: r = 0,9997; pendiente b = 1,0257; interseccin a = 1,9485 e) Sensibilidad: el mnimo lmite de deteccin es 0,54 mg/dl y la sensibilidad analtica es de 4,2 mg/dl. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Para las instrucciones de programacin debe consultarse el Manual del Usuario del Analizador en uso. Para la calibracin, se puede utilizar un calibrador con base de suero (Calibrador A plus de Wiener lab.). PRESENTACION - 1 x 250 ml (Cd. 1400106). - 4 x 250 ml (Cd. 1400107). BIBLIOGRAFIA - Henry, R.J. et.al. - Clinical Chemistry, Principles and Techniques, 2nd. ed., Harper and Row Pub. Inc. N.Y. p. 1288 (1974). - Lott, J.A. and Turner, K. - Clin. Chem. 21:1754-1760 (1975). - Trinder, P. - Ann. Clin. Biochem. 6/24 (1969). - Ziegenhorn, J. - J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15/1:13 (1977). - Caraway - Stand. Meth. Clin. Chem. 4:240 (1963). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001. - Burtis - Ashwood. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., fifth edition, United States of America, 2001.
SIMBOLOS Los siguientes smbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnstico de Wiener lab.
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Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnstico "in vitro"
P Representante autorizado en la Comunidad Europea

Uso diagnstico "in vitro" Contenido suficiente para <n> ensayos Fecha de caducidad Lmite de temperatura (conservar a) No congelar Riesgo biolgico Volumen despus de la reconstitucin
Cont.
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Contenido Nmero de lote Elaborado por: Nocivo Corrosivo / Castico
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Irritante Consultar instrucciones de uso Calibrador Control Control Positivo Control Negativo Nmero de catlogo
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Calibr.
b b c h
MWiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. N: 1978/97
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
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C
SIGNIFICACION CLINICA Protenas en orina Una cantidad de protenas plasmticas de pequeo peso molecular son filtradas normalmente en forma libre a travs del glomrulo renal y luego son, en parte, reabsorbidas por los tbulos renales. Hay condiciones fisiolgicas o benignas donde se puede observar un aumento en la excrecin urinaria de protenas como en el ejercicio violento, fiebre, hipotermia, embarazo. La medicin de las protenas urinarias es importante en la deteccin de patologa renal. La proteinuria en la enfermedad renal puede resultar de una disfuncin glomerular o tubular. En el primer caso se da por un aumento en el pasaje a travs de los capilares del glomrulo y caracterizada por la prdida de protenas plasmticas de igual o mayor tamao. En el segundo caso se da por una disminucin en la capacidad de reabsorcin de protenas por los tbulos. Entre las patologas en las que se produce un aumento en la excrecin de protenas urinarias se encuentran: sndrome nefrtico, sndrome nefrtico, hipergammaglobulinemia monoclonal, nefropata diabtica, infecciones del tracto urinario. Protenas en lquido cefalorraqudeo (LCR) La determinacin de protenas en LCR es til para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoenceflica en muchas enfermedades inflamatorias o infecciosas del SNC, como ocurre en las meningitis bacterianas, virales o de otros orgenes, encefalitis, poliomielitis, neurosfilis, esclerosis mltiple, hemorragia cerebral, tumores cerebrales o espinales. Otros desrdenes ocasionan una produccin anormal de protenas dentro del SNC como las enfermedades desmielinizantes. La sensibilidad del presente mtodo lo hace apropiado para ser usado en lquidos biolgicos tales como orina y lquido cefalorraqudeo donde la concentracin de protenas con respecto a la del plasma es demasiado baja como para determinarla por mtodos empleados habitualmente para suero. FUNDAMENTOS DEL METODO Las protenas presentes en la muestra reaccionan en medio cido con el complejo Rojo de Pirogalol-Molibdato originando un nuevo complejo coloreado que se cuantifica espectrofotomtricamente a 600 nm. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: solucin estabilizada de Rojo de Pirogalol 0,1 mmol/l, molibdato de sodio 0,1 mmol/l en buffer succinato 50 mmol/l. S. Standard: solucin de albmina 100 mg/dl (1,0 g/l).
Proti
Mtodo colorimtrico cuantitativo para la determinacin de protenas en orina y lquido cefalorraqudeo REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Solucin fisiolgica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivos Provistos: listos para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. El Reactivo A debe protegerse de la luz. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Cuando el espectrofotmetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia a 600 nm del Reactivo A superiores a 0,250 D.O. o inferiores a 0,030 D.O. son indicio de deterioro del mismo. MUESTRA Orina o lquido cefalorraqudeo a) Recoleccin: obtener orina ocasional o de 24 horas. Medir la diuresis. En caso de que las muestras sean turbias, es conveniente centrifugarlas. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: - la hemlisis puede ser causa de resultados falsamente aumentados tanto en orina como en LCR; - los conservantes para orina tales como cido clorhdrico, cido benzoico o timol pueden ser causas de resultados falsamente disminuidos; - algunas drogas o medicamentos pueden interferir en la reaccin. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la orina puede conservarse refrigerada (2-10oC) hasta 8 das o congelada (-20oC) hasta 3 meses. El LCR puede conservarse 3 das refrigerado (2-10oC) o 3 meses congelado (-20oC).
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MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro para lecturas a 600 nm (580-620 nm). - Bao de agua a 37oC. - Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados.
CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Protenas (mg/dl) x 10 = Protenas (mg/l) LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Proteger el Reactivo A de la luz. El material empleado debe estar libre de tensioactivos, caso contrario se obtendrn valores discordantes. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvo: Nivel 14 mg/dl 100 mg/dl D.S. 0,66 mg/dl 2,30 mg/dl C.V. 4,7 % 2,3 %
PROCEDIMIENTO Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar el ensayo. En tres tubos o cubetas espectrofotomtricas marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: B Standard Muestra Reactivo A 1 ml S 20 ul 1 ml D 20 ul 1 ml
Mezclar e incubar los tubos durante 10 minutos a 37oC. Leer en fotocolormetro entre 580-620 nm o en espectrofotmetro a 600 nm, llevando a cero el aparato con el Blanco.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable durante 30 minutos por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS 1) Protenas en orina de 24 horas D mg de protenas /24 horas = x V x 1000 S siendo: V = volumen de la diuresis expresado en litros /24 horas 1000 = mg/l del Standard 2) Protenas en orina ocasional D mg/dl protenas = x 100 S 3) Protenas en lquido cefalorraqudeo D mg/dl protenas = x 100 S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Proti U/LCR Control 2 niveles) con concentraciones conocidas de protenas, con cada determinacin. VALORES DE REFERENCIA Orina de 24 horas: 30-140 mg/24 horas (hasta 160 mg/24 horas en embarazadas) Orina ocasional: 25 mg/dl LCR: 15-45 mg/dl en personas sanas. En personas de ms de 60 aos, este rango se extiende hasta 60 mg/dl. Estos valores son orientativos. Es conveniente que cada laboratorio establezca sus propios rangos, dado que pueden variar de acuerdo a la poblacin de pacientes y a las condiciones del laboratorio.
b) Sensibilidad: en espectrofotmetro a 600 nm, un Standard de 100 mg/dl proporciona una lectura de aproximadamente 0,200 D.O., lo que significa que para 0,001 D.O. el mnimo cambio de actividad detectable ser de 0,5 mg/dl. c) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 150 mg/dl de protenas. Para valores superiores, diluir la muestra 1:2 1:4 con solucin fisiolgica y repetir la determinacin. Corregir los clculos multiplicando por el factor de dilucin empleado. Si se desea aumentar la sensibilidad analtica en muestras normales o levemente aumentadas, pueden emplearse 50 ul de muestra. En este caso, es preferible diluir el Standard 1:2 (1+1) con agua destilada, y usar este standard de 50 mg/dl en la prueba, de tal manera de ajustar la calibracin a los valores normales bajos. PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS Para las instrucciones de programacin consulte el manual del usuario del analizador en uso. PRESENTACION - 1 x 100 ml (Cd. 1690007). - 4 x 20 ml (Cd. 1009317). - 4 x 20 ml (Cd. 1009282). - 2 x 60 ml (Cd. 1009631). BIBLIOGRAFIA - Watanabe, N.; et al. - Clin. Chem. 32:1551, 1986. - Fujita, Y.; Mori, I.; Kitano, S. - Benseki Kagaku 32:379, 1983. - Watson, M.; Scott, M. - Clin Chem. 41/3:343, 1995. - Killingsworth, L. - Clin. Chem. 28/5:1093, 1982. - Orsonneau, J.; Douet, P.; Massoubre, C; Lustenberger, P.; Bernard, S. - Clin. Chem. 35/11:2233, 1989. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
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Smbolos
Los siguientes smbolos se utilizan en todos los kits de reactivos para diagnstico de Wiener lab.
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Este producto cumple con los requerimientos previstos por la Directiva Europea 98/79 CE de productos sanitarios para el diagnstico "in vitro" Representante autorizado en la Comunidad Europea Uso diagnstico "in vitro"
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Elaborado por:
Nocivo
Corrosivo / Castico
Contenido suficiente para <n> ensayos

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Irritante Fecha de caducidad
Lmite de temperatura (conservar a)
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Consultar instrucciones de uso
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Contenido
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9. HEMATOLOGA
Hematologa es el estudio de las clulas que se encuentran en la sangre y los factores que afectan a su funcionamiento. Volumen de sangre del cuerpo humano Un adulto que pese 60 kilogramos posee aproximadamente 4,5 litros de sangre. Por lo tanto, no existe peligro alguno en que se extraiga medio litro (0,5 l o 500 ml) de sangre para efectuar una transfusin, ni en llenar dos o ms tubos de ensayo de 10 ml para su estudio. Se debe explicar esto a los pacientes que se muestren atemorizados al extraerles sangre. Volemia: Volumen total de sangre. 9.1 TIPOS DE CLULAS SANGUNEAS Tres clases principales de clulas sanguneas se pueden distinguir bajo el microscopio: glbulos rojos (eritrocitos), glbulos blancos (leucocitos) y plaquetas (trombocitos). 9.1.1 Eritrocitos (Fig. 9.1) Sinonimia: Glbulos rojos, Hemates. Aspecto: clulas redondas o ligeramente ovaladas, llenas de hemoglobina. Despus de la tincin con Romanowsky (vase la seccin 9.10.4), aparecen de color rosa con un rea central plida. Al observarlos por un lado, los eritrocitos semejan discos bicncavos; no poseen ncleo. Tamao: 7-8 m. Concentracin de nmero: aproximadamente 4- 5 x 1012 por litro (4 000 000 -5 000 000 por mm3, es decir, 4 -5 x 106 por mm3) de sangre. Funcin: Los eritrocitos transportan la hemoglobina, que se combina con el oxgeno y lo lleva desde los pulmones hasta los tejidos. Tambin llevan el dixido de carbono de los tejidos a los pulmones, efectundose as la eliminacin del material ms importante al que se degradan por los procesos metablicos casi todas las sustancias orgnicas que se encuentran en el cuerpo. 9.1.2 Leucocitos (Fig. 9.2) Sinonimia: Glbulos blancos. Aspecto: clulas redondas; contienen un ncleo y grnulos en el citoplasma. Tamao: 9 - 20 m Concentracin de nmero: aproximadamente 8 x 109 por litro (8000 x mm3) de sangre. Funcin: defensa del organismo contra las infecciones (desempean un papel importante en el sistema de defensa o inmune). La presencia de un ncleo permite a los leucocitos a diferenciarse fcilmente de los eritrocitos en el microscopio. Hay cinco tipos de leucocitos (neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos) que difieren en tamao, forma del ncleo, el color de los grnulos en el citoplasma y otros factores. Estos pueden ser identificados por microscopa despus de la tincin con la coloracin de Romanowsky (vase la seccin 9.10.4). 9.1.3 Trombocitos (Fig. 9.3) Los trombocitos o plaquetas son fragmentos de megacariocitos que se encuentran en la sangre perifrica, en los que estn involucrados en la formacin de cogulos. Aspecto: fragmentos de clulas de formas variadas (triangulares, estrelladas, ovales, etc.), con grnulos Tamao: 2 - 5 m Citoplasma: muy poco visible, contiene grnulos. Concentracin de nmero: En adultos sanos, la sangre contiene alrededor de 150 a 300 x 109 plaquetas por litro de sangre (150 000-300 000 por mm3). Funcin: son importantes para la coagulacin de la sangre; forman el tapn plaquetario primario mediante la agregacin plaquetaria de unos con otros. La coagulacin de la sangre1 1Vase la seccin 9.9. Cuando la sangre se coloca en un tubo de vidrio se solidifica en 5 - 10 minutos, formando un cogulo; en otras palabras, la sangre se ha coagulado. Qu ocurre a la sangre coagulada? Despus de varias horas la sangre coagulada se separa en dos componentes (Fig. 9.4): 1. el suero, un lquido amarillo 2. el cogulo, una masa slida de color rojo. Si se aade a la sangre un anticoagulante especial tan pronto como se extraiga, se evitar que se coagule y seguir siendo lquida. Entre otros anticoagulantes se encuentran el oxalato de flor (reactivo n 26.), el citrato trisdico solucin al 3,2% (reactivo n 60), la solucin salina bipotsica de EDTA solucin al 10% (reactivo n 22). Qu ocurre a la sangre que no se coagula? La sangre tratada con un anticoagulante se separa en dos componentes lquidos (Fig. 9.5): 1. el plasma, un lquido amarillo 2. las clulas sanguneas, que se sedimentan y forman: una capa delgada de leucocitos y un precipitado de eritrocitos. (Dejando sedimentar con el tiempo o despus de la centrifugacin). Diferencia entre el plasma y el suero El plasma contiene una protena soluble llamada fibringeno, adems de un gran nmero de otras protenas.
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El suero no contiene fibringeno, pero todas las otras protenas estn presentes. El fibringeno se convierte en fibrina insoluble, que junto con los eritrocitos forma el cogulo.
Volumen total de sangre del cuerpo humano para un adulto de 60 kg: 4,5 litros. Comparacin grfica de los volmenes, 4,5 l (4 l), 500 ml (1/2 l), y 10 ml.
9.2 Recogida de muestras de sangre 9.2.1 Principio Se recoge sangre venosa de una vena en el brazo con una aguja y una jeringa, como se describe a continuacin. La sangre capilar puede ser recogida desde el dedo, el odo o el taln (en recin nacidos), tal como se describe en la seccin 9.4.1. 9.2.2 Materiales y reactivos Para la desinfeccin de la piel: - Algodn -Etanol al 70%, o tintura de yodo Para la puncin venosa (Fig. 9.6): -Guantes -un torniquete hecho con un tubo de goma blanda de 2-5 mm de dimetro -agujas, 30-40 mm de longitud, dimetro o calibre: calibre 20, calibre 19, calibre 18, bisel mediano (Los tamaos de las agujas se indican generalmente por su longitud y dimetro). Para extraer sangre de nios menores de cinco aos se usan agujas de calibre 23 (0,6 mm) 25 (0,5 mm) Para la recoleccin de la sangre:
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-Jeringas (con capacidad para 2, 5, 10 20 ml) Verifique que la desembocadura de cada jeringa se ajuste adecuadamente a la entrada de las agujas -Frascos o tubos Los frascos o tubos (Fig. 9.7) debern estar vacos o contener un anticoagulante (vase la seccin 9.1.3), y debern tener marcas que correspondan a la cantidad requerida de sangre (por ejemplo, 5 ml). Conserve cierta cantidad de agujas estriles en tubos de vidrio pequeos; las puntas de las agujas debern descansar en cojincillos de algodn no absorbente y los tubos se taponarn con el mismo material. En la actualidad, en muchos rincones del planeta, en especial en los pases en vas de desarrollo, ya se utilizan agujas y jeringas descartables, lo que no quita la explicacin anterior dada para agujas reutilizables que se lavan y esterilizan para volverlas a usar.
B A) Bisel mediano. B) Conserve cierta cantidad de agujas estriles en tubos de vidrio pequeos; las puntas de las agujas debern descansar en cojincillos de algodn no absorbente y los tubos se taponarn con el mismo material.
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F C) Cdigo de colores internacionales para las agujas desechables y su calibre. Cada color seala el calibre. Gauge: Calibre; dimetro en mm; color de cada una. D) Jeringas descartables de diferentes volmenes. En la foto se muestran las jeringas graduadas junto con su envoltorio protector respectivo. Vale decir que estas jeringas, as como las agujas, son esterilizadas con distintos mtodos, por ej., xido de etileno; se usan una sola vez y despus se descartan en recipientes apropiados para agujas (descartadores), las jeringas plsticas desechables se descartan en otro recipiente adaptado para tal fin. F) Agujas descartables. Se muestra en la foto las agujas, sus capuchones protectores de seguridad, y atrs el envoltorio en el que vienen estas agujas. Tambin se observa el color (vea el cdigo de colores antes en C)). 9.2.3 MTODO Preparacin 1. Lase cuidadosamente la planilla de solicitud del paciente: Decida la cantidad de sangre que se necesitar Prepare el frasco o el tubo adecuado, que se usar en el ensayo correspondiente. La planilla o formulario de solicitud del paciente es el pedido del mdico en donde coloca o escribe los anlisis solicitados. 2. Si la sangre se va a utilizar para diferentes investigaciones de laboratorio, planificar la secuencia en la que se deben tomar muestras de sangre. (Por ejemplo, se debe desechar el primer 1 ml de sangre cuando se toma la sangre para ensayos de coagulacin.) 3. Antes de tomar la sangre, lvese las manos con agua y jabn. Squese las manos, y recuerde que antes de extraer debe ponerse guantes desechables de un solo uso. Si el paciente se encuentra en el laboratorio Haga que se siente de manera que quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo donde se har la extraccin de sangre. Ponga el brazo del paciente sobre la mesa de trabajo apoyndolo en un pequeo cojn dispuesto bajo el codo, con la palma de la mano vuelta hacia arriba (Fig. 9.8). Si el paciente se encuentra en cama Extienda el brazo del paciente en una posicin descansada (Fig. 9.9). Puntos para la extraccin de sangre El sitio ms adecuado es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde sea ms gruesa y fcilmente visible (Fig. 9.10), aprovechando, de preferencia, una de las ramas que forman una Y inmediatamente arriba del lugar donde se juntan (1). Si fuera necesario se pueden usar los puntos 2, 3 4 como alternativas.
A B
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A) Lavado previo de las manos. B) Colocacin de los guantes desechables.
Figura 9.10 Los sitios para tomar muestras de sangre venosa 1: Sitio preferido, 2, 3, 4: Sitios alternativos.
Procedimiento Uso de la jeringa 1. Monte la aguja en la jeringa, sin tocar ms que la base de la aguja. Pruebe aguja y jeringa para cerciorarse de que no est obstruida y la jeringa es hermtica. Cubra el extremo de la aguja con el tubo estril hasta que se use. En el caso de las agujas descartables que vienen con un cubreagujas protector, se les debe sacar primero el cubreagujas para poder puncionar la vena. Pero debe dejarlas as con el cubreagujas puesto y sin sacar del envoltorio antes de extraer (recuerde que estn esterilizadas). El envoltorio se saca, se extrae el cubreagujas con la aguja dentro, se saca la aguja protegida dentro del cubreagujas, la aguja se coloca en la jeringa recin extrada de su envoltorio respectivo, todo esto antes de extraer la sangre, es decir, una vez que ya tiene todo listo para puncionar. 2. Aplique el torniquete. Con la mano derecha coloque firmemente el torniquete alrededor del brazo y sujete los extremos. 3. Con la mano izquierda tire de un extremo, cruzndolo (Fig. 9.11). 4. A continuacin introduzca este extremo por debajo de la parte principal del torniquete (Fig. 9.12). El torniquete se deber ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias. 5. Pida al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. 6. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en que introducir la aguja (Fig. 9.13). 7. Desinfecte la piel con una pieza de algodn embebida en tintura de yodo o etanol. 8. Tome la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja (Fig. 9.14). 9. Coloque la aguja sobre la vena, con el bisel hacia arriba. Introduzca la aguja en el centro de la vena (Fig. 9.15), sin titubeos. Importante: Nunca se intente puncionar una vena por un lado (Fig. 9.16). Nunca se introduzca la aguja con el bisel hacia abajo. Se sentir que la aguja atraviesa: (a) la piel, que es resistente (b) Inmediatamente despus, la pared de la vena, que es menos resistente (ms elstica).
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10. Haga entrar la aguja a lo largo de la vena a una profundidad de 1,0 a 1,5 cm. 11. Con la mano izquierda tire hacia atrs el mbolo de la jeringa muy lentamente. Deber entrar sangre en la jeringa (Fig. 9.17). 12. Retire el torniquete tirando del extremo doblado. Siga tirando el mbolo hacia atrs hasta llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite (Fig. 9.18). 13. Aplique una pieza seca de algodn sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Saque la aguja con un movimiento rpido por debajo de la pieza de algodn (Fig. 9.19). 14. Pida al paciente que presione firmemente la pieza de algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido (Fig. 9.20 (a)). En la actualidad no se recomienda que se flexione el brazo sobre la pieza de algodn (a causa del riesgo de que se forme un hematoma) (figura 9.20 (b)). 15. Separe la aguja de la jeringa. Llene los tubos o frascos con la muestra de sangre hasta la marca correspondiente (Fig. 9.21). Invierta varias veces los frascos que contengan anticoagulante. 16. Coloque en los frascos etiquetas en que se lean claramente: el nombre del paciente la fecha el nmero del paciente en el servicio de consulta externa o el hospital, si tal nmero existe. Enjuague inmediatamente jeringa y aguja con agua fra, luego enjuague con desinfectante (vase la seccin 3.5.4). Coloque las agujas y jeringas enjuagados en pequeos tubos de vidrio taponadas con algodn no absorbente y esterilizar en autoclave o esterilizador de calor seco (vase la seccin 3.5.5). Nunca use una aguja o jeringa a otra persona antes de que sean reesterilizados. Las agujas y jeringas desechables slo deben usarse una vez, ya que no pueden volver a esterilizarse. Para trabajar con agujas y jeringas desechables el procedimiento antes mencionado es el mismo, salvo que estas se descartan en los correspondientes recipientes de descarte.
B A A) Monte la aguja en la jeringa, sin tocar ms que la base de la aguja. Pruebe aguja y jeringa para cerciorarse de que no est obstruida y la jeringa es hermtica. Cubra el extremo de la aguja con el tubo estril hasta que se use. B) Aplicando el torniquete con la goma de ligar. Con la mano derecha coloque firmemente el torniquete alrededor del brazo y sujete los extremos.
Figura 9.11 Con la mano izquierda tire de un extremo, cruzndolo. Figura 9.12 A continuacin introduzca este extremo por debajo de la parte principal del torniquete. El torniquete se deber ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.
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C) Pida al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. Figura 9.13 Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en que introducir la aguja.
D) Desinfecte la piel con una pieza de algodn embebida en tintura de yodo o etanol. Figura 9.14 Tome la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja.
E F E) Posicin incorrecta para la venopuncin. Nunca se intente puncionar una vena por un lado. Nunca se introduzca la aguja con el bisel hacia abajo. F) Se sentir que la aguja atraviesa: (a) la piel, que es resistente, (b) Inmediatamente despus, la pared de la vena, que es menos resistente (ms elstica).
G) Haga entrar la aguja a lo largo de la vena 1-1,5 cm. Figura 9.17 Con la mano izquierda tire hacia atrs el mbolo de la jeringa muy lentamente. Deber entrar sangre en la jeringa. Siga tirando el mbolo hacia atrs hasta llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite.
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Figura 9.18 Una vez extrada la cantidad de sangre que se necesita retire el torniquete tirando del extremo doblado. Figura 9.19 Aplique una pieza seca de algodn sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Saque la aguja con un movimiento rpido por debajo de la pieza de algodn.
H H) Este procedimiento para tapar la aguja sin colocarla con la mano como describe la figura, es vlido tanto para el comienzo (vase ilustracin anexa A) antes de la extraccin, como para despus de extraer sangre para tapar con el capuchn y evitar pinchaduras accidentales (la sangre es un material potencialmente infeccioso).
Figura 9.20 Pida al paciente que presione firmemente la pieza de algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. En la actualidad no se recomienda que se flexione el brazo sobre la pieza de algodn (a causa del riesgo de que se forme un hematoma).
Figura 9.21 Transferencia de la sangre a un tubo para muestras. Separe la aguja de la jeringa. Llene los tubos o frascos con la muestra de sangre hasta la marca correspondiente. I) Coloque en los frascos etiquetas en las cuales se lean claramente los datos.
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9.3 ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DE HEMOGLOBINA La hemoglobina es el pigmento rojo contenida en los eritrocitos. Se compone de cadenas de protenas y molculas que contienen hierro. Transporta oxgeno a las clulas de los tejidos del organismo. Unidades de medicin Estrictamente, la unidad SI para expresar las concentraciones de hemoglobina es el milimol por litro (mmol/l). Cuando se usa esta unidad se necesita especificar la estructura qumica a la que se aplica. En la prctica esto significa que se debe emplear el trmino "hemoglobina (Fe)" en vez de la palabra "hemoglobina" sola. Sin embargo, como medida temporal antes de hacer el cambio a mmol/l, algunos laboratorios utilizan la unidad "gramo por litro" (g/l). Cuando se usa esta unidad basta el trmino simple "hemoglobina" y no se necesita decir "hemoglobina (Fe)". Los valores en gramos por litro se pueden convertir en valores expresados en mmol/l multiplicndolos por 0,062. Ejemplo: Hemoglobina, 150 g/l x 0,062 = hemoglobina (Fe) 9,3 mmol/l En este manual los clculos y valores se expresan generalmente en ambas formas. Tmese nota de que si se usa la unidad "gramo por litro" los valores son 10 veces mayores que cuando se usa la unidad tradicional "gramo por 100 ml". Por ejemplo, 150 g/l = 15,0/100 ml. 9.3.1 Mtodo fotomtrico de la Cianometahemoglobina Principio La sangre se diluye en lquido de Drabkin, que destruye los eritrocitos (hemlisis) y convierte la hemoglobina en Cianometahemoglobina. La solucin que se produce se examina por medio de un espectrofotmetro o un colormetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre. El mtodo fotomtrico de la Cianometahemoglobina permite hacer los clculos ms precisos de la cantidad de hemoglobina existente. Se debe usar siempre que sea posible. Materiales y reactivos Espectrofotmetro1 (o fotocolormetro) 1Algunos espectrofotmetros funcionan bien en la red elctrica o con corriente de una batera de automvil. Un modelo es suministrado por la UNICEF: Nmero de referencia 09.309.98 (batera de 110 V) o 09.310.00 (batera de 220 V); estos se pueden pedir en la siguiente direccin: UNICEF, UNICEF Plads, Freeport, DK 2100 Copenhague, Dinamarca. Cubetas para espectrofotmetro (o fotocolormetro) Tubos de ensayo Gradilla Pipetas de sangre (Sahli), 0,2 ml graduada hasta 0,02 ml (20 l), con tubo de goma y boquilla. Micropipeta de 20 l (alternativa a la pipeta de Sahli) Lquido de dilucin de Drabkin (reactivo N 21) Una pipeta graduada, de 5 ml. Una pipeta graduada, de 10 ml. Solucin de referencia, que puede ser: -La solucin de referencia de Cianometahemoglobina fresca utilizada para calibrar el instrumento, -Una solucin de referencia previamente calibrada contra la solucin de referencia de Cianometahemoglobina, o -Una muestra de sangre de concentracin de hemoglobina conocida. Lquido de Drabkin para dilucin (reactivo N 21) Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1 litro de agua destilada. Si se dispone de una balanza analtica, la preparacin se puede hacer en el laboratorio (vase el reactivo N 21). Esta solucin se puede conservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deschese si se enturbia. El lquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una descoloracin con reduccin del ferricianuro. Referencia para Cianometahemoglobina (estandarizada) Esta solucin se puede adquirir en el comercio o en un laboratorio de referencia. En las soluciones de referencia comerciales casi siempre se indica la concentracin en miligramos por 100 ml (generalmente en mg%) Nota: Lea la tcnica anexa comercial Antes de usar el espectrofotmetro (o colormetro) para calcular la hemoglobina se debe elaborar una curva de calibracin. Con esta curva se pueden preparar un grfico y una tabla de valores de la hemoglobina. Importante: Al comienzo de cada da: Limpie las cubetas del espectrofotmetro (o colormetro). Llenar uno de los tubos limpios con lquido de Drabkin fresco, que se utiliza para poner a cero el espectrofotmetro (o colormetro). Leer una solucin de referencia (vase ms arriba). Calibracin del fotocolormetro o espectrofotmetro Calibracin del espectrofotmetro (o colormetro) usando solucin de referencia de Cianometahemoglobina (o una solucin de referencia previamente calibrada contra una solucin de referencia de Cianometahemoglobina)
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Como se mencion antes, antes de usar el espectrofotmetro (o colormetro) para calcular la hemoglobina se debe elaborar una curva de calibracin. Con esta curva se pueden preparar un grfico y una tabla de valores de la hemoglobina. 1. Calcule la concentracin de hemoglobina de la solucin de referencia en gramos por litro empleando la frmula siguiente: concentracin en mg / 100 ml x 10 x 251 1000 (Nota: 10 es el factor que convierte 100 ml en 1 litro; 1000 es el factor que convierte miligramos en gramos y 251 es el factor de dilucin cuando 0,02 ml de sangre se diluyen con 5 ml del lquido de Drabkin). Ya que 10 x 251/1000 es casi 2,5, la frmula anterior se puede simplificar de la manera siguiente:* Contenido de hemoglobina de la solucin de referencia en gramos por litro = concentracin en mg/100 ml x 2,5 Ejemplo Concentracin de la solucin de referencia = 60 mg/100 ml Valor de la hemoglobina = 60 x 2,5 = 150 g/l * Si se emplea una dilucin de 1 x 200 (por ejemplo, 0,02 ml de sangre y 4 ml de lquido de Drabkin), multiplique por 2,0 en vez de 2,5. 2. Haga diluciones sucesivas de la solucin estandarizada: prepare cuatro tubos y numrelos del 1 al 4 (Fig. 9.22). por medio de pipetas deposite en cada tubo las cantidades mencionadas en la Tabla 9.1. 3. Mezclar el contenido de los tubos y dejar reposar durante 5 minutos (Fig. 9.23). 4. Lea las diluciones en el espectrofotmetro (o colormetro): (A) Establecer la longitud de onda de 540 nanmetros (nm) o coloque un filtro verde en el espectrofotmetro (o colormetro). (B) Llenar una cubeta igualados con lquido de Drabkin y colquelo en el aparato (en el espectrofotmetro o colormetro). (C) Poner a cero el espectrofotmetro. (D) leer el contenido de los tubos 1 a 4, utilizando una cubeta. Asegrese de que la aguja vuelve a cero entre cada lectura hecha con lquido de Drabkin. Si el aparato usa un display o pantalla digital vea los nmeros y observe el cero. 5. Prepare un grfico trazando las lneas correspondientes a las soluciones estandarizadas diluidas perpendicularmente a las lneas de sus concentraciones. (Tabla 9.2 y Fig. 9.24). 6. Con el grfico que se ha preparado: Elabore una tabla de valores de la hemoglobina, que abarque desde 20 g/l hasta 180 g/l. Tabla 9.1 Preparacin de diluciones seriadas de la solucin de referencia Volumen de la solucin Volumen del lquido de Nmero del tubo Dilucin de referencia (ml) Drabkin (ml) 1 4.0 0.0 Sin diluir 2 2.0 2.0 1:2 3 1.3 2.7 1:3 4 1.0 3.0 1:4 Tabla 9.2 Lecturas espectrofotomtricas para diferentes diluciones de la solucin de referencia Dilucin Concentracin de hemoglobina (g/l) Absorbancia a 540 nm Sin diluir 150 35.0 1:2 1:3 1:4 150/2 = 75 150/3 = 50 150/4 = 37.5 17.5 11.5 8.5
Figura 9.22 Preparando diluciones seriadas de solucin de referencia de cianometahemoglobina.
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Figura 9.23 Despus de mezclar las diluciones de la solucin de referencia, djelos reposar durante 5 minutos. Figura 9.24 Curva estndar para la determinacin de la concentracin de hemoglobina de muestras de sangre. Calibracin del espectrofotmetro (o colormetro) utilizando una muestra de sangre de concentracin de hemoglobina conocida 1. Obtener una muestra de sangre de concentracin de hemoglobina conocida (por ejemplo, 168 g/l). 2. Encender el espectrofotmetro (o colormetro) y ajustar la longitud de onda a 540 nm. 3. Pipetear 8 ml de lquido de Drabkin en un tubo de ensayo. Aadir 0,04 ml de sangre bien mezclada. Asegrese de limpiar la parte exterior de la pipeta de antemano para evitar la adicin de exceso de sangre. Mezclar la solucin de Cianometahemoglobina invirtiendo varias veces. Dejar reposar durante 10 minutos. 4. Poner a cero el espectrofotmetro con lquido de Drabkin. 5. Leer y registrar la absorbancia de la solucin de Cianometahemoglobina preparada anteriormente. 6. Preparar una serie de diluciones de la solucin de Cianometahemoglobina en cuatro tubos de ensayo (numeradas del 1 al 4), como se muestra en la Tabla 9.3. 7. Lea y registre las absorbancias de las soluciones diluidas. 8. Trazar una curva de absorbancia versus la concentracin de hemoglobina, utilizando papel cuadriculado comn. Trace una lnea recta a partir del origen pasando tan cerca de cada punto como sea posible. Extienda la lnea de tal forma que pueda leer absorbancias para los valores de hemoglobina superiores a 168 g/l. Se prepara una tabla de referencia de los valores usando los grficos obtenidos a partir de cualquiera de los mtodos anteriores: Elaborar una tabla de lecturas de absorbancia a partir de 0.00, 0.01, 0.02 y terminando en 1,50. Determinar las concentraciones de hemoglobina para cada una de las absorbancias de la grfica. Tabla 9.3 Preparacin de diluciones seriadas de solucin de Cianometahemoglobina Volumen de solucin de Volumen de lquido de Concentracin de Nmero del tubo Cianometahemoglobina (ml) Drabkin (ml) hemoglobinaa (g/l) 1 4.0 1.0 13.4 2 3.0 2.0 10.1 3 2.0 3.0 6.7 4 1.0 4.0 3.4 a En este ejemplo, se supone que la concentracin de hemoglobina de la solucin de Cianometahemoglobina es 168 g/l. Precauciones El cianuro de potasio es muy venenoso. Hay que tenerlo guardado en un armario cerrado con llave en todo momento cuando no est en uso. Lvese las manos inmediatamente despus de su manipulacin. Guarde el lquido de Drabkin en un frasco para reactivo marrn (color caramelo) porque se descompone al exponerse a la luz. Si un frasco para reactivo marrn no est disponible, utilice un frasco de vidrio transparente cuidadosamente envuelto en papel de plata. El lquido de Drabkin debe ser de color amarillo claro y plido. Si se vuelve turbio, o pierde su color, debe ser desechado. La claridad del lquido de dilucin se puede comprobar mediante la medicin de su absorbancia en un espectrofotmetro a 540 nm frente a agua como blanco. La absorbancia debe indicar cero. Una vez que la solucin de Cianometahemoglobina se ha preparado, la medicin de la hemoglobina debe llevarse a cabo dentro de las 6 horas. El lquido de Drabkin es estable durante varios meses si se conserva a temperaturas fras. Si la temperatura ambiente supera los 30 C, gurdela en el refrigerador a 4-6 C. No congele, ya que esto puede causar la descomposicin del compuesto. Siempre permita que el lquido de dilucin se caliente a temperatura ambiente antes de su uso. Mtodo 1. Pipetear 5 ml de lquido de Drabkin en un tubo. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de una pipeta de Sahli. Evite la entrada de burbujas. Si se usa sangre venosa asegrese que se mezcle adecuadamente invirtiendo el frasco en que se ha depositado junto con el anticoagulante varias veces, aproximadamente durante un minuto, inmediatamente antes de
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aspirarla con la pipeta. Como alternativa a la pipeta de Sahli, se puede usar una micropipeta de 20 l. 2. Limpie el exterior de la pipeta. Verifique que la sangre contina en el mismo nivel (en la marca de 0,02 ml) (Fig. 9.25). Deposite la sangre en el lquido de Drabkin y enjuague la pipeta varias veces aspirando y expulsando tres veces el lquido del tubo. 3. Mezcle el contenido del tubo y djelo reposar durante 5 minutos (vase la Fig. 9.23). 4. Ponga el colormetro en cero con lquido de Drabkin. Lea en el tablero la absorbencia de la sangre diluida del paciente usando la cubeta para colormetro. Si se forma turbidez en la sangre diluida, puede obedecer a la existencia de protenas anormales en el plasma o a una concentracin elevada de leucocitos. Se centrifuga la sangre diluida a 2000 g durante 5 minutos antes de tomar una lectura. Utilizando la tabla preparada a partir de la curva de calibracin, registrar la concentracin de la hemoglobina en g/l. La Tabla 9.4 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad.
Tabla 9.4 Concentraciones normales de hemoglobina, por grupo de edad Concentracin de hemoglobina Concentracin de hemoglobina Grupo de edad (Fe) (mmol/l) (g/l) Recin nacidos 8.4 a 12.1 136 - 196 Nios (1 ao) 7.0 a 8.1 113 - 130 Nios (10-12 aos) 7.4 a 9.2 115 - 148 Mujeres 7.4 a 9.9 120 - 160 Hombres 8.1 a 11.2 130 - 180 9.3.2 MTODO DE HEMATINA ALCALINA D Principio Cuando se aade una muestra de sangre a una solucin alcalina que contiene un detergente no inico, la hemoglobina se convierte en hematina alcalina D-575, que es un compuesto de color estable. La absorbancia de la hematina alcalina D-575 se mide usando un colormetro o hemoglobinmetro. El espectrofotmetro y hemoglobinmetro determinan directamente la concentracin de hemoglobina (Hb) de la muestra de sangre, mientras que con un colormetro, se obtiene la concentracin de hemoglobina de la muestra de sangre a partir de la absorbancia usando una curva de calibracin preparada o tabla de valores. El mtodo hematina alcalina D (HAD) ofrece varias ventajas sobre el mtodo de la cianmetahemoglobina: Es muy preciso, pero menos costoso. El procedimiento de calibracin utiliza Cloruro de hematina (o Cloruro de hemina), un compuesto cristalino estable que est disponible comercialmente. Cloruro de hematina; cristales de color marrn rojizo insolubles formados por la accin del cido clorhdrico en hematina en un ensayo para la presencia de sangre El reactivo HAD no incluye cianuro de potasio, que es altamente txico, en contraste con el lquido de Drabkin para el mtodo de la cianmetahemoglobina. El reactivo de HAD se puede preparar usando los productos qumicos que estn generalmente disponibles a nivel local. Materiales y reactivos Espectrofotmetro, hemoglobinmetro o colormetro Tubos de ensayo Gradillas Tapone de goma o de corcho Cubetas Lpiz graso o un marcador permanente Algodn o gasa
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Estndar HAD (suministrado por el laboratorio central) Reactivo HAD (reactivo no. 8). Calibracin del espectrofotmetro o hemoglobinmetro 1. Tenga en cuenta la concentracin del patrn de HAD se indica en la etiqueta, por ejemplo, 160 g/l, en una dilucin de 1:150. 2. Pipetear 20 l del estndar HAD en un tubo de ensayo limpio que contiene 3 ml de reactivo de HAD. 3. Tapar el tubo de ensayo usando un corcho limpio o tapn de goma y se mezcla por inversin. Deje el tubo en reposo durante 2-3 minutos. 4. Llenar una cubeta limpia con el reactivo de HAD sin diluir. Seque el exterior de la misma con un algodn o gasa y colquela en la cmara de la cubeta. Ajustar el espectrofotmetro o hemoglobinmetro para leer el cero (blanco). 5. Reemplace el reactivo HAD sin diluir en la cubeta con la solucin diluida HAD, repetir el procedimiento de medicin, y ajuste el espectrofotmetro o hemoglobinmetro para leer la concentracin de hemoglobina correcta indicado en la etiqueta, por ejemplo, 160 g/l. Calibracin del colormetro 1. Encienda el colormetro y fije la longitud de onda en 540 nm. Deje que el colormetro se caliente durante el tiempo recomendado por el fabricante. 2. Organizar seis tubos de ensayo en una gradilla. Etiquetar la tubos de prueba con los siguientes nmeros y letras: 1, 2, 3, 4, B y N. 3. Pipetear 5 ml de reactivo de HAD en el tubo de ensayo marcado B. 4. Pipetear 3 ml de reactivo de HAD y 20 l de estndar HAD en el tubo de ensayo marcados N. 5. Diluir la solucin de referencia en el tubo de ensayo N como se describe en la Tabla 9.5. 6. Pipetear los volmenes indicados de reactivo HAD y solucin de referencia en los tubos de ensayo numerados del 1 al 4. Tapar cada tubo y mezclar por inversin. 7. Calcular las concentraciones de hemoglobina en los tubos de ensayo de la siguiente manera: Concentracin de hemoglobina = concentracin de la solucin de referencia x factor de dilucin Por ejemplo: Tubo N: 160 g/l Hb Tubo 1: 160 g/l Hb x 4/5 = 128 g/l Hb Tubo 2: 160 g/l Hb x 3/5 = 96 g/l Hb Tubo 3: 160 g/l Hb x 2/5 = 64 g/l Hb Tubo 4: 160 g/l Hb x 1/5 = 32 g/l Hb Tubo B: 0 g de g/l Hb 8. Vierta el reactivo HAD del tubo de ensayo B en una cubeta limpia. Secar el exterior de la cubeta con un algodn o gasa. Colocar la cubeta en la cmara de la cubeta, cerrar la cmara de la cubeta y ajustar el colormetro para leer absorbancia cero (blanco). 9. Reemplace el reactivo HAD en la cubeta con la solucin de referencia de tubo de ensayo 4. Leer la absorbancia. Vierta la solucin en el tubo de ensayo numerado 4. 10. Repetir el procedimiento utilizando tubos de ensayo 3, 2, 1 y N, respectivamente, en secuencia. 11. Trazar la curva de los valores de absorbancia contra la concentracin de hemoglobina (g/l) para las muestras estndar y de prueba (N y tubos 1 al 4, respectivamente) (Fig. 9.26). Desde el origen, trace una lnea recta que una a su paso la mayor cantidad de puntos posibles. Nota: Siempre prepare una nueva curva de calibracin cada vez que se utiliza un colormetro diferente, el tipo de cubeta, o mtodo para la medicin de la hemoglobina. Tabla 9.5 Preparacin de diluciones seriadas de solucin de referencia HAD para la calibracin de un colormetro Tubo de ensayo 1 2 3 4 Reactivo HAD (ml) 1 2 3 4 Solucin de referencia 4 3 2 1 HAD (ml) Volumen total (ml) 5 5 5 5
Mtodo
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Mtodo utilizando un espectrofotmetro o hemoglobinmetro 1. Encender el espectrofotmetro o hemoglobinmetro. Deje que se caliente durante el tiempo recomendado por el fabricante (generalmente 10 minutos). 2. Colocar los tubos de ensayo en una gradilla: Uno para cada muestra a analizar, uno para el blanco y dos para las muestras de control. 3. Usando un lpiz graso o un marcador permanente, etiquete los tubos de ensayo con los nmeros de laboratorio correspondientes a las muestras a medir, B para el blanco, y C1 y C2 de las muestras de control. 4. Pipetear 3 ml de reactivo de HAD en cada tubo de ensayo. 5. Pipetear 20 l de sangre recogida en EDTA de un paciente en el reactivo de HAD del tubo correspondiente. Enjuague la pipeta cuidadosamente cinco veces con el reactivo de HAD. 6. Pipetear 20 l del estndar HAD en los tubos de ensayo C1 y C2. 7. Tapone todos los tubos de ensayo con un corcho limpio o tapn de goma y mezclar por inversin. Deje los tubos en reposo durante 2-3 minutos. 8. Vierta la solucin HAD del tubo B en una cubeta limpia. Secar el exterior de la cubeta con un algodn o gasa. Asegrese que no haya burbujas de aire en la solucin. Colocar la cubeta en la cmara de la cubeta y ajustar el espectrofotmetro o hemoglobinmetro para leer el cero. 9. Repetir el procedimiento con la solucin en los tubos de ensayo C1 y C2, respectivamente. Si las lecturas de los dos controles difieren en menos de 2,5%, medir la concentracin de hemoglobina de todas las muestras de ensayo. Registre todos los resultados. Mtodo utilizando un colormetro El mtodo HAD tambin es aplicable usando un colormetro. El procedimiento de medicin es el mismo que el descrito para un espectrofotmetro o hemoglobinmetro. Sin embargo, la absorbancia en un colormetro no aumenta linealmente con la hemoglobina a concentraciones elevadas. Por lo tanto, una curva de calibracin debe ser utilizada para relacionar las lecturas de absorbancia a la concentracin de hemoglobina, como se describe anteriormente. Resultados Reportar los resultados en g/l. Ejemplo: "hemoglobina = 89 g/l". Errores en la estimacin de la hemoglobina Errores en la toma de muestras : -Flujo inadecuado de sangre de los pinchazos en los dedos; -Exprimir en exceso el dedo despus del pinchazo; -El uso prolongado de un torniquete en la recogida de sangre venosa, que conduce a la concentracin de clulas de la sangre; -Una mezcla insuficiente de la sangre venosa, que se ha sedimentado despus de la recogida; -Pequeos cogulos en la sangre venosa debido a la mezcla inadecuada con EDTA despus de la recoleccin; -Agregado de muy poca o un exceso de sangre al lquido de Drabkin; -Burbujas de aire atrapadas en las pipetas. Equipo defectuoso o sucio, como por ejemplo: - Pipetas rotas o astilladas; - Pipetas sucias; - Cubetas sucias; -Filtros sucios; -Un espectrofotmetro, hemoglobinmetro o colormetro defectuoso. Falla en la tcnica: -El uso de un factor de dilucin diferente de aquel para el cual se calibr el espectrofotmetro, hemoglobinmetro o colormetro; -Inadecuada mezcla del reactivo; -Colocar la cubeta en la cmara con los lados esmerilados enfrentando la trayectoria de la luz; -Burbujas de aire en la cubeta; -El uso de un filtro estndar de otro espectrofotmetro o hemoglobinmetro para el ajuste; -Uso de un filtro incorrecto para el colormetro. Nota: Si el espectrofotmetro, colormetro o hemoglobinmetro requiere recalibracin frecuente, por ejemplo, cada 2-3 das, sustituir la lmpara y repetir el procedimiento de control de calidad interno. Si el problema de la recalibracin frecuente persiste, se debe devolver el equipo a un agente de servicio. 9.4 ESTIMACIN DE LA FRACCIN DE VOLUMEN DE ERITROCITOS El volumen total que ocupan los eritrocitos (glbulos rojos) en un volumen dado de sangre, dividido entre el volumen de sangre, se denomina fraccin de volumen de eritrocitos. Por ejemplo, si el volumen de los eritrocitos en 1 litro (1000 ml) de sangre es de 450 ml, la fraccin de volumen de eritrocitos ser 450 ml/1000 ml = 0,45 (ya que la fraccin consiste en mililitros divididos entre mililitros, la unidad "ml" se cancela y el resultado es una fraccin decimal simple, sin unidad). El resto de la sangre se compone casi completamente de plasma, junto con una reducida cantidad de glbulos blancos (leucocitos). Si estos se pasan por alto, la fraccin de volumen del plasma de este ejemplo ser 550 ml/1000 ml = 0,55 (obsrvese que 0,45 + 0,55 = 1,0 o sea que la fraccin de volumen de eritrocitos ms la fraccin de volumen de plasma = 1). Por lo tanto, la fraccin de volumen de eritrocitos es una forma de medir la proporcin de stos en el plasma. Se usa para calcular la concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos y se aprovecha tambin para elaborar el diagnstico en pacientes que sufren de deshidratacin, choque o quemaduras.
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Antes de la introduccin de las unidades SI, la fraccin de volumen de eritrocitos se denominaba "hematocrito" o "volumen de sedimentacin globular" (Volumen de clulas empaquetadas) y se notificaba como un porcentaje, y no como una fraccin decimal. Segn el sistema tradicional, el "hematocrito" correspondiente al ejemplo dado sera de 45%. Tmese nota de que al emplear las unidades SI el valor numrico no cambia, pero se convierte en 0,45 en vez de 45%. 9.4.1 Mtodo Microescala Principio La sangre (mezclada con anticoagulante) se deposita en un tubo capilar largo y se centrifuga empleando un "cabezal para microhematocrito". A continuacin se mide el nivel de la columna de eritrocitos por medio de una escala especial. Se debe preferir este mtodo que el uso de una macroescala; es ms rpido y se puede emplear sangre extrada de un dedo. Materiales y reactivos (Fig. 9.27) Una centrfuga (elctrica) para "microhematocrito", con cabezal plano para girar a alta velocidad Una escala especial para medir los resultados (generalmente se suministra junto con la centrfuga) Tubos capilares con heparina: o de 75 mm de longitud, o y de 1,5 mm de dimetro interior (Estos tubos contienen un depsito de heparina seca como anticoagulante), (si se utiliza sangre capilar). Si se usa sangre venosa mezclada con sal bipotsica de EDTA solucin al 10% (reactivo n 22), no ser necesario que los tubos capilares contengan heparina; los tubos heparinizados no son necesarios. Se pueden emplear tubos capilares sin heparina. Cera blanda o arcilla plstica para modelar (o un mechero de Bunsen o una lmpara de alcohol) Una lanceta estril para sangre y etanol al 70%, para la extraccin de sangre capilar. Pipetas Pasteur capilares largas y finas (lo suficientemente largas como para llegar a la parte inferior de los tubos) con perilla de goma. Papel de filtro
Figura 9.27 Materiales para la estimacin de la fraccin de volumen de eritrocitos utilizando la microescala.
Si no se cuenta con una escala u otro tipo de utensilio para efectuar la medicin se puede preparar uno utilizando papel milimtrico de 15 - 20 cm de anchura. En la orilla izquierda del papel, comenzando desde abajo, marque 10 puntos con una distancia de 4 mm entre uno y otro. En la orilla derecha marque 10 puntos con espacios de 6 mm. Con una regla trace 10 lneas que unan cada punto de la orilla izquierda con el punto correspondiente de la orilla derecha. En la orilla izquierda, junto al punto donde comience la lnea horizontal ms inferior, escriba "0". Contine hacia arriba por la orilla izquierda, numerando cada lnea trazada en el siguiente orden: 0,1, 0,2, 0,3, etc.; la lnea ms alta tendr por nmero 1,0. En la orilla derecha escriba los mismos nmeros junto al extremo de las lneas trazadas. A continuacin, nuevamente con una regla trace una sucesin de lneas horizontales mucho ms tenues que las primeras. Cada una de estas lneas tenues se deber trazar precisamente a la mitad de la distancia entre dos lneas gruesas. Por ltimo, siguiendo las lneas impresas en el papel milimtrico trace lneas verticales gruesas, separadas por espacios de unos 3 cm. La escala resultante deber ser similar a la de la figura 9.28. (Si se desea, en vez de elaborar una escala se puede usar la que se ha impreso en esta pgina, para determinar las fracciones de volumen de eritrocitos.) (Cubrirla con una lmina de plstico, es decir, puede meterla en un folio de plstico para protegerla de la suciedad, lquidos derramados, etc.) IMPORTANTE : LA ESCALA REPRESENTADA AQU EN ESTA TRADUCCIN NO ES RECOMENDABLE USARLA COMO REEMPLAZO COMO APARECE EN EL TEXTO. En su lugar podra utilizarla como un modelo para la construccin de una escala a mano en papel, como se indica en la explicacin anterior. (N del T.)
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Obtencin de sangre capilar Provoque la salida de sangre puncionando con una lanceta: el dedo cordial o el anular (Fig. 9.29) o bien, el lbulo de la oreja o el taln (en nios pequeos), Despus de haber desinfectado el rea con etanol. La sangre deber brotar libremente o despus de exprimir muy suavemente el rea. Recoja la primera gota de sangre con un papel de filtro. 1. Aplique el extremo delgado (que se hallar marcado con un crculo rojo) del tubo capilar con heparina sobre la gota de sangre (Fig. 9.30). La sangre entrar en el tubo por capilaridad. Llene aproximadamente tres cuartas partes (75%) del tubo. 2. Tapone el extremo contrario del tubo (el extremo que no ha estado en contacto con la sangre). Verifique que el taponamiento es hermtico y llega a unos 2 mm de profundidad dentro del tubo. Si no se puede obtener la cera o la arcilla plstica para modelar, cierre este extremo del tubo calentndolo cuidadosamente sobre la llama de una lmpara de alcohol o la de un mechero de Bunsen (Fig. 9.31 y Fig. 9.32). Djelo enfriar en posicin horizontal. 3. Es conveniente disponer de una gradilla numerada en que se haya colocado arcilla plstica para modelar, de manera que el tubo de cada paciente se pueda fijar en posicin vertical junto al nmero correspondiente. Muestras de sangre venosa 1. Se recoge una muestra de sangre venosa, como se describe en la seccin 9.2 y agregarlo a un tubo de ensayo que contiene solucin de EDTA dipotsico. 2. Usando una pipeta capilar, rellenar alrededor de tres cuartas partes de un tubo capilar con la sangre. 3. Selle el tubo como se describe en el paso 2 anterior.
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A A) Es conveniente disponer de una gradilla numerada en que se haya colocado arcilla plstica para modelar, de manera que el tubo de cada paciente se pueda fijar en posicin vertical junto al nmero correspondiente. Tcnica para la medicin 1. Coloque los tubos capilares en las ranuras numeradas del cabezal de la centrfuga, vigilando que el nmero de la ranura corresponda al nmero de la muestra. El extremo del tubo que se ha taponado con cera (o cerrado sobre la llama) deber apuntar hacia afuera, lejos del centro (Fig. 9.33). 2. Centrifguese a alta velocidad (3000 g) (durante el perodo de tiempo recomendado por el fabricante de la centrfuga, generalmente 10 minutos). Al terminar la centrifugacin cada uno de los tubos tendr en su interior tres capas (Fig. 9.34): en la parte superior, una columna de plasma (P) a la mitad, una capa sumamente delgada de glbulos blancos (GB) en la parte inferior y hasta el fondo, una columna de glbulos rojos (GR). La determinacin de la fraccin de volumen de eritrocitos se hace precisamente al nivel del tope de la columna de glbulos rojos. 3. Mantener el tubo en contra de la escala de manera que la parte inferior de la columna de eritrocitos (no la parte inferior del tubo) est alineado con la lnea horizontal en cero (vase Fig. 9.35). 4. Mueva el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada 1.0 pasa a travs de la parte superior de la columna de plasma. Compruebe para asegurarse que la parte inferior de la columna de eritrocitos sigue en la lnea de cero, compruebe tambin (a travs de las lneas verticales gruesas) que el tubo est vertical. 5. La lnea que pasa a travs de la parte superior de la columna de eritrocitos da la fraccin de volumen de eritrocitos (0,4 en la figura 9.35). Las lneas intermedias finas representan intervalos de 0,05; si la parte superior de la columna de eritrocitos no est en una lnea, pero entre una lnea gruesa y una lnea fina, su posicin se puede estimar al 0.01 ms cercano. Nota: Si el laboratorio todava no ha cambiado las unidades a las del sistema SI y se sigue utilizando el sistema tradicional, el mismo grfico se puede utilizar. Basta con leer los nmeros como porcentajes en lugar de fracciones. Por ejemplo, en lugar de "fraccin de volumen de eritrocitos: 0.4" presentamos el resultado como "hematocrito: 40%".
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Tabla 9.6 Fracciones de volumen de eritrocitos y hematocritos normales, por grupo de edad Grupo de edad Fraccin de volumen de eritrocitos Hematocrito (%) Recin nacidos 0,50-0,58 50-58 Bebs (3 meses) 0,35-0,40 35-40 Nios (5 aos) 0,38 - 0,44 38-44 Mujeres 0,37-0,43 37-43 Hombres 0,40-0,50 40-50 Resultados Rango de referencia La Tabla 9.6 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Valores bajos Los valores bajos se encuentran en pacientes que sufren de anemia. En los hombres con anemia de la fraccin de volumen de eritrocitos es inferior a 0,4 y en las mujeres es inferior a 0,37 (hematocrito de 40% y 37%, respectivamente). Valores altos
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Los valores altos se encuentran en los casos de prdida de plasma, quemaduras graves, deshidratacin (como en las enfermedades diarreicas) y tambin (raramente) en policitemia. Relacin entre la concentracin del nmero de eritrocitos y la fraccin de volumen de eritrocitos Normalmente, existe una relacin lineal entre la concentracin del nmero de eritrocitos y la fraccin de volumen de eritrocitos. Si la concentracin del nmero de eritrocitos es C x 1012 por litro, la fraccin de volumen de eritrocitos estar normalmente en el intervalo (C - 0,2)/10 a (C -0.4)/10. Ejemplo: Si la concentracin del nmero de eritrocitos es 5 X1012/l, la fraccin de volumen de eritrocitos estar normalmente en el intervalo (5 - 0,2)/10 a (5 -0,4)/10, es decir, 0,48 hasta 0,46. En unidades tradicionales, la relacin es similar, pero la frmula para el clculo es ligeramente diferente: si C es el recuento de eritrocitos, el hematocrito, como un porcentaje, estar normalmente en el rango de (C x10) - 2 a (C x10) - 4. Relacin entre la fraccin de volumen de eritrocitos y la concentracin de hemoglobina Normalmente, existe una relacin lineal entre la fraccin de volumen de eritrocitos y la concentracin de hemoglobina. La fraccin de volumen de eritrocitos es aproximadamente 0.003 veces la concentracin de hemoglobina cuando esta ltima se expresa en gramos por litro. Si la concentracin de hemoglobina se expresa en trminos de milimoles de hemoglobina (Fe) por litro, la fraccin de volumen de eritrocitos es aproximadamente 0.05 veces la cifra de gramos por litro. Ejemplo: Una persona con una concentracin de hemoglobina de 130 g/l tendr normalmente una fraccin de volumen de eritrocitos de 130 x 0.003 = 0,39. En trminos de la hemoglobina (Fe), la concentracin es de aproximadamente 8,0 mmol/l, y la fraccin de volumen de eritrocitos ser de aproximadamente de 8,0 x0.05 = 0,4. Informacin adicional que proporciona el ensayo de la fraccin de volumen de eritrocitos Leucocitos (Glbulos blancos) Examine la capa que forman los leucocitos inmediatamente arriba de la columna de glbulos rojos (ver Fig. 9.34). En condiciones normales es sumamente delgada; cuando aparentemente sea gruesa, determine la concentracin de nmero de leucocitos (ver seccin 9.6). Esta capa ser anormalmente gruesa si la concentracin de nmero de leucocitos es superior a 20 x 109/l (20000 mm3). En casos de leucemia, en que la concentracin de nmero de leucocitos puede ser de 100200 x 109/l (100 000-200 000 mm3), esta capa tendr varios milmetros de espesor. Concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos La concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos es una medida del contenido promedio de esta sustancia en los glbulos rojos. Se expresa en gramos de hemoglobina por litro o en milimoles de hemoglobina (Fe) por litro,* y se calcula dividiendo la concentracin de hemoglobina de la sangre entre la fraccin de volumen de eritrocitos. *Vase la nota sobre la forma de expresar la concentracin de hemoglobina antes. Ejemplos (1) Si la hemoglobina se expresa en gramos de hemoglobina por litro: hemoglobina = 150 g/l; fraccin de volumen de eritrocitos = 0,43 concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos = 150/0,43 = 349 g/l o (34,9%). (2) Si la hemoglobina se expresa en milimoles de hemoglobina (Fe) por litro: hemoglobina (Fe) = 9,3 mmol/l; fraccin de volumen de eritrocitos = 0,43 concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos = 9,3/0,43 = 21,6 mmol/l (Nota: para convertir valores en g/l a valores en mmol/l multiplique por 0,062 06. As, empleando el ejemplo anterior, 349 g/l x 0,062 06 = 21,6 mmol/l.) RESULTADOS Normalmente la concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos se encuentra entre los lmites siguientes: (a) lmite inferior: hemoglobina, 322 g/l o hemoglobina (Fe), 20 mmol/l; (b) lmite superior: hemoglobina, 371 g/l o hemoglobina (Fe), 23 mmol/l. Cuando la cifra se halla entre estos lmites se dice que los glbulos rojos son "normocrmicos" (de color normal). Si los valores descienden debajo del lmite inferior de los mrgenes normales indicarn que los eritrocitos son "hipocrmicos" (de color menos intenso que el de los eritrocitos normales), como ocurre en las anemias hipocrmicas. Si los valores son ms altos que el lmite superior de los mrgenes normales debern despertar sospechas y se habr de determinar nuevamente la concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos. La hemoglobina forma aproximadamente el 95% de la masa de eritrocitos. Los glbulos rojos nunca son "hipercrmicos" (de color ms intenso que el normal), pero pueden aumentar de tamao y, en estas condiciones, contener mayor cantidad de hemoglobina que los eritrocitos normales; en este caso la concentracin media de hemoglobina puede ascender hasta 380 g/l (hemoglobina (Fe) = 23,6 mmol/l), aunque nunca es superior a esta cifra. Unidades tradicionales En el sistema tradicional la concentracin media de hemoglobina en los eritrocitos se denominaba "concentracin de hemoglobina corpuscular media" (abrevindola generalmente como CHCM) y se expresaba por un porcentaje. Se calculaba dividiendo la concentracin de hemoglobina de la sangre expresada en gramos por 100 ml entre el hematocrito expresado como un porcentaje y multiplicando por 100. Ejemplo: concentracin de hemoglobina, 15,0 g/100 ml; hematocrito, 43%; concentracin de hemoglobina corpuscular media = (15,0/43) x 100 = 34%. En este sistema los mrgenes normales
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son de 32-37 % y los valores nunca ascienden a ms de 38%. Si se obtiene un resultado as, la prueba debe repetirse. 9.4.2 Mtodo de la Macroescala Principio La sangre (mezclada con anticoagulante) se coloca en un tubo graduado y se centrifuga para empaquetar a los eritrocitos. El nivel de la columna de eritrocitos se lee directamente en el tubo graduado (Fig. 9.36). Materiales y reactivos (Fig. 9.37) Centrfuga Tubos graduados especiales (tubos Wintrobe), 9,5 cm de largo con un dimetro interior de 0,6 cm, calibrados de 0 a 100 Pipeta Pasteur capilar fina larga (con una longitud suficiente como para llegar a la parte inferior del tubo) con perilla de goma Anticoagulante EDTA dipotsico, solucin al 10% (reactivo. N 22) o una solucin Wintrobe (reactivo. N 65). Mtodo Coleccin de muestras 1. Se recoge una muestra de sangre venosa, como se describe en la seccin 9.2 y se la agrega a un tubo graduado que contiene anticoagulante ((sal bipotsica de EDTA o solucin de Wintrobe). 2. Usando la pipeta Pasteur capilar, llenar el tubo graduado con sangre hasta la marca de 100, asegurndose que no se formen burbujas de aire (Fig. 9.38). Tcnica de medicin 1. Colocar los tubos graduados en la centrfuga y centrifugar durante 30 minutos con una fuerza centrfuga de 2300 g. Si la longitud del brazo del rotor de la centrfuga (medida desde el eje de rotacin hasta la base de la cubeta donde se aloja el tubo) es de 15 cm, se necesitarn 3600 rpm para lograr esta fuerza centrfuga; si el brazo es de 20 cm se necesitarn 3100 rpm. Importante: una fuerza centrfuga inferior a 2300 g producir resultados falsos. 2. Mida el nivel en que la columna de eritrocitos se encuentra con la capa de leucocitos. Verifique que se usan las unidades de graduacin adecuadas, que debern llegar, ascendiendo, hasta el nmero 100. La cifra que se obtenga ser un porcentaje ("hematocrito"); divdala entre 100 para obtener la fraccin de volumen de eritrocitos. Resultados Consulte antes lo explicado para el mtodo de la microescala. Los valores normales son iguales a los que se han indicado al tratar el mtodo de microescala.
Figura 9.36 Principio de la macroescala para estimar la fraccin de volumen de eritrocitos
Figura 9.37 Materiales para la estimacin de la fraccin de volumen de eritrocitos mediante la macroescala. Figura 9.38 Usando una pipeta Pasteur capilar de vidrio para llenar un tubo graduado con sangre.
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Figura 9.39 Medicin del hematocrito.
9.5 ESTIMACIN DE
LA CONCENTRACIN DEL NMERO DE ERITROCITOS
El nmero de los eritrocitos contenidos en 1 litro de sangre se denomina concentracin del nmero de eritrocitos. (En unidades tradicionales, que se expresa como el nmero de eritrocitos por milmetro cbico y se le llama "recuento" de eritrocitos o glbulos rojos.) Los mtodos precisos para contar eritrocitos requieren de un sistema contador electrnico. Por desgracia, dichos instrumentos a menudo no estn disponibles en los laboratorios perifricos. Es decir, para contar hemates de manera ms precisa se requiere de los automatizadores o contadores hematolgicos automticos y/o semiautomticos. Un mtodo simple pero mucho menos preciso utiliza una cmara de recuento en el que los eritrocitos se cuentan bajo el microscopio. Sin embargo, este mtodo es de tan baja precisin que no se debe utilizar. Es difcil lograr determinaciones precisas de la concentracin de nmero de eritrocitos con una cmara para recuento, y se recomienda que en vez de intentarlas se determinen la fraccin de volumen de eritrocitos (hematocrito) (ver seccin 9.4) y la concentracin de hemoglobina (ver seccin 9.3). Rango de referencia La Tabla 9.7 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Los valores altos Los pacientes que estn deshidratados o tienen policitemia tendrn altas concentraciones nmero de eritrocitos. Valores bajos Los pacientes con anemia causada por la produccin insuficiente, prdida o hemlisis de los eritrocitos tendrn concentraciones de nmero de eritrocitos bajas. Nota: La anemia es un sndrome clnico que tiene muchas causas subyacentes. El cuadro clnico se determina por el grado y la duracin de la anemia. Los sntomas van desde leve palidez y fatiga, dolor de cabeza, mareos e irritabilidad, al comportamiento incontrolado e incluso shock e insuficiencia cardaca. La anemia puede deberse a: -Prdida de sangre -Disminucin de la produccin de eritrocitos -Aumento de la destruccin de los eritrocitos. La causa ms comn de la anemia es la deficiencia de hierro. Otras causas comunes tales como la infeccin, la malaria, la malnutricin y las deficiencias vitamnicas generalmente contribuyen a la anemia en asociacin con deficiencia de hierro. Otras causas de anemia son los siguientes: -Trauma -Infecciones parasitarias -Enfermedades del sistema endocrino -Enfermedades crnicas Errores innatos del metabolismo -Intoxicacin. Tabla 9.7 Concentraciones nmero de eritrocitos normales, por grupo de edad Concentracin del nmero de eritrocitos Grupo de edad Unidades del SI (por litro) Unidades tradicionales (por mm3) 12 Recin nacidos 5.0-7.0 x10 5.07.0 x106 12 Bebs (1-6 meses) 3.85.9 x10 3.85.9 x106 Nios (4 aos) 3.85.4 x1012 3.85.4 x106 Mujeres 4.0-5.4 x1012 4.0-5.4 x106 12 Hombres 4.56.2 x10 4.56.2 x106
AGREGADO:
A pesar de que el recuento de hemates no se aconseja, se describe el recuento de glbulos rojos considerando que existen lugares donde no es posible determinar la fraccin de volumen o hematocrito.
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Fuentes: Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud 1 edicin 1980 Manual de Procedimientos de Laboratorio en Tcnicas Bsicas de Hematologa, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pblica, Repblica del Per, Elaboracin: T. M. Mara Muoz Zambrano, Dra. Cecilia Morn Cortijo Principio La sangre se diluye por medio del lquido para diluir eritrocitos. Los eritrocitos se cuentan con el microscopio en una cmara para recuento y se calcula el nmero por litro de sangre. MATERIALES Pipetas: (a) Una pipeta para sangre (conocida tambin como pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 ml (20 mm3 20 l), con tubo de goma y boquilla. No se recomienda el uso de pipetas con perilla, y a que son imprecisas, difciles de emplear y limpiar, y ms costosas. (b) Una pipeta de 5 ml, graduada. Una cmara para recuento. Se pueden emplear diversos tipos de cmara; aqu se describe el uso de la cmara cuadriculada de Neubauer mejorada. Lquido para dilucin: solucin de citrato y formaldehido. (Tambin pueden usarse los lquidos diluyentes para recuento de Hayem, de Gower, etc.) Un contador manual para recuento, si es posible. (Cuenta ganado) Mtodo 1. Con la pipeta de 5 ml graduada deposite 4,0 ml (o 3,8 ml) del lquido para dilucin en un frasco pequeo. 2. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de la pipeta para sangre. Evtese la entrada de burbujas. Si se emplea sangre venosa asegrese que se mezcle adecuadamente con el anticoagulante del frasco, invirtiendo este varias veces durante 1 minuto inmediatamente antes de aspirarla con la pipeta. Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre contina en el mismo nivel. Tambin se puede usar una micropipeta de 20 l en lugar de la pipeta de Sahli para aspirar la sangre. Asimismo, se debe limpiar el exterior del tip (punta) de la micropipeta. 4. Deposite la sangre en el frasco que contiene el lquido para dilucin. Enjuague la pipeta aspirando y expulsando este lquido 3 veces. La dilucin de la sangre ser de 1 x 200. Ponga una etiqueta en el frasco, con el nombre o el nmero del paciente. 5. Ajuste el cubrecmara de vidrio en la cmara para recuento. Mezcle completamente la sangre diluida. Con una pipeta Pasteur llene las dos reas cuadriculadas de la cmara. Evite llenar excesivamente las reas cuadriculadas a fin de que la sangre no se derrame. 6. Deje reposar la cmara para recuento en la mesa de trabajo durante 3 minutos, de modo que las clulas se asienten. 7. Coloque la cmara en la platina del microscopio. Utilice el objetivo x 10, localice el cuadro central de la cmara y cambie en seguida al objetivo x 40 para contar los eritrocitos. Recuento de eritrocitos Por medio de una cmara de Neubauer mejorada: Cuente las clulas en un rea de 0,2 mm2, empleando los cuadros A, B, C, D y E. Incluya en este recuento las clulas que se encuentren sobre las lneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica a continuacin: Este cuadro representa uno de los cinco en que se ha hecho el recuento, que son los cuadros A, B, C, D y E. (vase figura J). Calcule el nmero de clulas en un litro de sangre: Multiplique por 0,01 el nmero de clulas que se han contado en los primeros cinco cuadros. Haga lo mismo con el nmero de clulas que se han contado en los segundos cinco cuadros. Obtenga el promedio de las dos cifras. Notifique el resultado como "nmero x 1012/l Ejemplo: Nmero de clulas contadas en (a) la primera cmara cuadriculada = 390 Nmero de clulas contadas en (b) la segunda cmara cuadriculada = 370 Clulas por litro en (a) = (390 x 0,01) x 1012 = 3,9 x 1012 Clulas por litro en (b) = (370 x 0,01) x 1012 = 3,7 x 1012 Promedio (resultado que se notifica) = 3,8 x 1012/l Explicacin del clculo Cada uno de los cinco cuadros en que se cuentan las clulas tiene un rea de 0,04 mm2; por lo tanto, el rea total es de 0,2 mm2. La profundidad de la cmara es de 0,1 mm; en consecuencia, el volumen en que se cuentan las clulas es de 0,2 x 0,1 = 0,02 mm3. De este modo, dividiendo entre 2 y multiplicando por 100 (o bien multiplicando por 50) se obtiene el nmero de clulas por mm3 de sangre diluida. Puesto que la dilucin es de 1 x 200, al multiplicar por 200 se obtiene el nmero de clulas en 1 mm3 de sangre no diluida. Por ltimo, en un litro hay un milln (106) de mm3, de manera que si la multiplicacin se hace por 106 se obtiene el nmero de clulas en un litro de sangre sin diluir. Esto se puede resumir como se indica en seguida: Clulas por milmetro cbico = clulas contadas x 50 x 200 = clulas contadas x 10000 Ya que la concentracin de clulas es tan elevada, resulta ms fcil expresarla en millones. clulas contadas x 10 000 Clulas por milmetro cbico millones (clulas contadas x 0,01) millones (clulas contadas x 0,01) x 106 1 000 000 El nmero de clulas en un litro ser 106 veces este nmero; por lo tanto: Clulas por litro = clulas contadas x 0,01 x 106 x 106 = clulas contadas x 0,01 x 1012 Ejemplo:
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En los primeros cinco cuadros se cuentan 390 clulas. Por lo tanto, el nmero de clulas en 1 mm3 de sangre sin diluir es 390 x 0,01 x 106 = 3,9 millones. La concentracin por litro de sangre sin diluir es 390 x 0,01 x 1012, 3,9 x 1012 /l. USO DE LA PIPETA DE THOMA PARA EL RECUENTO DE HEMATES PIPETA DE GLBULOS ROJOS (DE THOMA) Presenta cerca del extremo superior una marca de 101, inmediatamente contina una dilatacin (bulbo) que contiene una perla roja mezcladora, luego sigue el tallo (extremo ms largo), el cual est dividido en 10 partes con 2 marcas: 1 acabando el bulbo y 0,5 a la mitad del tallo. Se requiere igual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar. Con esta pipeta de Thoma para glbulos rojos (que ya tiene la dilucin 1/200) se hace el procedimiento sin necesidad de hacer una dilucin en un tubo aparte con una pipeta graduada. Representa una alternativa al mtodo anterior. Procedimiento 1 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar. 2 Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilucin de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilucin ser 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. 3 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de lquido de dilucin hasta la marca de 101. 4 Se coloca en un rotador automtico o se hace rotar manualmente de 2 a 3 minutos. 5 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridad se llene exactamente. 6 Hacer el recuento con objetivo de 40x Clculo de los resultados
A.1 SOLUCIN DE GOWER A.1.1 Reactivos Sulfato de sodio 12,5 g cido actico glacial 33,3 ml Agua destilada c.s.p 200 ml A.1.2 Procedimiento A.1.2.1Disolver el sulfato de sodio y el cido actico glacial en el agua destilada. Guardar en lugar fresco. A.2 SOLUCIN DE HAYEM A.2.1 Reactivos Bicloruro de mercurio 0,5 g Sulfato de sodio 5,0 g Cloruro de sodio 1,0 g Agua destilada 200 ml A.2.2 Procedimiento A.2.2.1 Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco.
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L A) Materiales y reactivos. B) Con la pipeta de 5 ml graduada deposite 4,0 ml (o 3,8 ml) del lquido para dilucin en un frasco pequeo o en tubo. C) Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de la pipeta para sangre (Sahli). D) Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre contina en el mismo nivel. E) Deposite la sangre en el frasco que contiene el lquido para dilucin (la dilucin de la sangre ser de 1 x 200.) F) Con una pipeta Pasteur llene las dos reas cuadriculadas de la cmara. G) Coloque la cmara en la platina del microscopio. H) Por medio de una cmara de Neubauer mejorada: Cuente las clulas en un rea de 0,2 mm2, empleando los cuadros A, B, C, D y E. I) reas donde se cuentan los hemates (5 cuadros en rojo). En la ilustracin se observa la ampliacin de un cuadro para su mejor compresin. J) Este cuadro representa uno de los cinco en que se ha hecho el recuento, que son los cuadros A, B, C, D y E. Incluya en este recuento las clulas que se encuentren sobre las lneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica en la ilustracin (vase las flechas). K) Sentido de conteo de los hemates (vase la flecha). Este camino recorrido para el recuento de los hemates es el sugerido, ya que el operador puede escoger otra forma. L) Foto que muestra un cuadro para el recuento de hemates.
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3 1) Ilustracin que muestra las pipetas de Thoma para leucocitos (arriba) y hemates (abajo). Ntese las marcas (graduacin), en la de leucocitos la marca 0,5 y 11 (dilucin 1/20), en la de hemates 0,5, 1 y 101 (dilucin 1/200). Dentro del bulbo de cada una contienen una perla mezcladora, en la de leucocitos es de color azul y en la de hemates es de color rojo. 2) Ilustracin que muestra la pipeta de Thoma para hemates con sus marcas. 3) Foto que muestra una pipeta de Thoma para hemates (arriba) donde se nota el bulbo con la perla roja mezcladora; una pipeta de Thoma para leucocitos (al medio, 3 posicin contando desde abajo); una pipeta de Sahli (en donde se logra apreciar la marca correspondiente a los 20 l en color azul) (al medio); y una cmara de recuento de Neubauer mejorada (abajo). 9.6 Estimacin de la concentracin del nmero de leucocitos La concentracin de nmero de leucocitos (glbulos blancos) es el nmero de ellos que se encuentra en un litro de sangre. (En unidades tradicionales se expresa como el nmero de leucocitos por milmetro cbico y se llama "recuento" de leucocitos o glbulos blancos.) En ciertas enfermedades se modifica el nmero de leucocitos en la sangre. Por ejemplo, en la mononucleosis infecciosa y en las infecciones bacterianas hay un marcado aumento, mientras que en la fiebre tifoidea hay una marcada disminucin. 9.6.1 Principio La sangre se deposita en un lquido para diluir leucocitos, que: destruye los eritrocitos (hemlisis) deja intactos los glbulos blancos. A continuacin se cuentan los leucocitos (glbulos blancos) en una cmara para recuento, por medio del microscopio, y se calcula el nmero que existe en cada litro de sangre. 9.6.2 Materiales y reactivos Microscopio Cmara de Neubauer mejorada, de preferencia con "lnea brillante" (Fig. 9.40). Se pueden utilizar diferentes tipos de cmaras cuadriculadas, como la cmara Brker pero la cmara Brker rara vez se utiliza. Tape la cmara con la laminilla de vidrio especial que la acompaa. Pipeta para sangre (Sahli), graduada a la marca 50 l (0,05 ml) con tubo de goma y boquilla. Puede usarse como alternativa una micropipeta de 50 l. No se recomienda el uso de pipetas con perilla, que son imprecisas, difciles de usar y limpiar, y ms costosas. Pipeta graduada de 1 ml Pipeta Pasteur o un tubo capilar Contador manual (cuenta ganado) o contador con abalorios. Si es posible, use un contador manual. El lquido de dilucin (preparado mediante la adicin de 2 ml de cido actico glacial en 1 ml de violeta de genciana, solucin acuosa al 1%, y ajustando el volumen a 100 ml con agua destilada). Como alternativa se puede usar el lquido de Trk (reactivo N 61). Las dimensiones de la cmara de Neubauer mejorada son las siguientes: -rea = 9 mm2; -Profundidad = 0,1 mm. 9.6.3 Mtodo 1. Con la pipeta graduada de 1 ml traslade 0,95 ml del lquido para dilucin de leucocitos a un frasco pequeo. 2. Aspire sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,05 ml de la pipeta para sangre (Sahli). Evite la entrada de burbujas. Si la sangre es venosa asegrese que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene esta sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, inmediatamente antes de aspirarla con la pipeta. 3. Limpie el exterior de la pipeta con papel absorbente. Verifique que la sangre contina en el mismo nivel (la marca de 0,05 ml) (Fig. 9.41). 4. Deposite la sangre en el frasco que contiene el lquido para dilucin. Enjuague la pipeta aspirando y expulsando este lquido 3 veces. La dilucin de esta sangre ser de 1 en 20. Coloque en el frasco una etiqueta con el nombre o el nmero del paciente.
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5. Monte la laminilla de vidrio (cubrecmara) en la cmara para recuento, presionndola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Cuando la laminilla se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas anillos de Newton. 6. Mezcle bien la sangre diluida. Por medio de una pipeta Pasteur o un tubo capilar llene la cmara para recuento (fig. 9.42). Evite llenarla ms all del rea cuadriculada. Importante: Si el lquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cmaras, la operacin se deber repetir: quite y limpie la laminilla de vidrio; limpie tambin la cmara para recuento y llnela con otra gota. 7. Deje reposar la cmara para recuento sobre la mesa de trabajo durante 3 minutos a fin de que las clulas se asienten. 8. Coloque la cmara en la platina del microscopio. Utilice el objetivo x 10 (con ocular x 10). Reduzca la cantidad de luz que entre en el condensador, ajustando el diafragma iris. Enfoque la cuadrcula de la cmara y los leucocitos. No se confundan los leucocitos con partculas de polvo. Cuente las clulas en un rea de 4 mm2 de la cmara utilizando los cuadros numerados de las esquinas 1, 3, 7 y 9, como se indica en la figura 9.43. Incluya en este recuento las clulas que se observen sobre las lneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica a continuacin en la figura 9.44: Este cuadro representa uno de los cuatro revisados, es decir, los cuadros 1,3, 7 y 9. 9. Calcule el nmero de clulas en un litro de sangre: * Multiplique el nmero de clulas contadas en los cuatro cuadros por 0,05 Notifique el resultado como "nmero x 109/l Ejemplo: Nmero de clulas contadas = 188 Clulas que hay en un litro = (188 x 0,05) x 109 Resultado que se notifica: 9,4 x 109/l Explicacin del clculo Cada uno de los cuatro cuadros en que se cuentan las clulas tiene un rea de 1 mm2; por lo tanto, toda el rea mide 4 mm2. La profundidad de la cmara es de 0,1 mm; en consecuencia, el volumen en que se cuentan las clulas es 4 x 0,1 = 0,4 mm3. De este modo, la divisin entre 4 y la multiplicacin por 10 dar el nmero de clulas que haya en 1 mm3 de sangre diluida. Ya que la dilucin es de 1 en 20 (1/20), la multiplicacin por 20 dar el nmero de clulas en 1 mm3 de sangre sin diluir. Por ltimo, en un litro hay un milln (106) de milmetros cbicos, de manera que la multiplicacin por 106 dar el nmero de clulas por litro de sangre sin diluir. Esto se puede resumir como se indica a continuacin: Ejemplo: Un total de 188 leucocitos se cuentan en los cuatro cuadros. Por lo tanto, el nmero de leucocitos por milmetro cbico de sangre sin diluir es: 188 x 10 x 20 ( 188 x 50 9400) 4 Y el nmero por litro es: 9400 x 10 6 9,4 x 10 9
Fig. 9.41
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Figura 9.40 Cmara de recuento de Neubauer mejorada. Figura 9.41 Comprobacin de que la sangre todava est en la marca. Se observa la flecha indicando el sentido de aspiracin y la comprobacin de la marca. A) Colocando el cubrecmara en la cmara de Neubauer. Figura 9.42 Llenado de la cmara de recuento. Figura 9.43 Uso de la cmara de Neubauer mejorada. En una esquina (la 1) se indica el sentido de conteo. En 1, 3, 7 y 9 se realizan el conteo de leucocitos, es decir, en las 4 esquinas. B) Imagen del retculo de la cmara de Neubauer en donde se muestra en celeste las reas de conteo de leucocitos, y en rojo las reas de recuento de hemates. C) Otra imagen del retculo de Neubauer donde se indica las reas de conteo de leucocitos (L). D) Ilustracin que muestra una de las esquinas del retculo de la cmara de Neubauer y al lado una foto de los leucocitos en esta esquina
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(cuadrado). Figura 9.44 Contando leucocitos con la cmara de Neubauer mejorada. Se muestra una esquina con los leucocitos dentro, adems se sealan con flechas los leucocitos que deben ser contados y los que deben obviarse cuando estn sobre la lnea. Incluya en este recuento las clulas que se encuentren sobre las lneas de dos lados de cada cuadro revisado, como se indica en la ilustracin (vase las flechas). 9.6.4 Resultados Rango de referencia Los rangos de referencia para los diferentes grupos de edad se presentan en la Tabla 9.8. Valores elevados El aumento del nmero total de leucocitos circulantes se llama leucocitosis. Se observa en el curso de algunas infecciones bacterianas pigenas. En la leucemia se pueden encontrar concentraciones de nmero de leucocitos que varan desde 50 x 109/l hasta 400 x 109/l (50000/mm3 a 400 000/mm3) y an ms. Por lo tanto, se necesita emplear una dilucin mayor de sangre para determinar la concentracin de nmero; por ejemplo, 0,05 ml de sangre y 1,95 ml del lquido para dilucin, de modo que se obtenga una dilucin de 1 en 40. Si se emplea esta dilucin el nmero de clulas contadas se deber multiplicar por 0,1 en vez de 0,05 para obtener el nmero por 109 por litro (si se usan unidades tradicionales, multiplique por 100 en vez de 50 para obtener el nmero por mm3). Valores reducidos La disminucin del nmero total de leucocitos circulantes se denomina leucopenia. Se observa en algunas infecciones como la tifoidea y el paludismo, y despus de usar durante cierto tiempo algunos medicamentos. Cuando la concentracin de nmero de leucocitos es muy reducida, el grado de dilucin de la sangre deber ser menor; por ejemplo, 0,05 ml de sangre y 0,45 ml del lquido para dilucin, con lo que se obtendr una dilucin de 1 en 10. Si se emplea esta dilucin, el nmero de clulas contadas se deber multiplicar por 0,25 en vez de 0,05 para obtener el nmero por 109 por litro (si se usan unidades tradicionales multiplique por 25 en vez de 50 para obtener el nmero por mm3). Tabla 9.8 concentraciones nmero de leucocitos normales, por grupo de edad Concentracin del nmero de leucocitos Grupo de edad (por litro)a Recin nacidos 10-20 x109 Bebs (3-9 meses) 4-15 x109 Nios (de 3 aos) 4-11 x109 Nios (10 aos) 4-10 x109 Adultos 4-10 x109 a La referencia puede ser diferente en ciertas poblaciones autctonas Correccin de valores para restar eritrocitos nucleados Los glbulos rojos nucleados, o normoblastos (especficamente se denomina eritroblasto ortocromatfilo) (vase la Fig. 9.90), no se encuentran normalmente en la sangre, son precursores de los hemates. Sin embargo, pueden aparecer en ella durante ciertas enfermedades como la anemia falciforme y otras anemias hemolticas. Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el lquido para dilucin y, por lo tanto, se suelen contar junto con los leucocitos. Los elementos nucleados no son lisados, los elementos formes anucleados (hemates, plaquetas) s sufren la lisis por los lisantes del mtodo manual, y los de los contadores hematolgicos automticos y semiautomticos. Es ms correcto hablar de precursores eritropoyticos nucleados (recuerde que el reticulocito y el hemate ya no tienen ncleo) que en el caso de la eritropoyesis son todos nucleados hasta el inmediato anterior al reticulocito. En humanos, el proceso de produccin de eritrocitos o glbulos rojos pasa por varios estados eritroblsticos. En la lnea de eritropoyesis el primer eritroblasto presente en humanos, que proviene del proeritroblasto, se denomina eritroblasto basfilo. Del eritroblasto basfilo se diferencia el eritroblasto policromatfilo. El siguiente estado en la transformacin es el eritroblasto ortocromtico, eritroblasto ortocromatfilo o normoblasto. El normoblasto sufre la prdida del ncleo (que es fagocitado por macrfagos) dando lugar al reticulocito o eritrocito inmaduro. Tras unos das de maduracin en la mdula sea finalmente la abandona entrando en el torrente sanguneo y pasando a ser un eritrocito maduro. Dicho esto, entonces, es ms apropiado hablar de correccin del recuento de leucocitos por la presencia de Eritroblastos en sangre perifrica, detectados en un frotis sanguneo teido con Romanowski o May Grnwald Giemsa. Recuerde que cualquiera de estos eritroblastos puede llegar a aparecer en sangre perifrica en ciertos estados patolgicos y no solamente el Normoblasto. Los normoblastos y otros precursores eritroides nucleados son detectados por el examen microscpico de una extensin sangunea teida con los mtodos de tincin apropiados (Romanowski, May Grnwald Giemsa). Luego estos eritoblastos son contados e informados en el mismo papel o informe que en el de la frmula leucocitaria y se los coloca como dentro de las alteraciones observadas en la serie roja y no forman parte de la frmula leucocitaria porque no pertenecen a la serie blanca. Ahora, s son tenidos en cuenta en el recuento de leucocitos porque no se lisan como estos y pasan a formar parte del recuento total de los glbulos blancos. Esto lleva a la correccin del nmero de leucocitos porque se cuentan como leucocitos ms eritroblastos, y las mquinas y el recuento manual no estn preparados para distinguirlos y diferenciarlos. Es decir, no discriminan y los cuenta a los dos como iguales aunque no lo sean. Cuando la cantidad de normoblastos es elevada y los leucocitos se contaron usando un contador de clulas completamente automatizado (automtico) o semi-automatizado (y tambin por conteo manual en cmara), la concentracin de nmero de leucocitos se debe corregir como se indica en seguida:
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Examine una extensin sangunea teida con el mtodo de Romanowski (vase la seccin 9.10) y cuente el nmero de normoblastos que se observe por cada 100 leucocitos. Nota: Este clculo de correccin tambin es vlido para cuando se observan Eritroblastos (precursores de los hemates) ya que estos tambin son nucleados. Clculo: La concentracin de nmero de normoblastos (por litro) es: nmero de normoblastos contados x Concentracin de N de leucocitos 100 N de normoblastos contados Ejemplo Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracin de nmero de leucocitos es 16 x 109/l, la concentracin de nmero de normoblastos ser: 50 x16 5.3x10 9 / l 100 50 y la concentracin de nmero de leucocitos corregida ser: (16 5.3) x 10 9 / l 10.7 x10 9 / l En unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitos se expresan por milmetro cbico. En tales unidades el clculo correspondiente al ejemplo que se ha dado sera: 50 x16 000 5300 / ml 100 50 Recuento corregido de leucocitos: (16 000 5300) = 10 700/ mm3.
AGREGADO:
Fuentes: Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud 1 edicin 1980 Manual de Procedimientos de Laboratorio en Tcnicas Bsicas de Hematologa, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pblica, Repblica del Per, Elaboracin: T. M. Mara Muoz Zambrano, Dra. Cecilia Morn Cortijo MTODO ALTERNATIVO USANDO LQUIDO DE TRK El recuento de leucocitos manual tambin se puede hacer usando lquido diluyente de Trk (reactivo N 61) en vez del mencionado anteriormente (con violeta de genciana). Este lquido tambin usa cido actico y como colorante azul de metileno. El cido actico produce la lisis de los hemates pero preserva intactos a los leucocitos. El mtodo es similar al anterior, tambin se hace una dilucin de 1/20, pero con la excepcin que aqu se puede usar otra proporcin de volmenes: 20 l para 0,38 ml (1/20). El resto de la tcnica es similar, asimismo el conteo. A los 20 l se los puede cargar con una pipeta de Sahli para 20 l o usando una micropipeta de 20 l; el volumen de 0,38 ml puede ser medido con una pipeta graduada de 1 ml. De cualquier manera, se hace la dilucin en un tubo de Khan, de hemlisis o en un tubo de ensayo corto. Solucin de Trk (nm. 61) cido actico glacial 4 ml Solucin de azul de metileno (N 39) 10 gotas Cantidad suficiente de agua destilada 200 ml Tambin se puede hacer el recuento manual con una pipeta de Thoma para leucocitos, ya que en la misma pipeta se produce la dilucin 1/20. USO DE LA PIPETA DE THOMA PARA EL RECUENTO DE LEUCOCITOS PIPETA DE GLBULOS BLANCOS (DE THOMA) Presenta cerca del extremo superior una marca de 11, inmediatamente contina una dilatacin (bulbo) que contiene una perla que funciona como mezcladora, luego sigue el extremo ms largo de la pipeta (tallo) que est dividida en 10 partes, con 2 marcas: 1 (parte final del bulbo) y 0,5 (a la mitad del tallo). Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombilla para aspirar. Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente. Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucin de Trk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas). Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en un rotador automtico por 2 3 minutos. Monte la laminilla de vidrio en la cmara para recuento que debe estar limpia y seca. Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequea de esta solucin en la cmara. Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten. Enfocar con objetivo de 10 x y contar en 4 cuadrados grandes angulares. Uso de una micropipeta semiautomtica Cuando se usa la micropipeta semiautomtica, se toma 20 l (0,02 ml) de sangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante y se diluye en un tubo que contenga 0,38 ml de solucin de Trk (aqu tenemos una dilucin 1:20). Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo, se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente.
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4 3 Varias imgenes que representan a la pipeta de Thoma para glbulos blancos. 1) Pipetas de Thoma para hemates y leucocitos. La pipeta de Thoma para leucocitos se encuentra abajo. Ntese la marca 11 y 0,5. 2) Ilustracin de pipetas de Thoma para leucocitos (arriba) y hemates (abajo). Ntese la marca 11 y 0,5 en la pipeta de leucocitos. 3) Las pipetas de Thoma para leucocitos se ubican a la izquierda de la figura, a la derecha las de glbulos rojos. 4) La pipeta de Thoma para leucocitos se ubica abajo. Ntese la goma y la boquilla. 9.7 MEDICIN DE
LA
VELOCIDAD
DE SEDIMENTACIN DE LOS ERITROCITOS
(VSE)
9.7.1 Principio La sangre recogida en un recipiente que contiene un anticoagulante se deposita en un tubo largo y graduado, que se mantiene en posicin vertical. Los eritrocitos se sedimentan en el fondo del tubo y sobre este sedimento se forma una columna de plasma. La altura de la columna de plasma, medida despus de una hora, indica la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos (glbulos rojos). La velocidad de sedimentacin de los eritrocitos tambin es llamada velocidad de sedimentacin globular y eritrosedimentacin. Se los considera sinnimos. 9.7.2 Materiales y reactivos (Fig. 9.45) Un tubo o pipeta de Westergren para medir la VSE: -de 2,5 mm de dimetro interior, graduado de 0 a 200 mm (con frecuencia, la graduacin es de 1 a 20, en que 1 equivale a 10, 2 a 20, etc.) Soporte para pipeta o tubo de Westergren Soporte para pipeta o tubo de Westergren Tubos de ensayo Jeringa graduada, 5 ml Pipeta graduada, 5 ml Temporizador Anticoagulante: citrato sdico, solucin de 3,2% (reactivo n 60) (conservar en el frigorfico) o la sal EDTA dipotsico, solucin al 10% (reactivo n 22.). En varios pases de Hispanoamrica se utiliza la solucin de citrato trisdico en proporcin de 38 g/l (3,8%), la que tambin se deber conservar en el frigorfico. 9.7.3 Mtodo 1. En un tubo o frasco deposite: - 0,4 ml de la solucin de citrato trisdico 2. Extraiga sangre venosa (ver seccin 9.2).* Ponga el torniquete tan flojo como sea posible puncione le vena inmediatamente y suelte el torniquete. Aspire con la jeringa: - 2 ml de sangre. *En este ensayo tambin se puede emplear sangre que se haya recogido anteriormente en un frasco que contenga sal bipotsica de EDTA. 3. Desmonte la aguja de la jeringa y deposite 1,6 ml de sangre en el frasco con anticoagulante (este frasco tendr una marca al nivel de los 2,0 ml) (Fig. 9.46). Agite con suavidad. La medicin de la VSE se deber efectuar menos de dos horas despus de que se haya obtenido la sangre. 4. Aspire la sangre con citrato y depostela en el tubo de Westergren (si es posible, empleando una propipeta de goma) hasta la lnea 0 (Fig. 9.47). 5. Coloque el tubo en la gradilla de Westergren, asegurndose de que se encuentre en posicin completamente vertical (Fig. 9.48). Confirme que no hay burbujas en el interior del tubo.
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Verifique que el soporte se halle en un plano completamente horizontal. 6. Dejar el soporte con el tubo de Westergren en una mesa alejado de las vibraciones (por ejemplo, no ponerlo en la misma mesa de la centrfuga), libre de corrientes de aire, tambin que no est cerca de un radiador de calefaccin central y no dejar en la luz solar directa. 7. Espere durante una hora (ajuste el temporizador para ese tiempo (1 hora) y esperar que suene la campanilla o alarma) y a continuacin tome nota de la altura de la columna de plasma segn la graduacin milimtrica del tubo a partir de la lnea 0, del extremo superior (Fig.9.49). 9.7.4 Resultados El resultado se expresa en milmetros por hora (mm/h). Rango de referencia La Tabla 9.9 muestra los valores de referencia para adultos. Nota: Si el paciente est deshidratado, la medicin del ESR tiene poco valor. Valores altos Cualquier enfermedad que produzca cambios en las protenas plasmticas aumentar la VSE. Estas incluyen a las infecciones agudas y crnicas, infartos de miocardio y la artritis reumatoide. La ESR tambin es mayor en los pacientes que sufren de anemia (ver pginas anteriores). Asimismo, se encuentran valores muy altos de VSE en la tuberculosis, la tripanosomiasis y las enfermedades malignas. La VSE tambin est elevada en el embarazo. Temperatura del ensayo La VSE aumenta con la temperatura (a partir de 23C). En los pases clidos se debe vigilar que la gradilla de Westergren no se coloque en un lugar caluroso del laboratorio (por ejemplo, bajo la luz del sol). Lavado de los tubos de Westergren Enjuague los tubos con agua y a continuacin djelos en remojo en agua limpia durante 12 horas. Djelos secar completamente (si es posible, en una incubadora, a 37 C). No utilice polvos para lavar, cidos o etanol. Tabla 9.9 Velocidad de sedimentacin de eritrocitos (VSE)a, por grupo de edad Grupo de edad VSE (mm/hora) Adultos (<50 aos) Hombres <15 Mujeres < 20 Adultos (> 50 aos) Hombres 20 Mujeres 30 a A una temperatura ambiente de 25 C.
Fig. 9.45
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Fig. 9.49 Figura 9.45 Materiales para la medicin de la VSE. Figura 9.46 Adicin de una muestra de sangre a la solucin de citrato trisdico. Figura 9.47 Aspirando sangre citratada hasta la marca de 0 mm del tubo de Westergren. Figura 9.48 Colocando el tubo de Westergren en el soporte. Figura 9.49 Medicin de la altura de la columna de plasma.
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E D A) y B) Soportes para tubos de Westergren. Dos diferentes modelos. C) y D) Tubos o pipetas de Westergren. E) Propipeta de goma.
AGREGADO:
SISTEMA COMERCIAL DE VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN DE ERITROCITOS El Kit Eritub es un sistema de eritrosedimentacin semicerrado que consta de 100 pipetas regladas (WESTERGREN) y 100 tubos preparados con de Citrato de Na a 3,8 g% para un volumen de muestra de 1,0 ml. Este es un sistema comercial que usa tubos plsticos en vez de vidrio para la eritrosedimentacin. Se lo plantea como de un solo uso. Quizs no est extendido su uso hacia lugares distantes como en centros de salud perifricos, pero es una opcin para la determinacin de la eritrosedimentacin. FORMA DE USO
Tubo con tapn troquelado (Fig. 1). Introduzca el cono de la jeringa con muestra a travs del tapn (Fig. 2). Dispense hasta el nivel adecuado (Fig. 3). Mezclar invirtiendo suavemente el tubo para impedir la formacin de espuma (Fig. 4). Una vez que la muestra llega al Laboratorio, homogeneizar; introduzca la pipeta firmemente en el tubo atravesando el tapn (Fig. 5); una vez hecho esto, la columna de sangre ascender hasta alcanzar el 0 (Fig. 6). El exceso de muestra se descargar en el rebalsador de seguridad (Fig. 7), el cual cumple la doble funcin de enrasar correctamente dicha muestra y evitar salpicaduras. Por ltimo coloque el conjunto en la gradilla-soporte (Fig. 8). Lea luego de pasada 1 hora. Fuente: http://www.dvs.com.ar 9.8 MEDICIN DEL
TIEMPO DE SANGRADO :
MTODO
DE
DUKE
9.8.1 Principio Con una lanceta se hace una pequea incisin en el lbulo de !a oreja. La sangre fluye por esta incisin y se mide el tiempo que transcurre hasta que se detiene el sangrado. Este ensayo se lleva a cabo: - para diagnosticar ciertos padecimientos hemorrgicos; - antes de realizar operaciones quirrgicas; - antes de efectuar una puncin del hgado o el bazo. 9.8.2 Materiales y reactivos Lancetas estriles Portaobjetos Papel de filtro (o papel absorbente)
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Cronmetro, si est disponible, de lo contrario un reloj con segundero ter. 9.8.3 Mtodo 1. Limpie suavemente el lbulo de la oreja con un algodn y ter (Fig. 9.50). No frote. Deje que se seque. 2. Perforar el lbulo de la oreja (Fig. 9.51). La sangre debe fluir libremente, sin ninguna necesidad de apretar el lbulo de la oreja. Inicie el cronmetro. 3. Despus de 30 segundos recoja la primera gota de sangre en una esquina del papel de filtro (o papel absorbente) (Fig. 9.52). No toque la piel con el papel. 4. Espere 30 segundos ms. Recoger la segunda gota de sangre de la misma manera, un poco ms lejos a lo largo de la tira de papel (Fig. 9.53). 5. Continuar para recoger una gota ms de sangre cada 30 segundos. Las gotas se vuelven progresivamente ms pequeas (Fig. 9.54). 6. Cuando no aparezca ms sangre, detener el cronmetro (o anote el tiempo transcurrido en el reloj). Otro mtodo consiste en contar el nmero de gotas sobre el papel de filtro (o papel secante) y se multiplica por 30 segundos (Fig. 9.55). Por ejemplo: hay siete gotas. El tiempo de sangrado es de 7 x 30 segundos = 3,5 minutos. 9.8.4 Resultados Comunique el tiempo de sangrado redondendolo al medio minuto ms cercano. Mencionar tambin el rango de referencia para el mtodo utilizado. Ejemplo: tiempo de sangrado 3,5 minutos (rango normal, Mtodo de Duke: 1-5 minutos). Si el tiempo de sangrado se prolonga examine una extensin de sangre teida segn el mtodo de Romanowski (vase la seccin 9.10) para observar si las plaquetas son escasas (se debe usar sangre venosa).
Figura 9.50 Limpieza del lbulo de la oreja con ter. Figura 9.51 Haciendo una incisin en el lbulo de la oreja con una lanceta estril.
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Figura 9.52 Despus de 30 segundos, recoger la primera gota de sangre. Figura 9.53 Despus de 1 minuto, recoger la segunda gota de sangre. Figura 9.54 Continuar para recoger una gota ms de sangre cada 30 segundos. Figura 9.55 Clculo del tiempo de sangrado. 9.9 OBSERVACIN DE
LA RETRACCIN DEL COGULO Y LA MEDICIN DEL TIEMPO DE LISIS
9.9.1 Principio Los tubos de ensayo que contienen la sangre se utilizan para: - observar la retraccin del cogulo - medir el tiempo en que el cogulo se disuelve (lisis). Estas observaciones se hacen para establecer el diagnstico de ciertos padecimientos hemorrgicos. 9.9.2 Materiales Tubos de ensayo de vidrio, 75 mm x 10 mm, marcados para alojar a 1 ml Temporizador Gradilla metlica Bao mara Los materiales para la realizacin de la puncin venosa (ver seccin 9.2.2). 9.9.3 Mtodo Coleccin de muestras Se recoge una muestra de sangre venosa de pacientes como se describe en la seccin 9.2. No agregue anticoagulante para los tubos en los que usted recoge la sangre. 1. Coloque en el bao mara los tubos que contienen la sangre a 23 C (o djelos a la temperatura ambiente). Examine el cogulo: - a la hora - a las 2 horas - a las 3 horas - a las 4 horas. Normalmente el cogulo sigue siendo slido durante las primeras 4 horas, si bien comienza a retraerse por lo general desde la primera hora. 2. Examine el cogulo cuando hayan transcurrido 4 horas. Despus de 4 horas, el cogulo se retrae completamente, y la masa de glbulos rojos se hallar separada del suero amarillo (Fig. 9.56). 9.9.4 Resultados (a) Retraccin normal El cogulo rojo se separa completamente y en su parte ms alta se adhiere a la superficie interior del tubo de ensayo (Fig. 9.58).
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En el fondo del tubo se suele formar un pequeo sedimento de glbulos rojos; su espesor no debe ser mayor de 5 mm. (b) Retraccin anormal Sangre deficiente en fibringeno 1. En el fondo del tubo se forma un pequeo cogulo rojo que solo algunas veces se adhiere a la superficie interior. Se rodea de glbulos rojos y por arriba lo cubren el plasma y el suero (Fig. 9.59). - En este caso existe en la sangre una deficiencia de fibringeno. Sangre deficiente en trombocitos 2. Se forma un cogulo rojo que se adhiere casi completamente a la superficie interior del tubo y a veces se retrae un poco. El exudado de suero es sumamente reducido (Fig. 9.60). - Existe una deficiencia de plaquetas en la sangre. (Prepare una extensin sangunea venosa, teida con la tcnica de Romanowski y examnela como se ha indicado en la seccin 9.10). Protenas plasmticas anormales 3. Puede que se produzca un cogulo amarillo, es plasma coagulado. Inmediatamente debajo se observa un cogulo rojo ligeramente retrado (Fig. 9.61). - La coagulacin del plasma obedece a la presencia de protenas plasmticas anormales. Hemofilia 4. Puede ocurrir que no se forme cogulo alguno, o bien se produzca muy lentamente un cogulo amarillo sobre el sedimento de glbulos rojos (Fig. 9.62). - Si es as, existe una grave deficiencia del factor de coagulacin, como se observa en la hemofilia. La hemofilia en una enfermedad hemorrgica hereditaria que solo afecta individuos de sexo masculino. Notifique la retraccin del cogulo de la manera siguiente: - normal, o -anormal, con una descripcin completa del cogulo. Tiempo en que sobreviene la lisis Examine el cogulo: - despus de 12 horas - despus de 24 horas - despus de 48 horas - despus de 72 horas Hasta que ocurra la lisis; es decir, hasta que el cogulo se disuelva completamente y los glbulos rojos se sedimenten en el fondo del tubo de ensayo. Tiempo normal de lisis del cogulo: 12 horas o ms. Disminucin del tiempo de lisis del cogulo: 1 - 48 horas. En algunas afecciones fibrinolticas agudas el cogulo se puede disolver en 1 - 4 horas. Comunique en horas el tiempo transcurrido hasta que sobrevino la lisis del cogulo.
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Figura 9.56 Despus de 4 horas, examinar el cogulo. Figura 9.57 Lisis. Figura 9.58 Retraccin normal del cogulo. Figura 9.59 Sangre deficiente en fibringeno. Figura 9.60 sangre deficiente en trombocitos. Figura 9.61 sangre que contiene protenas plasmticas anormales. Figura 9.62 Hemofilia.
AGREGADO:
TIEMPO DE COAGULACIN DE LA SANGRE ENTERA: (Mtodo de Lee y White) Principio Se recoge sangre venosa en un tubo de ensayo. Se toma nota del tiempo que tarda la sangre para coagularse. La utilidad de este ensayo es limitada, ya que solo sirve para detectar deficiencias graves del factor de coagulacin. Materiales Dos tubos de ensayo limpios, de 75 x 10 mm, del mismo calibre, marcados en el nivel de 1 mm Un cronmetro Un bao mara a 37C, o un matraz al vaco, con agua a la misma temperatura Utensilios y materiales para puncin venosa. Mtodo 1. Mediante una jeringa de material plstico extraiga poco ms de 2 ml de sangre venosa. Puncione la vena rpidamente, de la manera adecuada. Pngase a funcionar cronmetro tan pronto como la sangre comience a entrar en la jeringa. 2. Llene con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 ml. Tapone ambos tubos con algodn no absorbente. Coloque los tubos en el bao mara a 37C (o en el matraz al vaco, con la misma temperatura). 3. Despus de 3 minutos saque el primer tubo del bao mara. Incline el tubo hasta un plano de 45 para observar si la sangre se ha coagulado. 4. Si la sangre no se ha coagulado coloque el tubo otra vez en el bao mara y examnelo cada 30 segundos hasta que sobrevenga la coagulacin. 5. Examine el segundo tubo inmediatamente despus que se haya coagulado la sangre del primero. Por lo general, la sangre del segundo tubo se coagula muy rpidamente despus que lo ha hecho la sangre del primero. Detenga el cronmetro o tome nota del tiempo transcurrido. Se notifica como tiempo de coagulacin de la sangre el correspondiente al segundo tubo. Resultados Registre el tiempo de coagulacin en minutos, redondendolo al medio minuto ms cercano. Mrgenes normales 5 12 minutos. Si el tiempo de coagulacin se prolonga, enve al paciente a un centro especializado a fin de que se ample la investigacin.
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6 5 1) Materiales. 2) Mediante una jeringa de material plstico extraiga poco ms de 2 ml de sangre venosa. Puncione la vena rpidamente, de la manera adecuada. Pngase a funcionar cronmetro tan pronto como la sangre comience a entrar en la jeringa. 3) Llene con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 ml. Tapone ambos tubos con algodn no absorbente. Coloque los tubos en el bao mara a 37C (o en el matraz al vaco, con la misma temperatura). 4) Despus de 3 minutos saque el primer tubo del bao mara. 5) Incline el tubo hasta un plano de 45 para observar si la sangre se ha coagulado. Si la sangre no se ha coagulado coloque el tubo otra vez en el bao mara y examnelo cada 30 segundos hasta que sobrevenga la coagulacin. 6) Examine el segundo tubo inmediatamente despus que se haya coagulado la sangre del primero. Por lo general, la sangre del segundo tubo se coagula muy rpidamente despus que lo ha hecho la sangre del primero. Detenga el cronmetro o tome nota del tiempo transcurrido. Se notifica como tiempo de coagulacin de la sangre el correspondiente al segundo tubo. 9.10 PREPARACIN Y TINCIN DE EXTENSIONES SANGUNEAS FINAS 9.10.1 Principio a) Preparacin de extensiones de sangre Principio La extensin se prepara repartiendo uniformemente una gota pequea de sangre sobre un portaobjetos de manera que solo se deposite una capa de clulas. Despus de teirlas, las extensiones de sangre se usan: Para determinar las fracciones de nmero de los tipos de leucocitos (ver seccin 9.13) Para detectar glbulos rojos anormales (ver seccin 9.10.4) Para identificar ciertos parsitos (ver seccin 4.7) La estimacin del nmero de trombocitos (vase la seccin 9.14). b) Tincin de extensiones de sangre Principio Las extensiones de sangre se colorean con las tinciones de Romanowski, que contienen azul de metileno, azur B esencial y eosina. Entre las tinciones de Romanowski ms ampliamente usadas figuran: La de Leishman y la de Wright, que proporcionan resultados similares y se emplean como tinciones individuales La de May-Grnwald y la de Jenner, cuyos resultados son semejantes y se emplean con la tincin de Giemsa La de Giemsa, que se puede usar como tincin individual o junto con la de May-Grnwald o la de Jenner Las de Field, A y B, que se preparan con agua a diferencia de las otras tinciones mencionadas, que se elaboran con metanol. Las tinciones de Field se usan por igual en extensiones de sangre y de gota gruesa. El colorante de Romanowski con metanol se puede utilizar para fijar las extensiones antes de diluirlo en los portaobjetos para la tincin. Los mejores resultados se obtienen haciendo primero la fijacin con metanol y coloreando a continuacin con colorantes diluidos, preparados anticipadamente como se indica ms abajo. 9.10.2 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos (Los portaobjetos que se habrn de usar para extensiones sanguneas se lavarn minuciosamente y, si es necesario, se limpiarn con una pieza de tela suave embebida en una mezcla de etanol y ter (Fig. 9.63)). Lmpara de alcohol o mechero Bunsen Extensor de vidrio (vase ms adelante) Lanceta estril para sangre Dos varillas de vidrio, ya sea en un fregadero o en una cubeta de tincin Probetas, 50 ml o 100 ml Vasos de precipitados y frascos que contengan agua limpia del grifo Pisetas con agua tamponada (reactivo. N 15) Un temporizador para marcar los intervalos (ya sea mecnico o digital electrnico a bateras) Soporte para portaobjetos deslizante para secar las extensiones teidas Tincin de Field (reactivo no. 25) Giemsa (reactivo. N 29) Tincin de Leishman (reactivo. Hay 34) Tincin de May-Grnwald (reactivo. N 38) sal dipotsica de EDTA, solucin al 10% (reactivo no. 22) Metanol Etanol al 70% o ter. Cmo hacer un instrumento para extender el frotis (Extensor) (Fig. 9.64)
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1. Seleccione un portaobjetos cuyos bordes estn completamente lisos. 2. Con una sierra pequea marque diagonalmente hasta cierta profundidad dos esquinas de uno de los extremos del portaobjetos. 3. Corte estas dos esquinas.
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D Figura 9.63 Limpiando los portaobjetos para ser usados en extensiones finas de sangre. Figura 9.64 Haciendo un extensor de vidrio. A) Obtenga La sangre: del dedo cordial o el anular; en una cara lateral de estos dedos. Figura 9.65 Recolectando una gota de sangre en un portaobjetos. Figura 9.66 Coloque el extensor frente a la gota de sangre. Figura 9.67 Mueva el extensor hacia atrs hasta que toque la gota de sangre. Figura 9.68 Permitir que la sangre corra a lo largo del borde del extensor. Figura 9.69 Empuje el extensor hasta un poco antes del final del portaobjetos con un movimiento deslizante suave (debe quedar un extendido no muy largo ni muy grueso, hay que regular el ngulo que debe ser de 45) (vea la direccin de la flecha). Figura 9.70 Extendidos de sangre: Preparado correctamente (a) y uno incorrectamente preparado (b). C) Es esencial que la extensin se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas hmedos. Agitarla al aire. Figura 9.71 El secado del extendido de sangre sobre una lmpara de alcohol. D) Marque la extensin ya seca con el nombre o el nmero del paciente. Escriba sta con un lpiz de grafito en la porcin gruesa de la extensin sangunea que no se utilizar para el examen. 9.10.3 Mtodo Obtencin de las muestras de sangre Obtenga la sangre (Fig. 9.29): del dedo cordial o el anular en una cara lateral de estos dedos. Deje que la sangre salga libremente. Recoja primero las muestras en que se determinarn las concentraciones de nmero de las clulas sanguneas (si se han solicitado) (ver secciones 9.5 y 9.6). Importante. No se extraiga sangre de: el dedo ndice o el pulgar un dedo infectado (paroniquia, etc.) la oreja (contiene demasiados monocitos). Uso de anticoagulantes Utilice solamente solucin salina bipotsica de EDTA seca; otros anticoagulantes alteran la conformacin de los leucocitos. No se debe dejar la sangre con el anticoagulante en reposo antes de preparar el frotis. Preparacin de la extensin 1. Recoja una gota de sangre aproximadamente de este tamao: tocndola ligeramente con una cara del portaobjetos, cerca del extremo de este (Fig. 9.65). 2. Sostenga el portaobjetos con una mano. Con la otra mano coloque el borde del portaobjetos que se ha recortado exactamente frente a la gota de sangre (Fig. 9.66). 3. Desplace el portaobjetos recortado hacia atrs, hasta que toque la gota de sangre (Fig. 9.67). 4. Deje que la gota de sangre se extienda por el borde del portaobjetos recortado (Fig. 9.68). 5. A continuacin, deslice el portaobjetos recortado hacia el extremo opuesto del portaobjetos que contiene la gota de sangre con un movimiento suave (se deber agotar toda la gota de sangre antes de llegar al extremo del portaobjetos) (Fig. 9.69). Extienda con mayor rapidez la sangre de los pacientes anmicos. 6. Confirme que la extensin est bien hecha (vase Fig. 9.70 (a)): no deber haber lneas a lo ancho ni a lo largo del frotis el extremo de la extensin deber terminar suave y gradualmente, sin desgarros ni vetas como los que se observan en la Fig. 9.70 (b). la extensin no deber ser demasiado larga tampoco deber ser demasiado gruesa no deber tener espacios vacos (debido a que se ha usado un portaobjetos con grasa). La preparacin de una extensin distribuida adecuadamente es sumamente importante. Una extensin preparada mal producir errores en la determinacin de las fracciones de nmero de los tipos de leucocitos y har imposible que se reconozca la morfologa de los glbulos rojos. Secado de la extensin Es esencial que la extensin se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas hmedos. Durante la estacin de lluvias (en los trpicos): Seque la extensin con rpidos movimientos de vaivn a unos 5 cm de distancia, a un lado y ligeramente arriba (pero nunca encima) de la llama de una lmpara de alcohol (Fig. 9.71). Si es necesario, proteja la preparacin de las moscas. Marque la extensin ya seca con el nombre o el nmero del paciente. Escriba sta con un lpiz de grafito en la porcin gruesa de la extensin sangunea que no se utilizar para el examen. Fijacin Si la extensin se ha preparado para determinar fracciones de nmero de los tipos de leucocitos se deber fijar con metanol, o directamente por medio de la tincin de May-Grnwald (vase ms abajo).
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Para la deteccin de parsitos (empleando las tinciones de Giemsa o Field, la extensin se fijar con metanol (ver ms abajo). Fijacin del extendido Si el extendido est destinado a la determinacin de fracciones de nmero de tipo de leucocitos, este debe fijarse con metanol antes de la tincin con colorante May-Grnwald (ver ms abajo). Si el extendido se destina a la deteccin de parsitos, este debe fijarse con metanol antes de la tincin con Giemsa o tincin de Field (ver ms abajo). Entonces, en estos casos fije las extensiones con metanol. Conservacin para hacer el trabajo en otro momento: Envulvanse por separado una vez que estn secas, con hojas de papel blanco. Esto evita a las moscas que se posaran en el extendido seco de sangre. Tincin del extendido Tincin de Leishman Materiales Dos varillas de vidrio colocadas a travs del fregadero o sobre una cubeta para tincin Una probeta de 50 ml 100 ml Un frasco de lavado (piseta) con agua amortiguada Un temporizador para marcar los intervalos Un soporte deslizante para secar los portaobjetos Tincin de Leishman (reactivo No. 34) Metanol. Mtodo 1. Fije la extensin de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. 2. Prepare una dilucin del colorante de Leishman al 1 en 3 (1/3), mezclando una parte de los colorantes con 2 partes de agua amortiguada. Mzclese. Ejemplo: Utilice 10 ml de los colorantes y 20 ml de agua amortiguada. Prepare solo la cantidad suficiente para un da, ya que el colorante diluido no se conserva bien. 3. Cubra el portaobjetos con el colorante diluido durante 7 -10 minutos Importante: Es posible que se necesite cambiar el tiempo de tincin, especialmente si se ha recibido en el laboratorio un nuevo lote de colorantes o bien si han estado guardados durante algn tiempo. 4. Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No escurra el colorante porque dejara un depsito sobre la extensin. 5. Vierta agua limpia sobre el portaobjetos y djela durante 2 - 3 minutos para la diferenciacin de la extensin. El tiempo necesario para la diferenciacin depender de la tincin y del pH del agua que se use. El pH es de importancia definitiva para diferenciar los diferentes tipos de leucocitos con la tincin de Leishman. Este pH deber ser de 6,8 y 7,2 y preferiblemente entre 7,0 y 7,2. 6. Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos hasta que se seque. Resultados En una extensin adecuadamente teida, las clulas parecen como se describe en la Tabla 9.10: Tabla 9.10 Aspecto de las clulas de la sangre en extensiones finas teidas con la coloracin de Leishman Tipo de clula Aspecto El citoplasma se tie de color rosceo y en su interior se observan grnulos pequeos de Neutrfilos color malva. El citoplasma se tie de color rosceo y en su interior se observan grnulos voluminosos Eosinfilos de color rojo. Basfilos Numerosos grnulos de color azul malva oscuro llenan la clula. Monocitos El citoplasma se tie de color azul grisceo. Linfocitos Grandes El citoplasma se tie de color azul claro. Pequeos El citoplasma se tie de color azul oscuro. Eritrocitos Se tien de color rojo plido. Plaquetas Se tien de color malva rosceo.
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B A
G A) Materiales para las tinciones. B) Fijacin. Fije la extensin de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. C) Dilucin del colorante. Prepare una dilucin (1/3) del colorante de Leishman, mezclando una parte de los colorantes con 2 partes de agua amortiguada. Mzclese. Use la dilucin en el da porque no se conserva bien. D) Cubra el portaobjetos con el colorante diluido durante 7 -1 0 minutos. E) Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada (usando una piseta). No escurra el colorante porque dejara un depsito sobre la extensin. F) Vierta agua limpia sobre el portaobjetos y djela durante 2 - 3 minutos para la diferenciacin de la extensin. G) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Tinciones de May Grnwald y de Giemsa Materiales Los mismos que se usan para la tincin de Leishman. Tincin de May-Grnwald (reactivo No. 38) Tincin de Giemsa (reactivo No. 29) Agua amortiguada. Mtodo 1. Fije la extensin con metanol durante 2 - 3 minutos. 2. Prepare los colorantes de la manera siguiente: Diluya el colorante de May-Grnwald al 1 en 2 (1/2); use volmenes iguales de los colorantes y agua amortiguada. Mzclese. Ejemplo: utilice 10 ml de los colorantes y 10 ml de agua amortiguada. Diluya el colorante de Giemsa al 1 en 10 (1/10) empleando un volumen de los colorantes y 9 volmenes de agua amortiguada. Mzclese con suavidad. Ejemplo: utilice 2 ml de los colorantes y 18 ml de agua amortiguada. Prepare solo las cantidades suficientes para un da, ya que los colorantes diluidos no se conservan bien. 3. Cubra el portaobjetos con el colorante diluido de May-Grnwald durante 5 minutos. 4. Escurra el colorante y sustityalo con colorante diluido de Giemsa durante 10 minutos. Importante: Es posible que se necesite cambiar los tiempos de tincin, especialmente si se ha recibido en el laboratorio un lote nuevo de colorantes o bien stos han permanecido guardados durante algn tiempo. 5. Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No se escurra el colorante porque dejara un depsito en la extensin.
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6. Deposite agua limpia sobre el portaobjetos y djela durante 2 - 3 minutos para que se afirmen las diferencias dentro de la extensin. El tiempo necesario para la diferenciacin depender de la tincin y del pH del agua que se use. El pH deber ser de 6,8 - 7,0. 7. Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos hasta que se seque. Resultados Similares a los que se obtienen con la tincin de Leishman (vase antes).
D C
H G A) Materiales para las tinciones. B) Fijacin. Fije la extensin de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. C) Dilucin del colorante. Prepare los colorantes de la manera siguiente: Diluya el colorante de May-Grnwald (1/2); use volmenes iguales de los colorantes y agua amortiguada. Mzclese. Diluya el colorante de Giemsa al (1/10) empleando un volumen de los colorantes y 9 volmenes de agua amortiguada. Mzclese con suavidad. D) Cubra el portaobjetos con el colorante diluido de May-Grnwald durante 5 minutos. E) Escurra el colorante y sustityalo con colorante diluido de Giemsa durante 10 minutos. F) Lave el colorante con una corriente de agua amortiguada. No se escurra el colorante porque dejara un depsito la extensin. G) Deposite agua limpia sobre el portaobjetos y djela durante 2 - 3 minutos para que se afirmen las diferencias dentro de la extensin. H) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Tincin rpida de extensiones con el mtodo de Field El mtodo de Field para teir extensiones es diferente del que se usa para teir gotas gruesas; el colorante B de Field se emplea antes del colorante A. Materiales Colorantes A y B de Field (reactivo No. 25). Frascos o vasos para anlisis con agua limpia (no se necesita agua amortiguada). Los colorantes A y B de Field se pueden usar sin diluir mientras proporcionen resultados satisfactorios. Se deben filtrar cada 2 - 3 das. Mtodo 1. Fije la extensin con metanol durante 2 - 3 minutos. 2. Sumerja el portaobjetos en el colorante B de Field y cuente hasta cinco (Fig. 9.72). Escurra la extensin y lvela en el primer recipiente con agua limpia (Fig. 9.73). 3. Escurra el portaobjetos y sumrjalo en el colorante
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A de Field y cuente hasta 10. Escrralo de nuevo y lvelo bien en el segundo recipiente con agua. 4. Examine el color de la extensin. Deber ser malva; ni demasiado azul ni demasiado rojizo. Si no es satisfactoria, sumrjala de nuevo durante algunos segundos en el colorante A o el colorante B de Field (cualquiera de los dos), segn se necesite. Si esta vez la extensin es satisfactoria, coloque el portaobjetos en un soporte deslizante para portaobjetos y djelo escurrir hasta que se seque. Resultados Similares a los que se obtienen con la tincin de Leishman (vase antes).
E A) Materiales de la tincin de Field. El mtodo de Field para teir extensiones es diferente del que se usa para teir gotas gruesas; el colorante B de Field se emplea antes del colorante A. Los colorantes A y B de Field se pueden usar sin diluir mientras proporcionen resultados satisfactorios. B) Fijacin. Fije la extensin de sangre con metanol durante 2 -3 minutos. Figura 9.72 Coloreando la extensin sangunea con el tinte de Field. Figura 9.73 Enjuague el portaobjetos en agua. C) Sumerja el portaobjetos en el colorante B de Field y cuente hasta cinco. Escurra la extensin y lvela en el primer recipiente con agua limpia. D) Escurra el portaobjetos y sumrjalo en el colorante A de Field y cuente hasta 10. Escrralo de nuevo y lvelo bien en el segundo recipiente con agua. E) Escurra el agua y coloque el portaobjetos en un soporte para portaobjetos deslizante hasta que se seque. Precauciones esenciales para obtener resultados provechosos Evite la formacin de depsitos de colorante. En las extensiones tienen el aspecto de acumulaciones de manchas negras y pequeas. Evite las tinciones defectuosas, que dan por resultado extensiones demasiado azules, demasiado rojizas o demasiado oscuras. 1. Utensilios de vidrio completamente limpios. Lvense todos los das. No utilice cidos. Elimine los depsitos de colorantes con metanol. 2. Agua neutra (amortiguada, si es posible a excepcin de la tincin de Field). La tcnica de preparacin se describe en la seccin 2.4.4. El agua cida hace que el frotis sea demasiado rojo; el
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agua alcalina hace que sea demasiado azul. El agua neutra que se use se deber haber preparado recientemente, ya que se acidifica al exponerse al aire. 3. Mezcla de Giemsa. Preprese con lentitud y cuidado. Los sacudimientos producen precipitaciones en los colorantes. Como remediar resultados insatisfactorios 1. Depsitos de colorantes Depsitos de la tincin de May-Grnwald o del agua neutra Son causados por la tincin de May-Grnwald o el agua neutra y se pueden observar a simple vista en el lquido que se encuentra sobre el portaobjetos. Escurra el colorante. Enjuague el portaobjetos dos veces con metanol. Djese secar y talo de nuevo con colorantes de May-Grnwald frescos o filtrados. 2. Depsitos de la tincin de Giemsa Se pueden observar a simple vista o con el microscopio. Enjuague el portaobjetos con metanol, como en el caso anterior, pero lave inmediatamente despus con agua neutra. Djelo secar y repita el procedimiento de tincin desde el principio. 3. Extensiones demasiado azules (tincin basoflica) Prepare una solucin de cido brico al 1% en etanol al 95%. Enjuague el portaobjetos dos veces en esta preparacin. Lvelo inmediatamente despus con agua neutra. Djese secar y examnelo con el microscopio sin otros tratamientos. Por lo general, la tincin basoflica se puede evitar empleando agua amortiguada con un pH ms cido y, si es necesario, alterando el tiempo para la diferenciacin. 9.10.4 El examen microscpico Con el objetivo x 40, examine las extensiones. Las clulas deben aparecer tal como se describe en la Tabla 9.10. Eritrocitos En ciertas enfermedades, especialmente la anemia, los eritrocitos pueden tener una forma, tamao o color anormales. Dnde se deben observar los eritrocitos: Para comprobar si hay eritrocitos anormales, los eritrocitos se deben observar poco antes del extremo donde termina la extensin de sangre; en esta porcin se hallan diseminados y se tocan unos a otros sin sobreponerse (Fig. 9.74). No mirar el extremo grueso, donde las clulas estn muy juntas, los eritrocitos se aglomeran (Fig. 9.75), o en el extremo delgado final, donde casi termina el extendido sanguneo, donde no hay suficientes clulas, es decir, los eritrocitos son demasiado escasos (Fig. 9.76). A continuacin se describen los distintos tipos de eritrocitos anormales.
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Figura 9.74 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: donde buscar. Los eritrocitos se deben observar poco antes del extremo donde termina la extensin de sangre; en esta porcin se hallan diseminados y se tocan unos a otros sin sobreponerse. Figura 9.75 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: En esta porcin la extensin es demasiado gruesa; los eritrocitos se aglomeran. Figura 9.76 El examen de frotis de sangre de eritrocitos anormales: no hay suficientes clulas. En esta porcin los hemates son demasiado escasos. Eritrocitos normales (Fig. 9.77) Tamao: 7 - 8 m Forma: redonda, discoidal, de vez en cuando un poco irregular. Tincin: La periferia se tie de color de rosa intenso; el centro lo hace de color rosa plido, o bien es casi incoloro. Clulas diana (Fig. 9.78) Tamao: 6-8 m Forma: redonda o ligeramente irregular Tincin: el centro y la orilla se tien intensamente, pero entre ambos se observa un anillo incoloro. Este tipo de eritrocitos se suele encontrar en la talasemia, la deficiencia de vitamina B6, la anemia drepanoctica y otras anemias causadas por la existencia de hemoglobinas anmalas (hemoglobinopatas), enfermedades del hgado, as como en la anemia ferropnica. Eritrocitos falciformes (Fig. 9.79) Forma: alargada y estrecha, frecuentemente con uno o ambos extremos curvos y puntiagudos. Se suelen hallar en la anemia falciforme o drepanoctica y la talasemia falciforme junto con eritrocitos nucleados, eritrocitos normales y muchas veces tambin macrocitos. El examen de los eritrocitos falciformes en preparaciones hmedas se describe en la seccin 9.11.4. Microcitos (Fig. 9.80) Tamao: pequeo (alrededor de 5 m). Visto a menudo en la anemia por deficiencia de hierro, anemia sideroblstica y talasemias. Deben distinguirse de los esferocitos (vase ms adelante). Macrocitos (Fig. 9.81) Son eritrocitos grandes que miden 9-10 m. Se observan en las anemias macrocticas causadas por deficiencias de cido flico o vitamina B-12, anemia por deficiencia de hierro y en ciertos padecimientos hepticos. Deben distinguirse de los reticulocitos (ver ms abajo). Los eritrocitos voluminosos que se tien de color malva azulado (policromasia) se denominan reticulocitos. Esquistocitos (Fig. 9.82) Tamao: normal o ligeramente ms pequeo que los eritrocitos normales. Clulas fragmentadas. Visto en anemias hemolticas, enfermedad de clulas falciformes y talasemias. Esferocitos (Fig. 9.83) Tamao: pequeo (6 m) Forma: completamente redonda Tincin: uniforme; todo el eritrocito se tie intensamente. Teido ms oscuro que los eritrocitos normales. Se suelen encontrar en las anemias hemolticas y esferocitosis hereditaria. Eliptocitos (Fig. 9.84) Tamao: normal (8 m) Forma: oval Tincin: ms oscura en la periferia (especialmente en los polos) Se observan muy raras veces. Se encuentran en la eliptocitosis hereditaria, anemia por deficiencia de hierro, anemia perniciosa, anemia de clulas falciformes, talasemias y mielofibrosis. Anisocitosis (Fig. 9.85) Este trmino se emplea para sealar una afeccin en que hay eritrocitos de tamaos diferentes en la misma sangre; por ejemplo, eritrocitos de 9 m mezclados con pequeos glbulos rojos de 6 m. Se observan en anemias de numerosos tipos. Poiquilocitos (Fig. 9.86) Los poiquilocitos son eritrocitos de formas diferentes que se encuentran en la misma sangre; por ejemplo, puede haber una mezcla de clulas redondas, ovales, triangulares, piriformes y dentadas. Se encuentran en numerosos tipos de anemias severas y mielofibrosis. Eritrocitos que contienen cuerpos de Howell-Jolly (Fig. 9.87) En el interior de estos eritrocitos se observan uno o ms grnulos voluminosos de color morado (restos del ncleo). No se deben confundir con las plaquetas que se suelen adherir a la superficie de los eritrocitos. Encontrados en anemias hemolticas y anemia megaloblstica, y despus de la esplenectoma. Eritrocitos que contienen cuerpos anulares Cabot (Fig. 9.88) Los eritrocitos contienen estructuras finas en forma de anillo o una figura en forma de ocho que se tien de rojo con la tincin de Wright. Estos cuerpos anulares tambin son llamados anillos de Cabot. Encontrados en anemias severas. No debe confundirse con parsitos de la malaria. Eritrocitos que contienen punteado basfilo (Fig. 9.89) En estos eritrocitos hay cierto nmero de grnulos pequeos (puntos) de color azul violceo. Tales grnulos no se deben confundir con depsitos de los colorantes. Encontrados en deficiencias de vitaminas, talasemias y la intoxicacin por plomo.
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Eritrocitos nucleados (Normoblastos) (Fig. 9.90) Tamao: 8-10 m Forma: redonda y, frecuentemente, irregular Ncleo: pequeo, redondo, de color morado oscuro, frecuentemente excntrico y provisto de cromatina densa Citoplasma: de color rosa o azul grisceo. Los normoblastos se observan en la eritropoyesis acelerada en anemias severas, como la anemia drepanoctica, en ciertas infecciones bacterianas graves y en las leucemias y cnceres. Reticulocitos (Fig. 9.91) Estos son precursores directos de los eritrocitos. Contienen grnulos (restos nucleares) que tien de azul oscuro con coloraciones vitales como el azul brillante de cresilo y el azul de Evan. Los reticulocitos normalmente desaparecen dentro de las 4 horas despus de la liberacin de los eritrocitos en la sangre. La cantidad de reticulocitos que se encuentre en la sangre indicar el grado de actividad de la mdula sea, y cuando sta es muy activa (como ocurre en las anemias) su nmero aumenta. Su aparicin y deteccin en un extendido de sangre perifrica teido convenientemente con algunas de las tinciones mencionadas antes (por Ej., la de May Grnwald Giemsa) se denomina Policromatofilia o Policromasia.
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B A
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F E A) y B) Hemates normales. C) y D) Clulas en diana (dianocitos) (vase flechas). E) y F) Clulas falciformes (hemates) (observe dentro de los crculos).
H G J
L K G) Se observa un microcito y un esferocito. H) Microcitosis. I) Macrocitosis (macrocitos). J) Esquistocitos. K) Esferocitos (dentro de los crculos). L) Eliptocitos.
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M N
R M) Anisocitosis. N) Poiquilocitosis (poiquilocitos). O) y P) Cuerpos de Howell Jolly en los hemates (vase dentro de los rectngulos). Q) Anillo de Cabot en un hemate (flecha). R) Alteraciones en los hemates (vase figura).
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V U S) Punteado basfilo en un eritrocito maduro. Al lado se observa un Eritroblasto policromtico. T) Normoblasto (Eritroblasto ortocromtico) (dentro del rectngulo). U) y V) Reticulocitos (ver dentro de los rectngulos). Fuentes: www.telmeds.org (Panam). http://www.iqb.es/ (Espaa) Leucocitos En contraste a los eritrocitos, los leucocitos contienen un ncleo que puede variar en tamao y forma. Como ya se ha mencionado, hay cinco tipos principales de leucocitos: -neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos. La proporcin de cada tipo de leucocitos, conocida como la fraccin del nmero del tipo de leucocitos, es de importancia diagnstica. Clulas polimorfonucleares (neutrfilos, eosinfilos y basfilos) Las clulas polimorfonucleares tienen: -Un ncleo con varios lbulos; -Grnulos en el citoplasma (de ah su nombre comn, granulocitos). Neutrfilos polimorfonucleares (Fig. 9.92) Tamao: 12-15 m Forma: redonda, bien definida Citoplasma: abundante, rosceo Grnulos: de color malva, muy pequeos, numerosos pero separados. Los grnulos aparecen de un color marrn-violeta despus de la tincin. Ncleo: varios lbulos (2 - 5), unidos por bandas de cromatina. La cromatina tiene el aspecto de una masa uniforme de color morado oscuro. (A medida que el leucocito envejece aumenta el nmero de lbulos del ncleo.) Eosinfilos polimorfonucleares (Fig. 9.93) Tamao: 12- 15 m Citoplasma: muy poco visible, que contiene numerosos grnulos de color rojo anaranjado. Grnulos: voluminosos, redondos, de color rojo anaranjado, abundantes y agrupados estrechamente Ncleo: generalmente consta de dos lbulos. Algunas veces se observa que estos leucocitos se han daado y los grnulos se encuentran diseminados en el exterior. Basfilos polimorfonucleares (Fig. 9.94) Este es el tipo ms raro de los granulocitos. Tamao: 11-13 m. Forma: redonda. Grnulos: muy voluminosos, redondos, de color morado oscuro, abundantes pero menos estrechamente agrupados que los grnulos de los eosinfilos Ncleo: difcil de observar, pues se halla cubierto por los grnulos en el citoplasma Vacuolas: se encuentran escasas vacuolas incoloras y pequeas. Citoplasma: muy poco visible, por la gran cantidad de grnulos. Linfocitos y monocitos Los linfocitos y monocitos tienen un ncleo compacto y pueden o no pueden tener grnulos en el citoplasma. Linfocitos pequeos (Fig. 9.95) Tamao: 7 - 10 m Forma: redonda Ncleo: voluminoso; ocupa la mayor parte de la clula; la cromatina es de color morado oscuro, y densa Citoplasma: la cantidad visible es reducida, de color azul y sin grnulos. Linfocitos grandes (Fig. 9.96) Tamao: 10-15 m Forma: redonda o irregular Ncleo: oval o redondo; puede ocupar un lado de la clula Citoplasma: abundante, de color azul plido Grnulos: escasos, voluminosos y azurfilos (de color rojo oscuro). Monocitos (Fig. 9.97) Tamao: 15 - 25 m; son los leucocitos ms voluminosos Forma: irregular Ncleo: variable, frecuentemente con forma de rin; la cromatina se dispone en cordones irregulares de color malva plido
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Grnulos: sumamente pequeos; semejan partculas de polvo; generalmente rojizos Vacuolas: casi siempre hay vacuolas en el citoplasma. En los pacientes que sufren de paludismo el citoplasma suele contener depsitos de color negro castao, formados por el pigmento paldico. Clulas raras o anormales Clulas plasmticas (Fig. 9.98) Las clulas plasmticas o plasmocitos producen anticuerpos. Se pueden observar en las extensiones sanguneas de casos de sarampin, tuberculosis, otras virosis e infecciones bacterianas y mieloma mltiple. Tamao: 12-15 m Forma: redonda u oval Ncleo: redondo, excntrico, con la cromatina aglutinada y frecuentemente dispuesta de tal manera que recuerda una rueda Citoplasma: de color azul oscuro, con un rea que se tie dbilmente alrededor del ncleo Vacuolas: numerosas y muy pequeas; visibles con dificultad. Granulocitos inmaduros Durante algunas enfermedades (infecciones bacterianas graves) los granulocitos polimorfonucleares inmaduros emigran de la mdula sea al torrente sanguneo. Se pueden distinguir por los caracteres siguientes: Tamao: 12-18 m Ncleo: un solo ncleo sin lbulos, con cromatina de color que vara entre el rojo oscuro y el morado Citoplasma: de color azul plido o rosceo con grnulos Grnulos: abundantes, voluminosos, de color malva o rojo oscuro. A veces se puede observar una granulacin txica con grnulos muy voluminosos que se tien de color oscuro. Si se ven polimorfonucleares neutrfilos inmaduros ("forma de banda" o "clulas en cayado") (Fig. 9.99), informar su fraccin del nmero como para otros tipos de leucocitos. Tambin es posible que se detecten leucocitos inmaduros de este tipo, sin grnulos, pero con nuclolos (Linfoblastos) (ver Fig. 9.102). Neutrfilos polimorfonucleares hipersegmentados (Fig. 9.100) Son neutrfilos polimorfonucleares "viejos", de aspecto normal, exceptuando que los ncleos poseen 5-10 lbulos y con frecuencia son ms voluminosos. Estos neutrfilos se suelen observar en pacientes que sufren de anemia macroctica causada por deficiencias de cido flico o vitamina B-12. Linfocitos atpicos (Fig. 9.101) Los linfocitos atpicos se pueden encontrar en infecciones vricas, especialmente la mononucleosis infecciosa (fiebre glandular), la tos ferina y el sarampin. Tambin se encuentran en la tuberculosis, en el paludismo grave y en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Tambin es posible que se detecten en casos de tuberculosis y paludismo grave. Tamao: muy variable, de 12 18 m Forma: generalmente irregular Ncleo: redondo o irregular; con frecuencia ocupa un lado de la clula, con nuclolos visibles Citoplasma: casi siempre es de color ms oscuro que el de los linfocitos grandes; se oscurece a medida que se acerca a la pared de la clula. No contiene grnulos. Linfoblastos (Fig. 9.102) Constituye el tipo ms joven (ms inmaduro) de todos los leucocitos. Los linfoblastos se pueden ver en las extensiones de sangre de pacientes con leucemia. Tamao: Grande, 15-25 m. Ncleo: grande, redondo, malva plido, conteniendo de 1 a 5 nuclolos. Citoplasma: azul oscuro, con un rea clara que no se tie, situada alrededor del ncleo. No contiene grnulos. Megacariocitos (Fig. 9.103) Son los precursores de las plaquetas en la mdula sea (vase la seccin 9.1.3). Tamao: muy voluminosos, de 60 100 m Ncleo: sumamente irregular, denso y con abundantes lbulos Citoplasma: lleno de grnulos pequeos, principalmente azurfilos, y de plaquetas. La pared celular no est claramente definida. (Muy raras veces se encuentran en la sangre.)
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A) PMN Neutrfilos segmentados. B) Collage que muestra varias clulas, entre ellas al PMN eosinfilo, al PMN basfilo, al linfocito pequeo. C) Linfocito grande. D) Monocito. E) Plasmocito. F) Neutrfilos en banda (cayado). G) PMN Neutrfilo hipersegmentado. H) Linfocitos atpicos. I) Linfoblastos. J) Megacariocito. PMN: Polimorfonuclear. Fuente: www.telmeds.org , www.anamerino.com 9.11 PRUEBA
DE LA ANEMIA DE CLULAS FALCIFORMES
Estudio de los eritrocitos falciformes La hemoglobina S es una hemoglobina anormal de tipo hereditario (una hemoglobina funcionalmente defectuosa). Si se hereda de ambos progenitores produce anemia falciforme (drepanoctica), una enfermedad grave. Cuando solo se hereda de un progenitor determina una propensin gentica a la formacin de clulas falciformes (rasgo de clulas falciformes: portador del rasgo de la clula falciforme), aunque generalmente no causa la enfermedad. En el frotis para la prueba de los eritrocitos falciformes no se distingue entre la anemia falciforme propiamente dicha y la propensin gentica a ella (rasgo de clulas falciformes). La hemoglobina S se suele encontrar en las regiones tropicales de frica, aunque tambin se observa en el Oriente Medio y entre los americanos de origen africano. 9.11.1 Principio En un portaobjetos se mezcla una gota de sangre con una gota de un reactivo elaborado a base de metabisulfito sdico. Si los eritrocitos contienen una hemoglobina anormal denominada hemoglobina S, adoptan formas de hoz o media luna (ver Fig. 9.79). El reactivo mencionado desplaza el oxgeno de los eritrocitos, con lo que sobreviene el cambio de forma de stos.
9.11.2 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Filtro de papel Pipeta Pasteur (o pipeta gotera) Dos palillos de madera pequeos Contenedores para prevenir el secado de la preparacin, tales como placas de Petri Metabisulfito de Sodio fresco, solucin al 2% (reactivo no. 55). 9.11.3 Mtodo 1. En el centro del portaobjetos deposite una gota pequea de sangre capilar (aproximadamente 0,02 ml, alrededor de 4 mm de dimetro) (vase la Fig. 9.65). 2. Aada una gota igual de la solucin de metabisulfito sdico. 3. Con una esquina del cubreobjetos mezcle cuidadosamente ambas gotas (Fig. 9.104). Coloque el cubreobjetos sobre la mezcla, verifique que no se forman burbujas. 4, Coloque el portaobjetos sobre dos palillos, en una caja de Petri que tenga en el fondo un filtro de papel humedecido (Fig. 9.105).
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Nota: Cuando se usa un reactivo reductor como el metabisulfito sdico no se necesita cerrar hermticamente el recipiente en que se coloca la preparacin. 5. Deje transcurrir 30 minutos.
A) Materiales y reactivos. Figura 9.65 En el centro del portaobjetos deposite una gota pequea de sangre capilar. B) Aada una gota igual (del mismo tamao) de la solucin de metabisulfito sdico. Figura 9.104 Mezcla de la sangre y la solucin de metabisulfito de sodio. Figura 9.105 Incubando el portaobjetos en una placa de Petri. 9.11.4 Examen microscpico Examine la preparacin con el microscopio (usando el objetivo x 40). RESULTADOS Resultado negativo Los eritrocitos conservan su forma redonda. (Fig. 9.106). Si el resultado es negativo, examine de nuevo la preparacin 30 minutos despus, y dos veces ms despus de dos horas y 24 horas. Resultado positivo Los eritrocitos toman forma de: a) hoz o banana (Fig. 9.107 (a)), y b) frecuentemente tienen espolones (Fig. 9.107 (b)). Es importante que se examinen varias porciones de la preparacin, ya que los cambios de forma pueden ocurrir ms rpidamente en una parte que en otra. Es preciso tener cuidado de no confundir las clulas falciformes con los eritrocitos que se encuentran de canto ni los eritrocitos crenados.
Figura 9.106 Prueba para la anemia de clulas falciformes: Resultado negativo (hemates intactos y redondos, bicncavos). Figura 9.107 Prueba para la anemia de clulas falciformes: a) Resultado positivo: Eritrocitos falciformes; b: eritrocitos falciformes con espolones. No confundir con hemates crenados. Nota: Los resultados falsos negativos pueden ocurrir si:
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- Se utilizan reactivos obsoletos; -Las concentraciones de hemoglobina S son bajas; - Los pacientes tienen anemia moderada o grave. Importante: Si el resultado del frotis es positivo se deber examinar una extensin de sangre. En los pacientes que sufren de anemia falciforme se suelen encontrar al mismo tiempo clulas con forma irreversible de hoz, eritrocitos nucleados, clulas diana, abundantes poiquilocitos y, con frecuencia, tambin numerosos macrocitos. Por lo general, los pacientes que tienen el rasgo gentico falciforme no son anmicos y la morfologa de sus glbulos rojos es normal. Siempre que sea posible se deber efectuar un estudio de la hemoglobina por electroforesis para confirmar el diagnstico de anemia falciforme. Tal estudio se har en un laboratorio de referencia. Otros mtodos 1. Esta misma prueba se puede realizar con sangre venosa, a condicin que se haya obtenido muy recientemente (1-2 horas) en un recipiente que contenga un anticoagulante (sal bipotsica de EDTA, solucin al 10% (reactivo no. 22)). 2. Mtodo del tubo: La prueba tambin puede llevarse a cabo utilizando un tubo de ensayo en lugar de una placa de Petri. En el comercio existen los reactivos necesarios para poner en prctica este mtodo. 9.12 DETERMINACIN DE
LA CONCENTRACIN
/ FRACCIN DEL
NMERO DE RETICULOCITOS
Los reticulocitos son glbulos rojos inmaduros que emigran de la medula sea al torrente sanguneo. La cantidad de reticulocitos que se encuentre en la sangre indicar el grado de actividad de la mdula sea con respecto a la produccin de eritrocitos, y cuando sta es muy activa (como ocurre en las anemias) su nmero aumenta. Los reticulocitos contienen grnulos violetas oscuros y finos dispuestos en una red (retculo). No contienen ncleo. 9.12.1 Principio Los reticulocitos contienen grnulos pequeos que se pueden teir con azul de cresil brillante. Este colorante se aplica a una extensin de sangre y a continuacin se observa con el microscopio cierto nmero de eritrocitos. Con este examen se calculan: a) el nmero de reticulocitos por litro de sangre, o b) la proporcin de glbulos rojos que integran los reticulocitos. 9.12.2 Materiales y reactivos Microscopio Portaobjetos (sin grasa) Extensor de vidrio Tubos de ensayo Gradilla Embudo Filtro de papel Dos pipetas Pasteur con perillas de goma Contador manual (cuenta ganado), si est disponible Solucin saturada de azul de cresilo brillante (no reactivo. 13). 9.12.3 Mtodo 1. Filtre al interior de un tubo de ensayo una cantidad pequea de la solucin de azul de cresil. En el fondo de otro tubo deposite: 2 gotas de la solucin filtrada de azul de cresil (Fig. 9.108). 2. Con una pipeta de Pasteur aspire algunas gotas de sangre de un dedo (Fig. 9.109), o utilice sangre venosa que se haya recogido en un recipiente con sal bipotsica de EDTA, mezclndola completamente. 3. En el tubo que contiene las 2 gotas de la solucin de azul de cresil deposite: 2 gotas de sangre. 4. Haga la mezcla sacudiendo suavemente el tubo. Tape ste con algodn no absorbente. Djelo reposar 15 minutos. 5. Tome el tubo y agtelo de nuevo con suavidad. Aspire una gota de la mezcla. Deposite esta gota en un portaobjetos, lista para hacer la extensin. 6. Haga una extensin sangunea con el portaobjetos recortado (extensor) (ver seccin 9.10.3). 7. Squela al aire. 9.12.4 Examen microscpico Examine el frotis con el objetivo de inmersin en aceite (x 100) (Fig. 9.110). Observe la porcin cercana al extremo donde termina la extensin, en que los eritrocitos suelen estar muy bien separados. Los eritrocitos se tien de color azul plido. Los reticulocitos son glbulos rojos en cuyo interior se observan pequeos grnulos que se tien de color violeta oscuro, y forman una red (retculo). Los retculos pueden contener: 1) grnulos, o 2) filamentos. Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo x 100 de inmersin en aceite. Cuente cuidadosamente: a) la cantidad total de hemates examinados, y b) el nmero total de reticulocitos que halla entre ellos.
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(Estos recuentos se efectan ms fcilmente si se reduce el tamao del campo microscpico. Tal cosa se logra colocando en el ocular una pieza de papel negro y rgido en la que se haya abierto un orificio de unos 5 mm de dimetro.) Algunos hematlogos prefieren que la cantidad de reticulocitos se comunique en trminos de la concentracin de nmero (nmero de reticulocitos por litro de sangre), en tanto que otros suelen solicitar que se les notifiquen en trminos de la fraccin de nmero (la proporcin de reticulocitos que hay en el total de eritrocitos).
Figura 9.108 Preparacin de la solucin de azul de cresilo brillante. Figura 9.109 Toma de una muestra de sangre capilar.
Figura 9.110 Examinar el frotis al microscopio. a: reticulocitos tpicos, contienen grnulos violceos oscuros y finos; b: reticulocitos que contienen filamentos; c: reticulocitos maduros (que contienen slo unos pocos grnulos)
Clculo Segn la costumbre adoptada en el laboratorio o la solicitud especfica del mdico haga los clculos como se indica a continuacin1: a) Concentracin de nmero: para poder calcularla se necesita conocer primero la concentracin del nmero total de eritrocitos. Si esta es C (omitiendo la multiplicacin "x 1012/l" y n es el nmero total de reticulocitos que se ha encontrado al estudiar 500 eritrocitos, la concentracin de nmero de reticulocitos ser C x 2n x 109/l. Ejemplo: Concentracin de nmero de eritrocitos = 4,5 x 1012/l Nmero de reticulocitos observados al contar 500 eritrocitos = 6 Concentracin de nmero de reticulocitos = 4,5 x (2 x 6) x 109/l= 4,5 x 12 = 54 x 109/l (comunique este resultado). b) Fraccin de nmero: para calcularla no es necesario conocer anticipadamente la concentracin de nmero de eritrocitos. Si n es el nmero de reticulocitos observados al examinar 500 eritrocitos, la fraccin de nmero de reticulocitos = (2 x n) x 10-3. Ejemplo: Nmero de reticulocitos visto en el conteo de 500 eritrocitos = 6 Fraccin de cantidad de reticulocitos = (2 x 6) x 10-3 = 12 x 10-3 Nota: Si se examinan ms de 500 eritrocitos en la extensin de sangre, el clculo se deber ajustar proporcionalmente. 1Tradicionalmente, los reticulocitos se han informado en forma de porcentajes (es decir, la proporcin, expresada como un porcentaje, de los eritrocitos que son reticulocitos). Si se observan 500 eritrocitos en la extensin de sangre y n de ellos son los reticulocitos, el porcentaje de eritrocitos se calcula multiplicando n por 0,2. Ejemplo: De 500 eritrocitos examinados, 25 son reticulocitos. El porcentaje de reticulocitos es entonces 25 x0.2 = 5%. El rango normal para los recin nacidos es de 2,0 a 6,0%, y para los adultos y los nios es 0,2-2,0%. Rango de referencia La Tabla 9.11 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.11 Concentraciones del nmero de reticulocitos y fracciones del nmero de reticulocitos, por grupo de edad Grupo de edad Concentracin del nmero de Fraccin del nmero de
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reticulocitosa reticulocitos Bebs (recin nacido) 100-300 x 109/l 20-60 x 109/l Nios 8-110 x 109/l 2-20 x 109/l 9 Adultos 8-110 x 10 /l 2-20 x 109/l a Valores aproximados. La concentracin depende de la concentracin del nmero de eritrocitos (vase la Tabla 9.7). Otras estructuras que se observan en el frotis de sangre Es posible que tambin se observen las estructuras siguientes en la extensin de sangre teida con azul de cresil brillante que se utiliza en la determinacin de los reticulocitos: Cuerpos de hemoglobina H. Cuando los hay son pequeas manchas de color azul plido, de tamao variable. A diferencia del retculo de los reticulocitos, se observan en la mayor parte de los glbulos rojos de la extensin sangunea. Se suelen encontrar en la talasemia y la hemoglobinopata H. Cuerpos de Heinz. Si los hay en la extensin se distinguen como unos grnulos azules de tamao variable que se agrupan en un lado de la clula, cerca de la membrana. Se suelen encontrar en la deficiencia de la glucosa-6-fosfato dehidrogenasa consecutiva al empleo de ciertos medicamentos.
4 3 1) y 2) Cuerpos de hemoglobina H. 3) y 4) Cuerpos de Heinz. 9.13 DETERMINACIN DE

LA FRACCIN NMERO DE TIPO DE LEUCOCITOS
No todos los leucocitos (glbulos blancos) que circulan en la sangre son idnticos. Hay cinco tipos principales, que se diferencian por el tamao, la forma del ncleo, el color de los grnulos del citoplasma y otros caracteres. La proporcin de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnstico. Esta proporcin se denomina fraccin de nmero del tipo de leucocitos. 9.13.1 Principio Se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que se ha encontrado de cada tipo de ellos. La proporcin de cada tipo de leucocitos se expresa como una fraccin decimal.* Ejemplo: Neutrfilos 0,56 Linfocitos 0,25 Eosinfilos 0,12 Monocitos 0,06 Basfilos 0,01 La suma de todas las fracciones deber ser igual a 1. Si se conoce el nmero total de leucocitos, expresar el resultado en trminos de la concentracin del nmero (es decir, nmero de clulas por litro) en lugar de una fraccin decimal. *En el sistema tradicional las fracciones de nmero de los tipos de leucocitos se denominan "recuento diferencial de leucocitos" y la proporcin de cada tipo se notifica como un porcentaje; as, el ejemplo anterior se expresara de la manera siguiente: neutrfilos, 56%; linfocitos, 25%; eosinfilos, 12%; monocitos, 6%; basfilos, 1%. 9.13.2 Materiales Un microscopio (con ocular x 10 y un objetivo x 100 de inmersin en aceite) Aceite de inmersin Extensiones finas de sangre, bien extendidas y teidas con un Romanowsky (ver seccin 9.10.3) Papel Lpiz Si es posible, un contador especial provisto de teclas. 9.13.3 Examen microscpico
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Empleando el objetivo x 100, de inmersin en aceite, verifique que los glbulos blancos se encuentran uniformemente distribuidos en la extensin. En un frotis defectuosamente extendido es posible que los neutrfilos se hallen agrupados en la ltima porcin. Elaborar una tabla con: -cinco columnas verticales (N, E, B, L y M), y -10 Lneas horizontales (ver Fig. 9.111). Cuando 10 trazos se han hecho en la primera lnea, vaya a la siguiente. Por lo tanto, cuando la lnea 10 se ha completado, usted sabe que usted ha contado 100 leucocitos. Luego sume el total de cada columna vertical. Estos totales dan el porcentaje de cada tipo de leucocitos. Los totales se convierten en fracciones decimales mediante la colocacin de un punto decimal de dos dgitos a la izquierda (en algunos casos esto puede requerir la insercin de un cero). Por lo tanto, 59 se convierte en 0.59, 8 se convierte en 0.08, 1 se convierte en 0,01, 28 se convierte en 0,28, etc., como en la ltima lnea de la ilustracin. Estos decimales son las fracciones del nmero de cada tipo de leucocitos, y son los resultados que se informan cuando se utilizan unidades SI.
349
Figura 9.111 Tabla para el registro de los diferentes tipos de leucocitos (se hace con lpiz y papel). N: neutrfilos, E: eosinfilos, B: basfilos, L: linfocitos, M: monocitos. A), B), C) Mquina especial para recuento, con teclado. Esta mquina contadora tiene un teclado, cada tecla corresponde a un tipo de leucocitos; la cantidad de cada tipo se registra automticamente. Su costo es elevado. Rango de referencia La Tabla 9.12 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.12 Fracciones del nmero del tipo de leucocitos normales, por grupo de edad Tipo clulara Grupo de edad Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfocitos Monocitos recin nacidos 0.55-0.65 0.02-0.04 0.00-0.01 0.30-0.35 0.03-0.06 Bebs (hasta1 ao, excluyendo a los 0,40 - 0,48 0,02-0,05 0,00 - 0,01 0,40-0,48 0,05-0,10 recin nacidos) 0.36-0.48 Nios (1-4 aos) 0.02-0.05 0.00-0.01 0.44-0.54 0.03-0.06 Nios (10 aos)
aPara
0,45 - 0,55
0,02 - 0,05
0,00-0,01
0,38 - 0,45
0,03-0,06
Adultos 0.55-0.65 0.02-0.04 0,00-0,01 0.25-0.35 0.03-0.06 obtener los valores en las unidades tradicionales (es decir, en porcentajes), se multiplica cada valor en 100. El recuento diferencial de leucocitos se calcula multiplicando el porcentaje de un tipo particular de leucocitos (por ejemplo, neutrfilos) por el recuento leucocitario total y dividiendo por 100. Ejemplo: Recuento total de leucocitos = 5000/mm3 Porcentaje de neutrfilos = 42 % "Absoluta" neutrfilos = (42 x 5.000)/100 = 2100/mm3 Hay dos patrones principales de distribucin de diferentes tipos de leucocitos: Un patrn muestra una mayora de los linfocitos (este tipo se observa en lactantes y menores de 10 aos). El otro patrn muestra una mayora de los neutrfilos (visto en el recin nacido, nios mayores de 10 aos y adultos). Cada tipo de leucocitos se puede informar en trminos de su concentracin de nmero (es decir, nmero de clulas por litro) en lugar de como una fraccin del nmero. El nmero de concentracin se calcula multiplicando la fraccin del nmero de un tipo particular de leucocitos por el nmero total de concentracin de leucocitos. Ejemplo: Concentracin del nmero de leucocitos = 5 x 109/l Fraccin del nmero de neutrfilos = 0,42 Concentracin del nmero de neutrfilos = 0.42 x 5 x 109 = 2,1 x 108/l. Resultados anormales (a) Neutrofilia: aumento de la proporcin de neutrfilos (ms de 0,65). Ocurre especialmente en las infecciones agudas. (b) Eosinofilia: aumento de la proporcin de eosinfilos (arriba de 0,05). Casi siempre sugiere que existe en los tejidos una infestacin por parsitos: esquistosomas, filarias, ancilostomas, scaris, etc. Tambin puede obedecer a una alergia. (c) Linfocitosis: aumento de la proporcin de linfocitos (por encima de 0,35 en adultos y y por encima de 0,45 en los nios). Se suele observar en algunas infecciones vricas (sarampin, etc.), ciertas infecciones crnicas (paludismo, tuberculosis, etc.) y varios estados txicos. (d) Monocitosis: aumento de la proporcin de monocitos (arriba de 0,06). Se observa en algunas infecciones bacterianas (por ej., fiebre tifoidea) y parasitarias como el paludismo y la leishmaniasis visceral. (e) Neutropenia: disminucin del nmero de neutrfilos. Puede ocurrir en ciertas infecciones (por ej. sepsis) y algunas otras enfermedades. (f) Linfopenia: es una disminucin del nmero de linfocitos y puede ocurrir en el SIDA. 9.14 DETERMINACIN DE
LA CONCENTRACIN DEL NMERO DE TROMBOCITOS
9.14.1 Materiales Microscopio Aceite de inmersin Frotis de sangre bien extendido teido con Romanowsky (ver seccin 9.10.3). 9.14.2 Examen Microscpico Usando el objetivo de inmersin en aceite x 100, cuente el nmero de plaquetas en 20 campos y crear una estimacin aproximada del nmero de eritrocitos por campo. Calcular la relacin de plaquetas a los eritrocitos. Si se conoce la concentracin del nmero de eritrocitos (ver seccin 9.5), el recuento de trombocitos puede ser estimado. Si no, una estimacin aproximada del nmero de trombocitos, puede ser "normal", "alto" o "bajo", y puede basarse en una proporcin de aproximadamente un trombocito por cada 500-1000 eritrocitos y ser considerada normal. Rango de referencia La Tabla 9.13 muestra los valores de referencia para los diferentes grupos de edad. Tabla 9.13 recuento de trombocitos normales, por grupo de edad Grupo de edad Recuento de trombocitos (por mm3) Bebs (<1 ao) 3.5 a 6.6 x 105 Nios (1-15 aos) 2.5 a 5.1 x 105
350
Adultos
1,7-4,0 x 105
AGREGADO:
Recuento en lmina (portaobjetos) Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la frmula convencional para recuento de plaquetas. Valores de referencia 150 000 - 450 000 plaquetas/mm3 RECUENTO DE PLAQUETAS Mtodos cuantitativos manuales Hay varios mtodos manuales para el contaje de plaquetas, se describirn 4: 1) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando procana) Principio El recuento de plaquetas se realiza directamente en un microscopio de contraste de fases, previa lisis de los hemates, o tambin se puede observar en un microscopio convencional. Materiales Recuento en cmara Hemocitmetro o cmara de Neubauer. Solucin de procana (lase ms adelante) Pipetas automticas de 100 a 1000 l y 0 a 100 l. Cmara hmeda. Tubos de plstico de 12 x 75. Microscopio convencional. Mtodo Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA. Hacer una dilucin de 20 l de sangre total con 380 l (0,38 ml) de solucin de procana en un tubo de plstico de 12 x 75 (dilucin 1/20). Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla. De esta dilucin, llenar en cmara de Neubauer. Dejar en reposo por 15 minutos en cmara hmeda. Enfocar con objetivo de 45x (o 40x) y contar las plaquetas en el retculo central de 1 mm2 cuadrado. Calcular el nmero total de plaquetas segn la frmula que se lee a continuacin: Resultados Se aplica la siguiente frmula:
Valores de referencia 150 000 - 450 000 plaquetas/mm3 SOLUCIN DE PROCANA Reactivos Procana (polvo) 3 g Cloruro de sodio 200 mg Agua destilada c.s.p. 1000 ml Procedimiento Mezclar los reactivos en agua destilada y completar hasta llegar a un litro. Guardar en refrigeracin a 4C.
Fuente: Manual de Procedimientos de Laboratorio en Tcnicas Bsicas de Hematologa, Ministerio de Salud,
351
Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Salud Pblica, Repblica del Per, Elaboracin: T. M. Mara Muoz Zambrano, Dra. Cecilia Morn Cortijo 2) RECUENTO DE PLAQUETAS (Mtodo de Rees Ecker) COLORANTE PLAQUETAS REES ECKER COLORANTE PARA EL RECUENTO MANUAL DE PLAQUETAS PRINCIPIO El recuento de plaquetas es uno de los mtodos de rutina. La condicin previa de todos los mtodos de recuento es la dilucin programada y preparacin de una muestra de sangre. La solucin de reaccin produce hemlisis de los hemates la sangre. Se recuenta el tipo de clula deseado en un volumen definido y se calcula el nmero de clulas en un microlitro de sangre. CONTENIDOS COLORANTE PLAQUETAS Listo para su uso Azul de Cresilo Brillante R.A. 1 g/l Sodio Citrato R.A 38g/l Formol neutro 22 ml Agua desmineralizada tipo II 978 ml CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Las soluciones deben almacenarse entre 15C y 30C y protegidos de la luz. Despus de abierto el contenido almacenado entre 15C y 30C y protegidos de la luz es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Temperaturas inferiores a 15C puede precipitar colorantes de las soluciones colorantes. Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS Observe la simbologa en los rtulos de las soluciones. Las soluciones usadas y las caducadas deben eliminarse como desechos especiales, debiendo cumplir las regulaciones locales para el desecho de compuestos peligrosos. MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS Microscopio Cmara de Neubauer Pipeta glbulos rojos Cronometro y/o timer MUESTRAS Sangre venosa anticoagulada. Toda muestra biolgica debe ser considerada como potencialmente infecciosa. PROCEDIMIENTO 1. Obtener sangre venosa o capilar hasta la marca 0,5 de pipeta de glbulos rojos. 2. Llenar con el diluyente hasta la marca 101, haciendo una dilucin a 1:200 de la sangre. 3. Mezclar la sangre diluida durante 5 minutos, preferiblemente en un agitador de pipetas. 4. Descartar varias gotas de la suspensin celular, llenando entonces ambas cmaras del contaje de la cmara de Neubauer y colocarlo en una placa de Petri cerrada conteniendo una pieza hmeda de algodn. Permitir reposar 15 minutos. 5. Utilizar un objetivo de 40 X del microscopio, contar las plaquetas contenidas en un mm2. (las plaquetas se observan color azul refringente), multiplicar el resultado por 2.000, obtenindose as el numero de plaquetas por milmetro cbico. VALORES DE REFERENCIA Varones, mujeres, nios: 150.000 300.000/mm3 NOTAS SOBRE EL EMPLEO El microscopio usado debe cumplir los requisitos de un laboratorio de diagnstico mdico. Utilizar pipeta para eritrocitos y cmara de recuento (Neubauer) estndar limpia. Usar placas preferiblemente nuevas, sin ralladuras y libres de grasa. BIBLIOGRAFA 1. Brecher, G. Gronkite, E.P., 1950, Morphology and Enumeration of Human Blood Platelets, J. Appel Physiol 3.365. 2. Brecher, G. Scheneiderman, M. Cronkite, E.P. 1953. The Reproducibility and Consistency of the platelet count. Amer J. Clin Pathol 23.15.26. 3. Miale, J.B., 1962, Laboratory Medicine, Hematology 2nd ed. C.V. Mosby Co., St. Louis, p 806-808. Seiverd, C.E., 1958, Hematology-for Medical Techinologists. 2nd ed. Lea and Febiger, Philadelphia, p 145-150. 4. Tocantinss, L.M. Kazal, LA., 1964, Blood Coagulation-Hemorrhege and. Thrombosis. 2nd ed. Grune and Stratton, New York, p 44-45. 3) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando oxalato de amonio al 1%) PROCEDIMIENTO El conteo de plaquetas se realiza en sangre anticuagulada con EDTA y diluida con oxalato de amonio al 1% mediante el uso de la pipeta para dilucin de hemates y el hemocitmetro. RECURSOS Sangre anticoagulada con EDTA Solucin de oxalato de amonio al 1% y/ o Rees Ecker Pipeta para dilucin de hemates Cmara de de recuento de Neubauer Laminilla de cuarzo Placa de Petri con papel de filtro humedecido Agitador de pipetas Microscopio MTODO Mezcle cuidadosamente, por inversin por lo menos 10 veces, la sangre anticoagulada con el fin de obtener una muestra homognea Llene la pipeta con la muestra de sangre hasta la marca 1.0 exactamente Elimine el exceso de sangre de las paredes externas de la pipeta para no contaminar la solucin diluente Aspire el lquido diluente hasta la marca 101 exactamente Sujeta la pipeta entre los dedos ndice y pulgar, desprenda la boquilla y deje en reposo durante 3 minutos
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Agite durante 10 minutos Descarte hasta la mitad del bulbo con el fin de eliminar el lquido del capilar e inmediatamente llene la cmara Llene la cmara de Neubauer en ambos lados y coloque en ambiente hmedo por 10 minutos. El ambiente hmedo se logra cubriendo la cmara con una Caja de Petri que llevar adherido un disco de papel de filtro humedecido Coloque la cmara en el microscopio. Enfoque con objetivo de 40X y observe el llenado de la cmara. No debe haber agregados plaquetarios. Cuidadosamente enfoque el cuadrado central Disminuya la intensidad de la luz. As le ser ms fcil distinguir y contar las plaquetas Las plaquetas se reconocen como estructuras pequeas, opacas, redondas o alargadas, medianamente refrctiles, y a veces con prolongaciones El nmero est determinado por el conteo de los 25 cuadrados en que se subdivide el cuadrado central, descartando las plaquetas que tocan las lneas derecha e inferior. Clculo El nmero de plaquetas por mm se calcula de acuerdo con: 1. Volumen del rea contada: 0.1 mm (1x1x0.1) 2. Dilucin utilizada: 1:100 3. Nmero de clulas contadas Plaquetas /mm Nmero de clulas contadas X 1 X dilucin Volumen de rea contada Plaquetas/mm = B X 10 X 100 Plaquetas /mm = B X 1000 Valores de Referencia El rango normal para el recuento de plaquetas es de 150.000 a 400.000xmm3 4) RECUENTO DE PLAQUETAS (usando Solucin estril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo) Composicin. Solucin estril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este lquido se provee listo para usar y su conservacin es indefinida en refrigerador (2 - 10 C). El fundamento del mtodo consiste en la produccin de hemlisis por la utilizacin de un lquido hipotnico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo. Procedimiento para el recuento de Plaquetas. Antes de usar, llevar el Diluyente para recuento de Plaquetas Biopur a temperatura ambiente (15 - 32 C). Medir sangre del pulpejo del dedo (o extrada con Anticoagulante EDTA) hasta la marca 0,5 de una pipeta para recuento de leucocitos, y diluir hasta la marca 11 con Diluyente para recuento de Plaquetas. Mezclar y dejar en reposo 15 minutos. Volver a mezclar el contenido de la pipeta y cargar una cmara para recuento globular. Dejar en ambiente hmedo (cpsula de Petri con algodn humedecido) durante 15 minutos ms. Contar las plaquetas de 25 cuadraditos mnimos, del retculo central que se emplea para recuento de glbulos rojos. Las plaquetas aparecen redondeadas, refringentes y aumentadas de volumen por la hipotona del Diluyente. Se favorece la observacin imprimiendo un ligero movimiento al botn micromtrico del microscopio. Clculos Multiplicar el nmero de plaquetas de los 25 cuadraditos por 3.200; el resultado es el nmero de plaquetas por milmetro cbico. El factor 3.200 al que nos hemos referido, proviene de los siguientes clculos: 10 X 16 X 20 = 3.200, donde: * factor 10 (altura de la cmara 0,1 mm) * factor 16 (400/25) Superficie contada, 1/16 del total del retculo. * factor 20 (dilucin de la muestra en la pipeta) Valores normales: 150.000 a 450.000 plaquetas por milmetro cbico. Importante Si se utiliza sangre recogida con anticoagulante debe vigilarse que el frasco de recoleccin est perfectamente limpio, lo mismo que el tapn, pues de lo contrario puede observarse aglutinacin parcial de las plaquetas. Si se utiliza sangre del pulpejo debe procurarse recoger la muestra dejando que la sangre fluya libremente, sin hacer excesiva presin sobre el dedo. La utilizacin de material siliconado (incluyendo pipetas) asegura excelentes resultados, especialmente en cuanto a reproducibilidad. Fuente: www.biopur.com.ar OBSERVACIONES Las plaquetas se cuentan ms fcilmente utilizando microscopio de contraste de fase, pero si el microscopio de luz se adeca correctamente y el conteo se hace con un estricto control de calidad el resultado ser igualmente confiable. Especial atencin debe tenerse con las soluciones diluentes. Estas no deben estar contaminadas, pues tanto las partculas como las bacterias pueden ser similares a las plaquetas. Los lquidos diluentes se deben mantener refrigerados y filtrar antes de su uso. La limpieza de la cmara de Neubauer y de las pipetas es importante en este procedimiento. Si se observan agregados en el recuento, el procedimiento debe repetirse. El uso de EDTA como anticoagulante ayuda a disminuir la agregacin plaquetaria. El rango de error para el recuento de plaquetas en el microscopio de luz es de 16 25%. No se debe informar el recuento de plaquetas sin confrontarlo con el extendido de sangre perifrica, coloreado con Wright. Existen dos mtodos para el conteo de plaquetas: manual y electrnico. El electrnico (dado por los contadores hematolgicos), es muy bueno y da otros parmetros. Su estudio aporta, adems del valor numrico, otros parmetros de importancia diagnstica, tales como promedio del volumen plaquetario e histograma plaquetario. A esta valoracin la llamamos plaquetograma. Los contadores hematolgicos son muy caros y es muy difcil disponer de uno en un laboratorio de un centro perifrico. En todo caso, estn disponibles en laboratorios de centros de mayor complejidad.
353
BIBLIOGRAFA BERRIO Margarita, CORREA Mara Cecilia, JIMENEZ Marta Elena. El hemograma. Editorial Universidad de Antioquia. 2003.
Fotos que muestran contadores manuales. (Asimismo, en algunos pases los denominan "cuenta ganado" o "cuenta personas")
HEMOGLOBIN
HEMOGLOBIN CAL
Hemoglobina
Drabkin. Colorimtrico
Determinacin cuantitativa de hemoglobina IVD
Conservar a 2-8C 2. 3. Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. Pipetear: Blanco 5,0 --Patrn 5,0 20 -Muestra 5,0 -20
PRINCIPIO DEL METODO La hemoglobina es oxidada por la accin del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de hemoglobina presente en la muestra ensayada1,2. SIGNIFICADO CLINICO La hemoglobina es una protena que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatas, deshidratacin o estancia en lugares de gran altitud1,5,6. El diagnostico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio.
REACTIVOS
HEMOGLOBIN 50x HEMOGLOBIN CAL
RT (mL) HEMOGLOBIN CAL (L) Muestra (L) 4. 5.
Mezclar e incubar 3 minutos a temperatura ambiente (15-25C). Leer la absorbancia (A) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
CALCULOS - Con factor : (A) Muestra x 36,77 = g/dL de hemoglobina en la muestra - Con Patrn: ( A ) Muestra x 15 (Conc. Patrn) = g/dL de hemoglobina en la muestra ( A ) Patrn CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias. VALORES DE REFERENCIA Hombres 14 - 18 g/dL 8,7 - 11,2 mmol/L Mujeres 12 - 16 g/dL 7,5 - 9,9 mmol/L Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. CARACTERISTICAS DEL METODO Rango de medida: Desde el limite de deteccin de 0,1 g/dL hasta el limite de linealidad de 20 g/dL. Si la concentracin de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2. Precisin:
1 2
Ferricianuro de potasio Cianuro de potasio Dihidrogeno fosfato de potasio

Patrn de Hemoglobina 15 g/dL Origen animal
0,60 mmol/L 0,90 mmol/L 2 mmol/L
PRECAUCIONES HEMOGLOBIN Ref: 1001230 Nocivo (Xn): R20/21/22: Nocivo por inhalacin, ingestin y en contacto con la piel. S7: Mantener el recipiente bien cerrado. S/28.1: En contacto con la piel, lavar inmediatamente y abundantemente con agua. S45: En caso de accidente o malestar, acudir inmediatamente al medico. Cianuro (venenoso): La concentracin de cianuro en el Reactivo concentrado (50x) es sensiblemente menor que la dosis mnima letal para el adulto. Su acidificacin puede provocar liberacin de cido cianhdrico.
Media (g/dL) SD CV (%)
Intraserie (n= 20) 8,00 15,2 0,29 0,33 3,59 2,19
Interserie (n= 20) 7,81 15,1 0,19 0,26 2,51 1,74
PREPARACION Reactivo de trabajo (RT): - Para 5 mL 4,9 mL agua destilada + 2 gotas de Reactivo - Para 250 mL 245 mL agua destilada + 1 frasco (5 mL) de Reactivo Mezclar bien. Estabilidad: 2 meses en nevera a 2-8C, protegido de la luz. CONSERVACION Y ESTABILIDAD Todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8C, protegidos de la luz y se evita la contaminacin durante su uso. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. Indicadores de deterioro de los reactivos: - Presencia de partculas y turbidez. - Absorbancia (A) del Blanco a 540 nm 0,01. MATERIAL ADICIONAL - Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 540 nm. - Cubetas de 1,0 cm de paso de luz. - Equipamiento habitual de laboratorio. MUESTRAS 1 Sangre capilar o venosa . Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato. Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8C. PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . 15-25C
Sensibilidad analtica: 1 g/dL = 0,027 A. Exactitud: Los reactivos de SPINREACT no muestran diferencias sistemticas significativas cuando se comparan con otros reactivos comerciales.
Las caractersticas del mtodo pueden variar segn el analizador utilizado.

INTERFERENCIAS Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la 3,4 determinacin de la hemoglobina . NOTAS SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicacin de este reactivo en distintos analizadores. BIBLIOGRAFIA
1. 2.
3. 4. 5. 6.
Franco R S. Hemoglobin. Kaplan A et al. Clin Chem The C.V. Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; 1294-1296 and 418. Van Kampen EJ et al. Standarization of hemoglobinometry Clin. Chim 1961;6: 438-544.
Young DS. Effects of drugs on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC Press, 1995. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed. AACC 2001. Burtis A. et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. AACC 1999. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. AACC 1995.
PRESENTACION
HEMOGLOBIN
Ref: 1001230
Cont.
4 x 5 mL
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10. QUMICA SANGUNEA

10.1 VALORACIN DE
LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA EN SANGRE: MTODO DE LA O-TOLUIDINA 1
La determinacin de la glucosa (azcar) sangunea es necesaria para establecer el diagnstico de la diabetes mellitus y otras enfermedades en que existen alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos. En el curso de esta enfermedad se suele encontrar glucosa en la orina (vase la seccin 7.2.4). 1Este mtodo tambin es usado para medir la concentracin de glucosa en LCR. La determinacin de glucosa en el LCR es necesaria para diagnosticar casos de meningitis (vase la seccin 8.3.4). 10.1.1 Principio Primeramente se provoca la precipitacin de las protenas de la sangre por medio de cido tricloroactico. En el producto resultante, filtrado, la glucosa reacciona con la ortotoluidina y se forma un color verde, cuya intensidad se mide en un colormetro fotoelctrico (o un espectrofotmetro) a 630 nm. Teora de la medicin El grupo aldehdo de las aldosas tales como la glucosa y la fructosa forma un producto de condensacin colorido con aminas aromticas en una reaccin estequiomtrica. El producto de reaccin coloreado, soluble en agua tiene su mximo de absorcin a 635 nm de longitud de onda y la absorbancia de la solucin es proporcional a la concentracin. En este mtodo de determinacin de glucosa, una amina aromtica primaria, o-toluidina, reacciona en cido actico glacial caliente con el grupo aldehdo terminal de la glucosa para producir un color azul-verde. La absorbancia de este producto se mide fotomtricamente y la glucosa se puede calcular. La absorbancia en la regin de 600 a 700 nm es directamente proporcional a la concentracin de glucosa. (Leer la bibliografa consultada.)
10.1.2 Materiales y reactivos Un fotocolormetro o espectrofotmetro Tubos cnicos para centrifugacin y tubos de ensayo de mayor tamao (con capacidad para 20 ml) Gradilla Centrfuga Reloj o temporizador capaz de medir los tiempos indicados en la tcnica Pipetas para sangre (Sahli) de 0,2 ml o micropipeta para 200 l Pipetas graduadas de 0,5 ml, 1,0 ml, 5,0 ml Cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas Un bao mara en ebullicin a 100 C Reactivos para glucosa (reactivo No. 30) (a) cido tricloroactico en solucin de 30 g/l (3%) (b) reactivo de ortotoluidina (c) cido benzoico en concentracin de 1 g/l (0,1%) (d) solucin normal de referencia para glucosa (reserva) (100 mmol/l) (e) soluciones normales de trabajo de referencia para trabajar con glucosa (2.5, 5.0, 10, 20 y 25 mmol/l) Muestra: Sangre entera (capilar o venosa), plasma o suero obtenidos del paciente en ayunas2, LCR, orina Suero control Suero control: Se deber usar un suero control con cada lote de muestras para ensayo. Si los resultados obtenidos con el suero control son correctos, se podr suponer que tambin lo sern los que se obtengan con la sangre del paciente. 2Si se emplea sangre venosa es conveniente utilizar oxalato de flor (reactivo No. 26) como anticoagulante. De este modo se evitar que la glucosa se descomponga en la sangre. El suero es el material de preferencia para trabajar con glucosa. El mtodo tambin admite sangre total o plasma obtenido con oxalato de flor. a) Recoleccin: - Suero o plasma: se debe obtener suero de la manera usual o plasma recolectado con anticoagulante oxalato de flor. Si se usa suero, colocar la sangre recin extrada en un tubo cnico de centrfuga sin anticoagulante y centrifugar a 2500 rpm aproximadamente durante 10 minutos. Para obtener plasma, centrifugar de manera similar. - Orina: si se trata de una muestra aislada, utilizar preferentemente orina fresca. Puede realizarse el ensayo en orina de 24 horas. En este caso, recolectar la muestra en un recipiente oscuro. - LCR: en caso de utilizar LCR, el ensayo debe realizarse en forma inmediata a la obtencin de la muestra.
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Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la destruccin enzimtica de la glucosa sangunea (gluclisis) por hemates y leucocitos es proporcional a la temperatura a la que se conserva la sangre, siendo mxima a 37 oC. Este proceso no se inhibe an en estado de congelacin, por lo que la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la extraccin. El sobrenadante lmpido se transfiere a otro tubo para su conservacin. De esta forma la glucosa es estable 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. En caso de no poder procesarse la muestra de la forma indicada, deber adicionarse un conservador en el momento de la extraccin. El LCR puede contaminarse con bacterias y otras clulas por lo que la determinacin debe realizarse de inmediato. En caso de no poder procesarse de esta manera, centrifugar el LCR y conservarlo 3 das a 2-10 oC o 5 horas a 2025 oC. 10.1.3 Mtodo Procedimiento previo antes de la medicin En esta etapa se debe trabajar con los tubos cnicos de centrfuga. Aqu se procede a realizar la precipitacin de las protenas plasmticas mediante el agregado de TCA. Prepare 3 tubos cnicos (o ms, si se necesitan) y mrquelos de la manera siguiente: Tubo Blanco: B (etiquete con la letra B) Tubo de referencia: R (etiquete con la letra R) Tubo del paciente: P (etiquete con la letra P; P de Paciente o Problema) Aclaracin: Si se lleva a cabo ms de un ensayo, esto es, si hay ms muestras correspondientes a varios pacientes, coloque en cada tubo cnico una etiqueta con el nombre y el nmero que correspondan a cada paciente. Por ej., si hay 4 pacientes a los cuales se les medir la glucosa se etiquetarn cada uno de los siguientes tubos cnicos con las letras P1, P2, P3, P4 o en su defecto el nombre de cada uno de los pacientes en su respectivo tubo cnico. Todos estos tubos cnicos se procesan junto con un tubo cnico blanco B y un tubo cnico de referencia R. Entonces, las operaciones previas exigen que se etiquete estos tubos cnicos. Tratamiento de la muestra 1. Por medio de una pipeta coloque en cada tubo cnico para centrifugacin 1,8 ml de solucin de cido tricloroactico (TCA). Si se usan 3 tubos cnicos poner en los 3 la misma cantidad de TCA. Proceder de igual forma si hay ms muestras problema (1,8 ml de TCA para cada uno). Nota: el cido tricloroactico es corrosivo. sese con cuidado. 2. Con una pipeta para sangre de 0,2 ml (o con una micropipeta de 200 l), deposite precisamente 0,2 ml de sangre total, suero o plasma1 (B en la Fig. 10.1) en el fondo del tubo cnico; es decir, debajo de la solucin de cido tricloroactico (A en la Fig. 10.1). La solucin de cido tricloroactico se enturbiar al ponerse en contacto con la sangre. 3. Suba la pipeta (o la punta de la micropipeta) dentro del tubo cnico y aspire la solucin clara de cido tricloroactico para enjuagar los residuos de sangre, plasma o suero (Fig. 10.2). 4. Sin sacar la pipeta del tubo expulse la solucin de cido tricloroactico que ha aspirado primero en el mismo tubo cnico de centrfuga (Fig. 10.3). 5. Mzclela bien (toda la solucin se enturbiar) y djela reposar 5 minutos. 1 Cuando esta prueba se lleva a cabo utilizando LCR, el volumen requerido en este paso es mayor (0,8 ml). Blanco y Referencia 6. Para preparar el blanco de reactivo y el estndar de trabajo de referencia de glucosa proceda exactamente de la misma forma que se explic antes en los puntos anteriores para con la muestra. En estos casos, usando una pipeta para sangre limpia (o una micropipeta con puntas limpias), coloque 0,2 ml de agua destilada en el tubo cnico etiquetado con la letra B y 0,2 ml de solucin de referencia de trabajo de glucosa en el tubo cnico etiquetado con la letra R. Estos tubos sern usados para preparar el blanco de reactivo y el estndar de trabajo de referencia de glucosa, respectivamente. En estos tubos (B y R) no se producir turbidez. 7. Coloque todos los tubos cnicos marcados en la centrfuga y centrifguelos a 3000 g durante 5 minutos. En el tubo que contiene la muestra de sangre (o suero) las protenas precipitadas sedimentan y se obtiene un lquido sobrenadante claro. Luego de finalizada la centrifugacin, saque los tubos cnicos de los portatubos de la centrfuga y colquelos en una gradilla que est ubicada sobra una plataforma horizontal firme y estable alejada de las vibraciones para poder trabajar. Recuerde que los tubos cnicos con muestra poseen un sedimento que no se debe resuspender. En esta tcnica, se trabaja con el sobrenadante.
Figura 10.1 Colocando sangre debajo de una solucin de cido tricloroactico con una pipeta de sangre. A: solucin de cido tricloroactico; B: sangre. Figura 10.2 Enjuague la pipeta de la sangre con solucin de cido tricloroactico. Figura 10.3 Expulsando solucin de cido tricloroactico en un tubo de centrfuga.
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A B A) Mezcle el contenido de cada tubo. Mzclela bien (toda la solucin se enturbiar) y djela reposar 5 minutos. B) Centrifguela a 3000 g durante 5 minutos a fin de que las protenas precipitadas se sedimenten y se pueda obtener un lquido sobrenadante claro. Tcnica de medicin 8. Prepare 3 tubos de ensayo grandes (o ms, si se necesitan) y mrquelos de la manera siguiente (Fig. 10.4): Tubo Blanco: B Tubo de referencia: R Tubo del paciente: P Nota: Si se lleva a cabo ms de un ensayo coloque en cada tubo P una etiqueta con el nombre y el nmero que correspondan a cada paciente. 9. Con las pipetas graduadas correspondientes deposite en cada tubo lo siguiente: En el tubo marcado blanco: 0,5 ml de agua destilada y 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina En el tubo de referencia: 0,5 ml de solucin de referencia para trabajar con glucosa y 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina En el tubo del paciente: 0,5 ml del lquido sobrenadante y 3,5 ml del reactivo de ortotoluidina Nota: el reactivo de ortotoluidina es corrosivo; si es posible, utilice una propipeta para aspirar el lquido al interior de la pipeta. 10. Mezclar el contenido de cada tubo. Coloque todos los tubos en el bao mara de agua a 100 C (en ebullicin) durante exactamente 12 minutos, a fin de que se forme el color verde (Fig. 10.5). 11. Saque los tubos del bao mara y djelos enfriar durante 5 minutos en un vaso para anlisis lleno de agua fra. 12. Mida la intensidad del color que se ha formado por medio de un fotocolormetro o en un espectrofotmetro con longitud de onda de 630 nm: A. Coloque el filtro de color rojo anaranjado en el fotocolormetro (rango que cubre 630 nm) o seleccione en el espectrofotmetro (EF) la longitud de onda de 630 nm. B. Llene el tubo de fotocolormetro o cubeta espectrofotomtrica de caras paralelas con la solucin contenida en el tubo marcado B (en blanco) y colquelo en el fotocolormetro. C. Ajuste la lectura del fotocolormetro o del EF a cero con la cubeta que contiene la solucin B conservando esta cubeta en su sitio. D. Deseche la solucin B de la cubeta; enjuague sta con una pequea cantidad de la solucin R (referencia); deseche esta pequea cantidad de la solucin y llene la cubeta de nuevo con solucin R; coloque otra vez la cubeta en el colormetro y vea en el tablero o pantalla el grado de absorbancia, AR E. Deseche la solucin R de la cubeta; lvela con una cantidad reducida de la solucin P (paciente); deseche tambin sta y a continuacin llene la cubeta con solucin P; coloque la cubeta en el fotocolormetro (o EF) y observe el grado de absorbancia, AP. Calibracin del fotocolormetro Antes de tomar las mediciones, preparar una curva de calibracin empleando las diferentes concentraciones de la solucin de referencia de trabajo de glucosa tratada como se describe en los pasos 6-9. El grfico debe ser lineal hasta la concentracin ms alta y debe pasar por el origen. Prepare un nuevo grfico cada vez que se renueva el reactivo o-toluidina, para confirmar la linealidad.
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Figura 10.4 Etiquetar los tubos de ensayo para la prueba. B: Tubo blanco; R: Tubo de referencia; P: Tubo del paciente. A) Mezcle el contenido de cada tubo.
Figura 10.5 El calentamiento de los tubos de ensayo en un bao mara de agua a 100 C para que se forme el color verde.
10.1.4 Resultados Clculo Calcular la concentracin de glucosa en la muestra de sangre usando la siguiente frmula1: Concentracin de glucosa en sangre (mmol/l) = (AP/AR) x C Donde: AP = Lectura de la absorbancia de la muestra del paciente AR = Lectura de la absorbancia de la solucin de referencia de trabajo de glucosa C = Concentracin de la solucin de referencia de trabajo de glucosa. Nota: Si se ha incluido un suero de control, hacer el clculo para que el suero coincida exactamente de la misma manera, sustituyendo Ac (Absorbancia de la solucin de control) por AP en la frmula. 1 El clculo dado es para unidades SI. La frmula para el clculo de las concentraciones de glucosa en la sangre en las unidades tradicionales es el siguiente: Concentracin de glucosa en (mg/100 ml) = Concentracin de glucosa (mmol/l) x 1/0,0555 Rango de referencia Los rangos de referencia de las concentraciones de glucosa en la sangre de los pacientes en ayunas se muestran en la Tabla 10.1. Tabla 10.1 Concentraciones de glucosa en sangre en pacientes en ayunas Concentracin de glucosa Lquido Unidades SI (mmol/l) Unidades tradicionales (mg/100 ml) Sangre venosa 3.3 a 5.5 60-100 Sangre capilar 3.9 a 5.5 70-100 Suero 3.9 a 6.4 70-115 Plasma 3.9 a 6.4 70-115 Valores altos y bajos Si se observan valores inusualmente altos o bajos, la prueba debe repetirse con el fin de confirmar los resultados, tal como se describe a continuacin. Concentraciones superiores a 16,5 mmol/l: Diluya las soluciones T (testigo) y P (paciente) con cantidades iguales de cido actico glacial. Coloque la solucin B diluida en la cubeta del fotocolormetro y ajuste el aparato en 0. Despus vea en el tablero el grado de absorbencia AP con la solucin P diluida en la cubeta. Calcule otra vez la concentracin de glucosa utilizando la nueva cifra de AP y el valor de AR obtenido anteriormente. Multiplique el resultado por 2 (puesto que la solucin P se ha diluido 1/2) para conocer la concentracin verdadera de la glucosa. Concentraciones inferiores a 2,3 mmol/l: Si se obtienen cifras tan reducidas como stas, repita todo el ensayo.
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En el paso 1 utilice 1,6 ml de solucin de cido tricloroactico (en vez de 1,8 ml) y en el paso 2 utilice 0,4 ml de sangre, suero o plasma (en vez de 0,1 ml). El ensayo y el clculo del resultado se harn exactamente con el mismo procedimiento usado anteriormente. Divida el resultado en 4 para conocer la concentracin verdadera de la glucosa. Mtodo enzimtico de la glucosa oxidasa Este mtodo se viene usando desde hace mucho tiempo, y en la actualidad, su acceso es ms fcil que en dcadas anteriores. Este mtodo ya ha reemplazado al de la ortotoluidina en muchas partes del planeta y en especial en los pases subdesarrollados en donde lleg a varios lugares distantes hasta en los centros perifricos de salud ms alejados. Lase el manual de instrucciones adjunto de un laboratorio comercial sobre la tcnica enzimtica para glucosa. Fuente: www.wienerlab.com.ar
Bibliografa consultada 1. Frings, C. S., Ratliff, C. R., and Dunn, R. T., Automated determination of glucose by a direct o-toluidine procedure. CLIN. CHEM. 16, 282 (1970). 2. Frings, C. S., Effect of dextrans on o-toluidine methods for glucose. CLIN. CHEM. 16, 618 (1970). (Letter to Ed.) 3. American Monitor Procedure Insert for Trucose, Literature No. 1051-P, Sept. 24, 1971, American Monitor Corp. 4. De Haan, J. B., and Roth, N., A new medium for the aldohexose-o-toluidine reaction: Direct microdeteriulnation of blood glucose. Z. Kim. Chem. Kim. Biochem. 7, 624 (1969). 5. Feteris, W. A., A serum glucose method without protein precipitation. Amer. J. Med. Technol. 31, 17 (1965). 6. Cooper, G. R., and McDaniel, V., Workshop Manual of Methods for the Determination of Glucose, American Society of Clinical Pathologists, Chicago, Ill. 1966, pp 70-75. 7. Fletcher, M. J., A colorimetric method for estimating serum triglycerides. Clin. Chim. Acta 22, 393 (1968). 8. Hugh Y. Yee, Edward S. Jenest, and Fred R. Bowles Modified Manual or Automated o-Toluidine System for Determining Glucose in Serum, with an Improved Aqueous Reagent Clinical Chemistry, Vol. 17, No. 2, 1971 103 - 107
10.2 ESTIMACIN
DE LA CONCENTRACIN DE UREA EN LA SANGRE: MTODO DE LA DIACETIL
MONOXIMA /TIOSEMICARBACIDA
La urea es un producto de desecho, que se forma en el hgado por la degradacin de las protenas. Pasa a la sangre, se filtra en los riones y se excreta en la orina. Si los riones no eliminan la urea, aumenta su concentracin en !a sangre. Esto puede ocurrir cuando se lesionan los tbulos renales o disminuye la irrigacin sangunea de los riones. 10.2.1 Principio Primeramente se precipitan las protenas de la sangre por medio de cido tricloroactico. La urea que se encuentra en el producto filtrado reacciona con la diacetilmonoxima en presencia del cido, del reactivo oxidante y de la tiosemicarbacida, formndose un color rojo en la solucin. La intensidad del color se mide en un colormetro fotoelctrico o en un EF a 520 nm. 10.2.2 Materiales y reactivos Fotocolormetro o un espectrofotmetro (EF) Tubos cnicos y tubos de ensayo (para contener 20 ml) Centrfuga Reloj o temporizador capaces de cronometrar los tiempos indicados Pipetas, 50 l, 0,1 ml, 0,5 ml, 5 ml (una micropipeta ajustable de 1 100 l o dos micropipetas de volumen fijo para medir 50 l y 100 l respectivamente) Probetas, 50 ml Bao mara con agua a 100 C Reactivos para Urea (reactivo n 62): cido tricloroactico, solucin al 5% - Solucin madre de Diacetilmonoxima (Diacetilmonoxima estandarizada) - Reactivo de color - Solucin de referencia madre o de reserva de Urea (Solucin de referencia estandarizada para urea) (125 mmol/l) - Solucin de referencia de trabajo de Urea (10 mmol/l) Reactivo cido (reactivo no. 6) Blanco de reactivo (reactivo no. 11) sangre del paciente (tratada con sal dipotsica de EDTA, solucin al 10% (reactivo N 22)), suero o plasma Suero control. Un suero de control (de concentracin conocida) se debe utilizar con cada lote de pruebas. Si el resultado de la prueba con el suero de control es correcto, se puede suponer que los resultados del paciente tambin sern correctos. 10.2.3 Mtodo 1. Preparar el reactivo de color inmediatamente antes de su uso, usando una mezcla 1:1 de la solucin madre de diacetil monoxima y reactivo cido. Preparar al menos 15 ml de reactivo de color para cada prueba. . Mezcle el reactivo en un tubo de ensayo grande o en un matraz pequeo. 2. Pipetear en un tubo cnico de centrfuga 50 l de sangre completa (tratada con una solucin de sal de EDTA dipotsico), suero o plasma. 3. Aadir 1 ml de solucin de cido tricloroactico y mezclar. La mezcla se enturbiar. Centrifugar a alta velocidad (3000 g) durante 5 minutos para sedimentar las protenas precipitadas y obtener un lquido sobrenadante claro. 4. Tome tres (o ms si es necesario) tubos de ensayo grandes y etiqutelos como se muestra en la Fig. 10.4:
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- Tubo Blanco (B) - Tubo de Referencia (R) - Tubo del Paciente (P). Nota: Si se realiza ms de una estimacin, coloque etiquetas en cada uno de los tubos P con el nombre o nmero del paciente. 5. Pipetear en cada tubo de la siguiente manera: Blanco: -0,1 ml de blanco de reactivo -3,0 ml de reactivo de color recin preparado. Referencia: -0,1 ml de la solucin de referencia de trabajo -3,0 ml de reactivo de color recin preparado. Paciente: -0,1 ml de lquido sobrenadante -3,0 ml de reactivo de color recin preparado. 6. Mezclar el contenido de cada tubo. Luego coloque todos los tubos en el bao de agua a 100 C durante 15 minutos (ver Fig. 10.5) para permitir que el color rojo se desarrolle. 7. Retire los tubos y colocarlos en un recipiente con agua fra hasta que se enfren a temperatura ambiente. 8. Mida el color producido en un colormetro a una longitud de onda de 520 nm. (A) Coloque el filtro verde en el fotocolormetro, o en un EF seleccione la longitud de onda de 520 nm. (B) Llenar el tubo o cubeta del fotocolormetro con la solucin contenida en el tubo marcado B (blanco) y colquelo en el fotocolormetro o EF en la respectiva cmara para cubetas. (C) Ajuste la lectura del fotocolormetro a cero con la cubeta que contiene la solucin B en la cmara para cubetas. (D) Vaciar la solucin B de la cubeta, luego enjuague la cubeta con una pequea cantidad de solucin de trabajo de referencia R (referencia), desechar esto, y luego llenar la misma cubeta con solucin de R, poner la cubeta con la Sol. R en la cmara de la cubeta del fotocolormetro y leer la absorbancia, AR. (E) Vaciar la solucin R de la cubeta, luego enjuague la cubeta con una pequea cantidad de solucin de P (paciente), deseche esto, y luego llenar la misma cubeta con solucin de P, poner la cubeta con la Sol. P en la cmara de la cubeta del fotocolormetro y leer la absorbancia, AP.
Figura 10.4 Etiquetar los tubos de ensayo para la prueba. B: Tubo blanco; R: Tubo de referencia; P: Tubo del paciente. A) Mezcle el contenido de cada tubo.
Figura 10.5 El calentamiento de los tubos de ensayo en un bao mara de agua a 100 C para que se forme el color rojo.
10.2.4 Resultados Clculo Calcular la concentracin de urea en la sangre de la siguiente manera1:
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Concentracin de urea (mmol/l) = (AP/AR) x C Donde: AP = Lectura de la absorbancia de la muestra del paciente AR = Lectura de la absorbancia de la urea de trabajo estndar de referencia C = concentracin de estndar de referencia de trabajo (10 mmol/l). 1El clculo dado es para unidades SI. La frmula para el clculo de las concentraciones de urea en sangre en unidades tradicionales es el siguiente: Concentracin de urea (mg/ 100ml) = concentracin de urea en (mmol/l) x 1/0,167 Rango de referencia El rango de referencia de las concentraciones de urea en la sangre es de aproximadamente 3-7 mmol / l (18-42 mg/100 ml). Valores altos Si se obtiene un valor mayor que 25 mmol/l (150 mg/100 ml), repetir toda la prueba, usando 0,1 ml de sangre completa (tratada con una solucin de sal de EDTA dipotsico), suero o plasma como en el paso 2. Realice la prueba y calcular los resultados exactamente como antes, pero el resultado se divide por dos para obtener la concentracin de urea verdadera. Mtodo enzimtico para la medicin de urea Este mtodo se viene usando desde hace mucho tiempo, y en la actualidad, su acceso es ms fcil que en dcadas anteriores. En muchas partes del planeta y en especial en los pases subdesarrollados en donde lleg a varios lugares distantes hasta en los centros perifricos de salud ms alejados. Lase los manuales de instrucciones adjuntos de un laboratorio comercial sobre las tcnicas enzimticas para urea. Fuente: www.wienerlab.com.ar
Uremia
Para la determinacin de urea en suero, plasma y orina SIGNIFICACION CLINICA La urea constituye la fraccin de nitrgeno no proteico ms importante en la mayora de los lquidos biolgicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hgado y es excretada por la orina a travs de los riones. Una elevacin de la concentracin srica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfuncin renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores sricos de urea se encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteracin en estas variables se traducir en un cambio de la concentracin de urea en suero. FUNDAMENTOS DEL METODO La ureasa descompone especficamente a la urea produciendo dixido de carbono y amonaco; ste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimtricamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: reactivo desecado conteniendo fenol y nitroferricianuro de sodio. B. Reactivo B: reactivo concentrado de hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio. S. Standard: solucin de urea 0,60 g/l. Concentraciones finales fenol ................................................................... 532 mmol/l nitroferricianuro de sodio ................................. 0,85 mmol/l hipoclorito de sodio .......................................... 36,6 mmol/l hidrxido de sodio ............................................. 0,625 mol/l REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Ureasa de Wiener lab.: solucin estabilizada y tamponada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A; preparacin: - 100 determinaciones: disolver con 95 ml de agua destilada. Mezclar por inversin hasta disolucin completa. Fechar. - 500 determinaciones: disolver con 475 ml de agua destilada. Mezclar por inversin hasta disolucin completa. Fechar. Reactivo B; preparacin: - 100 determinaciones: disolver con 80 ml de agua destilada. Mezclar por inversin hasta disolucin completa. Fechar. - 500 determinaciones: disolver con 400 ml de agua destilada. Mezclar por inversin hasta disolucin completa. Fechar. Standard: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Reactivo A: nocivo. R20/22: nocivo por inhalacin y por ingestin. S24/25: evtese el contacto con los ojos y la piel. S26/ 28: en caso de contacto con la piel y los ojos, lvese inmediatamente con abundante agua y acdase a un mdico. Reactivo B: irritante. R36/38: irrita los ojos y la piel. S26/28: en caso de contacto con ojos y piel, lvense inmediatamente y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S37/39: usar guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivos A y B: una vez reconstituidos son estables 1 ao en refrigerador (2-10oC) y al abrigo de la luz, a partir de la fecha de su preparacin. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Las contaminaciones con vapores amoniacales producen deterioro de los reactivos. Lecturas del Blanco > 0.150 D.O. indican contaminacin con amonaco, en tal caso desechar. Deben emplearse distintas pipetas para los Reactivos A y B y no deben intercambiarse las tapas de los frascos, ya que la contaminacin de un reactivo con el otro produce su deterioro definitivo. MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recoleccin: obtener de la manera usual. b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Sustancias interferentes conocidas: - Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la accin de la ureasa.
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- La hemlisis intensa puede producir resultados falsamente elevados que no sobrepasan el 5%. Esta interferencia puede corregirse con un Blanco de suero. - No se observan interferencias por hemlisis ligeras o moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/l. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en suero o plasma es estable varios das en refrigerador o 6 meses en congelador, sin agregado de conservantes. En orinas de pH < 4 es estable 4-5 das en refrigerador (2-10oC). MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro - Micropipetas y pipetas - Bao de agua a 37oC - Reloj o timer CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 540 nm - Temperatura de reaccin: 37oC - Tiempo de reaccin: 20 minutos - Volumen de reaccin: 12 ml - Volumen de muestra: 20 ul PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN SUERO O PLASMA En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido) colocar 1 2 gotas de agua y agregar: B Standard Suero o plasma Ureasa 1 gota S 20 ul 1 gota D 20 ul 1 gota
Densidad hasta 1,015 ................................ diluir 1/10 Densidad de 1,016 a 1,025 ........................ diluir 1/20 Densidad mayor de 1,025 .......................... diluir 1/40 Como la orina contiene cantidades variables de amonaco debe efectuarse un Blanco de orina (BD). Este Blanco se ejecuta igual que el Blanco de Reactivo (B), con la diferencia que, luego de agregar el Reactivo A y antes del B, se agregan 20 ul de la dilucin de orina. Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivos (B) y leer el Standard (S), el Blanco de orina (BD) y el Desconocido (D). ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin final es estable 12 horas, por lo que la absorbancia debe ser leda en ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS Suero o plasma Urea (g/l) = D x factor factor = 0,60 g/l S 0,28 g/l S
BUN (g/l) = D x factor Orina Urea (g/l) = (D-BD) x 0,60 S
factor =
x dilucin
Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37oC. Luego agregar: Reactivo A Reactivo B 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
METODO DE CONTROL DE CALIDAD Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de urea, con cada determinacin. En el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina. CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Urea (g/l) x 16,67 = Urea (mmol/l) BUN (mg/dl) x 0,357 = Urea (mmol/l) VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma Sobre un total de 1700 individuos de ambos sexos, con edades comprendidas entre los 20 y 45 aos, concurrentes al consultorio externo de un servicio hospitalario en la zona de Rosario (Argentina) sin patologa renal manifiesta (con control de diuresis y densidad urinaria), el 95% de los valores de uremia en suero estuvo comprendido entre 0,20 g/l y 0,45 g/l. Orina Normalmente, la eliminacin de urea est sujeta a grandes variaciones dependientes de la dieta. Por trmino medio, y con una dieta mixta corriente, se excretan unos 30 g en 24 horas, con oscilaciones comprendidas entre 20 g y 40 g.
Mezclar por agitacin suave e incubar 5 minutos a 37oC. Luego agregar: Agua destilada 10 ml 10 ml 10 ml
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 10 minutos leer en fotocolormetro con filtro verde (510550 nm) o en espectrofotmetro a 540 nm, llevando a cero con el Blanco. II- TECNICA EN ORINA Se sigue la misma tcnica que para sangre utilizando orina diluida con agua o solucin fisiolgica. Como el contenido de urea est relacionado con la densidad, es conveniente diluir segn el siguiente esquema:
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Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Evitar contaminaciones con amonaco provenientes del ambiente (humo de cigarrillo, vapores amoniacales). PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultneamente replicados de una misma muestra, se obtuvo: Nivel 0,36 g/l 1,02 g/l D.S. 0,016 g/l 0,035 g/l C.V. 4,4 % 3,4 %
C
V
X
H l

Cont.
b) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de urea a distintos sueros, se obtuvo una recuperacin entre 94,7% y 101,3%. c) Rango dinmico: cuando el resultado obtenido sobrepasa los 1,5 g/l de urea, debe diluirse la solucin final 1/3 empleando como diluyente Blanco de Reactivos y efectuando la lectura luego de 10 minutos de efectuada la dilucin. El resultado obtenido debe multiplicarse por la dilucin efectuada. d) Sensibilidad analtica: depende del fotmetro empleado y de la longitud de onda. En espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, para un A de 0,001 el mnimo cambio de concentracin detectable ser de 0,003 g/l. PRESENTACION - 100 determinaciones (Cd. 1810057) - 500 determinaciones (Cd. 1810058) Wiener lab. provee separadamente: - Ureasa x 100 determinaciones (Cd. 1810054) - Ureasa x 500 determinaciones (Cd. 1810055) - Ureasa x 3000 determinaciones (Cd. 1810061) BIBLIOGRAFIA - Stegemann, H.; et al. - Z. Physiol. Chem. 329:241 (1962). - Fawcett, J. K.; Scott, J. E. - Brit. J. Clin. Path. 13:156 (1960). - Searcy, R. L. et al. - Am. J. Med. Techn. 27:255 (1961). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
G
F
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Xi
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Calibr.
b b c h

Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Disp. N: 252/75-145/99
Wiener lab.
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C
SIGNIFICACION CLINICA La urea constituye la fraccin de nitrgeno no proteico ms importante en la mayora de los lquidos biolgicos. En el hombre es el principal producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hgado y es excretada por la orina a travs de los riones. Una elevacin de la concentracin srica de urea, se interpreta generalmente como una posible disfuncin renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores sricos de urea se encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier alteracin en estas variables se traducir en un cambio de la concentracin de urea en suero. FUNDAMENTOS DEL METODO La ureasa descompone especficamente la urea produciendo dixido de carbono y amonaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: solucin concentrada conteniendo buffer fosfatos 200 mmol/l, cido saliclico 750 mmol/l, nitroprusiato de sodio 20 mmol/l y EDTA 10 mmol/l. B. Reactivo B: solucin concentrada de hipoclorito de sodio 10 mmol/l en hidrxido de sodio 0,1 mol/l. C. Reactivo C: ureasa 75 U/ml en solucin glicerinada. S. Standard: solucin de urea 0,60 g/l (28,04 mg/dl de BUN). REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A; preparacin: diluir 1 parte del Reactivo A concentrado + 4 partes de agua destilada. Reactivo B; preparcin: diluir 1 parte del Reactivo B concentrado + 4 partes de agua destilada. Reactivo A+C: se prepara agregando 4 ml de Reactivo C cada 100 ml de Reactivo A. Pueden prepararse otras cantidades mientras se respete la proporcin indicada. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
Urea color
Para la determinacin de urea en lquidos biolgicos Reactivo B: irritante. R36/38: Irrita los ojos y la piel. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S37/39: sense guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivos A y B: estables durante 1 ao a partir del momento de su preparacin conservados en refrigerador (2-10oC). La mezcla de Reactivo A+C es estable durante 20 das en refrigerador (2-10oC) a partir del momento de su preparacin. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Valores de Blanco superiores a 0,150 D.O. son indicio de deterioro de los reactivos. En tal caso desechar. MUESTRA Suero, plasma u orina a) Recoleccin: obtener de la manera usual. b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Sustancias interferentes conocidas: - Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la accin de la ureasa. - No se observan interferencias por hemlisis ligeras o moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/l. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en suero es estable varios das en refrigerador (2-10oC) o 6 meses en congelador, sin agregado de conservadores. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC (opcional). - Reloj o timer. CONDICIONES DE REACCION - Temperatura de reaccin: 37oC o temperatura ambiente. - Tiempo de reaccin: 10 minutos a 37oC o 20 minutos a temperatura ambiente. - Volumen de reaccin: 2 ml - Volumen de muestra: 10 ul
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PROCEDIMIENTO I) TECNICA PARA SUERO O PLASMA En tres tubos marcados B (Blanco), D (Desconocido) y S (Standard) colocar: B Standard Suero o plasma Reactivo A+C 1 ml S 10 ul 1 ml D 10 ul 1 ml
CONVERSION DE UNIDADES AL SISTEMA SI Urea (g/l) x 16,67 = Urea (mmol/l) BUN (mg/dl) x 0,357 = Urea (mmol/l) VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: 0,10 - 0,50 g/l Este rango se obtuvo de 120 muestras de individuos en ayunas, pertenecientes a ambos sexos, con edades comprendidas entre 20 y 45 aos, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina), sin sntomas de disfuncin renal u otra enfermedad aparente. Orina: normalmente, la eliminacin de urea est sujeta a grandes variaciones dependientes de la dieta. Por trmino medio, y con una dieta mixta corriente, se excreta unos 30 g en 24 horas, con oscilaciones comprendidas entre 20 g y 40 g. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando simultneamente replicados de una misma muestra en un mismo da se obtienen los siguientes resultados: Nivel 0,60 g/l 2,28 g/l D.S. 0,008 g/l 0,045 g/l C.V. 1,32 % 1,97 %
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37oC o 10 minutos a temperatura ambiente. Luego agregar: Reactivo B 1 ml
o
1 ml
1 ml
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37 C o 10 minutos a temperatura ambiente. Leer en espectrofotmetro a 570 nm o en fotocolormetro con filtro naranja (560-580 nm). II) TECNICA PARA ORINA Se sigue la misma tcnica que para suero o plasma utilizando orina diluida con agua o solucin fisiolgica. Como el contenido de urea est generalmente relacionado con la densidad, es conveniente diluir segn el siguiente esquema: Densidad hasta 1,015 .................................... diluir 1/10 Densidad de 1,016 a 1,025 ........................... diluir 1/20 Densidad mayor de 1,025 .............................. diluir 1/40 Como la orina contiene cantidades variables de amonaco debe efectuarse un Blanco de orina (BD). Dicho Blanco se ejecuta igual que el Blanco de reactivos (B), con la diferencia que, despus de agregado el Reactivo B, se agregan 10 ul de la dilucin de orina. Llevar el aparato a cero con el Blanco de Reactivos (B) y leer el Standard (S), el Blanco de orina (BD) y desconocido (D).
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable durante 2 horas por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso. CALCULO DE LOS RESULTADOS Suero o plasma: 0,60 g/l Urea g/l = D x factor Orina: (D - BD) x 0,60 g/l Urea g/l = S METODO DE CONTROL DE CALIDAD Si la muestra a ensayar es suero, procesar 2 niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con concentraciones conocidas de urea, con cada determinacin. En el caso de muestras de orina, utilizar un control con base de orina.
x dilucin
b) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 2,50 g/l. Si las lecturas resultan muy altas para el aparato empleado pueden utilizarse 1,5 ml de cada Reactivo y 10 ul de muestra para obtener la linealidad mencionada. Cuando la concentracin de urea supera los 2,50 g/l o est por encima de la linealidad del aparato, puede diluirse la reaccin final con el blanco. En estas condiciones es lineal hasta 5 g/l. c) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de urea a diferentes alcuotas de la misma muestra se obtuvo una recuperacin entre 94,2 y 100,6%. d) Sensibilidad analtica: depende del fotmetro empleado y de la longitud de onda. En espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, para un A de 0,001 el mnimo cambio de concentracin detectable ser de 0,0125 g/l. PRESENTACION Equipo para 500 determinaciones (Cd. 1810050). BIBLIOGRAFIA - Kim, H.S.; et al. - J. Korean Agr. Chem. Soc. 2:23 (1961). - Stergermann, H. et al. - Z. Physiol. Chem. 329:241 (1962). - Fawcett, J.K. et al. - Brit. J. Clin. Path. 13:156 (1960). - Searcy, R.L. et al. - Am. J. Med. Techn. 27:255 (1961). - Patton, C.J. et al. - Analytical Chem. 49/3:464 (1977). - Lorenzo, L.; Setta, F.; Demara, I. - Evaluacin de un mtodo de Berthelot modificado para dosar urea - Revista ABA 55/2:76 (1991). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
factor = S
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Smbolos
C
P V X H l
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Xn
Elaborado por:
Nocivo
Corrosivo / Castico

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Calibr.
!
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Cont.
Calibrador
No congelar
Riesgo biolgico
Contenido
Nmero de lote
b b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Nmero de catlogo

Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Disp. N: 184/90-5266/98
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11. TCNICAS INMUNOLGICAS Y SEROLGICAS

Muchas de las tcnicas de diagnstico utilizadas en inmunologa se basan en el hecho que los antgenos y anticuerpos interactan, esto es, la interaccin entre el antgeno y el anticuerpo. La mayora de las enfermedades infecciosas se diagnostican mediante aislamiento e identificacin del microorganismo infeccioso en una muestra del paciente. En algunos casos, los microorganismos son difciles de cultivar y aislar o pueden requerir tcnicas especiales y, a menudo caras que no estn disponibles para el diagnstico rutinario. En otros trastornos inmunolgicos no hay microorganismo per se para identificar o aislar. Tambin hay algunas enfermedades inmunes "naturales" que se producen, a menudo clasificadas como enfermedades autoinmunes, que no son causadas por un microorganismo, pero pueden ser detectadas por algunas de las tcnicas de diagnstico empleadas en inmunologa. Varias de estas tcnicas detectan productos metablicos especficos o anticuerpos y antgenos especficos. En aquellos estados patolgicos en los que haya un microorganismo, estas pruebas inmunolgicas no detectan el microorganismo directamente, pero proporcionan una evidencia de su presencia. Se describen una serie de tcnicas de diagnstico basadas en reacciones biolgicas utilizando interacciones antgeno-anticuerpo. Est ms all del alcance de este manual entrar en detalles sobre el sistema inmunolgico. El objetivo es introducir algunos conceptos y terminologa en general del sistema inmunolgico, lo que ayudar en la comprensin de algunas de las tcnicas inmunolgicas descritas. Tenga en cuenta que las diversas metodologas estn disponibles para diferentes propsitos de diagnstico, la eleccin debe basarse en la pregunta y de la disponibilidad de las instalaciones. Las tcnicas de diagnstico que se describen aqu son los que se utilizan con ms frecuencia como una ayuda en el diagnstico de ciertas enfermedades que causan una reaccin inmunolgica. 11.1 INTRODUCCIN A LA INMUNOLOGA El papel del sistema inmune es la defensa. El sistema inmune tiene ambos mecanismos no especficos y especficos para reconocer y responder en consecuencia a microorganismos extraos y potencialmente patgenos. Las defensas no especficas son barreras fsicas o mecnicas, por ejemplo, la piel y las membranas mucosas. Estas barreras estn ah para evitar la entrada de agentes patgenos en el cuerpo. Estas barreras suelen funcionar muy bien, pero algunos patgenos logran entrar en el cuerpo donde son destruidos inmediatamente por los fagocitos como los macrfagos. Cuando los microorganismos patgenos entran en el cuerpo se activan los mecanismos de defensa especficos. Los mecanismos especficos se dividen en el humoral (mediado por anticuerpos) y los sistemas mediados por clulas o celular. El sistema humoral se asocia con las clulas conocidas como linfocitos B, que son los precursores de las clulas plasmticas. Las clulas plasmticas producen y secretan sustancias proteicas conocidas como anticuerpos o inmunoglobulinas. El sistema mediado por clulas est asociado con linfocitos T que pueden procesar y destruir cuerpos extraos. 11.1.1 Anticuerpos Los anticuerpos se encuentran en el suero, leche, saliva, lgrimas, orina y otros fluidos corporales. En los recin nacidos, la produccin de anticuerpos est virtualmente ausente y la proteccin es proporcionada por los anticuerpos maternos principalmente a travs de la leche materna y los que cruzan la placenta. Un nio en crecimiento est constantemente expuesto a varios antgenos ambientales los que promueven la produccin de anticuerpos. En los seres humanos hay cinco clases principales de anticuerpos o inmunoglobulinas: Ig G, Ig M, Ig A, Ig E e Ig D. Estas protenas difieren en su movilidad electrofortica, la masa molecular relativa, estructura antignica, coeficiente de sedimentacin, la forma y otras propiedades. Todas las inmunoglobulinas tienen una estructura compuesta de cuatro cadenas polipeptdicas con dos cadenas largas o pesadas (H) y dos cadenas cortas o livianas (L) (Fig. 11.1). Dentro de estas cadenas H y L hay regiones conocidas como regiones constantes, en donde las secuencias de aminocidos son regiones muy similares, y regiones variables (por lo general en los extremos de las cadenas), en donde las secuencias de aminocidos son altamente variables. Las regiones variables dan a los diferentes anticuerpos su especificidad.
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11.1.2 Antgenos Los antgenos son molculas (usualmente protenas) que pueden provocar una respuesta inmune. Los antgenos tienen sitios en su estructura conocidos como determinantes antignicos que pueden ser reconocidos por los anticuerpos. Los antgenos pueden tener varios determinantes antignicos de diferente configuracin o varios de la misma configuracin tal que los anticuerpos de la misma clase o de diferentes tipos pueden unirse a estos sitios. Varias propiedades pueden influir en la inmunogenicidad de un antgeno, los cuales se describen brevemente a continuacin. Reconocimiento del antgeno como una sustancia extraa La propiedad ms importante de un antgeno es la que permite que el cuerpo reconozca la sustancia como extraa. El sistema inmune de un individuo es normalmente capaz de distinguir las sustancias que pertenecen al cuerpo de las que no lo hacen (discierne lo propio de lo que no es propio o extrao). Ciertas condiciones incapacitan el mecanismo de auto-tolerancia y el sistema comienza a reaccionar en contra de s mismo. Masa molecular relativa La masa molecular relativa o el tamao de un antgeno tambin afecta su inmunogenicidad. Como regla general, las molculas grandes son buenos antgenos (es decir, que son eficaces en la generacin de una respuesta inmune), siempre que sean extraas al organismo. Las molculas pequeas normalmente son antgenos pobres (poca o nula induccin de anticuerpos o capacidad inmunognica). Complejidad Cuanto ms compleja sea la molcula, mejor ser la respuesta inmune al antgeno. Las protenas complejas hacen "mejores" antgenos que los polmeros repetitivos de hidratos de carbono, lpidos y cidos nucleicos. Estabilidad Es esencial para el antgeno ser estable para que pueda ser reconocido por el sistema inmune. Degradabilidad La sustancia debe ser degradable. Con el fin de iniciar una respuesta inmune, el sistema inmune debe ser capaz de procesar la sustancia. La va de administracin y la dosis de antgeno Los antgenos deben ser administrados correctamente. Algunas sustancias provocan una respuesta inmune si se administran por va subcutnea, pero no si se administran por va intravenosa. La dosis correcta es tambin importante, ya que demasiado antgeno o muy poco antgeno puede no provocar la respuesta inmune deseada. 11.1.3 Interacciones antgeno-anticuerpo La unin entre un antgeno y un anticuerpo puede ser comparado con el ajuste exclusivo que existe entre una cerradura y su llave. El determinante antignico (la "cerradura") tiene una conformacin predeterminada y slo un anticuerpo especfico (la "llave") con las regiones variables adecuadas (ranuras y contornos) dar un ajuste perfecto. Sin embargo, la situacin no siempre es tan clara. A veces, un antgeno se combina (mal o deficientemente) con un anticuerpo que se ha producido contra un antgeno diferente, causando la reactividad cruzada. Para evitar estas interacciones no deseadas, es importante conocer y definir la sensibilidad y especificidad analtica de los ensayos inmunolgicos basados en reacciones anticuerpo-antgeno. La sensibilidad analtica de un ensayo inmunolgico se refiere a su capacidad para detectar pequeas cantidades de antgeno o anticuerpo. Se utiliza como sinnimo para el lmite de deteccin. La especificidad analtica de un ensayo inmunolgico es su capacidad para medir slo la sustancia que pretende medir.1 Estas consideraciones son importantes, sobre todo cuando se elige una nueva prueba. Otras consideraciones incluyen: Aplicabilidad en un entorno de laboratorio determinado, el costo y disponibilidad, nivel de experiencia requerido, velocidad y simplicidad. 1La sensibilidad y especificidad analtica de un ensayo inmunolgico no deben confundirse con la sensibilidad y especificidad diagnstica tal como se define para discriminar entre las poblaciones de enfermos y no enfermos. 11.2 PRINCIPIO
DE LAS TCNICAS INMUNOQUMICAS
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Las reacciones antgeno-anticuerpo se pueden clasificar en tres grupos: Las reacciones de unin primaria, secundaria y terciaria. Slo se describen aqu las reacciones de unin primaria y secundaria. Las reacciones terciarias siguen reacciones secundarias y por lo general se presentan In vivo. 11.2.1 Ensayos de unin primaria Este grupo de pruebas proporciona una medida directa de la reaccin de unin inicial entre un antgeno y un anticuerpo. Este es un mtodo muy sensible para el cual se necesita una marca para detectar la reaccin de unin. Tales ensayos incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimticos y ensayos de inmunofluorescencia. Radioinmunoensayo En un radioinmunoensayo, ya sea un antgeno o un anticuerpo se conjuga con una substancia de marcado radiactivo y se mide la radiactividad con un contador de centelleo (Fig. 11.2). Este tipo de ensayo es cada vez menos comn, en parte debido a la necesidad de sustancias radiactivas y tambin debido a que el equipo de medicin requerido es difcil de usar. Aparte de ser muy caro.
Inmunoensayo enzimtico En un inmunoensayo enzimtico, un antgeno o un anticuerpo se conjugan con una enzima marcada y un cambio de color se produce por la reaccin de la enzima con su sustrato. Este cambio se puede detectar visualmente o con un espectrofotmetro. El tipo de unin puede ser ya sea competitivo o no competitivo. La unin competitiva depende de la competencia entre un antgeno marcado (de cantidad conocida) y un antgeno no marcado (de cantidad desconocida) para el mismo anticuerpo (al medir el antgeno) o entre un anticuerpo marcado (de cantidad conocida) y un anticuerpo no marcado (de cantidad desconocida) para el mismo antgeno (cuando se mide el anticuerpo) (Fig. 11.3). La cantidad de unin del antgeno marcado (o anticuerpo) se relaciona con la cantidad de antgeno no marcado (o anticuerpo) presente. En la unin no competitiva (tcnica de sndwich), el antgeno o anticuerpo es adsorbido (o inmovilizado) a una fase slida, que puede ser una partcula insoluble (perla) o los lados de un tubo de ensayo o la parte inferior de una placa de microtitulacin. A continuacin, se aade la muestra de ensayo que contiene el anticuerpo o antgeno correspondiente. Un anticuerpo o antgeno marcado (conjugado) se aade al ltimo para formar la capa superior del sndwich (Fig. 11.4). Cuando se prueba para un anticuerpo, el conjugado contendra anti-inmunoglobulina y cuando se prueba para un antgeno, el conjugado contendra un anticuerpo especfico para ese antgeno. La cantidad de unin del conjugado est directamente relacionada con la cantidad de antgeno o anticuerpo en la muestra de ensayo y slo la porcin ligada o unida se mide en este ensayo. Un ejemplo de esta tcnica es el ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA). Las enzimas utilizadas en el ELISA incluyen peroxidasa de rbano, fosfatasa alcalina, lisozima y galactosidasa. Los inmunoensayos enzimticos estn reemplazando a muchos radioinmunoensayos debido a sus ventajas con respecto a este ltimo, que incluyen tiempo de conservacin del reactivo ms largo, equipo ms barato y ms simple, no hay normas restrictivas para la eliminacin de reactivos (no hay reactivos radiactivos), y los reactivos son ms seguros. - ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay
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Inmunofluorescencia Los colorantes fluorescentes tales como el isotiocianato de fluorescena y el isotiocianato de tetrametilrodamina se pueden acoplar a los anticuerpos sin destruir su especificidad. La fluorescencia se produce cuando las molculas que han sido excitadas a un estado energtico superior retornan a su estado normal de energa. El exceso de energa se libera en forma de luz. Un microscopio de fluorescencia, que es un microscopio ptico modificado, se utiliza para visualizar la luz emitida. Se pueden utilizar dos tipos de tcnica de inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia directa La inmunofluorescencia directa se utiliza cuando se ensaya un antgeno. En esta tcnica un colorante fluorescente est unido a la porcin aislada de un antisuero que contiene anticuerpos dirigidos contra un componente especfico de clulas o de un tejido. El antisuero se aplica directamente a la muestra de tejido. El antgeno y el anticuerpo reaccionan, a continuacin, la muestra de tejido se lava. La muestra de tejido se examina bajo el microscopio de fluorescencia y se ve en donde el anticuerpo se une al antgeno (Fig. 11.5).
Inmunofluorescencia indirecta La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para determinar si los anticuerpos estn presentes en el suero de un paciente. El suero se aplica directamente a una muestra de tejido apropiado que contiene un antgeno dirigido contra el anticuerpo especfico bajo investigacin. El antgeno y el anticuerpo reaccionan, a continuacin, la muestra de tejido se lava. Se aade una antiinmunoglobulina con una marca fluorescente y posteriormente la muestra de tejido se incuba, antes de ser lavadas de nuevo. La anti-inmunoglobulina marcada se unir a cualquier anticuerpo ya unido al antgeno en la muestra de tejido y se observa bajo el microscopio como reas de fluorescencia (Fig. 11.6). El mtodo indirecto es ms sensible que el mtodo directo, ya que se amplifica, en el sentido que cada anticuerpo no marcado puede ser ligado por dos anticuerpos marcados.
372
11.2.2 Ensayos de unin secundaria Los ensayos de unin secundarias permiten manifestaciones visibles despus de la reaccin primaria que se observa. En estas pruebas uno puede ver los efectos de la unin sin la ayuda de una marca adicional. Estas pruebas incluyen la aglutinacin, la precipitacin, las reacciones dependientes del complemento y los mtodos de neutralizacin. Los mtodos de aglutinacin y precipitacin se emplean de forma rutinaria para fines de diagnstico. Estos mtodos se describen brevementeacontinuacin. Aglutinacin La aglutinacin implica la reaccin de un anticuerpo con un antgeno particulado (insoluble) que conduce a la formacin de grumos visibles de estas partculas (Fig. 11.7). La interaccin de los antgenos de superficie y anticuerpos dirigidos contra ellos conduce a la reticulacin de las partculas adyacentes, por ejemplo, bacterias, para formar un entramado o retculo de las clulas aglutinadas.
Aglutinacin activa (directo) Aglutinacin activa implica determinantes antignicos que son un componente intrnseco de la partcula, por ejemplo, reacciones de hemaglutinacin utilizadas para la determinacin del grupo sanguneo. Los anticuerpos especficos reaccionan con antgenos de la superficie del hemate dando una aglutinacin visible macroscpicamente sin necesidad del agregado de partculas extra para observar la aglutinacin. Aglutinacin pasiva (indirecta) Aglutinacin pasiva implica determinantes antignicos que no son un constituyente intrnseco de la partcula. Un antgeno soluble se combina con partculas insolubles, tales como los eritrocitos. Los eritrocitos normalmente se tratan con cido tnico, que altera sus propiedades superficiales de modo que el antgeno pueda unirse firmemente a la superficie del eritrocito. Otras partculas insolubles incluyen bacterias, carbn, bentonita (arcilla) y ltex de polivinilo donde el antgeno es simplemente adsorbido. Las titulaciones semicuantitativas pueden llevarse a cabo para determinar la cantidad de anticuerpo presente en una muestra. Un volumen constante de partculas en suspensin (antgeno) se aade a un volumen constante de antisuero diluido en serie. La presencia de anticuerpos en el suero causa aglutinacin de las partculas (Fig. 11.8) y la reaccin por lo general se califica en una escala de 0 a 4 +. El contenido de anticuerpos se expresa como un ttulo: La inversa de la dilucin final de antisuero capaz de producir una aglutinacin visible.
373
Inhibicin de la aglutinacin La inhibicin de la aglutinacin se utiliza para determinar la presencia de antgeno. Este ensayo se basa en la competencia entre partculas y antgeno soluble por los sitios de unin del anticuerpos. El anticuerpo y la muestra de ensayo se dejan reaccionar juntos. Si el antgeno soluble est presente en la muestra, el anticuerpo reacciona con l y no est libre para reaccionar con otro an ms despus de la adicin posterior de partculas de indicador o clulas. Por lo tanto, la ausencia de aglutinacin con una muestra bajo investigacin indica un resultado positivo de la prueba. Un ejemplo de este tipo de ensayo es la deteccin de gonadotrofina corinica humana (hCG) utilizado en el ensayo para la confirmacin del embarazo y tambin en ciertas condiciones patolgicas en las que los niveles de hCG son importantes (Fig. 11.9).
Precipitacin A diferencia de las reacciones de aglutinacin en las que el antgeno est particulado (insoluble), en las reacciones de precipitacin es la interaccin entre un anticuerpo soluble y un antgeno soluble. Si un anticuerpo soluble se incuba con un antgeno soluble, los complejos de anticuerpo y antgeno se entrecruzan y forman un precipitado. Los mtodos de precipitacin puede ser cuantitativos o cualitativos y las interacciones son dependientes de la fuerza inica, pH y concentracin. Una curva cuantitativa de precipitina se puede preparar en la que la proporcin de antgeno y anticuerpo determina la extensin de la reticulacin o entrecruzamiento y la precipitacin. La curva muestra las siguientes caractersticas (Fig. 11.10): La zona de equivalencia en la que las proporciones de antgeno y anticuerpo son equivalentes. La zona de exceso de anticuerpos en la que todos los determinantes antignicos disponibles estn limitados por las molculas de anticuerpos individuales, dejando un poco de molculas de anticuerpo no unido. La zona de exceso de antgeno en la que todos los sitios de unin al antgeno de un anticuerpo estn unidos con molculas de antgenos individuales, dejando algunas molculas de antgeno sin unir.
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Varias otras tcnicas inmunolgicas emplean la reaccin de precipitacin en una forma u otra. Estas incluyen a la nefelometra, la turbidimetra, la inmunodifusin radial (tcnica de Mancini), la doble difusin (Ouchterlony) y algunas tcnicas de inmunoelectroforesis.
Nefelometra y turbidimetra La nefelometra y turbidimetra implican la medicin de la dispersin de la luz y las propiedades de absorcin de la luz, respectivamente, de los complejos antgeno-anticuerpo. Estas tcnicas se utilizan para medir las concentraciones de protenas y frmacos en el suero o el lquido cefalorraqudeo. Los ensayos son rpidos y sensibles. Una cantidad excesiva y constante de anticuerpo se incuba con un antgeno en una cubeta. En la nefelometra la luz pasa a travs de la cubeta y se mide la dispersin producida por los complejos antgeno-anticuerpo que se han formado. La concentracin de antgeno se determina a partir de una curva estndar realizada por la medicin de la dispersin de la luz producida por una serie de soluciones de concentraciones conocidas de antgeno. En algunos ensayos, se aaden polmeros para acelerar la formacin de complejos antgeno-anticuerpo. En la turbidimetra la luz pasa a travs de la cubeta y se mide la absorcin producida por los complejos antgeno-anticuerpo que se han formado. Un fotmetro convencional se puede utilizar para este propsito. Inmunodifusin radial (Tcnica de Mancini) La inmunodifusin radial se basa en el principio de que existe una relacin cuantitativa entre la cantidad de antgeno colocado en un pocillo cortado en un gel de agarosa que contiene anticuerpo y el dimetro del anillo resultante de precipitado. La concentracin de antgeno es proporcional al cuadrado del dimetro del anillo de precipitado. La concentracin de muestras desconocidas se calcula con la ayuda de una curva estndar que se prepara mediante el trazado del (dimetro)2 (dimetro elevado al cuadrado) del anillo de precipitado resultante producido por una serie de soluciones de antgeno de concentracin conocida (Fig. 11.11). Esta tcnica se puede utilizar para la medicin cuantitativa de los factores del complemento e inmunoglobulinas.
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11.3 DETERMINACIN
LTEX
DE LOS FACTORES REUMATOIDES MEDIANTE LA TCNICA DE AGLUTINACIN DE
11.3.1 Materiales y reactivos Placas de ensayo (preferiblemente con un fondo oscuro) varillas de agitacin, palillos de madera de color naranja o un rotador Tubos de ensayo, 5 ml Gradilla Micropipetas Reactivo de factor reumatoide en ltex (FR) (suspensin acuosa de partculas de ltex recubiertas con Ig G humana) Sueros de control Negativo y positivo Cloruro de Sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). Los materiales y reactivos mencionados anteriormente se suministran por lo general como parte de un kit de ensayo comercial. # Kit: Sinnimo de equipo 11.3.2 Mtodo 1. Coloque la muestra, los sueros de control para FR y el reactivo de ltex a temperatura ambiente. 2. Diluir la muestra y el control de los sueros 1:5 con solucin de cloruro de sodio. 3. Aplicar una gota de cada dilucin a las placas de ensayo. 4. Agitar el vial del reactivo FR ltex y aadir una gota de cada una de las muestras sobre las placas de ensayo. 5. Mezclar bien con las varillas de agitacin o los palillos naranjas (una para cada muestra) y girar las placas suavemente (unas 10 veces), o coloque las placas en un rotador. 6. Despus de 2 minutos, examine las placas y comparar las reacciones de los sueros de ensayo con los de los sueros de control (Fig. 11.12). 7. Si algunos sueros son positivos, repita los pasos 3-6, utilizando una dilucin 1:2. La dilucin ms alta de suero que produzca la aglutinacin es el ttulo
11.4 PRUEBAS
PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI -ESTREPTOLISINA
11.4. 1 Prueba para la Anti-estreptolisina O (ASO, AELO)
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La estreptolisina O es una toxina producida por los estreptococos hemolticos. La prueba antiestreptolisina O (AELO o ASO) es la prueba de laboratorio ms comnmente utilizada para el seguimiento de una infeccin estreptoccica y sus secuelas (fiebre reumtica y glomerulonefritis post estreptoccica aguda). Ahora estn disponibles otras metodologas, pero la prueba para AELO "estndar" se basa en el hecho que la estreptolisina O destruye a los eritrocitos humanos o a los de oveja a menos que sea neutralizada por los anticuerpos anti-estreptolisina O presentes en el suero del paciente. Una unidad de estreptolisina O es la cantidad mnima de estreptolisina O que lisan 0,5 ml de una suspensin de eritrocitos de oveja recin preparada al 5% cuando se incuba durante 1 hora a 37 C. Una unidad Todd se define como la cantidad de anticuerpo anti-estreptolisina O que va a neutralizar 0,5 unidades de estreptolisina O. Principio La prueba se lleva a cabo mediante la incubacin de una cantidad constante y estandarizada de estreptolisina O con diluciones en serie de suero (que contiene anticuerpos antiestreptolisina O) a 37 C del paciente, inactivados con calor durante 15 minutos. Una suspensin recin preparada al 5% de eritrocitos de oveja se aade a todos los tubos y la incubacin se contina durante otros 45 minutos. Despus de la centrifugacin a 500 g, la dilucin ms alta de suero del paciente que todava tiene un sobrenadante claro (sin hemlisis) es el punto final y se notifica su valor en unidades Todd (inversa de la dilucin). Esta tcnica es ms bien lenta, pero ahora estn disponibles mtodos de aglutinacin con ltex ms simples y ms rpidos (vase la seccin 11.4.2). Materiales y reactivos Matraz aforado, 1000 ml Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm Gradillas Pipetas serolgicas Bao mara Centrfuga Agua tamponada con bfer de fosfato, pH 6,8 (reactivo no. 43) Cloruro de Sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53) Suspensin de eritrocitos de oveja al 5% lavados con solucin al 0.85% de cloruro de sodio, (reactivo. N 53) Estreptolisina O reducida (las instrucciones para la preparacin de la estreptolisina O (SLO) reducida de la forma no reducida son provistos normalmente por el fabricante). Mtodo 1. Hacer tres diluciones de suero del paciente (inactivado por calentamiento a 56 C por 30 minutos) de la siguiente manera: 0,5 ml de suero + 4,5 ml de tampn fosfato = 1:10 0,5 ml de suero 1: 10 + 4,5 ml de tampn fosfato = 1: 100 1 ml de suero 1: 100 + 4 ml de tampn fosfato = 1: 500 2. A partir de estas diluciones maestras, hacer una amplia serie de diluciones como se muestra en la Tabla 11.1. Para propsitos de deteccin, utilizar slo los primeros siete tubos y los tubos de control (13 y 14). 3. Aadir 0,5 ml (equivalente a 1 unidad internacional (UI)) de estreptolisina O reducida a todos los tubos excepto al tubo 13. Mezclar e incubar en un bao mara a 37 C durante 15 minutos. 4. Aadir 0,5 ml de la suspensin al 5% de eritrocitos de oveja a cada tubo. Mezclar e incubar en un bao mara a 37 C durante 45 minutos, mezclando de nuevo despus de los primeros 15 minutos de incubacin. 5. Centrifugar los tubos suavemente a 500 g por 3 minutos y observar la hemlisis. El punto final es el ltimo tubo (es decir, la dilucin ms alta) que no muestra la hemlisis. El tubo de control 13 no debe mostrar hemlisis. Si hay hemlisis en este tubo debe repetirse la prueba. El tubo de control 14 debe mostrar hemlisis completa. Tabla 11.1 Preparacin de series de dilucin para la prueba de antiestreptolisina O (AELO) Volumen Volumen del Volumen del de la Volumen del suero del Dilucin bfer para Tubo bfer para suspensin paciente (inactivado) (ml), del suero estreptolisina nmero estreptolisina al 5% de diluido: resultante O reducida O (ml) eritrocitos (ml) de oveja 1:10 1:100 1:500 1 0.8 ----0.2 1:12.5 0.5 0.5 2 0.2 ----0.8 1:50 0.5 0.5 3 --1.0 --0.0 1:100 0.5 0.5 4 --0.8 --0.2 1:125 0.5 0.5 5 --0.6 --0.4 1:167 0.5 0.5 6 --0.4 --0.6 1:250 0.5 0.5 7 --0.3 --0.7 1:333 0.5 0.5 8 --1.0 0.0 1:500 0.5 0.5 9 --0.8 0.2 1:625 0.5 0.5 10 --0.6 0.4 1:833 0.5 0.5 11 --0.4 0.6 1:1250 0.5 0.5 12 --0.2 0.8 1:2500 0.5 0.5 13 ----1.5 Control 0.0 0.5
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14
---
---
1.0
Control
0.5
0.5
11.4.2 Aglutinacin en ltex Materiales y reactivos Placas de ensayo Varillas de agitacin, palillos de madera o un rotador Tubos de ensayo, 5 ml Gradilla Micropipetas, 50 l Reactivo de ltex para anti-estreptolisina O: Suspensin de partculas de ltex recubiertas con estreptolisina O Suero de control negativo Sueros control positivo (uno fuertemente positivo y otro dbilmente positivo) Cloruro de Sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). Lmpara de iluminacin Mtodo 1. Llevar los reactivos, los sueros de control y los sueros de ensayo a temperatura ambiente. 2. Aplicar una gota de cada uno de los sueros de prueba (o ensayo) y de control en las placas de ensayo. 3. Agitar el reactivo de ltex para anti-estreptolisina O para mezclarlo, aadir una gota a cada uno de los sueros de prueba y de control. 4. Mezclar bien con las varillas de agitacin o palillos de madera (una por muestra) y rotar manualmente las placas suavemente unas 10 veces, o en su lugar colocarlo en un rotador. (Generalmente durante 2 minutos.) 5. Despus de 2 minutos, examinar las placas y comparar las reacciones de los sueros de prueba con las de los controles. Una reaccin positiva se detecta por la presencia de aglutinacin. Una reaccin negativa se detecta por la ausencia de aglutinacin. 6. Si algunos sueros son positivos, repita los pasos 2-5, utilizando una dilucin 1/2. La dilucin ms alta que produzca la aglutinacin es el ttulo. La mayora de reactivos antiestreptolisina O tienen un lmite de deteccin (por ejemplo, 200 UI/ml) que por lo general se multiplica por el factor de dilucin para obtener la concentracin de suero de anti-estreptolisina O en UI/ml. 11.5 DETERMINACIN
DE
-GONADOTROFINA
CORINICA HUMANA
( -hCG)
EN LA ORINA CON LA
TCNICA DE INHIBICIN DE LA AGLUTINACIN
11.5.1 Materiales y reactivos Placas de ensayo Varillas de agitacin, palillos de madera o un rotador Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm Gradilla Anticuerpos anti--gonadotrofina corinica humana (anti--hCG) Reactivo ltex hCG (suspensin de partculas de ltex recubiertas con hCG) Control negativo Controles positivos (uno fuertemente positivo y otro dbilmente positivo). Los reactivos anteriormente mencionados se suministran habitualmente como parte de un kit de ensayo comercial. 11.5.2 Mtodo 1. Lleve las muestras de orina y los reactivos a temperatura ambiente. 2. Aadir una gota de cada una de las muestras de orina y cada uno de los controles a las placas de ensayo. 3. Aadir una gota de anticuerpo anti- -hCG para cada una de las muestras y cada uno de los controles. Mezclar con cuidado. 4. Mezclar bien la suspensin reactivo ltex hCG, aplicar una gota a las muestras de ensayo y rotar las placas o mezclar con varillas de agitacin o palillos de madera (una por muestra). 5. Despus de 3 minutos examinar las placas y comparar las reacciones de las muestras de ensayo con las de los controles. Una reaccin positiva (embarazada o -hCG presente) se detecta mediante la ausencia de aglutinacin. Una reaccin negativa (no embarazada o -hCG ausente) se indica por la presencia de aglutinacin. Anlisis semicuantitativo El anlisis semicuantitativo puede ser conveniente en algunos casos en los que la produccin de hCG pueda tener una causa patolgica. Esto puede ocurrir tanto en pacientes embarazadas y no embarazadas. Hacer una dilucin 1/2 de las muestras de orina positivas y examinar como se describe en los pasos 2-5 anteriores. La dilucin ms alta que no causa la aglutinacin es el ttulo. Los resultados de este anlisis semicuantitativo se informan en UI/ml, que se puede obtener multiplicando el factor de dilucin de la dilucin ms alta que no causa la aglutinacin por la sensibilidad o lmite de deteccin del mtodo, segn lo indicado por el fabricante. 11.6 DETERMINACIN
RADIAL CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS
IGA, IGG
IGM
POR INMUNODIFUSIN
11.6.1 Materiales y reactivos Placas de vidrio siliconadas de 8 cm x 12 cm, o placas de Petri (de vidrio o plstico)
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Cajas con tapas que cierren hermticamente Perforador con dimetro interior de 2 mm Pipetas de 5 l (o micropipetas de 5 l) Bao mara Termmetro Tubos de ensayo Gradillas Agar, solucin al 3% en agua destilada Cloruro de Sodio, 0,15 mol/l con 0,1% de azida sdica Agarosa o agar Antisuero anti IgA humana Antisuero anti IgG humana Antisuero anti IgM humana suero estndar humano que contiene: -IgA 2,0 mg/ml (123 UI/ml) -IgG de 9,5 mg/ml (110 UI/ml) -IgM 0,96 mg/ml (111 UI/ml). Los reactivos anteriormente mencionados se suministran habitualmente como parte de un kit de ensayo comercial. 11.6.2 Mtodo 1. Recubrir tantas placas de vidrio (o placas de Petri) como sea necesario (permitiendo una por paciente) con solucin al 3% de agar. 2. Calcular el volumen exacto de gel de agarosa al 1% que tiene que estar preparado para cubrir todas las placas con gel de un espesor de 1,5 mm. La frmula para el clculo de esto la siguiente:
Donde d es el dimetro de la placa (en cm). 3. Preparar 40 ml de 1% de agarosa en 0,15 mol/l de cloruro de sodio con 0,1% de azida de sodio. Disuelva la agarosa mediante la colocacin en el bao mara a 100 C. Cuando la suspensin es clara, deje que se enfre a 56 C. 4. Caliente el antisuero a 56 C en el bao mara. 5. Aadir 0,1 ml de antisuero anti IgA humana por cada 10 ml de la solucin de agarosa. Mezclar bien. 6. Verter en cada placa de vidrio (o placa de Petri) el volumen exacto de la mezcla de agarosaantisuero necesario para hacer un gel con un espesor de 1,5 mm, y permitir que solidifique a temperatura ambiente. 7. Preparar otros dos geles de agarosa ms de la misma manera: la primera con 0,2 ml de antisuero anti IgG humana por 10 ml de solucin de agarosa y el segundo con 0,13 ml de antisuero anti IgM humana por 10 ml de solucin de agarosa. 8. Haga agujeros de 2 mm de dimetro en los geles (con el perforador). 9. Preparar diluciones 1:2 del suero estndar en 0,15 mol/l de cloruro de sodio, de la siguiente manera, para la determinacin de: IgA: 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 y 1:128. IgG: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320. IgM: sin diluir, 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. 10. Preparar diluciones 1:2, 1:16 y 1:40 de los sueros de los pacientes en 0,15 mol/l de cloruro de sodio para la determinacin de IgM, IgA e IgG, respectivamente. 11. Pipetear 5 l de cada una de las diluciones del suero estndar y de los sueros de los pacientes en diferentes agujeros de los geles de agarosa correspondientes (ver pasos 6 y 7). 12. Coloque las placas en cajas bien cerradas, en un ambiente hmedo e incubarlas durante 3 das a temperatura ambiente. 13. Medir el dimetro de los anillos de precipitado (en milmetros) usando una regla. 14. Haga un grfico de las titulaciones del suero estndar. En el eje y grafique el dimetro al cuadrado de los anillos de precipitado, y en el eje x grafique las concentraciones del suero estndar (ver Fig. 11.11). 15. Usar estas curvas para leer la concentracin de IgA, IgG e IgM en los sueros de los pacientes. 11.7 PRUEBAS
PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS CONTRA EL
VIH
11.7.1 ELISA Materiales y reactivos Micropipetas Incubadora o bao mara a 37 C Lavador o una bomba de vaco Espectrofotmetro (lector) Agua destilada o desionizada Equipo de ELISA (disponible en el comercio) Sistema de soporte en fase slida, reactivos y controles. Mtodo Cada kit viene con sus propias instrucciones que se deben seguir cuidadosamente. Sin embargo, los pasos generales son como se describen a continuacin.
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1. Aadir la muestra de prueba (suero) y los controles al sistema de soporte de fase slida recubierta con antgeno e incubar a la temperatura especificada durante el tiempo correspondiente. 2. Con cuidado aspirar la muestra del sistema en fase slida y lavar para eliminar el exceso de la muestra y otras protenas. El lavado no debe eliminar los anticuerpos contra el VIH que se han adherido a la fase slida durante la incubacin. 3. Aadir la cantidad indicada de conjugado (IgG anti-humana (por lo general de cabra) ligada a enzima) y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. 4. Con cuidado aspirar el lquido de nuevo para eliminar cualquier conjugado no unido y lavar el sistema de fase slida. 5. Aadir la cantidad apropiada de sustrato e incubar siguiendo las instrucciones del fabricante. Esta es la etapa de desarrollo de color y debe protegerse de la luz. 6. Al final del periodo de incubacin, aadir la solucin de detencin (agregar el stopper). La solucin de detencin inhibe cualquier reaccin adicional entre la enzima y el sustrato. 7. Leer los resultados en un espectrofotmetro a la longitud de onda recomendada. 8. Calcular los valores de corte (cut-off) para cada prueba de corrida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 9. Si se obtienen resultados dudosos, repita la prueba en caso que se hayan producido errores tcnicos. Si todava se obtienen resultados dudosos, examinar la muestra usando un western blot. Alternativamente, repita la prueba usando un ELISA diferente y/o un sistema de prueba rpida (vase la seccin 11.7.2). Una corrida de la prueba no es vlida si los valores de los controles positivos son menores que los valores de corte calculados. En tales casos, la ejecucin de la prueba debe repetirse. Nota: Los criterios para las muestras de prueba usando un western blot varan de un laboratorio a otro. Algunos laboratorios ensayan todas las muestras que dan una reaccin positiva en el ELISA. En algunos casos, se puede hacer una solicitud especfica para realizar un Western blot, incluso si el ELISA fue no reactivo. 11.7.2 Tira reactiva Principio Las tiras reactivas se han desarrollado para la deteccin rpida de antgenos y anticuerpos en suero humano. Estas pruebas se emplean generalmente en situaciones en las que se puede necesitar tomar decisiones rpidas y en las que a menudo no requieren ningn otro equipo aparte del proporcionado en los kits de decisiones rpidas. En la prueba con tira reactiva para anticuerpos contra el VIH, que est disponible comercialmente, una tira de poliestireno est recubierta con el antgeno del VIH que se hace reaccionar con el suero. Entonces, los anticuerpos contra VIH presentes se unen al antgeno del VIH. Despus de la incubacin posterior con una solucin de sustrato, se desarrolla una mancha de color en el punto donde est el antgeno que indica la presencia de anticuerpos contra el VIH (Fig. 11.13). Materiales y reactivos Temporizador Toallas absorbentes o de papel de filtro Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, reactivos y controles positivos y negativos Suero de control casero dbil-positivo. Mtodo Siga las instrucciones proporcionadas en el kit. Un resultado positivo se indica mediante cualquier desarrollo de color en el punto recubierto de antgeno; esto indica que los anticuerpos se unieron al antgeno. Un punto debe ser visible en el control positivo y una ausencia de color debe ser vista en el control negativo. Los controles internos dbilmente positivos deben ser incluidos para ayudar en los resultados de la lectura. La realizacin de la prueba no es vlida si los resultados obtenidos con los controles no son como se ha descrito anteriormente.
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11.8 PRUEBAS
PARA LA INFECCIN POR VIRUS DE LA HEPATITIS
Las pruebas de rutina para la hepatitis incluyen el uso de marcadores para los virus de la hepatitis A, B y C. La hepatitis A es ms comn en nios, especialmente en las guarderas infantiles, sin embargo, no se prueba rutinariamente, excepto en casos de epidemias. Los virus de las hepatitis B y C se transmiten a travs de productos de sangre, fluidos corporales, agujas contaminadas y otros materiales contaminados. El virus de la hepatitis B tiene varios marcadores los cuales incluyen: -Antgeno de superficie (HBsAg) -Anticuerpo contra el antgeno de superficie (anti-HBs) -Antgeno de la envoltura o cubierta (HBeAg) -Anticuerpo contra el antgeno de la cubierta (anti-HBe) -anticuerpos contra el antgeno core (anti-HBc). (Core: Ncleo, centro o corazn viral) Las concentraciones de estos marcadores pueden variar durante el curso de una infeccin. Los marcadores antgenos aparecen primero o al principio despus de la exposicin al virus. La seroconversin (produccin de anticuerpos) a menudo ocurre varias semanas o meses despus de la exposicin. La prueba de hepatitis se realiza rutinariamente con ELISA en fase slida y mtodos de radioinmunoanlisis. Estn disponibles los kits comerciales para la deteccin de marcadores de hepatitis y los criterios e instrucciones especficas se proporcionan en cada kit. Los principios generales de la tcnica de ELISA para uno de los marcadores del virus de la hepatitis B se describen a continuacin. 11.8.1 ELISA para el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) Materiales y reactivos Micropipetas Incubadora o bao mara Lavador o bomba de vaco Espectrofotmetro (lector) Kit de ensayo comercialmente disponible que contiene sistema de soporte de fase slida, reactivos y controles Agua destilada o desionizada. Mtodo 1. Aadir la muestra de prueba (suero) y los controles al sistema de soporte de fase slida recubierta con una capa preliminar de anti-HBs (anti-HBsAg)* e incubar siguiendo las instrucciones del fabricante. *Generalmente, suele ser anticuerpo de cobayo anti-HBs que acta como anticuerpo de captura. 2. Usando una bomba de vaco o un lavador automtico, aspirar cuidadosamente el lquido de la fase slida (la fase slida suele estar en pocillos de una policubeta) y lavar el sistema. 3. Aadir la cantidad especificada de conjugado (anticuerpo anti-HBs ligado a una enzima) y se incuba siguiendo las instrucciones del fabricante. 4. Aspirar el lquido del pocillo y lavar para eliminar el conjugado no unido. 5. Aadir la cantidad especificada de sustrato (generalmente o-fenilendiamina) y se incuba en la oscuridad. (Esta es la etapa de desarrollo de color y debe protegerse de la luz.) 6. Aadir la solucin de detencin como se especifica. La solucin de parada o detencin (por lo general un cido) inhibe cualquier reaccin adicional entre la enzima y el sustrato. 7. Leer los resultados en un espectrofotmetro a la longitud de onda especificada. 8. Calcular el valor de corte (cut off) para la realizacin de la prueba segn las instrucciones del fabricante. La realizacin de la prueba no es vlida si los valores de los controles positivos son menores que el valor de corte. En tales casos, se debe repetir el ensayo. Precauciones El mtodo ELISA es bastante fcil de realizar, pero preste atencin a lo siguiente: Asegrese que los reactivos y las muestras se llevaron a temperatura ambiente. Hacer diluciones apropiadas de reactivos o muestras si es necesario. Asegrese que el antgeno o anticuerpo pre-revestido (fase slida) no se altere durante la adicin de la muestra o de los reactivos, y tambin tener precaucin durante los lavados. Preparar una nica solucin de cromgeno suficiente como para una sola prueba. Guardar la solucin en un recipiente cerrado, en la oscuridad. Si el color se desarrolla antes del empleo de la tcnica, debe preparase una nueva solucin. Evite la contaminacin cruzada de las muestras. Siga estrictamente los tiempos de incubacin, las temperaturas y otras condiciones que se especifican en las instrucciones del fabricante. Adems de los controles en el kit, por lo general se recomienda incluir un control interno de densidad ptica conocida para los propsitos de control de calidad. Nota: Si no se dispone de un espectrofotmetro (lector de ELISA), se puede hacer la lectura visual de los colores formados siempre comparando con un control positivo y otro negativo. 11.8.2 Tira reactiva para el antgeno de superficie de la hepatitis B Principio La tira reactiva para la deteccin de antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se aprovecha de la formacin de un punto visible dado por la precipitacin de inmunocomplejos.
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Los conjugados de anticuerpos monoclonales contra HBsAg acoplado a partculas de oro coloidales se adsorben a un rea de una tira de nitrocelulosa (la zona A en la Fig. 11.14.). Los anticuerpos policlonales contra HBsAg se fijan qumicamente a otra zona de la tira (zona B en la Fig. 11.14.). Una gota de suero humano se aplica a la zona A (Fig. 11.15). El antgeno HBsAg en el suero se une al anticuerpo conjugado y el inmunocomplejo oro-HBsAg migra a lo largo de la tira hasta que llega a los anticuerpos policlonales fijos en la zona B. Los anticuerpos policlonales precipitan el inmunocomplejo oro-HBsAg, y forman una banda roja visible en la zona B (Fig. 11.16). No se forma la banda roja si el suero no contiene HBsAg. Materiales y reactivos Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, reactivos y controles. Mtodo 1. Etiquetar la tira de prueba con el nombre y / o nmero del paciente. 2. Aadir una gota de suero a la zona A segn lo recomendado por el fabricante. 3. Permitir que el suero migre a la zona B en la tira de prueba. 4. Inspeccionar la zona B despus de 10-20 minutos para observar la aparicin de un punto coloreado visible que indica una reaccin positiva.
11.9 Tira reactiva para P. falciparum Tambin se encuentran disponibles tiras reactivas de anlisis para la deteccin del parsito del paludismo Plasmodium falciparum. El ensayo descrito aqu se basa en la deteccin con anticuerpos monoclonales de la protena especfica de especie, la protena rica en histidina II (HRP-II), que se expresa en las etapas asexuales sanguneas y posiblemente en las etapas tempranas de los gametocitos del parsito. 11.9.1 Materiales y reactivos Tubos capilares y perillas de goma
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Tubos de ensayo Gradilla Soporte para la reaccin Kit de prueba comercialmente disponible que contiene tiras reactivas, placas de prueba, reactivos y controles. La tira reactiva se trata previamente con un anticuerpo monoclonal de ratn contra la HRP-II, que se aplica en una lnea a travs de la tira de aproximadamente 1 cm desde su base. Una segunda lnea de puntos de antgeno HRP-II se incorpora en la tira reactiva aproximadamente 2-3 mm por encima de la lnea del anticuerpo monoclonal como un reactivo de control positivo. 11.9.2 Mtodo 1. Recoger una muestra de sangre de puncin en el dedo del paciente. 2. Coloque una gota de sangre en un tubo de ensayo que contiene tres gotas de reactivo de lisis (o reactivo lisante) (Fig. 11.17). 3. Coloque una gota de la muestra de sangre lisada en uno de los pocillos de la placa de prueba en el soporte de reaccin (Fig. 11.18). 4. Coloque la tira reactiva en la sangre lisada hasta que toda la sangre ha sido absorbida (Fig. 11.19). 5. Aplicar una gota de reactivo de deteccin en la base de la tira reactiva (Fig. 11.20). Este reactivo consta de una suspensin de micelas (vesculas de fosfolpidos) que contiene sulforodamina B como un marcador acoplado al anticuerpo de conejo producido contra HRP-II. 6. Cuando el reactivo ha sido absorbido, aplicar dos gotas de reactivo de lavado para limpiar la sangre lisada (Fig. 11.21). Si el resultado es positivo, una delgada lnea roja se quedar en la tira reactiva con una lnea discontinua (el reactivo control) por encima de ella. Si el resultado es negativo, slo se ve la lnea de puntos (el reactivo control). Toda la prueba se realiza en menos de 10 minutos. Los estudios actuales indican que la prueba tiene una sensibilidad y una especificidad del 86-95% cuando se compara con la microscopia de luz estndar realizada por tcnicos experimentados. Una prueba similar para P. vivax est en fase de desarrollo.
Figura 11.17 Adicin de una muestra de sangre al reactivo lisante. Figura 11.18 Poniendo la muestra de sangre lisada a la placa de prueba.
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Figura 11.19 Poniendo la tira reactiva en la sangre lisada. Figura 11.20 Agregando el reactivo de deteccin a la tira reactiva.
Figura 11.21 Eliminacin de la sangre lisada con el reactivo de lavado. 11.10 PRUEBAS PARA LA INFECCIN POR
SFILIS
La sfilis es causada por el Treponema pallidum. Hay cuatro etapas de la infeccin por sfilis: primaria, secundaria, latente y terciaria, y una condicin especial de la transmisin materno-fetal denomina sfilis congnita. Las respuestas inmunes a la sfilis se pueden agrupar en dos categoras: no especfica (o reagnica) y especfica. La reagina no especfica es de la clase IgM y reacciona con un extracto alcohlico de corazn de bovinos conocido como cardiolipina (un fosfolpido). Dado que el anticuerpo reagnico carece de especificidad, este aparece en muchas otras enfermedades y estados patolgicos no relacionados con la infeccin treponmica. En estos casos pueden ocurrir reacciones falsas positivas. Se pueden desarrollar anticuerpos especficos para treponemas no patgenos habitantes de la flora bacteriana normal del tracto genital u oral. Tambin se pueden desarrollar anticuerpos especficos para T. pallidum. En ambos casos, estos anticuerpos son de la clase IgG y permanecen detectables durante toda la vida del paciente a pesar del tratamiento. Las pruebas de rutina para sfilis incluyen la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), la prueba de absorcin de anticuerpos treponmicos fluorescentes (FTA-Abs) y la prueba de hemaglutinacin para T. pallidum (TPHA). FTA-Abs: fluorescent treponemal antibody-absorbed; TPHA: T. pallidum haemagglutination test; RPR: rapid plasma regain. Principio Prueba de RPR La prueba RPR ha sustituido a la prueba VDRL, como prueba de deteccin rpida por las siguientes razones: No hay necesidad de una preparacin diaria de los reactivos. No se requiere microscopio. No se requiere La inactivacin del suero con calor (no es necesario inactivar la muestra)
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VDRL significa Venereal Disease Research Laboratory, donde se elabor originalmente este ensayo. La prueba RPR utiliza el antgeno VDRL modificado con cloruro de colina para inactivar el complemento, y partculas de carbn para permitir que los resultados de la reaccin puedan ser observados sin un microscopio (la reaccin produce una floculacin visible macroscpicamente, favorecida por las partculas de carbn). La prueba RPR tambin se puede aplicar como una prueba semicuantitativa. Prueba de FTA-Abs La prueba de FTA-ABS se utiliza en la confirmacin de la sfilis. En el primer paso de la prueba, el suero se diluye en un cultivo concentrado y filtrado de treponemas Reiter para absorber anticuerpos contra los treponemas no patgenos. El suero se coloca entonces sobre una placa de vidrio en la que se han fijado los microorganismos de T. pallidum muertos (cepa Nichols). La placa de vidrio se incuba, se lava y se recubre con un anticuerpo anti inmunoglobulina humana marcado con un compuesto fluorescente. Si el resultado es positivo los treponemas emiten fluorescencia. Esta tcnica de inmunofluorescencia indirecta es altamente sensible en todas las etapas de la sfilis, especialmente en las etapas muy tempranas y muy tardas. Una vez que esta prueba es positiva sigue siendo positiva por el resto de la vida del paciente. No se utiliza como una prueba de tamiz para la sfilis, ya que no detecta la reinfeccin y adems consume tiempo y es costosa (se requiere un microscopio de fluorescencia con un condensador de campo oscuro). Los resultados de una prueba para la sfilis deben ser interpretados de acuerdo con el tipo (o tipos) de prueba empleada y de la etapa de la enfermedad que el paciente ha alcanzado. Recuerde que un resultado positivo de una prueba tamiz o screening para sfilis puede deberse a la presencia de otros anticuerpos heterfilos, a una tcnica defectuosa o a la presencia de otros anticuerpos treponmicos (no sifilticos). Un resultado negativo puede significar uno de los siguientes: La infeccin es demasiado reciente como para haber producido niveles detectables de anticuerpos. La prueba est temporalmente no reactiva debido al tratamiento que el paciente est recibiendo. La prueba se ha convertido temporalmente en no reactiva debido a que el paciente ha consumido alcohol antes de la prueba. La enfermedad est latente o inactiva. El paciente no ha producido anticuerpos protectores, debido a la tolerancia inmunolgica. La tcnica es defectuosa. Los resultados dbilmente positivos pueden deberse a: - infeccin muy temprana; -disminucin de la actividad de la enfermedad despus del tratamiento; -reacciones inmunolgicas no especficas; - tcnica incorrecta. El mayor valor de las pruebas no treponmicas es en el seguimiento despus de la terapia y en la deteccin de la reinfeccin. Prueba TPHA La prueba TPHA tambin se utiliza en la confirmacin de la sfilis. En el primer paso de la prueba, el suero diluido se mezcla con diluyentes que contienen treponemas Reiter no patgenos absorbentes. El suero se transfiere a continuacin a una placa de microtitulacin y se aaden eritrocitos sensibilizados con microorganismos de T. pallidum muertos (cepa Nichols). Si el resultado es positivo los eritrocitos forman una capa fina o manto fino de clulas aglutinadas (hemoaglutinacin). 11.10.1 Prueba RPR Materiales y reactivos1 Placas de ensayo Pipetas Pasteur desechables Pipeta serolgica Tubos de ensayo de 75 mm x 12 mm Gradilla Rotador Antgeno RPR Controles negativos, dbilmente positivos y muy positivos Cloruro de Sodio, solucin al 0,85% (reactivo no. 53). Los reactivos anteriores se suministran normalmente como parte de un kit de prueba. 1 Nota: Los reactivos para la prueba RPR deben ser almacenados a 2-6 C en el frigorfico. Mtodo 1. Llevar la prueba y los sueros de control y el antgeno de RPR a temperatura ambiente. 2. Dispense una gota de cada uno de los sueros de prueba y de control a las placas de ensayo y extindalos cuidadosamente en los pocillos individuales. 3. Aadir una gota de antgeno RPR a cada pocillo de las placas de prueba. 4. Colocar las placas de ensayo en el rotador y rotar durante 8 minutos a 100 rpm. (La velocidad recomendada es de entre 95 y 105 rpm, lo que debera ser revisado diariamente como parte del control de calidad.) Si un rotador mecnico no est disponible, hacer rotar horizontalmente la placa de reaccin en forma manual, inclinando las placas de ida y vuelta y rotando las placas cuidadosamente durante 8 minutos a 80-85 rpm. 5. Examine las placas de ensayo para ver la floculacin (Fig. 11.22) y comparar las reacciones de los sueros de prueba con los de los controles.
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6. Preparar una dilucin 1:2 de cualquiera de los sueros positivos y examinar las diluciones tal como se describe en los pasos 2-5. La dilucin ms alta de suero en el que se observa floculacin es el ttulo.
11.10.2 Prueba TPHA Materiales y reactivos Tubos de ensayo Gradilla Kit de la prueba TPHA comercialmente disponible que contenga placas de microtitulacin, micropipetas (con puntas desechables), diluyente de absorcin, eritrocitos sensibilizados con T. pallidum, eritrocitos no sensibilizados, controles de suero positivo y negativo Agua destilada. Los reactivos y controles deben ser reconstituidos antes de su uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mtodo 1. Diluir la prueba y el control de sueros 1:20 con diluyente de absorcin. 2. Usando una micropipeta, dispensar 25 l del suero control negativo en los pocillos 1 y 2 de la primera fila horizontal de la placa de microtitulacin (A en la Fig. 11.23). 3. Dispensar 25 l del suero control positivo en los pocillos 1 y 2 de la segunda fila horizontal de la placa de microtitulacin (B en la Fig. 11.23). 4. Dispensar 25 l del primer suero de ensayo en los pocillos 1 y 2 de la tercera fila horizontal de la placa de microtitulacin (C en la Fig. 11.23). Repita el procedimiento con los sueros de prueba restantes. Si es necesario, utilice los pocillos adyacentes (por ejemplo, 3 y 4 en la Fig. 11.23). 5. Aadir 75 l del control de eritrocitos a los pocillos en la primera fila vertical (1) y en todas las dems filas (3, 5, 7, 9 y 11), segn corresponda. 6. Aadir 75 l de los eritrocitos sensibilizados a los pocillos en la segunda fila vertical (2) y en todas las dems filas (4, 6, 8, 10 y 12), segn corresponda. 7. Rotar las placas con cuidado, cubrir y dejar reposar a temperatura ambiente durante el tiempo recomendado por el fabricante. Las placas deben ser protegidas de las vibraciones, el calor radiante y la luz solar directa. 8. Colocar las placas con cuidado sobre un fondo blanco o una placa de vidrio sinterizado iluminada desde abajo, o usar un dispositivo de visualizacin que permita que el patrn de sedimentacin pueda ser visto desde abajo a travs de un espejo. Si el resultado es positivo se ver una capa fina (manto fino) de clulas aglutinadas (hemoaglutinacin). Las clulas pueden estar rodeadas por un crculo o anillo rojo, o incluso pueden cubrir toda la base del pocillo. Si el resultado es negativo se puede ver un botn compacto rojo de las clulas no aglutinadas, con o sin un agujero muy pequeo en su centro. Si el resultado es dudoso (borderline o limtrofe) se ver un botn de clulas no aglutinadas con un pequeo agujero en su centro. Nota: Los resultados deben interpretarse de acuerdo con los criterios establecidos por el fabricante.
Figura 11.23 Placa para la prueba de TPHA Nota: Se agregan manuales de instrucciones de equipos comerciales correspondientes a varias de estas tcnicas. Fuente: www.wiener-lab.com.ar
La tcnica de VDRL se agrega como informacin
O-Estreptolisina
liofilizada
Mtodo hemoltico para la determinacin del ttulo de antiestreptolisina O SIGNIFICACION CLINICA El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin embargo un ttulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infeccin reciente producida por estreptococo -hemoltico grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela. Tiene adems especial inters en los procesos que aparecen como segunda enfermedad: fiebre reumtica y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto, a pesar de no ser una prueba especfica para fiebre reumtica, apoya su diagnstico cuando lo sugieren la historia y los signos clnicos. FUNDAMENTOS DEL METODO La estreptolisina O, producida por el estreptococo -hemoltico de grupo A, tiene la propiedad de producir hemlisis cuando se pone en contacto con glbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reaccin antgeno-anticuerpo que neutraliza la capacidad hemoltica de la misma. Este fenmeno se evidencia por una inhibicin de la hemlisis al agregar suspensin de glbulos rojos del 3 al 5%. El ttulo de antiestreptolisina ser la recproca de la mxima dilucin del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina. REACTIVOS PROVISTOS Estreptolisina-O: estreptolisina liofilizada titulada. Buffer concentrado: solucin de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0,36 mol/l y cloruro de sodio 1,2 mol/l, para pH final 6,5. REACTIVOS NO PROVISTOS - Agua destilada. - Eritrocitos frescos humanos de grupo O, del mismo paciente o de conejo. - Solucin fisiolgica. INSTRUCCIONES PARA SU USO A baja temperatura el Buffer concentrado puede cristalizar. En tal caso, colocar en bao de agua a 37oC unos minutos mezclando por inversin hasta disolucin completa. Buffer; preparacin: - 6 x 3 ml: diluir el contenido con 150 ml de agua destilada. - 6 x 10 ml: diluir el contenido con 600 ml de agua destilada. Estreptolisina-O: disolver el vial con el volumen de Buffer indicado en el rtulo, mezclando por inversin hasta disolucin completa. Suspensin de eritrocitos: lavar los mismos 3 veces con solucin fisiolgica. Luego del ltimo lavado centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 15 minutos. En el sobrenadante no debe aparecer hemlisis; caso contrario desechar. Con los eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensin del 3 al 5% con Buffer pH 6,5. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de qumica clnica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Estreptolisina-O: una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente, 5 das en refrigerador (2-10oC) o 2 meses congelada (-20oC) y fraccionada. Ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. Buffer: estable 1 ao en refrigerador (2-10oC). Suspensin de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas despus de preparada la suspensin, si previamente se lavan una vez con Buffer y no se observa hemlisis. MUESTRA Suero a) Recoleccin: debe obtenerse suero libre de hemlisis. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemlisis visible pueden conducir a una interpretacin errnea de los resultados, por lo que deben descartarse. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta efectuar el ensayo. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Material volumtrico apropiado. - Centrfuga. - Bao de agua a 37oC. CONDICIONES DE REACCION - Temperatura de reaccin: 37oC - Tiempo de incubacin: 60 minutos - Volumen final de reaccin: 2 ml Si se emplea la presentacin 6 x 3 ml los volmenes de muestra y reactivo deben reducirse a la mitad. Si se desea realizar microtcnica en policubetas, solicitar las instrucciones al Servicio Bibliogrfico de Wiener lab.
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PROCEDIMIENTO Preparar diluciones de la siguiente forma: 1:10 (0,2 ml de suero + 1,8 ml de Buffer), 1:100 (0,5 ml de dilucin 1:10 + 4,5 ml de Buffer), 1:500 (1 ml de dilucin 1:100 + 4 ml Buffer). Luego proceder de la siguiente forma: Dilucin del suero Tubo N Suero diluido (ml) Buffer (ml) Estreptolisina-O (ml) 1:10 1 0,2 0,8 0,5 2 1 0,5 3 0,8 0,2 0,5 1:100 4 0,6 0,4 0,5 5 0,4 0,6 0,5 6 0,3 0,7 0,5 7 1 0,5 8 0,8 0,2 0,5 1:500 9 0,6 0,4 0,5 10 0,4 0,6 0,5 11 0,2 0,8 0,5 CONTROLES 12 1,5 13 1 0,5
Mezclar y mantener a bao Mara a 37C 15 minutos. Eritrocitos 3-5% (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Mezclar agitando ligeramente y mantener en bao Mara a 37oC durante 15 minutos, agitar nuevamente y continuar en bao Mara durante 30 minutos ms. Centrifugar 3 minutos a 1.500 r.p.m. y leer. Unidades Todd/ml 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 (-) (+)
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS El ttulo de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilucin en la cual se observa ausencia total de hemlisis. El tubo 12 (control eritrocitario) no deber presentar hemlisis mientras que el tubo 13 (control Estreptolisina-O) deber mostrar hemlisis completa. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar simultneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O. VALORES DE REFERENCIA Normalmente pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina O. Ttulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo -hemoltico de grupo A.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO En caso de conservar la Estreptolisina-O reconstituida congelada, se recomienda fraccionarla de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos sucesivos que ocasionan su deterioro. PRESENTACION - 6 x 3 ml (Cd. 1073202). - 6 x 10 ml (Cd. 1073204). BIBLIOGRAFIA - Bennett, C.V. - "Clinical Serology" - Charles Thomas Pub., USA (1964). - Sonnenwirth, A.C.; Jarret, L. - Gradwohl Mtodos y Diagnsticos del Laboratorio Clnico - Edit. Panamericana - 8 Ed. (1983). - Rantz, L.A. y Randall, M.F. - Proc. Soc. Exp. Bio. 59:22 (1945).
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EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS Estreptolisina O Estreptolisina O Buffer conc
Buffer concentrado
C
V
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Cont.
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Calibr.
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Wiener lab.
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SIGNIFICACION CLINICA El anticuerpo antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin embargo un ttulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infeccin reciente producida por un estreptococo beta hemoltico de grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela. FUNDAMENTOS DEL METODO Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reaccin con la estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de ltex. Los anticuerpos antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensin de partculas de ltex poliestireno recubiertas con estreptolisina O. Control Positivo: suero humano conteniendo antiestreptolisina O en concentracin superior a 250 UI/ml. Control Negativo: suero humano no reactivo con el Reactivo A. REACTIVOS NO PROVISTOS Solucin fisiolgica (para la tcnica semicuantitativa). INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: homogeneizar por agitacin intensa y luego cambiar la tapa ciega por la tapa gotero suministrada adicionalmente. Controles (Positivo y Negativo): listos para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antgeno de superficie del virus de hepatitis B, virus de la hepatitis C y anticuerpos contra HIV 1/2, encontrndose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
ASO
ltex
Prueba de ltex para la determinacin de antiestreptolisina O en suero INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La autoaglutinacin del Reactivo A es indicio de deterioro del mismo. En tal caso desechar. MUESTRA Suero a) Recoleccin: obtener suero de la manera usual. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros marcadamente lipmicos o contaminados pueden dar resultados falsamente positivos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero es estable 24 horas refrigerada (210oC) o congelada por perodos prolongados. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 placa de vidrio - 1 tapa gotero 2- No provisto - goteros o pipetas para dispensar los volmenes indicados. - palillos mezcladores descartables - cronmetro - lmpara o fuente de luz - tubos de Kahn PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. I- TECNICA CUALITATIVA En uno de los sectores delimitados de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar: Reactivo A Muestra 1 gota (50 ul) 1 gota (50 ul)
Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensin uniforme en la superficie delimitada de la placa. Inmediatamente disparar un cronmetro, balancear suavemente la placa y observar macroscpicamente el resultado dentro de los 2 minutos. II- TECNICA SEMICUANTITATIVA Los sueros positivos pueden titularse efectuando di-
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luciones seriadas en tubos de Kahn. a) Colocar 0,5 ml de solucin fisiolgica en cada uno de los tubos. b) Agregar 0,5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar. Transferir 0,5 ml de esta dilucin al tubo No 2 y mezclar, continuando as las diluciones hasta el ltimo tubo. Las diluciones as obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. c) Ensayar cada dilucin segn tcnica I. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Tcnica cualitativa Negativo: suspensin homognea. Positivo: aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos. Se califica de 1 a 4 +, siendo: 4+: aglutinacin franca 3+: moderada aglutinacin 2+: ligera aglutinacin 1+: aglutinacin dbil Tcnica semicuantitativa Ttulo: inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra, puede ser calculada por la frmula siguiente: ASO (UI/ml) = Ttulo x Sensibilidad de la reaccin (200 UI/ml) Ejemplo: la muestra presenta un ttulo de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400 UI/ml METODO DE CONTROL DE CALIDAD Es conveniente procesar simultneamente el Control Positivo y el Control Negativo provistos, empleando una gota del Control correspondiente en lugar de la muestra y una gota del Reactivo A segn la tcnica cualitativa. VALORES DE REFERENCIA Hasta 200 UI/ml. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Tiempos de reaccin mayores de 2 minutos pueden producir reacciones falsamente positivas por efecto del secado de los reactivos. - Se pueden producir falsos negativos en nios mayores de 6 meses y menores de 6 aos o en infeccin reciente. - Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, un resultado aislado slo constituye un dato auxiliar, por lo que se recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15-20 das durante 4 6 semanas. PERFORMANCE a) Sensibilidad: 200 UI/ml. b) Especificidad: en una poblacin adulta sana se obtienen ttulos de antiestreptolisina O menores o iguales a 200 Ul/ml
en el 95% de los casos. En una poblacin infantil ( mayores de 2 aos) se pueden tener ttulos de hasta 300 UI/ml. PRESENTACION Equipo para 50 determinaciones (Cd. 1073151). BIBLIOGRAFIA - Sonnenwirth A.C.; Jarret L. - Gradwohl Mtodos y Diagnsticos del Laboratorio Clnico - Editorial Panamericana - 8o Ed (1983).
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Smbolos
C
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M
Xn
Elaborado por:
Nocivo
Corrosivo / Castico

Xi
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Calibr.
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Cont.
No congelar
Calibrador
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Riesgo biolgico Volumen despus de la reconstitucin
Control
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C
SIGNIFICACION CLINICA La Gonadotrofina Corinica Humana (hCG) es una glucoprotena producida por las clulas trofoblsticas de la placenta. Comienza a secretarse en la fase ms temprana de la etapa gestacional y aumenta constantemente hasta alcanzar un pico, alrededor de 9 semanas despus del comienzo del ltimo perodo menstrual normal, cuyos niveles son muy variables de una mujer a otra. Su produccin es ndice de crecimiento placentario, hecho que permite establecer una relacin directa entre la aparicin de hCG y el diagnstico de embarazo. FUNDAMENTOS DEL METODO La muestra se pone en contacto con un reactivo de ltex sensibilizado con anticuerpos monoclonales anti-hCG. Si la muestra contiene hCG, sta se unir en forma sensible y especfica producindose una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensin de partculas de ltex-poliestireno que tienen adsorbidas molculas de anti-hCG. Control Positivo: solucin buffer conteniendo hCG y conservantes. Control Negativo: solucin buffer libre de hCG conteniendo conservantes. REACTIVOS NO PROVISTOS Solucin fisiolgica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: homogeneizar por agitacin antes de usar. Controles Positivo y Negativo: listos para usar. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antgeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg), virus de la hepatitis C (HCV) y anticuerpos contra HIV 1/2, encontrndose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de anlisis clnicos. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
Fecuntest
directo
Prueba de aglutinacin directa en placa para diagnstico de embarazo INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS La turbidez y/o cambio de coloracin de los reactivos pueden ser indicio de contaminacin de los mismos. MUESTRA Orina a) Recoleccin: recolectar orina en un recipiente perfectamente limpio y libre de restos de detergente. Para la Tcnica Cualitativa emplear orina sin diluir, recolectada en cualquier hora del da. No obstante, si se emplea la primera orina de la maana, puede lograrse mayor sensibilidad diagnstica. Para la titulacin emplear orina de 24 horas. La misma debe ser mantenida en refrigerador (2-10oC) durante su recoleccin. b) Aditivos: no se requieren. No usar conservantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hematuria, proteinuria y/o contaminaciones bacterianas son causa de resultados errneos. Las orinas no lmpidas deben filtrarse o centrifugarse antes de ser ensayadas. Referirse a las bibliografas de Young para los efectos de las drogas y las enfermedades en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: emplear orina fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento de la recepcin de la muestra, la misma debe ser mantenida en el refrigerador (2-10oC). Preferentemente, la orina debe procesarse lo antes posible dentro de las doce horas contadas desde el momento de su obtencin. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 placa de vidrio. - esptulas-gotero plsticas descartables 2- No provisto - 1 cronmetro. - material volumtrico adecuado. - fuente luminosa. PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente antes de usar. Utilizar una esptula-gotero plstica provista, en posicin vertical, para colocar cada muestra o control. I) TECNICA CUALITATIVA En cada uno de los sectores delimitados de la placa provista, colocar:
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Muestra o Controles Reactivo A
1 gota 1 gota
Con el extremo cerrado de la esptula-gotero descartable utilizada para dispensar la muestra o control, mezclar durante 4-5 segundos hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del sector. Inmediatamente, disparar el cronmetro, balancear suavemente la placa y observar macroscpicamente el resultado dentro de los 2 minutos, utilizando una fuente de luz ubicada directamente por encima de la placa. II) TITULACION Mezclar la orina recolectada durante 24 horas de la forma antes indicada (Ver MUESTRA) y medir su volumen. Tomar una alcuota y procesar como sigue: a) Preparar diluciones sucesivas (1/2, 1/4, 1/8, etc.) con solucin fisiolgica. b) Ensayar cada dilucin segn la TECNICA CUALITATIVA. INTERPRETACION Y CALCULO DE LOS RESULTADOS Positivo: aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos. Negativo: suspensin homognea. Pasados los dos minutos, pueden aparecer aglutinaciones inespecficas. Ttulo: inversa de la mxima dilucin a la cual se produce la aglutinacin. Clculos: 1- Ul de hCG/ml = S x T donde: S= sensibilidad de la reaccin= 0,2 UI/ml de hCG T= ttulo 2- Ul de hCG/24 horas = S x T x V donde: V= volumen total (en ml) de orina excretada durante las 24 hs METODO DE CONTROL DE CALIDAD Control Positivo: las reacciones positivas de Fecuntest directo presentan un aspecto grumoso que puede ser corroborado procesando una gota de orina que contenga una cantidad de hCG igual o mayor a la sensibilidad del equipo o una gota de Control Positivo en lugar de la Muestra, siguiendo la tcnica descripta (ver PROCEDIMIENTO). Orinas francamente positivas pueden conservarse en alcuotas a -20oC durante no ms de 60 das debiendo ser descartadas despus de su uso, puesto que su integridad no se mantiene al congelarlas y descongelarlas ms de una vez. Control Negativo: las reacciones negativas de Fecuntest directo presentan un aspecto homogneo que puede ser corroborado procesando una gota de solucin fisiolgica o una gota de Control Negativo en lugar de la muestra siguiendo la tcnica descripta (Ver PROCEDIMIENTO). VALORES DE REFERENCIA Durante el primer trimestre del embarazo se observan valores de hCG entre 25-50 Ul/ml, pudiendo llegar a un mximo de 250 Ul/ml en condiciones normales.
Un nmero de condiciones, adems del embarazo, incluyendo enfermedad trofoblstica y ciertos neoplasmas no trofoblsticos provocan niveles elevados de hCG. Estos diagnsticos debern considerarse si la evidencia clnica es apropiada. Un diagnstico clnico definitivo no deber estar basado en el resultado de una sola prueba, sino que deber hacerlo un mdico despus que todos los exmenes clnicos y de laboratorio han sido evaluados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Si la muestra de orina est demasiado diluida puede no contener niveles representativos de hCG. Repetir con la primera orina de la maana. Muestras con concentraciones de hCG menores a la sensibilidad del mtodo darn resultados negativos. Otras causas de resultados errneos son: - Intercambiar las tapas de los reactivos. - No respetar los tiempos de mezclado indicados en el PROCEDIMIENTO. - No emplear los goteros en posicin vertical. - Usar una placa de vidrio que no est perfectamente limpia. - No llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente antes de comenzar a trabajar. PERFORMANCE Sensibilidad: Fecuntest directo detecta hCG en orina a partir de 0,2 Ul/ml. Dicha sensibilidad fue verificada frente al 3rd International Standard de hCG (W.H.O.). PRESENTACION Equipo para 50 determinaciones (Cd. 1323152). BIBLIOGRAFIA - Derman, R. et al - "Current Status of Immunologic Pregnancy Test" - Int. Gynaecol. Obstet. 17/90 (1979). - Reiss, A.M. - "Immunologic Cross-Reaction between Luteinizing Hormone and Antisera to Human Chorionic Gonadotropin" - Int. Arch. Allergy 30:561 (1966). - Wide, L. - "An Immunological Method for the Assay of Human Chorionic Gonadotropin" - Acta Endocrinol. 41:49. Suppl. 70 (1962). - Batzer, F. - Fertil. Steril. 34:1 (1980). - Catt, K.; Dufan, M.; Vaitukaitis, J. - J. Clin. Endocrinol. Metab. 40:537 (1975). - Braunstein, G.; Rasor, J.; Adler, D.; Danzer, H.; Wade, M. Am. J. Obstet. Gynecol. 126:678 (1976). - Lenton, E.; Neal, M.; Sulaiman, R. - Fertil. Steril. 37:773 (1982). - Dawood, M.; Saxeba, B.; Landesman, R. - Ob. Gyn. 126:678 (1976). - Braunstein, G. et al. - Ann. Inter. Med. 78:39 (1973). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001. - Young, D.S. - "Effects of Deseases on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.
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Smbolos
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P V X H l
M
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Elaborado por:
Nocivo
Corrosivo / Castico

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Calibr.
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Cont.
No congelar
Calibrador
b
Riesgo biolgico Volumen despus de la reconstitucin
Control
Contenido
Nmero de lote
b c h
Control Positivo
Control Negativo
Nmero de catlogo

Wiener lab.
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C
SIGNIFICACION CLINICA La gonadotrofina corinica humana (hCG) es una glicoprotena producida por las clulas trofoblsticas de la placenta. Comienza a secretarse en la fase ms temprana de la etapa gestacional y aumenta constantemente hasta alcanzar un pico, alrededor de 9 semanas despus del comienzo del ltimo perodo menstrual normal. Su produccin es ndice de crecimiento placentario, hecho que permite establecer una relacin directa entre la aparicin de hCG y el diagnstico de embarazo. FUNDAMENTOS DEL METODO La prueba Fecuntest strips es un inmunoensayo cromatogrfico rpido para la deteccin de hCG en orina o suero. La membrana se encuentra recubierta con anticuerpos de captura anti-hCG en la zona de prueba (T) y de cabra antiratn en la zona de control (C). Durante la prueba, la muestra reacciona con las partculas de oro coloidal cubiertas con anticuerpos monoclonales de ratn anti-hCG. La mezcla migra por la membrana por capilaridad. Si el resultado es positivo, se formar una banda coloreada con la partcula compleja en la zona de prueba. La ausencia de una banda coloreada en la zona de prueba indica un resultado negativo. Como un control de procedimiento, siempre aparecer una banda de color en la zona de control independientemente de la presencia de hCG en la muestra. REACTIVOS PROVISTOS Tiras de reaccin: tiras de nitrocelulosa recubierta con anticuerpos de captura anti-hCG y partculas de oro coloidal recubiertas con anticuerpo monoclonal de ratn anti-hCG. PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". No usar luego de la fecha de vencimiento. - Las tiras deben permanecer en su envase hasta el momento de usar. - Una vez utilizada, la tira debe descartarse en recipientes destinados a desechos biolgicos. - Todas las muestras deben manipularse como si fueran potencialmente infectivas. - Los resultados obtenidos por este ensayo son estrictamente cualitativos y no arrojan ninguna correlacin con el grado de aumento o disminucin de la concentracin de hCG. - Los resultados del test deben usarse en conjunto con informacin disponible de la evaluacin clnica del paciente y otros procedimientos diagnsticos.
Fecuntest
strips
Prueba inmunocromatogrfica para la deteccin de embarazo en suero, plasma u orina - Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de qumica clnica. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los reactivos provistos son estables a temperatura ambiente (2-30oC) hasta la fecha de vencimiento indicada, mientras sean conservadas en su envase cerrado. Una vez abierto el envase retirar las tiras de reaccin necesarias y volver a cerrar inmediatamente el envase para evitar que las tiras restantes se humedezcan. MUESTRA Suero, plasma heparinizado u orina a) Recoleccin: obtener la muestra de la manera usual. La orina puede ser cualquiera del da sin embargo se recomienda la primera de la maana ya que contiene, en general, la mayor concentracin de la hormona. b) Aditivos: no se requieren. En caso de utilizar plasma, recolectar con heparina. c) Sustancias interferentes conocidas: la hemlisis intensa puede ser causa de resultados errneos. Las muestras de orina que presentaran sedimento o turbiedad deben ser filtradas o centrifugadas previamente al ensayo. No producen interferencias tanto en orina como en suero y plasma: acetaminofeno (20 mg/dl), cido acetilsaliclico (20 mg/dl), cido ascrbico (20 mg/dl), etinil estradiol (1400 mg/dl), progesterona (1500 mg/dl), cafena (20 mg/dl), bilirrubina (20 mg/dl), glucosa (2 mg/dl) y triglicridos (1200 mg/dl). Referirse a las bibliografas de Young para los efectos de las drogas y las enfermedades en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras pueden conservarse durante 48 horas a 2-10oC. Si deben conservarse por perodos ms prolongados, deben ser congeladas a -20oC o menos. Deben evitarse ciclos de congelamiento y descongelamiento reiterados. Llevar la muestra a temperatura ambiente antes de realizar la prueba. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Recipiente para recoleccin de muestras. - Cronmetro. CONDICIONES DE REACCION - Tiempo de reaccin: 3 minutos en caso de orina y 5 minutos
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en caso de suero o plasma. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente (< 30oC). PROCEDIMIENTO 1- Tanto la tira de reaccin como la muestra deben mantenerse a temperatura ambiente (< 30oC) antes de la prueba. 2- Retirar la tira de reaccin de su envase y rotular con la identificacin correspondiente al paciente. 3- Sumergir la tira de reaccin en la muestra a ensayar, mantenindola en posicin vertical por lo menos 15 segundos cuidando de no sobrepasar la lnea mxima permitida (MAX) especificada. 4- Colocar la tira de reaccin sobre una superficie limpia, plana y seca, activar el cronmetro y esperar hasta la aparicin de la/s lneas coloreadas. Para cada muestra, utilizar una tira de reaccin nueva. 5- Observar la aparicin de bandas coloreadas. Leer el resultado a los 3 minutos cuando se ensaya orina o a los 5 minutos si se ensaya suero. No interpretar los resultados pasados los 10 minutos ni antes del tiempo recomendado para cada tipo de muestra. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
hCG hCG hCG hCG hCG
pueden atribuirse a la disminucin de los niveles de hCG posteriores a abortos espontneos o inducidos. La intensidad del color en la zona de la banda de prueba (T) variar de acuerdo a la concentracin de hCG presente en la muestra. METODO DE CONTROL DE CALIDAD La prueba incluye un control de procedimiento. Pueden procesarse adicionalmente controles comerciales. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Se observan resultados falsos positivos en ciertas patologas como enfermedad trofoblstica y neoplasmas no trofoblsticos (tumores testiculares), cncer de prstata, mama y pulmn que cursan con niveles aumentados de hCG. Se observan resultados falsos negativos en caso de embarazo muy reciente, donde la concentracin de hCG se encuentra por debajo del valor de discriminacin y tambin en orinas muy diluidas, por lo que en estos casos se recomienda repetir el examen luego de 48-72 horas. Como cualquier ensayo que utiliza anticuerpos murinos, existe la posibilidad de interferencia positiva o negativa debido a la presencia de anticuerpos humanos anti-murinos (HAMA) presentes en la muestra del paciente (veterinarios, individuos tratados con terapias de anticuerpos, etc.). Esta prueba se utiliza para obtener un resultado cualitativo y visual. VALORES ESPERADOS Las mujeres sanas no gestantes y los varones sanos presentan valores de hCG no detectables para la prueba de hCG Fecuntest strips. Habitualmente en las mujeres gestantes sanas la concentracin de hCG se duplica cada 2 das durante los primeros das del embarazo alcanzando a los 10 das valores entre 10-30 mUI/ml; al mes, valores cercanos a 100 mUI/ml y al final del primer trimestre, un pico de actividad con valores entre 100.000-200.000 mUI/ml. Luego, la concentracin de hCG disminuye paulatinamente hasta alcanzar un valor normal luego del parto. Por lo tanto Fecuntest strips tiene la sensibilidad necesaria (25 mUI/ml), para detectar la hormona gonadotrofina corinica (hCG) en el suero, plasma u orina de mujeres gestantes sanas. PERFORMANCE a) Sensibilidad: Fecuntest strips detecta concentraciones urinarias de hCG iguales o superiores a 25 mUI/ml (calibradas de acuerdo al WHO Fourth International Standard NIBSC Code: 75/589). b) Especificidad: efectuando estudios de reaccin cruzada con 300 mUI/ml de LH, 1000 mUI/ml de FSH y 1000 uUI/ml de TSH se obtuvieron resultados negativos. c) Efecto prozona: no se observa efecto prozona hasta una concentracin de 625.000 mUI/ml. d) Estudio poblacional: se realiz el ensayo de correlacin del producto a evaluar (Fecuntest strips) con un kit co861238200 / 00 Pg. 2 de 6
C T
C T
C T
C T
C T
positivo
negativo
Positivo: se observan dos lneas rojas en la tira, una debida al control y otra debida a la presencia de hCG. Negativo: se observa slo una lnea roja en la regin de control (C). Invlido: falla en la aparicin de la lnea roja en la zona de control (C), que puede deberse a: insuficiente volumen de muestra; procedimiento tcnico incorrecto; deterioro de los reactivos. Si el resultado es invlido se debe repetir la determinacin con otra tira. Si el resultado es dudoso deber probarse nuevamente con una muestra obtenida 48 a 72 horas ms tarde. Las muestras dudosas con un resultado posterior negativo
invlido
mercialmente disponible (Fecuntest un paso v.2 de Wiener lab.). Los resultados fueron obtenidos siguiendo el protocolo EP12-A del NCCLS. Se procesaron 100 muestras de orina, 102 muestras de suero y 87 muestras de plasma heparinizado. Los resultados muestran una sensibilidad y una especificidad del 100% cuando se los compara con otro test inmunocromatogrfico para hCG de caractersticas similares. PRESENTACION Kit para 25 determinaciones (Cd. 1999705). BIBLIOGRAFIA - User Protocol for Evaluation of Quantitative Test Performance. Approved guideline. NCCLS 2006. - Bristow A, et al. "Establishment, value assignment, and characterization of new WHO Reference Reagents for six molecular forms of human chorionic gonadotropin" Clin. Chem. 51/1:177, 2005. - Cole LA et al. "Selecting human chorionic gonadotropin immunoassays: Consideration of cross-reacting molecules in first-trimester pregnancy serum and urine" Am. J. Obstet. Gynecol. 168/5:1580, 1993. - Fenili CA, et al. "Evaluacin de seis inmunoensayos (IES) utilizados para la medicin de hCG humana en primer trimestre de embarazo" Rev. Soc. Argent. Endocrinol. Ginecol. Reprod. 6:34, 2000. - Saavedra MS, et al. "Formas moleculares de Gonadotrofina Corinica Humana (hCG). Impacto en su medicin" Rev. Argent. Endocrinol. Metab. 41/1:27,2004. - Stenman UH. "Immunoassay standardization: is it possible, Who is responsible; who is capable?" Clin. Chem. 47:815, 2001.
C
V
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autorizado en la Comunidad EuroP Representante pea Uso diagnstico "in vitro" Contenido suficiente para <n> ensayos Fecha de caducidad Lmite de temperatura (conservar a) No congelar Riesgo biolgico Volumen despus de la reconstitucin
Cont.
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Calibr.
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Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Autorizado A.N.M.A.T. PM-1102-40
Wiener lab.
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DIA (Dot Immuno Assay)*

HIV 1+2
Inmunoensayo sobre soporte slido para la deteccin de anticuerpos contra los virus de inmunodeficiencia humana HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2 SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) causantes del SIDA, son transmitidos principalmente por contacto sexual o a travs de sangre o productos contaminados derivados de la sangre. En individuos infectados con estos virus aparecen anticuerpos, como respuesta del sistema inmunitario a la invasin viral. Estos anticuerpos no son protectores y no confieren inmunidad, pero por ser marcadores tempranos de la infeccin, su deteccin constituye la base del estudio de la patologa. El presente equipo ha sido desarrollado para detectar conjuntamente la presencia de los anticuerpos anti-HIV-1, antiHIV-1 grupo O y anti-HIV-2. FUNDAMENTOS DEL METODO La muestra diluida se pone en contacto con el soporte slido en forma de peine en el cual se encuentran inmovilizados pptidos sintticos de transmembrana de HIV-1 y HIV-2. Si la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o anti-HIV-2 se formar un inmunocomplejo que quedar unido al soporte. Luego de un lavado, se incuba el soporte con un conjugado de protena A-oro coloidal (Revelador). La protena A se une al fragmento Fc de los anticuerpos. La aparicin de una mancha rojiza en el lugar donde se encuentran depositados los pptidos sintticos es indicativo de que se form el inmunocomplejo y por lo tanto de la presencia en la muestra de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O o antiHIV-2. REACTIVOS PROVISTOS Antgeno: soporte slido en forma de peine, conteniendo inmovilizados en cada diente pptidos sintticos de antgenos de transmembrana de HIV-1 y HIV-2 (parte opaca del peine). Diluyente de Muestras: solucin fisiolgica con tensioactivo no inico, pH 7,3. Buffer de Lavado concentrado: cloruro de sodio 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no inico 0,1 g/l. Revelador: protena A de Staphylococcus aureus conjugada con oro coloidal. Control Positivo: dilucin de suero inactivado, reactivo para anticuerpos anti-HIV. Control Negativo: dilucin de suero inactivado, no reactivo. INSTRUCCIONES PARA SU USO Antgeno: listo para usar. Al cortar el sobre, tener la precaucin de no cortar con la tijera los peines o el sobre con desecante.
* Elaborado bajo licencia de Concept Foundation
Diluyente de Muestras: listo para usar. Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo pueden precipitar. En tal caso, colocar en bao de agua a 37oC unos minutos, mezclando luego por inversin. Diluir 1+7 con agua destilada (1 parte Buffer de Lavado concentrado + 7 partes de agua destilada). Tener en cuenta que al realizar la tcnica el Buffer de Lavado se prepara una sola vez y se utiliza en los dos lavados. Luego, debe descartarse la solucin agregndole previamente 5 ml de hipoclorito de sodio al 5%. Revelador: listo para usar. Control Positivo: listo para usar. Control Negativo: listo para usar. PRECAUCIONES - Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infeccin. Los controles se encuentran inactivados. Sin embargo, deben emplearse como si se tratara de material infectivo. - Los sueros controles han sido examinados para HBsAg, encontrndose negativos. - Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruidos a fin de asegurar la inactivacin de agentes patgenos. El mtodo recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los lquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentracin final 5%) durante por lo menos 60 minutos. - Si los pocillos de la policubeta no se utilizan en su totalidad, descartar el lquido de los pocillos utilizados en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito sdico. Luego golpear la policubeta varias veces sobre papel absorbente que se descartar como residuo biolgico y lavarla con una solucin alcohlica al 50%. Secarla y cubrir los pocillos empleados en el ensayo con cinta autoadhesiva para evitar su reutilizacin. - No intercambiar reactivos de distintos equipos y lotes. - No emplear reactivos de otro origen. - Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". - El Buffer de Lavado contiene azida sdica. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Buffer de Lavado: preparar en el momento de usar. Antgeno: los peines con antgeno inmovilizado se proveen cerrados y con desecante. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar ni antes que hayan tomado temperatura am870420000 / 00 Pg. 1 de 8
biente, para evitar la humectacin del contenido. Los peines no utilizados deben conservarse dentro del sobre con el desecante, cerrado con cinta autoadhesiva y a 2-10oC. Los peines conservados en estas condiciones pueden ser utilizados dentro de los 2 meses posteriores mientras no se supere la fecha de vencimiento del equipo. MUESTRA Suero o plasma a) Recoleccin: obtener la muestra de la manera usual. b) Aditivos: si se emplea plasma puede utilizarse cualquier anticoagulante de uso corriente en la prctica transfusional. c) Sustancias interferentes conocidas: la hemlisis puede ser causa de resultados errneos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras no diluidas pueden conservarse durante no ms de 4 horas a temperatura ambiente y hasta 7 das refrigeradas (2-10oC). Para conservacin por perodos ms prolongados deben ser congeladas a -20oC o menos. Los congelamientos y descongelamientos reiterados pueden producir falsos positivos y falsos negativos. Si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envo de materiales infecciosos. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - policubetas - recipiente para lavado 2- No provisto - micropipeta de 100 ul - reloj alarma o cronmetro - material volumtrico adecuado CONDICIONES DE REACCION - Tiempo total de reaccin: 20 minutos - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente (> 22oC). Si la temperatura ambiente es menor a 22oC, realizar la reaccin en estufa a 37oC. - Volumen de muestra: 100 ul PROCEDIMIENTO Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el anlisis completarlo sin interrupcin. Procesar simultneamente 1 Control Positivo (en el diente del extremo derecho del peine) y 1 Control Negativo (en el diente del extremo izquierdo del peine). Luego proceder de la siguiente forma: Preparacin del material: Colocar 2 gotas de Diluyente de Muestras en cada pocillo a utilizar de la policubeta. En cada uno de estos pocillos colocar 100 ul de Muestra o Controles. Tener la precaucin de colocar los mismos en el fondo de los pocillos para asegurarse de no producir salpicaduras que puedan contaminar pocillos vecinos. Mezclar aspirando con la
micropipeta varias veces el contenido de cada pocillo a fin de asegurar una correcta homogeneizacin. En la hilera de pocillos contigua a la utilizada para las muestras colocar 3 gotas de Revelador por pocillo a utilizar. Preparar el Buffer de Lavado como se explic en INSTRUCCIONES PARA SU USO. Colocar el Buffer de Lavado en el recipiente destinado a tal fin, teniendo la precaucin de no formar espuma. Este recipiente debe permitir que los dientes del peine queden completamente sumergidos. Realizacin de la prueba: Abrir cuidadosamente el envoltorio y extraer el nmero de peines necesarios para el ensayo. Conservar los restantes como se indic en ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO. Colocar la identificacin de cada muestra directamente en la parte superior del diente correspondiente. Importante: no tocar en ningn momento las zonas reactivas del peine ya que esto puede ocasionar resultados errneos. Colocar el peine en los pocillos de la policubeta que contienen las diluciones de muestras y controles e incubar durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente. Extraer el peine de los pocillos y escurrir las puntas de los dientes tocando sobre papel absorbente. No tocar el papel con la zona reactiva de los dientes. Manteniendo el peine en posicin vertical con los dientes hacia abajo y la zona reactiva de frente al operador sumergir el peine en el Buffer de Lavado. El lavado debe realizarse repitiendo 10 veces un movimiento del peine constante, lento y suave de adelante hacia atrs, sin tocar con el mismo las paredes del recipiente. Escurrir nuevamente las puntas de los dientes como se explic anteriormente. Insertar el peine en los pocillos que contengan el Revelador e incubar a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos. Tener en cuenta que la reaccin positiva se intensifica si se agita durante el revelado, por ejemplo en un agitador de Kline. Al finalizar la incubacin repetir el lavado como se indic ms arriba, empleando el mismo Buffer de Lavado que se usara anteriormente. Colocar el peine sobre una superficie limpia con la zona reactiva hacia arriba y dejar secar completamente antes de observar los resultados. El color del dot se intensifica al secarse. Efectuar la lectura de los resultados bajo luz natural o fluorescente. No emplear lmpara incandescente.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable indefinidamente por lo que el soporte puede conservarse para referencias futuras de los resultados. CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA La corrida se considera vlida si se cumplen simultneamente las siguientes condiciones:
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a) No debe aparecer color detectable en el diente correspondiente al Control Negativo. b) El Control Positivo debe ser ntidamente detectable. Si alguna de estas condiciones no se cumple, repetir la corrida, empleando un nuevo equipo de reactivos. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - El kit est diseado para usar con muestras puras. No utilizar muestras diluidas debido a que las mismas pueden ocasionar resultados falsos negativos. - Debe recordarse que la presencia de anticuerpos anti-HIV en el suero NO es diagnstico de SIDA. Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por mtodos de referencia como Western blot. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposicin o infeccin por HIV. - Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupus eritematoso sistmico, embarazo, vacunacin contra hepatitis B y otras inmunizaciones, hemodilisis, enfermedad heptica y otras enfermedades. PERFORMANCE - En un estudio conducido por el Global Program on AIDS (GPA) perteneciente a la World Health Organization (WHO) se evalu un panel de 600 sueros humanos y 8 paneles de seroconversin. Los datos obtenidos se compararon con Western blot como mtodo de referencia, encontrndose una sensibilidad del 100%, una especificidad del 99,7% y una reproducibilidad del 99,4%. - En un estudio realizado sobre 425 muestras provenientes de pacientes del Instituto de Infectologa Emlio Ribas de San Pablo, se obtuvo una sensibilidad del 99,5%, una especificidad del 96,4% y una eficiencia del 97,8%. - En un estudio realizado sobre dos muestras de HIV-1 grupo O, B7-2705-0001 y JP8-2707-0001, de Boston Biomedica Inc., fueron detectadas las 2 muestras. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Una vez finalizada la prueba y cuando el peine se haya secado completamente, observar los resultados sobre una superficie blanca, a ojo descubierto y con buena iluminacin. Muestra Reactiva: aparicin de una mancha coloreada (rosa tenue a rojo) en la zona reactiva del peine. Siempre que este crculo est presente, an cuando el color sea de menor intensidad que el Control Positivo, indica muestra reactiva. Muestra No Reactiva: no se observa coloracin en la zona reactiva del peine. Toda prueba inicialmente reactiva debe ser ensayada nuevamente por duplicado. Si uno o ambos de los duplicados son Reactivos, se presume que la muestra contiene anticuerpos anti-HIV-1 o anti-HIV-2. Si ambos duplicados resultan No Reactivos se considera el primer resultado como falsamente positivo, presumindose que la muestra no contiene anti-HIV-1 ni anti-HIV-2. Toda muestra Reactiva debe ensayarse nuevamente empleando un mtodo de referencia y realizar la discriminacin para HIV-1/HIV-2.
Esquema de interpretacin Muestra inicial
zona reactiva incolora Muestra No Reactiva
zona reactiva coloreada Muestra Reactiva
Repetir por duplicado
Ambos duplicados No Reactivos
Uno o ambos duplicados Reactivos
Muestra No Reactiva
Confirmar por Western blot y discriminar HIV-1/HIV-2
PRESENTACION Equipo para 48 determinaciones (Cd. 1723201). BIBLIOGRAFIA - Gallo, R.C. y cols. Science 224:500 (1984). - Montagnier, L. - Ann. Inst. Pasteur/Virol., 138, 3-11 (1987). - Centers for Disease Control - Morbidity and Mortality Weekly Report 36/31 (1987). - Lossa, G.R. - Acta Bioq. Cln. Latinoam. XXI/1:47-65 (1987). - NotiWiener N76, pg. 1, abril 1990. - Bansal, J.; Constantine, N.; Zhang, X.; Kataaha, P. - VIIth International Conference on AIDS in Africa, 1992. - Sato, N.; Rojkn, F.; Lorenzo, L.; Piovesana, M.; Beristain, C.; Takeda, A. - XXVII Congreso Brasileiro de Patologa Clnica San Pablo, Brasil - Setiembre 1993. - Lorenzo, L.E. ; Rojkn, L.F. ; Beristain, C.N. - 46th National Meeting, AACC, 17-21 julio, 1994, New Orleans, LA, USA Clin. Chem. 40/60:1036 Abs., 254, 1994. - Rojkn, L.F.; Lorenzo, L.E.; Beristain, C.N.- Resmenes 1 Congreso Argentino de Biotecnologa, II Feria Congreso Latinoamericano de Biotecnologa, 6-8 junio, 1994, Buenos Aires, Argentina, pag. 70. - Report of the WHO evaluation of the DIA (Dot Immuno Assay) HIV 1+ 2 (Wiener lab. - Argentina). Institute of Tropical Medicine, Department Infection and Immunity, WHO Collaborating Centre on AIDS, Division of Microbiology Antwerpen, 24 February, 1995. - Celum C., Coombs R., Jones M. et al. - Arch. Intern. Med. 154:1129 (1994). - Barthel H., Wallance D. - Semin. Arthritis Rheum. 23:1 (1993). - Doran T. and Parra E. - Arch. Fam. Med. 9/9:924 (2000). - Centers for Disease Control - MMWR 50/RR19:59 (2001).
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EXPLICACION DE LOS SIMBOLOS

Antgeno Antgeno Revelador Revelador Control + Diluyente Muestra Diluyente de Muestras Buf. Lavado Conc.
Buffer de Lavado concentrado Control -
Control Positivo
Control Negativo
C
V
X
H l

Cont.
?
F
g
M
Xn
Xi
i
Calibr.
b b c h
Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Autorizado A.N.M.A.T. Cert. N: 5181/04
Wiener lab.
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WL Check
HIV 1+2
Para la deteccin de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV-1 grupo O y anti-HIV-2 en suero, plasma y sangre entera SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son los agentes causales del Sndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Estos retrovirus son transmitidos por la exposicin a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente secreciones genitales y sangre o productos contaminados derivados de la sangre y por pasaje a travs de la placenta. En individuos infectados con estos virus aparecen anticuerpos como respuesta del sistema inmunitario a la invasin viral. La deteccin de dichos anticuerpos es utilizada como herramienta de diagnstico. Los Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades de EE.UU. (CDC), en su iniciativa "Advancing HIV Prevention" (AHP) destacan la importancia de la utilizacin de pruebas rpidas de deteccin del HIV para facilitar el acceso al diagnstico precoz en zonas de alta prevalencia, en individuos de alto riesgo o en zonas donde otros mtodos de diagnstico como ELISA, Western Blot o amplificacin de cidos nucleicos no estn disponibles. Tambin son de gran utilidad en el momento del parto, especialmente para el diagnstico de mujeres que no hayan sido controladas durante el embarazo. Por otra parte, estas pruebas rpidas constituyen una herramienta diagnstica que puede desempear un papel importante en campaas de prevencin y diagnstico en entornos clnicos y no clnicos, facilitando de esta manera, la deteccin precoz de la infeccin. FIN Y USO WL Check HIV 1+2 es una prueba rpida que detecta conjuntamente la presencia de anticuerpos anti-HIV-1, anti-HIV1 grupo O y anti-HIV-2, destinada a diagnstico clnico o estudios de campo. No est destinada como prueba de tamizaje de anticuerpos anti-HIV 1 y 2 para donantes de sangre y derivados. FUNDAMENTOS DEL METODO WL Check HIV 1+2 es un ensayo inmunocromatogrfico "in vitro", de lectura visual, para la deteccin cualitativa de anticuerpos contra los virus HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre entera. La prueba consta de un cassette plstico que contiene: - una membrana de nitrocelulosa sensibilizada con antgenos recombinantes para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) en la zona de prueba "T". - un parche impregnado con antgenos recombinantes especficos para HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) conjugados a oro coloidal. La muestra y el buffer se agregan en el pocillo de muestra "S" solubilizando y mezclndose con el conjugado de antgenos recombinantes. Seguidamente, esta mezcla migra por capilaridad a travs de la membrana de nitrocelulosa. Si la muestra es reactiva, los anticuerpos anti HIV-1 y HIV-2 presentes, formarn un complejo con los antgenos conjugados a oro coloidal. Este complejo se unir posteriormente a los antgenos inmovilizados en la zona de prueba "T" de la membrana de nitrocelulosa, formando as una lnea de color rosa-rojo prpura. La ausencia de dicha lnea indica un resultado negativo. Como control de procedimiento, la prueba incluye una zona de control "C" de color celeste que cambia a color rosa-rojo prpura tras el paso de la muestra. La ausencia de esta lnea invalida los resultados. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: cassette plstico compuesto por una membrana de nitrocelulosa sensibilizada con antgenos recombinantes especficos para HIV-1 y HIV-2 y conjugado de antgenos recombinantes. Listo para usar. B. Reactivo B: buffer borato de sodio 15 mM, azida 0,95 g/L, agente tensioactivo, pH = 9,1. Listo para usar. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipeta automtica para medir los volmenes indicados. - Dispositivo de 20 uL descartable para toma de sangre entera capilar (slo provisto en algunas presentaciones) - Tips descartables. - Reloj alarma o cronmetro. - Material para extraccin de muestra. - Guantes descartables, guardapolvo, proteccin ocular. - Contenedor para el descarte de residuos biolgicos. - Hipoclorito de sodio. PRECAUCIONES - Leer el manual de instrucciones de manera completa antes de realizar el ensayo y seguir las instrucciones cuidadosamente. - No realizar la prueba si el envase est daado. - No utilizar los reactivos despus de la fecha de vencimiento indicada en el envase. - Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". - Esta prueba proporciona un resultado cualitativo y visual. Es necesaria una buena fuente de luz para la lectura de los resultados. - No mezclar reactivos de diferentes lotes. - No utilizar reactivos de otro origen. - No tocar la membrana de nitrocelulosa con los dedos. - Seguir las prcticas de seguridad biolgica al utilizar muestras y reactivos:
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. Manipular todas las muestras de pacientes como potencialmente infecciosas. . Utilizar guantes, guardapolvo y proteccin ocular. . No pipetear con la boca. . No comer, beber, fumar, utilizar maquillaje ni manejar lentes de contacto en los lugares donde se trabaje con estos materiales. . Limpiar y desinfectar las salpicaduras de muestra o reactivos usando hipoclorito sdico (concentracin final 5%) u otro desinfectante adecuado. Para inactivar el material empleado autoclavar durante 1 hora a 121oC. - Evitar la formacin de burbujas en el pocillo de muestra "S" tanto al colocar la muestra como el Reactivo B. Al dispensar el Reactivo B descartar cualquier gota con burbuja. - Durante la realizacin de la prueba, colocar el cassette sobre una superficie limpia, plana y sin vibraciones. - No agitar el cassette durante la realizacin del ensayo. - El cassette y el dispositivo para toma de sangre entera capilar, son descartables. No reutilizar. Desechar en recipientes destinados a residuos con riesgo biolgico. - El Reactivo B posee azida sdica en bajas concentraciones como conservante. - Los reactivos y las muestras deben ser descartados de acuerdo a la normativa vigente. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El kit es estable a 2-30oC hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. En caso de almacenar refrigerado, asegurarse que el sobre alcance temperatura ambiente antes de ser utilizado, de lo contrario se favorecer la humectacin del contenido. El cassette debe permanecer en su sobre original sellado. No abrir el envoltorio hasta el momento de usar. MUESTRA Suero, plasma y sangre entera obtenida por puncin venosa o puncin capilar a) Recoleccin: recoger las muestras aspticamente y de manera tal de evitar hemlisis. - Suero: obtenido de sangre entera sin anticoagulantes. Separar el suero del cogulo inmediatamente para evitar hemlisis. Puede utilizarse suero obtenido en tubos con acelerador y gel separador. - Plasma: utilizar plasma recogido con EDTA, citrato o heparina. - Sangre entera (puncin venosa): utilizar sangre recogida con EDTA, citrato o heparina. - Sangre entera (puncin capilar): utilizar sangre recogida con el dispositivo descartable (slo provisto en algunas presentaciones). Realizar la prueba inmediatamente. En caso de utilizar otro dispositivo, es responsabilidad del usuario validar el dispositivo de toma de sangre entera capilar. b) Estabilidad y almacenamiento: - Suero y plasma: conservar a 2-10oC. En caso de no realizar la prueba dentro de los 5 das conservar la muestra a -20oC. No es recomendable realizar mltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto puede generar
resultados errneos. En caso de usar muestras congeladas, stas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de usar. - Sangre (puncin venosa): puede almacenarse hasta 3 das entre 2-10C. No congelar. - Sangre (puncin capilar): utilizar inmediatamente. No congelar. c) Sustancias Interferentes: en sueros y plasmas enriquecidos, no se ha observado interferencia por: - Hemlisis: hasta 1,1 g/dL de hemoglobina. - Lipemia: hasta un equivalente de triglicridos de 1500 mg/dL, tras enriquecer con Intralipid. - Bilirrubina: hasta 30 mg/dL. - Acido ascrbico: hasta 50 mg/dL. d) Transporte: si las muestras deben ser transportadas, embalar de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envo de material infeccioso.
PROCEDIMIENTO 1- Los reactivos y las muestras deben estar a temperatura ambiente (18-30oC) antes de utilizar. 2- Extraer el cassette de su sobre sellado inmediatamente antes de utilizar. 3- Colocar el cassette sobre una superficie limpia, plana y sin vibraciones. 4- Agregar la muestra sobre la superficie absorbente del pocillo de muestra "S". PARA SUERO O PLASMA - Colocar 10 uL con micropipeta automtica. - Esperar 10-15 seg. hasta que se absorba la muestra. - Agregar 3 gotas (100 uL) de Reactivo B en el pocillo de muestra "S". - Iniciar el cronmetro. PARA SANGRE ENTERA - Colocar 20 uL con micropipeta automtica.* - Esperar 10-15 seg. hasta que se absorba la muestra. - Agregar 3 gotas (100 uL) de Reactivo B en el pocillo de muestra "S". - Iniciar el cronmetro. Nota: *en caso de utilizar sangre entera capilar, usar el dispositivo de 20 uL descartable (slo provisto en algunas presentaciones) 5- En cualquiera de los casos, leer los resultados entre los 20 y 30 minutos. No leer pasado los 30 minutos ya que pueden obtenerse resultados errneos. Algunas muestras positivas reaccionan inmediatamente mientras que otras lo hacen ms lentamente dentro del tiempo de lectura indicado. Debido a caractersticas particulares de algunas muestras, el color de fondo de la membrana puede quedar ligeramente rosado sin afectar la interpretacin de los resultados.
CRITERIOS DE VALIDACION DE LA PRUEBA - El cassette cuenta con una lnea de color celeste en la zona de control "C" que permite identificar la determinacin WL Check HIV 1+2 e indica que los componentes de la prueba estn presentes y activos.
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- Al realizar el ensayo la lnea de color celeste debe cambiar a color rosa-rojo prpura. Este cambio de color confirma que se ha agregado el volumen adecuado de muestra, que su migracin fue apropiada y que la realizacin del procedimiento fue correcta. - Es responsabilidad del usuario efectuar el Control de Calidad del equipo de acuerdo a las normas locales vigentes. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS POSITIVO NEGATIVO INVALIDO
C T
C T
C T
C T
C T
Resultado Positivo (2 lneas): se observan 2 lneas de color rosa-rojo prpura, una en la zona de prueba "T" y otra en la zona de control "C". La intensidad de color de la lnea "T" depender de la muestra en estudio. Cualquier color rosado visible, aunque sea muy tenue debe ser interpretado como positivo. El resultado es positivo aunque las intensidades del color de las lneas "T" y "C" sean diferentes. Resultado Negativo (1 lnea): se observa solamente una lnea de color rojo-rosa prpura en la zona de control "C". No aparece lnea de color en la zona de prueba "T". Resultado Invlido: la ausencia de la lnea de color rosarojo prpura en la zona de control "C" invalida el resultado, aunque est o no presente la lnea de color rosa-rojo prpura en la zona de prueba "T". Un resultado invlido generalmente indica un error en la realizacin del procedimiento o un problema con la muestra. Con determinadas muestras pueden aparecer dificultades como migracin incompleta, muestra muy viscosa o presencia de fibrina. En cualquier caso, revisar el procedimiento, centrifugar nuevamente la muestra y repetir el ensayo utilizando un nuevo cassette.
Algoritmo de interpretacin Muestra original Resultado Positivo por WL Check HIV 1+2 Repetir por duplicado Uno o ambos duplicados Positivos por WL Check HIV 1+2 POSITIVO Realizar otra prueba (ej.: ELISA) y confirmar por Western Blot NEGATIVO Ambos duplicados Negativos por WL Check HIV 1+2 NEGATIVO Resultado Negativo por WL Check HIV 1+2
Nota: tener en cuenta las normativas especficas de cada pas para el diagnstico de infeccin por HIV LIMITACIONES DEL METODO - WL Check HIV 1+2 es una prueba complementaria en el diagnstico del HIV. Cualquier resultado obtenido con esta prueba debe ser cotejado con los datos clnicos del paciente antes de realizar el diagnstico definitivo. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infeccin por HIV. Se puede obtener un resultado falso negativo en las siguientes circunstancias: . Niveles bajos de anticuerpos anti-HIV en estadios tempranos de la infeccin. . Infeccin con una variante del virus que no se detecta con esta prueba. Por estas razones se debe tener cuidado al interpretar un resultado negativo, especialmente en pacientes con presencia de sntomas clnicos y factores de riesgo. En este caso se recomienda analizar una nueva muestra obtenida con posterioridad. - Muestras positivas por WL Check HIV 1+2 indican la presencia de anticuerpos anti-HIV-1 y anti-HIV-2. Estas muestras deben ser repetidas utilizando otro mtodo (como ELISA) y confirmadas por Western Blot. El diagnstico puede ser establecido solamente luego de interpretar los resultados junto con los datos clnicos del paciente. - Para un resultado positivo, la intensidad de color de la lnea "T" no necesariamente se correlaciona con la concentracin de anticuerpos anti-HIV especficos en la muestra. - Pueden obtenerse resultados falsos positivos en las siguientes situaciones: enfermedades autoinmunes, tuberculosis, lupus eritematoso sistmico, embarazo, vacunacin contra hepatitis B y otras inmunizaciones, hemodilisis, enfermedad heptica y otras enfermedades. - WL Check HIV 1+2 ha sido diseado para la deteccin de anticuerpos contra HIV-1 y HIV-2 en suero, plasma y sangre entera humana. No utilizar otros fluidos biolgicos como saliva, lquido cefalorraqudeo u orina. - Pueden obtenerse resultados errneos con muestras de suero o plasma con aspecto turbio debido a contaminacin bacteriana o por haber sido sometidas a varios ci-
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clos de congelacin y descongelacin. - La utilizacin de muestras inactivadas por calor puede proporcionar resultados incorrectos. - No utilizar pooles de muestras o muestras diluidas. - Ver sustancias interferentes en MUESTRA. PERFORMANCE a) Sensibilidad Sensibilidad Clnica en Paneles de Performance En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales, se obtuvieron los siguientes resultados: - PRB 108 (Anti-HIV 1 Low Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 13 de las 14 muestras reactivas. - PRB 109 (Anti-HIV 1 Low Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 15 de las 19 muestras reactivas. - PRB 204 (Anti-HIV 1 Mixed Titer Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 23 de las 23 muestras reactivas. - WWRB303 (Worldwide HIV Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 13 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 grupo M (subtipos A, B, C, D, F y G), HIV-1 grupo O y HIV-2. - WWRB350 (Worldwide HIV Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 18 de las 18 muestras reactivas para HIV-1 grupo M (subtipos A, CRF02_AG, B, C, D, CRF01_AE, F, G y H). - PRB 601 (HIV-1 Incidence/Prevalence Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 15 de las 15 muestras reactivas para HIV-1 correspondientes a infecciones recientes y de larga duracin. - PRZ 204 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PRZ 205 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PRZ 207 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel, Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas para HIV-1 y HIV-2. - PP 0508 (Panel de Performance para HIV, Q Panel, Brasil): se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas. - PP 0409 (Panel de Performance para HIV, Q Panel, Brasil): se detectaron 16 de las 16 muestras reactivas. Sensibilidad Clnica en Paneles de Seroconversin En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales de seroconversin (Sera Care Life Sciences, USA - BBI Diagnostics), se obtuvieron los siguientes resultados:
Nombre del panel Tiempo (das) en el cual la muestra es reactiva Dias desde el primer sangrado WL Check Western Blot HIV 1+2 (datos Sera Care)
PRB 916-P PRB 919-S PRB 924-X PRB 925-Y PRB 929-AD PRB 930-AE PRB 944-AT PRB 947-AW PRB 949-AY PRB 951-BA PRB 952-BB PRB 953-BC PRB 966
0, 4, 9, 15, 30, 35 0, 9, 11 0, 2, 8, 10, 26, 33, 35, 40 0, 10, 18, 22, 44, 49 0, 4, 14, 18, 21, 25, 28 0, 3, 7, 10 0, 2, 7, 9, 14, 16 0, 9, 11, 20 0, 6, 9, 18, 20 0, 2, 8, 11, 15, 19 0, 7, 10, 14, 17, 21 0, 3, 7, 10 0, 2, 20, 22, 30, 35, 37, 44, 48, 51
30 9 33 44 25 7 14 9 20 19 17 10 48
30 9 35 (Indet) 44 (Indet) 25 (Indet) 10 (Indet) 14 (Indet) 9 (Indet) 20 (Indet) Negativo hasta 19 das 14 (Indet) Negativo hasta 10 das Negativo hasta 51 das
Indet: indeterminadas
Sensibilidad Clnica en Paneles de muestras reactivas En un estudio de 68 muestras reactivas, incluidas 4 muestras HIV-1 grupo O, provenientes de una institucin hospitalaria, se detectaron las 68 muestras. En otro estudio se suplementaron 30 sangres enteras con 30 sueros positivos para HIV y se evaluaron en paralelo las sangres enteras suplementadas y los respectivos sueros. Se detectaron la totalidad de las muestras (sangres enteras y sueros). En otro estudio se evaluaron, en paralelo, 15 muestras reactivas de suero y plasma obtenidas del mismo paciente y para 10 de estas muestras tambin se evalu sangre entera obtenida por puncin capilar. Con todos los tipos de muestras se tuvieron resultados positivos. b) Especificidad En un estudio realizado sobre 1122 muestras de sueros, plasmas y sangres enteras provenientes de tres centros de salud diferentes, se encontr una especificidad de 99,91% con un IC95% = 99,49% - 99,98%. En otro estudio realizado sobre 417 muestras de banco de sangre, la especificidad obtenida fue de 99,76% con un IC95% = 98,65% - 99,96%. Para 100 muestras de las 417 se evaluaron, en forma paralela, muestras de suero y plasma del mismo paciente y para 40 de estas 100 muestras tambin se evalu sangre entera obtenida por puncin capilar. Con todos los tipos de muestras se tuvieron resultados negativos. En otro estudio de 393 muestras de sueros y plasmas de tres centros de salud diferentes, se encontr una especificidad de 99,24% con un IC95% = 97,78% - 99,74%. Tambin se estudi la posible aparicin de reactividades cruzadas ensayando muestras provenientes de 440 individuos con diferentes condiciones clnicas que pueden ser causantes de reacciones inespecficas para el ensayo WL Check HIV 1+2. Estas condiciones incluyen mujeres em-
PRB 904-D PRB 912-L
0, 21, 49, 92, 99 0, 9, 14, 16, 28, 30
92 0
92 9
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barazadas, pacientes hemodializados, pacientes con enfermedades autoinmunes o enfermedades infecciosas diferentes a HIV (Chagas, HTLV, Hepatitis C, Hepatitis B, Sfilis, otras). Para esta poblacin la especificidad fue de 98,18% con un IC95% = 96,45% - 99,08%. c) Precisin Se evalu la precisin del test siguiendo el protocolo EP5-A reLnea T Media (DO) Muestra positiva 1 Muestra positiva 2 Muestra positiva 3 Muestra positiva 4 (en dilucin) Muestra negativa 0,221 0,085 0,271 0,049 (-) Intraensayo S 0,027 0,018 0,044 0,017 NC CV 12,36% 20,88% 16,40% 35,79% NC S 0,032 0,021 0,049 0,017 NC
comendado por el CLSI (ex NCCLS). Los ensayos fueron realizados con 4 muestras positivas con diferentes niveles de reactividad y con 1 muestra negativa. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado por el transcurso de 20 das. Los resultados fueron ledos a los 20 minutos en un lector inmunocromatogrfico y en forma visual. Las muestras positivas siempre dieron un resultado reactivo y la muestra negativa siempre dio un resultado no reactivo. Lnea C Total CV 14,36% 24,23% 18,02% 35,36% NC Media (DO) 0,676 0,686 0,702 0,679 0,591 Intraensayo S 0,066 0,077 0,070 0,075 0,073 CV 9,69% 11,22% 9,94% 11,11% 12,34% S 0,078 0,087 0,076 0,085 0,104 Total CV 11,61% 12,61% 10,80% 12,59% 17,61%
N = 80; (-) = no reactivo por lectura visual; NC = no corresponde PRESENTACION 25 determinaciones (Cd. 1690319) BIBLIOGRAFIA - Centro Nacional de referencia para el SIDA (http:// www.cnrsida.org.ar) - Centers for Disease Control and Prevention: Rapid HIV Testing (http://www.cdc.gov/hiv/topics/testing/rapid/ index.htm) - Greenwald JL, Burstein GR, Pincus J, Branson B. - A rapid review of rapid HIV antibody tests. - Curr. Infect. Dis. Rep. 8/2:125 (2006). - Centers for Disease Control and Prevention: Advancing HIV Prevention: New Strategies for a Changing Epidemic, United States, 2003. MMWR 2003, 52:329332. (http:// www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5215a1.htm) - Centers for Disease Control and Prevention: Notice to Readers: Protocols for Confirmation of Reactive Rapid HIV Tests. MMWR 2004, 53:221-222 (http://www.cdc.gov/mmwr/ preview/mmwrhtml/mm5310a7.htm) - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. EP5-A, Vol. 19, N 2, NCCLS. - User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. EP12-A, Vol. 22, N 14, NCCLS. - Procedures and Devices for the Collection of Diagnostic Capillary Blood Specimens; Approved Standard, 5 Edicin. H4-A5, Vol. 24, N 21, CLSI (ex NCCLS). - Evaluation of Stability of In Vitro Diagnostic Reagents. Approved Guideline. EP-25A, Vol. 29, N 20, CLSI (ex NCCLS).
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HIV 1+2
ELISA 3 Generacin
Ensayo inmunoenzimtico (ELISA) para la deteccin de anticuerpos anti- HIV-1 y anti HIV-2 en suero o plasma SIGNIFICACION CLINICA Los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 y HIV-2) son los agentes causales del Sndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Estos retrovirus son transmitidos por la exposicin a ciertos fluidos corporales infectados, principalmente secreciones genitales y sangre o productos contaminados derivados de la sangre y por pasaje a travs de la placenta. La evidencia serolgica de la infeccin por HIV-1 y HIV-2 puede ser obtenida determinando la presencia de antgenos y anticuerpos en el suero de individuos en los que se sospecha la infeccin. Los antgenos pueden generalmente ser detectados en la fase aguda y durante la fase sintomtica de la enfermedad. Los anticuerpos pueden ser detectados a lo largo de toda la infeccin, comenzando en la fase aguda o inmediatamente despus de ella. El ensayo HIV 1+2 ELISA 3 Generacin est diseado para detectar anticuerpos contra HIV-1, HIV-1 grupo O y HIV-2. FUNDAMENTOS DEL METODO Los pocillos de la policubeta estn recubiertos con antgenos recombinantes de los virus HIV-1 y HIV-2. La muestra se incuba en los pocillos. Si la muestra contiene anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2, los mismos se unirn a los antgenos sensibilizados en la placa. El material no unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el conjugado que contiene los mismos antgenos de la placa conjugados a peroxidasa. Estos se unirn a los anticuerpos si estaban presentes en la muestra. El conjugado no unido se remueve por lavado. A continuacin se agrega una solucin conteniendo tetrametilbencidina y perxido de hidrgeno. Las muestras reactivas desarrollan color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reaccin con cido sulfrico. REACTIVOS PROVISTOS Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con 96 pocillos recubiertos con antgenos recombinantes de HIV-1 y HIV-2. Conjugado: antgenos recombinantes unidos a peroxidasa. Color rojo. Revelador: solucin de tetrametilbencidina (TMB) y perxido de hidrgeno. Stopper: cido sulfrico 2 N. Buffer de Lavado Concentrado: buffer salino con tensioactivo (25x). Color verde. Control Positivo: suero humano inactivado conteniendo anticuerpos anti-HIV-1 y HIV-2. Color naranja. Control Negativo: suero humano no reactivo inactivado. Color amarillo. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada o desionizada. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipetas para medir los volmenes indicados - Tips descartables - Material volumtrico para preparar las diluciones indicadas - Estufa a 37oC - Papel absorbente - Guantes descartables - Reloj alarma o cronmetro - Hipoclorito de sodio - Sistema de lavado de policubetas (manual o automtico) - Espectrofotmetro para lectura de policubetas PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnstico in vitro. -Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infeccin. - Los sueros controles han sido examinados para antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y anticuerpos contra el virus de hepatitis C (HCV), encontrndose no reactivos. Sin embargo, se recomienda manipularlos con las precauciones requeridas para muestras potencialmente infecciosas. - Al descartar los materiales empleados en el ensayo se deben tratar a fin de asegurar la inactivacin de agentes patgenos. El mtodo recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los lquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentracin final 5%) durante por lo menos 60 minutos. - No intercambiar reactivos de distintos lotes. - No emplear reactivos de otro origen. - Evitar tocar las paredes de los pocillos con los tips. - No utilizar elementos metlicos que puedan entrar en contacto con los reactivos. - Las policubetas deben incubarse en estufa. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. No usar bao de agua. - Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los recipientes para desechos biolgicos u otras fuentes entren en contacto con los reactivos, ya que el hipoclorito afecta la reaccin. - Evitar contacto del cido sulfrico (Stopper) con piel y mucosas. R36/38: irrita los ojos y la piel. R34: provoca quemaduras. S24/25: evtese el contacto con los ojos y la piel. S26: en caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S28: en caso de contacto con la piel, lvese inmediata y abundantemente con agua. S37/39: usar guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara.
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- Evitar el derrame de lquidos y formacin de aerosoles. - No pipetear con la boca. Usar guantes descartables y proteccin en los ojos durante la manipulacin de las muestras y reactivos del ensayo. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa vigente. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Es importante que todo el material utilizado para la preparacin de los reactivos est limpio y libre de detergente e hipoclorito. Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo concentrado pueden precipitar. En tal caso, llevar la solucin a 37oC hasta disolucin completa. Para la obtencin del buffer de lavado listo para usar, diluir una parte de Buffer de Lavado Concentrado (25x) con 24 partes de agua destilada o desionizada. Ej.: 20 ml con 480 ml para una policubeta. Policubeta sensibilizada, Conjugado, Revelador, Stopper, Control Positivo y Control Negativo: listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de Lavado Concentrado y Stopper: se pueden conservar a una temperatura entre 2 y 25oC. Buffer de lavado (1x): una vez diluido es estable 3 meses a temperatura entre 2 y 25oC. Policubeta sensibilizada: no abrir el sobre hasta el momento de usar, ni antes que haya tomado temperatura ambiente, de lo contrario se favorecer la condensacin de humedad sobre la superficie de los pocillos. Las tiras no utilizadas deben conservarse entre 2-10oC dentro del sobre con desecante bien cerrado. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 4 meses posteriores mientras no supere la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero o plasma a) Recoleccin: obtener la muestra de la manera habitual. b) Aditivos: no se requieren para suero. Para las muestras de plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como anticoagulante. c) Sustancias Interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina hasta 30 mg/dl, cido ascrbico hasta 50 mg/dl, triglicridos hasta 1500 mg/dl o hemoglobina hasta 270 mg/dl. Muestras conteniendo partculas debern clarificarse mediante centrifugacin. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra se debe conservar refrigerada (2-10oC). En caso de no realizar el anlisis dentro de las 72 horas se debe congelar a -20oC. No se recomienda realizar mltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento. Esto puede generar resultados errneos. En caso de utilizar muestras congeladas, stas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de su uso.
La inactivacin por calor puede afectar el resultado. No utilizar muestras con contaminacin microbiana. Si las muestras deben ser transportadas, embalarlas de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envo de material infeccioso.
PROCEDIMIENTO 1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. 2- Preparar el volumen necesario de buffer de lavado diluido. 3- Colocar en el soporte de tiras, el nmero de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a realizar, incluyendo 2 pocillos para el Control Positivo (CP) y 3 para el Control Negativo (CN). 4- Dispensar la Muestra (M) y los controles segn el siguiente esquema: M Control Positivo Control Negativo Muestra 50 ul CP 50 ul CN 50 ul -
5- Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con la cinta autoadhesiva provista, e incubar 30 2 minutos a 37oC 1oC. 6- Despus de la incubacin eliminar el lquido de cada pocillo por completo. Lavar 5 veces segn instruccin de lavado (ver Procedimiento de Lavado). 7- Agregar el Conjugado: Conjugado 100 ul 100 ul 100 ul
8- Para evitar la evaporacin cubrir la policubeta con cinta autoadhesiva. Incubar 30 2 minutos a 37oC 1oC. 9- Lavar 5 veces segn instruccin de lavado. 10- Dispensar el Revelador trasvasando a un recipiente limpio solamente el volumen necesario. No devolver el Revelador restante al frasco original. Evitar el contacto del reactivo con agentes oxidantes. Revelador 100 ul 100 ul 100 ul
11- Incubar 30 2 minutos a temperatura ambiente (1825oC), protegido de la luz. 12- Agregar el Stopper: Stopper 100 ul 100 ul 100 ul
13- Leer absorbancia en espectrofotmetro en forma bicromtica a 450/620-650 nm o a 450 nm. Nota: se recomienda realizar siempre la lectura en forma bicromtica. En caso de que la lectura sea monocromtica, realizar un blanco de reactivos que luego deber ser restado de todos los valores de las muestras.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable durante 10 minutos, por lo que los resultados deben leerse dentro de ese lapso.
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PROCEDIMIENTO DE LAVADO Eliminar el lquido de los pocillos por aspirado o volcado. Los pocillos se lavan con 350 ul de buffer de lavado diluido. Asegurar que la altura alcanzada al llenar los pocillos no cause desbordes. La solucin de lavado debe estar en contacto con los pocillos entre 30 y 60 segundos. Garantizar que luego del ltimo lavado no quede lquido residual. Realice un doble aspirado para eliminar el excedente de buffer. Si persiste luego de este procedimiento, invertir la placa sobre papel absorbente y golpearla varias
veces, de lo contrario podrn obtenerse resultados errneos. Nota: el procedimiento de lavado es crtico para el resultado del ensayo. Si queda buffer de lavado en el pocillo o si los pocillos no estn completamente llenos se obtendrn resultados errneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el procedimiento. Los lavadores automticos deben ser enjuagados con agua destilada o desionizada al final del da para evitar obstrucciones debido a las sales presentes en el buffer de lavado.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO ETAPA Dilucin Muestras Incubacin Lavado PROCEDIMIENTO Preparacin de la solucin de lavado (1x) Agregar 50 ul de M, CP e CN Cubrir los pocillos e incubar durante 30 2 mi- En estufa nutos a 37 1oC Lavar cada pocillo con 350 ul de buffer de lavado (5 veces) Agregar 100 ul de Conjugado Cubrir los pocillos e incubar durante 30 2 mi- En estufa nutos a 37 1oC Idem al lavado anterior Agregar 100 ul de Revelador Trasvasar el volumen necesario de Revelador a usar. No pipetear del frasco original. Descartar el reactivo remanente. Evitar el contacto com agentes oxidantes. Mantener la policubeta protegida de la luz Leer dentro de los 10 minutos 5. La diferencia entre el promedio de las D.O. de los Controles Positivos y Controles Negativos debe ser 1,100. Si una de estas condiciones no se cumple, repetir el ensayo. Recordar que las lecturas obtenidas dependern de la sensibilidad del aparato empleado. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS a) Con instrumental ptico: La presencia o ausencia de anticuerpos anti-HIV-1 o HIV-2 se determina relacionando la absorbancia de la muestra respecto al valor del Cut-off. Cut-off = CN + 0,250 CN: promedio de las D.O. del Control Negativo Ejemplo: 0,018 + 0,250 = 0,268 Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias menores al Cut-off Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias mayores o iguales al Cut-off. Tiempo de contacto de la solucin de lavado de 30 e 60 segundos. Eliminar completamente el lquido residual de los pocillos PRECAUCIONES/OBSERVACIONES Disolucin de los cristales de sales
Conjugado Incubacin Lavado Revelado
Incubacin Detencin Lectura
Durante 30 2 minutos entre 18-25oC Agregar 100 ul de Stopper Leer en espectrofotmetro
CRITERIOS DE VALIDACION DEL ENSAYO El ensayo se considera vlido si se cumplen simultneamente las siguientes condiciones: 1. El promedio de las densidades pticas (D.O.) de los Controles Negativos deben ser 0,050. Ejemplo: Lectura 1 = 0,015, Lectura 2 = 0,018, Lectura 3 = 0,021 Promedio = (0,015+0,018+0,021) / 3= 0,018 2. Eliminar cualquier Control Negativo con D.O. > 0,050. 3. Si se ha eliminado algn Control Negativo, volver a calcular el promedio de los Controles Negativos. Un ensayo es vlido si se aceptan al menos dos de los Controles Negativos. 4. El promedio de las D.O. de los Controles Positivos debe ser 1,200. Ejemplo: Lectura 1 = 1,658, Lectura 2 = 1,721 Promedio = (1,658+1,721) / 2 = 1,689
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b) Interpretacin visual: Si se opta por este tipo de interpretacin, debe considerarse No Reactiva toda muestra que no presente una coloracin mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra netamente amarilla se considera Reactiva. Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por duplicado. Si una o ambas repeticiones dan positivas, la misma debe considerarse reactiva. Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto puede deberse a: - Contaminacin cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva. - Contaminacin de la muestra durante la dispensacin, imprecisin en el dispensado de muestra, conjugado y/o Revelador en el pocillo - Reutilizacin de tips. - Contaminacin del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes. En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reaccin falsamente reactiva, tanto en el anlisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este fenmeno pueden ser: - Contaminacin de la muestra durante la extraccin, procesamiento o conservacin. - Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos, frmacos, etc. - Dispensacin y/o aspirado ineficiente de la solucin de lavado (sistema obstruido). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Ver Sustancias Interferentes conocidas en Muestra. - No se debe utilizar pool de muestras. - No se deben utilizar otros fluidos corporales como la saliva, lquido cefalorraqudeo u orina. - Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposicin o infeccin por HIV-1 o HIV-2. Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por un mtodo confirmatorio, de acuerdo a la normativa legal vigente. - No utilizar muestras inactivadas por calor ya que pueden ocasionar resultados falsos positivos. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE PERFORMANCE Sensibilidad clnica a) Sensibilidad clnica con paneles de seroconversin (BBI, Boston Biomedica Inc)
Das desde la recoleccin de la muestra Tiempo (das) en que la muestra se torna reactiva HIV 1+2 ELISAHIV ELISA 3 3 Gen. Gen. (BBI) W. Blot (BBI)
PRB 925-Y PRB 930-AE
0, 10, 18, 22, 44, 49 0, 3, 7, 10
44 7
44 7
44 (Indet) 10 (Indet)
PRB 934 AI
PRB 944-AT PRB 945 AU PRB 947-AW PRB 949-AY PRB 951-BE PRB 952-BB PRB 953-BC PRB 966
0, 7, 11
0, 2, 7, 9, 14, 16 0, 3, 13, 15, 20 0, 9, 11, 20 0, 6, 9, 18, 20 0, 2, 8, 11, 15, 19 0, 7, 10, 14, 17, 21 0, 3, 7, 10 0, 2, 20, 22, 30, 35, 37, 44, 48, 51
7
14 15 9 20 19 17 10 48
7
14 13 9 20 19 14 7 48
ND
14 (Indet) 20 20 20 (Indet) No reactivo 17 No reactivo No reactivo
Indet: indeterminadas
b) Sensibilidad clnica en Paneles de Performance En un estudio realizado sobre diferentes paneles comerciales internacionales, se obtuvieron los siguientes resultados: -PRZ 207 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel): se detectaron 14 de las 14 muestras reactivas. -PRZ 206 (Anti-HIV-1/2 Combo Performance Panel) se detectan 11 de las 12 muestras reactivas. c) Sensibilidad en paneles de muestras reactivas anti-HIV En un estudio realizado sobre 123 muestras de pacientes con infeccin por HIV-1 confirmados por diferentes mtodos, se encontraron reactivas la totalidad de las muestras con el kit HIV 1+2 ELISA 3 Generacin. b) Especificidad En un estudio realizado sobre 3004 muestras de sueros y plasmas de cinco centros de salud diferentes, se encontraron 33 muestras reactivas de las cuales 28 fueron confirmadas por otros mtodos, obtenindose una especificidad del 99,83% Se estudio la posible aparicin de reactividad cruzada en 272 muestras provenientes de individuos con diferentes condiciones clnicas que podran ser causantes de reacciones inespecficas en el ensayo HIV 1+2 ELISA 3 Generacin. Este grupo incluye muestras: - con anticuerpos contra HAV, HBV, EBV, CMV, HSV, VZV, HCV, HTLV y otros virus - con anticuerpos contra Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Toxoplasma gondii, Toxocara canis, Trypanosoma cruzi y otros microorganismos. - con diferentes autoanticuerpos (AGA, AMA, ATA, FAN, factor reumatoideo y otros) La especificidad en esta poblacin fue de 97,42%. En otro estudio sobre 91 plasmas de mujeres embarazadas se observ una especificidad del 98,9%. c) Precisin Se evalu la precisin del test siguiendo el protocolo EP5A recomendado por la NCCLS. Los ensayos fueron realizados con muestras de diferentes niveles de reactividad y con
Nombre del panel
PRB 904-D PRB 912-L PRB 916-P PRB 919-S PRB 924-X
0, 21, 49, 92, 99 0, 9, 14, 16, 28, 30 0, 4, 9, 18, 30, 35 0, 9, 11 0, 2, 8, 10, 26, 33, 35, 40
92 0 30 9 33
92 0 30 9 33
92 9 30 9 35 (Indet)
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los controles. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado por el transcurso de 20 das. Muestra M1 M2 C (+) C (-) n= 80 PRESENTACION - 96 determinaciones (Cd. 1723096) - 192 determinaciones (Cd. 1723192) BIBLIOGRAFIA - Gallo, RC - Retrovirology 3:72, 2006. - Fauci, AS - Nature Medicine 9/7:839-843, 2003. - Fiebig, EW et al. - AIDS 17 /13:1871-1879, 2003. - WHO - HIV Testing, Treatment and Prevention. Generic tools for operational research, 2009. - WHO - AIDS Epidemic update, 2009. - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A 19/2 (1999) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Specifications for Immunological Testing for Infectious Diseases. Approved Guideline I/LA18-A2 (1994) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Clinical Evaluation of Immunoassays. Approved Guideline I/LA21-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Interference testing in Clinical Chemistry. Approved Guideline EP7-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Media (D.O.) 0,354 0,790 1,273 0,014 Intra-ensayo D.S. 0,026 0,073 0,056 0,002 C.V. 7,34% 9,24% 4,40% 15,22% Inter-ensayo D.S. 0,037 0,107 0,096 0,003 C.V. 10,45% 13,54% 7,54% 23,19%

Policubeta Sensib. Buf. Lavado Conc. Policubeta sensibilizada Conjugado Conjugado Revelador Revelador Stopper Stopper Buffer de Lavado Concentrado Control +
Control Positivo Control -
Control Negativo

V
Cont.
C
X
H l
G
F
g
M
Xn
Xi
i
Calibr.
b b c h

Wiener lab.
UR110914
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HBsAg
ELISA
Ensayo inmunoenzimtico (ELISA) para la deteccin del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) SIGNIFICACION CLINICA La hepatitis B es una enfermedad viral del hgado causada por el virus de la hepatitis B (HBV). Puede cursar en forma asintomtica, o como un proceso agudo o crnico. En los casos ms graves puede derivar en cirrosis heptica y carcinoma hepatocelular primario. Se transmite principalmente por contacto parenteral, percutneo, o sexual. Tambin se ha observado transmisin perinatal y horizontal. El HBV est constituido por una nucleocpside que contiene el ADN asociado a protenas core y una envoltura cuyo principal componente es una protena conocida como antgeno de superficie (HBsAg). El HBsAg generalmente aparece 6 semanas despus de la exposicin al HBV y persiste durante 4-14 semanas. Est presente durante el periodo de incubacin, antes de la aparicin de la enfermedad clnica y puede ser detectado en sangre 2 a 8 semanas antes de la aparicin de ictericia o de evidencias bioqumicas de disfuncin heptica. As, el HBsAg es un primer indicador de infeccin por el HBV. La hepatitis B crnica se define como la presencia del HBsAg en sangre durante ms de 6 meses. La deteccin del HBsAg es importante para el diagnstico de las hepatitis agudas y crnicas, el control de portadores en bancos de sangre y unidades de dilisis, de transplantados y gestantes y para el control de preparados de sangre y derivados destinados a transfusiones. FUNDAMENTOS DEL METODO HBsAg ELISA es un mtodo inmunoenzimtico directo tipo sandwich. Los pocillos de la policubeta estn recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs (anti-HBsAg) que acta como anticuerpo de captura. La muestra se incuba en uno de los pocillos. Si la misma contiene HBsAg, ste formar un complejo con el anticuerpo unido a la placa. El material no unido se elimina por lavado. En el siguiente paso se agrega el anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa, que se unir con los complejos anticuerpo-antgeno formados previamente. El conjugado no unido se remueve por lavado. Posteriormente se agrega una solucin conteniendo tetrametilbencidina y perxido de hidrgeno. En los casos en que el HBsAg est presente en la muestra, se desarrolla color celeste que vira al amarillo cuando se detiene la reaccin con cido sulfrico. REACTIVOS PROVISTOS Policubeta sensibilizada: policubeta de tiras removibles con 96 pocillos recubiertos con anticuerpo de cobayo anti-HBs. Conjugado Concentrado: anticuerpo de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa (51x). Color rojo. Diluyente de Conjugado: buffer tris conteniendo protenas y conservantes. TMB: solucin de tetrametilbencidina (TMB) 36 mM en dimetilsulfxido (DMSO) (100x). Diluyente de TMB: buffer citrato 40 mM y perxido de hidrgeno 1,27 mM, pH 4,3. Stopper: cido sulfrico 2 N. Buffer de Lavado Concentrado: buffer salino con tensioactivo (25x). Color verde. Control Positivo: suero que contiene HBsAg inactivado y conservantes. Color naranja. Control Negativo: suero con conservantes. Color amarillo. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada o desionizada MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Micropipetas para medir los volmenes indicados - Tips descartables - Material volumtrico para preparar las diluciones indicadas - Estufa a 37oC - Papel absorbente - Guantes descartables - Reloj alarma o cronmetro - Hipoclorito de sodio - Sistema de lavado de policubetas (manual o automtico) - Espectrofotmetro para lectura de policubetas PRECAUCIONES - Los reactivos son para uso diagnstico in vitro. - Todas las muestras de pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infeccin. - Los sueros controles han sido examinados para anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y hepatitis C (HCV), encontrndose no reactivos. Sin embargo, se recomienda manipularlos con las precauciones requeridas para muestras potencialmente infecciosas. - A fin de asegurar la inactivacin de agentes patgenos, los materiales que han sido empleados en el ensayo deben descontaminarse antes de ser descartados. El mtodo recomendado para este procedimiento es autoclavar durante 1 hora a 121oC. Los lquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentracin final 5%) durante un mnimo de 60 minutos. - Evitar que los vapores de hipoclorito provenientes de los recipientes para desechos biolgicos u otras fuentes entren en contacto con los reactivos, ya que el hipoclorito afecta la reaccin. - Evitar el derrame de lquidos y formacin de aerosoles.
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- No usar los reactivos luego de la fecha de vencimiento. - No intercambiar reactivos de distintos lotes, o modificar los procedimientos del ensayo. - No emplear reactivos de otro origen. - Evitar tocar las paredes de los pocillos con los tips. - No utilizar elementos metlicos que puedan entrar en contacto con los reactivos. - Las policubetas deben incubarse en estufa. Debe evitarse abrir la estufa durante este proceso. No usar bao de agua. - Evitar el contacto del cido sulfrico (Stopper) y DMSO (TMB) con piel, mucosas y ojos. Si esto ocurre, enjuagar con abundante agua. R36/38: irrita los ojos y la piel. R34: provoca quemaduras. S24/25: evtese el contacto con los ojos y la piel. S26: en caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. S28: en caso de contacto con la piel, lvese inmediata y abundantemente con agua. S37/39: usar guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara. - No pipetear con la boca. Usar guantes descartables y proteccin en los ojos durante la manipulacin de las muestras y reactivos del ensayo. - La TMB es sensible a la luz. Mantenga el frasco cerrado cuando no se utiliza. - Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa vigente. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Buffer de Lavado: a baja temperatura los componentes del reactivo concentrado pueden precipitar. En tal caso, llevar la solucin a 37C hasta disolucin completa. Para la obtencin del buffer de lavado listo para usar (1x), diluir una parte de Buffer de Lavado Concentrado (25x) con 24 partes de agua destilada o desionizada. Ej.: 20 ml con 480 ml para una policubeta. Conjugado: para la obtencin del conjugado listo para usar (1x), diluir 1 parte de Conjugado Concentrado + 50 partes de Diluyente de Conjugado segn tabla siguiente: N de pocillos 8 16 24 32 96 Conjugado Concentrado 20 ul 40 ul 60 ul 80 ul 240 ul Diluyente de Conjugado 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 12 ml
Stopper, Control Positivo y Control Negativo: listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. Buffer de Lavado Concentrado y Stopper: conservar a temperatura entre 2 y 25oC. Buffer de lavado (1x): conservar en recipiente cerrado. Es estable 3 meses a temperatura entre 2 y 25oC. Conjugado (1x): es estable 7 das a 2-10oC, y 6 horas a temperatura 20-25oC. Policubeta sensibilizada: abrir el envoltorio cuando haya tomado temperatura ambiente y no antes del momento de usar, de lo contrario se favorecer la condensacin de humedad sobre la superficie de los pocillos. Las tiras no utilizadas se deben conservar a 2-10oC dentro del sobre con desecante y cerrado. Las tiras conservadas en estas condiciones pueden ser utilizadas dentro de los 4 meses posteriores, mientras no se supere la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero o plasma a) Recoleccin de muestra: obtener de la manera habitual. b) Aditivos: no se requieren para suero. Puede usarse el suero obtenido en tubos con acelerador de la coagulacin y gel separador. Para las muestras de plasma se puede emplear heparina, citrato o EDTA como anticoagulantes. c) Sustancias Interferentes conocidas: no se ha observado interferencia con muestras que contienen hasta 25 mg/dl de bilirrubina, 50 mg/dl de cido ascrbico, 1200 mg/dl de triglicridos o 300 mg/dl de hemoglobina. Muestras conteniendo partculas debern clarificarse mediante centrifugacin. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra puede conservarse refrigerada (2-10oC) hasta 3 das. Si se necesita conservarla por ms tiempo, se debe congelar a -20oC (o inferior). No es recomendable realizar mltiples ciclos de congelamiento y descongelamiento, ya que puede generar resultados errneos. En caso de utilizar muestras congeladas, stas deben ser homogeneizadas y centrifugadas antes de su uso. La inactivacin por calor puede afectar el resultado. No utilizar muestras con contaminacin microbiana. Si las muestras deben ser transportadas, deben embalarse de acuerdo a las especificaciones legales relativas al envo de material infeccioso.
Revelador: para la obtencin del revelador listo para usar (1x), diluir 1 parte de TMB (100x) + 100 partes de Diluyente de TMB (ver tabla siguiente). La TMB concentrada est disuelta en DMSO. Dado que la temperatura de fusin del DMSO es 18oC, la TMB debe alcanzar temperatura ambiente (2025oC) y homogeneizarse bien antes de usar. N de pocillos 8 16 24 32 96 TMB 10 ul 20 ul 30 ul 40 ul 120 ul Diluyente de TMB 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 12 ml
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO 1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. 2- Preparar el volumen necesario de Buffer de Lavado (1x). 3- Colocar en el soporte de tiras, el nmero de pocillos requeridos para la cantidad de determinaciones a realizar, incluyendo 2 pocillos para el Control Positivo (CP) y 3 para el Control Negativo (CN).
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4- Dispensar la muestra (M) y los controles segn el siguiente esquema: M Control Positivo Control Negativo Muestra 100 ul CP 100 ul CN 100 ul -
Stopper
100 ul
100 ul
100 ul
13- A los 5 minutos leer absorbancia en espectrofotmetro en forma bicromtica a 450/620-650 nm, o monocromtica a 450 nm. Nota: se recomienda realizar siempre la lectura en forma bicromtica. En caso de que la lectura sea monocromtica, realizar un blanco de reactivos que luego deber ser restado de todos los valores de las muestras.
Se puede verificar la dispensacin de controles o muestras a los pocillos visualmente, o mediante lectura espectrofotomtrica (a 410/450 nm). 5- Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con las lminas adhesivas provistas, e incubar 60 2 minutos a 37 1oC. En forma paralela, preparar el Conjugado (ver Tabla en PREPARACION DE LOS REACTIVOS). 6- Despus de la incubacin eliminar por completo el lquido de cada pocillo. Lavar 5 veces segn instruccin de lavado (ver Procedimiento de Lavado). 7- Agregar el Conjugado: Conjugado 100 ul 100 ul 100 ul
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la reaccin es estable entre 5 y 30 minutos, por lo que los resultados deben leerse dentro de ese lapso. PROCEDIMIENTO DE LAVADO Eliminar el lquido de los pocillos por aspirado o volcado. Los pocillos se lavan con 350 ul de Buffer de Lavado. Asegurar que la altura alcanzada al llenar los pocillos no cause desbordes. La solucin de lavado debe estar en contacto con los pocillos entre 30 y 60 segundos. En caso de hacer el lavado en forma automtica, se aconseja realizar un doble aspirado al final de cada lavado. Garantizar que luego del ltimo lavado no quede lquido residual. Para ello, realice un doble aspirado para eliminar el excedente de buffer. Si persiste luego de este procedimiento, invertir la placa sobre papel absorbente y golpearla varias veces, de lo contrario podrn obtenerse resultados errneos. Nota: el procedimiento de lavado es muy crtico para el resultado del ensayo. Si queda buffer de lavado en el pocillo o los pocillos no estn completamente llenos, se obtendrn resultados errneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el procedimiento. Los lavadores automticos deben ser enjuagados con agua destilada o desionizada al final del da, para evitar obstrucciones o corrosiones debido a las sales presentes en el buffer de lavado.
Para evitar la evaporacin cubrir la policubeta con lminas adhesivas. 8- Incubar 30 1 minutos a 37 1oC. En forma paralela, preparar el Revelador (ver Tabla en PREPARACION DE LOS REACTIVOS). 9- Lavar 5 veces segn instruccin de lavado. 10- Dispensar el Revelador. Revelador 100 ul 100 ul 100 ul
11- Incubar 30 2 minutos a temperatura ambiente (1825oC), protegido de la luz. 12- Agregar el Stopper:
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO ETAPA Dilucin Muestras Incubacin Lavado PROCEDIMIENTO Preparacin de la solucin de lavado (1x) Agregar 100 ul de M, CP y CN Cubrir los pocillos e incubar durante 60 2 minutos a 37 1oC Lavar cada pocillo con 350 ul de buffer de lavado (5 veces) Preparacin del Conjugado (1x) Agregar 100 ul de Conjugado (1x) Cubrir los pocillos e incubar durante 30 1 minuto a 37 1oC Idem al lavado anterior En estufa En estufa Tiempo de contacto de la solucin de lavado entre 30 y 60 segundos. Eliminar completamente el lquido residual de los pocillos Durante la incubacin con la muestra, diluir el Conjugado Concentrado (51x) PRECAUCIONES/OBSERVACIONES Disolucin de los cristales de sales
Dilucin Conjugado Incubacin Lavado
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Dilucin Revelado Incubacin Detencin Lectura
Preparacin del Revelador (1x) Agregar 100 ul de Revelador Durante 30 2 minutos entre 18-25oC Agregar 100 ul de Stopper Leer en espectrofotmetro
Durante la incubacin con el Conjugado, diluir la TMB (100x) Evitar el contacto con agentes oxidantes. No exponer a la luz. Mantener los pocillos protegidos de la luz
Leer dentro de los 5 y 30 minutos - Contaminacin de la muestra durante la dispensacin, imprecisin en el dispensado de muestra, conjugado y/o revelador en el pocillo. - Reutilizacin de tips. - Contaminacin del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes. En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reaccin falsamente reactiva, tanto en el anlisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este fenmeno pueden ser: - Contaminacin de la muestra durante la extraccin, procesamiento o conservacin. - Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos, frmacos, etc. - Dispensacin y/o aspirado ineficiente de la solucin de lavado (sistema obstruido). LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias Interferentes conocidas en Muestra. No se debe utilizar pool de sueros o plasmas. No se deben emplear otros fluidos corporales como la saliva, lquido cefalorraqudeo u orina. Un resultado no reactivo no excluye la posibilidad de infeccin por HBV ya que el antgeno puede encontrarse a una concentracin inferior a los lmites de deteccin. Si una muestra es repetidamente reactiva debern realizarse pruebas de confirmacin, y otros marcadores serolgicos de la hepatitis B, para confirmar la infeccin por el HBV. CARACTERISTICAS ESPECIFICAS DE PERFORMANCE Sensibilidad clnica En un estudio realizado con 122 muestras con infeccin por HBsAg, confirmada por diferentes mtodos, se encontraron repetidamente reactivas con el kit HBsAg ELISA la totalidad de las muestras. Sensibilidad en Paneles de Performance Se evaluaron diferentes paneles comerciales internacionales obtenindose los siguientes resultados: Panel PHA105 PHA106M PHA204 PHA205 PHA206 Muestras reactivas 14 12 23 23 23 Muestras detectadas 13 11 22 23 20
CRITERIOS DE VALIDACION DEL ENSAYO El ensayo se considera vlido si se cumplen simultneamente las siguientes condiciones: 1- El promedio de las absorbancias de los Controles Negativos debe ser menor o igual a 0,050. Ejemplo: Lectura 1 = 0,025, Lectura 2 = 0,028, Lectura 3 = 0,022 Promedio = (0,025 + 0,028 + 0,022) / 3= 0,025 2- Para el clculo eliminar cualquier Control Negativo con absorbancia mayor a 0,050. 3- Si se ha eliminado algn Control Negativo, calcular nuevamente el promedio de los Controles Negativos. Un ensayo es vlido si se aceptan al menos dos de los Controles Negativos. 4- El promedio de las absorbancias de los Controles Positivos debe ser mayor a 1,000. Ejemplo: Lectura 1 = 1,504, Lectura 2 = 1,496 Promedio = (1,504 + 1,496) / 2= 1,500 5- La diferencia entre el promedio de las absorbancias de los Controles Positivos y Controles Negativos debe ser mayor o igual a 0,950. Si una de estas condiciones no se cumple, repetir el ensayo. Recordar que las lecturas obtenidas dependern de la sensibilidad del aparato empleado. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La presencia o ausencia de antgeno HBsAg se determina relacionando la absorbancia de la muestra respecto al valor del Cut-off. Cut-off = CN + 0,060 CN: promedio de las absorbancias del Control Negativo Ejemplo: 0,025 + 0,060 = 0,085 Muestras No Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias menores al Cut-off. Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbancias mayores o iguales al Cut-off. Toda muestra inicialmente reactiva debe ser repetida por duplicado. Si una o ambas repeticiones dan reactivas, la misma debe considerarse reactiva. Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto puede deberse a: - Contaminacin cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra reactiva.
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PHA105, y PHA106M (HBsAg Low Titer Performance Panels, BBI, USA). PHA204, PHA205, y PHA206 (HBsAg Mixed Titer Performance Panels, BBI, USA). Sensibilidad en Paneles de Seroconversin Se evaluaron los siguientes paneles comerciales internacionales de seroconversin de BBI (USA): Panel PHM917 PHM920 PHM927 PHM928 PHM930 PHM933M PHM934 N de muestras 3 6 6 7 5 5 6 HBsAg ELISA* 1 (43) 4 (26) 4 (7) 3 (14) 4 (3) 4 (7) 5 (3) Subtipo indet. ad indet. ad ad ad ad
- con anticuerpos contra Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Trypanosoma cruzi, y otros microorganismos. - de pacientes hemodializados y mujeres embarazadas. La especificidad obtenida para esta poblacin fue de 99,73 % (IC95%: 99,05-100). Precisin Se evalu la precisin de la prueba siguiendo el protocolo EP5-A recomendado por la NCCLS. Los ensayos fueron realizados con muestras de diferentes niveles de reactividad en el HBsAg ELISA y con los controles. Se realizaron 2 ensayos diarios evaluando cada muestra por duplicado y por el transcurso de 20 das. Media de abs. Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Control (+) Control (-) 0,277 0,930 1,171 1,880 0,026 Intra-ensayo D.S. 0,012 0,031 0,050 0,068 0,002 C.V. 4,44% 3,32% 4,30% 3,62% 8,53% D.S. 0,032 0,113 0,117 0,146 0,004 Total C.V. 11,44% 12,11% 10,02% 7,79% 16,83%
*Se indica el nmero de muestras reactivas con el ELISA. El nmero entre parntesis indica el nmero de das entre el sangrado inicial y la primera muestra reactiva. Sensibilidad analtica (Lmite de deteccin inferior) Ha sido calculada con las siguientes preparaciones internacionales: - Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A. NIBSC cdigo 00/588: Diluido en suero humano negativo para HBsAg y anti-HBs, se detect hasta 0,10 UI/ml. - Estndares para HBsAg subtipos ad y ay provistos por el Paul Erlich Institute (a partir de preparaciones de 100 U/ml y 50000 U/ml, respectivamente): Diluidos en suero bovino se detect hasta la dilucin 0,063 U/ml del subtipo ad y hasta la dilucin 0,12 U/ml del subtipo ay. - Hepatitis B Surface Antigen Sensitivity Panel PHA808, BBI, USA: Se detectaron las muestras 1-8 (hasta 0,06 UI/ml del subtipo ad), y 11-17 (hasta 0,09 UI/ml del subtipo ay). Especificidad En un estudio realizado sobre 685 muestras de sueros y plasmas de pacientes de consultorios externos, la especificidad obtenida fue de 100 % (IC95%: 99,93-100). En un estudio realizado sobre 1134 muestras de sueros de banco de sangre, la especificidad obtenida fue de 99,82 % (IC95%: 99,54-100). En otro estudio de 1256 muestras de plasmas de dos centros de salud, se encontr una especificidad de 99,68 % (IC95%: 99,33-100). Se estudi la posible aparicin de reactividad cruzada ensayando 364 muestras provenientes de individuos con diferentes condiciones clnicas que podran ser causantes de reacciones inespecficas para el ensayo HBsAg ELISA. Este grupo inclua muestras: - con anticuerpos contra HCV, EBV, CMV, HIV, HTLV y otros virus. - con diferentes autoanticuerpos (AGA, AMA, ATA, ACA, TPO, y otros).
DS: desviacin estndar, CV: coeficiente de variacin n= 80 PRESENTACION Equipo para 96 determinaciones (Cd. 1483254). Equipo para 192 determinaciones (Cd. 1483260). BIBLIOGRAFIA - Barbara J. (1993) Vox sanguinis 65, 249-250. - Comanor L. (2006) Vox sanguinis 91, 1-12. - Engvall E. (1980) Methods in Enzymology 70, 419-439. - Gerlich WH (2007) Journal of Viral Hepatitis 14(I), 16-21. - Previsani N, Lavanchy D y Zuckerman A. Hepatitis B (2004) Viral. Hepatitis. In: Mushawar IK, editors. Perspectives in Medical. Virology, vol. 10. - Diagnostic problems caused by HBsAg mutants- A consensus report of an expert meeting (2004) Intervirology 47, 310-313. - WHO Working Group on International Reference Preparations for Testing Diagnostic Kits used in the Detection of HBsAg and anti-HCV Antibodies. Switzerland 2003. - Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A 19/2 (1999) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Specifications for Immunological Testing for Infectious Diseases. Approved Guideline I/LA18-A2 (1994) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Clinical Evaluation of Immunoassays. Approved Guideline I/ LA21-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards. - Interference testing in Clinical Chemistry. Approved Guideline EP7-A (2002) National Committee for Clinical Laboratory Standards.
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Policubeta Sensib. TMB Diluy. Policubeta sensibilizada Conjugado Conc. Diluyente de TMB Conjugado Diluy.
Conjugado Concentrado TMB TMB Control +
Diluyente de Conjugado Buf. Lavado Conc.
Buffer de Lavado Concentrado Control -
Control Positivo Stopper Stopper
Control Negativo

V
Cont.
C
X
H l
G
F
g
M
Xn
Xi
i
Calibr.
b b c h

Wiener lab.
UR130321
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C
SIGNIFICACION CLINICA La sfilis es una enfermedad venrea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en reas de abrasiones. El contacto sexual es la forma ms comn de transmisin. La deteccin y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sfilis cardiovascular, neurosfilis y sfilis congnita. El diagnstico de esta enfermedad sufre la carencia de un mtodo para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidrmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infeccin aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antgenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clnicos son por lo tanto los procedimientos ms rpidos y tiles disponibles para diagnstico de sfilis. FUNDAMENTOS DEL METODO En la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), las "reaginas" presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidum, se detectan por accin de las mismas con antgeno de cardiolipina, lecitina y colesterol adsorbido sobre partculas de carbn. La reaccin produce una aglutinacin visible macroscpicamente, favorecida por las partculas de carbn. Las reacciones inespecficas se evitan con el empleo de antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra. REACTIVOS PROVISTOS A. Reactivo A: suspensin de antgeno de cardiolipina 0,003%, lecitina 0,02% y colesterol 0,09%, adsorbido sobre partculas de carbn 0,02% especialmente tratado en buffer fosfatos 0,01 mol/l con cloruro de colina 0,72 mol/l, EDTA 12,5 mmol/l y conservantes apropiados. Control Positivo: dilucin de suero reactivo. Control Negativo: dilucin de suero no reactivo. REACTIVOS NO PROVISTOS Si se desea realizar la tcnica semicuantitativa se requiere adicionalmente solucin fisiolgica (ClNa 9 g/l). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.
RPR slide test

Prueba no-treponmica para la deteccin serolgica de sfilis INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo A: listo para usar. Agitar antes de usar. Para dispensar este reactivo utilizar el gotero metlico provisto o bien colocar 17 ul medidos con micropipeta. Controles Positivo y Negativo: listos para usar. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Los Controles Positivo y Negativo han sido examinados para antgeno de superficie del virus de hepatitis B y anticuerpos contra HCV y HIV 1/2, encontrndose no reactivos. Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de qumica clnica. Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - Tarjetas de reaccin - Gotero metlico para dispensar el Reactivo - Goteros plsticos descartables para dispensar y distribuir las muestras 2- No Provisto - Agitador rotativo de 100 rpm MUESTRA Suero o plasma a) Recoleccin: obtener la muestra de la manera usual. No es necesario inactivar. b) Aditivos: en caso de obtener plasma, utilizar heparina, EDTA, fluoruro u oxalato de sodio como anticoagulantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis o hiperlipemia pueden provocar resultados errneos, as como el exceso de anticoagulante empleado en la obtencin de plasma. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si no se procesa en el momento, el suero puede conservarse hasta 7 das en refrigerador (2-10oC). El plasma debe emplearse antes de las 24 horas de efectuada la extraccin.
PROCEDIMIENTO I- PRUEBA CUALITATIVA Llevar a temperatura ambiente los reactivos y la muestra antes de realizar el ensayo. En cada uno de los crculos de la tarjeta de reaccin colocar con un gotero plstico provisto:
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Muestra o Controles
1 gota (50 ul)
Con el extremo cerrado del gotero distribuir la muestra uniformemente en todo el crculo. Con el gotero metlico provisto, en posicin vertical, agregar en el centro del crculo: Reactivo A 1 gota (17 ul)
do se presenta el fenmeno de prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba con muestra diluida al 1:5 con solucin fisiolgica para verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa aglutinacin, la muestra es reactiva. - No obstante las ventajas del mtodo, sus resultados, al igual que los de cualquier mtodo serolgico, slo constituyen un dato auxiliar para el diagnstico que debe corroborarse con la historia clnica del paciente. PERFORMANCE Los estudios estadsticos realizados indican que la sensibilidad y especificidad del mtodo son similares a los correspondientes a la prueba USR (Unheated Serum Reagin). PRESENTACION Equipo para 250 determinaciones (Cd. 1853154). BIBLIOGRAFIA - Zinsser Microbiologa, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17o edicin Editorial Mdica Panamericana, 1983. - Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005, 1990. - McGrew, B.E. et al. - Am. J. Clin. Path. 50:52, 1968. - Stevens, R.W. and Stroebel, E. - Am. J. Clin. Path. 53:32, 1970.
SIN MEZCLAR, hacer rotar horizontalmente la tarjeta de reaccin en forma manual o con agitador rotativo a 100 rpm durante 8 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinacin al cabo de este tiempo. Tiempos de lectura mayores pueden dar lugar a falsos resultados. II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA Efectuar diluciones seriadas 1:2, 1:4, 1:8, hasta 1:64 empleando solucin fisiolgica y proceder de la misma manera que en la tcnica cualitativa. El ttulo estar dado por la inversa de la ltima dilucin que se observe reactiva.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: presencia de aglutinacin visible en forma de grumos negros sobre el fondo claro que indica presencia de "reaginas" en la muestra. No reactivo: aspecto gris homogneo que indica ausencia de "reaginas" en la muestra. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar la calidad del sistema procesar un Control Positivo y un Control Negativo utilizndolos de la misma forma que la muestra. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. - Evitar el contacto de los dedos con los crculos de la tarjeta de reaccin, dado que el depsito de grasa en los mismos puede ocasionar una mala distribucin de la muestra, produciendo resultados errneos. Si la muestra no puede ser distribuida uniformemente en toda la superficie de prueba, se recomienda utilizar otro crculo de la tarjeta. - Una vez utilizado el gotero metlico para dispensar el Reactivo A, descartar el remanente y enjuagarlo con agua destilada. - El Reactivo A debe dispensarse manteniendo el gotero en posicin vertical respecto de la tarjeta de reaccin a fin de asegurar que el volumen de la gota sea el correcto. - A temperaturas elevadas o humedad ambiente baja se recomienda el uso de una cmara hmeda durante la rotacin, para evitar que las muestras se sequen. - En individuos con cuadros patolgicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cncer, diabetes y enfermedades autoinmunes, pueden obtenerse resultados falsos positivos. Estos casos se presentan con ttulos bajos y una historia clnica que no coincide con las caractersticas de sfilis. - Pueden observarse resultados falsamente negativos cuan-
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Smbolos
C
P V X H l
M
Xn
Elaborado por:
Nocivo
Corrosivo / Castico

Xi
i
Calibr.
G
F
Cont.
Calibrador
No congelar
Riesgo biolgico
Contenido
Nmero de lote
b b c h
Control
Control Positivo
Control Negativo
Nmero de catlogo

Wiener lab.
UR120606
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V.D.R.L. test
Suspensin antignica estabilizada para realizar la prueba VDRL modificada (USR) de deteccin de sfilis SIGNIFICACION CLINICA La sfilis es una enfermedad venrea causada por el Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en reas de abrasiones. El contacto sexual es la forma ms comn de transmisin. La deteccin y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sfilis cardiovascular, neurosfilis y sfilis congnita. El diagnstico de esta enfermedad sufre la carencia de un mtodo para cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan lesiones epidrmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infeccin aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias denominadas "reaginas", que reaccionan con antgenos de cardiolipina, lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clnicos son por lo tanto los procedimientos ms rpidos y tiles disponibles para diagnstico de sfilis. FUNDAMENTOS DEL METODO Las "reaginas", presentes en individuos infectados por T. pallidum se detectan en suero por la reaccin con un antgeno cardiolipnico purificado y estabilizado. Si la muestra contiene reagina, sta se unir al antgeno produciendo una floculacin visible en microscopio. Las reacciones inespecficas se evitan con el empleo de antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de colina caracterstica de la tcnica USR (Unheated Serum Reagin) en la que no es necesario inactivar la muestra. REACTIVOS PROVISTOS Antgeno: suspensin acuosa de antgeno de cardiolipina y lecitina purificados, en buffer fosfatos con cloruro de colina y EDTA de acuerdo a las indicaciones de la O.M.S. REACTIVOS NO PROVISTOS - Solucin fisiolgica (para la prueba semicuantitativa). - Solucin de cloruro de sodio 10 g/dl (para la tcnica en lquido cefalorraqudeo). ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Antgeno: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar. INSTRUCCIONES PARA SU USO Antgeno: listo para usar. Agitar previo a la ejecucin de la prueba. PRECAUCIONES El Reactivo es para uso diagnstico "in vitro". MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - 1 gotero 2- No Provisto - Agitador rotativo ajustable a 180 rpm. - Placa de vidrio transparente con sectores de 14 mm de dimetro cada uno. - Micropipetas para medir los volmenes indicados. - Microscopio MUESTRA Suero, plasma o lquido cefalorraqudeo (LCR) a) Recoleccin: obtener de la manera usual. No inactivar. b) Aditivos: no se requieren para suero o LCR. Si la prueba se realiza con plasma, ste puede obtenerse empleando heparina, EDTA u oxalato de sodio como anticoagulantes. c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis o hiperlipemia pueden ocasionar resultados errneos. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: en caso de no procesarse de inmediato los sueros pueden conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). El plasma puede emplearse hasta 24 horas luego de la extraccin.
PROCEDIMIENTO Tanto los reactivos como la muestra deben estar a temperatura ambiente antes de realizar la prueba. I- PRUEBA CUALITATIVA EN SUERO O PLASMA En cada uno de los sectores delimitados de la placa colocar: Muestra Con gotero provisto colocar: Antgeno 1 gota 50 ul
Agitar horizontalmente la placa a 180 rpm durante 4 minutos. Observar inmediatamente en microscopio con poco aumento (60 a 100 X). II- PRUEBA SEMICUANTITATIVA EN SUERO O PLASMA Preparar diluciones de la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32 con solucin fisiolgica y realizar para cada dilucin la prueba como se describe en I.
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III- PRUEBA CUALITATIVA PARA LCR Diluir el Antgeno 1:2 con solucin de cloruro de sodio 10 g/dl. Emplear dentro de las 2 horas de preparacin. En cada sector delimitado de la placa colocar: Muestra Con aguja calibre 6 agregar: Antgeno diluido 1 gota (10 ul) 50 ul
BIBLIOGRAFIA - Zinsser Microbiologa, Joklik W., Willett H. y Amos D., 17o edicin Editorial Mdica Panamericana, 1983. - Manual of Tests for Syphilis, cap. 8 - American Public Health Association, Washington, D.C 20005, 1990. - Podest, D.; Svetaz. M.J.; Ricomi, R.; Capriotti, G.; Rojkn, L.; Lorenzo, L.; "Evaluacin de tres reactivos para deteccin de sfilis" - VIII Congreso Argentino de Bioqumica, 54 Triduo Bioqumico Cientfico Anual 1990 - Revista A.B.A. 54/3, 1990.
Mezclar bien y agitar horizontalmente la placa durante 8 minutos a 180 rpm. Leer los resultados en microscopio con poco aumento (60 a 100 X).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Reactivo: presencia de floculacin. No reactivo: ausencia completa de floculacin. Prueba semicuantitativa: el ttulo estar dado por la inversa de la ltima dilucin que se observe reactiva. Leer atentamente las LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Para controlar la calidad del sistema procesar un Control Positivo (suero seguramente reactivo) y un Control Negativo (suero seguramente no reactivo) utilizndolos de la misma forma que las muestras. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Resultados falsamente positivos pueden ser observados en individuos con cuadros patolgicos diversos como hepatitis, influenza, brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cncer, diabetes y enfermedades autoinmunes. Estos casos no son muy comunes y generalmente presentan reacciones con ttulos bajos y una historia clnica que no coincide con las caractersticas de sfilis. Es imprescindible por estos motivos ante toda prueba cualitativa reactiva realizar la prueba semicuantitativa. Resultados falsamente negativos pueden observarse cuando se presenta el fenmeno de prozona. Por este motivo se recomienda repetir la prueba en suero diluido 1:5 con solucin fisiolgica para verificar el resultado. Si en estas condiciones se observa floculacin la muestra es reactiva. A pesar de las ventajas de este mtodo, sus resultados al igual que los de cualquier prueba serolgica, slo constituyen un dato auxiliar de diagnstico que debe corroborarse con la historia clnica del paciente. PERFORMANCE Sobre 2140 muestras de un servicio hospitalario, ensayadas usando V.D.R.L. test e inmunofluorescencia como mtodo de referencia, se observ una concordancia superior al 96%. PRESENTACION Equipo para 250 determinaciones (Cd 1853151).
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqu mica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 1068/91 - 7585/97 - 6895/00
Wiener lab.
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OMS
Anexo: Reactivos y su preparacin
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Orden La relacin de reactivos se ha dispuesto en orden alfabtico. Por ejemplo: actico, cido ......................................................... se encuentra en ................ ..A brillante, azul de cresilo.............................................. .... se encuentra en ..............B carbolfucsina.............................................. .... se encuentra en ..............................C bovina, albmina .............................................. .... se encuentra en .................... .B fenicada, fucsina ................................................ .... se encuentra en ......................F potsico, hidrxido .............................................. se encuentra en ....................P sdico, carbonato .............................................. .... se encuentra en ..................... S A cada reactivo se ha dado un nmero, que figura inmediatamente despus del nombre (estos nmeros tambin se encuentran junto a las descripciones de las tcnicas). q.s.= cantidad necesaria para preparar un volumen dado Por ejemplo: cloruro sdico ................................. 8,5 g agua destilada ...................... q.s. 1 000 ml # q.s. en castellano sera c.s., es similar a c.s.p. (cantidad suficiente para), Significado: Coloque 8,5 g de cloruro sdico en un matraz volumtrico o en una probeta. Agregue agua destilada suficiente (q.s.) para lograr un volumen total de 1 000 ml.
Frmulas qumicas Las frmulas qumicas de los compuestos empleados se indican, por lo general, inmediatamente despus de los nombres: sdico, cloruro (NaCl) potsico, hidrxido (KOH) sulfrico, cido (H2S04) etc. Esto puede ser til para comparar la etiqueta del frasco correspondiente. Una solucin acuosa es la que se prepara con un compuesto disuelto en agua. Nota: A modo de orientacin se agrega el nombre tradicional y habitual en castellano, es decir, el mismo nombre del reactivo preparado pero sin el orden indicado antes. Esto es solamente para facilitar la lectura de corrido y la comprensin directa que realiza el lector, de esta manera, la persona entiende rpidamente el nombre del reactivo. Lo expuesto no debe contradecir el orden ya explicado, el cual debe seguirse. Lo explicado es a manera de ayuda. Por tanto, NO debe ser considerado para la etiquetacin de los frascos. Por ej.: Actico, cido, 50 g/l (5%) solucin de (N 1), en el orden establecido; usualmente sera Solucin de cido Actico al 5% (50 g/l) Adems, en la traduccin del ingls al castellano, siguiendo el orden alfabtico del ingls no sale tan fiel el orden alfabtico en el castellano (A Z), por lo que debe seguirse el orden numrico dado a cada reactivo ya que este permanece inalterado. 1. Actico, cido, 50 g/l (5%) solucin de (N 1) cido actico glacial (CH3COOH) 20 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACTICO, CIDO 5% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El cido actico glacial es altamente corrosivo. Solucin de cido Actico al 5% (50 g/l) (N 1) 2. Actico, cido, 100 g/l (10%) solucin de (N 2) cido actico glacial (CH3COOH) 20 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACTICO, CIDO 10% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El cido actico glacial es altamente corrosivo. Solucin de cido Actico al 10% (100 g/l) (N 2) 3. Actico, cido, 500 g/l (50%) solucin de (N 3) cido actico glacial (CH3COOH) 100 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Etiquetar el frasco con "ACTICO, CIDO 50% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El cido actico glacial es altamente corrosivo. Solucin de cido Actico al 50% (500 g/l) (N 3) 4. Acetona-etanol decolorante para la tincin de Gram (No. 4) Acetona 200 ml Etanol absoluto 475 ml Agua destilada 25 ml Mezclar la acetona, el etanol y el agua destilada y transferir a un frasco de vidrio limpio con tapn. Etiquetar el frasco con "ACETONA-ETANOL DECOLORANTE" y escriba la fecha.
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Decolorante acetona-etanol para la tincin de Gram (N 4) Ntese que aqu no va q.s (c.s.p.) porque la cantidad de agua destilada para agregar aqu (25 ml) es la requerida y se debe medir con pipeta graduada. 5. cido-etanol para Ziehl-Neelsen (N 5) cido clorhdrico (HCl), concentrado 3 ml Etanol (CH3CH2OH) , 95% 97 ml Etiquetar el frasco con "ACIDO-ETANOL PARA ZIEHL-NEELSEN" y escriba la fecha. Advertencia: El cido clorhdrico es altamente corrosivo. 6. cido, reactivo (N 6) cido sulfrico concentrado (H2SO4) 44ml cido ortofosfrico (H3PO4), 85% 66 ml Sulfato de Cadmio 1,6 g Tiosemicarbazida 50 mg Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Llene la mitad de un frasco de 500 ml con agua destilada, aadir el cido sulfrico muy lentamente, revolviendo constantemente, y seguir con el cido ortofosfrico (mezclando). Continuar mezclando la solucin y aadir la tiosemicarbazida y luego el sulfato de cadmio. Completar el volumen a 500 ml con agua destilada. Transferir el reactivo a un frasco marrn oscuro. Consrvese en un frasco de vidrio oscuro. Etiquetar el frasco con "CIDO, REACTIVO" y escriba la fecha. Almacenar a 2-8 C. El reactivo se mantendr durante al menos 6 meses a 2-8 C. Advertencia: El cido sulfrico es sumamente corrosivo. Reactivo cido (N 6) 7. Albert, tincin (No. 7) Azul de toluidina 0,15 g Verde de malaquita 0,20 g cido actico glacial (CH3COOH) 1 ml Etanol (CH3CH2OH), 96% 2 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver el cido actico glacial en 30 ml de agua destilada en un frasco limpio de 100 ml. Agregue el azul de toluidina y el verde de malaquita y mezclar bien. Aadir el etanol y completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Mezclar bien. Etiquetar el frasco con "ALBERT, TINCIN" y escriba la fecha. Guarde a temperatura ambiente. Advertencia: El cido actico glacial es altamente corrosivo. Tincin de Albert (N 7) 8. Alcalina, Hematina D reactivo (N 8) Hidrxido de sodio (NaOH) 4g Triton X-100 (o equivalente) 25 g Agua destilada 1000 ml Se disuelve el hidrxido de sodio en el agua destilada en un matraz cnico limpio. Agitar con una varilla de vidrio hasta que los cristales se disuelvan completamente. Aadir el Triton X-100 (o equivalente) y mezclar bien. Filtrar la solucin en un frasco de reactivo de vidrio limpio con tapn de vidrio, usando papel de filtro Whatman N 1 (o equivalente). Etiquetar el frasco con "ALCALINA, HEMATINA D REACTIVO" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 C). Compruebe la calidad de la solucin (ver abajo). El reactivo Hematina Alcalina D (HAD) se mantendr durante varios meses a 20-25 C. Si se forma un precipitado durante el almacenamiento, el reactivo debe ser filtrado antes de su uso. Nota: Si el agua destilada no est disponible, use agua de lluvia filtrada. Reactivo Hematina Alcalina D (N 8) Control de calidad del reactivo Hematina Alcalina D Una solucin estndar de hematina alcalina D (estndar HAD) suministrado por el laboratorio central se utiliza para probar la calidad de los nuevos lotes de reactivos de HAD en laboratorios de nivel perifrico. 1. Llenar una cubeta limpia con agua destilada. Colocar la cubeta en la cmara de cubetas y ajustar el hemoglobinmetro o el espectrofotmetro para leer el cero a 540 nm de longitud de onda. 2. Cambie el agua destilada con el reactivo de HAD. El hemoglobinmetro o colormetro debern marcar cero. 3. Pipetear 20 l del estndar HAD en un tubo de ensayo que contiene 3 ml del reactivo de HAD recin preparado (dilucin 1:150). 4. Medir la concentracin de hemoglobina del estndar HAD (ver seccin 9.3.2). 5. Repita el procedimiento con el lote anterior de reactivo de HAD. Compare los resultados. 6. Si los valores de hemoglobina difieren en ms de 5 g/l, deseche el reactivo HAD recin preparado y preparar un nuevo lote, prestando atencin a la medida exacta de los constituyentes y la limpieza del material de vidrio. La solucin madre estndar de HAD se mantendr durante 8 meses a 4-8 C. 9. Amies, medio de transporte (No. 9) Carbn de calidad farmacutica Cloruro de sodio (NaCl) Hidrofosfato disdico dihidratado (Na2HPO4 2H2O) Fosfato de potasio y dihigrgeno (KH2P04) anhidro Tioglicolato de sodio 10,0 g 3,0 g 1,15 g 0,20 g 0,10 g
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Cloruro de calcio (CaCl2), anhidro 0,10 g Cloruro de magnesio (MgCl2) 0,10 g Agar 4,00 g Agua destilada 1000 ml Suspender la mezcla de sales en el agua destilada. Aadir el agar y calentar hasta que el agar est completamente disuelto. Aadir el carbn. Distribuir en pequeos tubos o frascos y agitarlos para mantener el carbn suspendido uniformemente. Esterilizar en autoclave a 120 C durante 15 min. Enfriar inmediatamente en agua fra para mantener el carbn suspendido uniformemente. Etiquetar los tubos o frascos "AMIES, MEDIO de TRANSPORTE " y escriba la fecha. El medio de transporte Amies tambin est disponible comercialmente. Medio de transporte Amies (No. 9) 10. Benedict, solucin de (N 10) Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) 17,3 g Citrato trisdico (Na3C6H5O7 2H2O) 173 g Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro 100 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver los cristales de sulfato de cobre por calentamiento en 100 ml de agua destilada. Se disuelve el citrato trisdico y el carbonato de sodio en aproximadamente 800 ml de agua destilada. Aadir la solucin de sulfato de cobre lentamente al carbonato de sodio/solucin de citrato trisdico, revolviendo constantemente. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada. Transferir la solucin a un frasco de vidrio con tapn. Etiquetar el frasco "BENEDICT, SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de Benedict (N 10) 11. Blanco, reactivo (No. 11) cido tricloroactico (CCl3COOH), solucin 50 g/l (5%) 50 ml (5 g en 100 ml de agua destilada; vase el N 62) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar. Transferir la solucin a un frasco de vidrio con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "BLANCO, REACTIVO" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 C). El reactivo se conserva durante varios meses a 20-25 C. Advertencia: El cido tricloroactico es altamente corrosivo. Reactivo Blanco (N 11) 12. Brico, cido, solucin saturada (N 12) cido brico 4,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Guarde en un frasco de vidrio con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "BRICO, CIDO SOLUCIN SATURADA" y escriba la fecha. Solucin saturada de cido Brico (N 12) 13. Cresilo brillante, Azul de (No. 13) Azul brillante de cresilo 1,0 g Citrato trisdico (Na3C6H5O7 2H2O) 0,4 g Solucin de Cloruro de sodio (NaCl), 8,5 g/l (0,85%) (N 53) 100 ml Se disuelve el colorante y el citrato trisdico juntos en la solucin de cloruro de sodio. Se filtra la solucin obtenida en un frasco de tincin. Etiquetar el frasco con "CRESILO BRILLANTE, AZUL DE" y escriba la fecha. Azul brillante de cresilo (No. 13) 14. Amortiguado, Glicerol salino (N 14) Cloruro de sodio (NaCl) 4,2 g Fosfato dipotsico de hidrgeno (K2HPO4), anhidro 3,1 g Fosfato de potasio y dihigrgeno (KH2P04) anhidro 1,0 g Rojo de fenol 0,003 g Agua destilada 700 ml Glicerol (C3H8O3) 300 ml PH final = 7,2 Dispensar la solucin en pequeas botellas de vidrio cilndrico con un tapn de rosca (botellas de bijou) por lo que slo hay una brecha de 2 cm entre la parte superior del medio y la parte superior de las botellas. Etiquetar las botellas "AMORTIGUADO, GLICEROL SALINO" y escriba la fecha. Glicerol salino tamponado o amortiguado (N 14) 15. Agua amortiguada, pH 7,2 (N 15) Solucin tampn de las tinciones de May-Grnwald, Giemsa y Leishman. Hidrofosfato disdico (Na2HPO4 2H2O) 3,8 g Fosfato de potasio y dihigrgeno (KH2P04) anhidro 2,1 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver las sales en el agua destilada, agitar bien. Compruebe el pH utilizando papeles de pH de intervalo estrecho, este debera estar entre 7,0-7,2. Transferir la solucin a un frasco con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "AGUA TAMPONADA" o AGUA AMORTIGUADA y escriba la fecha. 16. Carbolfucsina, Solucin de, para la tincin de Ziehl-Neelsen (N 16) Solucin A (solucin saturada de fucsina bsica):
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Fucsina bsica 3g Etanol (CH3CH2OH), 95% 100 ml Solucin B (solucin acuosa de fenol, 50 g/l (5%)): Fenol (C6H5OH) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Mezclar 10 ml de la solucin A con 90 ml de la solucin B. Transferir la mezcla resultante a un frasco con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "CARBOLFUCSINA, SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El fenol es altamente corrosivo y venenoso. Solucin de Carbolfucsina para la tincin de Ziehl-Neelsen (N 16) 17. Cary-Blair, medio de transporte (No. 17) Tioglicolato de sodio 1,5 g Hidrofosfato disdico (Na2HP04) anhidro 1,1 g Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g Agar 5,0 g Agua destilada 991,0 ml Aadir las sales, el agar y el agua destilada a un vaso de precipitados de 1000 ml limpio y mezclar. Calentar mientras se mezcla hasta que la solucin se aclare. Enfriar a 50 C, aadir 9 ml de cloruro de calcio acuoso recin preparado (CaCl2), solucin de 10g/l (1%), y ajustar el pH aproximadamente a 8,4. Vierta la solucin en volmenes de 7 ml en viales con tapn de rosca de 9 ml previamente lavados y esterilizados. Autoclave los viales que contienen el medio durante 15 minutos, enfriar y apriete las tapas. Etiquetar los viales con "CARY BLAIR, MEDIO DE TRANSPORTE" y escriba la fecha. Medio de transporte Cary-Blair (N 17) 18. Cristal violeta, Hucker modificado (No. 18) Solucin A Cristal violeta 2,0 g Etanol (CH3CH2OH), 95% 20 ml Solucin B Oxalato de amonio ((NH4) 2CO4 H2O) 0,8 g Agua destilada 80 ml Mezcle las soluciones A y B. almacenar durante 24 horas antes de su uso. Filtrar en un frasco de tincin. Se filtra la solucin de tincin en un frasco de tincin. Etiquetar el frasco con "CRISTAL VIOLETA, MODIFICADO HUCKER" y escriba la fecha. Cristal violeta modificado por Hucker (No. 18) 19. Delafield, Hematoxilina tincin de (N 19) Hematoxilina 4,0 g Alumbre de amonio 8,0 g Permanganato de potasio 0,2 g Etanol absoluto 125 ml Agua destilada 410 ml Caliente el etanol, colocando el vaso de precipitados en un recipiente con agua caliente. Agregue la hematoxilina y remover hasta que se disuelva. Deje que la solucin se enfre, y luego filtrar. Aadir el alumbre de amonio a 400 ml de agua destilada (calentada a 40 C) y agitar hasta que se disuelva. Aadir la solucin a la solucin de hematoxilina filtrada y mezclar bien. Disolver el permanganato de potasio en 10 ml de agua destilada y aadir esta solucin a la solucin de tincin. Mezclar bien. Transferir la solucin de tincin a un frasco de tincin. Etiquetar el frasco "DELAFIELD, TINCIN HEMATOXILINA" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 C). La tincin se mantendr durante varios meses a 20-25 C. Tincin de hematoxilina de Delafield (N 19) 20. Dicromato, solucin de limpieza (No. 20) Para la limpieza del material de vidrio. Dicromato de potasio (K2Cr2O7) 100g cido sulfrico concentrado (H2SO4) 100 ml Agua destilada 1000 ml Disolver el dicromato en el agua destilada. Aadir el cido gradualmente, revolviendo constantemente. El cido siempre debe ser aadido al agua, no el agua al cido. Transferir la solucin a un frasco de vidrio con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "DICROMATO SOLUCIN DE LIMPIEZA" y escriba la fecha. Advertencia: Debido a que el dicromato de potasio y el cido sulfrico son ambos corrosivos y la mezcla an ms, utilice la solucin lo menos posible. Solucin de limpieza de dicromato (No. 20) 21. Drabkin, lquido de, para dilucin (N 21) El lquido de Drabkin para dilucin se puede preparar con tabletas reactivas que se adquieren directamente del fabricante. Estas tabletas se acompaan de las instrucciones pertinentes. En los laboratorios que cuentan con una balanza de precisin el lquido de Drabkin se puede elaborar de la manera siguiente: Ferricianuro de potasio (K3Fe (CN)6) 0,40 g Cianuro de potasio (KCN) 0,10 g Fosfato de potasio y dihigrgeno (KH2PO4) 0,28 g Sterox SE (o equivalente) 1 ml
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Agua destilada q.s. (c.s.p.) 2000 ml Disuelva los tres primeros agentes qumicos en el agua y mzclelos. Agregue el detergente (Storex) y mzclelos con suavidad. El reactivo resultante deber ser claro y de color amarillo plido. Cuando se mide contra el agua como blanco en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, la absorbancia debe ser cero. Consrvese en un frasco de vidrio oscuro. Se debe desechar si se enturbia. Advertencia: el cianuro potsico es una sustancia qumica extraordinariamente txica que solo debe ser manejada por qumicos capacitados. Mientras no se emplee se deber guardar en una alacena con cerrojo. Despus de utilizarla las manos se lavarn escrupulosamente. En su defecto, usar guantes desechables de ltex. Etiquetar el frasco con "DRABKIN LQUIDO DILUYENTE" y escriba la fecha. Lquido de Drabkin para dilucin (N 21) 22. EDTA, solucin salina bipotsica de, 100 g/l (10%) (N 22) Etilendiaminotetraacetato bipotsico 20 g (Edetato potsico) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Para el uso, pipetear 0,04 ml de esta solucin en pequeos contenedores con capacidad para contener 2,5 ml de sangre. Djese secar este anticoagulante haciendo que los recipientes permanezcan toda la noche sobre una mesa de trabajo tibia o en una incubadora a 37C. Etiquetar el frasco con EDTA, SOLUCIN SALINA BIPOTSICA y escriba la fecha. Solucin salina bipotsica de EDTA 100 g/l (10%) (N 22) 23. Eosina, 10 g/l (1%), solucin acuosa de (N 23) Eosina Agua destilada Etiquetar el frasco con "EOSINA 1% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de Eosina al 1% (N 23) 1g q.s. (c.s.p.) 100 ml
24. Eosina, 20 g/l (2%) solucin salina de (N 24) Eosina 2g Cloruro de sodio (NaCl), 8,5 g/l (0,85%) en solucin acuosa (N 53) q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el frasco con "EOSINA SOLUCIN AL 2% EN SOLUCIN SALINA" y escriba la fecha. Solucin salina de Eosina al 2% (N 24) 25. Field, tincin de (N 25) Colorante A de Field: Elaboracin a partir de polvos preparados: Polvos para colorante A de Field 5,0 g Agua destilada caliente (calentada a 80 C) q.s. (c.s.p.) 600 ml Mezcle hasta que los polvos se disuelvan. Filtre cuando se haya enfriado en un frasco de 1000 ml. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE A" y escriba la fecha. Elaboracin a partir de colorantes y agentes qumicos originales: Azul de metileno (medicinal) 1,6 g Azur 1 1,0 g Hidrofosfato disdico (Na2HP04) anhidro 10,0 g Fosfato de potasio y dihidrgeno (KH2P04) anhidro 12,5 g agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disuelva ambos fosfatos en el agua. Vierta aproximadamente la mitad de esta solucin en un frasco con capacidad para un litro, en que se hayan colocado algunas cuentecillas de vidrio. Aada los polvos colorantes y mezcle minuciosamente todo el contenido del frasco. Agregue el resto de la solucin de fosfatos. Mezcle bien y filtre en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE A" y escriba la fecha. Colorante B de Field: Elaboracin a partir de polvos preparados: Polvos para colorante B de Field 4,8 g Agua destilada caliente (calentada a 80 C) q.s. (c.s.p.) 600 ml Mezcle bien hasta que se disuelva. Filtre la mezcla cuando se haya enfriado en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE B" y escriba la fecha. Elaboracin a partir de colorantes y agentes qumicos originales: Eosina (hidrosoluble, amarilla) 2,0 g Hidrofosfato disdico (Na2HP04) anhidro 10,0 g Fosfato de potasio y dihidrgeno (KH2P04) anhidro 12,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disuelva ambos fosfatos en el agua. Vace la mezcla en un frasco con capacidad para 1 litro. Aada la eosina. Mezcle hasta que se disuelva. Filtre en un frasco de 1000 ml limpio. Etiquetar el frasco con "FIELD, COLORANTE B" y escriba la fecha. Sin diluir, los colorantes de Field pueden ser usados por un tiempo, ya que dan buenos resultados. Despus de la dilucin, deben ser filtrados cada 2-3 das. 26. Flor, oxalato de (N 26), Anticoagulante Fluoruro sdico (NaF) Oxalato potsico (KCOOH) 1,2 g 6,0 g
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Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Para usar este anticoagulante, trasldelo con una pipeta de 0,1 ml a recipientes pequeos con capacidad para 2 ml de sangre (o LCR). Advertencia: el fluoruro sdico y el oxalato potsico son sustancias txicas. Anticoagulante Oxalato de Flor (N 26) 27. Formaldehido, solucin salina de (N 27) Solucin neutra de formaldehido (CH2O), por lo menos al 37% 10 ml ("formalina") Solucin de cloruro sdico, 8,5 g/l (0,85%) (No. 53) 90 ml La solucin comercial de formaldehido se neutraliza aadiendo unas gotas de solucin de carbonato sdico en concentracin de 50 g/l (5%) (Reactivo N 52). Mida el pH con una cinta de papel indicador. Etiquetar el frasco con " Formaldehido solucin Salina" y escriba la fecha. Advertencia: el formaldehido es corrosivo y txico. Solucin salina de Formaldehido (N 27) 28. Formaldehido, solucin al 10% de (N 28) Solucin comercial de formaldehido (CH2O), por lo menos al 37% ("formalina") 100 ml Agua destilada 300 ml Transferir la solucin a un frasco con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "FORMALDEHIDO AL 10% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El formaldehido es corrosivo y txico. Solucin al 10% de Formaldehido (N 28) 29. Giemsa, tincin de (N 29) Colorante de Giemsa en polvo 0,75 g Metanol (CH3OH) 65 ml Glicerol (C3H8O3) 35 ml Coloque los ingredientes en un frasco que contenga cuentecillas de vidrio y sacdalo. Despus sacuda el frasco 3 veces al da durante 4 das consecutivos. Por ltimo, fltrese en un frasco para tincin. Etiquetar el frasco con GIEMSA, TINCIN y escriba la fecha. (Vanse las instrucciones del fabricante; puede ocurrir que las cantidades indicadas por ste sean diferentes). Tincin de Giemsa (N 29) 30. Glucosa, reactivos para (No. 30) cido tricloroactico, 30 g/l (3%) Acido tricloroactico (CCl3COOH) 15 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Pese el cido con rapidez, ya que es sumamente delicuescente. Trasldelo a un vaso para anlisis y agregue agua para disolverlo. Vace la solucin en un matraz con capacidad para 500 ml y llene hasta esta marca con agua. Esta solucin se puede conservar en el frigorfico por tiempo indefinido. Etiquetar el frasco con "CIDO TRICLOROACTICO AL 3% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: el cido tricloroactico es sumamente corrosivo. Reactivo de ortotoluidina Tiourea 0,75 g Acido actico glacial (CH3COOH) 470 ml Ortotoluidina 30 ml Disuelva la tiourea en el cido actico glacial. (Si esto resulta difcil, coloque el matraz en un recipiente con agua caliente). Aada la ortotoluidina y mezcle bien. Vace en un frasco oscuro y consrvese a la temperatura ambiente. Etiquetar el frasco con "O-TOLUIDINA REACTIVO" y escriba la fecha. Dejar reposar durante al menos 24 horas antes de su uso. Advertencia: evite tocar estos agentes qumicos; el cido actico glacial es sumamente corrosivo. cido benzoico, 1 g/l (0,1%) cido benzoico 1g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1 000 ml Mida 1000 ml de agua destilada y calintela casi hasta el punto de ebullicin. Agregue el cido benzoico y mezclar bien hasta que se disuelva. Deje que se enfre. Transferir la solucin a un frasco con tapn de vidrio de 1000 ml. Etiquetar el frasco con "CIDO BENZOICO 0,1% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin estandarizada de referencia para glucosa (100 mmol/l) Glucosa pura, anhidra 9g Solucin de cido benzoico, 1 g/l (0,1%) q.s. (c.s.p.) 500 ml Pese la glucosa con precisin extrema. Trasldela a un matraz volumtrico de 500 ml y llene el matraz hasta ese nivel con la solucin de cido benzoico. Mezcle bien. Congele fracciones separadas, aproximadamente de 100 ml. Utilice un nuevo frasco de solucin de referencia congelada cada vez que se prepare la solucin de referencia para trabajar con glucosa. Etiquetar el frasco con "GLUCOSA, SOLUCIN REFERENCIA ESTANDARIZADA 100 mmol/l" y escriba la fecha.
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Solucin de referencia para trabajar con glucosa (2,5, 5, 10, 20 y 25 mmol/l) Deje que la solucin estandarizada de referencia para glucosa alcance la temperatura ambiente. Cuidadosamente pipetear 2,5, 5, 10, 20 y 25 ml de la solucin estandarizada de referencia para glucosa en cada uno de cinco matraces volumtricos de 100 ml. Completar hasta la marca con la solucin de cido benzoico y mezclar bien. Etiquetar los frascos como se describi antes y escribir la fecha. Gurdese en el frigorfico. Se debe renovar cada mes. 31. Glicerol-verde malaquita Solucin de (No. 31) 1. Preparar una solucin madre de verde malaquita, solucin al 1%: Verde de malaquita 1g Agua destilada 100 ml Usando una mano de mortero y un mortero, moler los cristales de verde malaquita hasta obtener un polvo. Disolver 1 g del polvo recin preparado en 100 ml de agua destilada y verter la solucin en un frasco oscuro. Etiquetar el frasco con "VERDE MALAQUITA 1% SOLUCIN" y escriba la fecha. Cierre bien el frasco y gurdelo en la oscuridad. 2. Prepare una solucin de trabajo de glicerol-verde malaquita: Glicerol 100 ml Verde malaquita, solucin al 1% 1 ml Agua destilada 100 ml Aadir el glicerol, la solucin de verde malaquita de stock (madre) y agua destilada a un frasco con tapn de vidrio de 250 ml. Etiquetar el frasco con "GLICEROL - VERDE MALAQUITA SOLUCIN" y escriba la fecha. Mezclar bien antes de usar. Solucin de glicerol verde de malaquita (N 31) 32. Clorhdrico, cido, 0,01 mol/l solucin de (N 32) cido clorhdrico (HCl), concentrado 8,6 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Medir 500 ml de agua destilada en un frasco con tapn de vidrio de 1 000 ml. Aadir el cido, gota a gota. Completar hasta 1 000 ml con el resto del agua destilada. Etiquetar el frasco con "CIDO CLORHDRICO 0,01 mol/l" y escriba la fecha. Renovar mensualmente. Advertencia: El cido clorhdrico es altamente corrosivo. Solucin de cido Clorhdrico 0,01 mol/l (N 32) Isotnica, solucin salina Ver cloruro de sodio. 33. Lactofenol, solucin de montaje de azul algodn de (No. 33) Azul algodn (azul de anilina) 50 mg Cristales de fenol (C6H5OH) 20 mg cido lctico (CH3CH(OH)COOH) 20 ml Glicerol (C3H8O3) 40ml Agua destilada 20 ml Aadir el fenol, el cido lctico y el glicerol al agua destilada, mezclar todo y disolver por calentamiento suavemente. Agregue el azul algodn y mezclar. Transferir la solucin a un frasco con tapn. Etiquetar el frasco con "LACTOFENOL AZUL ALGODN, SOLUCIN DE MONTAJE" y escriba la fecha. Advertencia: El fenol es altamente corrosivo y venenoso. Solucin de montaje de azul algodn de lactofenol (No. 33) 34. Leishman, tincin de (N 34) Polvos de Leishman 1,5 g Metanol (CH3OH) q.s. (c.s.p.) 1000 ml Enjuague con metanol un frasco limpio. Coloque en su interior algunas cuentecillas de vidrio limpias y secas. Aada los polvos colorantes y el metanol. Mezcle bien para disolver los polvos colorantes. El material de tincin estar as listo para usarlo al da siguiente. Etiquetar el frasco con "LEISHMAN, TINCIN" y escriba la fecha. Al preparar una tincin empleando metanol, es importante que se impida la entrada a la humedad durante la elaboracin y posteriormente, durante su conservacin. Tincin de Leishman (N 34) 35. Loeffler azul de metileno (N 35) Azul de metileno 0,5 g Etanol absoluto (CH3CH2OH) 30 ml Hidrxido de potasio (KOH), 200 g/l (20%) solucin (N 45) 0,1 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver el azul de metileno en 30 ml de agua destilada y transferir la solucin a un frasco marrn (color caramelo) limpio. Aadir el hidrxido de potasio, el etanol y el resto del agua destilada y mezclar bien. Etiquetar el frasco con "LOEFFLER AZUL DE METILENO" y escriba la fecha. Conservar en un lugar oscuro a temperatura ambiente (20-25 C). Azul de metileno de Loeffler (N 35) 36. Lugol, solucin yodurada 1 g/l (0,1%) de (N 36) Yodo Yoduro potsico (KI) Agua destilada 1g 2g 300 ml
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Pese el yodo en un plato de porcelana o un vidrio de reloj. Pulvercelo junto con el yoduro potsico, ambos secos, en un mortero. Aada algunos mililitros de agua a intervalos y muela minuciosamente hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan. Deposite esta solucin en un frasco de vidrio de color mbar con el resto del agua destilada. De otro modo: Coloque 300 ml de agua destilada en una probeta. Disuelva primero el yoduro potsico en unos 30 ml de esta agua. Agregue el yodo y mezcle hasta disolverlo. Aada el resto del agua destilada y mezcle bien. Consrvese en un frasco oscuro color caramelo. Etiquetar el frasco con "LUGOL YODO 0,1% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin yodurada 1 g/l (0,1%) de Lugol (N 36) 37. Lugol, solucin yodurada 5 g/l (0,5 %) de (N 37) Yodo 5g Yoduro potsico (KI) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 300 ml Pese el yodo en un plato de porcelana o un vidrio de reloj. Pulvercelo junto con el yoduro potsico, ambos secos, en un mortero. Aada algunos mililitros de agua a intervalos y muela minuciosamente hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan. Deposite esta solucin en un frasco de vidrio de color mbar con el resto del agua destilada. Alternativamente, coloque 300 ml de agua destilada en una probeta. Disuelva primero el yoduro potsico en unos 30 ml de esta agua. Agregue el yodo y mezcle hasta disolverlo. Aada el resto del agua destilada y mezcle bien. Consrvese en un frasco oscuro color caramelo. Etiquetar el frasco con "LUGOL YODO 0,5% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin yodurada 5 g/l (0,5%) de Lugol (N 36) 38. May - Grnwald, tincin de (N 38) Polvos de May-Grnwald 5g Metanol q.s. (c.s.p.) 1000 ml Enjuague con metanol un frasco limpio. Deposite en su interior algunas cuentecillas de vidrio limpias y secas. Agregue los polvos colorantes y el metanol. Mezcle bien para disolver completamente los polvos colorantes. Esta tincin mejora despus de conservarla durante 1 - 2 semanas, mezclndola con suavidad a intervalos. Al preparar una tincin empleando metanol, es importante que se impida la entrada a la humedad durante la elaboracin y posteriormente, durante su conservacin. Etiquetar el frasco con "MAY-GRNWALD, TINCIN" y escriba la fecha. Tincin de May Grnwald (N 38) 39. Metileno, azul de, solucin acuosa (N 39) Azul de metileno 0,3 g Agua destilada 100 ml Disolver el azul de metileno en el agua destilada. Filtrar la solucin en un frasco color caramelo limpio. Etiquetar el frasco con "METILENO, AZUL DE, SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de azul de metileno (N 39) 40. Rojo neutro, 1 g/l (0,1%) solucin (N 40) Rojo neutro 1g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver el rojo neutro en aproximadamente 300 ml de agua destilada en un frasco de 1000 ml limpio. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada y mezclar bien. Etiquetar el frasco con "ROJO NEUTRO 0,1 % SOLUCIN" y escriba la fecha. Guarde a temperatura ambiente. Solucin de Rojo neutro 0,1% (N 40) 41. Pandy, reactivo de (N 41) Fenol (C6H5OH) 30 g Agua destilada 500 ml Coloque el fenol en un frasco de 1000 ml. Agregue el agua destilada. Agite vigorosamente. Etiquetar el frasco con "PANDY REACTIVO" y escriba la fecha. Deje en reposo durante un da. Observe si hay alguna parte de fenol que no se haya disuelto. Si es as, fltrelo. (Si todo el fenol se ha disuelto, aada otros 10 g y espere durante un da ms antes de filtrar). El reactivo de Pandy es una solucin saturada de fenol. Advertencia: el fenol es sumamente corrosivo y txico. Reactivo de Pandy (N 41) 42. Rojo fenol, 10 g/l (1%) solucin de (N 42) Cristales de rojo fenol 0,1 g Agua destilada 10 ml Pesar los cristales de rojo fenol en un vaso de precipitados de 20 ml. Agregue el agua destilada y agitar hasta que los cristales se hayan disuelto. Transferir la solucin a un frasco cuentagotas de plstico. Etiquetar el frasco con "ROJO FENOL 1% SOLUCIN" y escriba la fecha. Conservar a temperatura ambiente (20-25 C). Solucin de rojo fenol 10 g/l (1%) (N 42) 43. Tamponada, agua con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (N 43) 1. Preparar una solucin madre de hidrofosfato disdico anhidro en un matraz aforado de 1000 ml: Hidrofosfato disdico (Na2HP04) anhidro 13,6 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml
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Esterilizar la solucin madre filtrndola a travs de un filtro con tamao de poro de 0,2 m. Si no est disponible el hidrofosfato disdico anhidro, la solucin se puede preparar mediante la disolucin de 17,2 g de hidrofosfato disdico dihidratado (NaH2PO4 2H2O) en 1000 ml de agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "ANHIDRO DISDICO HIDROFOSFATO" y escriba la fecha. Mantenga la solucin madre en un refrigerador. 2. Preparar una solucin madre de fosfato de hidrgeno disdico en un matraz aforado de 1000 ml: Hidrofosfato disdico dihidratado (Na2HPO4 2H2O) 17,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Esterilizar la solucin madre filtrndola a travs de un filtro con tamao de poro de 0,2 m. Si no est disponible el hidrofosfato disdico dihidratado, la solucin se puede preparar mediante la disolucin de 26,8 g de hidrofosfato disdico heptahidratado (Na2HPO4 7H2O) o 35,8 g de hidrofosfato disdico dodecahidratado (Na2HPO4 12H2O). Etiquetar el matraz aforado con "DISDICO HIDROFOSFATO, SOLUCIN MADRE" y escriba la fecha. Mantenga la solucin madre en un refrigerador. 3. Mezclar las dos soluciones madre en las cantidades que se muestran en la siguiente tabla para obtener 100 ml de agua tamponada. El pH debe ser como se indica en la tabla. Si el pH es demasiado bajo, ajuste con hidrxido de sodio (NaOH), solucin 0,01 mol/l (N 54), y si es demasiado alto, ajustarlo con cido clorhdrico (HCl), solucin 0,01 mol/l (N 32). Agua tamponada con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (N 43) Agua tamponada con Fosfato 0,01 mol/l, pH 6,8 (N 43) pH de la solucin de trabajo Volumen de la solucin madre (ml) NaH2PO4 Na2HPO42H2O 83.2 16.8 6.4 6.5 75.0 25.0 6.8 50.8 49.2 6.9 43.9 56.1 7.0 39.0 61.0 7.2 28.0 72.0 7.4 19.9 81.0 7.6 13.0 87.0 7.8 8.5 91.5 8.0 5.3 94.7 44. Alcohol de polivinilo (PVA) fijador (N 44) Nota: Esto se debe preparar en un laboratorio de nivel intermedio, debido a los reactivos peligrosos involucrados. Fijador de Alcohol de polivinilo (PVA) (N 44) Schaudinn, fijador modificado Cristales de cloruro de mercurio (HgCl2) 1,5 g Etanol, 95% 31,0 ml cido actico glacial 5,0 ml Se disuelve el cloruro de mercurio en el etanol en un matraz tapado (50 o 125 ml) por agitacin a intervalos. Aadir el cido actico, obturar con el tapn y mezclar por agitacin. Etiquetar el frasco con "SCHAUDINN FIJADOR MODIFICADO" y escriba la fecha. Advertencia: El cido de mercurio es altamente txico. El cido actico glacial es altamente corrosivo. Fijador modificado de Schaudinn Mezcla de PVA Glicerol 1,5 ml PVA en polvo (de baja viscosidad) 5,0 g Agua destilada 52,5 ml En un pequeo vaso de precipitados, aadir el glicerol al PVA en polvo y mezclar bien con una varilla de vidrio hasta que todas las partculas aparezcan recubiertas con el glicerol. Remover la mezcla raspndola en un matraz de 125 ml. Agregue el agua destilada, tapar y dejar a temperatura ambiente (20-25 C) durante 3 horas o toda la noche. Etiquetar el frasco con "MEZCLA PVA" y escriba la fecha. Agitar la mezcla de vez en cuando para mezclar. El PVA en polvo y las soluciones fijadoras de PVA estn disponibles de varias fuentes comerciales. Hay muchos grados de PVA en polvo en el mercado, pero los grados con alta hidrlisis y baja o media viscosidad son ms satisfactorios para la preparacin del fijador PVA. PVA fijador, solucin de trabajo de 1. Calentar en bao mara (o en un vaso grande de agua) a 70-75 C. Ajuste el calor para mantener este rango de temperatura. 2. Colocar el matraz que contiene la mezcla de PVA, sin apretar el tapn, en el bao mara durante unos 10 minutos, agitando con frecuencia. 3. Cuando el polvo de PVA parece estar disuelto en su mayor parte, se vierte en la solucin fijadora modificada de Schaudinn, volver a tapar y agitar para mezclar. 4. Continuar girando la mezcla en el bao mara durante 2-3 minutos para disolver el resto del PVA, para permitir que se escapen las burbujas, y para aclarar la solucin. 5. Retirar el matraz del bao mara y dejar que se enfre. Guarde el fijador de PVA en un frasco con tapa a rosca o tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "PVA FIJADOR" y escriba la fecha. El fijador se mantendr durante 6 a 12 meses.
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Solucin de trabajo de Fijador de PVA 45. Potasio, Hidrxido, solucin de 200 g/l (20%) (N 45) Hidrxido de potasio (KOH) a granel 20 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado "POTASIO HIDROXIDO 20% solucin" y escriba la fecha. Advertencia: El hidrxido de potasio es corrosivo. Solucin de Hidrxido de Potasio 200 g/l (20%) (N 45) 46. Permanganato de potasio, solucin de 40 g/l (4%) (N 46) Permanganato de potasio (KMnO4) 40g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Disolver el permanganato de potasio en 300 ml de agua destilada en un matraz aforado de 1000 ml. Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "PERMANGANATO DE POTASIO 4% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de Permanganato de Potasio (40 g/l) (4%) (N 46) 47. Safranina, solucin de (N 47) 1. Preparar una solucin madre: Safranina O 2,5 g Etanol (CH3CH2OH), 95% q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar hasta que toda la safranina se haya disuelto. Transferir la solucin a un frasco con tapn de vidrio. Etiquetar el frasco con "SAFRANINA, SOLUCIN MADRE" y escriba la fecha. 2. Prepare una solucin de trabajo en un frasco con tapn de vidrio: Solucin madre 10 ml Agua destilada 90 ml Etiquetar el frasco con "SAFRANINA, SOLUCIN DE TRABAJO" y escriba la fecha. Almacenar en la oscuridad. Solucin de safranina (N 47) 48. Saponina, solucin salina de 10 g/l (1%) (N 48) Saponina 1g Cloruro de sodio (NaCl), solucin de 8,5 g/l (8,5%) (N 53) 100 ml Aadir la solucin de cloruro de sodio a una botella de vidrio. Aadir la saponina, mezclar y calentar hasta que se haya disuelto completamente. Etiquetar el frasco con "1% SAPONINA EN SOLUCIN SALINA" y escriba la fecha. Solucin salina de saponina 10 g/l (1%) (N 48) 49. Nitrato de plata, solucin 17 g/l (1,7%) (N 49) Nitrato de plata (AgNO3) 5,1 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 300 ml Mezclar hasta que todo el nitrato de plata se ha disuelto. Etiquetar el frasco con "NITRATO DE PLATA 1,7% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: El nitrato de plata es custico. Solucin de Nitrato de Plata 17 g/l (1,7%) (N 49) 50. Sodio bicarbonato, solucin de 20 g/l (2%) (N 50) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 2g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SODIO BICARBONATO 2% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de bicarbonato de sodio 20 g/l (2%) (N 50) 51. Sodio carbonato, solucin de 2 g/l (0,2%) (N 51) Carbonato de sodio (Na2CO3), anhidro 2g (o una cantidad equivalente de uno de los hidratos) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "CARBONATO DE SODIO 0.2% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de carbonato de sodio 2 g/l (0,2%) (N 51) 52. Sodio carbonato, solucin de 50 g/l (5%) (N 52) Carbonato de sodio (Na2CO3), anhidro 5g (o una cantidad equivalente de uno de los hidratos) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "CARBONATO DE SODIO 5% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de carbonato de sodio 50 g/l (5%) (N 52) 53. Sodio, Cloruro, solucin de 8,5 g/l (0,85%) (solucin salina isotnica) (N 53) Cloruro de sodio (NaCl) 8,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 1000 ml Etiquetar el matraz aforado con "CLORURO DE SODIO 0,85% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de Cloruro de Sodio 8,5 g/l (0,85 %) (N 53) Sodio, Citrato de Ver Citrato trisdico. Sodio, Carbonato cido de Ver bicarbonato de sodio.
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54. Sdico, solucin acuosa de hidrxido, 0,01 mol/l (N 54) Hidrxido de sodio (NaOH) a granel 3g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SDICO, HIDRXIDO 0,01 mol/l" y escriba la fecha. Advertencia: El hidrxido de sodio es corrosivo. Solucin acuosa de hidrxido de sodio 0,01 mol/l (N 54) 55. Sdico, solucin acuosa de metabisulfito, 20 g/l (2%) solucin (N 55) Metabisulfito de sodio (Na2S2O5) 0,5 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 25 ml Preprese para usarse inmediatamente. Etiquetar el matraz aforado con "SODIO METABISULFITO 2% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de metabisulfito de sodio 20 g/l (2%) (N 55) 56. Stuart, medio de transporte modificado de (N 56) Agar 4,00 g Agua destilada 1000 ml Calintese hasta que se disuelva y, mientras se encuentra caliente: Cloruro sdico (NaCl) 3,00 g Cloruro potsico (KCl) 0,20 g Hidrofosfato disdico (Na2HP04) anhidro 1,15 g Fosfato sdico y de hidrgeno (NaH2P04) anhidro 0,20 g Tioglicolato sdico 1,00 g Cloruro clcico (CaCl2), 10 g/l (1%), solucin acuosa recin 10,00 ml preparada Cloruro magnsico (MgCl2), 10 g/l (1%), solucin acuosa 10,00 ml pH final: 7,3 1. Agite hasta que se disuelva. Agregue 10 g de polvos de carbn neutro. 2. Coloque 5 - 6 ml en tubos de 13 x 10 mm con tapa de rosca (evitar el aplastamiento). 3. Esterilice los tubos en el autoclave a 121C durante 20 minutos. Invierta los tubos antes de que el medio se solidifique, a fin de que el carbn neutro se distribuya uniformemente. Etiquete los tubos con "STUART TRANSPORTE MEDIO, MODIFICADO" y escriba la fecha. A continuacin guarde en el frigorfico. Medio de transporte modificado de Stuart (N 56) 57. Sulfosaliclico, solucin acuosa de cido, 30 g/l (30%) (N 57) cido sulfosaliclico 3g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Etiquetar el matraz aforado con "SULFOSALICLICO CIDO 3% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de cido Sulfosaliclico 30 g/l (30%) (No. 57) 58. TIF (tiomersal yodo-formaldehido) fijador (N 58) 1. Preparar una solucin madre: Tintura de tiomersal, 1: 1000 200 ml Formaldehido, solucin al 10% (N 28) 25 ml Glicerol 5 ml Agua destilada q.s. (c.s.p.) 250 ml Transferir la solucin madre a un frasco color caramelo. Etiquetar el frasco con "TIOMERSALFORMALDEHIDO SOLUCIN MADRE" y escriba la fecha. Consrvese en un frasco oscuro color caramelo hasta 3 meses. 2. Elaboracin de solucin yodurada de Lugol, 50 g/l (5%): Yodo 5g Yoduro potsico (KI) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Preprela de la misma manera que la solucin yodurada de Lugol (No. 37). Se debe guardar durante un mes solamente en un frasco oscuro. 3. El da en que se vaya a usar, mezcle: Solucin madre de tiomersal 9,4 ml Solucin yodurada de Lugol; 50 g/l (5 %) (N 37) 0,6 ml Advertencia: el formaldehido es corrosivo y txico. Fijador TIF (tiomersal yodo-formaldehido) (N 58) 59. Trisdico, solucin salina de citrato, 20 g/l (2%) (N 59) Citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7 2H2O) 2g Cloruro de sodio, 8,5 g/l (0,85%) solucin (N 53) q.s. (c.s.p.) 100 ml Consrvese en el frigorfico. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISDICO 2% SOLUCIN SALINA" y escriba la fecha. Solucin salina de citrato trisdico 20 g/l (2%) (N 59) 60. Trisdico, solucin acuosa de citrato, 32 g/l (3,2%) (N 60) Esto se utiliza como un anticoagulante. Citrato trisdico anhidro (Na3C6H5O7) (o una cantidad equivalente de 3,2 g dihidrato o pentahidrato) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml
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Consrvese en el frigorfico. sese 1 ml de la solucin por 4 ml de sangre. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISDICO 3,2% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de citrato trisdico 32 g/l (3,2%) (N 60) Trisdico, solucin acuosa de citrato, 38 g/l (3,8%) (N 60) Esto se utiliza como un anticoagulante. Citrato trisdico anhidro (Na3C6H5O7) (o una cantidad equivalente de dihidrato o pentahidrato) 3,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Consrvese en el frigorfico. sese 1 ml de la solucin por 4 ml de sangre. Etiquetar el matraz aforado con "CITRATO TRISDICO 3,8% SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin acuosa de citrato trisdico 38 g/l (3,8%) (N 60) *La solucin de citrato trisdico al 3,8 % an se usa bastante en Latinoamrica. 61. Trk, Solucin de (N 61) cido actico glacial (CH3COOH) 4 ml Solucin acuosa de azul de metileno (N 39) 10 gotas Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml La solucin de azul de metileno (N 39) se prepara disolviendo 0,3 g de azul de metileno en 100 ml de agua destilada. Fltrese antes de aadirla a la solucin cida. Disolver el cido actico glacial en 100 ml de agua destilada. Aadir la solucin de azul de metileno y mezclar. Transfiera la mezcla a un matraz aforado de 200 ml y completar el volumen a 200 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "TRK SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: el cido actico glacial es altamente corrosivo. Solucin de Trk (N 61) 62. Urea, reactivos para (N 62) cido tricloroactico, 50 g/l (5%) solucin cido tricloroactico (CCl3COOH) 10 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 200 ml Pese el cido con rapidez, ya que es sumamente delicuescente. Trasldelo a un vaso de precipitados. Agregue 100 ml de agua destilada y mezclar para disolverlo. Trasldelo a una probeta o a un matraz aforado con tapn y complete los 200 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "CIDO TRICLOROACTICO 5% SOLUCIN" y escriba la fecha. Advertencia: el cido tricloroactico es sumamente corrosivo. Solucin de cido tricloroactico 50 g/l (5%) Diacetil monoxima solucin madre Diacetil monoxima (tambin llamado monoxima 2,32g butanodiona) Agua destilada q.s. (c.s.p.) 500 ml Disuelva la diacetil monoxima en agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "DIACETIL MONOXIMA, SOLUCIN MADRE" y escriba la fecha. La solucin se mantendr durante al menos 6 meses a 2-8 C. Solucin madre de diacetil monoxima Reactivo de color Reactivo cido (N 6) 50 ml Reactivo de diacetil monoxima 50 ml Mezclar el reactivo de cido y la solucin madre en un matraz de 100 ml tapado. Etiquetar el frasco con "COLOR, REACTIVO". Las cantidades que se muestran arriba son suficientes para 33 mediciones. El reactivo debe prepararse diariamente. Solucin de referencia de reserva de urea, 125 mmol/l Urea 750 mg Solucin de cido benzoico (C7H6O2), 1 g/l (0,1%) (vase N 30) q.s. (c.s.p.) 100 ml Pese la urea con precisin extrema. Disolver la urea en aproximadamente 20 ml de la solucin de cido benzoico en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con solucin de cido benzoico. Mezcle minuciosamente la solucin de ambos compuestos. Etiquetar el frasco "UREA RESERVA REFERENCIA SOLUCIN 125 mmol/l" y escriba la fecha. Guarde en el frigorfico. La solucin se conserva durante varios meses a 2-8 C. Solucin de referencia de trabajo de urea, 10 mmoles/l Solucin de referencia de reserva de urea 8 ml Solucin de cido benzoico (C7H6O2), 1 g/l (0,1%) (vase N 30) q.s. (c.s.p.) 100 ml Mezclar bien las soluciones en un matraz aforado de 100 ml. Etiquetar el matraz aforado "UREA SOLUCIN DE TRABAJO DE REFERENCIA 10 mmol/l" y escriba la fecha. 63. Wayson, tincin de (N 63) Solucin A1: Fucsina bsica Metanol absoluto anhidro (CH3OH) Solucin A2: Azul de metileno Metanol absoluto anhidro (CH3OH) Combinar las dos soluciones para dar la solucin A. (A1 + A2 = A) Solucin B: solucin acuosa de fenol, (50 g/l) (5%):
2g 100 ml 7g 100 ml
438
Fenol (C6H5OH) 100 g Agua destilada 2000 ml Agregue la solucin A a la solucin B. Las propiedades de la tincin de Wayson mejoran con el tiempo. Prepare en grandes volmenes y distribyase en cantidades pequeas, en frascos de vidrio oscuro, para usarla posteriormente. Etiquetar los frascos con "WAYSON, TINCIN" y escriba la fecha. Advertencia: el fenol es corrosivo. Tincin de Wayson (N 63) 64. Willis, Solucin de (N 64) Esta es una solucin saturada de cloruro de sodio. Cloruro de sodio (NaCl) 125 g Agua destilada 500 ml Disuelva el cloruro sdico calentando la mezcla hasta el punto de ebullicin. Djese enfriar y reposar. Observe si cierta proporcin de sal queda sin disolver. Si toda la sal se ha disuelto agregue otros 50 g. Fltrela y consrvela en un frasco con tapn de corcho. Etiquetar el frasco con "WILLIS, SOLUCIN" y escriba la fecha. Solucin de Willis (N 64) 65. Wintrobe, solucin de (N 65) Solucin anticoagulante. Oxalato de amonio (NH4) 2C2O4 H2O) 1,2 g Oxalato de potasio (K2C2O4 H2O) 0,8 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Disolver las dos sales en 50 ml de agua destilada en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "WINTROBE, SOLUCIN" y escriba la fecha. Deposite 0,5 ml de esta mezcla en cada frasco o tubo de 5 ml que se use para recolectar sangre. Deje los frascos abiertos a fin de que se sequen a la temperatura ambiente o, de preferencia, colquelos en una incubadora a 37 C. Solucin de Wintrobe o Mezcla de Wintrobe (N 65) 66. Zenker, fijador de (N 66) Dicromato de potasio (K2Cr2O7) 2,5 g Cloruro mercrico (HgCl2) 5,0 g Sulfato de sodio (Na2SO4) 1,0 g Agua destilada q.s. (c.s.p.) 100 ml Poco antes de usarla, agregue a los 100 ml de la solucin: Acido actico glacial 5 ml Disolver las tres sales en 50 ml de agua destilada en un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen a 100 ml con agua destilada. Etiquetar el matraz aforado con "ZENKER FIJADOR" y escriba la fecha. Advertencia: el cido actico glacial es sumamente corrosivo y el cloruro mercrico es extremadamente txico. Este fijador solo debe ser preparado por tcnicos totalmente capacitados, que posean suficiente experiencia. Fijador de Zenker (N 66)
# Esta traduccin realizada del ingls al castellano del Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud, OMS, 2 Edicin, 2003, no trae ndice analtico.
Seleccin de publicaciones de la OMS sobre temas afines

Mtodos bsicos de laboratorio en parasitologa mdica 1991 (122 pginas) Mtodos bsicos de laboratorio en bacteriologa clnica 1991 (128 pginas) Diagnstico de laboratorio de las infecciones de transmisin sexual (ITS) Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. 1999 (146 pginas) Mantenimiento y reparacin del laboratorio, diagnstico por imagen, y equipos hospitalarios. 1994 (164 pginas) Manejo seguro de los residuos procedentes de las actividades de atencin de la salud Prss A, Giroult E, Rushbrook P, eds. 1999 (244 pginas) Seguridad en los laboratorios de salud (documento OMS/LAB/97.1) 1997 (157 pginas) Manual de laboratorio de bioseguridad, 2 ed. 1993 (133 pginas) Conceptos bsicos de garanta de calidad para los laboratorios intermedios y perifricos, 2 ed. El-Nageh MM et al. OMS Publicaciones Regionales, Eastern Mediterranean Series, No. 2 2002 (256 pginas)
Ms informacin sobre estas u otras publicaciones de la OMS pueden solicitarse a Comercializacin y Difusin, Organizacin Mundial de la Salud, 1211 Ginebra 27, Suiza.
Este manual ofrece una gua prctica para el desempeo seguro y preciso de las tcnicas bsicas de laboratorio. Diseado para ser utilizado por tcnicos de laboratorio que trabajan en laboratorios de nivel perifrico en los pases en desarrollo, el libro hace hincapi en procedimientos sencillos y econmicos que pueden producir resultados precisos en lugares donde los recursos, incluidos los equipos, son escasos y el clima es clido y hmedo. El libro est dividido en tres partes. La primera describe la puesta en marcha de un laboratorio de salud perifrico y procedimientos generales de laboratorio, incluyendo el uso de un microscopio y balanzas de laboratorio, centrifugacin, medicin y dispensacin de lquidos, y la limpieza, desinfeccin y esterilizacin de material de laboratorio. Tambin son tratados los mtodos de eliminacin de residuos de laboratorio, el envo de muestras a los laboratorios de referencia y seguridad del laboratorio. En la segunda parte se describen las tcnicas para el estudio de diferentes muestras para los helmintos, protozoos, bacterias y hongos. Las tcnicas para la preparacin, la fijacin y tincin de frotis tambin se discuten. En la tercera y ltima parte se describe el examen de la orina, lquido cefalorraqudeo y sangre, incluyendo las tcnicas basadas en principios inmunolgicos y serolgicos. Se da para cada tcnica, una lista de materiales y reactivos, seguida por una descripcin detallada del mtodo y los resultados del examen microscpico. Numerosas ilustraciones se utilizan en todo el libro para aclarar los diferentes pasos. Un resumen de los reactivos necesarios para las diversas tcnicas y su preparacin se proporciona en el anexo.
ISBN 92-4-154530-5
9 789241 545303

Manual de Técnicas Básicas para Un Laboratorio de Salud OMS 2º Edición 2003 en Castellano

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Manual de Técnicas Básicas para Un Laboratorio de Salud OMS 2º Edición 2003 en Castellano

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M A N U A L DE TCNICAS BSICAS

PARA UN LABORATORIO DE SALUD

ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD GINEBRA

Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud

Organizacin Mundial de la Salud Ginebra 2003

Manual of basic techniques for a health laboratory

Manual de tcnicas bsicas para un laboratorio de salud

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Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud

1.1 OBJETIVO DE ESTE MANUAL

Laboratorista, tambin un Bioqumico Clnico; NDT.

10004 1012 10005 1015

0,000 000 000 000 000 001

0,000 000 000 000 000 000 001

0,000 000 000 000 000 000 000 001

trombocitos o recuento de plaquetas Glucosa, concentracin de masac (sangre y LCR)

%e mg/100ml g/l mg/100ml mg/100ml

Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud

Tipo de electrolito Mximo de descarga Descarga durante el funcionamiento normal

1,2 V Elevada Mnimo Alto Altamente recomendada

2V Baja Infrecuente De valor medio Altamente recomendada

2V Media Frecuente De valor medio Recomendada

2V Baja Infrecuente Bajo No recomendada

Figura 2.3 Un contador o medidor de corriente elctrica

Figura 2.4 Instrumentos de doble voltaje

2.3 FONTANERA: PROCEDIMIENTOS SENCILLOS

Figura 2.15 Herramientas y materiales para las reparaciones de fontanera.

Figura 2.18 Extraccin de la arandela. B: base de la llave.

Ilustracin anexa A Empleo de agentes qumicos para destupir el sifn.

2.4 AGUA PARA USO DEL LABORATORIO

Figura 2.36 Transferencia de Hidrofosfato disdico a un matraz volumtrico aforado.

RELACIN DE APARATOS NECESARIOS PARA EQUIPAR UN LABORATORIO PERIFRICO 2.5 EQUIPAMIENTO

Figura 2.44 Calentamiento del tubo de vidrio antes de estirar la pipeta.

Figura 2.45 Estirando la pipeta. Figura 2.46 Redondeo de los extremos.

Figura 2.47 Redondeo de los extremos de la varilla de vidrio por flameado.

Ilustracin anexa A Tarro plstico y caja para la recogida de esputo.

Ilustracin anexa A Cajn donde se guardan las pipetas graduadas en secciones.

2000 2001 2002 2003

Tabla 2.5 Registro de Hematologa a

Leucocitos Concentracin Fraccin de nmero de l os tipos de No. N L M E O

Otras Resultados pruebas enviados

Tabla 2.6 Registro de qumica sangunea

Tabla 2.7 Registro de anlisis de orina

Prueba de embarazo: positiva

Leucocitos tipo, no., fraccin: neutrfilos 0.94, linfocitos 0.06

Tabla 2.9 Registro de bacteriologa

Tabla 2.10 Registro de parasitologa Fecha Muestra

Resultados enviados en (fecha) 2.1.01

Sala Cortes de Mdica 1 piel Dr R Heces

Tabla 2.11 Registro de serologa Fecha

Resultados No reactivo Reactivo, 1 : 8

Resultados enviados en (Fecha) 3.1.01 3.1.01

3 PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO

Figura 3.2 Componentes del sistema de aumento de un microscopio.

Figura 3.6 Un ocular.

Figura 3.7 Un espejo de microscopio.

Figura 3.8 Un condensador.