Enzimas AmpC plasmdicas en enterobacterias

Julio de 2010

Bioq. Mara Irene Almeida Bioq. Matas Toms Messina

Objetivos: Describir los mecanismos de resistencia antibiticos mediados por -lactamasas a

Analizar las diferentes metodologas de deteccin de -lactamasas de tipo AmpC

Analizar la prevalencia de AmpC plasmdica

Blancos Moleculares
Alteracin de la sntesis de la pared celular
-lactmicos, glucopptidos, etc

Alteracin de la sntesis de cidos nucleicos

Quinilonas, rifampicina, etc

Interferencia en la sntesis del cido tetrahidroflico

Trimetoprima, sulfonamidas, etc

Alteracin de la sntesis proteica

Aminoglucosidos, macrlidos, etc

Actividad a nivel de membrana celular

Polimixinas

Esquema de las envolturas bacterianas

Gram Positiva Gram negativa

PBP: penicillin binding proteins

PRESCOTT - MICROBIOLOGA, 7 EDC

Mecanismo de Accin de los -lactmicos

PRESCOTT - MICROBIOLOGA, 7 EDC

Mecanismos de resistencia a
-lactmicos
Alteracin de los blancos moleculares
Disminucin en la afinidad de las PBPs Adquisicin de una PBP adicional de baja afinidad Sobreproduccin de una PBP de baja afinidad

Alteracin en la permeabilidad Produccin de -lactamasas

N Engl J Med 2008;358:1271-81

Mecanismo principal de resistencia a -lactmicos en Enterobacterias

- LACTAMASAS

Accin de - Lactamasas

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Jan. 1988, p. 109-123

Accin de - Lactamasas

- Lactamasas

Historia de la clasificacin de - Lactamasas

Sawai et al (1968): penicilinasas y cefalosporinasas Richmond - Sykes (1973): 5 grupos segn hidrlisis de sustrato Sykes- Matthew (1976): - Lactamasas plasmidicas diferenciadas segn su pI Ambler (1980): segn su estructura molecular Mitsuhashi- Inoue (1981): penicilinasas, cefalosporinasas y - Lactamasas hidrolizantes de cefuroxima Bush (1989): integracin de estructura molecular con perfil de actividad
ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, June 1995, p. 12111233

Clasificacin de lactamasas

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, June 1995, p. 12111233

AmpC: generalidades
Serin - lactamasas Grupo C de Ambler Grupo 1 de la clasificacin de Bush-Jacoby-Medeiros (1995) Cefalosporinasas Resistencia a oximino-cefalosporinas y algunas cefamicinas No inhibidas por inhibidores clsicos

AmpC
Cromosmicas
Constitutivas Constitutivas/ Inducibles
Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Serratia spp. Morganella morganii Providencia spp Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Otras

Plasmdicas

AmpC plasmdicas
Descriptas por primera vez en 1989 (Philippon et al) Distribucin mundial, principalmente en aislamientos nosocomiales Derivan de AmpC cromosomales

AmpC plasmdicas
Hafnia alvei Desconocido

Desconocido

M. morganii

C. freundii

E. cloacae
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2002, p. 21532162

Propiedades Enzimticas (I)

Propiedades Enzimticas (II)

AmpC plasmdicas

ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Jan. 2002, p. 111

Laboratorio

Alexander Fleming (1881 1955)

Screening Positivo para bsqueda de BLEE

Ampicilina R Cefalotina R

CTX= 22mm

Bsqueda de BLEE

Aumento 5mm
CTX/ CLA

CAZ/
CLA

c
CTX CAZ

BLEE positiva

Prueba Confirmatoria

Mtodos de deteccin de AmpC

NO existen mtodos fentipicos estandarizados por el CLSI para la deteccin de enzimas AmpC

Sospecha de AmpC

screening para - lactamasas positivo + test con cido clavulnico negativo

Fenotipo no especfico de AmpC (TEM, OXA, carbapenemasas) R a FOX y oximino -lactmicos bsqueda de AmpC

Cepas con AmpC plasmdicas S a CTX, CRO y CAZ segn criterios de CLSI 2009 TEST CONFIRMATORIOS

Mtodos de deteccin: tests confirmatorios

Test en 3D Agar cefoxitina Inhibidores -lactmicos No clsicos E-test Inhibidores No -lactmicos Mtodos moleculares
Confirmacin de AmpC plasmdica

Mtodos de deteccin
FOX

Test en 3D (Indirecto)

Cepa en estudio

E. coli
ATCC 25922

Mtodos de deteccin

Agar Cefoxitina

Cepa en estudio
(extracto enzimtico)

E. coli
ATCC 25922

Mtodos de deteccin

Inhibidores -lactmicos No Clsicos

Test positivo: Incremento dimetro de halo 4mm

LN-2-128 (LN) Ro 48-1220 (48) Syn 2190

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2004, p. 22032206

Mtodos de deteccin

Inhibidores -lactmicos No clsicos

cefotetan + Syn 2190

100% Especificidad 91% Sensibilidad

LN-2-128 (LN) Ro 48-1220 (48) Syn 2190

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2004, p. 22032206

Mtodos de deteccin

E-test

Cefotetn: 0.5-32 g/ml Cefotetn + Cloxacilina

Cefoxitin: 4-256 g/ml Cefoxitin + Cloxacilina

Bolmstrm, A et al. Evaluation of two new Etest strips for AmpC detection. Abstr. 46th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother.

Mtodos de deteccin

E-test

Test positivo: Reduccin de CIM a cefamicina de 3 diluciones Deformacin de la elipse de inhibicin Presencia de zona fantasma

AmpC negativo
Bolmstrm, A et al. Evaluation of two new Etest strips for AmpC detection. Abstr. 46th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother

Mtodos de deteccin

E-test

88-93% Especificidad 88-93% Sensibilidad

AmpC positivo. Genotipo DHA-1

Bolmstrm, A et al. Evaluation of two new Etest strips for AmpC detection. Abstr. 46th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother

Mtodos de deteccin

Inhibidores no -lactmicos

18 mm

18 mm

30 mm

5mm

Mtodos de deteccin

Inhibidores no -lactmicos

AmpC

BLEE

Mtodos de deteccin

Mtodos moleculares

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2002, p. 21532162

Mtodos de deteccin

Mtodos moleculares

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2002, p. 21532162

Mtodos de deteccin

Mtodos moleculares

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2002, p. 21532162

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

CEJAS D1, FERNANDEZ CANIGIA L2, QUINTEROS M3, GIOvANAKIS M4, VAY C5, LASCIALANDARE S6, MUTTI D6, PAGNIEZ G7, ALMUZARA M8, GUTKIND G1, RADICE M1
1-Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA, 2- Hospital Alemn, 3- Hospital de Infecciosas F.J Muiz, 4- Hospital Britnico, 5- sanatorio mater dei 6- Hospital SAMCO, Villa Constitucin, 7-Coorporacin Mdica de San Martin, Bs As., 8 Hospital Eva Pern.

Objetivo: realizar un estudio Multicntrico y Prospectivo sobre la Prevalencia de AmpC plasmdica en nuestro medio durante el perodo Agosto-Octubre de 2009 En el estudio participaron 7 centros de la Ciudad de Buenos Aires y del Conurbano Bonaerense

Enterobacterias recuperadas (n=2202)

Especies incluidas: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Proteus vulgaris Shigella spp. Citrobacter koseri Salmonella spp.

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Criterios de inclusin

1.Resistencia a Cefalotina y Ampicilina Halo de Inhibicin de Cefotaxima 27 mm y/o Ceftazidima 22 mm Resistente o Intermedio a Cefoxitina

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Prueba de Screening para bsqueda de BLEE

Ampicilina R

Cefalotina R

CTX= 22mm

Criterios de inclusin

1.Resistencia a Cefalotina y Ampicilina Halo de Inhibicin de Cefotaxima 27 mm y/o Ceftazidima 22 mm Resistente o Intermedio a Cefoxitina
2.Ausencia de sinergia con cido Clavulnico (confirmacin de BLEE NG)

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Bsqueda de BLEE

CTX

CTX/
CLA

c
CAZ CAZ/
CLA

CTX: cefotaxima CAZ: ceftazidima CLA: clavulnico Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Bsqueda de BLEE

FEP

FEP/
CLA

FEP: cefepime CLA: clavulnico

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Criterios de inclusin

1.Resistencia a Cefalotina y Ampicilina Halo de Inhibicin de Cefotaxima 27 mm y/o Ceftazidima 22 mm Resistente o Intermedio a Cefoxitina 2.Ausencia de sinergia con cido Clavulnico (confirmacin de BLEE NG) 3.Sinergia Positiva con cido Fenil Bornico

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Deteccin Fenotpica de AmpC

FOX

BOR

1,0 cm

c
CTX BOR CAZ

1,0 cm

1,0 cm

BOR: cido fenil bornico FOX: cefoxitina

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Enterobacterias con Screening positivo para bsqueda de BLEE

Enterobacterias con FOX Resistente o Intermedio

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Porcentaje de enterobacterias que cumplieron con el criterio de inclusin

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Confirmacin genotipica de AmpC ( multiplex PCR)

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Enterobacterias recuperadas (n=553)

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Enterobacterias con Screening positivo para bsqueda de BLEE

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Enterobacterias con FOX Resistente o Intermedio

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Screening fenotpico con cido fenil bornico

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Confirmacin genotipica de AmpC ( multiplex PCR)

E coli n=6 (5 orinas; 1 lquido abdominal) P mi n=1 (orina)

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Conclusiones:
La prevalencia de AmpC plasmdica fue del 1% del total de enterobacterias recuperadas en este perodo

En Escherichia coli la produccin de AmpC plasmdicas correspondi a un 25% de la resistencia a cefalosporinas de 3 generacin

Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Conclusiones
La resistencia a cefoxitina no es especfico de la presencia de AmpC

En nuestros aislamientos de K pneumoniae este mecanismo es poco frecuente

Los aislamientos productores de AmpC fueron tanto de origen nosocomial como ambulatorio
Anlisis de la prevalencia de enzimas de tipo AmpC de codificacin plasmdica en Enterobacteriaceae

Consideraciones finales

Presencia de enzimas de tipo AmpC en plsmidos

Presencia de AmpC en especies que habitualmente no se encontraban

Mtodo fenotpico: sinergia con cido bornico es buen predictor de presencia de AmpC

Resistencia antibitica mltiple; difcil eleccin de un tratamiento efectivo

Cmo informamos?

CLSI 2009
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis

CLSI 2010
Enterobacterias

CTX 27mm CAZ 22mm

S CTX CAZ FEP 26 21 18

I 25-23 20-18 17-15

R 22 17 14

Bsqueda de BLEE

Resultado Negativo
S I R 14 14 14 CTX 23 22-15 CAZ 18 17-15

Resultado Positivo CAZ, CTX, FEP Resistente

FEP

18 17-15

Recomendacin local
CTX 26 CAZ 21
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis

Bsqueda de BLEE

Resultado Positivo CAZ, CTX, FEP Resistente

Resultado Negativo
S CTX CAZ FEP 26 21 18 I 25-23 20-18 17-15 R 22 17 14

Rotacin teraputica a cefalosporinas de 4 generacin y carbapenemes, consecuencias?

Agradecimientos
Bioq. Liliana Fernandez Canigia Bioq. Ivana Maldonado Bioq. Daniela Cejas Jefa de Residentes Equipo de bioqumicos de Laboratorio Domecq y Lafage

Gracias por su atencin!!!